JP2804436B2 - ストレプトミセス属菌および大腸菌の新規の細菌プラスミドシャトルベクター - Google Patents
ストレプトミセス属菌および大腸菌の新規の細菌プラスミドシャトルベクターInfo
- Publication number
- JP2804436B2 JP2804436B2 JP6045926A JP4592694A JP2804436B2 JP 2804436 B2 JP2804436 B2 JP 2804436B2 JP 6045926 A JP6045926 A JP 6045926A JP 4592694 A JP4592694 A JP 4592694A JP 2804436 B2 JP2804436 B2 JP 2804436B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- streptomyces
- plasmid
- dna
- host cell
- coli
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/76—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Actinomyces; for Streptomyces
Landscapes
- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、微生物ストレプトミセ
ス・アヴェルミティリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）を含む種々の放線菌（ａｃｔ
ｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）において組換えＤＮＡ操作を助
けるための新規の細菌シャトルクーロニングベクターの
採集に関する。
ス・アヴェルミティリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）を含む種々の放線菌（ａｃｔ
ｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）において組換えＤＮＡ操作を助
けるための新規の細菌シャトルクーロニングベクターの
採集に関する。
【０００２】多数の医薬品は微生物によって製造されて
いる。有用な製品の生成における微生物の関与は、その
製品の実際の化学的構造を製造するのに必要な不可欠の
遺伝情報がどれだけたくさん微生物中に存在しているか
に基づいて三つの種類に分けることができる。第一の種
類は、抗生物質のような天然の代謝生成物であるこれら
の生成物から成り、それらの合成のための情報は全て細
胞に固有である。第二の種類は、微生物の天然の代謝生
成物ではないこれらの生成物を含むが、微生物は、化学
薬品一つ一つの化学的変換に用いられる生物学的段階の
情報の一因となっている。これを生物変換と称する（例
えば、ステロイドの生物変換）。第三の種類は、生成物
分子の構造を規定する情報は微生物のゲノム中で初めて
見出されるのではないということを特徴とする。この場
合、情報は細胞中に挿入される。３種類全部の化合物の
製造は、組換えＤＮＡ技術によって影響されてきたしま
たは影響される。産業上の用途を有するこれらの微生物
の内で、土壌に生存する放線菌は中心的役割を果たして
おり、そして抗生物質および他の生物学的に重要な化合
物の重要な源として認められてきた。
いる。有用な製品の生成における微生物の関与は、その
製品の実際の化学的構造を製造するのに必要な不可欠の
遺伝情報がどれだけたくさん微生物中に存在しているか
に基づいて三つの種類に分けることができる。第一の種
類は、抗生物質のような天然の代謝生成物であるこれら
の生成物から成り、それらの合成のための情報は全て細
胞に固有である。第二の種類は、微生物の天然の代謝生
成物ではないこれらの生成物を含むが、微生物は、化学
薬品一つ一つの化学的変換に用いられる生物学的段階の
情報の一因となっている。これを生物変換と称する（例
えば、ステロイドの生物変換）。第三の種類は、生成物
分子の構造を規定する情報は微生物のゲノム中で初めて
見出されるのではないということを特徴とする。この場
合、情報は細胞中に挿入される。３種類全部の化合物の
製造は、組換えＤＮＡ技術によって影響されてきたしま
たは影響される。産業上の用途を有するこれらの微生物
の内で、土壌に生存する放線菌は中心的役割を果たして
おり、そして抗生物質および他の生物学的に重要な化合
物の重要な源として認められてきた。
【０００３】放線菌目（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅ
ｓ）の主要な属の一つであるストレプトミセス属（Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）を実質的に研究した。ストレプ
トミセス属のメンバーはグラム陽性土壌細菌である。土
壌試料からの無数の単離物の分析により、９０％を越え
る治療的に有用な抗生物質が得られた。抗生物質を製造
するのに放線菌発酵が用いられてきた４０年間にわたる
放線菌の増殖および取扱いに関する多数の産業上の経験
がある。更に、抗生物質の製造を改良する問題のため
に、放線菌における遺伝学的研究が進歩している。放線
菌は、抗生物質生合成遺伝子を単離し、新規の誘導体ま
たはハイブリッド化合物を生成し、調節遺伝子を単離
し、そして一次および二次代謝双方に関与する調節機序
を研究するための組換えＤＮＡクローニング技術を開発
する研究の焦点である。
ｓ）の主要な属の一つであるストレプトミセス属（Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）を実質的に研究した。ストレプ
トミセス属のメンバーはグラム陽性土壌細菌である。土
壌試料からの無数の単離物の分析により、９０％を越え
る治療的に有用な抗生物質が得られた。抗生物質を製造
するのに放線菌発酵が用いられてきた４０年間にわたる
放線菌の増殖および取扱いに関する多数の産業上の経験
がある。更に、抗生物質の製造を改良する問題のため
に、放線菌における遺伝学的研究が進歩している。放線
菌は、抗生物質生合成遺伝子を単離し、新規の誘導体ま
たはハイブリッド化合物を生成し、調節遺伝子を単離
し、そして一次および二次代謝双方に関与する調節機序
を研究するための組換えＤＮＡクローニング技術を開発
する研究の焦点である。
【０００４】
【従来の技術】放線菌についてはほとんど研究された
が、これらの微生物はなお分子生物学者に対する挑戦を
示している。放線菌は、これらの微生物をその他の原核
生物と区別する多数の独特な構造的および代謝的特徴を
有する。放線菌を固形培地上で増殖させた場合、通常、
それらは複雑な菌糸体菌類様サイクルの形態分化を示
す。菌糸体の増殖および分化は少なくとも三つの主要な
相、すなわち、基底菌糸、気中菌糸および胞子形成を含
む。更に、ストレプトミセス属ゲノムは大型で、大腸菌
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のそれの２倍を
越える約１０４ｋｂ（キロベース）である。放線菌ゲノ
ムは、天然において観察される上限に近い、極めて高い
グアノシンおよびシトシン（Ｇ＋Ｃ）含量（平均最大約
７３％まで、若干の領域では９０％より大）のＤＮＡか
ら成る。これらの顕著な特徴により、放線菌特異的組換
えＤＮＡ技術の開発が必要とされる。
が、これらの微生物はなお分子生物学者に対する挑戦を
示している。放線菌は、これらの微生物をその他の原核
生物と区別する多数の独特な構造的および代謝的特徴を
有する。放線菌を固形培地上で増殖させた場合、通常、
それらは複雑な菌糸体菌類様サイクルの形態分化を示
す。菌糸体の増殖および分化は少なくとも三つの主要な
相、すなわち、基底菌糸、気中菌糸および胞子形成を含
む。更に、ストレプトミセス属ゲノムは大型で、大腸菌
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のそれの２倍を
越える約１０４ｋｂ（キロベース）である。放線菌ゲノ
ムは、天然において観察される上限に近い、極めて高い
グアノシンおよびシトシン（Ｇ＋Ｃ）含量（平均最大約
７３％まで、若干の領域では９０％より大）のＤＮＡか
ら成る。これらの顕著な特徴により、放線菌特異的組換
えＤＮＡ技術の開発が必要とされる。
【０００５】抗生物質生産性放線菌の遺伝学的改良に対
する組換えＤＮＡ技術の応用における基本的構成要素
は、適当なクローニングベクターの開発である。様々な
プラスミドおよびファージベクター並びに形質転換シス
テムが開発されてきた。いくつかのベクター構築は、デ
ヴィッド・ホップウッド（Ｄａｖｉｄ Ｈｏｐｗｏｏ
ｄ）率いるグループによってジョン・インス・インステ
ィトゥート（Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ
ｅ）、英国で開発されてきた。ｐＩＪ１０１に誘導され
た高コピー数プラスミドベクター［キーサー（Ｋｉｅｓ
ｅｒ），Ｔ．、ホップウッド，Ｄ．Ａ．、ライト（Ｗｒ
ｉｇｈｔ），Ｈ．Ｍ．およびトンプソン（Ｔｈｏｍｐｓ
ｏｎ），Ｃ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１
８５，２２３〜２３８，１９８２］およびＳＣＰ２＊に
誘導された低コピー数プラスミドベクター［リディエー
ト（Ｌｙｄｉａｔｅ），Ｄ．Ｊ．、マルパーティダ（Ｍ
ａｌｐａｒｔｉｄａ），Ｆ．およびホップウッド，Ｄ．
Ａ．，Ｇｅｎｅ，３５，２２３〜２３５，１９８５］は
両方とも、放線菌ＤＮＡをクローニングするのに成功し
て用いられてきた。ＳＣＰ２＊は、ストレプトミセス・
コーリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉ
ｃｏｌｏｒ）において最初に見出された分子寸法３１．
４ｋｂの稔性因子であり且つ１〜２コピー／染色体で存
在する［ビブ（Ｂｉｂｂ），Ｍ．Ｊ．およびホップウッ
ド，Ｄ．Ａ．、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１
２６，４２７〜４４２，１９８１］。ＳＣＰ２＊は広い
宿主範囲を有する。広範に用いられた２種類の放線菌ベ
クターは、Ｓ．コーリカラーから最初に単離されたＳＣ
Ｐ２＊レプリコンの誘導体である低コピー数ベクターｐ
ＩＪ９２２［リディエートら、Ｇｅｎｅ，３５，２２３
〜２３５，１９８５］およびＳ．リヴィダンス（ｌｉｖ
ｉｄａｎｓ）から最初に単離されたプラスミドｐＩＪ１
０１の誘導体である高コピー数ベクターｐＩＪ７０２
［カッツ（Ｋａｔｚ），Ｅ．、トンプソン（Ｔｈｏｍｐ
ｓｏｎ），Ｃ．Ｊ．およびホップウッド，Ｄ．Ａ．、
Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１２９，２７０３
〜２７１４，１９８３］である。両方のベクターはスト
レプトミセス・アズレウス（Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ
ａｚｕｒｅｕｓ）からのチオストレプトン耐性（ｔｓ
ｒ）マーカーを有し、これは特異的リボソームＲＮＡメ
チラーゼによって抗生物質チオストレプトンに対する耐
性を与える。具体的な計画に応じて、用いられるベクタ
ーのコピー数の決定を行なう。低または単コピー数／ゲ
ノムのベクターは、大型のＤＮＡフラグメント（最大４
０ｋｂまで）を安定して維持する能力および可能な遺伝
子量効果の不存在が好ましい大部分の生理学的実験に好
適である。時々、特異的突然変異の相補性によるＤＮＡ
のクローン化セグメントの分析は、多数の利用可能なク
ローニングベクターによって得られた形質転換体の不安
定性によって妨げられる。コピー数が高いもの、例え
ば、ｐＩＪ７０２（４０〜３００コピー／染色体）は、
クローニングおよびクローン化ＤＮＡフラグメントの回
収の容易さに有効である。ｐＩＪ７０２は更に、広範囲
の適当な放線菌宿主を有する。
する組換えＤＮＡ技術の応用における基本的構成要素
は、適当なクローニングベクターの開発である。様々な
プラスミドおよびファージベクター並びに形質転換シス
テムが開発されてきた。いくつかのベクター構築は、デ
ヴィッド・ホップウッド（Ｄａｖｉｄ Ｈｏｐｗｏｏ
ｄ）率いるグループによってジョン・インス・インステ
ィトゥート（Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ
ｅ）、英国で開発されてきた。ｐＩＪ１０１に誘導され
た高コピー数プラスミドベクター［キーサー（Ｋｉｅｓ
ｅｒ），Ｔ．、ホップウッド，Ｄ．Ａ．、ライト（Ｗｒ
ｉｇｈｔ），Ｈ．Ｍ．およびトンプソン（Ｔｈｏｍｐｓ
ｏｎ），Ｃ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１
８５，２２３〜２３８，１９８２］およびＳＣＰ２＊に
誘導された低コピー数プラスミドベクター［リディエー
ト（Ｌｙｄｉａｔｅ），Ｄ．Ｊ．、マルパーティダ（Ｍ
ａｌｐａｒｔｉｄａ），Ｆ．およびホップウッド，Ｄ．
Ａ．，Ｇｅｎｅ，３５，２２３〜２３５，１９８５］は
両方とも、放線菌ＤＮＡをクローニングするのに成功し
て用いられてきた。ＳＣＰ２＊は、ストレプトミセス・
コーリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉ
ｃｏｌｏｒ）において最初に見出された分子寸法３１．
４ｋｂの稔性因子であり且つ１〜２コピー／染色体で存
在する［ビブ（Ｂｉｂｂ），Ｍ．Ｊ．およびホップウッ
ド，Ｄ．Ａ．、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１
２６，４２７〜４４２，１９８１］。ＳＣＰ２＊は広い
宿主範囲を有する。広範に用いられた２種類の放線菌ベ
クターは、Ｓ．コーリカラーから最初に単離されたＳＣ
Ｐ２＊レプリコンの誘導体である低コピー数ベクターｐ
ＩＪ９２２［リディエートら、Ｇｅｎｅ，３５，２２３
〜２３５，１９８５］およびＳ．リヴィダンス（ｌｉｖ
ｉｄａｎｓ）から最初に単離されたプラスミドｐＩＪ１
０１の誘導体である高コピー数ベクターｐＩＪ７０２
［カッツ（Ｋａｔｚ），Ｅ．、トンプソン（Ｔｈｏｍｐ
ｓｏｎ），Ｃ．Ｊ．およびホップウッド，Ｄ．Ａ．、
Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１２９，２７０３
〜２７１４，１９８３］である。両方のベクターはスト
レプトミセス・アズレウス（Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ
ａｚｕｒｅｕｓ）からのチオストレプトン耐性（ｔｓ
ｒ）マーカーを有し、これは特異的リボソームＲＮＡメ
チラーゼによって抗生物質チオストレプトンに対する耐
性を与える。具体的な計画に応じて、用いられるベクタ
ーのコピー数の決定を行なう。低または単コピー数／ゲ
ノムのベクターは、大型のＤＮＡフラグメント（最大４
０ｋｂまで）を安定して維持する能力および可能な遺伝
子量効果の不存在が好ましい大部分の生理学的実験に好
適である。時々、特異的突然変異の相補性によるＤＮＡ
のクローン化セグメントの分析は、多数の利用可能なク
ローニングベクターによって得られた形質転換体の不安
定性によって妨げられる。コピー数が高いもの、例え
ば、ｐＩＪ７０２（４０〜３００コピー／染色体）は、
クローニングおよびクローン化ＤＮＡフラグメントの回
収の容易さに有効である。ｐＩＪ７０２は更に、広範囲
の適当な放線菌宿主を有する。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】放線菌における遺伝子
工学研究は、大腸菌システムと比較して時間を浪費す
る。シャトルベクターとしても知られている二重機能プ
ラスミドベクターは、ストレプトミセス属および１種類
またはそれ以上の代替宿主（例えば、大腸菌）において
複製することができ、放線菌遺伝子のクローニング、制
限地図作成、ＤＮＡ配列決定、特定部位の突然変異誘発
および機能分析を極めて容易にする。大腸菌および放線
菌双方のレプリコン並びにそれぞれの宿主に特異的な選
択的マーカーを有する二重機能のストレプトミセス属−
大腸菌シャトルベクターは、大腸菌においてもストレプ
トミセス属においても安定して維持されることができ
