JP6979484B2 - ２，３−ブタンジオール生産用の組換え微生物および２，３−ブタンジオールの生産方法 - Google Patents

Description

本発明は、一種の遺伝子組換え微生物により、当該微生物の２，３−ブタンジオールの生産能力を高める効果を開示し、さらに、本発明は、当該遺伝子組換え微生物の発酵反応により、２，３−ブタンジオールを生産する方法を開示する。

２，３−ブタンジオールはポリオールの一種であり、重要な化学原料および液体燃料である。化学工業、エネルギー、食品産業、航空宇宙などの異なる分野において、様々な用途で使用されている。例えば、燃料産業では、２，３−ブタンジオールはオクタンブースターとして、ガソリンと配合することが可能であり、液体燃料として使用することが可能である。化学工業では、２，３−ブタンジオールは凝固点が非常に低いため、不凍剤として使用することができる。汎用性の高い化学原料として、簡単な反応で１，３−ブタジエンに変換し、合成ゴムや合成樹脂の原料となる。メチルエチルケトンに変換され、燃料添加剤や溶剤として使用されるほか、低沸点溶剤として、接着剤や塗料、燃料、潤滑剤、インクなど、様々な産業で幅広く利用することができる。食品産業では、２，３−ブタンジオールは、２，３−ブタンジオン（ジアセチル）またはアセチルメチルカルビノール、アセトイン（アセチルメチル）に変換することができ、香料や天然食品香料として、幅広く食品業界で利用されている。

現在、２，３−ブタンジオールは、化学的方法と生物学的発酵法の二種類の生産方法で生産されている。化学的生産方法は、再生不可能な化石原料を原料とし、従来の石油化学的方法による分解・精製により生産されるが、分解・精製のプロセスでは高温高圧が必要であるため、深刻な汚染につながる。これと比較して、生物学的発酵法は再生可能な原料をベースに、微生物発酵による生産であるため、環境に優しい原料と生産方法は、工業と環境保護の両立が望ましい現在の国際社会情勢に相応しいことから、環境に優しい生物学的生産技術が優勢となり、世界各国が積極的に開発に力を入れている技術分野である。

２，３−ブタンジオールは、クレブシエラ属菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）やエンテロバクター菌（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、バチルス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、セラチア菌（Ｓｅｒｒａｔｉａ）など多種の細菌発酵による生産が可能であることが知られているが、温度やｐＨ値、酸素濃度などの発酵条件を最適化し、微生物の発酵能力を向上させた後も、生物学的発酵法による生産性は低く、生産コストが高いという問題点がある。

また、上記の２，３−ブタンジオールの発酵生産に用いられる微生物の多くは病原性を有しており、各地域の保健当局が様々な微生物の病原性レベルに従って分類しており、これらの微生物を取り扱う上で対応する規定を遵守する必要がある。そのため、取り扱い規制や潜在的な疾患リスクなどにより、さらに生物学的発酵法による２，３−ブタンジオールの生産コストが増加する。

このような観点から、２，３−ブタンジオールの発酵生産にはより安全で効率のよい、生産コストを下げる生産方法が求められている。

したがって、本発明の目的は、２，３−ブタンジオールの生産能力を有する組替え微生物を提供することにあり、ウリジン二リン酸グルコースリン酸ウラニルトランスフェラーゼ遺伝子（ｇａｌＵ）、アセチルアルコール脱水素酵素遺伝子（ａｃｏＡ）、リン酸アセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ｐｔａ）、グルコースリン酸アデノシルトランスフェラーゼ遺伝子（ｇｌｇＣ）、ラクトースデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｌｄｈＡ）、ホスホジエステラーゼ遺伝子（ｐｄｅＣ）からなるグループから選択される少なくとも３つの遺伝子が改変される。

特定の実施形態では、本発明により開示される組替え微生物の一つは、ウリジン二リン酸グルコースリン酸ウラニルトランスフェラーゼ遺伝子、アセチルアルコール脱水素酵素遺伝子およびリン酸アセチルトランスフェラーゼ遺伝子を改変したものである。別の特定の実施形態では、本発明により開示される組替え微生物の一つは、ウリジン二リン酸グルコースリン酸ウラニルトランスフェラーゼ遺伝子、アセチルアルコール脱水素酵素遺伝子、リン酸アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、およびグルコースリン酸アデノシルトランスフェラーゼ遺伝子を改変したものである。別の特定の実施形態では、本発明により開示される組替え微生物の一つは、ウリジン二リン酸グルコースリン酸ウラニルトランスフェラーゼ遺伝子、アセチルアルコール脱水素酵素遺伝子、リン酸アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、グルコースリン酸アデノシルトランスフェラーゼ遺伝子およびラクトースデヒドロゲナーゼ遺伝子を改変したものである。別の特定の実施形態では、本発明により開示される組替え微生物の一つは、ウリジン二リン酸グルコースリン酸ウラニルトランスフェラーゼ遺伝子、アセチルアルコール脱水素酵素遺伝子、リン酸アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、グルコースリン酸アデノシルトランスフェラーゼ遺伝子、ラクトースデヒドロゲナーゼ遺伝子およびホスホジエステラーゼ遺伝子を改変したものである。

本発明で提供される組替え微生物の遺伝子は改変されており、改変は抑制、欠失、またはサイレンシング含む。特定の実施形態では、本発明で提供される組替え微生物の遺伝子は改変されており、改変は欠失である。

