JPH0158949B2 - - Google Patents
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- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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Description
【発明の詳細な説明】
この発明は、広い細菌宿主域を有する新しい小
プラスミド・リング（plasmid rings）、およびデ
オキシリボ核酸プラスミドをインビボにおいて細
菌宿主に輸送する方法に関する。 種々の化学薬品を製造するためにプラスミド組
換え体の遺伝的操作を含む先行技術の商業ベース
による研究は、これまで宿主生物として大腸菌に
集中してきた。その理由は、その組換え体プラス
ミドが他の宿主生物と和合できないためである。
しかしながら、大腸菌は、哺乳動物の腸道内にお
けるその成長能と疾患をもたらすために、これら
の目的に最適の生物ではない。大腸菌の外に、広
い細菌宿主域を有するプラスミドをもつた宿主細
菌を使用できることが極めて望ましい。本発明
は、特に哺乳動物の体温において生存できない生
物（細菌）の使用に関する。 以下はこの発明に関して用いた語義である。 「細菌接合」とは、少なくとも２つの細菌宿主
間の支配と遺伝的伝達を意味し、その供与菌は
「雄」、そして受容菌は「雌」と呼ばれる。 「プラスミド集合体（又は集塊）」とは、２つ
のプラスミド・リング間の会合を意味する、この
場合、各プラスミドはその環状体としての構造を
保ち、各環状体は各組換え体の遺伝的操作のでき
るものである。 「輸送」とは、DNAが１つの細菌から別の細
菌へ転移されるプロセスを意味する。 「形質導入」とは、DNAプラスミドまたは断
片が細菌ウイルスによつてインビボでの自然のプ
ロセスで１つの細菌から別の細菌へ移り入れられ
ることを意味する。 「形質転換」とは、インビトロでの細菌の全細
胞から取り除いたDNAを宿主細菌へ移し入れる
ことを意味する。 「転位（トランスポジシヨン）」とは、遺伝物
質がDNA分子の１部分から他の部分、又は１つ
のDNA分子から他のDNA分子へ移動することを
意味する。 「トランスポゾン（transpcscn）」とは、転位
によつて移送された遺伝物質を意味する。 「DNA源」または「DNA断片」とは、真核細
胞又は原核細胞および／またはそれらのウイルス
を含む寄生体から誘導された染色体または染色体
外の細胞要素からのDNAを意味する。 特許技術の状態は、主国特許第3813316号；第
4038143号；第4080261号；第4082613号および第
4190495号に一般的に記載されている。これらの
特許には本発明に関連した先行技術の方法が記載
されている。 DNA分子自体の合成に必要な酵素と蛋白質の
一連の群の外に、インビボでのDNA分子の複製
に必要な２つのエレメントが同定されている。そ
れらは、(1)DNA分子上の領域であつてDNA複製
の起源として同定され、蛋白質によつて認識され
るものである、また(2)同じDNA分子にみられる
前記蛋白質の遺伝子である。この最小限の仕様を
細菌細胞内で独自の自己増殖ができるDNA分子
と仮定すると、前記２つの機能を妨げない限りさ
らに別のDNA小片が含まれうる。事実、宿主細
菌種内に含まれ、宿主細菌種によつて染色体外に
保持されていることがわかつている前記(1)と(2)の
組合せがプラスミドまたは染色体要素と呼ばれて
きた（Bacteriological Reviews、９、pp.552−
590（1976）参照）。最近まで、微生物遺伝学者は、
細菌染色体のDNAをプラスミドに組換えるため、
または同一の宿主細菌内に一緒に保持されたプラ
スミド間の組換えをするために、宿主細菌細胞の
組換え機構を利用してインビボにおいてDNA断
片を操作してきた。この方法は、複雑なゲノムの
一部分を除去することによつて複雑なゲノムの
種々の領域を精製して別の複製単位にすることが
できた。しかし、この方法は、通常は別の源か
ら、又は別の生物体から大きな生物学的障壁を越
えて運搬されたDNAから成るプラスミド−ハイ
ブリツドの構成を考慮しない。 しかしながら、最近、DNAの異種断片のイン
ビボでの操作および組換え技術によつて雑種
DNA分子の生成が可能になつた。文献
〔“Recombinant Molecules：Impact on Sciene
and Society”、R.F.Beers and E.G.Bassett.pp.9
−20、Raven Press、New York（1977）〕から
引用したインビトロ法の要約は次の通りである： 「インビトロでの組換え体（DNA）技術には、
最終的に全ての源からのDNA断片をレプリコン
（プラスミド）へ挿入さすことになる２、３の重
要な技術的要素；およびそれらの複製要素として
の回復がある。これら技術的要素は： (1) 目的のDNA分子の制限エンドヌクレアーゼ
による系統的切断（これら酵素の検討について
は、ロバーツ（Roberts）著のRecombinant
Moleculesを参照されたい）； (2) 連結反応によるDNA断片の適当なクローニ
ング媒体（またはレプリコーン）への再結合； (3) 組換え体DNAによる細胞の形質転換、およ
び組換え体プラスミドを含む細胞の選択；およ
び (4) 得られたDNAの「クロン化（Cloned）」断
片の同定および特性指摘。」 この発明は、上記事項の全て、特に第(2)項、す
なわち適当なクローニング運搬体（プラスミド）
の必要条件、および前記形質変換法の利用に寄与
するプラスミド・クローニング・ベクターの新し
い性質に関するものである。 分子DNAのクローニングに潜在的に有用なプ
ラスミドの生物学的な性質は、ヘリンスキイら
（D.B.Helinski at al）によつて次のように要約
されている〔Recombinant Molecules：Impact
on Science and Society、P.151、R.F.Beers
and E.G.Bassett、eds.、Raven Press、New
York（1977）を参照〕： 「大腸菌における遺伝子のクローニングに対す
るプラスミド要素の利用性が最初に論証されて以
来、種々のプラスミド要素が大腸菌および他の細
菌におけるクローニング媒体として開発されてき
た。これらの新しいクローニング媒体はDNAの
クローニングに有利な次のようなプラスミド特性
をもつている： (1) 宿主細菌細胞内での安定維持、 (2) 非自己伝達能、 (3) 遺伝的操作の容易性、 (4) 分離の容易性、 (5) 寸法的に大きな範囲の異種DNAとの結合能
力およびその複製能力、 (6) インビトロで生じた雑種プラスミドの細菌細
胞への導入の容易性。」 しかしながら、組換え体DNAの技術に有用な
プラスミドを最大限に利用するのに望ましいと考
えられた特性に関する前記仕様は広い細菌宿主域
をもつたクローニング・プラスミドの高利用性を
考慮していない。 今までに記載された大部分の細菌プラスミド
は、プラスミドが最初に分離された細菌に密接に
関係した細菌種においてのみ維持することができ
る。このために、特定プラスミドのDNAの維持
および重複に関連した必要条件は一般に問題のプ
ラスミドに特有なものである。しかし、この一般
的な所見には例外があつた。例えば、オルセン
（Olsen.本願の発明者）とシツプレイ（Shipley）
は、多重の抗生物質抵抗を特定とするプラスミ
ド、R1822（後でRP1と呼ぶようになつた）が、
有性接合によつて関係および無関係の細菌属を代
表する種々の細菌種に転移されることを示した
〔Journal of Bacteriology、113、No.２、pp.772
−780（1973）を参照〕。菌株、緑膿菌1822（これか
ら後でRP1が得られた）の起源はロウペリー
（Lowbury、E.J.）らにより示された（Lancet
ii、448−452（1969）参照）。プラスミドRP1の細
菌宿主域は、腸内菌（Enterobacteriaceae）、土
壤腐生菌（Pseudomonas）、ナイセリア・ペルフ
ロバ（Neisseria perflava）および光合成菌を含
む。従つて、プラスミドRP1は、関係のない細菌
種間を自由に転移する広宿主域の細菌プラスミド
の一例である。 そのプラスミド・リングRP1は比較的大きいも
のである。この寸法が大きいこととプラスミド・
リングの組成が細菌の形質転換のプロセスを非効
率的なものにする。特に形質転換によつて細菌宿
主から細菌宿主へと容易かつ広く輸送できるクロ
ーニング媒体としての小さなプラスミド・リング
およびその組換え体を提供することは技術的に著
しい改良となる。それらのプラスミドが同定のた
めに抗生物質抵抗性の単一表現型標識形質を含む
ならば、それらプラスミドは特に有用なものとな
る。また、小プラスミド・リングの断片を他の遺
伝子断片とインビボまたはインビトロでの組換え
方法を提供することも改良となる。 従つて、本発明の目的はデオキシ核酸プラスミ
ドをインビボの細菌宿主に輸送する方法を提供す
ることである。 さらに、組換え体のプラスミド・リング内で結
合されるときにクローニング媒体の働をする小プ
ラスミドから誘導され、広い細菌宿主転移範囲を
有する新しい組換え体プラスミド・リングを提供
することがこの発明の目的である。 特に、宿主細菌において有用な化学薬品生成特
性または他の有用な特性を有する組換え体プラス
ミド・リングを提供することが本発明の目的であ
る。これらおよび他の目的は、添付図面と共に以
下の記載からさらに明白となるであろう。 本発明は、細菌の接合、形質転換または形質導
入の工程を用いてデオキシリボ核酸プラスミドを
インビボにおいて細菌宿主に運搬する方法におい
て、(a)緑膿菌NRRL−Ｂ−12124、NRRL−Ｂ−
12125、NRRL−Ｂ−12126、NRRL−Ｂ−
12127、NRRL−Ｂ−12149およびNRRL−Ｂ−
12148にそれぞれ運ばれるpRO1600、pRO1601、
pRO1613、pRO1614、pRO1615およびpRO1616
から選んだクローニング運搬体としての第１のプ
ラスミドと、(b)その第１のプラスミドおよび第２
のDNA源のエンドヌクレアーゼによる切断によ
つて産生された第１のプラスミドの組換体プラス
ミド・リング誘導体から選んだDNAプラスミ
ド・リングを線状のDNA断片内に運搬し、それ
ら線状DNA断片を一緒に連結反応させて、組換
体プラスミドを形成させることから成り、前記プ
ラスミド・リングは緑膿菌PAO ATCC15692に
よつて運搬することができ、かつ広細菌宿主域を
有し、該プラスミド・リング自身は宿主細菌の細
菌分裂中にデオキシリボ核酸の複製によつてクロ
ーンを生成し、クローニング運搬体からのDNA
が細菌分裂中に組換え体プラスミドの複製を制御
することを特徴とするDNAプラスミドをインビ
ボにおいて細菌宿主に運搬することを特徴とす
る。 細菌のプラスミド含量は、スラブ・アガロー
ス・ゲルの電気泳動法を採用し得られた電気フエ
ログラムの写真を観察することにより便利かつ迅
速に決定することができる（例えば、Hansen
and Olsen、Journal of Bacteriology、135、No.