る。シャトルベクターは双方の代替宿主間で形質転換す
ることができ、放線菌遺伝子の遺伝子転移および分子遺
伝学実験を極めて容易にする。次に、放線菌宿主からシ
ャトルベクター中にクローン化された１種類またはそれ
以上の遺伝子を大腸菌宿主に転移させることができる。
実験中の１種類または複数の遺伝子をいったん分析し且
つ大腸菌宿主中において操作したら、次に、それをその
元の放線菌宿主に戻して転移させることができる。
工学研究は、大腸菌システムと比較して時間を浪費す
る。シャトルベクターとしても知られている二重機能プ
ラスミドベクターは、ストレプトミセス属および１種類
またはそれ以上の代替宿主（例えば、大腸菌）において
複製することができ、放線菌遺伝子のクローニング、制
限地図作成、ＤＮＡ配列決定、特定部位の突然変異誘発
および機能分析を極めて容易にする。大腸菌および放線
菌双方のレプリコン並びにそれぞれの宿主に特異的な選
択的マーカーを有する二重機能のストレプトミセス属−
大腸菌シャトルベクターは、大腸菌においてもストレプ
トミセス属においても安定して維持されることができ
る。シャトルベクターは双方の代替宿主間で形質転換す
ることができ、放線菌遺伝子の遺伝子転移および分子遺
伝学実験を極めて容易にする。次に、放線菌宿主からシ
ャトルベクター中にクローン化された１種類またはそれ
以上の遺伝子を大腸菌宿主に転移させることができる。
実験中の１種類または複数の遺伝子をいったん分析し且
つ大腸菌宿主中において操作したら、次に、それをその
元の放線菌宿主に戻して転移させることができる。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は、放線菌、好ま
しくは、ストレプトミセス属菌および大腸菌に関する４
種類の新規の二重機能プラスミドシャトルベクターの構
築を開示する。新規のベクターは、放線菌および関連微
生物における多数の組換体ＤＮＡの適用を容易にするよ
うに設計された。ベクターの内の３種類はストレプトミ
セス属において中〜高コピー数に調節する温度感受性複
製起点を有する。このレプリコンの温度感受性は、スト
レプトミセス属遺伝子置換および突然変異体設計実験に
おいてそれを用いることを可能にする。更に、これらの
シャトルベクターの内の一つは、多数のクローニング領
域に隣接するＳＰ６およびＴ７双方のＲＮＡポリメラー
ゼプロモーターを含み、ハイブリッド形成実験に有用な
ｃＲＮＡ転写物の合成を可能にする。更に、クローニン
グ領域はβ−ガラクトシダーゼ遺伝子のα−ペプチドコ
ーディング領域中に位置し、大腸菌における着色スクリ
ーニングによって組換体クローンを識別することを可能
にする。ここに記載した４種類のシャトルベクターは、
ストレプトミセス属において低コピー数に調節するＳＣ
Ｐ２＊ストレプトミセス属複製起点を有し、これが、多
数のストレプトミセス属種におけるクローニングおよび
相補性実験において用いられるベクターに特有の利点と
なる。
しくは、ストレプトミセス属菌および大腸菌に関する４
種類の新規の二重機能プラスミドシャトルベクターの構
築を開示する。新規のベクターは、放線菌および関連微
生物における多数の組換体ＤＮＡの適用を容易にするよ
うに設計された。ベクターの内の３種類はストレプトミ
セス属において中〜高コピー数に調節する温度感受性複
製起点を有する。このレプリコンの温度感受性は、スト
レプトミセス属遺伝子置換および突然変異体設計実験に
おいてそれを用いることを可能にする。更に、これらの
シャトルベクターの内の一つは、多数のクローニング領
域に隣接するＳＰ６およびＴ７双方のＲＮＡポリメラー
ゼプロモーターを含み、ハイブリッド形成実験に有用な
ｃＲＮＡ転写物の合成を可能にする。更に、クローニン
グ領域はβ−ガラクトシダーゼ遺伝子のα−ペプチドコ
ーディング領域中に位置し、大腸菌における着色スクリ
ーニングによって組換体クローンを識別することを可能
にする。ここに記載した４種類のシャトルベクターは、
ストレプトミセス属において低コピー数に調節するＳＣ
Ｐ２＊ストレプトミセス属複製起点を有し、これが、多
数のストレプトミセス属種におけるクローニングおよび
相補性実験において用いられるベクターに特有の利点と
なる。
【０００８】本出願中で用いられる専門用語は、分子遺
伝学の分野の熟練者に周知である。これらの用語の定義
は、分子生物学分野に献呈された多数の教本、例えば、
ベンジャミン・ルウィン博士（Ｄｒ．Ｂｅｎｊａｍｉｎ
Ｌｅｗｉｎ）による「遺伝子（Ｇｅｎｅｓ）」第２
版，ジョン・ウィリー・アンド・サンズ・インコーポレ
ーテッド（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎ
ｃ．），ニューヨークにおいて見出される。本発明にお
いて頻繁に用いられる用語を以下に定義する。
伝学の分野の熟練者に周知である。これらの用語の定義
は、分子生物学分野に献呈された多数の教本、例えば、
ベンジャミン・ルウィン博士（Ｄｒ．Ｂｅｎｊａｍｉｎ
Ｌｅｗｉｎ）による「遺伝子（Ｇｅｎｅｓ）」第２
版，ジョン・ウィリー・アンド・サンズ・インコーポレ
ーテッド（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎ
ｃ．），ニューヨークにおいて見出される。本発明にお
いて頻繁に用いられる用語を以下に定義する。
【０００９】抗生物質：細菌細胞の増殖を阻害する化学
薬剤。組換体細菌細胞を選択するのに用いられる。
薬剤。組換体細菌細胞を選択するのに用いられる。
【００１０】抗生物質耐性遺伝子：特定の抗生物質に対
して本来感受性である宿主細胞中に導入された場合にそ
の抗生物質に対する耐性を伝えるＤＮＡ配列。抗生物質
マーカーとしても知られる。
して本来感受性である宿主細胞中に導入された場合にそ
の抗生物質に対する耐性を伝えるＤＮＡ配列。抗生物質
マーカーとしても知られる。
【００１１】ｃＲＮＡ：ＤＮＡに対して相補的な、イン
ビトロの転写によってそれから合成された一本鎖ＲＮ
Ａ。
ビトロの転写によってそれから合成された一本鎖ＲＮ
Ａ。
【００１２】クローン：単一の祖先と同一の多数の細胞
または分子。
または分子。
【００１３】クローニングベクター：異種のＤＮＡを挿
入してクローン化させることができる任意のプラスミ
ド。それは、形質転換の際に異種ＤＮＡを宿主細菌細胞
中に運搬する。
入してクローン化させることができる任意のプラスミ
ド。それは、形質転換の際に異種ＤＮＡを宿主細菌細胞
中に運搬する。
【００１４】ＤＮＡ連結反応：ＤＮＡの２種類のフラグ
メントを結合する化学結合の形成である。
メントを結合する化学結合の形成である。
【００１５】ハイブリッド形成：挿入されたＤＮＡが特
定の配列と同様であるキメラベクターを有する細菌コロ
ニーを同定するのに用いられる技術。
定の配列と同様であるキメラベクターを有する細菌コロ
ニーを同定するのに用いられる技術。
【００１６】ｋｂ：ＤＮＡまたはＲＮＡの１，０００塩
基対の略号。
基対の略号。
【００１７】複製起点：プラスミドベクターの複製が開
始される地点のＤＮＡ配列。
始される地点のＤＮＡ配列。
【００１８】プラスミド：自律性自己複製染色体外環状
ＤＮＡ。
ＤＮＡ。
【００１９】プラスミドコピー数：細菌中において宿主
染色体毎に維持されるプラスミド分子数。
染色体毎に維持されるプラスミド分子数。
【００２０】プロモーター：（ＲＮＡポリメラーゼプロ
モーターとしても知られる）特定のＤＮＡ配列のＲＮＡ
中への転写の開始を決定するのに重要なＤＮＡの領域。
モーターとしても知られる）特定のＤＮＡ配列のＲＮＡ
中への転写の開始を決定するのに重要なＤＮＡの領域。
【００２１】レプリコン：ＤＮＡが複製されるゲノムの
単位；複製起点を含む。
単位；複製起点を含む。
【００２２】制限酵素：ＤＮＡの特定の短配列を認識し
且つそれを開裂させる酵素タンパク質。
且つそれを開裂させる酵素タンパク質。
【００２３】シャトルベクター：１種類またはそれ以上
の代替宿主（例えば、大腸菌およびストレプトミセス
属）を複製しうる二重機能クローニングベクター。
の代替宿主（例えば、大腸菌およびストレプトミセス
属）を複製しうる二重機能クローニングベクター。
【００２４】温度感受性突然変異：低温で機能するが更
に高温では不活性である遺伝子産物を生成する。
に高温では不活性である遺伝子産物を生成する。
【００２５】転写：ＤＮＡ鋳型でのＲＮＡの合成。
【００２６】細菌細胞の形質転換：追加のＤＮＡの取込
みによる新規の遺伝マーカーの獲得を示す。
みによる新規の遺伝マーカーの獲得を示す。
【００２７】本発明は、ストレプトミセス属菌細胞中に
おいて中〜高コピー数に調節する組換体ＤＮＡシャトル
ベクターであって、 （ａ）プラスミドｐＭＴ６６０の寸法が約５．７キロベ
ースの複製起点含有ＳａｃＩ制限フラグメント； （ｂ）感受性ストレプトミセス属宿主細胞中に形質転換
された場合に耐性を与える少なくとも１種類の抗生物質
マーカーを含むＤＮＡセグメント； （ｃ）プラスミドｐＧＥＭ−３Ｚの寸法が約２．７キロ
ベースの複製起点含有ＳａｃＩ制限フラグメント； （ｄ）感受性大腸菌宿主細胞中に形質転換された場合に
耐性を与える少なくとも１種類の抗生物質マーカーを含
むＤＮＡセグメント； （ｅ）４種類の好都合なクローニング部位：ＢｇＩＩ
Ｉ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ；並び
に （ｆ）種々のストレプトミセス属菌および大腸菌宿主双
方において効率よく複製しうる該ベクターを含む上記組
換体ＤＮＡシャトルベクターに関する。
おいて中〜高コピー数に調節する組換体ＤＮＡシャトル
ベクターであって、 （ａ）プラスミドｐＭＴ６６０の寸法が約５．７キロベ
ースの複製起点含有ＳａｃＩ制限フラグメント； （ｂ）感受性ストレプトミセス属宿主細胞中に形質転換
された場合に耐性を与える少なくとも１種類の抗生物質
マーカーを含むＤＮＡセグメント； （ｃ）プラスミドｐＧＥＭ−３Ｚの寸法が約２．７キロ
ベースの複製起点含有ＳａｃＩ制限フラグメント； （ｄ）感受性大腸菌宿主細胞中に形質転換された場合に
耐性を与える少なくとも１種類の抗生物質マーカーを含
むＤＮＡセグメント； （ｅ）４種類の好都合なクローニング部位：ＢｇＩＩ
Ｉ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ；並び
に （ｆ）種々のストレプトミセス属菌および大腸菌宿主双
方において効率よく複製しうる該ベクターを含む上記組
換体ＤＮＡシャトルベクターに関する。
【００２８】更に、本発明は、ストレプトミセス属菌細
胞中において中〜高コピー数に調節する組換体ＤＮＡシ
ャトルベクターであって、 （ａ）プラスミドｐＭＴ６６０の寸法が約５．７キロベ
ースの複製起点含有ＳａｃＩ制限フラグメント； （ｂ）寸法が約０．８キロベースのＰｓｔＩ制限フラグ
メントの欠失； （ｃ）感受性ストレプトミセス属宿主細胞中に形質転換
された場合に耐性を与える少なくとも１種類の抗生物質
マーカーを含むＤＮＡセグメント； （ｄ）プラスミドｐＧＥＭ−３Ｚの寸法が約２．７キロ
ベースの複製起点含有ＳａｃＩ制限フラグメント； （ｅ）感受性大腸菌宿主細胞中に形質転換された場合に
耐性を与える少なくとも１種類の抗生物質マーカーを含
むＤＮＡセグメント； （ｆ）５種類の好都合なクローニング部位：ＥｃｏＲ
Ｉ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳａｃＩ、ＳｐｈＩおよびＰｓｔ
Ｉ； （ｇ）種々のストレプトミセス属菌および大腸菌宿主双
方において効率よく複製しうる該ベクターを含む上記組
換体ＤＮＡシャトルベクターに関する。
胞中において中〜高コピー数に調節する組換体ＤＮＡシ
ャトルベクターであって、 （ａ）プラスミドｐＭＴ６６０の寸法が約５．７キロベ
ースの複製起点含有ＳａｃＩ制限フラグメント； （ｂ）寸法が約０．８キロベースのＰｓｔＩ制限フラグ
メントの欠失； （ｃ）感受性ストレプトミセス属宿主細胞中に形質転換
された場合に耐性を与える少なくとも１種類の抗生物質
マーカーを含むＤＮＡセグメント； （ｄ）プラスミドｐＧＥＭ−３Ｚの寸法が約２．７キロ
ベースの複製起点含有ＳａｃＩ制限フラグメント； （ｅ）感受性大腸菌宿主細胞中に形質転換された場合に
耐性を与える少なくとも１種類の抗生物質マーカーを含
むＤＮＡセグメント； （ｆ）５種類の好都合なクローニング部位：ＥｃｏＲ
Ｉ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳａｃＩ、ＳｐｈＩおよびＰｓｔ
Ｉ； （ｇ）種々のストレプトミセス属菌および大腸菌宿主双
方において効率よく複製しうる該ベクターを含む上記組
換体ＤＮＡシャトルベクターに関する。
【００２９】本発明は、更に、中〜高コピー数に調節す
る組換体ＤＮＡシャトルベクターであって、 （ａ）プラスミドｐＭＴ６６０の寸法が約５．７キロベ
ースのブラント末端複製起点含有ＳａｃＩ制限フラグメ
ント； （ｂ）感受性ストレプトミセス属宿主細胞中に形質転換
された場合に耐性を与える少なくとも１種類の抗生物質
マーカーを含むＤＮＡセグメント； （ｃ）プラスミドｐＧＥＭ−３Ｚの寸法が約２．７キロ
ベースのブラント末端複製起点含有ＮｄｅＩ制限フラグ
メント； （ｄ）感受性大腸菌宿主細胞中に形質転換された場合に
耐性を与える少なくとも１種類の抗生物質マーカーを含
むＤＮＡセグメント； （ｅ）６種類の好都合なクローニング部位：ＢｇＩＩ
Ｉ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳａｃＩ、ＳｓｐＩ
およびＸｂａＩ； （ｆ）大腸菌における着色スクリーニングによって組換
体クローンを識別することを可能にする、β−ガラクト
シダーゼ遺伝子のα−ペプチドコーディング領域中に位
置したクローニング部位の内の４種類（ＥｃｏＲＩ、Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ、ＳａｃＩおよびＸｂａＩ）； （ｇ）ハイブリッド形成実験に有用なｃＲＮＡ転写物の
合成を可能にするクローニング部位（ｅ）に隣接するＳ
Ｐ６およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター；お
よび （ｈ）種々のストレプトミセス属菌および大腸菌宿主双
方において効率よく複製しうる該ベクターを含む上記組
換体ＤＮＡシャトルベクターに関する。
る組換体ＤＮＡシャトルベクターであって、 （ａ）プラスミドｐＭＴ６６０の寸法が約５．７キロベ
ースのブラント末端複製起点含有ＳａｃＩ制限フラグメ
ント； （ｂ）感受性ストレプトミセス属宿主細胞中に形質転換
された場合に耐性を与える少なくとも１種類の抗生物質
マーカーを含むＤＮＡセグメント； （ｃ）プラスミドｐＧＥＭ−３Ｚの寸法が約２．７キロ
ベースのブラント末端複製起点含有ＮｄｅＩ制限フラグ
メント； （ｄ）感受性大腸菌宿主細胞中に形質転換された場合に
耐性を与える少なくとも１種類の抗生物質マーカーを含
むＤＮＡセグメント； （ｅ）６種類の好都合なクローニング部位：ＢｇＩＩ
Ｉ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳａｃＩ、ＳｓｐＩ
およびＸｂａＩ； （ｆ）大腸菌における着色スクリーニングによって組換
体クローンを識別することを可能にする、β−ガラクト
シダーゼ遺伝子のα−ペプチドコーディング領域中に位
置したクローニング部位の内の４種類（ＥｃｏＲＩ、Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ、ＳａｃＩおよびＸｂａＩ）； （ｇ）ハイブリッド形成実験に有用なｃＲＮＡ転写物の
合成を可能にするクローニング部位（ｅ）に隣接するＳ
Ｐ６およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター；お
よび （ｈ）種々のストレプトミセス属菌および大腸菌宿主双
方において効率よく複製しうる該ベクターを含む上記組
換体ＤＮＡシャトルベクターに関する。
【００３０】更に、本発明は、ストレプトミセス属菌細
胞中において低コピー数に調節する組換体ＤＮＡシャト
ルベクターであって、 （ａ）プラスミドｐＩＪ９２２の寸法が約２３．４キロ
ベースの複製起点含有ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲｌ制限フラ