特定の実施形態では、本発明で開示される組換え微生物は、クレブシエラ属菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）である。別の特定の実施形態では、本発明で開示される組換え微生物は、財団法人食品産業開発研究所に寄託された寄託番号ＢＣＲＣ９１０９７９のクレブシエラ属菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐ）である。

本発明により開示される組替え微生物は、未改変微生物と比較して、２，３−ブタンジオールの生産能力が向上する。本発明により開示される組替え微生物は、未改変微生物と比較して、同じ培養時間でより多くの２，３−ブタンジオールを生産する。別の特定の実施形態では、本発明により開示される組替え微生物は、未改変微生物と比較して、２，３−ブタンジオールを持続的に生産し、持続時間は少なくとも５０時間、少なくとも６０時間、少なくとも７０時間、少なくとも８０時間、少なくとも９０時間である。

本発明により開示される組替え微生物は、未改変微生物と比較して、安全性が向上する。別の特定の実施形態では、本発明により開示される組替え微生物は、未改変微生物と実質的に同じ成長能力を有する。さらに別の特定の実施形態では、本発明により開示される組替え微生物は、酸性環境で２，３−ブタンジオールを生産する。

本発明はさらに、本発明により開示される組替え微生物の培養、および培養液から分離することにより得られる２，３−ブタンジオールの生産方法を開示する。

野生型株（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎ）と接合完了体（ｔｒａｎｓｃｏｎｊｕｇａｎｔ）の染色体上での、形質転換と組換えに使用される標的遺伝子とＤＮＡフラグメントの相同組換えを示す模式図である。 ２回の相同組換えを行った後、染色体上の標的遺伝子が除去された突然変異株（ｍｕｔａｎｔ ｓｔｒａｉｎ）を示す模式図である。 ストレプトマイシンの天然突然変異体のコロニーを示す図である。 ＲＴ−ＰＣＲによるＳ１Ｕ１遺伝子の発現を示す電気泳動図である。 ＲＴ−ＰＣＲによるＳ１Ｕ１Ｄ１遺伝子の発現を示す別の電気泳動図である。 ＲＴ−ＰＣＲによるＳ１Ｕ１Ｄ２遺伝子の発現を示す電気泳動図である。 ＲＴ−ＰＣＲによるＳ１Ｕ１Ｄ３遺伝子の発現を示す電気泳動図である。 ＲＴ−ＰＣＲによるＳ１Ｕ１Ｄ４遺伝子の発現を示す電気泳動図である。 ＲＴ−ＰＣＲによるＳ１Ｕ１Ｄ５遺伝子の発現を示す電気泳動図である。 遺伝子組換え株Ｓ１Ｕ１およびＳ１Ｕ１−２と野生型株（Ｓ１）および復帰株（Ｕｒ１）のコロニーの外観を示す図である。 遺伝子組換え株Ｓ１Ｕ１とその他遺伝子組換え株Ｓ１Ｕ１Ｄ１、Ｓ１Ｕ１Ｄ２、Ｓ１Ｕ１Ｄ３、Ｓ１Ｕ１Ｄ４およびＳ１Ｕ１Ｄ５の成長曲線図である。 野生型株（Ｓ１）と遺伝子組換え株Ｓ１Ｕ１の成長曲線図である。 異なる２，３−ＢＤＯ濃度でのＴＬＣ−バニリン試験の色反応を示す図である。 ＴＬＣ−バニリン試験の灰色数値曲線図である。 各遺伝子組換え株の２，３−ＢＤＯ生産平均曲線図である。 野生型株（Ｓ１）と遺伝子組換え株Ｓ１Ｕ１の、５％グルコースを含むＭ９培養液中での異なる時間での２，３−ＢＤＯ生産量を示す図である。 Ｓ１Ｕ１とその他遺伝子組換え株Ｓ１Ｕ１Ｄ１、Ｓ１Ｕ１Ｄ２、Ｓ１Ｕ１Ｄ３、Ｓ１Ｕ１Ｄ４およびＳ１Ｕ１Ｄ５の、５％グルコースを含むＭ９培養液中での異なる時間での２，３−ＢＤＯ生産量を示す図である。 Ｓ１Ｕ１とその他遺伝子組換え株Ｓ１Ｕ１Ｄ１、Ｓ１Ｕ１Ｄ２、Ｓ１Ｕ１Ｄ３、Ｓ１Ｕ１Ｄ４およびＳ１Ｕ１Ｄ５の、２，３−ＢＤＯ生産量（ｇ／Ｌ）の曲線図である。 Ｓ１Ｕ１とその他遺伝子組換え株Ｓ１Ｕ１Ｄ１、Ｓ１Ｕ１Ｄ２、Ｓ１Ｕ１Ｄ３、Ｓ１Ｕ１Ｄ４およびＳ１Ｕ１Ｄ５が、５％グルコースを含むＭ９培養液中での発酵時間が異なることを示すｐＨ値曲線図である。

以下、特定の実施形態によって、本発明の実施方法を説明するが、当業者は、本明細書に開示された以外の利点や効能を理解することができる。本発明は様々な特定の実施形態によって実施または適用することができる。本開示の精神から逸脱することなく、様々な改変および変更を行うことができる。

本文に別段の記載がない限り、本明細書および添付の特許出願の範囲で使用される単数形「ｏｎｅ」および「ｔｈａｔ」には、複数形が含まれる。

本文に別段の記載がない限り、本明細書および添付の特許出願の範囲で使用される「または」という用語は、「および／または」の意味を含む。

本文に別段の記載がない限り、本明細書および添付の特許出願の範囲で使用される「微生物」という用語は、細菌、古細菌、ウイルスまたは真菌を含む顕微鏡的な生物である。本発明に記載されている「微生物」は、「細菌」を含むものと理解する。

