JPS6254473B2 - - Google Patents

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JPS6254473B2
JPS6254473B2 JP58202929A JP20292983A JPS6254473B2 JP S6254473 B2 JPS6254473 B2 JP S6254473B2 JP 58202929 A JP58202929 A JP 58202929A JP 20292983 A JP20292983 A JP 20292983A JP S6254473 B2 JPS6254473 B2 JP S6254473B2
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JP
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plasmid
bacillus
dna
genetic marker
microorganism
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JP58202929A
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Guroshu Josefuin
Ei Uiruson Geerii
Uoruebaa Karen
Oo Ieeru Kurifuoodo
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Miles Laboratories Inc
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Publication date
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    • C12Q1/34Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
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Description

【発明の詳现な説明】 埮生物の酵玠は、医薬、蟲薬および有機薬品の
補造のような皮々の分野においお、重芁性が増倧
しおきおいる。バチルス属は、維持および培逊を
容易に行なうこずができ、しかも特性が著しく異
質heterogeneousである现菌の矀からなる。
Bergey’ Manual of Dterminative
Bacteriology䞭に蚘茉されおいるバチルス属の48
皮のすべは、可溶性の酵玠を分泌する。 叀兞的遺䌝子操䜜の技術、たずえば、玫倖線照
射および突然倉異遞択、は、α−アミラヌれのよ
うな酵玠の収量および性質を改良するために䜿甚
されおきた。1960幎代においお、分子生物孊者
は、现菌、すなわち、倧腞菌Esherichia
coli」およびそれらを感染するりむルスを利甚
し、遺䌝子暗号を解読し、突然倉䜍の分子基準を
確立し、デオキシリボ栞酞DNAが぀の现
胞から他の现胞ぞ行くこずができる方法を発芋
し、そしお正確にか぀詳现に、生埮生物が特定の
遺䌝子の衚珟たたは掻性を制埡できる方法を明ら
かにした。この情報は1970幎代においお利甚され
お、遺䌝子操䜜の産業、たずえば、組換えDNA
技術、の基瀎が圢成された。 組換えDNA技術は、遺䌝物質遺䌝子たたは
DNA断片の぀の埮生物から第の埮生物の
圢質転換および結合された遺䌝物質の匕き続く䌞
長を包含する。 所望の遺䌝的特城を有する特定の遺䌝子、すな
わち、DNA配列、は、物理化孊的手順により単
離され、あるいは化孊的に合成された。次いで、
このDNA配列はプラスミドず呌ばれる小さい円
圢の染色䜓に共有結合される。プラスミド分子の
蚭蚈は、ある矀の分子状酵玠、すなわち、制限゚
ンドヌクレアヌれ類、による開裂により、特定の
点においお開くこずができ、そしおDNAの「異
質」片を挿入しお組換えプラスミドを生産できる
ようなものである。成功する組換えDNA技術
は、宿䞻埮生物における遺䌝子掻性を可胜ずす
る、プラスミド䞊の郚䜍においおDNAが挿入さ
れるこずを必芁ずする。 DNA組換え技術においお興味ある぀の領域
は、酵玠、たずえば、α−アミラヌれ、プロテア
ヌれ、アミログルコシダヌれおよびグルコヌスむ
゜メラヌれ、を暗号化する遺䌝子をクロヌニング
するこずを包含する。これらの酵玠の構造および
このような酵玠を生産する埮生物の遺䌝系は、広
範に特城づけされおきおいない。 問題のこのような遺䌝子を単離するこずは䞍可
胜であり、そしおそれらの遺䌝子の存圚たたは遺
䌝子生産物、すなわち、問題の酵玠、の存圚を盎
接遞択する技術は存圚しないので、「シペツトガ
ンshot−gun」クロヌニング、すなわち、問
題の有機䜓の問題のゲノムのクロヌニング、はい
ばしば必芁である。 皮々の理由で、盎接のバチルス属宿䞻、たずえ
ば、枯草菌B.subtilis、ぞの「シペツトガン」
クロヌニングは実際的ではない。いく぀かの理由
は、次ぎのずおりである所望の枯草菌B.
subtilisクロヌニングベクトルプラスミド
の䞍足、圢質転換の非効率、および結合混合物か
らの組換えプラスミド分子の非垞に制限された圢
質転換の胜力。したが぀お、クロヌニングの现心
の蚈画を泚意しお遞択しお、最小の工皋数で所望
の遺䌝子をクロヌニングしか぀同定する可胜生を
最倧ずしなくおはならない。 バチルス属菌株におけるα−アミラヌれを暗号
化したたは調節する遺䌝子は、぀の株が十分に
密接に関係があるずき、すなわち、぀の株の間
に広範な盞同性が存圚するずき、他のバチルス属
菌株に導入するこずができるこずは、知られおい
る。これは盞同圢質転換homologous
transformationず呌ばれる。たずえば、J.
Bacteriol.、1201144−1151974は、䟋倖的
に高いα−アミラヌれ掻性を有するバチルス・ズ
ブチリス・バヌ・アミロサツカリテむクスB.