グメント； （ｂ）感受性ストレプトミセス属宿主細胞中に形質転換
された場合に耐性を与える少なくとも１種類の抗生物質
マーカーを含むＤＮＡセグメント； （ｃ）プラスミドｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）の寸法が約
３．２キロベースの複製起点含有ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲ
ｌ制限フラグメント； （ｄ）感受性大腸菌宿主細胞中に形質転換された場合に
耐性を与える少なくとも１種類の抗生物質マーカーを含
むＤＮＡセグメント； （ｅ）４種類の好都合なクローニング部位：ＢａｍＨ
ｌ、ＥｃｏＲｌ、ＨｉｎｄｌｌｌおよびＸｈｏｌ；並び
に （ｆ）種々のストレプトミセス属菌および大腸菌宿主双
方において効率よく複製しうる該ベクターを含む上記組
換体ＤＮＡシャトルベクターに関する。
胞中において低コピー数に調節する組換体ＤＮＡシャト
ルベクターであって、 （ａ）プラスミドｐＩＪ９２２の寸法が約２３．４キロ
ベースの複製起点含有ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲｌ制限フラ
グメント； （ｂ）感受性ストレプトミセス属宿主細胞中に形質転換
された場合に耐性を与える少なくとも１種類の抗生物質
マーカーを含むＤＮＡセグメント； （ｃ）プラスミドｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）の寸法が約
３．２キロベースの複製起点含有ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲ
ｌ制限フラグメント； （ｄ）感受性大腸菌宿主細胞中に形質転換された場合に
耐性を与える少なくとも１種類の抗生物質マーカーを含
むＤＮＡセグメント； （ｅ）４種類の好都合なクローニング部位：ＢａｍＨ
ｌ、ＥｃｏＲｌ、ＨｉｎｄｌｌｌおよびＸｈｏｌ；並び
に （ｆ）種々のストレプトミセス属菌および大腸菌宿主双
方において効率よく複製しうる該ベクターを含む上記組
換体ＤＮＡシャトルベクターに関する。
【００３１】したがって、大腸菌およびストレプトミセ
ス属双方において機能的な４種類の新規のシャトルベク
ターは、本明細書中記載した本発明の好ましい実施態様
である。
ス属双方において機能的な４種類の新規のシャトルベク
ターは、本明細書中記載した本発明の好ましい実施態様
である。
【００３２】これらのシャトルベクターの内の３種類
（ｐＣＤ２６２、ｐＣＤ３８５およびｐＣＤ５００）
は、ストレプトミセス属において中〜高コピー数に調節
するストレプトミセス属温度感受性複製起点を有する。
温度感受性複製起点は、ヒドロキシラミンを用いるイン
ビトロの突然変異誘発後に得られたプラスミドｐＩＪ７
０２の誘導体であるプラスミドｐＭＴ６６０に由来する
［バーチ（Ｂｉｒｃｈ），Ａ．Ｗ．およびカラム（Ｃｕ
ｌｌｕｍ），Ｊ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．，１３１，１２９９〜１３０３，１９８５）。この
レプリコンの温度感受性は、ストレプトミセス属遺伝子
置換および突然変異体設計実験においてそれを用いるこ
とを可能にする。更に、シャトルベクターｐＣＤ３８５
は、多数のクローニング領域に隣接するＳＰ６およびＴ
７双方のＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含み、ハイ
ブリッド形成実験に有用なｃＲＮＡ転写物の合成を可能
にする。更に、クローニング領域は、β−ガラクトシダ
ーゼ遺伝子のα−ペプチドコーディング領域中に位置
し、大腸菌における着色スクリーニングによって組換体
クローンを識別することを可能にする。
（ｐＣＤ２６２、ｐＣＤ３８５およびｐＣＤ５００）
は、ストレプトミセス属において中〜高コピー数に調節
するストレプトミセス属温度感受性複製起点を有する。
温度感受性複製起点は、ヒドロキシラミンを用いるイン
ビトロの突然変異誘発後に得られたプラスミドｐＩＪ７
０２の誘導体であるプラスミドｐＭＴ６６０に由来する
［バーチ（Ｂｉｒｃｈ），Ａ．Ｗ．およびカラム（Ｃｕ
ｌｌｕｍ），Ｊ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．，１３１，１２９９〜１３０３，１９８５）。この
レプリコンの温度感受性は、ストレプトミセス属遺伝子
置換および突然変異体設計実験においてそれを用いるこ
とを可能にする。更に、シャトルベクターｐＣＤ３８５
は、多数のクローニング領域に隣接するＳＰ６およびＴ
７双方のＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含み、ハイ
ブリッド形成実験に有用なｃＲＮＡ転写物の合成を可能
にする。更に、クローニング領域は、β−ガラクトシダ
ーゼ遺伝子のα−ペプチドコーディング領域中に位置
し、大腸菌における着色スクリーニングによって組換体
クローンを識別することを可能にする。
【００３３】第四のシャトルベクターｐＣＤ３９６は、
ストレプトミセス属において低コピー数に調節するＳＣ
Ｐ２＊ストレプトミセス属複製起点を有し、これが、多
数のストレプトミセス属種におけるクローニングおよび
相補性実験で用いられるベクターに特有の利点となる。
ストレプトミセス属において低コピー数に調節するＳＣ
Ｐ２＊ストレプトミセス属複製起点を有し、これが、多
数のストレプトミセス属種におけるクローニングおよび
相補性実験で用いられるベクターに特有の利点となる。
【００３４】本発明は、ストレプトミセス属および大腸
菌のための４種類の安定な二重機能プラスミドシャトル
ベクターの構築を開示する。新規のベクターは、放線菌
および関連微生物における多数の組換体ＤＮＡの適用を
容易にするように設計された。ベクターの内の３種類
は、ストレプトミセス属において中〜高コピー数に調節
するｐＩＪ１０１複製起点の温度感受性誘導体を有す
る。このレプリコンの温度感受性は、ストレプトミセス
属遺伝子置換および突然変異体設計実験においてそれを
用いることを可能にする。ここに記載した第四のシャト
ルベクターは、ストレプトミセス属において低コピー数
に調節するＳＣＰ２＊ストレプトミセス属複製起点を有
し、これが、多数のストレプトミセス属種におけるクロ
ーニングおよび相補性実験で用いられるベクターに特有
の利点となる。
菌のための４種類の安定な二重機能プラスミドシャトル
ベクターの構築を開示する。新規のベクターは、放線菌
および関連微生物における多数の組換体ＤＮＡの適用を
容易にするように設計された。ベクターの内の３種類
は、ストレプトミセス属において中〜高コピー数に調節
するｐＩＪ１０１複製起点の温度感受性誘導体を有す
る。このレプリコンの温度感受性は、ストレプトミセス
属遺伝子置換および突然変異体設計実験においてそれを
用いることを可能にする。ここに記載した第四のシャト
ルベクターは、ストレプトミセス属において低コピー数
に調節するＳＣＰ２＊ストレプトミセス属複製起点を有
し、これが、多数のストレプトミセス属種におけるクロ
ーニングおよび相補性実験で用いられるベクターに特有
の利点となる。
【００３５】これらのシャトルベクターは、ストレプト
ミセス属および大腸菌双方におけるクローニングに、並
びにストレプトミセス属における分子遺伝学技術での種
々の用途に有用である。構築物は構造的に安定であり且
つ多数のストレプトミセス属種において複製され、広い
寸法範囲のクローン化ＤＮＡフラグメントが前後の一つ
一つの宿主に転移することを可能にする。これらのベク
ターは、広範に用いられたＣｏｌＥ１複製起点を有し
［ハーシュフィールド（Ｈｅｒｓｈｆｉｅｌｄ），
Ｖ．、ボイア（Ｂｏｙｅｒ），Ｈ．Ｗ．、ヤノフスキ
（Ｙａｎｏｆｓｋｙ），Ｃ．、ロヴェット（Ｌｏｖｅｔ
ｔ），Ｍ．Ａ．およびＤ．Ｒ．ヘリンスキ（Ｈｅｌｉｎ
ｓｋｉ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，
７１：３４５５，１９７４］、そして組換えＤＮＡ実験
において一般的に用いられる全大腸菌株中で効率よく複
製される。これらのベクターは、放線菌細胞中への形質
転換によって抗生物質チオストレプトンに対する耐性を
与えるｔｓｒ遺伝子および、大腸菌細胞中への形質転換
によって抗生物質アンピシリンに対する耐性を与えるａ
ｍｐ遺伝子双方を有する。本発明において記載したシャ
トルベクターの内の３種類は、ストレプトミセス属にお
いて中〜高コピー数に調節するストレプトミセス属温度
感受性複製起点を有する。このレプリコンの温度感受性
および環境ストレス下でのその不十分な生存は、ストレ
プトミセス属遺伝子置換および突然変異体設計実験にお
いてそれを用いることを可能にする。これらのシャトル
ベクターの内の一つは、多数のクローニング領域に隣接
するＳＰ６およびＴ７双方のＲＮＡポリメラーゼプロモ
ーターを含み、ハイブリッド形成実験に有用なｃＲＮＡ
転写物の合成を可能にする。更に、クローニング領域
は、β−ガラクトシダーゼ遺伝子のα−ペプチドコーデ
ィング領域中に位置し、大腸菌における着色スクリーニ
ングによって組換体クローンを識別することを可能にす
る。本明細書中に記載した第四のシャトルベクターは、
ストレプトミセス属において低コピー数に調節するスト
レプトミセス属複製起点を有し、これが、多数のストレ
プトミセス属種におけるクローニングおよび相補性実験
で用いられるベクターに特有の利点となる。
ミセス属および大腸菌双方におけるクローニングに、並
びにストレプトミセス属における分子遺伝学技術での種
々の用途に有用である。構築物は構造的に安定であり且
つ多数のストレプトミセス属種において複製され、広い
寸法範囲のクローン化ＤＮＡフラグメントが前後の一つ
一つの宿主に転移することを可能にする。これらのベク
ターは、広範に用いられたＣｏｌＥ１複製起点を有し
［ハーシュフィールド（Ｈｅｒｓｈｆｉｅｌｄ），
Ｖ．、ボイア（Ｂｏｙｅｒ），Ｈ．Ｗ．、ヤノフスキ
（Ｙａｎｏｆｓｋｙ），Ｃ．、ロヴェット（Ｌｏｖｅｔ
ｔ），Ｍ．Ａ．およびＤ．Ｒ．ヘリンスキ（Ｈｅｌｉｎ
ｓｋｉ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，
７１：３４５５，１９７４］、そして組換えＤＮＡ実験
において一般的に用いられる全大腸菌株中で効率よく複
製される。これらのベクターは、放線菌細胞中への形質
転換によって抗生物質チオストレプトンに対する耐性を
与えるｔｓｒ遺伝子および、大腸菌細胞中への形質転換
によって抗生物質アンピシリンに対する耐性を与えるａ
ｍｐ遺伝子双方を有する。本発明において記載したシャ
トルベクターの内の３種類は、ストレプトミセス属にお
いて中〜高コピー数に調節するストレプトミセス属温度
感受性複製起点を有する。このレプリコンの温度感受性
および環境ストレス下でのその不十分な生存は、ストレ
プトミセス属遺伝子置換および突然変異体設計実験にお
いてそれを用いることを可能にする。これらのシャトル
ベクターの内の一つは、多数のクローニング領域に隣接
するＳＰ６およびＴ７双方のＲＮＡポリメラーゼプロモ
ーターを含み、ハイブリッド形成実験に有用なｃＲＮＡ
転写物の合成を可能にする。更に、クローニング領域
は、β−ガラクトシダーゼ遺伝子のα−ペプチドコーデ
ィング領域中に位置し、大腸菌における着色スクリーニ
ングによって組換体クローンを識別することを可能にす
る。本明細書中に記載した第四のシャトルベクターは、
ストレプトミセス属において低コピー数に調節するスト
レプトミセス属複製起点を有し、これが、多数のストレ
プトミセス属種におけるクローニングおよび相補性実験
で用いられるベクターに特有の利点となる。
【００３６】プラスミドシャトルベクターｐＣＤ２６２
は、 ａ．温度感受性ｐＩＪ７０２に誘導された放線菌複製起
点および、感受性放線菌宿主細胞中に形質転換された場
合にチオストレプトン耐性を伝えるＤＮＡ配列を含む約
５．７ｋｂのＳａｃＩ ｐＭＴ６６０残基；および ｂ．ＣｏｌＥ１大腸菌複製起点および、感受性大腸菌宿
主細胞中に形質転換された場合に抗生物質アンピシリン
耐性を伝えるＤＮＡ配列を含む約２．７ｋｂのＳａｃＩ
ｐＧＥＭ−３Ｚ（プロメガ・コーポレーション（Ｐｒ
ｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、マディソン、
ＷＩ）残基を含む。
は、 ａ．温度感受性ｐＩＪ７０２に誘導された放線菌複製起
点および、感受性放線菌宿主細胞中に形質転換された場
合にチオストレプトン耐性を伝えるＤＮＡ配列を含む約
５．７ｋｂのＳａｃＩ ｐＭＴ６６０残基；および ｂ．ＣｏｌＥ１大腸菌複製起点および、感受性大腸菌宿
主細胞中に形質転換された場合に抗生物質アンピシリン
耐性を伝えるＤＮＡ配列を含む約２．７ｋｂのＳａｃＩ
ｐＧＥＭ−３Ｚ（プロメガ・コーポレーション（Ｐｒ
ｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、マディソン、
ＷＩ）残基を含む。
【００３７】この構築の結果として、プラスミドｐＣＤ
２６２は以下の有用な特徴を有する。すなわち、 ａ．それは、広い寸法範囲のＤＮＡフラグメントのクロ
ーニングを可能にする中程度の寸法（８．４ｋｂ）を有
し； ｂ．それは構造的に安定であり且つ種々の放線菌および
大腸菌宿主双方において効率よく複製され； ｃ．それは４種類の好都合なクローニング部位、すなわ
ち、ＢｇＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸ
ｂａＩを有し；そして ｄ．それは、ストレプトミセス属遺伝子置換および突然
変異体設計実験においてそれを用いることを可能にする
温度感受性放線菌レプリコンを有する。
２６２は以下の有用な特徴を有する。すなわち、 ａ．それは、広い寸法範囲のＤＮＡフラグメントのクロ
ーニングを可能にする中程度の寸法（８．４ｋｂ）を有
し； ｂ．それは構造的に安定であり且つ種々の放線菌および
大腸菌宿主双方において効率よく複製され； ｃ．それは４種類の好都合なクローニング部位、すなわ
ち、ＢｇＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸ
ｂａＩを有し；そして ｄ．それは、ストレプトミセス属遺伝子置換および突然
変異体設計実験においてそれを用いることを可能にする
温度感受性放線菌レプリコンを有する。
【００３８】プラスミドシャトルベクターｐＣＤ５００
は、プラスミドｐＣＤ２６２中に存在する約０．８ｋｂ
のＰｓｔＩフラグメントを削除することによって構築さ
れた。この欠失の結果として、以下の更に有用な特徴が
得られた。すなわち、 ａ．その寸法は更に小さく（７．６ｋｂ）； ｂ．それは５種類の好都合なクローニング部位、すなわ
ち、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳａｃＩ、ＳｐｈＩ
およびＰｓｔＩを有する。
は、プラスミドｐＣＤ２６２中に存在する約０．８ｋｂ
のＰｓｔＩフラグメントを削除することによって構築さ
れた。この欠失の結果として、以下の更に有用な特徴が
得られた。すなわち、 ａ．その寸法は更に小さく（７．６ｋｂ）； ｂ．それは５種類の好都合なクローニング部位、すなわ
ち、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳａｃＩ、ＳｐｈＩ
およびＰｓｔＩを有する。
【００３９】プラスミドシャトルベクターｐＣＤ３８５
は、 ａ．バクテリオファージＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ中に
存在する３′〜５′エキソヌクレアーゼ活性の作用によ
ってブラント末端付きになった約５．７ｋｂのＳａｃＩ
ｐＭＴ６６０残基を含む。この残基は、温度感受性ｐ
ＩＪ７０２に誘導された放線菌複製起点および、感受性
放線菌宿主細胞中に形質転換された場合にチオストレプ
トン耐性を伝えるＤＮＡ配列；および ｂ．大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメン
トによって触媒された充填反応によってブラント末端付
きになった約２．７ｋｂのＮｄｅＩ ｐ１ＧＥＭ−３Ｚ
残基を含む。この残基は、β−ガラクトシダーゼのアミ
ノ末端フラグメントをコードする大腸菌のｌａｃオペロ
ン由来のＤＮＡセグメントを含む［ヤニシュ・ペロン
