CN112094791A - 一种生产2,3-丁二醇的重组微生物及其制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种生产2,3‑丁二醇的非天然微生物，其中所述微生物包含一或多种遗传修饰，本发明另外提供一种使用所述多个微生物生产2,3‑丁二醇的方法。

Description

一种生产2,3-丁二醇的重组微生物及其制造方法
技术领域
本发明涉及一种通过基因重组的微生物，以提高所述微生物2,3-丁二醇的生产能力，另外，本发明亦涉及一种利用基因重组的微生物进行酦酵反应，以生产2,3-丁二醇的方法。
背景技术
2,3-丁二醇为多元醇的一种，是重要的化工原料和液体燃料，其应用的范围相当广泛，包括在化工、能源、食品以及航太等不同的领域，均有诸多不同的用途。举例而言，在燃料产业中，2,3-丁二醇可以与汽油混合，作为辛烷值提升剂，亦可直接作为一种液体燃料。在化工产业中，2,3-丁二醇具有非常低的凝固点，可作为抗冻剂；而作为多用途的化工原料，2,3-丁二醇可通过简单的反应转化为1,3-丁二烯，可作为合成橡胶及合成树脂的原料，或转化为甲基乙基酮，除可用作燃料添加剂及溶剂外，亦常作为低沸点溶剂，可广泛使用于粘结剂、涂料、燃料、润滑剂和油墨等不同的行业。在食品产业中，2,3-丁二醇亦可转化为2,3-丁二酮(联乙酰)或乙酰乙醇(乙偶姻)，作为风味剂或天然食用香料使用，二者均广泛应用在食品工业中。
目前用于生产2,3-丁二醇的方法主要有化学法和生物酦酵法两大类。化学法以传统石油化工方法进行裂解提炼，以非再生性的化石原油做为原料，由于裂解提炼过程需高温高压，因而导致严重污染；相较于此，生物酦酵法以可再生性的生质原料为基础，并以微生物进行酦酵方式进行生产，其原料及生产方式均对环境友善，较符合现今国际社会对于工业在环保和永续发展上的诉求，鉴于此类环保和可永续发展的技术领域已成为趋势，也是世界各国目前正积极投入发展的领域。
然而，虽然已知2,3-丁二醇可通过多种细菌进行酦酵生产，其中包括克雷白氏菌属(Klebsiella)、肠杆菌属(Enterobacter)、杆菌属(Bacillus)、锯杆菌属(Serratia)等，但历经各种针对酦酵条件的优化，如温度、pH值、氧浓度等，和微生物酦酵能力的改良，以微生物酦酵生产2,3-丁二醇仍然有低生产率的问题，因此，以生物酦酵法生产2,3-丁二醇的成本仍居高不下。
此外，上述用于酦酵生产2,3-丁二醇的微生物多具有致病性，在各地卫生管理机关均有依各种微生物的致病能力进行分级下，于使用此等微生物的操作过程中，均需符合相对应的规定。此等有关操作过程中的规定及潜在的致病风险，更进一步增加了以生物酦酵法生产2,3-丁二醇的成本。
有鉴于此，本领域仍需一种安全且产率高的方法进行2,3-丁二醇的酦酵生产，以进一步降低以生物酦酵法生产2,3-丁二醇的成本。
发明内容
因此，本发明的目的在于提供一种具有2,3-丁二醇生产能力的重组微生物，其中至少三种选自于由尿苷二磷酸葡萄糖磷酸尿甘酰转移酶基因(galU)、乙酰乙醇去氢酶基因(acoA)、磷酸乙酰转移酶基因(pta)、葡萄糖磷酸腺苷酰转移酶基因(glgC)、乳糖去氢酶基因(ldhA)和磷酸二酯酶基因(pdeC)所组成群组的基因被修饰。
于一具体实施例中，本发明公开一种重组微生物包括尿苷二磷酸葡萄糖磷酸尿甘酰转移酶基因、乙酰乙醇去氢酶基因和磷酸乙酰转移酶基因被修饰。于另一具体实施例中，本发明公开一种重组微生物包括尿苷二磷酸葡萄糖磷酸尿甘酰转移酶基因、乙酰乙醇去氢酶基因、磷酸乙酰转移酶基因和葡萄糖磷酸腺苷酰转移酶基因被修饰。于再另一具体实施例中，本发明公开一种重组微生物包括尿苷二磷酸葡萄糖磷酸尿甘酰转移酶基因、乙酰乙醇去氢酶基因、磷酸乙酰转移酶基因、葡萄糖磷酸腺苷酰转移酶基因和乳糖去氢酶基因被修饰。于再另一具体实施例中，本发明公开的重组微生物包括尿苷二磷酸葡萄糖磷酸尿甘酰转移酶基因、乙酰乙醇去氢酶基因、磷酸乙酰转移酶基因、葡萄糖磷酸腺苷酰转移酶基因、乳糖去氢酶基因和磷酸二酯酶基因被修饰。
本发明所提供重组微生物的基因是通过修饰，其中所述修饰包括抑制、删除、或静默。于一具体实施例中，本发明所提供重组微生物的基因修饰为删除。
本发明公开的重组微生物相较于未通过修饰的微生物具有提高的2,3-丁二醇生产能力。
本发明公开的重组微生物相较于未通过修饰的微生物，在相同培养时间内生产较多的2,3-丁二醇。