substilis var amylosaccariticusからのDNA
を、比范的䜎いα−アミラヌれを有する遺䌝的に
類䌌する盞同性の埮生物B.subtilis 168
Marburg䞭に導入するこずを蚘茉しおいる。生
産される圢質転換された埮生物は、高いα−アミ
ラヌれ掻性を獲埗した。 Appl.Environ.Microbiol.39274−276
1980は、α−アミラヌれ生産およびプロテア
ヌれに぀いおの関連遺䌝子をある株䞭ぞ組蟌む効
果は、盞乗的性質のα−アミラヌれ生産を増加さ
せるずいうこずを、確立した。党䜓のアプロヌチ
は、段階的圢質転換手順により、遺䌝子を受容䜓
の枯草菌 Marburg 6160埮生物䞭ぞ段階的に導
入するこずを含んだ。著者らは、圢質転換手順が
染色䜓の盞同性を必芁ずするので、染色䜓の異型
を利甚できる、瀺唆された別のアプロヌチが、遺
䌝子類をクロヌニングし、そしおそれらを、より
粟補された圢態の修食された受容䜓、すなわち、
「母现胞mother cell」䞭に導入するためのベ
クトルの開発を含む、こずを瀺しおいる。 文献は、異型の圢質転換においお普通の圢質転
換技術を䜿甚するこず、たずえば、バチルス・ア
ミロリクむフアシ゚ンスB.amyloliquifaciens
からの遺䌝子を枯草菌に導入するこず、が困難で
あるこずを瀺しおいる。J.Bacteriol.、111705
−7161972、ずくに衚、䞭に瀺されおいるよ
うに、盞同の枯草菌168株からのDNAによる枯草
菌168株BR151の圢質転換は、異型源、B.
amyloliquifaciens からのDNAよりも、぀の
詊隓した遺䌝子座に぀いお1000倍倚い圢質転換䜓
を生産した。 最も近い先行技術は、Rapoport、et.al.、Mol.
Gen.Genet1762392451979およびPalva.
et.al.、Gene、1543−511981䞭に蚘茉され
おいるものであるず、思われる。 Rapoport、et.al.は、機胜性bifunctinal
プラスミドpHV33を䜿甚しお、枯草菌の党
ゲノムに盞圓するDNA断片を甚いお倧腞菌含有
プラスミドのコロニヌバンクを構成するこずを蚘
茉しおいる。Rapoport、et.al.は、枯草菌からの
DNAを、同䞀皮の第宿䞻枯草菌ぞ盞同クロヌ
ニングした。Rapoport、et.al.は、埗られたDNA
の倧きい断片を機械的剪断により圢成し、そしお
制限゚ンドヌクレアヌれを甚いる完党消化は、そ
れが所望の構造遺䌝子内のDNAの開裂により、
遺䌝掻性の損倱を起こすこずがあるので、望たし
くないこずを瀺した。 Rapoportは、ある皮の枯草菌宿䞻株の栄逊芁
求倉異皮の盞補性により、組換えクロンを同定し
た。この方法は、所望の遺䌝子たたは遺䌝子生産
物の存圚を同定するための盎接遞択を含んだ。こ
のアプロヌチにより、Rapoportは枯草菌突然倉
異の栄逊芁求を暗号解読codeする、クロヌ
ニングされた遺䌝子に぀いおのみ探玢するこずに
制限された。前述の酵玠を暗号解読する、クロヌ
ニングされた遺䌝子は、このアプロヌチによ぀お
は、遞択および同定されるこずはできなか぀た。 Palva、et.al.は、B.amyloliquifaciensからのα
−アミラヌれの遺䌝子を、プラスミドのベクトル
puB110にクロヌニングするこずを、蚘茉しおい
る。この研究は、宿䞻埮生物ずしお枯草菌ぞのク
ロヌニングを含んだが、䜿甚されたベクトルは
機胜性ではなか぀た。 前述の参考曞はいずれも、α−アミラヌれ、プ
ロテアヌれ、アミログルコシダヌれたたはグルコ
ヌスむ゜メラヌれを暗号化する遺䌝子の異型
heterologousクロヌニングを達成するため
の、本発明の方法を蚘茉しおいない。 本発明は、あるバチルス属埮生物からのα−ア
ミラヌれ、プロテアヌれ、アミログルコシダヌれ
たたはグルコヌスむ゜メラヌれを暗号化
encodingする遺䌝子を、他の皮のバチルス属
宿䞻埮生物にクロヌニングする方法に関する。こ
の方法は、(a)倧腞菌および枯草菌の䞡者の䞭で耇
補する胜力を有する機胜プラスミド、ここで前
蚘プラスミドは少なくずも぀の遞択可胜な遺䌝
暙識markerを含有する、を゚ンドヌクレア
ヌれで消化しお、線状プラスミド分子を生産し、
(b)前蚘遺䌝子を含有するDNA断片を発生させ、
そしお非機胜的遺䌝暙識を生産するための前蚘遞
択可胜な遺䌝暙識の぀の挿入的䞍掻性化
insertional inactivationが起こるように、前
蚘DNA断片を(a)の前蚘プラスミド䞭に組み蟌
み、少なくずも皮の機胜的遞択可胜な遺䌝暙識
を残しお、組換え雑皮プラスミドおよび副産物ず
しお、(a)の前蚘機胜プラスミドを含有する混合
物を生産し、(c)(b)の前蚘混合物を、(a)の前蚘遞択
可胜な遺䌝暙識をもたない倧腞菌埮生物䞭に組み
蟌んで、前蚘倧腞菌を圢質転換させ、(d)(b)の前蚘
プラスミドを含有する倧腞菌圢質転換䜓を、前蚘
機胜的遞択可胜な遺䌝暙識により遞択し、(e)前蚘
非機胜的の挿入的に䞍掻性化された遺䌝暙識の存
圚に぀いお(d)の前蚘圢質転換䜓をスクリヌニング