本発明で使用される「組換え」という用語は、互いに分離された２つのシーケンスセグメントを人工的に結合することを意味する。一般的に「組換え」という用語は、核酸、タンパク質、または微生物など多くの異なる供給源からの遺伝物質や、遺伝物質のコーディングによってコード化されることを意味する。例えば、二つ以上の異なる系統または種からの微生物などである。本発明で使用される「組換え」という用語は、微生物の突然変異した核酸やたんぱく質を意味する、それは、化学合成または遺伝子工学的技術によって得られた突然変異した内因性核酸またはタンパク質を含む。

本発明で使用される「突然変異」という用語は、菌中の核酸またはタンパク質が、その野生型または親微生物系と比較して改変されていることを意味する。いくつかの実施形態において、突然変異は、酵素をコードする遺伝子の欠失、挿入または置換を含む。他の実施形態において、突然変異は、酵素中の一つまたは多くのアミノ酸の欠失、挿入または置換を含む。

本発明で使用される「遺伝子組換え」という用語は、広義には微生物のゲノムまたは核酸の操作を意味する。遺伝子組換え方法として、異種遺伝子の発現、遺伝子またはプロモーターの挿入、削除、欠失またはサイレンシング、遺伝子発現の変更または遺伝子発現の不活性化または抑制、酵素工学、定向進化、知識ベース設計、ランダム突然変異誘導、遺伝子改変、コドン最適化などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

本発明はさらに配列表を開示しており、配列表で参照される配列は、実施方法の表１および表５に記載のプライマー配列である。

本発明では、２，３−ブタンジオールを生産する組替え微生物の一種は、ウリジン二リン酸グルコースリン酸ウラニルトランスフェラーゼ遺伝子（ｇａｌＵ）、アセチルアルコール脱水素酵素遺伝子（ａｃｏＡ）、リン酸アセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ｐｔａ）、グルコースリン酸アデノシルトランスフェラーゼ遺伝子（ｇｌｇＣ）、ラクトースデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｌｄｈＡ）、ホスホジエステラーゼ遺伝子（ｐｄｅＣ）からなるグループから選択される少なくとも３つの遺伝子が改変されたものである。その組替え微生物は微生物寄託番号ＢＣＲＣ ９１０９７９として、財団法人食品産業開発研究所に寄託したものである。

実験方法
一、菌種の培養方法
特に指定しない限り、本発明の組換え菌株の培養方法は、ルリア・ベルターニ（ＬＢ）または酵母エキスペプトン（ＹＰＤ）培地中で、室温または３０℃で約１８〜２４時間培養する。

二、全ての菌体染色体を抽出
本発明の組換え菌株を構築するため、まず初めに、標的遺伝子を含むＤＮＡフラグメントのポリメラーゼ連鎖反応により増幅するための鋳型として、全ての菌体染色体を抽出する。全ての菌体染色体の抽出方法は、長期保存を必要とする全ての菌体染色体ＤＮＡに適している。例えば、Ｑｉａｇｅｎ ＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔなどの市販の染色体抽出キットを使用することができる。詳しい抽出手順を以下に説明する。

ＬＢ培養液で４０時間（ｈ）増殖させた菌体２ ｍＬを遠心分離して収集し、６５℃に予熱した４００μＬ ＡＰ１緩衝液（４μＬＲＮａｓｅＡを含む、植物組織用ゲノム ＤＮＡ キット、Ｙｅａｓｔｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ 社）で各サンプルを再構成し、菌体を振とうにより処理し懸濁後、６５℃のウォーターバスに約５分間静置し、十分に混合するように時々反転させる。その後、１３０μＬのＰ３緩衝液を加え、十分混合して、氷の上に５分間静置し、１４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離後、上澄み液を均質な遠心分離カラム（ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒ ｓｐｉｎ ｃｏｌｕｍｎ）で吸引する。その後、２ｍＬのコレクションチューブに入れ、１４０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、濾液を新しい遠心管に移す。沈殿物がある場合は、分散させずに、ＡＷ１緩衝液を添加し、混合物をマイクロ遠心管で慎重に繰り返し吸引する。その後、約６５０μＬの混合液を抽出遠心分離カラム（ＤＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ｓｐｉｎ ｃｏｌｕｍｎ）で吸引し、２ ｍＬのコレクションチューブに入れ、８０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、ろ液を捨て、混合液が完全にろ過されるまでこの手順を繰り返す。下部のコレクションチューブを交換し、上部の遠心管（ｓｐｉｎ ｃｏｌｕｍｎ）に５００μＬのＡＷ２緩衝液を加え、８０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、ろ液を捨て、ＡＷ２緩衝液で再度洗浄する。その後、１４０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、ろ液を捨て、下部のコレクションチューブを慎重に取り外し、上部の遠心管のチューブ壁にろ液を残さないよう注意する。下部を新しい１．５ｍＬマイクロ遠心管に交換し、６５℃に予熱した１００ μＬのＡＥ緩衝液（１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．５ ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ ９．０）を加え、室温で約５分間静置した後、１４，０００ｒｐｍで１分間遠心分離すると、すべての菌体染色体の抽出が完了する。上記の方法に従い、抽出された全ゲノムＤＮＡを分光光度計で分析および定量化し、ブランク対照群にＡＥ緩衝液を用いて、各サンプルを４μＬ採取し、４００μＬＡＥ緩衝液を加えて希釈し、さらに２６０ｎｍおよび２８０ｎｍの吸光度をそれぞれ測定する。