于另一具体实施例中，本发明公开的重组微生物相较于未通过修饰的微生物可持续生产2,3-丁二醇的时间较长，如可持续生产2,3-丁二醇至少50个小时、至少60个小时、至少70个小时、至少80个小时、或至少90个小时。
本发明公开的重组微生物相较于未通过修饰的微生物具有提高的安全性。
于另一具体实施例中，本发明公开的重组微生物与未通过修饰的微生物具有实质上同等的生长能力。于再另一具体实施例中，本发明公开的重组微生物可在酸性环境下生产2,3-丁二醇。
本发明公开的重组微生物属于克雷白氏菌属(Klebsiella)。
本发明还公开一种制造2,3-丁二醇的方法，包含：培养如本发明所提供的重组微生物；以及从培养液中分离取得2,3-丁二醇。
附图说明
图1A显示野生株(wild-type strain)及转形菌株(transconjugant)的染色体上，目标基因与通过转形重组用的DNA片段进行同源重组的示意图。
图1B显示经过两次同源重组后，染色体上的目标基因经去除的突变株(mutantstrain)的示意图。
图2显示链霉素自然突变株的菌落图。
图3显示利用RT-PCR表现S1U1基因的电泳图。
图4显示利用RT-PCR表现S1U1D1基因的另一电泳图。
图5显示利用RT-PCR表现S1U1D2基因的电泳图。
图6显示利用RT-PCR表现S1U1D3基因的电泳图。
图7显示利用RT-PCR表现S1U1D4基因的电泳图。
图8显示利用RT-PCR表现S1U1D5基因的电泳图。
图9显示基因重组菌株S1U1及S1U1-2与野生株(S1)和回复株(Ur1)的菌落外观示意图。
图10显示基因重组菌株S1U1及其他基因重组菌株S1U1D1、S1U1D2、S1U1D3、S1U1D4及S1U1D5的生长曲线图。
图11显示野生株S1与基因重组菌株S1U1的生长曲线图。
图12显示不同2,3-BDO浓度进行TLC-香草醛测试的呈色反应的示意图。
图13A显示TLC-香草醛测试的灰色值曲线图。
图13B显示各基因重组菌株的2,3-BDO产量的标准曲线图。
图14A显示野生株S1与基因重组菌株S1U1在含有5％葡萄糖的M9培养液中不同时间的2,3-BDO产量的示意图。
图14B显示S1U1与其他基因重组菌株S1U1D1、S1U1D2、S1U1D3、S1U1D4及S1U1D5在含有5％葡萄糖的M9培养液中不同时间的2,3-BDO产量的示意图。
图15显示S1U1与其他基因重组菌株S1U1D1、S1U1D2、S1U1D3、S1U1D4及S1U1D5的2,3-BDO产量(g/L)的曲线图。
图16显示S1U1与其他基因重组菌株S1U1D1、S1U1D2、S1U1D3、S1U1D4及S1U1D5在含有5％葡萄糖的M9培养液中酦酵不同时间的pH值曲线图。
图例说明：
<本发明>
无
具体实施方式
以下是通过特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟习此技艺的人士可由本说明书所公开的内容了解本发明的其他优点与功效。本发明也可通过其他不同的具体实施例加以施行或应用，本发明中的各项细节亦可基于不同观点与应用，在不悖离本发明的精神下进行各种修饰与变更。
除非文中另有说明，否则说明书及所附申请专利范围中所使用的单数形式「一」及「所述」包括多个体。
除非文中另有说明，否则说明书及所附申请专利范围中所使用的术语「或」包括「及/或」的含义。
除非文中另有说明，否则说明书及所附申请专利范围中所使用的术语「微生物」属于微观生物体，包括细菌、古细菌、病毒或真菌等。如于本发明中所述，「微生物」的引述应理解为涵盖「细菌」。
本发明中所使用的术语「重组」是指以人工方式组合两个彼此分离的序列片段。一般而言，术语「重组」是指核酸、蛋白质或微生物含有源自于多个不同来源的遗传物质，或由源自于多个不同来源的遗传物质编码，诸如源自于两种或更多种不同品系或物种的微生物。如本发明中所使用，术语「重组」亦可用于描述微生物包括突变核酸或蛋白质，其包括通过例如化学合成或通过以基因工程技术操作所得到包含突变形式的内源性核酸或蛋白质。
本发明中所使用的术语「突变」是指细菌中的核酸或蛋白质相较于其野生型或亲本微生物是已经过修饰。在一些实施例中，突变可为编码酶的基因的缺失、插入或取代。在其他实施例中，突变可为酶中的一或多种胺基酸的缺失、插入或取代。
本发明中所使用的术语「基因修饰」广泛地指对微生物的基因组或核酸的操作。基因修饰的方法包含例如异源基因的表现、基因或启动子的插入、缺失、删除或静默、更改基因的表现或基因表现的不活化或抑制、酶工程、定向进化、基于知识的设计、随机突变诱发、基因改组及密码子最佳化，但不以上述为限。