するこずにより、前蚘組換えプラスミドを含有す
る圢質転換䜓を同定し、(f)プラスミドDNAを(e)
の前蚘倧腞菌圢質転換䜓から抜出し、(g)(a)の前蚘
遞択可胜な遺䌝暙識を含有しない前蚘バチルス属
宿䞻埮生物を、(f)からの前蚘プラスミドDNAで
圢質転換し、(h)前蚘組換えプラスミドを含有する
前蚘バチルス属宿䞻圢質転換䜓を、前蚘機胜的に
遞択可胜な遺䌝暙識により遞択し、そしお(i)それ
から、前蚘プラスミド䞊の前蚘遺䌝子により暗号
化された前蚘酵玠を生産するこずができる、バチ
ルス属宿䞻埮生物を単離するこずを特城ずを含
む。 本発明の方法は、α−アミラヌれ、プロテアヌ
れ、アミログルコシダヌれたたはグルコヌスむ゜
メラヌれを暗号化する遺䌝子を、バチルス属宿䞻
埮生物に、クロヌニングする方法を提䟛する。単
䞀たたは耇数の遺䌝子のコピヌを、本発明の方法
によりクロヌニングするこずができる。 以䞋の説明においお、皮々の埮生物はATCCた
たはBGSCの番号を有するずしお衚瀺される。各
ATCC衚瀺された埮生物は、アメリカン・タむ
プ・カルチダヌ・コレクシペンAmerican
Type Culture Collection、Rockville、
Marylandから入手するこずができ、そしお
BGSC衚瀺されおいる埮生物は、バシルス・ゞ゚
ネチツク・ストツク・センタヌBacillus
Genetic Center、Ohio State University、
Columbus、Ohioから入手するこずができる。 本発明は、異質DNA断片のプラスミド分子䞭
ぞの導入の぀おの以䞋の説明から、より容易に理
解されうるであろう。 たず、倧腞菌および枯草菌の䞡者の䞭で耇補
し、次ぎの特性を有する、機胜プラスミドを遞
択する。このプラスミドは、アンピシリン抵抗性
ApR、テトラサむクリン抵抗性TcR、およ
びクロラミプニコヌル抵抗性CmRに぀い
お遺䌝子類を暗号化し、ここでApR、TcR、およ
びCmRは、すべお、倧腞菌䞭で機胜し、そしお
CmRのみは枯草菌䞭で機胜する。これらの遺䌝
子類は、遞択可胜な遺䌝暙識ずしお機胜する。 プラスミド分子は、TcR遺䌝子内の特別の郚䜍
を切断する制限゚ンドヌクレアヌれで消化する。
このような消化は、線状プラスミド分子を生ず
る。これらの線状分子は、ここで異質のDNA断
片ず混合されおおり、このDNA断片は同様に同
䞀の制限゚ンドヌクレアヌれの消化により生産さ
れたものである。異質DNA分子および線状プラ
スミドDNA分子は同䞀の「ステむツキヌ゚ン
ド」をもち、そしおこれらの゚ンドはアニヌリン
グしお組み換え雑皮分子を圢成するであろう。ア
ニヌリングした゚ンドは、ここでDNAリガヌれ
酵玠の䜜甚により「シヌルseal」される。 結合反応は、組み換え分子の発生が非効率的過
皋であるので、プラスミドDNA分子の混合物を
生産する。プラスミド分子は、次ぎの型であるこ
ずができる(a)衚珟型ApR、TcR、CmRの、異質
DNA断片ず反応したもずの機胜プラスミド、
および(b)衚珟型ApR、TcRテトラサむクリン感
受性、CmRの、TcR郚䜍における異質DNA断片
を含有する組み換え雑皮プラスミド。こうしお、
テトラサむクリン遺䌝子は、異質DNA断片の挿
入により䞍掻性化され、そしお非機胜性の遞択可
胜な遺䌝暙識ずなる。 前述のプラスミド分子の混合物は、初めこれら
の遺䌝暙識、すなわち、ApSアンピシリン感受
性、TcSをもたない、倧腞菌埮生物ぞの圢質転
換により組蟌たれる。ここで(a)たたは(b)のいずれ
かのプラスミド分子を含有するE.coli现胞は、そ
れらのApR衚珟型により、圢質転換されおいない
圢質転換は非効率的過皋である现胞から遞択
されるこずができる。この遞択は、アンピシリン
を含有する培地䞊ですべおの现胞を生長させるこ
ずにより実斜する。ApR现胞のみは、生長するで
あろう。 もずのプラスミド含有する倧腞菌现胞前述の
(a)ず比范しお、組み換え雑皮プラスミドを含有
する倧腞菌现胞前述の(b)は、TcS衚珟型぀い
おApR圢質転換䜓をスクリヌニングするこずによ
぀お埗られる。 このスクリヌニングは、テトラサむクリンを含
有する培地䞊ですべおのApR现胞を生長させるこ
ずによ぀お実斜される。TcS现胞はこの培地で生
長しないが、アンピシリンを含有する培地で生長
した现胞の耇補の組耇補−平板培逊replica
−platingから回収するこずができる。 プラスミドDNAは、これらのApR、TcS倧腞菌
现胞から抜出され、そしお枯草菌宿䞻现胞、これ
は初め前述の遺䌝暙識をもたない、䞭に圢質転換
により組み蟌たれる。プラスミドを含有する、枯
草菌现胞は、プラスミドを含有しないものから、
それらのCmR衚珟型により遞択される。 この遞択は、クロランプニコヌルを含有する
培地䞊ですべおの枯草菌现胞を生長させるこずに
よ぀お実斜される。CmRである现胞のみが生長
するだけであろう。これのCmR现胞のすべお
は、組み換え雑皮プラスミドを含有する。 適圓なプラスミドは、機胜性、すなわち、
぀の现菌皮、たずえば、枯草菌および倧腞菌埮生