三、ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）
本発明に記載されるポリメラーゼ連鎖反応は、当業者であれば容易に理解し適用可能な実験方法である。また、本発明のポリメラーゼ連鎖反応に用いられるポリメラーゼは、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｖｉｌｎｉｕｓ， Ｌｉｔｈｕａｎｉａ， ＵＳＡ）である。反応手順として、始めに９５℃で５分間反応させてから、以下の手順を３５〜４０回繰り返す。９５℃で３０秒〜３分（コロニーを直接テンプレートとして使用する場合は１０分まで延長）、５０〜６２℃で３０秒（グラジエント設定、または実験条件に応じて温度設定値を変更する）、７２℃で９０〜１２０秒（増幅されたフラグメントの長さに応じて１５〜３０秒／ｋｂ）。上記のサイクルの後、反応を最終的に７２℃で５〜１０分間行い、その後、４℃まで冷却する。

四、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）産物の電気泳動分析
本発明に記載されるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）産物の電気泳動分析は、当業者であれば容易に理解し適用可能な実験方法である。本発明の電気泳動分析は、ＰＣＲ産物を１０μＬ採取し、１％のアガロースゲル（ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ）で電気泳動分析（１３５Ｖ）し、臭化エチジウム（ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ，０．５μＬ／ｍＬ）で３０分間染色した後、１０分間蒸留水で脱染し、紫外線イメージングで分析および記録写真を撮る。

五、相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）遺伝子ノックアウト法
本発明は、相同組換え遺伝子ノックアウト法を用いて組換え株を構築するものであり、菌体内の内因性リコンビナーゼを用いて標的遺伝子の上流と下流の配列を相同組換えした後、カウンターセレクション（ｃｏｕｎｔｅｒ−ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）を経て、２回目の相同組換え後に改変プラスチド（抗生物質耐性遺伝子を含む）の配列が消失した組換え株を選択する。選択される組換え株の抗生物質耐性遺伝子はプラスチド消失（ｐｌａｓｍｉｄ ｌｏｓｓ）とともに消失するため、選択される組換え株は薬剤に対して耐性がないものとなる。もし２回の相同組換え後に元の野生型株の配列が染色体上に残っている場合、プラスチドの除去後、その株は復帰株（ｒｅｖｅｒｔａｎｔ）と呼ばれる野生型株に戻る。

本発明で用いる相同組換えノックアウト法は、安定であり、突然変異株を繰り返し選択することができる。カウンターセレクションのために、この相同組換え遺伝子ノックアウト法は、まず、ストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）耐性菌株を突然変異体親株としてランダムに突然変異させる必要があり、このランダム突然変異選択を行うことにより、菌株によっては生理的特性が変化する可能性がある。また、この相同組換えノックアウト法では、突然変異プロセスを進行させるために、標的遺伝子の上流および下流に約１０００ｂｐを含むフラグメントを突然変異体プラスチドに構築する必要があり、また、突然変異標的株は、接合による遺伝子伝達を成功させることができる必要がある。

例えば、図１Ａを参照されたい。相同組換えが発生する前に、野生型株（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎ）と接合完了体（ｔｒａｎｓｃｏｎｊｕｇａｎｔ）の染色体上に位置する標的遺伝子を、形質転換に用いるＤＮＡフラグメントと相同組換え後、カウンターセレクションを行い、自殺プラスチドの上流領域と下流領域の突然変異はそれぞれＡ、Ｂと表記される。続いて、図１Ｂを参照されたい。２回の相同組換えを終え、突然変異株（ｍｕｔａｎｔ ｓｔｒａｉｎ）染色体上の標的遺伝子は除去されており、ここでＫｍＲはカナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）耐性遺伝子を表す。

本発明では、相同組換え遺伝子ノックアウト法を用いて組換え株を構築する方法は以下のステップからなる。
（ａ）ストレプトマイシン天然突然変異体を選択する
（ｂ）最初の相同組換え株を選択するために接合を行う
（ｃ）２回目の相同組換え株を得るためにカウンターセレクションを行う
（ｄ）遺伝子突然変異の位置を確認する

ストレプトマイシン天然突然変異体の選択方法を以下に簡単に説明する。まず、野生型株の単一コロニーを２ｍＬのＬＢ培養液に接種し、３７℃で８時間回転培養し、その後、遠心分離して菌体を採取する。その後、生理食塩水（０．８５％ＮａＣｌ）で菌体を２回洗浄し、５００ｇ／ｍＬストレプトマイシンを含むＬＢ培地にそれぞれ均一に塗布し、３７℃で一晩静置して培養する。

続いて、本発明のストレプトマイシン天然突然変異体のコロニー図である図２を参照されたい。５００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含むＬＢ培地で生育可能なコロニーを選択する（図２の矢印は、５００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを許容できるコロニーを示す）。そして、単一のコロニーを選択し、５００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含むＬＢ培養液で培養し、−８０℃で保存する。本発明で使用するストレプトマイシンは天然突然変異体Ｓ１である。