１・pp.227−238（1978）を参照されたい）。かく
して、DNAは第１図に示すように次の如く電気
泳動された：図のＡは緑膿菌NRRL12123から抽
出したDNA；ＢはRP1／pRO1600のDNA；Ｃは
pRO1601のDNA；Ｄは大腸菌V517〔サイズ標準
として使用した多プラスミドを含む菌株
（Plasmid、１ pp.417−420（1978）参照）の
DNA；ＥはpRO1613のDNA；そしてＦは
pRO1614のDNAである。この方法は、適当な標
準体を併用することにより存在するプラスミドの
分子の大きさも決定することができる。 プラスミドRP1が細菌接合（又は有性接合）の
プロセスによつて１つの細菌から別の細菌へ伝達
される時、そのプラスミドを新たに得た受容菌
は、普通、電気泳動図では供与菌に存在するプラ
スミドと区別できないプラスミドを含む。第１図
のＡ列には、伝達後に供与菌細胞個体群または受
容菌細胞個体群から抽出した時のプラスミドRP1
の通常の様相（又は様子）が示されている。ある
場合には別の結果が得られた。緑膿菌PAO 25で
の交雑実験においてプラスミドRP1を受け取つた
ATCC15692（菌株PAO2）の単一受容菌細胞から
誘導した培養体を分析した所、異なるプラスミド
集合体を生成していた。そのトランス接合個体は
親のプラスミドのみならずかなり小さい第２のプ
ラスミドを示した（第１図、Ｂ列参照）。親の大
きさのプラスミドは第１図Ｂ列の最上部に、異常
に小さなプラスミドは下部に示されている。この
下部のプラスミドの大きさは、Ｄ列に示す標準寸
法と比較、計算した所38×1016ダルトンのRP1に
対して２×106ダルトンであつた。従つて、この
小プラスミドの出現は、一般に親プラスミドRP1
の受容菌への伝達中に生じたランダムの突然変異
と考えられる新規の出来事を示している。本発明
者は、小プラスミドpRO1600およびRP1を有す
る集合体をRP1／pRO1600と名付けた。 組換え体DNAの技術における小プラスミドの
利用性は、宿主細菌がもつていなかつた独特な代
謝特性用の遺伝情報をエンコード（encode）す
る能力から一部由来する。従つて、プラスミドの
存在又は不在は、遺伝的操作後に問題の代謝特性
の存否に基いて決めることができる。第１図のＢ
列に示す細菌株を予備的に分析した所、プラスミ
ドpRO1600の存在に関連した独特な代謝特性
（又は表現型形質）を示さなかつた。従つて、本
発明者は、pRO1600に区別の目安となる表現型
形質を加えて後の実験でその検出をする細菌の遺
伝的標準技法を適用し、それによつて部分的に精
製したDNA溶液から受容菌株へ転換される能力
を試験した。加えた区別の目安となる表現型形質
は、抗生物質カルベニシリンへの耐性用の遺伝情
報をエンコードするDNAの断片であつた。従つ
て、このDNA断片とプラスミドpRO1600を保有
する細菌は全て、親のプラスミドを含まない細菌
株と異なりカルベニシリンの存在下で成長するこ
とになる。 カルベニシリン耐性用の遺伝特性（又は形質）
は、トランスポジシヨンと呼ぶ遺伝的プロセスで
プラスミドpRO1600へ添加された。トランスポ
ゾンと呼ぶ若干の抗生物質耐性遺伝子は、DNA
の断片上のある場所から別の場所へ移動できる、
或いはトランスポジシヨンと呼ぶ遺伝的なプロセ
スで細菌細胞内にあるDNA分子から別のDNA分
子へ移動できる（S.Cohen.“Trans−posable
gonetic elements and plasmid evolution”、
Natre、263.pp.731−738（1976）参照）。これらの
遺伝的エレメントは、細菌宿主の遺伝的組換え機
構なしにこのプロセスを果たす。第１図のＡ列に
示すプラスミドRP1は、カルベニシリンおよび関
連抗生物質（ペニシリン、アムピシリン）に対す
る耐性用遺伝情報をエンコードするTnlと呼ぶト
ランスポゾンを含む。トランスポゾンTnlは分子
の大きさが3.2×106ダルトンの転置可能な遺伝的
エレメントである。従つて、Tnlによつて転置さ
れたDNAは3.2×106ダルトンまで大きさを増す
ことになる。 転位（トランスポジシヨン）は、トランスポゾ
ンを有する供与菌のDNA分子を含む細菌細胞の
個体群において不規則に生じる。従つて、菌株緑
膿菌RP1／pRO1600の場合に、小比率の細菌細
胞が転位された異体のプラスミドを含むことが期
待される。例えば、第１図のＢ列に示すように、
培養における２、３の細菌細胞は、電気泳動図の
下部に示す小DNA分子より3.2×106ダルトンま
で大きいDNA分子を含んでいる（そのプラスミ
ドはpRO1600となづけた）。しかしながら、培養
におけるこれら細菌の比較的少数は第１図に示す
ようにアガロース・ゲルでの検出を妨害する。し
かし、これらプラスミドpRO1600の転置誘導体
は、細菌の形質転換と呼ぶ遺伝的技法を採用する
ことにより検出と分離をされる。この方法によつ
て、供与菌細胞から抽出されたDNAはプラスミ
ドを含まない受容菌細胞培養体へ付加される。次
に、その混合体は、この場合抗生物質のカルベニ
シリンを含む細菌学的媒質で成長する。これらの
条件下で、抗生物質カルベニシリン用の遺伝情報
をエンコードしている遺伝エレメントを得て複製
した細菌細胞のみが高密度個体群に成長する。こ
の実験が行なわれる時、２種類のカルベニシリン
耐性細菌株が期待される：即ち、供与菌親プラス
ミドRP1の全てを受け入れたものと、カルベニシ
リン耐性をエンコードしているトランスポゾン
Tnlと結合したpRO1600のみを受け入れたもので
ある。前者の可能な細菌分離体は、これらの細菌
がカルベニシリンのみならずテトラサイクリンお
よびカナマイシンに耐性があることによつて区別
することができる。しかし、後者の可能性の場合
に、これらの細菌分離体は、それらがプラスミド
RP1から細菌細胞内で同時に共に保持されたプラ
スミドpRO1600へジヤンプしたTnlだけを受け入
れたから、抗生物質カルベニシリンに対する耐性
のみを示すであろう。そのような細菌株は前述の
プロセスで得られた、そしてそのDNAは、その
プラスミドの抽出および電気泳動後のものを第１
図のＣ列に示す。このプラスミドpRO1601の電
気泳動による移動度は、プラスミドpRO1600よ
りも遅い（これはサイズが大きいこと表わす）。
第１図のＤ列に示す標準DNAを用いて計算する
と、pRO1601がpRO1600よりも分子の大きさで
3.2×106大きいことになる。従つて、この関係は
TnlがpRO1600へ付加されたこと、従つて独特な
代謝特質（表現型標識形質）がpRO1600へ付加
されたこと示唆する（その検出は抗生物質カルベ
ニシリンに対する耐性を試験することによつて行
なう）。 DNA分子はプリンおよびピリミジンと呼ぶ置
換分子からなる線状分子である。その結合したプ
リン又はピリミジンの正確な線状配例（シークエ
ンス）が注目のDNA分子の領域を画定する。
DNA分子に類似した領域は、クラスの制限エ
ンドヌクレアーゼと呼ぶ領域におけるそれらの活
性に特有な酵素での分割（cleavage）によつて
識別することができる（B.Allet.“Fragments
Produced by cleavage of lambda
deoxyribonucleic acid with Haemophilus
parainfluenzae restriction enzyme Hpa”
Biochemistry、12、pp.3972−3977（1972）参
照）。認識シークエンスと呼ばれ、40以上の特異
制限エンドヌクレアーゼのいずれかによつて切断
されるための部位の役目をするDNAの特定領域
は、異なる生物源からのDNAと比較したときに、
異なつた分布をするか、或いは１つも存在しな
い。逆に言えば、関係又は同一のDNA分子は、
制限エンドヌクレアーゼ消化およびスラブ・アガ
ロース・ゲル電気泳動法による分析後に同一セツ
トの断片を生成する。従つて、新しいプラスミド
は前述の消化後に生成することができる。DNA
分子の大きさが小さく、制限エンドヌクレアーゼ
での処理により生成した断片の数が少ないと、こ
れらの断片は、親分子に最初に存在した時と異な
る順序で不規則に連合することができる。この不
規則な再連合に続いて、それら断片は、再連合複
合体がDNAリガーゼと呼ぶ第２酵素で処理され
る時に再び共有結合ができ、補因子を必要とす
る。従つて、前述の方法はDNA分子の構造解析
およびDNAシークエンスの新組合せ体の生成に
適用できる。従つて、前述の方法によつて、プラ
スミドの構造はDNAの必須でない領域の欠失或
いは生物学的に関係のない源からのDNAからな
るDNA分子の生成によつて変えることができる。 本発明は特に、プラスミドpRO1601、通常
DNA組換え技術と呼ばれる前述の原理および手
順を適用することによる遺伝的クローニングおよ
び新規性に対する前記プラスミドpRO1601の修
飾および有用性に関する。このDNA組換え技術
の主な特徴は、既に要約されている（S.Cohen、
Scientific American、July、pp.25−33（1975）
参照）。 上記通常の方法によるプラスミドpRO1601の
DNAの分析（制限エンドヌクレアーゼの地図作
製）した所、第２図のＡ部に示す構造となつた。
この遺伝学的地図は、制限エンドヌクレアーゼ
Pstについて４つの制限エンドヌクレアーゼ認
識座位（sites）があることを示している。
pRO1601を生成するためにpRO1601へ付加され
たトランスポゾンTn1は、３つのPst制限エン
ドヌクレアーゼの座位を含むことが知られている
（J.Grinsted et al、plasmid、１、pp34−37
（1977）参照）。従つてTn１により置換を受けた
組換え体プラスミドのpRO1600の領域は単一の
Pst座位を含まなければならない。また、Tn１
と連合したPst断片の大きさは前述のように評
価されたから、pRO1600に独特なPst分割用の
特定座位は同定することができる。この座位は、
遺伝地図作製用基準座位として選ばれた、そして
第２図のＡ部に示す図面の左側に現われている。
組換え体プラスミドpRO1601の領域を表わす他
の座位（それらはTn１の一部である）は
pRO1600 Pstの座位に関して並置されてい
る。また、この遺伝地図に示すように、制限エン
ドヌクレアーゼBg1についての特定認識座位が
ある。これらは、トランスポゾンTn１を
pRO1600に挿入した点に関してpRO1601と異な
るTn１−置換プラスミドpRO1600の他の変種を
比較することによつて決定された。このために、
組換え体DNA技術に付随する通常の方法を採用
した。 第２図のパネルＡの1.21の所に引いたPst制
限エンドヌクレアーゼの座位（これはトランスポ
ゾンTn１の付加を反映する領域の部分として知
られている）は、カルベニシリンに対する耐性を
エンコードする遺伝的領域の中央にあるべきこと
が知られている。従つて、この点に過剰DNAの
挿入はDNA配列の連続性を破壊し、DNAのこの
領域がカルベニシリン耐性をもつた酵素を特定す
る能力を喪失をもたらすことになる。pRO1601
の分子クローニングへの有用性を示すために、
DNAの断片をこの座位に挿入した。しかしなが
ら、このDNA断片は抗生物質テトラサイクリン
に対する耐性用の遺伝情報を含んでいる。従つ
て、この断片をこの座位でプラスミドpRO1601
へ組み込まれ、連結されて閉鎖、円形DNA構造
を形成し、受容菌に形質転換され、そしてテトラ
サイクリンの存在下で成長できるように培養され
ると、挿入断片のクローニングが生じるであろ
う。 これらの実験用のDNA源には、さらに
pBR322と呼ぶ別のプラスミドがあつた（F.