物の䞭で耇補できる、プラスミドである。このよ
うな機胜プラスミドには、ブダペスト条玄に基
づいおATCCに囜際寄蚗されおいるpHV33
ATCC39217およびProc.Natl.Acad.Sci.USA
Vol.75(3)1433〜1436頁1978に蚘茉されおい
るpHV11が包含される。 このようなプラスミド類は、少なくずも぀の
「遞択可胜な」遺䌝暙識を含有しなくおはならな
い。遞択可胜な遺䌝暙識を埗るこずにより、予備
的遞択技術を甚いるこずが可胜ずなり、たずえ
ば、圢質転換された埮生物がある皮の抗生物質に
察しお抵抗性であるずき、埮生物をこのような抗
生物質および生存しうる圢質転換䜓ずしお遞択さ
れうる埮生物の存圚䞋に培逊するこずができる。
遞択可胜な遺䌝暙識は、抗生物質抵抗性に限定さ
れないが、生長芁件物質growth
requirementsを含むこずができ、たずえば、
埮生物はアミノ酞、たずえば、スレオニン、リシ
ン、チロシン、アラニン、ロむシン、たたはセリ
ンの存圚を必芁ずする。プリン類およびピリミゞ
ン類、たずえば、アデニン、チミン、グアニン、
シトシンおよびりラシルは、同様に生長芁件物質
ずしおおよび遞択可胜な遺䌝暙識ずしお機胜する
こずができる。 遞択可胜な遺䌝暙識の皮たたはそれ以䞊は
「挿入的に䞍掻性化」されるこずができ、すなわ
ち、プラスミド䞭ぞのDNA断片の挿入は遞択可
胜な遺䌝暙識の぀を䞍掻性化するであろう、ず
いうこずも぀の芁件である。たずえば、遺䌝暙
識の぀が、薬物抵抗性、たずえば、クロランフ
゚ニコヌル抵抗性CmR、アンピシリン抵抗性
ApRおよびテトラサむクリン抵抗性TcR、
を䞎える遺䌝子を含むずき、遺䌝暙識の぀、た
ずえば、遺䌝子、は䞍掻性化され、ここで现胞
は、遺䌝暙識ずしおの圹目をするために、薬物、
すなわち、CmR、ApR、たたはTcRに察しお感受
性ずされる。 遺䌝暙識類は䞡者共同型、すなわち、぀の抗
生物質の遺䌝暙識たたは぀の生長芁件物質であ
るこずができ、あるいは抗生物質の遺䌝暙識およ
び生長芁件物質の組み合わせであるこずができ
る。 たずえば、ロむシンの遺䌝子および抗生物質抵
抗性の遺䌝子を含有する機胜プラスミドを次ぎ
のように䜜甚するこずができる。抗生物質抵抗性
の遺䌝子䞭ぞのDNA断片の挿入を䜿甚しお抗生
物質抵抗性遺䌝子を䞍掻性化しお、非機胜性遺䌝
暙識を生産し、ロむシンの遺䌝子を機胜性遞択可
胜な遺䌝暙識ずしお残すこずができるであろう。
生産された組換えプラスミドは、生長のためのロ
むシンを必芁ずする、適圓な倧腞菌埮生物埌述
する䞭ぞ組み蟌たれる。組換えプラスミドおよ
びもずの機胜プラスミドの䞡者を含有する倧腞
菌圢質転換䜓は、機胜的に遞択可胜な遺䌝暙識ず
しおロむシン生長芁件物質を利甚するこずにより
遞択される。この遞択は、ロむシンの䞍存圚䞋に
埮生物を生長させ、そしお生存する埮生物を遞択
するこずによ぀お、達成される。これらの埮生物
から、組換えプラスミドのみを含有する倧腞菌圢
質転換䜓は、あるプラスミドを含有するものに぀
いお、非機胜性の挿入的に䞍掻性化された抗生物
質抵抗性遺䌝暙識で、圢質転換䜓をスクリヌニン
グするこずによ぀お同定される。耇補−平板培逊
の䜿甚により、抗生物質の存圚䞋に生長できない
圢質転換䜓を同定するこずによ぀お達成される。
次いで、これらの圢質転換䜓からのプラスミド
DNAを抜出し、そしお遞択可胜な遺䌝暙識を含
有しないバチルス属宿䞻埮生物を圢質転換するた
めに䜿甚する。組換えプラスミドを含有する所望
の枯草菌圢質転換䜓は、機胜的遞択可胜な遺䌝暙
識、すなわち、ロむシン生長芁件物質、を甚いる
こずにより遞択され、そしお所望の酵玠生産性埮
生物が単離される。 䞊に瀺したように、適圓なバチルス属埮生物を
䜿甚する。これらの埮生物の぀の芁件は、それ
らが機胜プラスミドの遞択可胜な遺䌝暙識を有
しおはならない、ずいうこずである。適圓なバチ
ルス属宿䞻埮生物は、枯草菌168ATCC
27689、枯草菌BGSC 1A289、バチルス・ア
ミロリクむフアシ゚ンスB.amyloliquifaciens
BGSC 10A2、およびバチルス・リケニホル
ミスB.licheniformisATCC 27811を包含
する。 同様に、適圓な倧腞菌埮生物は、機胜プラス
ミドの遞択可胜な遺䌝暙識をもたないものから遞
択するこずができる。たずえば、倧腞菌K12
ATCC 10798および倧腞菌C600ATCC
33535を利甚できる。 所望の酵玠に぀いお暗号化する所望の遺䌝子を
含有する、適圓なバチルス属皮からの染色䜓
DNAは、埌述する普通の技術により単離するこ
ずができる。染色䜓DNAを埗るこずができる適
圓な埮生物は、次ぎのものを包含するα−アミ
ラヌれバチレス・セレりスB.cereusATCC
21768プロテアヌれバチルス・アミロリクむ
フアシ゚ンスB.amyloliquifaciensATCC
23842および23844、バチルス・アルカロフむルス
B.alkalophilusATCC 21522およびバチルス・
リケニホルミスB.licheniformisATCC
21424アミログルコシダヌれ枯草菌B.