本发明中还另公开一个序列表，所述序列表内所提的序列是指具体实施方式的表1与表5所述的引子序列。
本发明的一种生产2,3-丁二醇的重组微生物，其中至少三种选自于由尿苷二磷酸葡萄糖磷酸尿甘酰转移酶基因(galU)、乙酰乙醇去氢酶基因(acoA)、磷酸乙酰转移酶基因(pta)、葡萄糖磷酸腺苷酰转移酶基因(glgC)、乳糖去氢酶基因(ldhA)和磷酸二酯酶基因(pdeC)所组成群组的基因被修饰。
实验方法：
一、菌种培养方法
本发明中构筑重组菌株的菌种培养方法除非特别说明，菌种通常于室温或30℃培养在Luria-Bertani(LB)或Yeast Extract Peptone(YPD)培养基，培养时间约18至24小时。
二、抽取全菌体染色体
本发明中构筑重组菌株的步骤首先为抽取全菌体染色体，以作为聚合酶链锁反应增幅含目标基因的DNA片段的模板。全菌体染色体的抽取方法应为适合制备需长期保存的全菌体染色体DNA。例如，可以使用市面上的染色体抽取套组，如Qiagen DNeasy PlantMini Kit，详细的抽取步骤于以下说明。
首先，离心收集于LB培养液生长40小时(h)的菌体2mL，接着将每个样品复溶于预先加热至65℃的400μL AP1缓冲液(内含4μL RNaseA，Genomic DNA Kit for PlantTissues,Yeastern Biotech Co.,Ltd.)，通过震荡处理菌体，并于悬浮后置于65℃水浴槽约5分钟，偶尔翻转混匀。随后加入130μL的P3缓冲液，翻转混匀后静置于冰上5分钟，再以14,000rpm离心5分钟，将上清液吸取至均质离心管柱(QIAshredder spin column)，并置于2mL收集管中，以14000rpm离心2分钟，将过滤液移至新离心管，若有沉淀物不要打散，随后加入AW1缓冲液，以微量离心管小心反复吸取混匀，再吸取约650μL的混合液至萃取离心管柱(DNeasy Mini spin column)，并置于2mL的收集管，以8000rpm离心1分钟，倒掉过滤液，重复此步骤直到混合液全部过滤完毕。将下方收集管换新，上方离心管(spin column)加入500μL的AW2缓冲液，以8000rpm离心1分钟，倒掉过滤液，再重复以AW2缓冲液冲洗一次，并以14000rpm离心2分钟，倒掉过滤液，小心移除下方收集管，并尽可能不要使过滤液残留在上方离心管的管壁，下方则换成新的1.5mL微量离心管，此时加入100μL预热至65℃的AE缓冲液(10mM Tris-HCl，0.5mM EDTA，pH 9.0)，静置于室温约5分钟后，以14,000rpm离心1分钟，即完成全菌体染色体抽取。依照上述方法，将抽取的全基因体DNA以分光光度计分析并定量，其中空白对照组使用AE缓冲液，每个样品则取4μL，加入400μL的AE缓冲液稀释后，再分别测量260nm及280nm的吸光值。
三、聚合酶链锁反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)
本发明所述的聚合酶链锁反应为本领域具有普通技术人员所能轻易理解而应用的实验方法。而本发明中的聚合酶链锁反应所使用的聚合酶为Phusion High FidelityDNA Polymerase(Thermo Scientific,Vilnius,Lithuania,USA)。反应的步骤设置为：先于95℃反应5分钟，接下来重复35至40个以下的循环：95℃反应30秒至3分钟(若以菌落直接作为模版，则延长为10分钟)、50至62℃(使用梯度设定，或依照实验需求改变温度设定值)反应30秒，72℃反应90至120秒(或依增幅片段的长度以15至30秒/kb设置)。上述循环结束后，最后于72℃反应5至10分钟，再降温至4℃。
四、聚合酶链锁反应(PCR)产物的电泳分析
本发明所述的聚合酶链锁反应(PCR)产物的电泳分析为本领域具有普通技术人员所能轻易理解而应用的实验方法。而本发明中的电泳分析是取10μL的PCR产物以1％洋菜琼脂凝胶(agarose gel)进行电泳分析(135V)，先以溴化乙锭(ethidium bromide,0.5μL/mL)染色30分钟，再以一次水(蒸馏水)退染10分钟，并以UV光显像分析及拍照记录。
五、同源重组(homologous recombination)基因剔除方法