Bolivar et al、“Construction and
Characterization of New Cloning Vehicles
．ａ multipurpose cloning system”Gene、
２、pp.95−113（1977）参照）。現在まで開発され
たクローニング・プラスミドの代表的なものであ
るプラスミドpBR322は、原菌の大腸菌に密接に
関係しない細菌中に保存することができない。従
つて、このプラスミドDNAを無関係の緑膿菌へ
導入すると、それは耐性、即ちカルベニシリンお
よびテトラサイクリンに対する耐性をエンコード
する抗生物質の存在下で成長する能力を授与する
ことができない。一方、組換えによつてプラスミ
ドpBR322のDNAがプラスミドpRO1601のよう
なプラスミドの構造の一部分になると、組換え体
プラスミドを含むpRO1601−pBR322雑種にその
遺伝機能が授与されることになる。プラスミド
pRO1601に類似したプラスミドpBR322も抗生物
質カルベニシリンに対する耐性を特定する遺伝子
を含む。この遺伝子もカルベニシリン耐性と関連
したそのDNAの領域内に制限エンドヌクレアー
ゼPst用の座位を有する。プラスミドpRO1601
のカルベニシリン耐性遺伝子の部分がプラスミド
pBR322からの類似遺伝子の部分と接合できて、
この場合１つの場所で接合した雑種分子にカルベ
ニシリン耐性の保存をもたらすという仮説を試験
するために、プラスミドpRO1601およびプラス
ミドpBR322を制限エンドヌクレアーゼPstで
分割（又は切断）した。これによつて、親の円形
構造から２つの線状分子（それは不規則に会合で
きる）、即ちプラスミドpRO1601からの可能な４
断片の１つと、プラスミドpBR322から誘導され
たDNAの線状単一断片が得られた。DNA組換え
技術、即ちプラスミドの分割、連結およびテトラ
サイクリンに対する抵抗性獲得用選択をもつた形
質転換を行なうことによつて２グループ（制限エ
ンドヌクレアーゼで地図を作ることにより後で判
定した）の組換え体プラスミドが得られた。 pRO1613の決定構造は次の可能性から期待さ
れるものに一致する：第２図のパネルＡに示す０
と1.21の間および1.21と2.93の間の距離を横切る
プラスミドpRO1601 Pst断片の再会合。しか
しながら、理論的に、これは得られたプラスミド
pRO1613について第２図のパネルＢに示すもの
ではない２つのPstの座位を有するプラスミド
を生成する。従つて、他の系の先例に基いて、
pRO1601地図上の０と2.93におけるDNAは、Pst
の座位の欠失をさせるが細菌培養の成長および
生殖中に細菌およびその子孫細胞によつてプラス
ミドの生存に必要な閉鎖リング構造を再形成させ
る過程において、未知の要素によつて変えられた
らしい。プラスミドpRO1613は、制限エンドヌ
クレアーゼPstを生んだDNA断片のクローニン
グ用に潜在的に有用である（その存在は、代謝特
性のDNAクローンド断片内の体現によつて確認
できる。） プラスミドpRO1614の決定構造は、クローニ
ング・ベクター・プラスミドpRO1601の一部お
よびクローンド断片（この場合はプラスミド
pBR322）を含む雑種−組換え体プラスミドに期
待される構造に一致している。さらに、この組換
え体pRO1614の形成およびその緑膿菌への形質
転換は、今はカルベニシリン耐性およびテトラサ
イクリン耐性である細菌の発生を伴う。従つて、
前記仮説を設けたように、カルベニシリン耐性遺
伝子の部分はブラスミドpRO1601から誘導され
（1.21の所に示すPstの座位の左側の領域）、そ
してカルベニシリンの遺伝子の部分は、挿入され
たDNA断片（第２図のパネルＣの右側の領域で
あつて、それはプラスミドpBR322の部分であ
る）から誘導されたことは明らかである。従つ
て、この結果は関係の無いDNA（プラスミド
pRB322）のクローニング用にプラスミド
PRO1601が有用であることを示した。また、こ
の結果は大きさは小さいが親のプラスミドDNA
分子pRO1601よりも高有用性である関連の派生
プラスミドの誘導を示す。 宿主細菌による維持に必要なプラスミド
pRO1601の重要な特徴に関する別の情報もこれ
らの実験により提供される。即ち第２図のパネル
Ａ、ＢおよびＣで0.05〜0.88の地図単位（0.83メ
ガダルトンの距離がある）領域が図示した全ての
プラスミドに共通している。従つて、これはプラ
スミドpRO1600に最初に存在するプラスミド
DNAの領域であつてプラスミド・クローニン
グ・ベクターおよびその可能な誘導体の複製およ
び維持に必須なものである。0.05および0.88地図
単位における制限エンドヌクレアーゼ酵素の座位
によつて画定されるこの領域はこの本発明の重要
な実施態様である。 以上の外に、本発明の開発において記載された
プラスミドの制限エンドヌクレアーゼ消化分析に
よつて、RP1から独立してプラスミドpRO1600
の遺伝地図の推論をすることができる。その制限
エンドヌクレアーゼ消化地図を第２図のパネルＤ
に示す。 本発明は特に、制限エンドヌクレアーゼでの染
色体分割により得られた染色体DNA断片を広宿
主域のレプリケーター・プラスミドへ添加するこ
とからなる方法に関する。このプラスミドと染色
体DNA断片の混和体は次にリガーゼによる処理
および組換えDNAの適当な細菌宿主への形質転
換を受ける。 この系列のクローニング実験用DNA源はプラ
スミドpRO1614と緑膿菌株PAO染色体であつた。
これら実験の目的は、細菌細胞の生合成活性に寄
与する特定の代謝機能を組み込んだ染色体上の遺
伝的場所に対応する染色体DNA断片をクローニ
ングするためのpRO1614の有用性を示すことで
あつた。このために、菌株PAO236と呼ぶ緑膿菌
の突然変異体を形質転換−クローニング受容菌と
して使用した（D.Haas and B.Holloway、
Molecular and general genetics 144：251
（1976）参照）。親菌の緑膿菌株PAO1c
（ATCC15692）と異なり、菌株PAO236は突然変
異したが、細胞合成と成長を維持するための成長
媒質にアミノ酸のＬ−イソロイシン、Ｌ−バリン
およびＬ−メチオンの添加を要した。従つて、こ
れらのアミノ酸の栄養素要求は、これらの化合物
の合成と関係する染色体DNA断片を含む組換え
体クローンの選択を考慮に入れる適当なクローン
ドDNA断片を受入した細菌はアミノ酸がない時
に成長能力を得る。また、この原理を適用するこ
とから、組換え体プラスミド（この場合は
pRO1614にクローニングまたは染色体DNA断片
を加えたもの）がプラスミドpRO1614の分子よ
りも大きくなるという結果になる（これは分子の
クローニング・プロセスにおいて付加DNAの獲
得を表わす。）広細菌宿主域のレプリケーター・
プラスミドpRO1613にクローニングされたプラ
スミドpBR322のDNAの中に、抗生物質テトラ
サイクリンに対する耐性を特定する遺伝情報が含
まれる。クローニングされた断片のこの領域内に
は、制限エンドヌクレアーゼBamH1用の認識座
位もある。 従つて、この関係から、クローニングされた
DNA断片のインビトロでの挿入によるこのテト
ラサイクリン耐性遺伝子の連続性の中断はこの遺
伝子により特定されたテトラサイクリン耐性を無
効にするという結果になる。さらに、クローニン
グされたDNA断片の選択が特定代謝特質の獲得
に基くならば、適当な組換体プラスミドを受入し
た細菌は問題の特定代謝特質に対応する代謝産物
がなくて成長するであろう。そのような菌株は前
述の方法で得られた、そしてそれらのプラスミド
抽出後のそれらのDNAを第３図に示す。第３図
において、Ｂ列は大きさの基準として用いた基準
のDNAを含んでいる。Ｃ列はプラスミド
pRO1614を示し、Ａ列はプラスミドpRO1614の
DNA断片が今やアミノ酸のイソロイシンとＬ−
バリンがなくて菌株PAO236を成長さすpRO1615
と呼ぶプラスミドを示し、Ｄ列はプラスミド
pRO1614のクローニングされたDNA断片が今や
アミノ酸のＬ−メチオニンがなくて菌株PAO236
を成長さすpRO1616と呼ぶプラスミドを示す。
Ａ列とＤ列に示す組換え体プラスミドが
pRO1614より大きいことは明らかである。これ
は、組換え体DNA技術の適用により異種のDNA
断片の獲得に関連した期待される関係である。 特定の説明 １ 工程 遺伝的クローニング・プラスミドを人工的、
化学的に誘導した非伝達性プラスミドの形にす
る特定の方法およびDNAの代表的断片の遺伝
的クローニングへの利用は次の通りである： (1) 遺伝的転移実験に続いて、先祖のプラスミ
ドRP1の存在についてのルーチン分析中に突
然変異プラスミドの新規性および潜在的有用
性の認識（pRO1600の発生）； (2) 特に不規則なプラスミドとして観察される
小プラスミドに抗生物質カルベニシリン耐性
用の識別可能な表現型特質の付加（プラスミ
ドpRO1601の産生）； (3) 制限エンドヌクレアーゼを用いてプラスミ
ドpRO1601の物理的遺伝子地図の作製； (4) プラスミドpRO1601のサイズ縮少（プラ
スミドpRO1613の産生）、プラスミド
pBR322のプラスミドpRO1601への遺伝的ク
ローニング（プラスミドpRO1614の産生）；
および (5) DNA組換え技術を用いて、Ｌ−イソロイ
シンおよびＬ−バリンまたはＬ−メチオニン
のない時に菌株PAO236による成長と関連し
た細菌染色体DNAの遺伝的クローニング。 ２ 使用菌株 遺伝的クローニング用プラスミドの発生およ
び確認に用いた細菌株およびそれらの顕著な特
色は次の通りである： (1) 緑膿菌PAO2：この菌株は緑膿菌1c
（ATCCNo.15692）の突然変異体であり、その
成長および維持にアミノ酸のセリンを必要と
する。 (2) 緑膿菌PAO2（RP1）：この菌株は前記
PAO2（RP1）NRRL−Ｂ−12123から細菌接
合のプロセスでプラスミドRP1の付加により
前記菌株PAO2から誘導された。 (3) シユードモナス・プチダPPO131：この菌
株はシユードモナス・プチダA.3.12（ATCC
No.12633）の突然変異体であり、その成長お
よび維持にアミノ酸のヒスチジンを必要とし
た。 (4) 螢光菌PFO141：この分離体は自然界から
分離された野生型菌株から誘導された。この
菌株のクローンは32℃以上の温度でその成長
と増殖が不能になつた。従つて、この生理学
的特性が細菌の成長を効果的に抑制する。従
つてそのプラスミドは補乳動物環境を排除す
る。螢光菌RFO141は成長および維持にアミ
ノ酸のヒスチジンを必要とする野生型菌株の
突然変異体である。 (5) 大腸菌ED8654：この菌株は大腸菌K12の
誘導された、そしてこの成長と維持にアミノ
酸のメチオニンを必要とする。この菌株も突
然変異したものでDNAを制限或いは修飾し
ない。 (6) アゾトバクター・バイネランデイ
AVM100：これは自然界から分離された菌
株である。 (7) 肺炎桿菌KPO100：これは自然界から分離
された菌株である。 (8) 大腸菌PAO236：この菌株は緑膿菌1c
（ATCC No.15692）の突然変異体であり、突
然変異にはイソロイシン、バリン、メチオニ
ン、その他のアミノ酸を必要とした。 前記培養菌は全てミシガン大学医学部の微
生物学科の培養菌集積所に保管されていて、
適性な受容菌に自由に利用できる。そのよう
な培養菌は他の貯蔵所からも入手することが
できる。 ３ 材料 前記細菌株の日常的な維持および増殖に使用
された細菌学的媒質は次の成分を含有した： バクト−トリプトン ５ｇ バクト−イースト・エキス 3.75ｇ デキストロース １ｇ KNO3 ４ｇ 蒸留水 1000ml 固体媒質を使用した時は、減菌前にバクト・
アガール（15ｇ）を添加した。媒質は121℃の
温度で15分間オートクレーブで処理することに
より減菌された。減菌処理後、前記媒質に抗生
物質を添加して50℃に冷却した。プラスミド
DNAが受容菌に添加され、抗生物質耐性を特
定するプラスミドの取込みおよび維持のための
選択が行なわれた。カルベニシリンには0.5
mg／ml、テトラサイクリンには大腸菌PAO2を
除いて0.025mg／mlであつた。この菌株に、テ
トラサイクリンを0.05mg／ml（媒質）添加し
た。 ４ 温度 シユードモナス・プチダ又は螢光菌を利用す
る実験は25℃で行ない、他の実験は全て37℃で
行なつた。 実施例 １ これはプラスミドpRO1600に選択遺伝標識形
質の付加実験（プラスミドpRO1601の生成）で
ある。 この実験には、緑膿菌PAO2（RP1）または緑
膿菌（RP1／pRO1600）から誘導され、部分的
に精製されたDNA懸濁液が緑膿菌PAO2の成長
培養菌に添加された。細菌の形質転換の周知プロ
セスに伴う実験操作に続いて、混和物を抗生物質
カルベニシリンを含んだ固体媒質の表面に置い
た。これを37℃で24時間培養した、そして細菌群
体の数を計数した。代表的な実験結果を第１表に
示す。カルベニシリンの存在下で成長できるよう
に選んだこれらの群体は、さらに抗生物質のテト
ラサイクリン又はカナマイシンを含む栄養培地で
増殖させた。 【表】 第１表に示す結果は、緑膿菌PAO2（RP1／
pRO1600）のDNA懸濁液から得た形質転換体の
８％だけがカルベニシリン耐性を獲得して、テト
ラサイクリン又はカナマイシン耐性は獲得できな
かつたことを示す。従つて、この結果は、前記技
術的背景の検討の所で示唆したように、Tn１ト
ランスポゾンをもつたpRO1600が形質転換され
たことを示唆する。一方、緑膿菌PAO2（RP1）
のDNA懸濁液を使用して誘導された形質転換体
は、この菌株が潜在的トランスポゾン受容菌プラ
スミドとしてプラスミドpRO1600を含まないか
ら、カルベニシリンのみに対する耐性をもつた形
質転換前を生成しなかつた。 実施例 ２ この実験はプラスミドpRO1601のサイズ減縮
（プラスミドpRO1613の生成）および
pBR322DNAのプラスミドpRO1601へのクロー
ニング（プラスミドpRO1614の生成）である。 この実験には、第２表に示す部分的に精製した
DNA溶液を表記酵素で処理した。形質転換体は
前もつてプラスミドを受け入れなかつた緑膿菌
PAO2の細胞を使用して選択された。表記のよう
に処理された種々のDNA標本との混合の結果と
して細菌により獲得された抗生物質耐性は表の右
欄に示す。 【表】 【表】 シリンおよびテ
トラサイクリン
耐性pRO1614
上記実験から、プラスミドpBR322はそれ自身
で形質転換できなかつたことが注目される。従つ
て、プラスミドpRO1601にクローニングされた
時そのテトラサイクリン耐性の表現は、中介体プ
ラスミドpRO1601によつて提供された重要な機
能との共同によるその維持を表わす。 実施例 ３ これは、pRO1600から誘導されたプラスミド
について広細菌宿主域の実証実験である。 異なる生態的地位および生理学的性質の細菌に
DNA組換え技術を用いてクローニングの実験を
行なうのに本発明の有用性に関してプラスミド
pRO1600の誘導体（pRO1613、pRO1614）の有
用性を示すために、形質転換−受容菌として緑膿
菌PAO2以外の細菌を用いて細菌の形質転換の研
究を行なつた。代表的な実験結果を第３表に示
す。DNAの生成および抽出の方法は前記ハンセ
ンおよびオルセンの引例に記載されている。 この研究のために、0.025ml緩衝溶液に懸濁し
た約0.5μｇのDNAが約１×108受容菌細胞（0.2ml
の体積）に添加された。その溶液はレーデルブル
グら（D.E.Lederburg and S.N.Cohen、J.Bact.