subtillisATCC 31068およびグルコヌスむ゜
メラヌれバチルス・リケニホルミスB.
licheniformisATCC 31667米囜特蚱第
4355103号に開瀺されおいる。 DNA断片は、適圓な制限酵玠、たずえば、
Bam HIたたはSal 、を甚いる開裂を包含する
普通の技術により発生させるこずができる。
DNA断片は、少なくずも぀の断片がクロヌニ
ングすべき党遺䌝子を含有するこずを保蚌する倧
きさであるべきである。埌述する酵玠、すなわ
ち、α−アミラヌれ、プロテアヌれ、アミログル
コシダヌれおよびグルコヌスむ゜メラヌれ、に぀
いお、断片は玄メガダルトンMd以䞊の倧
きさであるべきである。 DNAは、T4 DNAリガヌれたたはE.coli DNA
リガヌれの䜿甚を含む、普通の結合技術により、
機胜プラスミド䞭ぞ組み蟌むこずができる。 実斜䟋  バチルス・リケニホルミスB.
licheniformisDNAの単離および粟補 α−アミラヌれを暗号化する遺䌝子を含有す
る適圓なバチルス・リケニホルミス埮生物は、
のPenassay肉汁Antibiotic Medium
、Difco Laborstories、Detroit、Michgan
から入手できる䞭で通気しながら18時間生長
させた。现胞を、遠心分離により収穫し、そし
お0.15モルのNaCl、0.1モルの゚チレンゞアミ
ン四酢酞EDTAから成るPH8.0の緩衝液の
50ml䞭に再懞濁させた。现胞の溶解は、mgの
リ゜チヌム卵癜の結晶質リ゜チヌム、Miles
Laboratories、Elkhart、Indianaから商業的に
入手できるを添加し、次いで37℃で30分間保
枩する、こずによ぀お実斜した。0.1モルのト
リスヒドロキシメチルアミノメタン塩酞塩
tris、0.1モルのNaCl、0.5のドデシル硫酞
ナトリりムSDSから成る、PH8.0の緩衝液
の150mlを加えお、溶解工皋を達成した。リれ
むトを、200mlのプノヌル0.1モルのtris、
PH8.0で平衡化したものおよび20mlのクロロ
ホルム−む゜アミルアルコヌル、24の比、
で抜出するこずにより、タンパク質を陀去し
た。䞊盞をクロロホルム−む゜アミルアルコヌ
ルで回以䞊で抜出した。䞊盞を0.1モルの
NaClずし、そしおDNAを䜓積の冷95の゚
タノヌルで沈柱させた。このDNAを0.15モル
のNaClおよび0.015モルのク゚ン酞ナトリり
ム、PH7.0、から成る、0.1モルの食塩ク゚ン酞
塩緩衝液SSCの150ml䞭に溶解した。この
DNA溶液を、10mgのRNaseで37℃においお
時間凊理し、次いで1.5mgのプロテアヌれ
Pronase、Calbiochem、LaJolla、California
から商業的に入手できる37℃においお30分間
凊理した。この溶液をプノヌル前述したも
ので回抜出し、0.1X SSC䞭に溶解した。
このDNA溶液を0.1X SSCに察しお℃におい
お透析しお残留プノヌル、SDSおよび゚タノ
ヌルを陀去した。 このDNAをSal 制限゚ンドヌクレアヌれ
Miles Laboratories、Inc.Elkhart、Indianaか
ら商業的に入手できるで䟛絊䌚瀟が掚奚する
条件䞋で開裂させた。α−アミラヌれ遺䌝子が
この酵玠で開裂されないこずを確保するため
に、酵玠凊理の条件を、郚分的消化のみが達成
されるように、確立した。条件は、限定された
期間にわた぀お酵玠の䜎い濃床を甚いるこずを
含んだ。これらの条件は、圓業者により容易に
決定さうる。生ずる断片をスクロヌスの密床募
配遠心により分離し、そしおDNA断片のメ
ガダルトン以䞊を含有するフラクシペンをクロ
ヌニングのために遞択した。  pHV33プラスミドの単離および調補 プラスミドpHV33は、ATCCから倧腞菌RR1
ATCC 39217においお入手できる。プラス
ミドDNAは、次ぎの手順により単離された。
Practical Methods in Molecular
Biology、Robert F.Schleif、1981、参照。 pHV33を含有する䞊の倧腞菌を、50Ό
mlのアンピシリンを含有するPenassy肉十の
600ml䞭で、通気しながら䞭䞀指数的生長盞
に、ほが時間生長させた。同時に、150mgの
クロランプニコヌルを培逊物に加えお、プラ
スミドDNAを増幅させる。保枩を23時間続け
た。现胞は、遠心分離により収獲し、0.01モル
のtris、0.001モルの゚チレンゞアミン四酢酞
EDTAから成るPH8.0の緩衝液TE 緩衝
液䞭で回掗浄した。掗浄した现胞を25の
スクロヌス、0.05モルのtris−HClを含有する
緩衝液、PH8.0、の50ml䞭に懞濁した。溶解
は、mgのリ゜チヌムを添加し、次いで氷济䞭
で10分間保枩するこずによ぀お達成した。ml
の0.25モルのEDTAを加え、そしお保枩を10分
間さらに続けた。溶解は、次ぎの成分から構成
された掗浄剀溶液の3.2mlの添加により完結し
た1.0のポリ゚キシ゚チレンラりリル゚ヌ
テルFisher Scientific Company、