ストレプトマイシンの天然突然変異体を取得した後、接合を行い、最初の相同組換え株を選択する。接合とは、ストレプトマイシンの天然突然変異体に突然変異体プラスチドを入れる方法であり、ドナー株とレシピエント株を適切な割合で混合し培養した後、ストレプトマイシン耐性を有するコロニーを選択し、遺伝子フラグメントが標的遺伝子部位にうまく埋め込まれているかをＰＣＲで確認することである。その後、２回目の相同組換えを行い、培養後に希釈したコロニーを１個選択し、ストレプトマイシンを含むＬＢ培地に塗布し培養する。培養後、異なるコロニーを１個選択し、カナマイシンまたはストレプトマイシン含むＬＢ培地に塗布し、一晩培養した後、ストレプトマイシンには耐性があるがカナマイシン耐性を失ったコロニーを選択し、それぞれＰＣＲ確認を行う。この時、コロニーは、２回目の相同組換えを受け、遺伝子欠失突然変異体（ｇｅｎｅ−ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｍｕｔａｎｔ）、または野生型株に回復した復帰株（ｒｅｖｅｒｔａｎｔ）として変化するため、電気泳動分析を行い、正しい遺伝子欠失突然変異体を選択する。

六、２，３−ブタンジオール（２，３−ＢＤＯ）の定量法
本発明は、細菌培養液の成分を薄膜クロマトグラフィーで分離し、バニリン（ｖａｎｉｌｌｉｎ）で着色することからなる２，３−ブタンジオール（２，３−ＢＤＯ）の特定の定量法を含む。詳細な反応条件は以下の通りである。薄層クロマトグラフィー（ｔｈｉｎ ｌａｙｅｒ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ＴＬＣ）プレート（Ｐｒｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｓｉｌｉｃａ ＴＬＣ ｐｌａｔｅ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて、５μＬのサンプルをプレートの一端に滴下し、移動相としてヘキサン：酢酸エチル：氷酢酸＝７０：３０：１．５を用いてクロマトグラフィー分析を行う。４０分後、移動相がプレートの上部に移動したら、プレートに表示剤（バニリン：硫酸：エタノール＝０．５ｇ：１ｍｌ：９ｍｌ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）をスプレーする。その後、１１０℃で５分ほど焼くと色が観察できる。試験後、２，３−ＢＤＯのみが青色を示し、グルコースは暗褐色を示し、アセチルエタノールやジアセチルなどの他のものは発色しないため、この定量法は２，３−ＢＤＯに固有のものである。

本発明は、以下の実施形態でさらに説明するが、これらの実施形態は、例示のみを目的とするため、本発明の実施に対する制限として解釈されるべきではないことを理解されたい。

＜実施例１：突然変異体プラスチドの構築＞
上記のポリメラーゼ連鎖反応により、標的遺伝子の上流と下流の約１，０００塩基対（ｂａｓｅ ｐａｉｒ，ｂｐ）のＤＮＡフラグメントが増幅される。ポリメラーゼ連鎖反応で使用したプライマー配列を表１に示す。
表１． ポリメラーゼ連鎖反応で使用されるプライマー配列

表２に示すように、上記の標的遺伝子の上流および下流のフラグメントを接合した後、自殺性プラスチドｐＫＡＳ４６を埋め込み、異なる標的遺伝子フラグメントを有する突然変異体プラスチドを構築する。ここで用いられるプラスチドの構築方法は、当該技術分野において一般的に知られている。
表２．各標的遺伝子の上流フラグメントと下流のフラグメントを結合した後、埋め込まれた自殺性プラスチド

さらに、標的遺伝子ｇａｌＵを含む突然変異体プラスチドは、中山医学大学

准教授より提供された。７１０ｂｐのｇａｌＵ遺伝子を欠失させた１．８ｋｂのＤＮＡフラグメントを含むｐＫＡＳ４６遺伝子プラスチド（ｐＹＣ０９４と命名）も提供された。

表３に示すように、標的遺伝子をｐｔａとして含む突然変異体プラスチドの構築方法は、まず、ＰＣＲにより約１７００ｂｐ増加させた部分のｐｔａ遺伝子フラグメントを利用し（使用したＰＣＲプライマー配列はｐｔａ （Ｆ）：ＴＣＴＡＧＡＣＡＴＣＴＴＣＣＡＴＣＴＧＣＡＣＧＡＣＡＣＣＣ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． ２９）とｐｔａ （Ｒ） ＧＡＡＴＴＣＡＧＴＣＧＧＣＧＴＴＧＡＴＧＴＡＧＴＴＧＧＣ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ． ３０） ）、その後、制限酵素ＫｐｎＩを用いて、このフラグメントの中央より約３００塩基対のフラグメントを切除し、自殺性プラスチドｐＫＡＳ４６（ｐＫＡＳ４６−Ｄ２と命名）を埋め込む。
表３． ｐＧ−Ｄ２とｐＫＡＳ４６−Ｄ２の比較表。

＜実施例２：組換え菌株の構築＞
実施例１における異なる標的遺伝子を有する突然変異組換えプラスチドはそれぞれ、形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）によって大腸菌Ｅ． ｃｏｌｉ Ｓ１７−１ λｐｉｒに入れられ、突然変異のための組換えプラスチドを含む大腸菌株を得る。次に、上記の相同組換え遺伝子ノックアウト法に従って、標的遺伝子を含む組換え株を構築する。