Vol.119、pp1072〜1074（1974）、
“Transformation of Salmonella typhinium by
plasmid Deoxyribonucleic Acid”）の方法で０
℃と45℃の間をサイクル加熱された。この混和体
は、細菌形質転換の周知方法に伴う実験操作に続
いて抗生物質を含んで固体媒質の表面に置いた。
これを37℃の温度で48時間培養して細菌群体の数
を計数した。これらの実験結果を第３表に示す。 【表】 第３表に示した実験は、プラスミドpRO1600
から誘導されたプラスミドの広宿主域の特徴を明
示している。使用した菌株での形質転換効率の変
動は、多分問題の菌株に最適でない形質転換プロ
セスを採用したことに関連していると思われる。
従つて、これらの結果の定量的解釈は、形質転換
効率の低い細菌での遺伝的クローニング実験用に
プラスミドpRO1600−誘導体の有用性を決して
限定するものではない。これらの場合に、問題の
細菌株についての細菌形質転換プロセスにおける
改良は、将来においてこれらの菌株を用いて形質
転換自体の効率を高めるべきである。 実施例 ４ 本例は、組換え体プラスミドpRO1614を使用
して緑膿菌から染色体DNAの分子クローニング
を実証するものである。 細菌の染色体遺伝子のクローニングにDNA組
換え技術を使用してクローニング実験を行なうの
に本発明の有用性に関して誘導プラスミド
pRO1614の効用を示すべく、アミノ酸のＬ−イ
ソロイシン、Ｌ−バリンおよびＬ−メチオニンの
生合成と関連した細菌遺伝子の選択（又は淘汰）
および分離のためにクローニング実験を行なつ
た。染色体およびプラスミドDNAの生成方法は
前記ハンセンとオルセンの引例に記載されてい
る。 この実験には、PAO1cから抽出した染色体
DNA又はプラスミドpRO1614DNA約05μｇが
0.025mlの緩衝液に懸濁され、制限エンドヌクレ
アーゼBamH1で消化された。次にそれぞれの溶
液を混合し、酵素T4リガーゼおよび共同因子で
処理した。この混合体は、細菌の形質転換法に伴
う実験操作に続いて、アミノ酸のＬ−イソロイシ
ンとＬ−バリンの場合、および別のアミノ酸のＬ
−メチオニンの場合を除いて緑膿菌による成長に
必要な栄養素を補給された固体培地の表面に置か
れた。前記選択培地の各々に細菌成長の単一群体
が現われた（108個の受容菌に１個の頻度）。これ
らの組換え体DNAプラスミドが形質転換の受容
菌から抽出される時、得られたDNAはさらに別
の受容菌への形質転換によるテスト時に高形質転
換頻度を示す。アミノ酸の生合成獲得の頻度はこ
れら実験におけるカルベニシリン耐性獲得の頻度
に対応する。次に、これらの群体はプラスミド
DNAの生成のために精製、成長される。 第３図は緑膿菌PAO236からのプラスミド
DNAについてのスラブ・アガロース・ゲル電気
泳動写真の一部を示す。細菌細胞は栄養のブイヨ
ン媒質で成長させ、プラスミドDNAは第１図に
関して記載したように抽出そして処理された。電
気泳動させたDNAの試料は次の通りである：Ａ
はＬ−イソロイシン又はＬ−バリンなしに成長で
きる形質転換体クローンから抽出したDNA
（pRO1615）；Ｂは大腸菌V517からのDNAであつ
て、大きさの標準として使用した菌株を含む多重
プラスミド；Ｃは緑膿菌PAO2（pRO1614）から
のDNA；ＤはＬ−メチオニンなしに成長できる
形質転換クローンから抽出したDNA
（pRO1616）。これら組換え体プラスミドの算定
した分子の大きさはＡ列のプラスミドが14×106
ダルトン、そしてＤ列のプラスミドが10.4×106
ダルトンである。 イソロイシンおよびバリン生合成の組換え体ク
ローン（Ａ列）又はメチオニン生合成（Ｄ列）は
プラスミドpRO1614クローニング・ベクター
（Ｃ列）より明らかに大きい。この関係は、DNA
の組換え技術を用いて問題のアミノ酸の生合成を
導く染色体DNAの獲得を表わしている。その組
換え体プラスミドは予想通りカルベニシリン耐性
を保持した。 本発明の新規プラスミドおよびRP1は、国際寄
託当局であるノーザン・リージヨナル研究所
（Northern Regional Research Laboratry）に
寄託されている、そして次の国際受託番号で請求
することにより自由に入手できる。また、それら
プラスミドは内国参照番号で請求することによつ
てミシガン大学からも入手することができる： 【表】 以上記載した実験の外に、本発明の範囲内にお
いて多くの実験がありうることは明らかである。
プラスミド・リング（plasmid rings）、およびデ
オキシリボ核酸プラスミドをインビボにおいて細
菌宿主に輸送する方法に関する。 種々の化学薬品を製造するためにプラスミド組
換え体の遺伝的操作を含む先行技術の商業ベース
による研究は、これまで宿主生物として大腸菌に
集中してきた。その理由は、その組換え体プラス
ミドが他の宿主生物と和合できないためである。
しかしながら、大腸菌は、哺乳動物の腸道内にお
けるその成長能と疾患をもたらすために、これら
の目的に最適の生物ではない。大腸菌の外に、広
い細菌宿主域を有するプラスミドをもつた宿主細
菌を使用できることが極めて望ましい。本発明
は、特に哺乳動物の体温において生存できない生
物（細菌）の使用に関する。 以下はこの発明に関して用いた語義である。 「細菌接合」とは、少なくとも２つの細菌宿主
間の支配と遺伝的伝達を意味し、その供与菌は
「雄」、そして受容菌は「雌」と呼ばれる。 「プラスミド集合体（又は集塊）」とは、２つ
のプラスミド・リング間の会合を意味する、この
場合、各プラスミドはその環状体としての構造を
保ち、各環状体は各組換え体の遺伝的操作のでき
るものである。 「輸送」とは、DNAが１つの細菌から別の細
菌へ転移されるプロセスを意味する。 「形質導入」とは、DNAプラスミドまたは断
片が細菌ウイルスによつてインビボでの自然のプ
ロセスで１つの細菌から別の細菌へ移り入れられ
ることを意味する。 「形質転換」とは、インビトロでの細菌の全細
胞から取り除いたDNAを宿主細菌へ移し入れる
ことを意味する。 「転位（トランスポジシヨン）」とは、遺伝物
質がDNA分子の１部分から他の部分、又は１つ
のDNA分子から他のDNA分子へ移動することを
意味する。 「トランスポゾン（transpcscn）」とは、転位
によつて移送された遺伝物質を意味する。 「DNA源」または「DNA断片」とは、真核細
胞又は原核細胞および／またはそれらのウイルス
を含む寄生体から誘導された染色体または染色体
外の細胞要素からのDNAを意味する。 特許技術の状態は、主国特許第3813316号；第
4038143号；第4080261号；第4082613号および第
4190495号に一般的に記載されている。これらの
特許には本発明に関連した先行技術の方法が記載
されている。 DNA分子自体の合成に必要な酵素と蛋白質の
一連の群の外に、インビボでのDNA分子の複製
に必要な２つのエレメントが同定されている。そ
れらは、(1)DNA分子上の領域であつてDNA複製
の起源として同定され、蛋白質によつて認識され
るものである、また(2)同じDNA分子にみられる
前記蛋白質の遺伝子である。この最小限の仕様を
細菌細胞内で独自の自己増殖ができるDNA分子
と仮定すると、前記２つの機能を妨げない限りさ
らに別のDNA小片が含まれうる。事実、宿主細
菌種内に含まれ、宿主細菌種によつて染色体外に
保持されていることがわかつている前記(1)と(2)の
組合せがプラスミドまたは染色体要素と呼ばれて
きた（Bacteriological Reviews、９、pp.552−
590（1976）参照）。最近まで、微生物遺伝学者は、
細菌染色体のDNAをプラスミドに組換えるため、
または同一の宿主細菌内に一緒に保持されたプラ
スミド間の組換えをするために、宿主細菌細胞の
組換え機構を利用してインビボにおいてDNA断
片を操作してきた。この方法は、複雑なゲノムの
一部分を除去することによつて複雑なゲノムの
種々の領域を精製して別の複製単位にすることが
できた。しかし、この方法は、通常は別の源か
ら、又は別の生物体から大きな生物学的障壁を越
えて運搬されたDNAから成るプラスミド−ハイ
ブリツドの構成を考慮しない。 しかしながら、最近、DNAの異種断片のイン
ビボでの操作および組換え技術によつて雑種
DNA分子の生成が可能になつた。文献
〔“Recombinant Molecules：Impact on Sciene
and Society”、R.F.Beers and E.G.Bassett.pp.9
−20、Raven Press、New York（1977）〕から
引用したインビトロ法の要約は次の通りである： 「インビトロでの組換え体（DNA）技術には、
最終的に全ての源からのDNA断片をレプリコン
（プラスミド）へ挿入さすことになる２、３の重
要な技術的要素；およびそれらの複製要素として
の回復がある。これら技術的要素は： (1) 目的のDNA分子の制限エンドヌクレアーゼ
による系統的切断（これら酵素の検討について
は、ロバーツ（Roberts）著のRecombinant
Moleculesを参照されたい）； (2) 連結反応によるDNA断片の適当なクローニ
ング媒体（またはレプリコーン）への再結合； (3) 組換え体DNAによる細胞の形質転換、およ
び組換え体プラスミドを含む細胞の選択；およ
び (4) 得られたDNAの「クロン化（Cloned）」断
片の同定および特性指摘。」 この発明は、上記事項の全て、特に第(2)項、す
なわち適当なクローニング運搬体（プラスミド）
の必要条件、および前記形質変換法の利用に寄与
するプラスミド・クローニング・ベクターの新し
い性質に関するものである。 分子DNAのクローニングに潜在的に有用なプ
ラスミドの生物学的な性質は、ヘリンスキイら
（D.B.Helinski at al）によつて次のように要約
されている〔Recombinant Molecules：Impact
on Science and Society、P.151、R.F.Beers
and E.G.Bassett、eds.、Raven Press、New
York（1977）を参照〕： 「大腸菌における遺伝子のクローニングに対す
るプラスミド要素の利用性が最初に論証されて以
来、種々のプラスミド要素が大腸菌および他の細
菌におけるクローニング媒体として開発されてき
た。これらの新しいクローニング媒体はDNAの
クローニングに有利な次のようなプラスミド特性
をもつている： (1) 宿主細菌細胞内での安定維持、 (2) 非自己伝達能、 (3) 遺伝的操作の容易性、 (4) 分離の容易性、 (5) 寸法的に大きな範囲の異種DNAとの結合能