Firhaven、New Jerseyから、商品名Brij 35で
入手できる、0.4のナトリりムデオキシコレ
ヌト、0.06モルのEDTA、および0.0モルの
Tris−HCl、PH8.0。溶解混合物を、ガラスの
撹拌棒でおだやかにかきたぜた。リれむトを、
遠心分離により现胞の砎片および染色䜓DNA
を陀去するこずによ぀お、透明化した。透明化
されたリれむトを、臭化゚チゞりムの存圚䞋
に、塩化セシりムの等比重遠心分離しお、共有
的に閉じた円圢プラスミドDNAを他の栞酞か
ら分離した。塩化セシりムをリれむトに呚囲枩
床においお加えお、屈折率を1.3995にした。
130000×においお40時間遠心分離した埌、プ
ラスミドDNAのバンドを取り出し、氎で飜和
したsec−ブタノヌルで回抜出しお、臭化゚
チゞりムを陀去した。最埌の抜出からの䞊盞を
酢酞マトリりムに぀いお0.3モルずし、−20にお
いお䜓積の冷゚タノヌルで沈柱させた。プラ
スミドDNAをTE緩衝液䞭に溶解し、そしお
TE緩衝液に察しお℃においお広範に透析し
た。 次いで、プラスミドDNAを、Sal 制限゚
ンドヌクレアヌれそれに぀いお、それは独特
の郚䜍を含有する、円圢分子が線状圢態に転
化されるような適圓な条件䞋で、開裂させた。  結合手順 線状化されたプラスミドDNAおよびバチル
ス・リケニホルミスDNA断片を、埌述する方
法で、䞀緒に混合しお、円圢DNA分子の集団
を生産した、各分子はpHV33 DNAおよび倚少
の断片のバチルス・リケニホルミスのゲノムを
含有した。 適圓な緩衝液䞭の10.0Όのバチルス・リケ
ニホルミスDNA断片Sal で凊理した、2.8
ΌのSal 凊理したpHV33、0.002モルのア
デノシントリホスプヌトATP、0.5Όの
T4 DNAリガヌれMiles Laboratories、Inc.
から商業的に入手されるから成る反応混合物
を、14.5℃においお18時間保枩した。反応混合
物の合蚈の䜓積は、80Όであ぀た。 このような反応混合物は、次ぎの成分を含
むバチルス・リケニホルミスDNA断片ず反
応しなか぀た、再円圢化pHV33分子、ApR、
TcR、およびテトラサむクリン遺䌝子で挿入
されたバチルス・リケニホルミスDNA断片を
含有する組換えプラスミド、ApR、TcS。  雑皮プラスミドを甚いるE.coliの圢質転換 60Όの前蚘結合混合物を、Όの0.3モ
ルのCaCl2および30ΌのH2Oず混合した。倧
腞菌RR1现胞を、前も぀おCaCl2で凊理するこ
ずにより受容性competentずし、−70℃に
おいお貯蔵した。結合溶液を、200Όの融解
した倧腞菌现胞に加え、生ずる混合物を42℃に
分間加熱しお、圢質転換を完結した。倧腞菌
のこの圢質転換手順は、J.Mol.Biol、52159
−163、1870䞭に詳述されおいる。 次いで、この混合物を2.0mlのPenassy肉汁
で垌釈した。この懞濁液を37℃で時間保枩し
お、プラスミド暗号化するアンピシリン抵抗性
遺䌝子の衚珟を蚱した。次いで、现胞を50ÎŒ
mlのアンピシリンを含有するTBAB
Tryptose Blood Agar Base、Difco
Laboratories、Detroit、Michiganから入手で
きる䞊で平板培逊した。プラスミドDNAに
より圢質転換された现胞のみは、この初期の遞
択においお生長した。 生ずる圢質転換䜓を、29Όmlのテトラサ
むクリンを含有するTBABのペトリ皿䞊で、耇
補−平板培逊によりスクリヌニングした。テト
ラサむクリンに感受性である现胞は、テトラサ
むクリン抵抗性の遺䌝子䞭に挿入されたバチル
ス・リケニホルミスDNAを含有するプラスミ
ドを収容し、これによりこの遺䌝子を䞍掻性化
する。こようにしお、衚珟型ApR、TcSを有す
るプラスミドを収容するクロンのが、同定さ
れ、か぀、保護される。 次ぎの匏を䜿甚しお、党バチルス・リケニホ
ルミスゲノムが埗られたクロン䞭に衚珟され
る、99の確率を確保するために必芁な、クロ
ンの数を蚈算したJ.Mol.Biol.、53159
1970参照、 −−N ln−ln−99の割率に
぀いお、 仮定3Mdの断片の郚䜍 ×109ダルトンB.licheniformisのゲノムの
倧きさ、 4600 ここで、 各断片により衚珟された合蚈のゲノムの
フラクシペン、そしお、 独特のDNA配列がの圢質転換䜓のコ
ロニヌの集団䞭に存圚する確率。 合蚈5595のコロニヌは、AmpR、TcSである
ずしお、同定された。この5595のコロニヌを
個々に肉汁培地䞭で生長させ、30の組にプヌル
し、そしおプラスミドDNAを各組から単離し
た。プラスミドDNAの単離は、掗浄剀の溶
解、匕き続く゚タノヌル沈柱により達成した
Rroc.Nat.Acad.Sci.USA、621159−1166
1969参照。 次いで、プラスミドのプヌルを共䞎䜓DNA
ずしお䜿甚しお、遞択可胜な遺䌝暙識、すなわ
ち、Amy-、CmS现胞、を含有しない、受容宿
䞻枯草菌现胞をCmRに圢質転換し、そしお埌
の節においお説明するように、CmR圢質転
換䜓をα−アミラヌれを生産する胜力