例えば、上記で得られたストレプトマイシン天然突然変異体（Ｓ１）を接合時にレシピエント株として使用し、ドナー株は、ｐＹＣ０９４突然変異の組換えプラスチドを含む大腸菌Ｅ． ｃｏｌｉ Ｓ１７−１ λｐｉｒ（カナマイシンおよびアンピシリン耐性）とし、コロニーを抗生物質を含むＬＢ培地で一晩培養する。遠心分離により菌体を採取し、生理食塩水で２回洗浄し、菌体を２：１（ドナー株：レシピエント株）で混合し遠心分離を行い、ＬＢ培地上の滅菌ニトロセルロース膜（ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ，ＮＣ ｍｅｍｂｒａｎｅ）上に均一に塗布し、３７℃で一晩培養する。その後、ニトロセルロース膜を滅菌ピンセットで採取し、約３ｍＬのＬＢ培養液が入った試験管に入れて振とうし、菌体がニトロセルロース膜からＬＢ培養液に剥離した後、１ ｍＬの再懸濁した菌液を吸引し遠心分離を行い、菌体を採取し、生理食塩水で２回洗浄後、生理食塩水で１０倍（１０倍、１００倍希釈）に希釈する。次いで、Ｍ９培地（４７ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、２２ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１８ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ、８ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１５ｍＭ ＣａＣｌ２）、ＬＢ培地（カナマイシンおよびアンピシリンを含む）およびＭ９培地（カナマイシンおよびアンピシリンを含む）にそれぞれ１００μＬの異なる希釈率の菌液を塗布し、３７℃で一晩培養する。次に、Ｍ９培地（カナマイシンとアンピシリンを含む）で生育できるコロニーを選択し、ＬＢ培地（カナマイシンとアンピシリンを含む）でそれらを精製する。この時点で、コロニーは最初の相同組換え株（ｔｒａｎｓｃｏｎｊｕｇａｎｔ）となる。続いて、ＰＣＲを用いて、遺伝子フラグメントがｇａｌＵ遺伝子の位置にうまく埋め込まれているかを確認する。

続いて、２回目の相同組換えを行う。まず、単一コロニーを選択し、一晩３７℃でＬＢ培養液中にて培養した後、一晩培養した菌液を１００倍に希釈し、ＬＢ培養液（５００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含む）に入れ、３７℃で８時間回転培養する。その後、菌液を生理食塩水配列で希釈し、５００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含むＬＢ培地に均一に塗布し、３７℃で一晩培養する。その後、異なる単一コロニーを選択し、カナマイシンまたはストレプトマイシンを含むＬＢ培地に塗布し、一晩培養した後、ストレプトマイシン耐性はあるがカナマイシン耐性を失ったコロニーを選択するためのＰＣＲ確認を行う。この時、コロニーは、２回目の相同組換えを受け、遺伝子欠失突然変異体、または野生型株に回復した復帰株（ｒｅｖｅｒｔａｎｔ）として変化するため、電気泳動分析を行い、正しい遺伝子欠失突然変異体を選択する。この遺伝子突然変異株は、ｇａｌＵ遺伝子が欠失した組換え株である。

例えば、ｐ０３２に対してＰＣＲプライマーを使用する。

表４に示すように、ＧＣＣＧＡＧＣＴＣＡＣＴＣＴＴＧＣＡＴＧＧＡＴＧＧＣＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１７）およびｐ０４２：ＧＴＣＡＧＣＴＧＡＡＴＴＴＣＡＴＣＡＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１８）をｇａｌＵ遺伝子フラグメントに対してＰＣＲし、次いで１Ｘ ＴＡＥ（トリス塩基、酢酸、およびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））緩衝液を用いて１％のコロイドを作成する。２回目の相同組換え後に選択される菌株から採取した標的遺伝子フラグメントの大きさを解析するため、９０Ｖで４０分間電気泳動を行う。図３に示すように、２から６の番号が付けられた５つのコロニーは遺伝子欠損突然変異株である（Ｓ１Ｕ１と命名）。１から７と１３の番号が付けられたコロニーは復帰株である。Ｍは１ ｋｂのＤＮＡラダー、Ｗは一晩培養したＳ１株のゲノムＤＮＡの増幅結果、ＰはｐＹＣ０９４プラスチドＤＮＡの増幅結果である。ここで、矢印で示した位置は、それぞれ野生型株と突然変異株のフラグメントをＰＣＲで増幅させた結果である。実施例１で得た異なる標的遺伝子突然変異に対応するプラスチドを含む菌株を、接合におけるレシピエント株またはドナー株として用いることにより、上記のような相同組換えノックアウト法における接合および選択することができ、１種または複数の標的遺伝子改変を含む組換え株を構築することができる。
表４． 異なる標的遺伝子の突然変異に使用されるプラスチドの菌株と接合におけるレシピエント株と、接合と選択により構築される組換え菌株

上記のようにＳ１Ｕ１Ｄ１、Ｓ１Ｕ１Ｄ２、Ｓ１Ｕ１Ｄ３、Ｓ１Ｕ１Ｄ４およびＳ１Ｕ１Ｄ５の組換え株を選択した後、ＰＣＲにより標的遺伝子フラグメントを増幅させた際に使用したＰＣＲプライマーを表５に示す。
表５． 各ＰＣＲプライマー配列と配列番号