本发明是使用同源重组基因剔除方法构筑重组菌株，同源重组基因剔除方法是利用菌体的内源重组酶，将目标基因上下游的序列进行同源重组，再通过反向筛选(counter-selection)过程，选择经过第二次同源重组后，失去改造用质体序列(含抗生素抗性基因)的重组菌株，由于筛选后的菌株抗生素抗药性基因随质体剔除(plasmid loss)后消失，因此筛选后的菌株不具抗药性。若原始野生株序列经过两次同源重组后仍留在染色体上，则经过质体剔除后，菌株将回复成为野生株，此称为回复株(revertant)。
本发明所使用的同源重组基因剔除方法具稳定性，并可重复筛选突变株。为了反向筛选，此同源重组基因剔除方法必须先随机突变筛选链霉素(streptomycin)抗药性菌株，以作为突变用母株，此随机突变筛选过程可能改变部份菌株生理特性。此外，此同源重组基因剔除方法包括将含有目标基因上下游各约1000bp的片段构筑至突变用质体，才能进行突变流程，且突变目标菌株也必须能够成功通过接合作用接受基因传递。
举例说明：请参阅图1A，于同源重组发生前，将位在野生株(wild-type strain)及转形菌株(transconjugant)染色体上的目标基因与通过转形重组用的DNA片段进行同源重组，再通过反向筛选，在此，突变用位于自杀质体上的上、下游区域分别以A、B表示，接续，请参阅图1B，经过两次同源重组后，突变株(mutant strain)染色体上的目标基因经去除，在此，KmR表示卡那霉素(kanamycin)抗药性基因。
本发明使用同源重组基因剔除方法构筑重组菌株，所述方法包括以下步骤：(a)筛选链霉素自然突变株、(b)进行接合作用以挑选第一次同源重组菌株、(c)反向筛选取得第二次同源重组菌株以及(d)确认基因突变位置。
筛选链霉素自然突变株的方法简述如下。首先，将野生株的单一菌落接种于2mL的LB培养液，于37℃旋转培养8小时，再离心收集菌体，并以生理食盐水(0.85％的NaCl)清洗菌体两次，再将菌体分别均匀涂抹在含有500μg/mL链霉素的LB培养基，并于37℃隔夜静置培养。
接续，请参阅图2，为本发明的链霉素自然突变株的菌落图。挑选可生长于含有500μg/mL链霉素的LB培养基的菌落(图2中箭头所指为能耐受500μg/mL链霉素的菌落)。并挑选单一菌落，然后培养于含有500μg/mL链霉素的LB培养液，再将菌种保存于－80℃，在此本发明中所使用的链霉素为自然突变株S1。
获得链霉素自然突变株后，进行接合作用，并挑选第一次同源重组菌株。接合作用是一种将突变用质体送入链霉素自然突变株的方法，包括将给予株(donor)和接收株(recipient)以适当比例混和后进行培养，再挑选具有链霉素抗性的菌落，并以PCR确认基因片段是否成功嵌入目标基因位置。接者进行第二次同源重组，挑选单一菌落进行培养后稀释，并涂抹在含有链霉素的LB培养基上，培养后挑选不同单一菌落，分别涂抹在含有卡那霉素或链霉素的LB培养基上，隔夜培养后挑选可耐受链霉素但失去卡那霉素抗性的菌落，分别进行PCR确认，此时菌落经过第二次同源重组，可能为基因缺失突变株(gene-deletionmutant)，或者回复成野生株的回复株(revertant)，接着以电泳分析并选择正确的基因缺损突变株。
六、2,3-丁二醇(2,3-BDO)定量方法
本发明包含对2,3-丁二醇(2,3-BDO)专一地进行定量，包括以薄膜层析法将细菌培养液的成分分开，再以香草醛(vanillin)呈色。详细的反应条件如下：使用薄层层析(thin layer chromatography，TLC)平板(Pre-activated silica TLC plate，Sigma-Aldrich)，将5μL样品滴于平板的一端，再利用己烷：醋酸乙酯：冰醋酸＝70：30：1.5作为移动相，进行色层分析。40分钟后，当移动相接近平板顶端时，将平板喷上显示剂(香草醛：硫酸：乙醇＝0.5g：1ml：9ml；Sigma-Aldrich)。随后于110℃烘烤5分钟，即可观察到颜色出现。经过测试后，只有2,3-BDO呈现蓝色，而葡萄糖呈现深褐色，其他如乙酰乙醇与双乙酰均无颜色产生，因此本定量方法对2,3-BDO具有专一性。
本发明将就下面的实施例来做进一步说明，但应了解的是，所述多个实施例仅是供例示说明用，而不应被解释为本发明的实施上的限制。
《实施例1：构筑突变用质体》
以上述的聚合酶链锁反应增幅目标基因的上下游约1,000碱基对(base pair，bp)的DNA片段，聚合酶链锁反应中所使用的引子序列如表1所示。
表1.聚合酶链锁反应中所使用的引子序列。
引子名称 引子序列 SEQ ID NO.