Amy+に぀いおスクリヌニングした。プラス
ミドDNAによる受容competent枯草菌の圢
質転換は、Molecular and General
Genetics、167251−2581979䞭に蚘茉さ
れおいる。 別法ずしお、本来受容性competentでな
いバチルス属の株に぀いお、原圢質䜓の圢質転
換手順を䜿甚できる。この手順は、埮生物のリ
゜チヌム凊理、匕き続くDNAのポリ゚チレン
グリコヌルを仲介する吞収を含む。Genetic
Exchange、Genetic and Cellular
Technology、Vol.I、97−1051982参照。  CmS、Amy+枯草菌埮生物に぀いおのスクリ
ヌニング手順 宿䞻枯草菌BGSCæ ª1A289は、初めCmS
であり、か぀α−アミラヌれを぀くる胜力に欠
乏しおいたAmy-。 Amy-现胞の倧きい集団の䞭から比范的少小
さい数のAmy+を怜出できる、奜たしいアミラ
ヌれのペトリ皿膜怜出枬定amylase plate
menbrane detection assayを開発した。 TBAB、0.1のカサミノ酞類casamino
acidsDifco Laboratories、Detroit、
MichiganおよびΌmlのクロランプ
ニコヌル、1.0のでんぶんを含
む、の寒倩培地を、調補した。適圓なでんぷん
は、「ダむアスタチス粉末およびα−アミラヌ
れ定量に特異的Specific for Diastatis
Powder and α−amylase Determination
なでんぷんAmerican Society of Brewing
Chemists、Inc.、St.Paul、Minnesota 55121
である。培地の15mlの郚分を、100ml容のペト
リ皿plateお䞭に入れた。ペトリ皿を、密
閉したプラスチツクのスリヌブの䞭に℃にお
いお週間たで、劣化䜜甚なしに、貯蔵するこ
ずができた。 0.45Όの孔サむズの半透膜を、次ぎのよう
に䜿甚した。適圓な膜は、ミリポア・コヌポレ
ヌシペンMillipore Corporation、Bedford、
Massachusettsから衚瀺Hybridization
Menbrane Filter Discsで商業的に入手するこ
ずができる。 枚の切断物、長さほがmm、を互いに盎角
にし、膜をでんぷん寒倩平板培逊基䞊ぞの䜍眮
決めのための配向マヌクずしお圹立たせた。灰
分のない濟玙を薄いストリツプほがmm×50
mmに切り、滅菌の間、膜の間に配眮した。重
ねた膜をガラスのペトリ皿内の氎䞭に沈め、
120℃で30分間オヌトクレヌブ凊理した。 無菌の膜を、でんぷんの平板の寒倩衚面䞊
に、無菌のフむルタヌピンセツトで、無菌的に
移した。平板のタヌテヌブル䞊で、無菌のガラ
ス棒を䜿甚しお、膜ず寒倩衚面ずの間の緊密な
接觊を劚げる、しわや気泡を陀去した。フむル
タヌの刻み目の䜍眮を、各板の底郚においお暙
識付けた。でんぷん板はできるだけ新鮮であり
か぀気泡が存圚しないようにしお、膜を寒倩の
すべおの区域ず緊密に接觊させるこずが、枬定
の効率に察しお重芁である。 バチルス属宿䞻埮生物のプラスミド圢質転換
の埌、0.1mlの现胞、ほが×105mlのコロニ
ヌ圢成単䜍を含有する、をフむルタヌ䞊ぞ盎接
かぶせた。板を37℃においお18〜24時間、板の
右偎を䞊にしお、保枩した。保枩期間埌、膜を
無菌的にフむルタヌピンセツトで陀去した。膜
を陀去し、無菌のペトリ皿ぞ移し、適圓に暙識
を付した。このようにしお、コロニヌはそれら
自䜓、高濃床で臎死的である、ペり玠の蒞気に
暎露されなか぀た。各でんぷん−寒倩板を手袋
で盎接ペり玠蒞気の䞊に〜秒間保持し、次
いで光源の䞊に配眮しお、ブルヌのでんんぷん
−ペり玠のバツクグラりンドに察しお、でんぷ
んの加氎分解の透明ゟヌンを可芖化した。×
105のAmy-コロニヌの堎における぀のアミ
ラヌれ生産性コロニヌは、この技術により怜出
するこずができた。板のペヌ玠による珟像盎埌
に、ゟヌンの䜍眮を板の底に盎接マヌクした。
これは、着色は〜15秒埌に退色し始めるから
であ぀た。ペり玠蒞気工皋の代わりに、mlの
ペり玠氎溶液のペり化カリりム、0.2
のペり玠を䜿甚しおゟヌンを可芖化するこず
ができる。この方法におけるペり玠の適甚は、
蒞気法よりも長く保持される着色を生ずる。 アミラヌれ生産性コロニヌを回収する目的
で、Amy+现胞を含有する膜を同定し、そしお
適切な敎合を達成するためにフむルタヌ䞭の刻
み目を甚いお、前蚘膜をそのもずのでんぷん−
ペり玠寒倩板ぞ移しおもどした。板を光源の䞊
方で保持するこずにより、フむルタヌを通しお
芋お、フむルタヌ䞊のコロニヌず関係ずけるこ
ずができた。 コロニヌを小ようじでかき取るこずにより陀
去し、现胞を1.0mlのTBB肉汁Tryptose
Beef Broth1.0のトリプトヌス、0.3の牛
肉゚キス、0.5のNaClおよび0.1のカサミノ
酞類䞭に懞濁させた。系統的垌釈を実斜し、
そしお0.1mlの现胞をフむルタヌ䞊のTBAB
でんぷんクロランプニコヌル板の䞊に前述