（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ），Ｃ．、ヴィエイラ
（Ｖｉｅｉｒａ），Ｊ．およびＪ．メシング（Ｍｅｓｓ
ｉｎｇ）、Ｇｅｎｅ，３３，１０３，１９８５］。イソ
プロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）によ
って合成を引起こすことができるこのフラグメントは、
宿主によってコードされたβ−ガラクトシダーゼの欠陥
型との対立遺伝子内（α）相補性が可能である。インデ
ューサーＩＰＴＧに対して暴露された大腸菌細胞は、酵
素の両方のフラグメントを合成し、そして色素原基質５
−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラ
クトシド（Ｘ−ｇａｌ）を含む培地上で平板培養した場
合に青色コロニーを形成する。プラスミドのポリクロー
ニング部位中への異種ＤＮＡの挿入は、β−ガラクトシ
ダーゼのアミノ末端フラグメントを失活させ且つα−相
補性を無効にする。したがって、組換体プラスミドを有
する細菌は白色コロニーを生じる。更に、バクテリオフ
ァージＳＰ６およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモー
ターは両方とも多数のクローニング領域に隣接して位置
し、ハイブリッド形成実験に有用なｃＲＮＡ転写物の合
成を可能にする。更に、ｐＧＥＭ−３Ｚ残基は、Ｃｏｌ
Ｅ１大腸菌複製起点および、感受性大腸菌宿主中に形質
転換された場合に抗生物質アンピシリン耐性を伝えるＤ
ＮＡ配列を含む。
は、 ａ．バクテリオファージＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ中に
存在する３′〜５′エキソヌクレアーゼ活性の作用によ
ってブラント末端付きになった約５．７ｋｂのＳａｃＩ
ｐＭＴ６６０残基を含む。この残基は、温度感受性ｐ
ＩＪ７０２に誘導された放線菌複製起点および、感受性
放線菌宿主細胞中に形質転換された場合にチオストレプ
トン耐性を伝えるＤＮＡ配列；および ｂ．大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメン
トによって触媒された充填反応によってブラント末端付
きになった約２．７ｋｂのＮｄｅＩ ｐ１ＧＥＭ−３Ｚ
残基を含む。この残基は、β−ガラクトシダーゼのアミ
ノ末端フラグメントをコードする大腸菌のｌａｃオペロ
ン由来のＤＮＡセグメントを含む［ヤニシュ・ペロン
（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ），Ｃ．、ヴィエイラ
（Ｖｉｅｉｒａ），Ｊ．およびＪ．メシング（Ｍｅｓｓ
ｉｎｇ）、Ｇｅｎｅ，３３，１０３，１９８５］。イソ
プロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）によ
って合成を引起こすことができるこのフラグメントは、
宿主によってコードされたβ−ガラクトシダーゼの欠陥
型との対立遺伝子内（α）相補性が可能である。インデ
ューサーＩＰＴＧに対して暴露された大腸菌細胞は、酵
素の両方のフラグメントを合成し、そして色素原基質５
−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラ
クトシド（Ｘ−ｇａｌ）を含む培地上で平板培養した場
合に青色コロニーを形成する。プラスミドのポリクロー
ニング部位中への異種ＤＮＡの挿入は、β−ガラクトシ
ダーゼのアミノ末端フラグメントを失活させ且つα−相
補性を無効にする。したがって、組換体プラスミドを有
する細菌は白色コロニーを生じる。更に、バクテリオフ
ァージＳＰ６およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモー
ターは両方とも多数のクローニング領域に隣接して位置
し、ハイブリッド形成実験に有用なｃＲＮＡ転写物の合
成を可能にする。更に、ｐＧＥＭ−３Ｚ残基は、Ｃｏｌ
Ｅ１大腸菌複製起点および、感受性大腸菌宿主中に形質
転換された場合に抗生物質アンピシリン耐性を伝えるＤ
ＮＡ配列を含む。
【００４０】この構築の結果として、プラスミドｐＣＤ
３８５は以下の有用な特徴を有する。すなわち、 ａ．それは、広い寸法範囲のＤＮＡフラグメントのクロ
ーニングを可能にする中程度の寸法（８．４ｋｂ）を有
し； ｂ．それは構造的に安定であり且つ種々の放線菌および
大腸菌宿主双方において効率よく複製され； ｃ．それは６種類の好都合なクローニング部位、すなわ
ち、ＢｇＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｓａｃ
Ｉ、ＳｓｐＩおよびＸｂａＩを有し； ｄ．クローニング部位の内の４種類（ＥｃｏＲＩ、Ｈｉ
ｎｄＩＩＩ、ＳａｃＩおよびＸｂａＩ）はβ−ガラクト
シダーゼ遺伝子のα−ペプチドコーディング領域中に位
置して、大腸菌における着色スクリーニングによって組
換体クローンを識別するのを可能にし； ｅ．それは、上述の制限部位に隣接するＳＰ６およびＴ
７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを有して、ハイブ
リッド形成実験に有用なｃＲＮＡ転写物の合成を可能に
し；そして ｆ．それは、ストレプトミセス属遺伝子置換および突然
変異体設計実験においてそれを用いることを可能にする
温度感受性放線菌レプリコンを有する。
３８５は以下の有用な特徴を有する。すなわち、 ａ．それは、広い寸法範囲のＤＮＡフラグメントのクロ
ーニングを可能にする中程度の寸法（８．４ｋｂ）を有
し； ｂ．それは構造的に安定であり且つ種々の放線菌および
大腸菌宿主双方において効率よく複製され； ｃ．それは６種類の好都合なクローニング部位、すなわ
ち、ＢｇＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｓａｃ
Ｉ、ＳｓｐＩおよびＸｂａＩを有し； ｄ．クローニング部位の内の４種類（ＥｃｏＲＩ、Ｈｉ
ｎｄＩＩＩ、ＳａｃＩおよびＸｂａＩ）はβ−ガラクト
シダーゼ遺伝子のα−ペプチドコーディング領域中に位
置して、大腸菌における着色スクリーニングによって組
換体クローンを識別するのを可能にし； ｅ．それは、上述の制限部位に隣接するＳＰ６およびＴ
７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを有して、ハイブ
リッド形成実験に有用なｃＲＮＡ転写物の合成を可能に
し；そして ｆ．それは、ストレプトミセス属遺伝子置換および突然
変異体設計実験においてそれを用いることを可能にする
温度感受性放線菌レプリコンを有する。
【００４１】プラスミドシャトルベクターｐＣＤ３９６
は、 ａ．ＳＣＰ２＊放線菌複製起点および、感受性放線菌宿
主細胞中に形質転換された場合にチオストレプトン耐性
を伝えるＤＮＡ配列を含む約２３．４ｋｂのＢａｍＨＩ
／ＥｃｏＲＩ ｐＩＪ９２２残基；並びに ｂ．ＣｏｌＥ１大腸菌複製起点および、感受性大腸菌宿
主細胞中に形質転換された場合に抗生物質アンピシリン
耐性を伝えるＤＮＡ配列を含む約３．２ｋｂのＢａｍＨ
Ｉ／ＥｃｏＲＩ ｐ１ＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）残基を含
む。
は、 ａ．ＳＣＰ２＊放線菌複製起点および、感受性放線菌宿
主細胞中に形質転換された場合にチオストレプトン耐性
を伝えるＤＮＡ配列を含む約２３．４ｋｂのＢａｍＨＩ
／ＥｃｏＲＩ ｐＩＪ９２２残基；並びに ｂ．ＣｏｌＥ１大腸菌複製起点および、感受性大腸菌宿
主細胞中に形質転換された場合に抗生物質アンピシリン
耐性を伝えるＤＮＡ配列を含む約３．２ｋｂのＢａｍＨ
Ｉ／ＥｃｏＲＩ ｐ１ＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）残基を含
む。
【００４２】この構築の結果として、プラスミドｐＣＤ
３９６は以下の有用な特徴を有する。すなわち、 ａ．それは構造的に安定であり且つ種々のストレプトミ
セス属菌および大腸菌宿主双方において効率よく複製さ
れ； ｂ．それは４種類の好都合なクローニング部位、すなわ
ち、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸ
ｈｏＩを有し； ｃ．ザバロフスキ（Ｚａｂａｒｏｖｓｋｙ）およびアリ
クメッツ（Ａｌｌｉｋｍｅｔｓ）、Ｇｅｎｅ，４２：１
１９，１９８６によって記載されたように、簡単なゲノ
ムクローニング計画の適用を可能にするＸｈｏＩクロー
ニング部位を有し；そして ｄ．それは、相補性実験に特有の利点となる、ストレプ
トミセス属において低コピー数に調節する放線菌複製起
点を有する。
３９６は以下の有用な特徴を有する。すなわち、 ａ．それは構造的に安定であり且つ種々のストレプトミ
セス属菌および大腸菌宿主双方において効率よく複製さ
れ； ｂ．それは４種類の好都合なクローニング部位、すなわ
ち、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸ
ｈｏＩを有し； ｃ．ザバロフスキ（Ｚａｂａｒｏｖｓｋｙ）およびアリ
クメッツ（Ａｌｌｉｋｍｅｔｓ）、Ｇｅｎｅ，４２：１
１９，１９８６によって記載されたように、簡単なゲノ
ムクローニング計画の適用を可能にするＸｈｏＩクロー
ニング部位を有し；そして ｄ．それは、相補性実験に特有の利点となる、ストレプ
トミセス属において低コピー数に調節する放線菌複製起
点を有する。
【００４３】下記を、ブダペスト条約の条件に基づい
て、本出願に関して特許がを付与される場合に寄託の永
続性およびそれに対する公的に容易な利用可能性を与え
る承認された受託機関であるアメリカン・タイプ・カル
チャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ
Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、ロックビ
ル、メリーランド州に寄託した。寄託は、米国規制基準
３７条１．１４および米国成文法３５条１２２に基づい
て米国特許商標局長によって資格が与えられることが決
定されたものに対しておよび本出願の対応またはその所
産が提出されている国の外国特許法にしたがって本出願
の訴訟係属中に入手可能である。寄託された微生物の公
的利用可能性に対する制限はいずれも、特許の付与によ
って決定的に排除される。
て、本出願に関して特許がを付与される場合に寄託の永
続性およびそれに対する公的に容易な利用可能性を与え
る承認された受託機関であるアメリカン・タイプ・カル
チャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ
Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、ロックビ
ル、メリーランド州に寄託した。寄託は、米国規制基準
３７条１．１４および米国成文法３５条１２２に基づい
て米国特許商標局長によって資格が与えられることが決
定されたものに対しておよび本出願の対応またはその所
産が提出されている国の外国特許法にしたがって本出願
の訴訟係属中に入手可能である。寄託された微生物の公
的利用可能性に対する制限はいずれも、特許の付与によ
って決定的に排除される。
【００４４】 本発明によるＡＴＣＣ寄託 寄託者ファイザー・インコーポレーテッド ＡＴＣＣ表示 （Ｐｆｉｚｅｒ Ｉｎｃ．）による識別番号 大腸菌、ＦＤ２９３９０ ６９４３２ 大腸菌、ＦＤ２９３９１ ６９４３３ 大腸菌、ＦＤ２９４０１ ６９４３６ 大腸菌、ＦＤ２９３９３ ６９４３５ Ｓ．リヴィダンスＴＫ６４、ＦＤ２９４０５ ６９４４２ Ｓ．リヴィダンスＴＫ６４、ＦＤ２９４１８ ６９４４４ Ｓ．リヴィダンスＴＫ６４、ＦＤ２９４０４ ６９４４１ Ｓ．リヴィダンスＴＫ６４、ＦＤ２９４０６ ６９４４３ 以下に、図面でも図示されている新規のプラスミドシャ
トルベクターｐＣＤ２６２、ｐＣＤ５００、ｐＣＤ３８
５およびｐＣＤ３９６の構築の実施例を詳述する。
トルベクターｐＣＤ２６２、ｐＣＤ５００、ｐＣＤ３８
５およびｐＣＤ３９６の構築の実施例を詳述する。
【００４５】
【実施例】実施例１ ストレプトミセス属菌株からのプラスミドベクターの大
規模製造 プラスミドベクターｐＩＪ９２２を含むストレプト・リ
ヴィダンス菌株ＴＫ６４［リディエートら、Ｇｅｎｅ，
３５，２２３〜２３５，１９８５］およびプラスミドベ
クターｐＭＴ６６０を含むＳ．リヴィダンスＴＫ６４
［バーチ，Ａ．Ｗ．およびカラム，Ｊ．、Ｊ．Ｇｅｎ．
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３１，１２９９〜１３０３，
１９８５］は、Ｄ．Ａ．ホップウッド博士（ザ・ジョン
・インス・インスティトゥート（Ｔｈｅ Ｊｏｈｎ Ｉ
ｎｎｅｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、ノリッジ、英国）に
よって快く提供された。Ｓ．リヴィダンス菌株ＴＫ６４
は極めて十分に分析されており、しかも放線菌の研究に
おいて広範囲に用いられる。この菌株の詳細な説明は、
教本「ストレプトミセス属の遺伝子操作、実験室マニュ
アル（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏ
ｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、ザ・ジョン・インス・ファウ
ンデーション（Ｔｈｅ Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｆｏｕ
ｎｄａｔｉｏｎ）、ノリッジ、Ｕ．Ｋ．，１９８５に見
出しうるが、そこには更に、放線菌培養物の他の取扱い
手順および放線菌細胞の実験に適用される基本的な分子
生物学プロトコルが詳細に記載されている。Ｓ．リヴィ
ダンス菌株をＲ２ＹＥ寒天平板上で増殖させた。Ｒ２Ｙ
Ｅ培地（トンプソン，Ｃ．Ｊ．、ワード（Ｗａｒｄ），
Ｊ．Ｍ．およびＤ．Ａ．ホップウッド、１９８０，Ｎａ
ｔｕｒｅ，２８６：５２５〜５２７）は、スクロース１
０．３ｇ、Ｋ２ＳＯ４が０．０２５ｇ、ＭｇＣｌ２・６
Ｈ２Ｏが１．０１２ｇ、グルコース１ｇ、カサミノ酸
０．０１ｇおよび寒天２．２ｇを蒸留水８０ｍｌ中に溶
解させることによって製造され且つ１２１℃で４０分間
オートクレーブにかけられた。次に、以下の化合物、す
なわち、微量元素溶液（１リットル当り：ＺｎＣｌ２が
４０ｍｇ、ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏが２００ｍｇ、ＣｕＣ
ｌ２・２Ｈ２Ｏが１０ｍｇ、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏが１
０ｍｇ、Ｎａ２Ｂ４Ｏ７・１０Ｈ２Ｏが１０ｍｇおよび
（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏが１０ｍｇ）０．
２ｍｌ、０．５％ＫＨ２ＰＯ４が１ｍｌ、３．６８％Ｃ
ａＣｌ２・２Ｈ２Ｏが８．０２ｍｌ、２０％Ｌ−プロリ
ン１．５ｍｌ、ＴＥＳ緩衝液（０．２５Ｍトリス−ＨＣ
ｌ、ｐＨ７．２；０．０５ＭＥＤＴＡナトリウム；０．
５Ｍ ＮａＣｌ）１０ｍｌ、１Ｎ ＮａＯＨが０．５ｍ
ｌおよび１０％酵母抽出物５ｍｌを、濾過滅菌水溶液と
して逐次的に加えた。プラスミドＤＮＡは、液体ＹＥＭ
Ｅ培地（ビッブ（Ｂｉｂｂ），Ｍ．Ｊ．、フリーマン
（Ｆｒｅｅｍａｎ），Ｒ．Ｆ．およびＤ．Ａ．ホップウ
ッド、１９７７，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，
１５４：１５５〜１６６）中で増殖した培養物から製造
された。ＹＥＭＥ培地は、１リットル当り酵母抽出物３
ｇ、バクト−ペプトン５ｇ、麦芽抽出物３ｇ、スクロー
ス３４０ｇを含んだ。１２１℃で４０分間オートクレー
ブにかけた後、２．５Ｍ ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏの２ｍ
ｌを加えた。培養物を３０℃で４０〜４８時間増殖させ
た。放線菌細胞の培養物５００ｍｌからの菌糸体を遠心
分離によって採集し、そしてリゾチーム溶液（０．３Ｍ
スクロース、０．０２５Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．