acoA_up(F) ATGAATTCTGAAGCGATCTTCATGCCC SEQ ID NO.1
acoA_up(R) ATTCTAGAAAGGTCACCCAGGCGGG SEQ ID NO.2
acoA_down(F) ATTCTAGACGCTGCCTACCCGGCTC SEQ ID NO.3
acoA_down(R) ATGATATCAGCACTTGACGGACGGC SEQ ID NO.4
glgC_up(F) ATGAATTCACTGTTCGAGGCTATCCGC SEQ ID NO.5
glgC_up(R) ATGGTACCCGGATCGTTTTTTTCAAGC SEQ ID NO.6
glgC_down(F) ATGGTACCAAACAGGAGCGCTAATGC SEQ ID NO.7
glgC_down(R) ATTCTAGAGCCCACTTTGCCTGGATGT SEQ ID NO.8
ldhA_up(F) ATGATATCTAAGACGCGGGCTCTCCTG SEQ ID NO.9
ldhA_up(R) ATGGTACCCCGCGATTTTCATAAGACT SEQ ID NO.10
ldhA_down(F) ATGGTACCCTGATCAGCATTTCGGAGA SEQ ID NO.11
ldhA_down(R) ATGAATTCTACTTCCCCTCTCGACGCC SEQ ID NO.12
pdeC_up(F) TATCTAGAGGCTGCAGAAAACGAAAAAGC SEQ ID NO.13
pdeC_up(R) TAGGATCCACCATTTCCGTTTTTTGC SEQ ID NO.14
pdeC_down(F) ATGGATCCCTCTACAAGCGCGGCGTAC SEQ ID NO.15
pdeC_down(R) ATGAATTCCTCGCCTGCAGACAAAAC SEQ ID NO.16
将以上所得的目标基因上下游片段接合后嵌入自杀性质体pKAS46，以构筑带有不同目标基因片段的突变用质体，如表2所示。此处使用的质体构筑的方法为本技术领域中一般公知技术。
表2.各目标基因上下游片段接合后，所嵌入的自杀性质体。
Figure BDA0002472160570000081
Figure BDA0002472160570000091
另外，包含目标基因为galU的突变用质体则由中山医学大学赖怡琪副教授所提供，即包含带有通过删除710bp的galU基因且全长为1.8kb的DNA片段的pKAS46基因选殖质体，命名为pYC094。
包含有目标基因为pta的突变用质体的构筑方式为先利用PCR增幅约1700bp的部分pta基因片段(使用的PCR引子序列为pta(F)：TCTAGACATCTTCCATCTGCACGACACCC(SEQ IDNO.29)以及pta(R)GAATTCAGTCGGCGTTGATGTAGTTGGC(SEQ ID NO.30))，并以限制酶KpnI将此片段中间切除约300个碱基对的片段后，再接入自杀性质体pKAS46(命名为pKAS46-D2)，如表3所示。
表3.pG-D2及pKAS46-D2比较表。
Figure BDA0002472160570000092
《实施例2：构筑重组菌株》
将实施例1中带有不同目标基因的突变用重组质体，各自以转形作用(transformation)送入大肠杆菌E.coli S17-1λpir中，所得到包含突变用重组质体的大肠杆菌菌株，再依照上述的同源重组基因剔除方法构筑包含目标基因的重组菌株。