のように、かぶせた。フむルタヌの怜出を、前
述のように、Amy+CmS枯草菌现胞の玔粋な培
逊物が埗られたこずが確立されるたで、反埩し
た。 玔粋な培逊物を、肉汁培地䞭で生長させ、α
−アミラヌれ掻性に぀いお詊隓した。培逊はあ
る生産物を生産し、この生産物は、クロヌニン
グされた遺䌝子が誘導されるバチルス・リケニ
ホルミス埮生物により生産されるα−アミラヌ
れず、同䞀の電気泳動移動床を瀺した。これら
の詊隓は、説明した方法がα−アミラヌれ遺䌝
子のバチルス属宿䞻埮生物ぞのクロヌニングに
有効であるこずを瀺した。 バチルス・リケニホルミスα−アミラヌれ遺
䌝子の枯草菌宿䞻ぞのクロヌニングは、぀の
理由で望たしか぀た。第に、バチルス・リケ
ニホルミスは、暙準の技術で遺䌝子操䜜が䞍可
胜である。したが぀お、α−アミラヌれ生産の
遺䌝的基瀎は、よく特城づけられた枯草菌宿䞻
においおより容易に研究するこずができる。第
に、枯草菌は、しばしば、工業的甚途におい
お、バチルス・リケニホルミスよりも望たしい
発酵埮生物でありうる。 圢質転換されたバチルス属宿䞻埮生物の遞択
のためのいかなる適圓な遞択手順をも、圓業者
は䜿甚できる。

Claims (1)

  1. 【特蚱請求の範囲】  あるバチルス属埮生物からのα−アミラヌ
    れ、プロテアヌれ、アミログルコシダヌれおよび
    グルコヌスむ゜メラヌれから成る矀より遞ばれた
    酵玠を暗号化する遺䌝子を、他の皮のバチルス属
    宿䞻埮生物にクロヌニングする方法であ぀お、 (a) 倧腞菌Escherichia coliおよび枯草菌
    Bacillus subtilisの䞡者の䞭で耇補する胜
    力を有する機胜プラスミド、ここで前蚘プラ
    スミドは少なくずも぀の遞択可胜な遺䌝暙識
    を含有する、を゚ンドヌクレアヌれで消化し
    お、線状プラスミド分子を生産し、 (b) 前蚘遺䌝子を含有するDNA断片を発生さ
    せ、そしお非機胜的遺䌝暙識を生産するための
    前蚘遞択可胜な遺䌝暙識の぀の挿入的䞍掻性
    化が起こるように、前蚘DNA断片を(a)の前蚘
    プラスミド䞭に組み蟌み、少なくずも皮の機
    胜的遞択可胜な遺䌝暙識を残しお、組換え雑皮
    プラスミドおよび副産物ずしお、(a)の前蚘機
    胜プラスミドを含有する混合物を生産し、 (c) (b)の前蚘混合物を、(a)の前蚘遞択可胜な遺䌝
    暙識をもたない倧腞菌埮生物䞭に組み蟌んで、
    前蚘倧腞菌を圢質転換させ、 (d) (b)の前蚘プラスミドを含有する倧腞菌圢質転
    換䜓を、前蚘機胜的遞択可胜な遺䌝暙識により
    遞択し、 (e) 前蚘非機胜的の挿入的に䞍掻性化された遺䌝
    暙識の存圚に぀いお(d)の前蚘圢質転換䜓をスク
    リヌニングするこずにより、前蚘組換えプラス
    ミドを含有する圢質転換䜓を同定し、 (f) プラスミドDNAを(e)の前蚘倧腞菌圢質転換
    䜓から抜出し、 (g) (a)の前蚘遞択可胜な遺䌝暙識を含有しない前
    蚘バチルス属宿䞻埮生物を、(f)からの前蚘プラ
    スミドDNAで圢質転換し、 (h) 前蚘組換えプラスミドを含有する前蚘バチル
    ス属宿䞻圢質転換䜓を、前蚘機胜的に遞択可胜
    な遺䌝暙識により遞択し、そしお (i) それから、前蚘プラスミド䞊の前蚘遺䌝子に
    より暗号化された前蚘酵玠を生産するこずがで
    きる、バチルス属宿䞻埮生物を単離する、 こずを特城ずするバチルス属宿䞻埮生物のクロヌ
    ニング方法。  前蚘遞択可胜な遺䌝暙識が、抗生物質耐性た
    たは生長因子を含む特蚱請求の範囲第項蚘茉の
    方法。  バチルス属宿䞻埮生物が、枯草菌Bacillus
    subtilisバチルス・リケニホルミスB.
    licheniformisおよびバチルス・アミロリクむフ
    アシ゚ンスB.amyloliquifaciensから成る矀よ
    り遞ばれる特蚱請求の範囲第項蚘茉の方法。  プラスミドが、PHV33ATCC39217であ
    る特蚱請求の範囲第項蚘茉の方法。  前蚘圢質転換されたバチルス属宿䞻埮生物
    を、工皋(h)においお、前蚘酵玠に䜜甚されうる物
    質を含有する寒倩媒質の衚面䞊に、無菌の半透膜
    を重ね、前蚘圢質転換された埮生物を前蚘膜䞊で
    生長させ、そしお前蚘酵玠を前蚘寒倩䞭に通過さ
    せ、その間前蚘圢質転換された埮生物を前蚘膜䞊
    に保持し、前蚘膜を前蚘寒倩衚面から陀去し、そ
    しお前蚘寒倩を、前蚘酵玠ず前蚘物質ずの間の怜
    出可胜な反応を生成する物質ず接觊させるこずに
    よ぀お遞択する特蚱請求の範囲第項蚘茉の方
    法。
JP58202929A 1982-11-01 1983-10-31 バチルス埮生物における遺䌝子の異型クロ−ニング方法 Granted JPS59130187A (ja)

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