力およびその複製能力、 (6) インビトロで生じた雑種プラスミドの細菌細
胞への導入の容易性。」 しかしながら、組換え体DNAの技術に有用な
プラスミドを最大限に利用するのに望ましいと考
えられた特性に関する前記仕様は広い細菌宿主域
をもつたクローニング・プラスミドの高利用性を
考慮していない。 今までに記載された大部分の細菌プラスミド
は、プラスミドが最初に分離された細菌に密接に
関係した細菌種においてのみ維持することができ
る。このために、特定プラスミドのDNAの維持
および重複に関連した必要条件は一般に問題のプ
ラスミドに特有なものである。しかし、この一般
的な所見には例外があつた。例えば、オルセン
（Olsen.本願の発明者）とシツプレイ（Shipley）
は、多重の抗生物質抵抗を特定とするプラスミ
ド、R1822（後でRP1と呼ぶようになつた）が、
有性接合によつて関係および無関係の細菌属を代
表する種々の細菌種に転移されることを示した
〔Journal of Bacteriology、113、No.２、pp.772
−780（1973）を参照〕。菌株、緑膿菌1822（これか
ら後でRP1が得られた）の起源はロウペリー
（Lowbury、E.J.）らにより示された（Lancet
ii、448−452（1969）参照）。プラスミドRP1の細
菌宿主域は、腸内菌（Enterobacteriaceae）、土
壤腐生菌（Pseudomonas）、ナイセリア・ペルフ
ロバ（Neisseria perflava）および光合成菌を含
む。従つて、プラスミドRP1は、関係のない細菌
種間を自由に転移する広宿主域の細菌プラスミド
の一例である。 そのプラスミド・リングRP1は比較的大きいも
のである。この寸法が大きいこととプラスミド・
リングの組成が細菌の形質転換のプロセスを非効
率的なものにする。特に形質転換によつて細菌宿
主から細菌宿主へと容易かつ広く輸送できるクロ
ーニング媒体としての小さなプラスミド・リング
およびその組換え体を提供することは技術的に著
しい改良となる。それらのプラスミドが同定のた
めに抗生物質抵抗性の単一表現型標識形質を含む
ならば、それらプラスミドは特に有用なものとな
る。また、小プラスミド・リングの断片を他の遺
伝子断片とインビボまたはインビトロでの組換え
方法を提供することも改良となる。 従つて、本発明の目的はデオキシ核酸プラスミ
ドをインビボの細菌宿主に輸送する方法を提供す
ることである。 さらに、組換え体のプラスミド・リング内で結
合されるときにクローニング媒体の働をする小プ
ラスミドから誘導され、広い細菌宿主転移範囲を
有する新しい組換え体プラスミド・リングを提供
することがこの発明の目的である。 特に、宿主細菌において有用な化学薬品生成特
性または他の有用な特性を有する組換え体プラス
ミド・リングを提供することが本発明の目的であ
る。これらおよび他の目的は、添付図面と共に以
下の記載からさらに明白となるであろう。 本発明は、細菌の接合、形質転換または形質導
入の工程を用いてデオキシリボ核酸プラスミドを
インビボにおいて細菌宿主に運搬する方法におい
て、(a)緑膿菌NRRL−Ｂ−12124、NRRL−Ｂ−
12125、NRRL−Ｂ−12126、NRRL−Ｂ−
12127、NRRL−Ｂ−12149およびNRRL−Ｂ−
12148にそれぞれ運ばれるpRO1600、pRO1601、
pRO1613、pRO1614、pRO1615およびpRO1616
から選んだクローニング運搬体としての第１のプ
ラスミドと、(b)その第１のプラスミドおよび第２
のDNA源のエンドヌクレアーゼによる切断によ
つて産生された第１のプラスミドの組換体プラス
ミド・リング誘導体から選んだDNAプラスミ
ド・リングを線状のDNA断片内に運搬し、それ
ら線状DNA断片を一緒に連結反応させて、組換
体プラスミドを形成させることから成り、前記プ
ラスミド・リングは緑膿菌PAO ATCC15692に
よつて運搬することができ、かつ広細菌宿主域を
有し、該プラスミド・リング自身は宿主細菌の細
菌分裂中にデオキシリボ核酸の複製によつてクロ
ーンを生成し、クローニング運搬体からのDNA
が細菌分裂中に組換え体プラスミドの複製を制御
することを特徴とするDNAプラスミドをインビ
ボにおいて細菌宿主に運搬することを特徴とす
る。 細菌のプラスミド含量は、スラブ・アガロー
ス・ゲルの電気泳動法を採用し得られた電気フエ
ログラムの写真を観察することにより便利かつ迅
速に決定することができる（例えば、Hansen
and Olsen、Journal of Bacteriology、135、No.
１・pp.227−238（1978）を参照されたい）。かく
して、DNAは第１図に示すように次の如く電気
泳動された：図のＡは緑膿菌NRRL12123から抽
出したDNA；ＢはRP1／pRO1600のDNA；Ｃは
pRO1601のDNA；Ｄは大腸菌V517〔サイズ標準
として使用した多プラスミドを含む菌株
（Plasmid、１ pp.417−420（1978）参照）の
DNA；ＥはpRO1613のDNA；そしてＦは
pRO1614のDNAである。この方法は、適当な標
準体を併用することにより存在するプラスミドの
分子の大きさも決定することができる。 プラスミドRP1が細菌接合（又は有性接合）の
プロセスによつて１つの細菌から別の細菌へ伝達
される時、そのプラスミドを新たに得た受容菌
は、普通、電気泳動図では供与菌に存在するプラ
スミドと区別できないプラスミドを含む。第１図
のＡ列には、伝達後に供与菌細胞個体群または受
容菌細胞個体群から抽出した時のプラスミドRP1
の通常の様相（又は様子）が示されている。ある
場合には別の結果が得られた。緑膿菌PAO 25で
の交雑実験においてプラスミドRP1を受け取つた
ATCC15692（菌株PAO2）の単一受容菌細胞から
誘導した培養体を分析した所、異なるプラスミド
集合体を生成していた。そのトランス接合個体は
親のプラスミドのみならずかなり小さい第２のプ
ラスミドを示した（第１図、Ｂ列参照）。親の大
きさのプラスミドは第１図Ｂ列の最上部に、異常
に小さなプラスミドは下部に示されている。この
下部のプラスミドの大きさは、Ｄ列に示す標準寸
法と比較、計算した所38×1016ダルトンのRP1に
対して２×106ダルトンであつた。従つて、この
小プラスミドの出現は、一般に親プラスミドRP1
の受容菌への伝達中に生じたランダムの突然変異
と考えられる新規の出来事を示している。本発明
者は、小プラスミドpRO1600およびRP1を有す
る集合体をRP1／pRO1600と名付けた。 組換え体DNAの技術における小プラスミドの
利用性は、宿主細菌がもつていなかつた独特な代
謝特性用の遺伝情報をエンコード（encode）す
る能力から一部由来する。従つて、プラスミドの
存在又は不在は、遺伝的操作後に問題の代謝特性
の存否に基いて決めることができる。第１図のＢ
列に示す細菌株を予備的に分析した所、プラスミ
ドpRO1600の存在に関連した独特な代謝特性
（又は表現型形質）を示さなかつた。従つて、本
発明者は、pRO1600に区別の目安となる表現型
形質を加えて後の実験でその検出をする細菌の遺
伝的標準技法を適用し、それによつて部分的に精
製したDNA溶液から受容菌株へ転換される能力
を試験した。加えた区別の目安となる表現型形質
は、抗生物質カルベニシリンへの耐性用の遺伝情
報をエンコードするDNAの断片であつた。従つ
て、このDNA断片とプラスミドpRO1600を保有
する細菌は全て、親のプラスミドを含まない細菌
株と異なりカルベニシリンの存在下で成長するこ
とになる。 カルベニシリン耐性用の遺伝特性（又は形質）
は、トランスポジシヨンと呼ぶ遺伝的プロセスで
プラスミドpRO1600へ添加された。トランスポ
ゾンと呼ぶ若干の抗生物質耐性遺伝子は、DNA
の断片上のある場所から別の場所へ移動できる、
或いはトランスポジシヨンと呼ぶ遺伝的なプロセ
スで細菌細胞内にあるDNA分子から別のDNA分
子へ移動できる（S.Cohen.“Trans−posable
gonetic elements and plasmid evolution”、
Natre、263.pp.731−738（1976）参照）。これらの
遺伝的エレメントは、細菌宿主の遺伝的組換え機
構なしにこのプロセスを果たす。第１図のＡ列に
示すプラスミドRP1は、カルベニシリンおよび関
連抗生物質（ペニシリン、アムピシリン）に対す
る耐性用遺伝情報をエンコードするTnlと呼ぶト
ランスポゾンを含む。トランスポゾンTnlは分子
の大きさが3.2×106ダルトンの転置可能な遺伝的
エレメントである。従つて、Tnlによつて転置さ
れたDNAは3.2×106ダルトンまで大きさを増す
ことになる。 転位（トランスポジシヨン）は、トランスポゾ
ンを有する供与菌のDNA分子を含む細菌細胞の
個体群において不規則に生じる。従つて、菌株緑
膿菌RP1／pRO1600の場合に、小比率の細菌細
胞が転位された異体のプラスミドを含むことが期
待される。例えば、第１図のＢ列に示すように、
培養における２、３の細菌細胞は、電気泳動図の
下部に示す小DNA分子より3.2×106ダルトンま
で大きいDNA分子を含んでいる（そのプラスミ
ドはpRO1600となづけた）。しかしながら、培養
におけるこれら細菌の比較的少数は第１図に示す
ようにアガロース・ゲルでの検出を妨害する。し
かし、これらプラスミドpRO1600の転置誘導体
は、細菌の形質転換と呼ぶ遺伝的技法を採用する
ことにより検出と分離をされる。この方法によつ
て、供与菌細胞から抽出されたDNAはプラスミ
ドを含まない受容菌細胞培養体へ付加される。次
に、その混合体は、この場合抗生物質のカルベニ
シリンを含む細菌学的媒質で成長する。これらの
条件下で、抗生物質カルベニシリン用の遺伝情報
をエンコードしている遺伝エレメントを得て複製
した細菌細胞のみが高密度個体群に成長する。こ
の実験が行なわれる時、２種類のカルベニシリン
耐性細菌株が期待される：即ち、供与菌親プラス
ミドRP1の全てを受け入れたものと、カルベニシ
リン耐性をエンコードしているトランスポゾン
Tnlと結合したpRO1600のみを受け入れたもので
ある。前者の可能な細菌分離体は、これらの細菌
がカルベニシリンのみならずテトラサイクリンお
よびカナマイシンに耐性があることによつて区別
することができる。しかし、後者の可能性の場合
に、これらの細菌分離体は、それらがプラスミド
RP1から細菌細胞内で同時に共に保持されたプラ
スミドpRO1600へジヤンプしたTnlだけを受け入
れたから、抗生物質カルベニシリンに対する耐性
のみを示すであろう。そのような細菌株は前述の
プロセスで得られた、そしてそのDNAは、その