举例而言，使用上述所得的链霉素自然突变株(S1)做为接合作用中的接收株，给予株则为含有pYC094突变用重组质体的E.coli S17-1λpir(可耐受卡那霉素和胺苄青霉素(ampicillin))，将菌落隔夜培养于含有适当抗生素的LB培养液，离心收集菌体后，分别以生理食盐水清洗菌体两次，再将菌体以2：1混合(给予株：接受株)，离心之后均匀涂抹在置于LB培养基上的无菌硝化纤维膜(nitrocellulose membrane，NC membrane)上，于37℃隔夜静置培养，之后将硝化纤维膜以无菌镊子夹起，放入含有约3mL的LB培养液试管中震荡，待菌体自硝化纤维膜脱离至LB培养液后，吸取1mL的再悬浮菌液，通过离心后收集菌体，以生理食盐水清洗菌体两次，再将菌体以10倍序列稀释(10倍与100倍稀释)于生理食盐水，接着分别将100μL不同稀释倍率的菌液涂抹在M9培养基(47mM Na2HPO4，22mM KH2PO4，18mMNH4Cl，8mM NaCl，2mM MgSO4，0.15mM CaCl2)、LB培养基(含卡那霉素和胺苄青霉素)及M9培养基(含卡那霉素和胺苄青霉素)，于37℃隔夜静置培养。之后挑选可于M9培养基(含卡那霉素和胺苄青霉素)生长的菌落，并于LB培养基(含卡那霉素和胺苄青霉素)纯化，此时菌落为第一次同源重组接合菌株(transconjugant)。随后以PCR方式确认基因片段是否成功嵌入galU基因位置。
随后，进行第二次的同源重组。首先，挑选单一菌落于LB培养液中37℃隔夜培养，再将隔夜培养的菌液以100倍稀释于LB培养液(含500μg/mL的链霉素)中，37℃旋转培养8小时，然后将菌液以生理食盐水序列稀释，并均匀涂抹在含有500μg/mL链霉素的LB培养基上，37℃隔夜培养。随后挑选不同的单一菌落，分别涂抹在含有卡那霉素或链霉素的LB培养基上，隔夜培养后挑选可耐受链霉素但失去卡那霉素抗性的菌落，分别进行PCR确认。此时所挑选的菌落是经过第二次同源重组，可能为基因突变株，或者为回复成野生株的回复株(revertant)，可以电泳分析选择基因突变株，此基因突变株即为galU基因缺失的重组菌株。
举例而言，使用PCR引子对p032:
GCCGAGCTCACTCTTGCATGGATGGCT(SEQ ID NO.17)及p042：GTCAGCTGAATTTCATCAC(SEQ ID NO.18)针对galU基因片段进行PCR，再以1X TAE(Tris-base、乙酸(acetic acid)和乙二胺四乙酸(EDTA))缓冲液制作1％洋菜的胶体，并以90V进行电泳40分钟，分析取自第二次同源重组后所挑选菌株的目标基因片段的大小。如图3所示，显示编号2至6的五个菌落为基因缺损突变株(命名为S1U1)；编号1及7至13的菌落则为回复株。M为1kb的DNA阶梯，W为隔夜培养的S1菌株基因体DNA的增幅结果，P为pYC094质体DNA的增幅结果，在此，箭头所指位置分别为野生株片段及突变株片段经过PCR增幅的结果。通过使用包含实施例1中所得的不同目标基因突变用质体的菌株做为接合作用中的接受株或给予株，进行如上述的同源重组基因剔除方法中的接合作用及筛选，可构筑包含一或多个目标基因修饰的重组菌株，如表4所示。
表4.不同目标基因突变用质体的菌株及其接合作用中的接受株，进行接合作用及筛选所构筑的重组菌株。
Figure BDA0002472160570000101
Figure BDA0002472160570000111
如上所述，挑选出S1U1D1、S1U1D2、S1U1D3、S1U1D4及S1U1D5重组菌株后，以PCR增幅目标基因片段，所使用的PCR引子如表5所示。
表5.各PCR引子的序列及SEQ ID NO.。
引子名称 引子序列 SEQ ID NO.