上記のように、ＰＣＲ産物フラグメントのサイズを電気泳動で分析し、結果をそれぞれ図４〜８に示す。

ＲＴ−ＰＣＲを使用してＳ１Ｕ１遺伝子を発現した本発明の別の電気泳動図については、図４を参照されたい。フラグメントサイズが約１０９４ｂｐの７つのコロニー（番号１、６、７、１０、１３、１７、１９）は遺伝子欠損突然変異体であり、フラグメントサイズが約２０４８ｂｐの１５つのコロニー（番号２〜５、８〜９、１１〜１２、１４〜１６、１８、２０〜２２）は復帰株である。Ｍは１ ｋｂのＤＮＡラダー、Ｗは一晩培養したＳ１Ｕ１株のゲノムＤＮＡの増幅結果、ＰはｐＫＡＳ４６−Ｄ１プラスチドＤＮＡの増幅結果である。

ＲＴ−ＰＣＲを使用してＳ１Ｕ１Ｄ２遺伝子を発現した本発明の電気泳動図については、図５を参照されたい。フラグメントサイズが約１４５３ｂｐの２つのコロニー（番号３、１２）は遺伝子欠損突然変異体であり、フラグメントサイズが約１７５８ｂｐの２０つのコロニー（番号１〜２、４〜１１、１３〜２２）は復帰株である。Ｍは１ ｋｂのＤＮＡラダー、Ｗは一晩培養したＳ１Ｕ１株のゲノムＤＮＡの増幅結果、ＰはｐＫＡＳ４６−Ｄ２プラスチドＤＮＡの増幅結果である。

ＲＴ−ＰＣＲを使用してＳ１Ｕ１Ｄ３遺伝子を発現した本発明の電気泳動図については、図６を参照されたい。フラグメントサイズが約１０８３ｂｐの１６つのコロニー（番号１、３〜５、７〜８、１０、１２〜１３、１５〜２１）は遺伝子欠損突然変異体であり、フラグメントサイズが約２３３７ｂｐの６つのコロニー（番号２、６、９、１１、１４、２２）は復帰株である。Ｍは１ ｋｂのＤＮＡラダー、Ｗは一晩培養したＳ１Ｕ１株のゲノムＤＮＡの増幅結果、ＰはｐＫＡＳ４６−Ｄ３プラスチドＤＮＡの増幅結果である。

ＲＴ−ＰＣＲを使用してＳ１Ｕ１Ｄ４遺伝子を発現した本発明の電気泳動図については、図７を参照されたい。フラグメントサイズが約１０８３ｂｐの１６つのコロニー（番号１、３〜５、７〜８、１０、１２〜１３、１５〜２１）は遺伝子欠損突然変異体であり、フラグメントサイズが約２３３７ｂｐの６つのコロニー（番号２、６、９、１１、１４、２２）は復帰株である。Ｍは１ ｋｂのＤＮＡラダー、Ｗは一晩培養したＳ１Ｕ１株のゲノムＤＮＡの増幅結果、ＰはｐＫＡＳ４６−Ｄ３プラスチドＤＮＡの増幅結果である。

ＲＴ−ＰＣＲを使用してＳ１Ｕ１Ｄ５遺伝子を発現した本発明の電気泳動図については、図８を参照されたい。フラグメントサイズが約６００ｂｐの２１つのコロニー（番号１〜１２、１４〜２２）は遺伝子欠損突然変異体であり、フラグメントサイズが約２５５１ｂｐのコロニー（番号１３）は復帰株である。Ｍは１ ｋｂのＤＮＡラダー、Ｗは一晩培養したＳ１Ｕ１株のゲノムＤＮＡの増幅結果、ＰはｐＫＡＳ４６−Ｄ５プラスチドＤＮＡの増幅結果である。

組換え遺伝子菌株のコロニーの外観を観察すると、図９に示すように、遺伝子組み換え株Ｓ１Ｕ１およびＳ１Ｕ１−２は、未改変の親株Ｓ１と比較して、莢膜多糖類の合成に重要な遺伝子ｇａｌＵがないため、コロニーは明らかに小さくなり、Ｕｒ１復帰株のコロニー成長の様子は、親株Ｓ１の成長の様子と似ている。

＜実施例３：組換え株の成長の比較＞
野生型株Ｓ１および実施例２の組換え株６株（Ｓ１Ｕ１、Ｓ１Ｕ１Ｄ１、Ｓ１Ｕ１Ｄ２、Ｓ１Ｕ１Ｄ３、Ｓ１Ｕ１Ｄ４、およびＳ１Ｕ１Ｄ５）を、それぞれ５％グルコースを含むＭ９培地中で、２００ｒｐｍ、３０℃のインキュベーターで振盪し培養した。２時間ごとに菌液のＯＤ５９５吸光度を測定した。成長曲線は図１０に示す。組換え株Ｓ１Ｕ１、Ｓ１Ｕ１Ｄ１、Ｓ１Ｕ１Ｄ２、Ｓ１Ｕ１Ｄ３、およびＳ１Ｕ１Ｄ４の成長速度に大きな差はなく、組換え株Ｓ１Ｕ１Ｄ５の成長速度だけが最初の３０時間では他の菌株に比べてわずかに遅いが、３０時間後の成長速度は同程度である。また、図１１に示すように、野生型株Ｓ１とＳ１Ｕ１の成長曲線には大きな差はなく、Ｓ１Ｕ１のみが成長後期（４時間以上）にわずかに遅れているが、これによって組換え株の成長速度は、それに含まれる遺伝子組換えの影響を受けていないことを示す。

＜実施例４：組換え株によって生産されたポリオールの収量の比較＞

２，３−ＢＤＯの異なる濃度（１０ｍＭ、２５ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ、２００ｍＭ、３００ｍＭ、４００ｍＭ、５００ｍＭ）を用いてＴＬＣ−バニリン試験を行い、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを用いて画像をグレースケールに変換し（図１２）、Ｅｘｃｅｌで回帰曲線を描き（図１３）、この回帰曲線を標準曲線として使用し、各突然変異体の２，３−ＢＤＯ生産量を算出した。