プラスミドの抽出および電気泳動後のものを第１
図のＣ列に示す。このプラスミドpRO1601の電
気泳動による移動度は、プラスミドpRO1600よ
りも遅い（これはサイズが大きいこと表わす）。
第１図のＤ列に示す標準DNAを用いて計算する
と、pRO1601がpRO1600よりも分子の大きさで
3.2×106大きいことになる。従つて、この関係は
TnlがpRO1600へ付加されたこと、従つて独特な
代謝特質（表現型標識形質）がpRO1600へ付加
されたこと示唆する（その検出は抗生物質カルベ
ニシリンに対する耐性を試験することによつて行
なう）。 DNA分子はプリンおよびピリミジンと呼ぶ置
換分子からなる線状分子である。その結合したプ
リン又はピリミジンの正確な線状配例（シークエ
ンス）が注目のDNA分子の領域を画定する。
DNA分子に類似した領域は、クラスの制限エ
ンドヌクレアーゼと呼ぶ領域におけるそれらの活
性に特有な酵素での分割（cleavage）によつて
識別することができる（B.Allet.“Fragments
Produced by cleavage of lambda
deoxyribonucleic acid with Haemophilus
parainfluenzae restriction enzyme Hpa”
Biochemistry、12、pp.3972−3977（1972）参
照）。認識シークエンスと呼ばれ、40以上の特異
制限エンドヌクレアーゼのいずれかによつて切断
されるための部位の役目をするDNAの特定領域
は、異なる生物源からのDNAと比較したときに、
異なつた分布をするか、或いは１つも存在しな
い。逆に言えば、関係又は同一のDNA分子は、
制限エンドヌクレアーゼ消化およびスラブ・アガ
ロース・ゲル電気泳動法による分析後に同一セツ
トの断片を生成する。従つて、新しいプラスミド
は前述の消化後に生成することができる。DNA
分子の大きさが小さく、制限エンドヌクレアーゼ
での処理により生成した断片の数が少ないと、こ
れらの断片は、親分子に最初に存在した時と異な
る順序で不規則に連合することができる。この不
規則な再連合に続いて、それら断片は、再連合複
合体がDNAリガーゼと呼ぶ第２酵素で処理され
る時に再び共有結合ができ、補因子を必要とす
る。従つて、前述の方法はDNA分子の構造解析
およびDNAシークエンスの新組合せ体の生成に
適用できる。従つて、前述の方法によつて、プラ
スミドの構造はDNAの必須でない領域の欠失或
いは生物学的に関係のない源からのDNAからな
るDNA分子の生成によつて変えることができる。 本発明は特に、プラスミドpRO1601、通常
DNA組換え技術と呼ばれる前述の原理および手
順を適用することによる遺伝的クローニングおよ
び新規性に対する前記プラスミドpRO1601の修
飾および有用性に関する。このDNA組換え技術
の主な特徴は、既に要約されている（S.Cohen、
Scientific American、July、pp.25−33（1975）
参照）。 上記通常の方法によるプラスミドpRO1601の
DNAの分析（制限エンドヌクレアーゼの地図作
製）した所、第２図のＡ部に示す構造となつた。
この遺伝学的地図は、制限エンドヌクレアーゼ
Pstについて４つの制限エンドヌクレアーゼ認
識座位（sites）があることを示している。
pRO1601を生成するためにpRO1601へ付加され
たトランスポゾンTn1は、３つのPst制限エン
ドヌクレアーゼの座位を含むことが知られている
（J.Grinsted et al、plasmid、１、pp34−37
（1977）参照）。従つてTn１により置換を受けた
組換え体プラスミドのpRO1600の領域は単一の
Pst座位を含まなければならない。また、Tn１
と連合したPst断片の大きさは前述のように評
価されたから、pRO1600に独特なPst分割用の
特定座位は同定することができる。この座位は、
遺伝地図作製用基準座位として選ばれた、そして
第２図のＡ部に示す図面の左側に現われている。
組換え体プラスミドpRO1601の領域を表わす他
の座位（それらはTn１の一部である）は
pRO1600 Pstの座位に関して並置されてい
る。また、この遺伝地図に示すように、制限エン
ドヌクレアーゼBg1についての特定認識座位が
ある。これらは、トランスポゾンTn１を
pRO1600に挿入した点に関してpRO1601と異な
るTn１−置換プラスミドpRO1600の他の変種を
比較することによつて決定された。このために、
組換え体DNA技術に付随する通常の方法を採用
した。 第２図のパネルＡの1.21の所に引いたPst制
限エンドヌクレアーゼの座位（これはトランスポ
ゾンTn１の付加を反映する領域の部分として知
られている）は、カルベニシリンに対する耐性を
エンコードする遺伝的領域の中央にあるべきこと
が知られている。従つて、この点に過剰DNAの
挿入はDNA配列の連続性を破壊し、DNAのこの
領域がカルベニシリン耐性をもつた酵素を特定す
る能力を喪失をもたらすことになる。pRO1601
の分子クローニングへの有用性を示すために、
DNAの断片をこの座位に挿入した。しかしなが
ら、このDNA断片は抗生物質テトラサイクリン
に対する耐性用の遺伝情報を含んでいる。従つ
て、この断片をこの座位でプラスミドpRO1601
へ組み込まれ、連結されて閉鎖、円形DNA構造
を形成し、受容菌に形質転換され、そしてテトラ
サイクリンの存在下で成長できるように培養され
ると、挿入断片のクローニングが生じるであろ
う。 これらの実験用のDNA源には、さらに
pBR322と呼ぶ別のプラスミドがあつた（F.
Bolivar et al、“Construction and
Characterization of New Cloning Vehicles
．ａ multipurpose cloning system”Gene、
２、pp.95−113（1977）参照）。現在まで開発され
たクローニング・プラスミドの代表的なものであ
るプラスミドpBR322は、原菌の大腸菌に密接に
関係しない細菌中に保存することができない。従
つて、このプラスミドDNAを無関係の緑膿菌へ
導入すると、それは耐性、即ちカルベニシリンお
よびテトラサイクリンに対する耐性をエンコード
する抗生物質の存在下で成長する能力を授与する
ことができない。一方、組換えによつてプラスミ
ドpBR322のDNAがプラスミドpRO1601のよう
なプラスミドの構造の一部分になると、組換え体
プラスミドを含むpRO1601−pBR322雑種にその
遺伝機能が授与されることになる。プラスミド
pRO1601に類似したプラスミドpBR322も抗生物
質カルベニシリンに対する耐性を特定する遺伝子
を含む。この遺伝子もカルベニシリン耐性と関連
したそのDNAの領域内に制限エンドヌクレアー
ゼPst用の座位を有する。プラスミドpRO1601
のカルベニシリン耐性遺伝子の部分がプラスミド
pBR322からの類似遺伝子の部分と接合できて、
この場合１つの場所で接合した雑種分子にカルベ
ニシリン耐性の保存をもたらすという仮説を試験
するために、プラスミドpRO1601およびプラス
ミドpBR322を制限エンドヌクレアーゼPstで
分割（又は切断）した。これによつて、親の円形
構造から２つの線状分子（それは不規則に会合で
きる）、即ちプラスミドpRO1601からの可能な４
断片の１つと、プラスミドpBR322から誘導され
たDNAの線状単一断片が得られた。DNA組換え
技術、即ちプラスミドの分割、連結およびテトラ
サイクリンに対する抵抗性獲得用選択をもつた形
質転換を行なうことによつて２グループ（制限エ
ンドヌクレアーゼで地図を作ることにより後で判
定した）の組換え体プラスミドが得られた。 pRO1613の決定構造は次の可能性から期待さ
れるものに一致する：第２図のパネルＡに示す０
と1.21の間および1.21と2.93の間の距離を横切る
プラスミドpRO1601 Pst断片の再会合。しか
しながら、理論的に、これは得られたプラスミド
pRO1613について第２図のパネルＢに示すもの
ではない２つのPstの座位を有するプラスミド
を生成する。従つて、他の系の先例に基いて、
pRO1601地図上の０と2.93におけるDNAは、Pst
の座位の欠失をさせるが細菌培養の成長および
生殖中に細菌およびその子孫細胞によつてプラス
ミドの生存に必要な閉鎖リング構造を再形成させ
る過程において、未知の要素によつて変えられた
らしい。プラスミドpRO1613は、制限エンドヌ
クレアーゼPstを生んだDNA断片のクローニン
グ用に潜在的に有用である（その存在は、代謝特
性のDNAクローンド断片内の体現によつて確認
できる。） プラスミドpRO1614の決定構造は、クローニ
ング・ベクター・プラスミドpRO1601の一部お
よびクローンド断片（この場合はプラスミド
pBR322）を含む雑種−組換え体プラスミドに期
待される構造に一致している。さらに、この組換
え体pRO1614の形成およびその緑膿菌への形質
転換は、今はカルベニシリン耐性およびテトラサ
イクリン耐性である細菌の発生を伴う。従つて、
前記仮説を設けたように、カルベニシリン耐性遺
伝子の部分はブラスミドpRO1601から誘導され
（1.21の所に示すPstの座位の左側の領域）、そ
してカルベニシリンの遺伝子の部分は、挿入され
たDNA断片（第２図のパネルＣの右側の領域で
あつて、それはプラスミドpBR322の部分であ
る）から誘導されたことは明らかである。従つ
て、この結果は関係の無いDNA（プラスミド
pRB322）のクローニング用にプラスミド
PRO1601が有用であることを示した。また、こ
の結果は大きさは小さいが親のプラスミドDNA
分子pRO1601よりも高有用性である関連の派生
プラスミドの誘導を示す。 宿主細菌による維持に必要なプラスミド
pRO1601の重要な特徴に関する別の情報もこれ
らの実験により提供される。即ち第２図のパネル
Ａ、ＢおよびＣで0.05〜0.88の地図単位（0.83メ
ガダルトンの距離がある）領域が図示した全ての
プラスミドに共通している。従つて、これはプラ
スミドpRO1600に最初に存在するプラスミド
DNAの領域であつてプラスミド・クローニン
グ・ベクターおよびその可能な誘導体の複製およ
び維持に必須なものである。0.05および0.88地図
単位における制限エンドヌクレアーゼ酵素の座位
によつて画定されるこの領域はこの本発明の重要
な実施態様である。 以上の外に、本発明の開発において記載された
プラスミドの制限エンドヌクレアーゼ消化分析に
よつて、RP1から独立してプラスミドpRO1600
の遺伝地図の推論をすることができる。その制限