０）および０．０２５Ｍ ＥＤＴＡ中リゾチーム２ｍｇ
／ｍｌ）で最終容量５０ｍｌまで再懸濁させた。この工
程の後、本質的には「ストレプトミセス属の遺伝子操
作、実験室マニュアル」、ザ・ジョン・インス・ファウ
ンデーション、ノリッジ、１９８５のマニュアルに記載
されたように、アルカリ溶解法にしたがってプラスミド
を製造した。ＤＮＡペレットを、１０ｍＭトリス−ＨＣ
ｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡの５００μｌ中に再
溶解させ、そして更に、本質的にはマニアティスら、分
子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ）−実験室マニュアル、コールド・スプリング・ハー
バー・ラボラトリー、１９８９に記載されたように、塩
化セシウム−臭化エチジウム勾配超遠心分離によって精
製した。最終的に、単離されたプラスミドＤＮＡをＤＮ
Ａ緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、４ｍＭ ＮａＣ
ｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ；ｐＨ７．５）中に溶解させ
て、濃度をプラスミドＤＮＡ約１μｇ／１０μｌ（緩衝
液）にした。
規模製造 プラスミドベクターｐＩＪ９２２を含むストレプト・リ
ヴィダンス菌株ＴＫ６４［リディエートら、Ｇｅｎｅ，
３５，２２３〜２３５，１９８５］およびプラスミドベ
クターｐＭＴ６６０を含むＳ．リヴィダンスＴＫ６４
［バーチ，Ａ．Ｗ．およびカラム，Ｊ．、Ｊ．Ｇｅｎ．
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３１，１２９９〜１３０３，
１９８５］は、Ｄ．Ａ．ホップウッド博士（ザ・ジョン
・インス・インスティトゥート（Ｔｈｅ Ｊｏｈｎ Ｉ
ｎｎｅｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、ノリッジ、英国）に
よって快く提供された。Ｓ．リヴィダンス菌株ＴＫ６４
は極めて十分に分析されており、しかも放線菌の研究に
おいて広範囲に用いられる。この菌株の詳細な説明は、
教本「ストレプトミセス属の遺伝子操作、実験室マニュ
アル（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏ
ｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、ザ・ジョン・インス・ファウ
ンデーション（Ｔｈｅ Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｆｏｕ
ｎｄａｔｉｏｎ）、ノリッジ、Ｕ．Ｋ．，１９８５に見
出しうるが、そこには更に、放線菌培養物の他の取扱い
手順および放線菌細胞の実験に適用される基本的な分子
生物学プロトコルが詳細に記載されている。Ｓ．リヴィ
ダンス菌株をＲ２ＹＥ寒天平板上で増殖させた。Ｒ２Ｙ
Ｅ培地（トンプソン，Ｃ．Ｊ．、ワード（Ｗａｒｄ），
Ｊ．Ｍ．およびＤ．Ａ．ホップウッド、１９８０，Ｎａ
ｔｕｒｅ，２８６：５２５〜５２７）は、スクロース１
０．３ｇ、Ｋ２ＳＯ４が０．０２５ｇ、ＭｇＣｌ２・６
Ｈ２Ｏが１．０１２ｇ、グルコース１ｇ、カサミノ酸
０．０１ｇおよび寒天２．２ｇを蒸留水８０ｍｌ中に溶
解させることによって製造され且つ１２１℃で４０分間
オートクレーブにかけられた。次に、以下の化合物、す
なわち、微量元素溶液（１リットル当り：ＺｎＣｌ２が
４０ｍｇ、ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏが２００ｍｇ、ＣｕＣ
ｌ２・２Ｈ２Ｏが１０ｍｇ、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏが１
０ｍｇ、Ｎａ２Ｂ４Ｏ７・１０Ｈ２Ｏが１０ｍｇおよび
（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏが１０ｍｇ）０．
２ｍｌ、０．５％ＫＨ２ＰＯ４が１ｍｌ、３．６８％Ｃ
ａＣｌ２・２Ｈ２Ｏが８．０２ｍｌ、２０％Ｌ−プロリ
ン１．５ｍｌ、ＴＥＳ緩衝液（０．２５Ｍトリス−ＨＣ
ｌ、ｐＨ７．２；０．０５ＭＥＤＴＡナトリウム；０．
５Ｍ ＮａＣｌ）１０ｍｌ、１Ｎ ＮａＯＨが０．５ｍ
ｌおよび１０％酵母抽出物５ｍｌを、濾過滅菌水溶液と
して逐次的に加えた。プラスミドＤＮＡは、液体ＹＥＭ
Ｅ培地（ビッブ（Ｂｉｂｂ），Ｍ．Ｊ．、フリーマン
（Ｆｒｅｅｍａｎ），Ｒ．Ｆ．およびＤ．Ａ．ホップウ
ッド、１９７７，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，
１５４：１５５〜１６６）中で増殖した培養物から製造
された。ＹＥＭＥ培地は、１リットル当り酵母抽出物３
ｇ、バクト−ペプトン５ｇ、麦芽抽出物３ｇ、スクロー
ス３４０ｇを含んだ。１２１℃で４０分間オートクレー
ブにかけた後、２．５Ｍ ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏの２ｍ
ｌを加えた。培養物を３０℃で４０〜４８時間増殖させ
た。放線菌細胞の培養物５００ｍｌからの菌糸体を遠心
分離によって採集し、そしてリゾチーム溶液（０．３Ｍ
スクロース、０．０２５Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．
０）および０．０２５Ｍ ＥＤＴＡ中リゾチーム２ｍｇ
／ｍｌ）で最終容量５０ｍｌまで再懸濁させた。この工
程の後、本質的には「ストレプトミセス属の遺伝子操
作、実験室マニュアル」、ザ・ジョン・インス・ファウ
ンデーション、ノリッジ、１９８５のマニュアルに記載
されたように、アルカリ溶解法にしたがってプラスミド
を製造した。ＤＮＡペレットを、１０ｍＭトリス−ＨＣ
ｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡの５００μｌ中に再
溶解させ、そして更に、本質的にはマニアティスら、分
子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ）−実験室マニュアル、コールド・スプリング・ハー
バー・ラボラトリー、１９８９に記載されたように、塩
化セシウム−臭化エチジウム勾配超遠心分離によって精
製した。最終的に、単離されたプラスミドＤＮＡをＤＮ
Ａ緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、４ｍＭ ＮａＣ
ｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ；ｐＨ７．５）中に溶解させ
て、濃度をプラスミドＤＮＡ約１μｇ／１０μｌ（緩衝
液）にした。
【００４６】実施例２ 大腸菌株からのプラスミドベクターの大規模製造 複製ベクターを有する大腸菌株のアンピシリン耐性形質
転換細胞は、マニアティスら、分子クローニング−実験
室マニュアル、コールド・スプリング・ハーバー・ラボ
ラトリー、１９８９に記載の標準的なプロトコルにした
がって、問題のプラスミドを用いるコンピテント大腸菌
Ｋ１２ＤＨ５−α細胞の形質転換によって得られた。コ
ンピテント大腸菌株ＤＨ５−α細胞（ライフ・テクノロ
ジーズ・インコーポレーテッド（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、ゲイサーズバーグ、ＭＤ
から購入された）を、供給者によって提示された方法に
より、精製プラスミドＤＮＡを用いて形質転換した。特
定の大腸菌形質転換細胞の単一細菌コロニーを、標準的
な微生物学的手順にしたがって、水溶液１リットル当り
バクトトリプトン１０ｇ、バクト酵母抽出物５ｇおよび
ＮａＣｌ（ｐＨ７．０）１０ｇとアンピシリン５０ｍｇ
を含む滅菌ＬＢ培地中に接種した。培養物を３５℃で一
晩中インキュベートした。
転換細胞は、マニアティスら、分子クローニング−実験
室マニュアル、コールド・スプリング・ハーバー・ラボ
ラトリー、１９８９に記載の標準的なプロトコルにした
がって、問題のプラスミドを用いるコンピテント大腸菌
Ｋ１２ＤＨ５−α細胞の形質転換によって得られた。コ
ンピテント大腸菌株ＤＨ５−α細胞（ライフ・テクノロ
ジーズ・インコーポレーテッド（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、ゲイサーズバーグ、ＭＤ
から購入された）を、供給者によって提示された方法に
より、精製プラスミドＤＮＡを用いて形質転換した。特
定の大腸菌形質転換細胞の単一細菌コロニーを、標準的
な微生物学的手順にしたがって、水溶液１リットル当り
バクトトリプトン１０ｇ、バクト酵母抽出物５ｇおよび
ＮａＣｌ（ｐＨ７．０）１０ｇとアンピシリン５０ｍｇ
を含む滅菌ＬＢ培地中に接種した。培養物を３５℃で一
晩中インキュベートした。
【００４７】翌朝、４℃において１０，０００ｒｐｍで
５分間の遠心分離によって細菌細胞を採集した。ベクタ
ーＤＮＡは、デノヤ（Ｄｅｎｏｙａ）ら（Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｓ Ｌｅｔｔ．，１９８５，２９：８７）によって
記載されたように、バーンボイム（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ）
およびドリー（Ｄｏｌｙ）（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓ．，１９７９，７：１５１３）の変法を用い
て新鮮な採集された大腸菌細胞から単離された。ＤＮＡ
ペレットを、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１
ｍＭ ＥＤＴＡの５００μｌ中に再溶解させ、そして更
に、本質的にはマニアティスら、分子クローニング−実
験室マニュアル、コールド・スプリング・ハーバー・ラ
ボラトリー、１９８９に記載されたように、塩化セシウ
ム−臭化エチジウム勾配超遠心分離によって精製した。
最終的に、単離されたプラスミドＤＮＡをＤＮＡ緩衝液
（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、４ｍＭ ＮａＣｌ、０．１
ｍＭ ＥＤＴＡ；ｐＨ７．５）中に溶解させて、濃度を
プラスミドＤＮＡ約１μｇ／１０μｌ（緩衝液）にし
た。
５分間の遠心分離によって細菌細胞を採集した。ベクタ
ーＤＮＡは、デノヤ（Ｄｅｎｏｙａ）ら（Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｓ Ｌｅｔｔ．，１９８５，２９：８７）によって
記載されたように、バーンボイム（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ）
およびドリー（Ｄｏｌｙ）（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓ．，１９７９，７：１５１３）の変法を用い
て新鮮な採集された大腸菌細胞から単離された。ＤＮＡ
ペレットを、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１
ｍＭ ＥＤＴＡの５００μｌ中に再溶解させ、そして更
に、本質的にはマニアティスら、分子クローニング−実
験室マニュアル、コールド・スプリング・ハーバー・ラ
ボラトリー、１９８９に記載されたように、塩化セシウ
ム−臭化エチジウム勾配超遠心分離によって精製した。
最終的に、単離されたプラスミドＤＮＡをＤＮＡ緩衝液
（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、４ｍＭ ＮａＣｌ、０．１
ｍＭ ＥＤＴＡ；ｐＨ７．５）中に溶解させて、濃度を
プラスミドＤＮＡ約１μｇ／１０μｌ（緩衝液）にし
た。
【００４８】実施例３ シャトルベクターｐＣＤ２６２の構築 プラスミドシャトルベクターｐＣＤ２６２は、ストレプ
トミセス属ベクターｐＭＴ６６０と大腸菌ベクターｐＧ
ＥＭ−３Ｚとをそれらの独特のＳａｃＩ制限部位で結合
したハイブリッドである。
トミセス属ベクターｐＭＴ６６０と大腸菌ベクターｐＧ
ＥＭ−３Ｚとをそれらの独特のＳａｃＩ制限部位で結合
したハイブリッドである。
【００４９】Ａ．プラスミドｐＭＴ６６０のＳａｃＩ消
化 ｐＭＴ６６０は、ストレプトミセス属において中〜高コ
ピー数に調節する温度感受性複製起点を含む５．７ｋｂ
のストレプトミセス属プラスミドである。この複製起点
に特有の温度感受性は、その親プラスミドｐＩＪ７０２
のヒドロキシラミンによるインビトロ突然変異誘発後に
得られた［バーチ，Ａ．Ｗ．およびカラム，Ｊ．、Ｊ．
Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３１，１２９９〜１
３０３，１９８５］。精製プラスミドｐＭＴ６６０は、
実施例１に記載のＳ．リヴィダンス形質転換細胞から製
造された。プラスミドＤＮＡをインビトロにおいて特定
部位で開裂し、予め開裂したＤＮＡを連結するのに用い
られる技術および用いられる特定の酵素の名称は分子生
物学の熟練者に周知であり、例えば、マニアティスらに
よる実験室マニュアル「分子クローニング」（コールド
・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、１９８９）に
記載されている。これに続いて、ＤＮＡ緩衝液２６μｌ
中約３μｇのプラスミドｐＭＴ６６０を、供給者によっ
て指定された検定用緩衝液中の制限酵素ＳａｃＩ（制限
酵素はいずれもベーリンガー・マンハイム・バイオケミ
カルズ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｈｅｉｍ Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）から購入した）１０単位と一緒
に全反応容量３０μｌ中において３７℃で４時間インキ
ュベートした。ＳａｃＩによる制限後、ＤＮＡを等量の
フェノール−クロロホルムで２回、等量のエーテルで２
回抽出し、そして最後に２容量の無水エタノールを加え
ることによってＤＮＡを沈殿させた。沈殿したＤＮＡを
１０，０００ｘＧで１０分間の遠心分離によって回収し
且つ真空下で乾燥させた。次に、ＳａｃＩで処理したＤ
ＮＡをＤＮＡ緩衝液１２μｌ中に溶解させた。
化 ｐＭＴ６６０は、ストレプトミセス属において中〜高コ
ピー数に調節する温度感受性複製起点を含む５．７ｋｂ
のストレプトミセス属プラスミドである。この複製起点
に特有の温度感受性は、その親プラスミドｐＩＪ７０２
のヒドロキシラミンによるインビトロ突然変異誘発後に
得られた［バーチ，Ａ．Ｗ．およびカラム，Ｊ．、Ｊ．
Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３１，１２９９〜１
３０３，１９８５］。精製プラスミドｐＭＴ６６０は、
実施例１に記載のＳ．リヴィダンス形質転換細胞から製
造された。プラスミドＤＮＡをインビトロにおいて特定
部位で開裂し、予め開裂したＤＮＡを連結するのに用い
られる技術および用いられる特定の酵素の名称は分子生
物学の熟練者に周知であり、例えば、マニアティスらに
よる実験室マニュアル「分子クローニング」（コールド
・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、１９８９）に
記載されている。これに続いて、ＤＮＡ緩衝液２６μｌ
中約３μｇのプラスミドｐＭＴ６６０を、供給者によっ
て指定された検定用緩衝液中の制限酵素ＳａｃＩ（制限
酵素はいずれもベーリンガー・マンハイム・バイオケミ
カルズ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｈｅｉｍ Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）から購入した）１０単位と一緒
に全反応容量３０μｌ中において３７℃で４時間インキ
ュベートした。ＳａｃＩによる制限後、ＤＮＡを等量の
フェノール−クロロホルムで２回、等量のエーテルで２
回抽出し、そして最後に２容量の無水エタノールを加え
ることによってＤＮＡを沈殿させた。沈殿したＤＮＡを
１０，０００ｘＧで１０分間の遠心分離によって回収し