各遺伝子の組換え株を、３０℃で５％グルコースを含むＭ９培地で培養し、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間ごとにサンプルを採取した後、遺伝子組換え株の２，３−ＢＤＯ生産量を、ＴＬＣ−バニリン法で分析した結果を図１４Ａおよび図１４Ｂに示す。図１４Ａおよび図１４ＢのＴＬＣ−バニリン分析で得た結果を、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアで定量し、表６に示した後、曲線で表した（図１５）。
表６． Ｓ１Ｕ１およびその他の遺伝子組換え株Ｓ１Ｕ１Ｄ１、Ｓ１Ｕ１Ｄ２、Ｓ１Ｕ１Ｄ３、Ｓ１Ｕ１Ｄ４、およびＳ１Ｕ１Ｄ５の、異なる時間での２，３−ＢＤＯ生産量

図１５と表６に示すように、Ｓ１Ｕ１の２，３−ＢＤＯの生産量は約６０時間後から減少するが、Ｓ１Ｕ１Ｄ１の２，３−ＢＤＯの生産量は約９０時間まで緩やかに増加し続ける。遺伝子組換え株Ｓ１Ｕ１Ｄ２、Ｓ１Ｕ１Ｄ３、Ｓ１Ｕ１Ｄ４、Ｓ１Ｕ１Ｄ５の２，３−ＢＤＯ生産量はＳ１Ｕ１と比較して大幅に増加し、培養初期から明らか多くの２，３−ＢＤＯを生産することができ、９６時間まで生産し続ける。ここで、遺伝子組換え株Ｓ１Ｕ１Ｄ２、Ｓ１Ｕ１Ｄ３、Ｓ１Ｕ１Ｄ４、Ｓ１Ｕ１Ｄ５は４８時間培養後に５．７７〜６．１６ｇ／Ｌの２，３−ＢＤＯを生産し、Ｓ１Ｕ１の３．０１ｇ／Ｌと比較して９１．７〜１０５％の増加を示した。さらに、７２から９６時間後には、７．０８〜７．８６ｇ／Ｌの２，３−ＢＤＯを生産し、Ｓ１Ｕ１の３．０１ｇ／Ｌと比較して１１７〜１４０％の増加を示した。

＜実施例５：組換え菌株の発酵ｐＨ値の比較＞
各遺伝子組換え株を、５％グルコースを含むＭ９培養液に３０℃で培養し、菌液のｐＨ値をサンプリングして測定した結果を図１６に示す。結果として、最初の６時間の培養では、菌株間のｐＨ値に明らかな差はないが、菌株培養の２４時間頃から、明かなｐＨ値に差が現われる。また、Ｓ１Ｕ１Ｄ３およびＳ１Ｕ１Ｄ２のｐＨ値は、平均して最も高いｐＨ５以上であるのに対し、Ｓ１Ｕ１は最も低くｐＨ４以下であることから、組換え株は発酵環境の酸性化を遅らせる効果があることを示している。

図１６に示すように、すべての株のｐＨ値は、菌株培養４８時間後には３から４に低下する。上記の図１５、１６および表６に示すように、遺伝子組換え株Ｓ１Ｕ１Ｄ２、Ｓ１Ｕ１Ｄ３、Ｓ１Ｕ１Ｄ４、およびＳ１Ｕ１Ｄ５は、低ｐＨ酸性発酵環境の影響を受けず、低ｐＨ酸性発酵環境下でも２，３−ＢＤＯを高い収率で生産することができる。例えば、遺伝子組換え株Ｓ１Ｕ１Ｄ２、Ｓ１Ｕ１Ｄ３、Ｓ１Ｕ１Ｄ４、およびＳ１Ｕ１Ｄ５は４８時間の培養後、発酵環境のｐＨ値がｐＨ ４未満に低下しても、生産量はＳ１Ｕ１株よりも著しく高く、２，３−ＢＤＯを５．７７〜６．１６ｇ／Ｌ生産する。さらに、７２時間および９６時間まで高い生産量を示し、２，３−ＢＤＯの生産量は７．０８〜７．８６ｇ／Ｌとなり、これはＳ１Ｕ１株の生産量の２倍以上である。

しかしながら、上記は本発明の実施例の中でもより好ましい例に過ぎず、本発明の実施範囲を限定するものではない。すなわち、特許出願の範囲および本発明の説明に従って行われた全ての単純な同等の変更および改変は、本発明の範囲内に留まるものとする。

台湾（ＴＷ）、財団法人食品産業開発研究所生物資源保存研究センター、寄託日は１０９年３月２０日、寄託番号はＢＣＲＣ９１０９７９である。

Claims (1)

1. ２，３−ブタンジオールを生産する組換え微生物であって、２，３−ブタンジオールを生産する当該組換え微生物はクレブシエラ属菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐ．）であり、酸性環境でも２，３−ブタンジオールを生産することができ、
   ２，３−ブタンジオールを生産する当該組換え微生物は、少なくとも、ウリジン二リン酸グルコースリン酸ウラニルトランスフェラーゼ遺伝子（ｇａｌＵ）と、アセチルアルコール脱水素酵素遺伝子（ａｃｏＡ）と、リン酸アセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ｐｔａ）が改変され、当該改変は欠失である。

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