エンドヌクレアーゼ消化地図を第２図のパネルＤ
に示す。 本発明は特に、制限エンドヌクレアーゼでの染
色体分割により得られた染色体DNA断片を広宿
主域のレプリケーター・プラスミドへ添加するこ
とからなる方法に関する。このプラスミドと染色
体DNA断片の混和体は次にリガーゼによる処理
および組換えDNAの適当な細菌宿主への形質転
換を受ける。 この系列のクローニング実験用DNA源はプラ
スミドpRO1614と緑膿菌株PAO染色体であつた。
これら実験の目的は、細菌細胞の生合成活性に寄
与する特定の代謝機能を組み込んだ染色体上の遺
伝的場所に対応する染色体DNA断片をクローニ
ングするためのpRO1614の有用性を示すことで
あつた。このために、菌株PAO236と呼ぶ緑膿菌
の突然変異体を形質転換−クローニング受容菌と
して使用した（D.Haas and B.Holloway、
Molecular and general genetics 144：251
（1976）参照）。親菌の緑膿菌株PAO1c
（ATCC15692）と異なり、菌株PAO236は突然変
異したが、細胞合成と成長を維持するための成長
媒質にアミノ酸のＬ−イソロイシン、Ｌ−バリン
およびＬ−メチオンの添加を要した。従つて、こ
れらのアミノ酸の栄養素要求は、これらの化合物
の合成と関係する染色体DNA断片を含む組換え
体クローンの選択を考慮に入れる適当なクローン
ドDNA断片を受入した細菌はアミノ酸がない時
に成長能力を得る。また、この原理を適用するこ
とから、組換え体プラスミド（この場合は
pRO1614にクローニングまたは染色体DNA断片
を加えたもの）がプラスミドpRO1614の分子よ
りも大きくなるという結果になる（これは分子の
クローニング・プロセスにおいて付加DNAの獲
得を表わす。）広細菌宿主域のレプリケーター・
プラスミドpRO1613にクローニングされたプラ
スミドpBR322のDNAの中に、抗生物質テトラ
サイクリンに対する耐性を特定する遺伝情報が含
まれる。クローニングされた断片のこの領域内に
は、制限エンドヌクレアーゼBamH1用の認識座
位もある。 従つて、この関係から、クローニングされた
DNA断片のインビトロでの挿入によるこのテト
ラサイクリン耐性遺伝子の連続性の中断はこの遺
伝子により特定されたテトラサイクリン耐性を無
効にするという結果になる。さらに、クローニン
グされたDNA断片の選択が特定代謝特質の獲得
に基くならば、適当な組換体プラスミドを受入し
た細菌は問題の特定代謝特質に対応する代謝産物
がなくて成長するであろう。そのような菌株は前
述の方法で得られた、そしてそれらのプラスミド
抽出後のそれらのDNAを第３図に示す。第３図
において、Ｂ列は大きさの基準として用いた基準
のDNAを含んでいる。Ｃ列はプラスミド
pRO1614を示し、Ａ列はプラスミドpRO1614の
DNA断片が今やアミノ酸のイソロイシンとＬ−
バリンがなくて菌株PAO236を成長さすpRO1615
と呼ぶプラスミドを示し、Ｄ列はプラスミド
pRO1614のクローニングされたDNA断片が今や
アミノ酸のＬ−メチオニンがなくて菌株PAO236
を成長さすpRO1616と呼ぶプラスミドを示す。
Ａ列とＤ列に示す組換え体プラスミドが
pRO1614より大きいことは明らかである。これ
は、組換え体DNA技術の適用により異種のDNA
断片の獲得に関連した期待される関係である。 特定の説明 １ 工程 遺伝的クローニング・プラスミドを人工的、
化学的に誘導した非伝達性プラスミドの形にす
る特定の方法およびDNAの代表的断片の遺伝
的クローニングへの利用は次の通りである： (1) 遺伝的転移実験に続いて、先祖のプラスミ
ドRP1の存在についてのルーチン分析中に突
然変異プラスミドの新規性および潜在的有用
性の認識（pRO1600の発生）； (2) 特に不規則なプラスミドとして観察される
小プラスミドに抗生物質カルベニシリン耐性
用の識別可能な表現型特質の付加（プラスミ
ドpRO1601の産生）； (3) 制限エンドヌクレアーゼを用いてプラスミ
ドpRO1601の物理的遺伝子地図の作製； (4) プラスミドpRO1601のサイズ縮少（プラ
スミドpRO1613の産生）、プラスミド
pBR322のプラスミドpRO1601への遺伝的ク
ローニング（プラスミドpRO1614の産生）；
および (5) DNA組換え技術を用いて、Ｌ−イソロイ
シンおよびＬ−バリンまたはＬ−メチオニン
のない時に菌株PAO236による成長と関連し
た細菌染色体DNAの遺伝的クローニング。 ２ 使用菌株 遺伝的クローニング用プラスミドの発生およ
び確認に用いた細菌株およびそれらの顕著な特
色は次の通りである： (1) 緑膿菌PAO2：この菌株は緑膿菌1c
（ATCCNo.15692）の突然変異体であり、その
成長および維持にアミノ酸のセリンを必要と
する。 (2) 緑膿菌PAO2（RP1）：この菌株は前記
PAO2（RP1）NRRL−Ｂ−12123から細菌接
合のプロセスでプラスミドRP1の付加により
前記菌株PAO2から誘導された。 (3) シユードモナス・プチダPPO131：この菌
株はシユードモナス・プチダA.3.12（ATCC
No.12633）の突然変異体であり、その成長お
よび維持にアミノ酸のヒスチジンを必要とし
た。 (4) 螢光菌PFO141：この分離体は自然界から
分離された野生型菌株から誘導された。この
菌株のクローンは32℃以上の温度でその成長
と増殖が不能になつた。従つて、この生理学
的特性が細菌の成長を効果的に抑制する。従
つてそのプラスミドは補乳動物環境を排除す
る。螢光菌RFO141は成長および維持にアミ
ノ酸のヒスチジンを必要とする野生型菌株の
突然変異体である。 (5) 大腸菌ED8654：この菌株は大腸菌K12の
誘導された、そしてこの成長と維持にアミノ
酸のメチオニンを必要とする。この菌株も突
然変異したものでDNAを制限或いは修飾し
ない。 (6) アゾトバクター・バイネランデイ
AVM100：これは自然界から分離された菌
株である。 (7) 肺炎桿菌KPO100：これは自然界から分離
された菌株である。 (8) 大腸菌PAO236：この菌株は緑膿菌1c
（ATCC No.15692）の突然変異体であり、突
然変異にはイソロイシン、バリン、メチオニ
ン、その他のアミノ酸を必要とした。 前記培養菌は全てミシガン大学医学部の微
生物学科の培養菌集積所に保管されていて、
適性な受容菌に自由に利用できる。そのよう
な培養菌は他の貯蔵所からも入手することが
できる。 ３ 材料 前記細菌株の日常的な維持および増殖に使用
された細菌学的媒質は次の成分を含有した： バクト−トリプトン ５ｇ バクト−イースト・エキス 3.75ｇ デキストロース １ｇ KNO3 ４ｇ 蒸留水 1000ml 固体媒質を使用した時は、減菌前にバクト・
アガール（15ｇ）を添加した。媒質は121℃の
温度で15分間オートクレーブで処理することに
より減菌された。減菌処理後、前記媒質に抗生
物質を添加して50℃に冷却した。プラスミド
DNAが受容菌に添加され、抗生物質耐性を特
定するプラスミドの取込みおよび維持のための
選択が行なわれた。カルベニシリンには0.5
mg／ml、テトラサイクリンには大腸菌PAO2を
除いて0.025mg／mlであつた。この菌株に、テ
トラサイクリンを0.05mg／ml（媒質）添加し
た。 ４ 温度 シユードモナス・プチダ又は螢光菌を利用す
る実験は25℃で行ない、他の実験は全て37℃で
行なつた。 実施例 １ これはプラスミドpRO1600に選択遺伝標識形
質の付加実験（プラスミドpRO1601の生成）で
ある。 この実験には、緑膿菌PAO2（RP1）または緑
膿菌（RP1／pRO1600）から誘導され、部分的
に精製されたDNA懸濁液が緑膿菌PAO2の成長
培養菌に添加された。細菌の形質転換の周知プロ
セスに伴う実験操作に続いて、混和物を抗生物質
カルベニシリンを含んだ固体媒質の表面に置い
た。これを37℃で24時間培養した、そして細菌群
体の数を計数した。代表的な実験結果を第１表に
示す。カルベニシリンの存在下で成長できるよう
に選んだこれらの群体は、さらに抗生物質のテト
ラサイクリン又はカナマイシンを含む栄養培地で
増殖させた。 【表】 第１表に示す結果は、緑膿菌PAO2（RP1／
pRO1600）のDNA懸濁液から得た形質転換体の
８％だけがカルベニシリン耐性を獲得して、テト
ラサイクリン又はカナマイシン耐性は獲得できな
かつたことを示す。従つて、この結果は、前記技
術的背景の検討の所で示唆したように、Tn１ト
ランスポゾンをもつたpRO1600が形質転換され
たことを示唆する。一方、緑膿菌PAO2（RP1）
のDNA懸濁液を使用して誘導された形質転換体
は、この菌株が潜在的トランスポゾン受容菌プラ
スミドとしてプラスミドpRO1600を含まないか
ら、カルベニシリンのみに対する耐性をもつた形
質転換前を生成しなかつた。 実施例 ２ この実験はプラスミドpRO1601のサイズ減縮
（プラスミドpRO1613の生成）および
pBR322DNAのプラスミドpRO1601へのクロー
ニング（プラスミドpRO1614の生成）である。 この実験には、第２表に示す部分的に精製した
DNA溶液を表記酵素で処理した。形質転換体は
前もつてプラスミドを受け入れなかつた緑膿菌
PAO2の細胞を使用して選択された。表記のよう
に処理された種々のDNA標本との混合の結果と
して細菌により獲得された抗生物質耐性は表の右
欄に示す。 【表】 【表】 シリンおよびテ
トラサイクリン
耐性pRO1614
上記実験から、プラスミドpBR322はそれ自身
で形質転換できなかつたことが注目される。従つ
て、プラスミドpRO1601にクローニングされた
時そのテトラサイクリン耐性の表現は、中介体プ
ラスミドpRO1601によつて提供された重要な機
能との共同によるその維持を表わす。 実施例 ３ これは、pRO1600から誘導されたプラスミド
について広細菌宿主域の実証実験である。 異なる生態的地位および生理学的性質の細菌に
DNA組換え技術を用いてクローニングの実験を
行なうのに本発明の有用性に関してプラスミド
pRO1600の誘導体（pRO1613、pRO1614）の有
用性を示すために、形質転換−受容菌として緑膿
菌PAO2以外の細菌を用いて細菌の形質転換の研
究を行なつた。代表的な実験結果を第３表に示
す。DNAの生成および抽出の方法は前記ハンセ
ンおよびオルセンの引例に記載されている。 この研究のために、0.025ml緩衝溶液に懸濁し
た約0.5μｇのDNAが約１×108受容菌細胞（0.2ml
の体積）に添加された。その溶液はレーデルブル
グら（D.E.Lederburg and S.N.Cohen、J.Bact.