且つ真空下で乾燥させた。次に、ＳａｃＩで処理したＤ
ＮＡをＤＮＡ緩衝液１２μｌ中に溶解させた。
【００５０】Ｂ．プラスミドｐＧＥＭ−３ＺのＳａｃＩ
消化および脱リン酸化 ｐＧＥＭ−３Ｚは、プロメガ・コーポレーション（Ｐｒ
ｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、マディソン、
ＷＩから購入された２．７ｋｂの大腸菌ベクターであ
る。精製プラスミドｐＧＥＭ−３Ｚは、実施例１に記載
の大腸菌形質転換細胞から製造された。これに続いて、
ＤＮＡ緩衝液１μｌ中約１μｇのプラスミドｐＧＥＭ−
３Ｚを、供給者によって指定された検定用緩衝液中の制
限酵素ＳａｃＩ（ベーリンガー・マンハイム・バイオケ
ミカルズ）１０単位と一緒に全反応容量２０μｌ中にお
いて３７℃で３．５時間インキュベートした。次に、Ｓ
ａｃＩで直鎖状にしたｐＧＥＭ−３Ｚを、供給者から得
られた指示にしたがって、子ウシ腸アルカリ性ホスファ
ターゼ（ＣＩＡＰ）（プロメガ・コーポレーション、マ
ディソン、ＷＩから購入された）を用いて脱リン酸化し
た。反応混合物を３７℃で３０分間インキュベートした
後、ＤＮＡをフェノール／クロロホルムおよびエーテル
で連続的に抽出し、エタノールで沈殿させ、そして遠心
分離によってペレットにした。最終ペレットをＤＮＡ緩
衝液１０μｌ中に再溶解させた。
消化および脱リン酸化 ｐＧＥＭ−３Ｚは、プロメガ・コーポレーション（Ｐｒ
ｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、マディソン、
ＷＩから購入された２．７ｋｂの大腸菌ベクターであ
る。精製プラスミドｐＧＥＭ−３Ｚは、実施例１に記載
の大腸菌形質転換細胞から製造された。これに続いて、
ＤＮＡ緩衝液１μｌ中約１μｇのプラスミドｐＧＥＭ−
３Ｚを、供給者によって指定された検定用緩衝液中の制
限酵素ＳａｃＩ（ベーリンガー・マンハイム・バイオケ
ミカルズ）１０単位と一緒に全反応容量２０μｌ中にお
いて３７℃で３．５時間インキュベートした。次に、Ｓ
ａｃＩで直鎖状にしたｐＧＥＭ−３Ｚを、供給者から得
られた指示にしたがって、子ウシ腸アルカリ性ホスファ
ターゼ（ＣＩＡＰ）（プロメガ・コーポレーション、マ
ディソン、ＷＩから購入された）を用いて脱リン酸化し
た。反応混合物を３７℃で３０分間インキュベートした
後、ＤＮＡをフェノール／クロロホルムおよびエーテル
で連続的に抽出し、エタノールで沈殿させ、そして遠心
分離によってペレットにした。最終ペレットをＤＮＡ緩
衝液１０μｌ中に再溶解させた。
【００５１】Ｃ．ｐＣＤ２６２を製造する連結反応 ５．７ｋｂのＳａｃＩで直鎖状にしたｐＭＴ６６０（実
施例３Ａを参照されたい）約１０μｌおよび２．７ｋｂ
のＳａｃＩで直鎖状にし、ＣＩＡＰで脱リン酸化したｐ
ＧＥＭ−３Ｚ約２μｌをリガーゼ（ニュー・イングラン
ド・バイオラブズ・インコーポレーテッド（Ｎｅｗ Ｅ
ｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）、ビバリ
ー、ＭＡ）１単位と一緒に、供給者によって指定された
条件下で全反応容量２０μｌ中において１５℃で一晩中
インキュベートした。翌朝、連結反応混合物を用いて、
供給者によって指定された方法でコンピテント大腸菌株
ＤＨ５−α（ライフ・テクノロジーズ・インコーポレー
テッド、ゲイサーズバーグ、ＭＤ）を形質転換した。多
数のアンピシリン耐性形質転換細胞を回収した。これら
のコロニーは、独特の制限部位地図を含むプラスミドｐ
ＣＤ２６２を含むはずである。これは、菌株ＣＤ２６２
と称する一つのコロニーを選択し、この菌株から（実施
例２に予め記載された方法によって）プラスミドＤＮＡ
を単離し、そして制限地図を作成することによって確証
された。ｐＣＤ２６２の制限地図を図面の図４に示す。
施例３Ａを参照されたい）約１０μｌおよび２．７ｋｂ
のＳａｃＩで直鎖状にし、ＣＩＡＰで脱リン酸化したｐ
ＧＥＭ−３Ｚ約２μｌをリガーゼ（ニュー・イングラン
ド・バイオラブズ・インコーポレーテッド（Ｎｅｗ Ｅ
ｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）、ビバリ
ー、ＭＡ）１単位と一緒に、供給者によって指定された
条件下で全反応容量２０μｌ中において１５℃で一晩中
インキュベートした。翌朝、連結反応混合物を用いて、
供給者によって指定された方法でコンピテント大腸菌株
ＤＨ５−α（ライフ・テクノロジーズ・インコーポレー
テッド、ゲイサーズバーグ、ＭＤ）を形質転換した。多
数のアンピシリン耐性形質転換細胞を回収した。これら
のコロニーは、独特の制限部位地図を含むプラスミドｐ
ＣＤ２６２を含むはずである。これは、菌株ＣＤ２６２
と称する一つのコロニーを選択し、この菌株から（実施
例２に予め記載された方法によって）プラスミドＤＮＡ
を単離し、そして制限地図を作成することによって確証
された。ｐＣＤ２６２の制限地図を図面の図４に示す。
【００５２】実施例４ シャトルベクターｐＣＤ５００の構築 Ａ．シャトルベクターｐＣＤ２６２のＰｓｔＩ消化およ
び約７．６ｋｂの制限フラグメントの単離 精製プラスミドｐＣＤ２６２約３μｇおよびＰｓｔＩ制
限酵素１０単位を供給者によって指定された検定用緩衝
液中、全反応容量３０μｌ中において３７℃で２時間イ
ンキュベートした。次に、試料は、マニアティスらによ
って記載されたように、１ｘＴＢＥ緩衝液（９０ｍＭト
リス−ＨＣｌ、ｐＨ８．５、９０ｍＭホウ酸、２．５ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ）中の水平０．８％アガロースゲル中にお
いて１００Ｖで１．５時間電気泳動を行なった。分離し
たＤＮＡフラグメントは臭化エチジウムで染色し且つ３
６５ｎｍ紫外線によって蛍光バンドを可視化することに
よってゲル中で見出された。７．６ｋｂのＤＮＡバンド
を安全かみそりの刃でスライスし、そして一方向エレク
トロエルター（インターナショナル・バイオテクノロジ
ー・インコーポレーテッド（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａ
ｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．）、ニュー
ヘヴン、ＣＴ）を用いて７．５Ｍ酢酸アンモニウムを充
填したＶ字型ウェル中に８０Ｖで５０分間の電気溶出す
ることによってアガロースゲルからＤＮＡを回収した。
次に、ＤＮＡをエタノールで沈殿させ、ペレットにし、
そして最後にＤＮＡ緩衝液２２μｌ中に再溶解させた。
び約７．６ｋｂの制限フラグメントの単離 精製プラスミドｐＣＤ２６２約３μｇおよびＰｓｔＩ制
限酵素１０単位を供給者によって指定された検定用緩衝
液中、全反応容量３０μｌ中において３７℃で２時間イ
ンキュベートした。次に、試料は、マニアティスらによ
って記載されたように、１ｘＴＢＥ緩衝液（９０ｍＭト
リス−ＨＣｌ、ｐＨ８．５、９０ｍＭホウ酸、２．５ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ）中の水平０．８％アガロースゲル中にお
いて１００Ｖで１．５時間電気泳動を行なった。分離し
たＤＮＡフラグメントは臭化エチジウムで染色し且つ３
６５ｎｍ紫外線によって蛍光バンドを可視化することに
よってゲル中で見出された。７．６ｋｂのＤＮＡバンド
を安全かみそりの刃でスライスし、そして一方向エレク
トロエルター（インターナショナル・バイオテクノロジ
ー・インコーポレーテッド（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａ
ｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．）、ニュー
ヘヴン、ＣＴ）を用いて７．５Ｍ酢酸アンモニウムを充
填したＶ字型ウェル中に８０Ｖで５０分間の電気溶出す
ることによってアガロースゲルからＤＮＡを回収した。
次に、ＤＮＡをエタノールで沈殿させ、ペレットにし、
そして最後にＤＮＡ緩衝液２２μｌ中に再溶解させた。
【００５３】Ｂ．ｐＣＤ５００を製造する連結反応 電気溶出された７．６ｋｂのＰｓｔＩｐＣＤ２６２ Ｄ
ＮＡフラグメント（実施例４Ａを参照されたい）約１２
μｌをリガーゼ（ニュー・イングランド・バイオラブズ
・インコーポレーテッド、ビバリー、ＭＡ）１単位と一
緒に、供給者によって指定された条件下で全反応容量２
０μｌ中において１６℃で一晩中インキュベートした。
翌朝、前に論及されたように、連結反応混合物を用いて
コンピテント大腸菌株ＤＨ５−αを形質転換した。選択
された形質転換細胞を菌株ＣＤ５００と称した。次に、
識別された形質転換細胞を、引続きのシャトルベクター
ｐＣＤ５００の製造および単離に用いた。シャトルベク
ターｐＣＤ５００の制限地図を図５に示す。
ＮＡフラグメント（実施例４Ａを参照されたい）約１２
μｌをリガーゼ（ニュー・イングランド・バイオラブズ
・インコーポレーテッド、ビバリー、ＭＡ）１単位と一
緒に、供給者によって指定された条件下で全反応容量２
０μｌ中において１６℃で一晩中インキュベートした。
翌朝、前に論及されたように、連結反応混合物を用いて
コンピテント大腸菌株ＤＨ５−αを形質転換した。選択
された形質転換細胞を菌株ＣＤ５００と称した。次に、
識別された形質転換細胞を、引続きのシャトルベクター
ｐＣＤ５００の製造および単離に用いた。シャトルベク
ターｐＣＤ５００の制限地図を図５に示す。
【００５４】実施例５ シャトルベクターｐＣＤ３８５の構築 プラスミドシャトルベクターｐＣＤ３８５は、ストレプ
トミセス属ベクターｐＭＴ６６０と大腸菌ベクターｐＧ
ＥＭ−３Ｚとをそれらの独特のＳａｃＩおよびＮｄｅＩ
制限部位でそれぞれ結合したハイブリッドである。この
構築は、ｐＧＥＭ−３Ｚ中に存在する多数のクローニン
グ部位をそのまま保存することを示している。
トミセス属ベクターｐＭＴ６６０と大腸菌ベクターｐＧ
ＥＭ−３Ｚとをそれらの独特のＳａｃＩおよびＮｄｅＩ
制限部位でそれぞれ結合したハイブリッドである。この
構築は、ｐＧＥＭ−３Ｚ中に存在する多数のクローニン
グ部位をそのまま保存することを示している。
【００５５】Ａ．ｐＭＴ６６０のＳａｃＩ消化およびブ
ラント末端を生じる３′オーバーハンギング末端の修復 したがって、ｐＭＴ６６０約３μｇを、実例３Ａに記載
したのと本質的に同様の方法にしたがって、制限酵素Ｓ
ａｃＩで直鎖状にした。次に、ＤＮＡ試料を等量のフェ
ノール−クロロホルムで２回、等量のエーテルで２回抽
出し、そして最後に２容量の無水エタノールを加えるこ
とによってＤＮＡを沈殿させた。沈殿したＤＮＡを１
０，０００ｘＧで１０分間の遠心分離によって回収し且
つ真空下で乾燥させた。最後に、ＳａｃＩで処理したＤ
ＮＡをＤＮＡ緩衝液２０μｌ中に溶解させた。次に、Ｓ
ａｃＩで処理したｐＭＴ６６０約１８μｌを、３１ｍＭ
トリス酢酸緩衝液、ｐＨ７．９、１０ｍＭ酢酸マグネシ
ウム、６６ｍＭ酢酸ナトリウム、０．１ｍＭの各デオキ
シヌクレオチドおよび１０ｍＭ ＤＴＴを含む反応混合
物中においてバクテリオファージＴ４ ＤＮＡポリメラ
ーゼ（ＢＲＬ／ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）から購入された）
１０単位を用いて１１℃で１５分間処理した。次に、
０．５Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０の４μｌを、酵素が失
活するまで加えた。これらの条件下において、Ｔ４ Ｄ
ＮＡ中に存在する強力な３′〜５′エキソヌクレアーゼ
活性は、３′突出末端が二重らせん領域に達する場合に
その分解を止める。次に、前記のようにＤＮＡを抽出
し、沈殿させ、そしてＤＮＡ緩衝液２０μｌ中に再懸濁
させる。
ラント末端を生じる３′オーバーハンギング末端の修復 したがって、ｐＭＴ６６０約３μｇを、実例３Ａに記載
したのと本質的に同様の方法にしたがって、制限酵素Ｓ
ａｃＩで直鎖状にした。次に、ＤＮＡ試料を等量のフェ
ノール−クロロホルムで２回、等量のエーテルで２回抽
出し、そして最後に２容量の無水エタノールを加えるこ
とによってＤＮＡを沈殿させた。沈殿したＤＮＡを１
０，０００ｘＧで１０分間の遠心分離によって回収し且
つ真空下で乾燥させた。最後に、ＳａｃＩで処理したＤ
ＮＡをＤＮＡ緩衝液２０μｌ中に溶解させた。次に、Ｓ
ａｃＩで処理したｐＭＴ６６０約１８μｌを、３１ｍＭ
トリス酢酸緩衝液、ｐＨ７．９、１０ｍＭ酢酸マグネシ
ウム、６６ｍＭ酢酸ナトリウム、０．１ｍＭの各デオキ
シヌクレオチドおよび１０ｍＭ ＤＴＴを含む反応混合
物中においてバクテリオファージＴ４ ＤＮＡポリメラ
ーゼ（ＢＲＬ／ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）から購入された）
１０単位を用いて１１℃で１５分間処理した。次に、
０．５Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０の４μｌを、酵素が失
活するまで加えた。これらの条件下において、Ｔ４ Ｄ
ＮＡ中に存在する強力な３′〜５′エキソヌクレアーゼ
活性は、３′突出末端が二重らせん領域に達する場合に
その分解を止める。次に、前記のようにＤＮＡを抽出
し、沈殿させ、そしてＤＮＡ緩衝液２０μｌ中に再懸濁
させる。
【００５６】Ｂ．ｐＧＥＭ−３ＺのＮｄｅＩ消化、ブラ
ント末端を生じる５′オーバーハンギング末端の修復お
よび脱リン酸化 したがって、ＤＮＡ緩衝液１３μｌ中のプラスミドｐＧ
ＥＭ−３Ｚ約１．５μｇを、供給者によって指定された
検定用緩衝液中の制限酵素ＮｄｅＩ（ベーリンガー・マ
ンハイム・バイオケミカルズ）１０単位と一緒に全反応
容量４０μｌ中において３７℃で２時間インキュベート
した。次に、０．５ｍＭ ｄＮＴＰ（０．５ｍＭ各４ｄ
ＮＴＰ）４μｌおよび大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ（ベ
ーリンガー・マンハイム・バイオケミカルズ）のクレノ
ウフラグメント６単位を加え、そして混合物を３０℃で
１５分間更にインキュベートした。０．５Ｍ ＥＤＴ
Ａ、ｐＨ８．０を２μｌ加えることによって修復反応を
止めた後、前記のようにＤＮＡを抽出し、沈殿させ、そ
してＤＮＡ緩衝液１０μｌ中に再懸濁させた。最後に、
供給者から得られた指示にしたがって、ＮｄｅＩで直鎖
状にしたクレノウブラント末端付きｐＧＥＭ−３Ｚを、
子ウシ腸アルカリ性ホスファターゼ（ＣＩＡＰ）（プロ
メガ・コーポレーション、マディソン、ＷＩから購入さ
れた）を用いて脱リン酸化した。反応混合物を３７℃で
４５分間インキュベートした後、ＤＮＡをフェノール／
クロロホルムおよびエーテルで連続的に抽出し、エタノ
ールで沈殿させ、そして遠心分離によってペレットにし
た。最終ペレットをＤＮＡ緩衝液１０μｌ中に再溶解さ
せた。
ント末端を生じる５′オーバーハンギング末端の修復お
よび脱リン酸化 したがって、ＤＮＡ緩衝液１３μｌ中のプラスミドｐＧ
ＥＭ−３Ｚ約１．５μｇを、供給者によって指定された
検定用緩衝液中の制限酵素ＮｄｅＩ（ベーリンガー・マ
ンハイム・バイオケミカルズ）１０単位と一緒に全反応
容量４０μｌ中において３７℃で２時間インキュベート
した。次に、０．５ｍＭ ｄＮＴＰ（０．５ｍＭ各４ｄ
ＮＴＰ）４μｌおよび大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ（ベ
ーリンガー・マンハイム・バイオケミカルズ）のクレノ
ウフラグメント６単位を加え、そして混合物を３０℃で
１５分間更にインキュベートした。０．５Ｍ ＥＤＴ
Ａ、ｐＨ８．０を２μｌ加えることによって修復反応を
止めた後、前記のようにＤＮＡを抽出し、沈殿させ、そ
してＤＮＡ緩衝液１０μｌ中に再懸濁させた。最後に、
供給者から得られた指示にしたがって、ＮｄｅＩで直鎖
状にしたクレノウブラント末端付きｐＧＥＭ−３Ｚを、
子ウシ腸アルカリ性ホスファターゼ（ＣＩＡＰ）（プロ
メガ・コーポレーション、マディソン、ＷＩから購入さ
れた）を用いて脱リン酸化した。反応混合物を３７℃で
４５分間インキュベートした後、ＤＮＡをフェノール／
クロロホルムおよびエーテルで連続的に抽出し、エタノ
ールで沈殿させ、そして遠心分離によってペレットにし
た。最終ペレットをＤＮＡ緩衝液１０μｌ中に再溶解さ
せた。
【００５７】Ｃ．ｐＣＤ３８５を製造するブラント末端