acoA_check(F) CGTGGAAGTCGTCGATAATCAGGTAC SEQ ID NO.19
acoA_check(R) AACTTAGCCGCCTGGTTGTACAGTGC SEQ ID NO.20
pta_check(F) TCTAGACATCTTCCATCTGCACGACACCC SEQ ID NO.21
pta_check(R) GAATTCAGTCGGCGTTGATGTAGTTGGC SEQ ID NO.22
glgC_check(F) TAATGCTTACTGCCAGGACAATGCCC SEQ ID NO.23
glgC_check(R) CCATGCATGTTGTAAAACGACCACG SEQ ID NO.24
ldhA_check(F) AGCCTCGGTCATTTCCTGCTAATGTG SEQ ID NO.25
ldhA_check(R) AGCGTCAACTGGTTTTCCGTCAGATC SEQ ID NO.26
pdeC_check(F) CGTAATCGCTTTTGCGAAGCTGAATA SEQ ID NO.27
pdeC_check(R) GGCTACGTCTCGCAGCAAACCTTCT SEQ ID NO.28
如上所述，以电泳分析PCR产物片段的大小，结果分别如图4至图8所示。
请参阅图4，为本发明利用RT-PCR表现S1U1基因的另一电泳图。片段大小约为1094bp的七个菌落(编号1、6、7、10、13、17、19)为基因缺损突变株；片段大小约为2048bp的十五个菌落(编号2至5、8至9、11至12、14至16、18、20至22)则为回复株。M为1kb的DNA阶梯，W为隔夜培养的S1U1菌株基因体DNA的增幅结果，P为pKAS46-D1质体DNA的增幅结果。
请参阅图5，为本发明利用RT-PCR表现S1U1D2基因的电泳图。片段大小约为1453bp的二个菌落(编号3及12)为基因缺损突变株；片段大小约为1758bp的二十个菌落(编号1至2、4至11及13至22)则为回复株。M为1kb的DNA阶梯，W为隔夜培养的S1U1菌株基因体DNA的增幅结果，P为pKAS46-D2质体DNA的增幅结果。
请参阅图6，为本发明利用RT-PCR表现S1U1D3基因的电泳图。片段大小约为1083bp的十六个菌落(编号1、3至5、7至8、10、12至13及15至21)为基因缺损突变株；片段大小约为2337bp的六个菌落(编号2、6、9、11、14及22)则为回复株。M为1kb的DNA阶梯，W为隔夜培养的S1U1菌株基因体DNA的增幅结果，P为pKAS46-D3质体DNA的增幅结果。
请参阅图7，为本发明利用RT-PCR表现S1U1D4基因的电泳图。片段大小约为1083bp的十六个菌落(编号1、3至5、7至8、10、12至13及15至21)为基因缺损突变株；片段大小约为2337bp的六个菌落(编号2、6、9、11、14及22)则为回复株。M为1kb的DNA阶梯，W为隔夜培养的S1U1菌株基因体DNA的增幅结果，P为pKAS46-D3质体DNA的增幅结果。
请参阅图8，为本发明利用RT-PCR表现S1U1D5基因的电泳图。片段大小约为600bp的二十一个菌落(编号1至12及14至22)为基因缺损突变株；片段大小约为2551bp的菌落(编号13)则为回复株。M为1kb的DNA阶梯，W为隔夜培养的S1U1菌株基因体DNA的增幅结果，P为pKAS46-D5质体DNA的增幅结果。
观察重组基因菌株的菌落外观，如图9所示，基因重组菌株S1U1及S1U1-2与其未通过基因修饰的母株S1相比，因缺少合成荚膜多醣体的重要基因galU，菌落明显变小，而Ur1回复株菌落的生长外观则与母株S1相近。
《实施例3：比较重组菌株的生长情形》
将野生株S1及实施例2中所得的六株重组菌株(S1U1、S1U1D1、S1U1D2、S1U1D3、S1U1D4及S1U1D5)分别培养于含有5％葡萄糖的M9培养基，并在30℃培养箱内以200rpm震荡培养，每两小时测量菌液的OD595吸光值。生长曲线如图10所示，S1U1、S1U1D1、S1U1D2、S1U1D3及S1U1D4重组菌株的生长速度差异不大，仅重组菌株S1U1D5于前30个小时的生长速度较其他菌株稍微迟缓，但于30个小时后的生长速度则均相似。另如图11所示，野生株S1和S1U1的生长曲线并无明显差异，仅S1U1在生长中后期(4小时以上)稍微迟缓，显示重组菌株的生长速度并未受其所包含的基因修饰而有明显影响。
《实施例4：比较重组菌株酦酵生产多元醇的产量》
利用不同浓度的2,3-BDO(10mM、25mM、50mM、100mM、200mM、300mM、400mM、500mM)进行TLC-香草醛测试，使用Image J软体将影像转成灰阶(图12)，再以Excel绘制回归曲线(图13)，并以此回归曲线作为标准曲线，以计算各突变株的2,3-BDO产量。
将各基因重组菌株于含有5％葡萄糖的M9培养液中以30℃培养，在第24、48、72和96小时进行取样，并利用TLC-香草醛法分析不同基因重组菌株通过酦酵生产的2,3-BDO产量，结果如图14A及图14B所示。将图14A及图14B中TLC-香草醛分析所得的结果以Image J软体量化后，列于表6中，再以曲线表示(如图15所示)。
表6.S1U1与其他基因重组菌株S1U1D1、S1U1D2、S1U1D3、S1U1D4及S1U1D5于不同时间内所测得2,3-BDO产量。
Figure BDA0002472160570000131
如图15及表6所示，S1U1于约第60个小时之后，2,3-BDO的产量趋缓，而S1U1D1的2,3-BDO产量则持续缓慢增加至约第90个小时；相较于S1U1，基因重组菌株S1U1D2、S1U1D3、S1U1D4和S1U1D5的2,3-BDO产量明显增加，于一开始培养时即明显产出较多的2,3-BDO，并持续生产至约第96个小时，其中，基因重组菌株S1U1D2、S1U1D3、S1U1D4和S1U1D5在48个小时培养后，可产出5.77至6.16g/L的2,3-BDO，相较于S1U1的3.01g/L，增加了91.7％至105％的产量；于72和96小时培养后，甚至可产出7.08至7.86g/L的2,3-BDO，相较于S1U1的3.27g/L，增加了117％至140％的产量。
《实施例5：比较重组菌株的酦酵pH值》
将各基因重组菌株于含有5％葡萄糖的M9培养液中以30℃培养，并取样测量菌液的pH值，结果如图16所示。结果显示，于菌株培养的前6个小时，各菌株间的pH值并无显著差异，然于菌株培养的第24个小时左右，其间显示显著的pH值差异，以S1U1D3及S1U1D2的pH值最高，平均有pH 5以上，而S1U1的pH值最低，低于pH 4，显示基因重组菌株具有减缓酦酵环境酸化的效果。
如图16所示，在菌株培养的第48个小时，所有菌株的pH值均降至3至4之间。综合以上图15、16及表6所示，基因重组菌株S1U1D2、S1U1D3、S1U1D4和S1U1D5于低pH值的酸性酦酵环境中，仍能持续以较高的产量生产2,3-BDO，而不受低pH值的酸性酦酵环境所影响，例如，基因重组菌株S1U1D2、S1U1D3、S1U1D4和S1U1D5在48个小时培养后，虽然酦酵环境pH值均已降至pH 4以下，其产量仍显著高于S1U1菌株，产出5.77至6.16g/L的2,3-BDO，并持续具有较高的产量至培养72和96小时后，产出7.08至7.86g/L的2,3-BDO，为S1U1菌株产量的2倍以上。
但是以上所述者，仅为本发明的较佳实施例而已，当不能以此限定本发明实施的范围，即大凡依本发明申请权利要求及发明说明内容所作的简单等效变化与修饰，皆仍属本发明专利涵盖的范围内。

Claims (10)

1.一种生产2,3-丁二醇的重组微生物，其特征在于，至少三种选自于由尿苷二磷酸葡萄糖磷酸尿甘酰转移酶基因(galU)、乙酰乙醇去氢酶基因(acoA)、磷酸乙酰转移酶基因(pta)、葡萄糖磷酸腺苷酰转移酶基因(glgC)、乳糖去氢酶基因(ldhA)和磷酸二酯酶基因(pdeC)所组成群组的基因被修饰。
2.根据权利要求1所述的生产2,3-丁二醇的重组微生物，其特征在于，包括尿苷二磷酸葡萄糖磷酸尿甘酰转移酶基因、乙酰乙醇去氢酶基因和磷酸乙酰转移酶基因被修饰。
3.根据权利要求1所述的生产2,3-丁二醇的重组微生物，其特征在于，包括尿苷二磷酸葡萄糖磷酸尿甘酰转移酶基因、乙酰乙醇去氢酶基因、磷酸乙酰转移酶基因和葡萄糖磷酸腺苷酰转移酶基因被修饰。
4.根据权利要求1所述的生产2,3-丁二醇的重组微生物，其特征在于，包括尿苷二磷酸葡萄糖磷酸尿甘酰转移酶基因、乙酰乙醇去氢酶基因、磷酸乙酰转移酶基因、葡萄糖磷酸腺苷酰转移酶基因和乳糖去氢酶基因被修饰。
5.根据权利要求1所述的生产2,3-丁二醇的重组微生物，其特征在于，包括尿苷二磷酸葡萄糖磷酸尿甘酰转移酶基因、乙酰乙醇去氢酶基因、磷酸乙酰转移酶基因、葡萄糖磷酸腺苷酰转移酶基因、乳糖去氢酶基因和磷酸二酯酶基因被修饰。
6.根据权利要求1至5所述的生产2,3-丁二醇的重组微生物，其特征在于，所述修饰包括抑制、删除、或静默。
7.根据权利要求1至5所述的生产2,3-丁二醇的重组微生物，其特征在于，所述修饰为删除。
8.根据权利要求1至5所述的生产2,3-丁二醇的重组微生物，其特征在于，是属于克雷白氏菌属(Klebsiella)。
9.根据权利要求1至5所述的生产2,3-丁二醇的重组微生物，其特征在于，在酸性环境具有生产2,3-丁二醇的能力。
10.一种制造2,3-丁二醇的方法，其特征在于，包含：培养根据权利要求1至9中任一项所述的重组微生物、以及从培养液中分离取得2,3-丁二醇。
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