Vol.119、pp1072〜1074（1974）、
“Transformation of Salmonella typhinium by
plasmid Deoxyribonucleic Acid”）の方法で０
℃と45℃の間をサイクル加熱された。この混和体
は、細菌形質転換の周知方法に伴う実験操作に続
いて抗生物質を含んで固体媒質の表面に置いた。
これを37℃の温度で48時間培養して細菌群体の数
を計数した。これらの実験結果を第３表に示す。 【表】 第３表に示した実験は、プラスミドpRO1600
から誘導されたプラスミドの広宿主域の特徴を明
示している。使用した菌株での形質転換効率の変
動は、多分問題の菌株に最適でない形質転換プロ
セスを採用したことに関連していると思われる。
従つて、これらの結果の定量的解釈は、形質転換
効率の低い細菌での遺伝的クローニング実験用に
プラスミドpRO1600−誘導体の有用性を決して
限定するものではない。これらの場合に、問題の
細菌株についての細菌形質転換プロセスにおける
改良は、将来においてこれらの菌株を用いて形質
転換自体の効率を高めるべきである。 実施例 ４ 本例は、組換え体プラスミドpRO1614を使用
して緑膿菌から染色体DNAの分子クローニング
を実証するものである。 細菌の染色体遺伝子のクローニングにDNA組
換え技術を使用してクローニング実験を行なうの
に本発明の有用性に関して誘導プラスミド
pRO1614の効用を示すべく、アミノ酸のＬ−イ
ソロイシン、Ｌ−バリンおよびＬ−メチオニンの
生合成と関連した細菌遺伝子の選択（又は淘汰）
および分離のためにクローニング実験を行なつ
た。染色体およびプラスミドDNAの生成方法は
前記ハンセンとオルセンの引例に記載されてい
る。 この実験には、PAO1cから抽出した染色体
DNA又はプラスミドpRO1614DNA約05μｇが
0.025mlの緩衝液に懸濁され、制限エンドヌクレ
アーゼBamH1で消化された。次にそれぞれの溶
液を混合し、酵素T4リガーゼおよび共同因子で
処理した。この混合体は、細菌の形質転換法に伴
う実験操作に続いて、アミノ酸のＬ−イソロイシ
ンとＬ−バリンの場合、および別のアミノ酸のＬ
−メチオニンの場合を除いて緑膿菌による成長に
必要な栄養素を補給された固体培地の表面に置か
れた。前記選択培地の各々に細菌成長の単一群体
が現われた（108個の受容菌に１個の頻度）。これ
らの組換え体DNAプラスミドが形質転換の受容
菌から抽出される時、得られたDNAはさらに別
の受容菌への形質転換によるテスト時に高形質転
換頻度を示す。アミノ酸の生合成獲得の頻度はこ
れら実験におけるカルベニシリン耐性獲得の頻度
に対応する。次に、これらの群体はプラスミド
DNAの生成のために精製、成長される。 第３図は緑膿菌PAO236からのプラスミド
DNAについてのスラブ・アガロース・ゲル電気
泳動写真の一部を示す。細菌細胞は栄養のブイヨ
ン媒質で成長させ、プラスミドDNAは第１図に
関して記載したように抽出そして処理された。電
気泳動させたDNAの試料は次の通りである：Ａ
はＬ−イソロイシン又はＬ−バリンなしに成長で
きる形質転換体クローンから抽出したDNA
（pRO1615）；Ｂは大腸菌V517からのDNAであつ
て、大きさの標準として使用した菌株を含む多重
プラスミド；Ｃは緑膿菌PAO2（pRO1614）から
のDNA；ＤはＬ−メチオニンなしに成長できる
形質転換クローンから抽出したDNA
（pRO1616）。これら組換え体プラスミドの算定
した分子の大きさはＡ列のプラスミドが14×106
ダルトン、そしてＤ列のプラスミドが10.4×106
ダルトンである。 イソロイシンおよびバリン生合成の組換え体ク
ローン（Ａ列）又はメチオニン生合成（Ｄ列）は
プラスミドpRO1614クローニング・ベクター
（Ｃ列）より明らかに大きい。この関係は、DNA
の組換え技術を用いて問題のアミノ酸の生合成を
導く染色体DNAの獲得を表わしている。その組
換え体プラスミドは予想通りカルベニシリン耐性
を保持した。 本発明の新規プラスミドおよびRP1は、国際寄
託当局であるノーザン・リージヨナル研究所
（Northern Regional Research Laboratry）に
寄託されている、そして次の国際受託番号で請求
することにより自由に入手できる。また、それら
プラスミドは内国参照番号で請求することによつ
てミシガン大学からも入手することができる： 【表】 以上記載した実験の外に、本発明の範囲内にお
いて多くの実験がありうることは明らかである。
第１図はスラブ・アガロース・ゲル電気泳動図
形であつて、Ａは先行技術のRP1；Ｄは電気泳動
の大きさ基準となる大腸菌V517；ＢのRP1／
pRO1600；およびＣ，Ｅ、およびＦは本発明の
プラスミドについてのものである。第２図は、本
発明の望ましいプラスミド（特にpRO1601、
pRO1613、pRO1614およびpRO1600）について
の制限エンドヌクレアーゼPstおよびBg1の
遺伝地図（メガダルトンで表わす）を示す。かつ
こ内の数値は制限エンドヌクレアーゼ断片の分子
の大きさ（メガダルトンで表わす）を示す。水平
の実線の上下に示す数値は、プラスミド
pRO1600に存在する単一のPst制限エンドヌク
レアーゼ−DNA分割位置で画定されるゼロ点か
らの制限エンドヌクレアーゼ認識位置（メガダル
トンで表わす）の地図距離である。第３図はスラ
ブ・アガロース・ゲル電気泳動図形を示し、Ｃは
pRO1614；Ｂは先行技術による大腸菌V517から
のDNA；ＡおよびＤはそれぞれpRO1614の組換
え修飾の結果として、Ｌ−イソロイシン又はＬ−
バリンおよびＬ−メチオニンなしに成長できる形
質転換体クロンからのDNA（pRO1615）、および
DNA（pRO1616）についての図形である。
形であつて、Ａは先行技術のRP1；Ｄは電気泳動
の大きさ基準となる大腸菌V517；ＢのRP1／
pRO1600；およびＣ，Ｅ、およびＦは本発明の
プラスミドについてのものである。第２図は、本
発明の望ましいプラスミド（特にpRO1601、
pRO1613、pRO1614およびpRO1600）について
の制限エンドヌクレアーゼPstおよびBg1の
遺伝地図（メガダルトンで表わす）を示す。かつ
こ内の数値は制限エンドヌクレアーゼ断片の分子
の大きさ（メガダルトンで表わす）を示す。水平
の実線の上下に示す数値は、プラスミド
pRO1600に存在する単一のPst制限エンドヌク
レアーゼ−DNA分割位置で画定されるゼロ点か
らの制限エンドヌクレアーゼ認識位置（メガダル
トンで表わす）の地図距離である。第３図はスラ
ブ・アガロース・ゲル電気泳動図形を示し、Ｃは
pRO1614；Ｂは先行技術による大腸菌V517から
のDNA；ＡおよびＤはそれぞれpRO1614の組換
え修飾の結果として、Ｌ−イソロイシン又はＬ−
バリンおよびＬ−メチオニンなしに成長できる形
質転換体クロンからのDNA（pRO1615）、および
DNA（pRO1616）についての図形である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 細菌の接合、形質転換または形質導入のプロ
セスを利用してDNAプラスミドをインビボにお
いて細菌宿主に運搬する方法において、 (a) 緑膿菌NRRL−Ｂ−12124、NRRL−Ｂ−
12125、NRRL−Ｂ−12126、NRRL−Ｂ−
12127、NRRL−Ｂ−12149およびNRRL−Ｂ
−12148にそれぞれ運ばれるpRO1600、
pRO1601、pRO1613、pRO1614、pRO1615お
よびpRO1616から選んだクローニング運搬体
としての第１のプラスミドと、 (b) 該第１のプラスミドおよび第２のDNA源の
エンドヌクレアーゼによる切断によつて産生さ
れた第１のプラスミドの組換え体プラスミド・
リング誘導体、から選んだDNAプラスミド・
リングを線状のDNA断片内に運搬し、該線状
DNA断片を一緒に連結反応させて、組換え体
プラスミドを形成させることから成り、前記プ
ラスミド・リングは緑膿菌PAO ATCC15692
によつて運搬することができ、かつ広細菌宿主
域を有し、該プラスミド・リング自身は宿主細
菌の細菌分裂中にデオキシリボ核酸の複製によ
つてクローンを生成し、クローニング運搬体か
らのDNAが細胞分裂中に組換え体プラスミド
の複製を制御することを特徴とするDNAプラ
スミドをインビボにおいて細菌宿主に運搬する
方法。 ２ 組換え体プラスミドとして第２のDNAセグ
メントと結合される第１のプラスミド・リング・
セグメントが、宿主細菌に所定の抗生物質耐性を
与える表現型標識形質を有する特許請求の範囲第
１項記載の方法。 ３ 抗生物質耐性が抗生物質カルベニシリンに対
するものであり、かつ第１のプラスミドが
pRO1601である特許請求の範囲第２項記載の方
法。 ４ プラスミドpRO1601が緑膿菌NRRL−Ｂ−
12125に担われているものである特許請求の範囲
第３項記載の方法。 ５ 抗生物質耐性が抗生物質のカルベニシリンお
よびテトラシリンに対するものであつて、第１の
プラスミドがpRO1614である特許請求の範囲第
２項記載の方法。 ６ 第１のプラスミドが緑膿菌NRRL−Ｂ−
12127に担われているものである特許請求の範囲
第５項記載の方法。 ７ 第１のプラスミドがpRO1613である特許請
求の範囲第１項記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US147563 | 1980-05-08 | ||
| US06/147,563 US4374200A (en) | 1980-05-08 | 1980-05-08 | Broad host range small plasmid rings as cloning vehicles |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61234784A JPS61234784A (ja) | 1986-10-20 |
| JPH0158949B2 true JPH0158949B2 (ja) | 1989-12-14 |
Family
ID=22522070
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP13943180A Granted JPS572299A (en) | 1980-05-08 | 1980-10-07 | Wide range host plasmid ring as cloning vector |
| JP61006630A Granted JPS61234784A (ja) | 1980-05-08 | 1986-01-17 | デオキシリボ核酸プラスミドをインビボの細菌宿主に輸送する方法 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP13943180A Granted JPS572299A (en) | 1980-05-08 | 1980-10-07 | Wide range host plasmid ring as cloning vector |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP0039743A3 (ja) |
| JP (2) | JPS572299A (ja) |
| AU (1) | AU538600B2 (ja) |
| CA (1) | CA1150169A (ja) |
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| US4508823A (en) * | 1980-05-08 | 1985-04-02 | Microlife Technics, Inc. | Gene splicing method and products produced therefrom |
| JPS58893A (ja) * | 1981-06-25 | 1983-01-06 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法によるｌ−イソロイシンの製造法 |
| US4654307A (en) * | 1983-02-17 | 1987-03-31 | The Research Foundation Of State University Of New York | Novel bacteria containing a plasmid having a tRNA code |
| US4567141A (en) * | 1983-04-25 | 1986-01-28 | Microlife Technics, Inc. | Plasmid vectors including Tn904 |
| US4593003A (en) * | 1983-05-19 | 1986-06-03 | Microlife Technics, Inc. | Bacterial method and compositions for isoprenoid degradation |
| EP0185005B1 (en) | 1984-12-10 | 1992-01-22 | Monsanto Company | Insertion of the bacillus thuringiensis crystal protein gene into plant-colonizing microorganisms and their use |
| US4695455A (en) * | 1985-01-22 | 1987-09-22 | Mycogen Corporation | Cellular encapsulation of pesticides produced by expression of heterologous genes |
| ATE84072T1 (de) * | 1985-04-30 | 1993-01-15 | Monsanto Co | Pflanzenkolonisierende mikroorganismen, die das bacillus thuringiensis-toxingen als chromosomeinsetzung enthalten. |
| JPS63104406U (ja) * | 1986-12-26 | 1988-07-06 | ||
| JPH0519092Y2 (ja) * | 1987-03-06 | 1993-05-20 | ||
| EP2147105B1 (en) | 2007-05-02 | 2013-04-24 | Merial Limited | Dna plasmids having improved expression and stability |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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1980
- 1980-05-08 US US06/147,563 patent/US4374200A/en not_active Expired - Lifetime
- 1980-06-18 AU AU59374/80A patent/AU538600B2/en not_active Ceased
- 1980-06-27 DE DE198080103658T patent/DE39743T1/de active Pending
- 1980-06-27 EP EP80103658A patent/EP0039743A3/en not_active Withdrawn
- 1980-06-30 CA CA000355182A patent/CA1150169A/en not_active Expired
- 1980-10-07 JP JP13943180A patent/JPS572299A/ja active Granted
-
1986
- 1986-01-17 JP JP61006630A patent/JPS61234784A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS61234784A (ja) | 1986-10-20 |
| JPS572299A (en) | 1982-01-07 |
| JPS6359677B2 (ja) | 1988-11-21 |
| AU538600B2 (en) | 1984-08-23 |
| CA1150169A (en) | 1983-07-19 |
| US4374200A (en) | 1983-02-15 |
| AU5937480A (en) | 1981-11-12 |
| EP0039743A3 (en) | 1982-10-27 |
| EP0039743A2 (en) | 1981-11-18 |
| DE39743T1 (de) | 1983-02-03 |
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