連結反応 ＳａｃＩで直鎖状にし、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ処理
したｐＭＴ６６０（実施例５Ａを参照されたい）約８μ
ｌおよびＮｄｅＩで直鎖状にし、クレノウ処理し、ＣＩ
ＡＰで脱リン酸化したｐＧＥＭ−３Ｚ約１μｌをリガー
ゼ（ニュー・イングランド・バイオラブズ・インコーポ
レーテッド、ビバリー、ＭＡ）１単位と一緒に、実施例
３Ｃに記載したのと同様の条件下で一晩中インキュベー
トした。翌朝、連結反応混合物を用いて、前に論及した
ようにコンピテント大腸菌株ＤＨ５−αを形質転換し
た。選択された形質転換細胞を菌株ＣＤ３８５と称し
た。次に、識別された形質転換細胞を、引続きのシャト
ルベクターｐＣＤ３８５の製造および単離に用いた。シ
ャトルベクターｐＣＤ３８５の制限地図を図７に示す。
連結反応 ＳａｃＩで直鎖状にし、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ処理
したｐＭＴ６６０（実施例５Ａを参照されたい）約８μ
ｌおよびＮｄｅＩで直鎖状にし、クレノウ処理し、ＣＩ
ＡＰで脱リン酸化したｐＧＥＭ−３Ｚ約１μｌをリガー
ゼ（ニュー・イングランド・バイオラブズ・インコーポ
レーテッド、ビバリー、ＭＡ）１単位と一緒に、実施例
３Ｃに記載したのと同様の条件下で一晩中インキュベー
トした。翌朝、連結反応混合物を用いて、前に論及した
ようにコンピテント大腸菌株ＤＨ５−αを形質転換し
た。選択された形質転換細胞を菌株ＣＤ３８５と称し
た。次に、識別された形質転換細胞を、引続きのシャト
ルベクターｐＣＤ３８５の製造および単離に用いた。シ
ャトルベクターｐＣＤ３８５の制限地図を図７に示す。
【００５８】実施例６ シャトルベクターｐＣＤ３９６の構築 Ａ．ｐＩＪ９２２のＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ二重消化 精製プラスミドｐＩＪ９２２は、実施例１に記載のＳ．
リヴィダンス形質転換細胞から製造された。これに続い
て、ＤＮＡ緩衝液１０μｌ中のプラスミドｐＩＪ９２２
約３μｇを、供給者によって「Ｂ」と指定された検定用
緩衝液中の制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ（ベー
リンガー・マンハイム・バイオケミカルズから購入され
た）それぞれ１０単位と一緒に全反応容量３０μｌ中に
おいて３７℃で２時間インキュベートした。制限後、Ｄ
ＮＡを等量のフェノール−クロロホルムで２回、等量の
エーテルで２回抽出し、そして最後に２容量の無水エタ
ノールを加えることによってＤＮＡを沈殿させた。沈殿
したＤＮＡを遠心分離によって回収し且つ真空下で乾燥
させた。次に、ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで処理したＤＮ
ＡをＤＮＡ緩衝液１２μｌ中に溶解させた。
リヴィダンス形質転換細胞から製造された。これに続い
て、ＤＮＡ緩衝液１０μｌ中のプラスミドｐＩＪ９２２
約３μｇを、供給者によって「Ｂ」と指定された検定用
緩衝液中の制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ（ベー
リンガー・マンハイム・バイオケミカルズから購入され
た）それぞれ１０単位と一緒に全反応容量３０μｌ中に
おいて３７℃で２時間インキュベートした。制限後、Ｄ
ＮＡを等量のフェノール−クロロホルムで２回、等量の
エーテルで２回抽出し、そして最後に２容量の無水エタ
ノールを加えることによってＤＮＡを沈殿させた。沈殿
したＤＮＡを遠心分離によって回収し且つ真空下で乾燥
させた。次に、ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで処理したＤＮ
ＡをＤＮＡ緩衝液１２μｌ中に溶解させた。
【００５９】Ｂ．プラスミドｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）の
ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ消化および脱リン酸化 ｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）は、プロメガ・コーポレーショ
ン・マディソン、ＷＩから購入された。精製プラスミド
ｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）は、実施例１に記載の大腸菌形
質転換細胞から製造された。これに続いて、ＤＮＡ緩衝
液１０μｌ中のプラスミドｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）約１
μｇを、供給者によって「Ｂ」と指定された検定用緩衝
液中の制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ（ベーリン
ガー・マンハイム・バイオケミカルズから購入された）
それぞれ１０単位と一緒に、全反応容量３０μｌ中にお
いて３７℃で２時間インキュベートした。次に、Ｂａｍ
ＨＩ／ＥｃｏＲＩで処理したｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）
を、前記のように子ウシ腸アルカリ性ホスファターゼ
（ＣＩＡＰ）（プロメガ・コーポレーション、マディソ
ン、ＷＩから購入された）を用いて脱リン酸化した。次
に、ＤＮＡをフェノール／クロロホルムおよびエーテル
で連続的に抽出し、エタノールで沈殿させ、そして遠心
分離によってペレットにした。最終ペレットをＤＮＡ緩
衝液１２μｌ中に再溶解させた。
ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ消化および脱リン酸化 ｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）は、プロメガ・コーポレーショ
ン・マディソン、ＷＩから購入された。精製プラスミド
ｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）は、実施例１に記載の大腸菌形
質転換細胞から製造された。これに続いて、ＤＮＡ緩衝
液１０μｌ中のプラスミドｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）約１
μｇを、供給者によって「Ｂ」と指定された検定用緩衝
液中の制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ（ベーリン
ガー・マンハイム・バイオケミカルズから購入された）
それぞれ１０単位と一緒に、全反応容量３０μｌ中にお
いて３７℃で２時間インキュベートした。次に、Ｂａｍ
ＨＩ／ＥｃｏＲＩで処理したｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）
を、前記のように子ウシ腸アルカリ性ホスファターゼ
（ＣＩＡＰ）（プロメガ・コーポレーション、マディソ
ン、ＷＩから購入された）を用いて脱リン酸化した。次
に、ＤＮＡをフェノール／クロロホルムおよびエーテル
で連続的に抽出し、エタノールで沈殿させ、そして遠心
分離によってペレットにした。最終ペレットをＤＮＡ緩
衝液１２μｌ中に再溶解させた。
【００６０】Ｃ．ｐＣＤ３９６を製造する連結反応 ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで処理したｐＩＪ９２２（実施
例６Ａを参照されたい）約１０μｌおよびＢａｍＨＩ／
ＥｃｏＲＩで処理し、ＣＩＡＰで脱リン酸化したｐＧＥ
Ｍ−３Ｚｆ（＋）約３μｌをリガーゼ（ニュー・イング
ランド・バイオラブズ・インコーポレーテッド、ビバリ
ー、ＭＡ）１単位と一緒に、供給者によって指定された
条件下で全反応容量２０μｌ中において１５℃で一晩中
インキュベートした。翌朝、連結反応混合物を用いて、
前に論及したようにコンピテント大腸菌株ＤＨ５−αを
形質転換した。選択された形質転換細胞を菌株ＣＤ３９
６と称した。次に、識別された形質転換細胞を、引続き
のシャトルベクターｐＣＤ３９６の製造および単離に用
いた。シャトルベクターｐＣＤ３９６の制限地図を図８
に示す。
例６Ａを参照されたい）約１０μｌおよびＢａｍＨＩ／
ＥｃｏＲＩで処理し、ＣＩＡＰで脱リン酸化したｐＧＥ
Ｍ−３Ｚｆ（＋）約３μｌをリガーゼ（ニュー・イング
ランド・バイオラブズ・インコーポレーテッド、ビバリ
ー、ＭＡ）１単位と一緒に、供給者によって指定された
条件下で全反応容量２０μｌ中において１５℃で一晩中
インキュベートした。翌朝、連結反応混合物を用いて、
前に論及したようにコンピテント大腸菌株ＤＨ５−αを
形質転換した。選択された形質転換細胞を菌株ＣＤ３９
６と称した。次に、識別された形質転換細胞を、引続き
のシャトルベクターｐＣＤ３９６の製造および単離に用
いた。シャトルベクターｐＣＤ３９６の制限地図を図８
に示す。
【００６１】実施例７ シャトルベクターによるストレプトミセス・リヴィダン
スの形質転換および Ｓ．リヴィダンス形質転換細胞から
のプラスミドベクターの大規模製造 Ｓ．リヴィダンス菌株ＴＫ６４をこれらの実験において
用いた。Ｓ．リヴィダンスを増殖させ且つプロトプラス
トにする培地並びにプロトプラストおよび形質転換細胞
の製造は、Ｄ．Ａ．ホップウッドら、ストレプトミセス
属の遺伝子操作−実験室マニュアル，１９８５，ザ・ジ
ョン・インス・ファウンデーション、ノリッジ、Ｕ．
Ｋ．に記載されたように実施された。更に、後者の文献
にはＳ．リヴィダンス菌株ＴＫ６４が十分に説明されて
いる。シャトルベクターｐＣＤ２６２、ｐＣＤ３８５、
ｐＣＤ３９６またはｐＣＤ５００によって形質転換され
たＳ．リヴィダンスのプロトプラストはチオストレプト
ン耐性に関して選択された。プラスミドＤＮＡは、実施
例１に記載の選択された形質転換細胞から製造された。
ベクターｐＣＤ３９６はＳ．リヴィダンスを、その親放
線菌レプリコン、すなわちｐＩＪ９２２と同様の効率で
形質転換することが分かった。ベクターｐＣＤ２６２、
３８５および５００はＳ．リヴィダンスを、その親放線
菌レプリコン、すなわちｐＭＴ６６０と同様の効率で形
質転換することが分かった。
スの形質転換および Ｓ．リヴィダンス形質転換細胞から
のプラスミドベクターの大規模製造 Ｓ．リヴィダンス菌株ＴＫ６４をこれらの実験において
用いた。Ｓ．リヴィダンスを増殖させ且つプロトプラス
トにする培地並びにプロトプラストおよび形質転換細胞
の製造は、Ｄ．Ａ．ホップウッドら、ストレプトミセス
属の遺伝子操作−実験室マニュアル，１９８５，ザ・ジ
ョン・インス・ファウンデーション、ノリッジ、Ｕ．
Ｋ．に記載されたように実施された。更に、後者の文献
にはＳ．リヴィダンス菌株ＴＫ６４が十分に説明されて
いる。シャトルベクターｐＣＤ２６２、ｐＣＤ３８５、
ｐＣＤ３９６またはｐＣＤ５００によって形質転換され
たＳ．リヴィダンスのプロトプラストはチオストレプト
ン耐性に関して選択された。プラスミドＤＮＡは、実施
例１に記載の選択された形質転換細胞から製造された。
ベクターｐＣＤ３９６はＳ．リヴィダンスを、その親放
線菌レプリコン、すなわちｐＩＪ９２２と同様の効率で
形質転換することが分かった。ベクターｐＣＤ２６２、
３８５および５００はＳ．リヴィダンスを、その親放線
菌レプリコン、すなわちｐＭＴ６６０と同様の効率で形
質転換することが分かった。
【００６２】実施例８ シャトルベクターによるストレプトミセス・アヴェルミ
ティリスの形質転換 Ａ．ストレプトミセス・アヴェルミティリスの生存しう
るプロトプラストの製造 Ｓ．アヴェルミティリス菌株ＡＴＣＣ３１２７２を全体
を通して用いた。菌糸体培養物をトリプティケース・ソ
イ・ブロス（Ｔｒｉｐｔｉｃａｓｅ ＳｏｙＢｒｏｔ
ｈ）（ＴＳＢ）中において６００ｎｍでの濁度２〜９ま
で増殖させた。培養物をガラス製組織グラインダーを１
０回用いて均一にした。均一にされた菌糸体をＴＳＢ中
で２倍に希釈し、そして２０ｍｌを滅菌ポリプロピレン
遠心管に加えた。超音波プローブ（ブロンウィル・ビオ
ソニク（Ｂｒｏｎｗｉｌｌ Ｂｉｏｓｏｎｉｋ）ＩＩ
Ｉ）を液体中に深さ１〜２ｃｍまで浸水させ、そして試
料を５０％強度（最大ワットの半分）で１０秒間音波処
理した。音波処理は、継代培養した場合に急速な指数的
成長を生じた単一または二重細胞単位中に菌糸体塊を分
散させた。音波処理した菌糸体標品を最終濃度４０％グ
リセロールまで希釈し、バイアル中にピペットで移し、
そして−８５℃で凍結させた。Ｓ．アヴェルミティリス
を増殖させ且つプロトプラストにする培地並びにプロト
プラストおよび形質転換細胞の製造は、Ｄ．Ａ．ホップ
ウッドら、ストレプトミセス属の遺伝子操作−実験室マ
ニュアル，１９８５，ザ・ジョン・インス・ファウンデ
ーション、ノリッジ、Ｕ．Ｋ．に記載されたように、マ
クネイル（ＭａｃＮｅｉｌ），Ｄ．Ｊ．およびクラプコ
（Ｋｌａｐｋｏ），Ｌ．Ｍ．、Ｊ．Ｉｎｄｕｓｔｒｉａ
ｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９８７，２，２０９〜２１
８に記載の変法にしたがって実施された。シャトルベク
ターｐＣＤ２６２、ｐＣＤ３８５、ｐＣＤ３９６または
ｐＣＤ５００によって形質転換されたＳ．アヴェルミテ
ィリスのプロトプラストはチオストレプトン耐性に関し
て選択された。Ｓ．アヴェルミティリスプロトプラスト
を形質転換するのに用いられたプラスミドＤＮＡは、実
施例１に記載のＳ．リヴィダンス形質転換細胞から製造
された。ベクターｐＣＤ３９６はＳ．アヴェルミティリ
スを、その親放線菌レプリコン、すなわちｐＩＪ９２２
と同様の効率で形質転換することが分かった。ベクター
ｐＣＤ２６２、３８５および５００はＳ．アヴェルミテ
ィリスを、その親放線菌レプリコン、すなわちｐＭＴ６
６０と同様の効率で形質転換することが分かった。
ティリスの形質転換 Ａ．ストレプトミセス・アヴェルミティリスの生存しう
るプロトプラストの製造 Ｓ．アヴェルミティリス菌株ＡＴＣＣ３１２７２を全体
を通して用いた。菌糸体培養物をトリプティケース・ソ
イ・ブロス（Ｔｒｉｐｔｉｃａｓｅ ＳｏｙＢｒｏｔ
ｈ）（ＴＳＢ）中において６００ｎｍでの濁度２〜９ま
で増殖させた。培養物をガラス製組織グラインダーを１
０回用いて均一にした。均一にされた菌糸体をＴＳＢ中
で２倍に希釈し、そして２０ｍｌを滅菌ポリプロピレン
遠心管に加えた。超音波プローブ（ブロンウィル・ビオ
ソニク（Ｂｒｏｎｗｉｌｌ Ｂｉｏｓｏｎｉｋ）ＩＩ
Ｉ）を液体中に深さ１〜２ｃｍまで浸水させ、そして試
料を５０％強度（最大ワットの半分）で１０秒間音波処
理した。音波処理は、継代培養した場合に急速な指数的
成長を生じた単一または二重細胞単位中に菌糸体塊を分
散させた。音波処理した菌糸体標品を最終濃度４０％グ
リセロールまで希釈し、バイアル中にピペットで移し、
そして−８５℃で凍結させた。Ｓ．アヴェルミティリス
を増殖させ且つプロトプラストにする培地並びにプロト
プラストおよび形質転換細胞の製造は、Ｄ．Ａ．ホップ
ウッドら、ストレプトミセス属の遺伝子操作−実験室マ
ニュアル，１９８５，ザ・ジョン・インス・ファウンデ
ーション、ノリッジ、Ｕ．Ｋ．に記載されたように、マ
クネイル（ＭａｃＮｅｉｌ），Ｄ．Ｊ．およびクラプコ
（Ｋｌａｐｋｏ），Ｌ．Ｍ．、Ｊ．Ｉｎｄｕｓｔｒｉａ
ｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９８７，２，２０９〜２１
８に記載の変法にしたがって実施された。シャトルベク
ターｐＣＤ２６２、ｐＣＤ３８５、ｐＣＤ３９６または
ｐＣＤ５００によって形質転換されたＳ．アヴェルミテ
ィリスのプロトプラストはチオストレプトン耐性に関し
て選択された。Ｓ．アヴェルミティリスプロトプラスト
を形質転換するのに用いられたプラスミドＤＮＡは、実
施例１に記載のＳ．リヴィダンス形質転換細胞から製造
された。ベクターｐＣＤ３９６はＳ．アヴェルミティリ
スを、その親放線菌レプリコン、すなわちｐＩＪ９２２
と同様の効率で形質転換することが分かった。ベクター
ｐＣＤ２６２、３８５および５００はＳ．アヴェルミテ
ィリスを、その親放線菌レプリコン、すなわちｐＭＴ６
６０と同様の効率で形質転換することが分かった。
【００６３】実施例９ シャトルベクターによる大腸菌の形質転換 コンピテント大腸菌株ＤＨ５−α細胞（ライフ・テクノ
ロジーズ・インコーポレーテッド、ゲイサーズバーグ、
ＭＤ）を、供給者によって指示された方法で精製プラス
ミドＤＮＡを用いて形質転換した。回収されたアンピシ
リン耐性形質転換細胞を増殖させ、プラスミドを単離
し、そして標準法（マニアティスら、分子クローニング
−実験室マニュアル、コールド・スプリング・ハーバー
・ラボラトリー、１９８９）にしたがって分析した。
ロジーズ・インコーポレーテッド、ゲイサーズバーグ、
ＭＤ）を、供給者によって指示された方法で精製プラス
ミドＤＮＡを用いて形質転換した。回収されたアンピシ
リン耐性形質転換細胞を増殖させ、プラスミドを単離
し、そして標準法（マニアティスら、分子クローニング
−実験室マニュアル、コールド・スプリング・ハーバー
・ラボラトリー、１９８９）にしたがって分析した。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、プラスミドベクターｐＭＴ６６０の制
限地図を示す。
限地図を示す。
【図２】図２は、プラスミドベクターｐＧＥＭ−３Ｚの
制限地図を示す。
制限地図を示す。
【図３】図３は、プラスミドシャトルベクターｐＣＤ２
６２およびｐＣＤ５００の構築を示す。ｐＣＤ２６２
は、ストレプトミセス属ベクターｐＭＴ６６０と大腸菌
ベクターｐＧＥＭ−３Ｚとをそれらの独特のＳａｃＩ制
限部位で結合したハイブリッドである。ｐＣＤ５００
は、ｐＣＤ２６２中に存在する０．８ｋｂのＰｓｔＩフ
ラグメントを削除することによって構築されたｐＣＤ２
６２の誘導体である。
６２およびｐＣＤ５００の構築を示す。ｐＣＤ２６２
は、ストレプトミセス属ベクターｐＭＴ６６０と大腸菌
ベクターｐＧＥＭ−３Ｚとをそれらの独特のＳａｃＩ制
限部位で結合したハイブリッドである。ｐＣＤ５００
は、ｐＣＤ２６２中に存在する０．８ｋｂのＰｓｔＩフ
ラグメントを削除することによって構築されたｐＣＤ２
６２の誘導体である。
【図４】図４は、プラスミドシャトルベクターｐＣＤ２
６２の制限地図を示す。
６２の制限地図を示す。
【図５】図５は、プラスミドシャトルベクターｐＣＤ５
００の制限地図を示す。
００の制限地図を示す。
【図６】図６は、プラスミドシャトルベクターｐＣＤ３
８５の構築を示し、それは、ストレプトミセス属ベクタ
ーｐＭＴ６６０と大腸菌ベクターｐＧＥＭ−３Ｚとをそ
れらの独特のＳａｃＩおよびＮｄｅＩ制限部位でそれぞ
れ結合したハイブリッドである。この構築は、ｐＧＥＭ
−３Ｚ中に存在する多数のクローニング領域をそのまま
保存することを目的としている。
８５の構築を示し、それは、ストレプトミセス属ベクタ
ーｐＭＴ６６０と大腸菌ベクターｐＧＥＭ−３Ｚとをそ
れらの独特のＳａｃＩおよびＮｄｅＩ制限部位でそれぞ
れ結合したハイブリッドである。この構築は、ｐＧＥＭ
−３Ｚ中に存在する多数のクローニング領域をそのまま
保存することを目的としている。
【図７】図７は、プラスミドシャトルベクターｐＣＤ３
８５の制限地図を示す。
８５の制限地図を示す。
【図８】図８は、プラスミドシャトルベクターｐＣＤ３
９６の制限地図を示す。
９６の制限地図を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:465） (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12N 1/00 - 1/38 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (16)
- 【請求項１】 下記制限地図： によって示されるプラスミドｐＣＤ２６２。
- 【請求項２】 プラスミドｐＣＤ２６２を含む形質転換
した宿主細胞。 - 【請求項３】 ストレプトミセス・アヴェルミティリス
（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉ
ｓ）、ストレプトミセス・コーリカラー（Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトミ
セス・ハイグロスコピクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）およびストレプトミセ
ス・リヴィダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖ
ｉｄａｎｓ）から成る群より選択される請求項２に記載
の形質転換した宿主細胞。 - 【請求項４】 大腸菌である請求項２に記載の形質転換
した宿主細胞。 - 【請求項５】 下記制限地図： によって示されるプラスミドｐＣＤ５００。
- 【請求項６】 ストレプトミセス属菌および大腸菌から
成る群より選択されるプラスミドｐＣＤ５００を含む形
質転換した宿主細胞。 - 【請求項７】 ストレプトミセス・アヴェルミティリス
（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉ
ｓ）、ストレプトミセス・コーリカラー（Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトミ
セス・ハイグロスコピクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）およびストレプトミセ
ス・リヴィダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖ
ｉｄａｎｓ）から成る群より選択される請求項６に記載
の形質転換した宿主細胞。 - 【請求項８】 大腸菌である請求項７に記載の形質転換
した宿主細胞。 - 【請求項９】 下記制限地図： によって示されるプラスミドｐＣＤ３８５。
- 【請求項１０】 ストレプトミセス属菌および大腸菌か
ら成る群より選択されるプラスミドｐＣＤ３８５を含む
形質転換した宿主細胞。 - 【請求項１１】 ストレプトミセス・アヴェルミティリ
ス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉ
ｓ）、ストレプトミセス・コーリカラー（Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトミ
セス・ハイグロスコピクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）およびストレプトミセ
ス・リヴィダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖ
ｉｄａｎｓ）から成る群より選択される請求項１０に記
載の形質転換した宿主細胞。 - 【請求項１２】 大腸菌である請求項１０に記載の形質
転換した宿主細胞。 - 【請求項１３】 下記制限地図： によって示されるプラスミドｐＣＤ３９６。
- 【請求項１４】 ストレプトミセス属菌および大腸菌か
らなる群より選択されるプラスミドｐＣＤ３９６を含む
形質転換した宿主細胞。 - 【請求項１５】 ストレプトミセス・アヴェルミティリ
ス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉ
ｓ）、ストレプトミセス・コーリカラー（Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトミ
セス・ハイグロスコピクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）およびストレプトミセ
ス・リヴィダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖ
ｉｄａｎｓ）から成る群より選択される請求項１４に記
載の形質転換した宿主細胞。 - 【請求項１６】 大腸菌である請求項１４に記載の形質
転換した宿主細胞。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US3292593A | 1993-03-18 | 1993-03-18 | |
| US032925 | 1993-03-18 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06303985A JPH06303985A (ja) | 1994-11-01 |
| JP2804436B2 true JP2804436B2 (ja) | 1998-09-24 |
Family
ID=21867607
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6045926A Expired - Fee Related JP2804436B2 (ja) | 1993-03-18 | 1994-03-16 | ストレプトミセス属菌および大腸菌の新規の細菌プラスミドシャトルベクター |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0618297A1 (ja) |
| JP (1) | JP2804436B2 (ja) |
| CA (1) | CA2119161A1 (ja) |
| FI (1) | FI941263A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP6906215B2 (ja) * | 2016-07-19 | 2021-07-21 | 国立大学法人 筑波大学 | ストレプトマイセス属微生物用ベクター |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3412093A1 (de) * | 1984-03-31 | 1985-10-10 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Hybridplasmide mit einem streptomyceten- und einem escherichia coli-replicon |
| US4898828A (en) * | 1985-08-07 | 1990-02-06 | Eli Lilly And Company | Ultrahigh copy number streptomycetes plasmids |
-
1994
- 1994-03-11 EP EP94301735A patent/EP0618297A1/en not_active Withdrawn
- 1994-03-16 CA CA 2119161 patent/CA2119161A1/en not_active Abandoned
- 1994-03-16 JP JP6045926A patent/JP2804436B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1994-03-17 FI FI941263A patent/FI941263A/fi unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FI941263A (fi) | 1994-09-19 |
| FI941263A0 (fi) | 1994-03-17 |
| EP0618297A1 (en) | 1994-10-05 |
| JPH06303985A (ja) | 1994-11-01 |
| CA2119161A1 (en) | 1994-09-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Deng et al. | Unmarked gene deletion and host–vector system for the hyperthermophilic crenarchaeon Sulfolobus islandicus | |
| EP0334841B1 (de) | Microorganismen and plasmide für die 2,4-dichlorphenoxyessigsäure (2,4-d)-monooxigenase - bildung und verfahren zur herstellung dieser plasmide und stämme | |
| Buan et al. | Genetic methods for Methanosarcina species | |
| Farkas et al. | Recombinogenic properties of Pyrococcus furiosus strain COM1 enable rapid selection of targeted mutants | |
| WO2007022623A1 (en) | Regulation of heterologous recombinant protein expression in methylotrophic and methanotrophic bacteria | |
| Guthrie et al. | The level of a transcript required for production of a Streptomyces coelicolor antibiotic is conditionally dependent on a tRNA gene | |
| JPWO2016080424A1 (ja) | 環状ｄｎａの増幅方法 | |
| WO2018195136A1 (en) | Compositions and methods for regulated gene expression | |
| Suzuki et al. | Plasmid artificial modification: a novel method for efficient DNA transfer into bacteria | |
| WO2021258580A1 (zh) | 一种基于CRISPR/Cas12a的体外大片段DNA克隆方法及其应用 | |
| Bode et al. | easyPACId, a Simple Method for Induced Production, Isolation, Identification, and Testing of Natural Products from Proteobacteria | |
| US9309542B2 (en) | Recombinant Caldicellulosiruptor bescii and methods of use | |
| JPH0158949B2 (ja) | ||
| CN111117942B (zh) | 一种产林可霉素的基因工程菌及其构建方法和应用 | |
| CN109321618B (zh) | 一种通过糖多孢红霉菌sace_5717基因提高红霉素产量的方法 | |
| JP2804436B2 (ja) | ストレプトミセス属菌および大腸菌の新規の細菌プラスミドシャトルベクター | |
| JPS62155081A (ja) | 新規微生物およびそれを用いる醗酵法によるビオチンの製造法 | |
| Lo Sciuto et al. | Generation of stable and unmarked conditional mutants in Pseudomonas aeruginosa | |
| Bryan et al. | Constructing unmarked gene deletions in Legionella pneumophila | |
| US8927254B2 (en) | Pyrococcus furiosus strains and methods of using same | |
| US9023618B2 (en) | Engineering complex microbial phenotypes with transcription enhancement | |
| US4393137A (en) | Cloning plasmid for streptomyces | |
| Zhang et al. | Improvement of transformation system in Streptomyces using a modified regeneration medium | |
| CN1989255A (zh) | 降低细胞中的自发突变率 | |
| JPH0363357B2 (ja) |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |