JPS6254473B2 - - Google Patents

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JPS6254473B2
JPS6254473B2 JP58202929A JP20292983A JPS6254473B2 JP S6254473 B2 JPS6254473 B2 JP S6254473B2 JP 58202929 A JP58202929 A JP 58202929A JP 20292983 A JP20292983 A JP 20292983A JP S6254473 B2 JPS6254473 B2 JP S6254473B2
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JP
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plasmid
bacillus
dna
genetic marker
microorganism
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JP58202929A
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Guroshu Josefuin
Ei Uiruson Geerii
Uoruebaa Karen
Oo Ieeru Kurifuoodo
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Miles Laboratories Inc
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Application filed by Miles Laboratories Inc filed Critical Miles Laboratories Inc
Publication of JPS59130187A publication Critical patent/JPS59130187A/ja
Publication of JPS6254473B2 publication Critical patent/JPS6254473B2/ja
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Description

【発明の詳細な説明】 微生物の酵素は、医薬、農薬および有機薬品の
製造のような種々の分野において、重要性が増大
してきている。バチルス属は、維持および培養を
容易に行なうことができ、しかも特性が著しく異
質（heterogeneous）である細菌の群からなる。
Bergey’ｓ Manual of Dterminative
Bacteriology中に記載されているバチルス属の48
種のすべは、可溶性の酵素を分泌する。 古典的遺伝子操作の技術、たとえば、紫外線照
射および突然変異選択、は、α−アミラーゼのよ
うな酵素の収量および性質を改良するために使用
されてきた。1960年代において、分子生物学者
は、細菌、すなわち、大腸菌（Esherichia
coli」）およびそれらを感染するウイルスを利用
し、遺伝子暗号を解読し、突然変位の分子基準を
確立し、デオキシリボ核酸（DNA）が１つの細
胞から他の細胞へ行くことができる方法を発見
し、そして正確にかつ詳細に、生微生物が特定の
遺伝子の表現または活性を制御できる方法を明ら
かにした。この情報は1970年代において利用され
て、遺伝子操作の産業、たとえば、組換えDNA
技術、の基礎が形成された。 組換えDNA技術は、遺伝物質（遺伝子または
DNA断片）の１つの微生物から第２の微生物の
形質転換および結合された遺伝物質の引き続く伸
長を包含する。 所望の遺伝的特徴を有する特定の遺伝子、すな
わち、DNA配列、は、物理化学的手順により単
離され、あるいは化学的に合成された。次いで、
このDNA配列はプラスミドと呼ばれる小さい円
形の染色体に共有結合される。プラスミド分子の
設計は、ある群の分子状酵素、すなわち、制限エ
ンドヌクレアーゼ類、による開裂により、特定の
点において開くことができ、そしてDNAの「異
質」片を挿入して組換えプラスミドを生産できる
ようなものである。成功する組換えDNA技術
は、宿主微生物における遺伝子活性を可能とす
る、プラスミド上の部位においてDNAが挿入さ
れることを必要とする。 DNA組換え技術において興味ある１つの領域
は、酵素、たとえば、α−アミラーゼ、プロテア
ーゼ、アミログルコシダーゼおよびグルコースイ
ソメラーゼ、を暗号化する遺伝子をクローニング
することを包含する。これらの酵素の構造および
このような酵素を生産する微生物の遺伝系は、広
範に特徴づけされてきていない。 問題のこのような遺伝子を単離することは不可
能であり、そしてそれらの遺伝子の存在または遺
伝子生産物、すなわち、問題の酵素、の存在を直
接選択する技術は存在しないので、「シヨツトガ
ン（shot−gun）」クローニング、すなわち、問
題の有機体の問題のゲノムのクローニング、はい
ばしば必要である。 種々の理由で、直接のバチルス属宿主、たとえ
ば、枯草菌（B.subtilis）、への「シヨツトガン」
クローニングは実際的ではない。いくつかの理由
は、次ぎのとおりである：所望の枯草菌（B.
subtilis）クローニングベクトル（プラスミド）
の不足、形質転換の非効率、および結合混合物か
らの組換えプラスミド分子の非常に制限された形
質転換の能力。したがつて、クローニングの細心
の計画を注意して選択して、最小の工程数で所望
の遺伝子をクローニングしかつ同定する可能生を
最大としなくてはならない。 バチルス属菌株におけるα−アミラーゼを暗号
化しまたは調節する遺伝子は、２つの株が十分に
密接に関係があるとき、すなわち、２つの株の間
に広範な相同性が存在するとき、他のバチルス属
菌株に導入することができることは、知られてい
る。これは相同形質転換（homologous
transformation）と呼ばれる。たとえば、J.
Bacteriol.、120：1144−115（1974）は、例外的
に高いα−アミラーゼ活性を有するバチルス・ズ
ブチリス・バー・アミロサツカリテイクス（B.
substilis var amylosaccariticus）からのDNA
を、比較的低いα−アミラーゼを有する遺伝的に
類似する（相同性の）微生物（B.subtilis 168
Marburg）中に導入することを記載している。生
産される形質転換された微生物は、高いα−アミ
ラーゼ活性を獲得した。 Appl.Environ.Microbiol.39：274−276
（1980）は、α−アミラーゼ生産およびプロテア
ーゼについての関連遺伝子をある株中へ組込む効
果は、相乗的性質のα−アミラーゼ生産を増加さ
せるということを、確立した。全体のアプローチ
は、段階的形質転換手順により、遺伝子を受容体
の枯草菌 Marburg 6160微生物中へ段階的に導
入することを含んだ。著者らは、形質転換手順が
染色体の相同性を必要とするので、染色体の異型
を利用できる、示唆された別のアプローチが、遺
伝子類をクローニングし、そしてそれらを、より
精製された形態の修飾された受容体、すなわち、
「母細胞（mother cell）」中に導入するためのベ
クトルの開発を含む、ことを示している。 文献は、異型の形質転換において普通の形質転
換技術を使用すること、たとえば、バチルス・ア
ミロリクイフアシエンス（B.amyloliquifaciens）
からの遺伝子を枯草菌に導入すること、が困難で
あることを示している。J.Bacteriol.、111：705
−716（1972）、とくに表２、中に示されているよ
うに、相同の枯草菌168株からのDNAによる枯草
菌168株（BR151）の形質転換は、異型源、B.
amyloliquifaciens ＨからのDNAよりも、３つの
試験した遺伝子座について1000倍多い形質転換体
を生産した。 最も近い先行技術は、Rapoport、et.al.、Mol.
Gen.Genet．176：239245（1979）およびPalva.
et.al.、Gene、15：43−51（1981）中に記載され
ているものであると、思われる。 Rapoport、et.al.は、２機能性（bifunctinal）
プラスミド（pHV33）を使用して、枯草菌の全
ゲノムに相当するDNA断片を用いて大腸菌含有
プラスミドのコロニーバンクを構成することを記
載している。Rapoport、et.al.は、枯草菌からの
DNAを、同一種の第２宿主枯草菌へ相同クロー
ニングした。Rapoport、et.al.は、得られたDNA
の大きい断片を機械的剪断により形成し、そして
制限エンドヌクレアーゼを用いる完全消化は、そ
れが所望の構造遺伝子内のDNAの開裂により、
遺伝活性の損失を起こすことがあるので、望まし
くないことを示した。 Rapoportは、ある種の枯草菌宿主株の栄養要
求変異種の相補性により、組換えクロンを同定し
た。この方法は、所望の遺伝子または遺伝子生産
物の存在を同定するための直接選択を含んだ。こ
のアプローチにより、Rapoportは枯草菌突然変
異の栄養要求を暗号解読（code）する、クロー
ニングされた遺伝子についてのみ探索することに
制限された。前述の酵素を暗号解読する、クロー
ニングされた遺伝子は、このアプローチによつて
は、選択および同定されることはできなかつた。 Palva、et.al.は、B.amyloliquifaciensからのα
−アミラーゼの遺伝子を、プラスミドのベクトル
puB110にクローニングすることを、記載してい
る。この研究は、宿主微生物として枯草菌へのク
ローニングを含んだが、使用されたベクトルは２
機能性ではなかつた。 前述の参考書はいずれも、α−アミラーゼ、プ
ロテアーゼ、アミログルコシダーゼまたはグルコ
ースイソメラーゼを暗号化する遺伝子の異型
（heterologous）クローニングを達成するため
の、本発明の方法を記載していない。 本発明は、あるバチルス属微生物からのα−ア
ミラーゼ、プロテアーゼ、アミログルコシダーゼ
またはグルコースイソメラーゼを暗号化
（encoding）する遺伝子を、他の種のバチルス属
宿主微生物にクローニングする方法に関する。こ
の方法は、(a)大腸菌および枯草菌の両者の中で複
製する能力を有する２機能プラスミド、ここで前
記プラスミドは少なくとも２つの選択可能な遺伝
標識（marker）を含有する、をエンドヌクレア
ーゼで消化して、線状プラスミド分子を生産し、
(b)前記遺伝子を含有するDNA断片を発生させ、
そして非機能的遺伝標識を生産するための前記選
択可能な遺伝標識の１つの挿入的不活性化
（insertional inactivation）が起こるように、前
記DNA断片を(a)の前記プラスミド中に組み込
み、少なくとも１種の機能的選択可能な遺伝標識
を残して、組換え雑種プラスミドおよび副産物と
して、(a)の前記２機能プラスミドを含有する混合
物を生産し、(c)(b)の前記混合物を、(a)の前記選択
可能な遺伝標識をもたない大腸菌微生物中に組み
込んで、前記大腸菌を形質転換させ、(d)(b)の前記
プラスミドを含有する大腸菌形質転換体を、前記
機能的選択可能な遺伝標識により選択し、(e)前記
非機能的の挿入的に不活性化された遺伝標識の存
在について(d)の前記形質転換体をスクリーニング
することにより、前記組換えプラスミドを含有す
る形質転換体を同定し、(f)プラスミドDNAを(e)
の前記大腸菌形質転換体から抽出し、(g)(a)の前記
選択可能な遺伝標識を含有しない前記バチルス属
宿主微生物を、(f)からの前記プラスミドDNAで
形質転換し、(h)前記組換えプラスミドを含有する
前記バチルス属宿主形質転換体を、前記機能的に
選択可能な遺伝標識により選択し、そして(i)それ
から、前記プラスミド上の前記遺伝子により暗号
化された前記酵素を生産することができる、バチ
ルス属宿主微生物を単離することを特徴とを含
む。 本発明の方法は、α−アミラーゼ、プロテアー
ゼ、アミログルコシダーゼまたはグルコースイソ
メラーゼを暗号化する遺伝子を、バチルス属宿主
微生物に、クローニングする方法を提供する。単
一または複数の遺伝子のコピーを、本発明の方法
によりクローニングすることができる。 以下の説明において、種々の微生物はATCCま
たはBGSCの番号を有するとして表示される。各
ATCC表示された微生物は、アメリカン・タイ
プ・カルチヤー・コレクシヨン（American
Type Culture Collection、Rockville、
Maryland）から入手することができ、そして
BGSC表示されている微生物は、バシルス・ジエ
ネチツク・ストツク・センター（Bacillus
Genetic Center、Ohio State University、
Columbus、Ohio）から入手することができる。 本発明は、異質DNA断片のプラスミド分子中
への導入のつての以下の説明から、より容易に理
解されうるであろう。 まず、大腸菌および枯草菌の両者の中で複製
し、次ぎの特性を有する、２機能プラスミドを選
択する。このプラスミドは、アンピシリン抵抗性
（ApR）、テトラサイクリン抵抗性（TcR）、およ
びクロラミフエニコール抵抗性（CmR）につい
て遺伝子類を暗号化し、ここでApR、TcR、およ
びCmRは、すべて、大腸菌中で機能し、そして
CmRのみは枯草菌中で機能する。これらの遺伝
子類は、選択可能な遺伝標識として機能する。 プラスミド分子は、TcR遺伝子内の特別の部位
を切断する制限エンドヌクレアーゼで消化する。
このような消化は、線状プラスミド分子を生ず
る。これらの線状分子は、ここで異質のDNA断
片と混合されており、このDNA断片は同様に同
一の制限エンドヌクレアーゼの消化により生産さ
れたものである。異質DNA分子および線状プラ
スミドDNA分子は同一の「ステイツキーエン
ド」をもち、そしてこれらのエンドはアニーリン
グして組み換え雑種分子を形成するであろう。ア
ニーリングしたエンドは、ここでDNAリガーゼ
酵素の作用により「シール（seal）」される。 結合反応は、組み換え分子の発生が非効率的過
程であるので、プラスミドDNA分子の混合物を
生産する。プラスミド分子は、次ぎの型であるこ
とができる：(a)表現型ApR、TcR、CmRの、異質
DNA断片と反応したもとの２機能プラスミド、
および(b)表現型ApR、TcR（テトラサイクリン感
受性）、CmRの、TcR部位における異質DNA断片
を含有する組み換え雑種プラスミド。こうして、
テトラサイクリン遺伝子は、異質DNA断片の挿
入により不活性化され、そして非機能性の選択可
能な遺伝標識となる。 前述のプラスミド分子の混合物は、初めこれら
の遺伝標識、すなわち、ApS（アンピシリン感受
性）、TcSをもたない、大腸菌微生物への形質転
換により組込まれる。ここで(a)または(b)のいずれ
かのプラスミド分子を含有するE.coli細胞は、そ
れらのApR表現型により、形質転換されていない
（形質転換は非効率的過程である）細胞から選択
されることができる。この選択は、アンピシリン
を含有する培地上ですべての細胞を生長させるこ
とにより実施する。ApR細胞のみは、生長するで
あろう。 もとのプラスミド含有する大腸菌細胞［前述の
(a)］と比較して、組み換え雑種プラスミドを含有
する大腸菌細胞［前述の(b)］は、TcS表現型つい
てApR形質転換体をスクリーニングすることによ
つて得られる。 このスクリーニングは、テトラサイクリンを含
有する培地上ですべてのApR細胞を生長させるこ
とによつて実施される。TcS細胞はこの培地で生
長しないが、アンピシリンを含有する培地で生長
した細胞の複製の組［複製−平板培養（replica
−plating）］から回収することができる。 プラスミドDNAは、これらのApR、TcS大腸菌
細胞から抽出され、そして枯草菌宿主細胞、これ
は初め前述の遺伝標識をもたない、中に形質転換
により組み込まれる。プラスミドを含有する、枯
草菌細胞は、プラスミドを含有しないものから、
それらのCmR表現型により選択される。 この選択は、クロランフエニコールを含有する
培地上ですべての枯草菌細胞を生長させることに
よつて実施される。CmRである細胞のみが生長
するだけであろう。これのCmR細胞のすべて
は、組み換え雑種プラスミドを含有する。 適当なプラスミドは、２機能性、すなわち、２
つの細菌種、たとえば、枯草菌および大腸菌微生
物の中で複製できる、プラスミドである。このよ
うな２機能プラスミドには、ブダペスト条約に基
づいてATCCに国際寄託されているpHV33
（ATCC39217）およびProc.Natl.Acad.Sci.USA
Vol.75(3)：1433〜1436頁（1978）に記載されてい
るpHV11が包含される。 このようなプラスミド類は、少なくとも２つの
「選択可能な」遺伝標識を含有しなくてはならな
い。選択可能な遺伝標識を得ることにより、予備
的選択技術を用いることが可能となり、たとえ
ば、形質転換された微生物がある種の抗生物質に
対して抵抗性であるとき、微生物をこのような抗
生物質および生存しうる形質転換体として選択さ
れうる微生物の存在下に培養することができる。
選択可能な遺伝標識は、抗生物質抵抗性に限定さ
れないが、生長要件物質（growth
requirements）を含むことができ、たとえば、
微生物はアミノ酸、たとえば、スレオニン、リシ
ン、チロシン、アラニン、ロイシン、またはセリ
ンの存在を必要とする。プリン類およびピリミジ
ン類、たとえば、アデニン、チミン、グアニン、
シトシンおよびウラシルは、同様に生長要件物質
としておよび選択可能な遺伝標識として機能する
ことができる。 選択可能な遺伝標識の１種またはそれ以上は
「挿入的に不活性化」されることができ、すなわ
ち、プラスミド中へのDNA断片の挿入は選択可
能な遺伝標識の１つを不活性化するであろう、と
いうことも１つの要件である。たとえば、遺伝標
識の１つが、薬物抵抗性、たとえば、クロランフ
エニコール抵抗性（CmR）、アンピシリン抵抗性
（ApR）およびテトラサイクリン抵抗性（TcR）、
を与える遺伝子を含むとき、遺伝標識の１つ、た
とえば、遺伝子、は不活性化され、ここで細胞
は、遺伝標識としての役目をするために、薬物、
すなわち、CmR、ApR、またはTcRに対して感受
性とされる。 遺伝標識類は両者共同型、すなわち、２つの抗
生物質の遺伝標識または２つの生長要件物質であ
ることができ、あるいは抗生物質の遺伝標識およ
び生長要件物質の組み合わせであることができ
る。 たとえば、ロイシンの遺伝子および抗生物質抵
抗性の遺伝子を含有する２機能プラスミドを次ぎ
のように作用することができる。抗生物質抵抗性
の遺伝子中へのDNA断片の挿入を使用して抗生
物質抵抗性遺伝子を不活性化して、非機能性遺伝
標識を生産し、ロイシンの遺伝子を機能性選択可
能な遺伝標識として残すことができるであろう。
生産された組換えプラスミドは、生長のためのロ
イシンを必要とする、適当な大腸菌微生物（後述
する）中へ組み込まれる。組換えプラスミドおよ
びもとの２機能プラスミドの両者を含有する大腸
菌形質転換体は、機能的に選択可能な遺伝標識と
してロイシン生長要件物質を利用することにより
選択される。この選択は、ロイシンの不存在下に
微生物を生長させ、そして生存する微生物を選択
することによつて、達成される。これらの微生物
から、組換えプラスミドのみを含有する大腸菌形
質転換体は、あるプラスミドを含有するものにつ
いて、非機能性の挿入的に不活性化された抗生物
質抵抗性遺伝標識で、形質転換体をスクリーニン
グすることによつて同定される。複製−平板培養
の使用により、抗生物質の存在下に生長できない
形質転換体を同定することによつて達成される。
次いで、これらの形質転換体からのプラスミド
DNAを抽出し、そして選択可能な遺伝標識を含
有しないバチルス属宿主微生物を形質転換するた
めに使用する。組換えプラスミドを含有する所望
の枯草菌形質転換体は、機能的選択可能な遺伝標
識、すなわち、ロイシン生長要件物質、を用いる
ことにより選択され、そして所望の酵素生産性微
生物が単離される。 上に示したように、適当なバチルス属微生物を
使用する。これらの微生物の１つの要件は、それ
らが２機能プラスミドの選択可能な遺伝標識を有
してはならない、ということである。適当なバチ
ルス属宿主微生物は、枯草菌168（ATCC
27689）、枯草菌（BGSC 1A289）、バチルス・ア
ミロリクイフアシエンス（B.amyloliquifaciens）
Ｈ（BGSC 10A2）、およびバチルス・リケニホル
ミス（B.licheniformis）（ATCC 27811）を包含
する。 同様に、適当な大腸菌微生物は、２機能プラス
ミドの選択可能な遺伝標識をもたないものから選
択することができる。たとえば、大腸菌K12
（ATCC 10798）および大腸菌C600（ATCC
33535）を利用できる。 所望の酵素について暗号化する所望の遺伝子を
含有する、適当なバチルス属種からの染色体
DNAは、後述する普通の技術により単離するこ
とができる。染色体DNAを得ることができる適
当な微生物は、次ぎのものを包含する：α−アミ
ラーゼ：バチレス・セレウス（B.cereus）ATCC
21768：プロテアーゼ：バチルス・アミロリクイ
フアシエンス（B.amyloliquifaciens）ATCC
23842および23844、バチルス・アルカロフイルス
（B.alkalophilus）ATCC 21522およびバチルス・
リケニホルミス（B.licheniformis）ATCC
21424；アミログルコシダーゼ：枯草菌（B.
subtillis）ATCC 31068；およびグルコースイソ
メラーゼ：バチルス・リケニホルミス（B.
licheniformis）ATCC 31667；（米国特許第
4355103号に開示されている）。 DNA断片は、適当な制限酵素、たとえば、
Bam HIまたはSal Ｉ、を用いる開裂を包含する
普通の技術により発生させることができる。
DNA断片は、少なくとも１つの断片がクローニ
ングすべき全遺伝子を含有することを保証する大
きさであるべきである。後述する酵素、すなわ
ち、α−アミラーゼ、プロテアーゼ、アミログル
コシダーゼおよびグルコースイソメラーゼ、につ
いて、断片は約２メガダルトン（Md）以上の大
きさであるべきである。 DNAは、T4 DNAリガーゼまたはE.coli DNA
リガーゼの使用を含む、普通の結合技術により、
２機能プラスミド中へ組み込むことができる。 実施例 Ａ バチルス・リケニホルミス（B.
licheniformis）DNAの単離および精製 α−アミラーゼを暗号化する遺伝子を含有す
る適当なバチルス・リケニホルミス微生物は、
１のPenassay肉汁（Antibiotic Medium
＃３、Difco Laborstories、Detroit、Michgan
から入手できる）中で通気しながら18時間生長
させた。細胞を、遠心分離により収穫し、そし
て0.15モルのNaCl、0.1モルのエチレンジアミ
ン四酢酸（EDTA）から成るPH8.0の緩衝液の
50ml中に再懸濁させた。細胞の溶解は、５mgの
リソチーム（卵白の結晶質リソチーム、Miles
Laboratories、Elkhart、Indianaから商業的に
入手できる）を添加し、次いで37℃で30分間保
温する、ことによつて実施した。0.1モルのト
リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩
（tris）、0.1モルのNaCl、0.5％のドデシル硫酸
ナトリウム（SDS）から成る、PH8.0の緩衝液
の150mlを加えて、溶解工程を達成した。リゼ
イトを、200mlのフエノール（0.1モルのtris、
PH8.0で平衡化したもの）および20mlのクロロ
ホルム−イソアミルアルコール、24：１の比、
で抽出することにより、タンパク質を除去し
た。上相をクロロホルム−イソアミルアルコー
ルで２回以上で抽出した。上相を0.1モルの
NaClとし、そしてDNAを２体積の冷95％のエ
タノールで沈澱させた。このDNAを0.15モル
のNaClおよび0.015モルのクエン酸ナトリウ
ム、PH7.0、から成る、0.1モルの食塩クエン酸
塩緩衝液（SSC）の150ml中に溶解した。この
DNA溶液を、10mgのRNaseで37℃において２
時間処理し、次いで1.5mgのプロテアーゼ
（Pronase、Calbiochem、LaJolla、California
から商業的に入手できる）37℃において30分間
処理した。この溶液をフエノール（前述したも
の）で２回抽出し、0.1X SSC中に溶解した。
このDNA溶液を0.1X SSCに対して４℃におい
て透析して残留フエノール、SDSおよびエタノ
ールを除去した。 このDNAをSal 制限エンドヌクレアーゼ
（Miles Laboratories、Inc.Elkhart、Indianaか
ら商業的に入手できる）で供給会社が推奨する
条件下で開裂させた。α−アミラーゼ遺伝子が
この酵素で開裂されないことを確保するため
に、酵素処理の条件を、部分的消化のみが達成
されるように、確立した。条件は、限定された
期間にわたつて酵素の低い濃度を用いることを
含んだ。これらの条件は、当業者により容易に
決定さうる。生ずる断片をスクロースの密度勾
配遠心により分離し、そしてDNA断片の２メ
ガダルトン以上を含有するフラクシヨンをクロ
ーニングのために選択した。 Ｂ pHV33プラスミドの単離および調製 プラスミドpHV33は、ATCCから大腸菌RR1
（ATCC 39217）において入手できる。プラス
ミドDNAは、次ぎの手順により単離された。
［Practical Methods in Molecular
Biology、Robert F.Schleif、（1981）、参照］。 pHV33を含有する上の大腸菌を、50μｍ／
mlのアンピシリンを含有するPenassy肉十の
600ml中で、通気しながら中一指数的生長相
に、ほぼ３時間生長させた。同時に、150mgの
クロランフエニコールを培養物に加えて、プラ
スミドDNAを増幅させる。保温を23時間続け
た。細胞は、遠心分離により収獲し、0.01モル
のtris、0.001モルのエチレンジアミン四酢酸
（EDTA）から成るPH8.0の緩衝液（TE 緩衝
液）中で１回洗浄した。洗浄した細胞を25％の
スクロース、0.05モルのtris−HClを含有する
緩衝液、PH8.0、の50ml中に懸濁した。溶解
は、５mgのリソチームを添加し、次いで氷浴中
で10分間保温することによつて達成した。１ml
の0.25モルのEDTAを加え、そして保温を10分
間さらに続けた。溶解は、次ぎの成分から構成
された洗浄剤溶液の3.2mlの添加により完結し
た：1.0％のポリエキシエチレンラウリルエー
テル（Fisher Scientific Company、
Firhaven、New Jerseyから、商品名Brij 35で
入手できる）、0.4％のナトリウムデオキシコレ
ート、0.06モルのEDTA、および0.0モルの
Tris−HCl、PH8.0。溶解混合物を、ガラスの
撹拌棒でおだやかにかきまぜた。リゼイトを、
遠心分離により細胞の破片および染色体DNA
を除去することによつて、透明化した。透明化
されたリゼイトを、臭化エチジウムの存在下
に、塩化セシウムの等比重遠心分離して、共有
的に閉じた円形プラスミドDNAを他の核酸か
ら分離した。塩化セシウムをリゼイトに周囲温
度において加えて、屈折率を1.3995にした。
130000×ｇにおいて40時間遠心分離した後、プ
ラスミドDNAのバンドを取り出し、水で飽和
したsec−ブタノールで６回抽出して、臭化エ
チジウムを除去した。最後の抽出からの上相を
酢酸マトリウムについて0.3モルとし、−20にお
いて２体積の冷エタノールで沈澱させた。プラ
スミドDNAをTE緩衝液中に溶解し、そして
TE緩衝液に対して４℃において広範に透析し
た。 次いで、プラスミドDNAを、Sal Ｉ制限エ
ンドヌクレアーゼ（それについて、それは独特
の部位を含有する）、円形分子が線状形態に転
化されるような適当な条件下で、開裂させた。 Ｃ 結合手順 線状化されたプラスミドDNAおよびバチル
ス・リケニホルミスDNA断片を、後述する方
法で、一緒に混合して、円形DNA分子の集団
を生産した、各分子はpHV33 DNAおよび多少
の断片のバチルス・リケニホルミスのゲノムを
含有した。 適当な緩衝液中の10.0μｇのバチルス・リケ
ニホルミスDNA断片（Sal Ｉで処理した）、2.8
μｇのSal Ｉ処理したpHV33、0.002モルのア
デノシントリホスフエート（ATP）、0.5μｇの
T4 DNAリガーゼ（Miles Laboratories、Inc.
から商業的に入手される）から成る反応混合物
を、14.5℃において18時間保温した。反応混合
物の合計の体積は、80μであつた。 このような反応混合物は、次ぎの成分を含
む：バチルス・リケニホルミスDNA断片と反
応しなかつた、再円形化pHV33分子、（ApR、
TcR）、およびテトラサイクリン遺伝子で挿入
されたバチルス・リケニホルミスDNA断片を
含有する組換えプラスミド、（ApR、TcS）。 Ｄ 雑種プラスミドを用いるE.coliの形質転換 60μの前記結合混合物を、１μの0.3モ
ルのCaCl2および30μのH2Oと混合した。大
腸菌RR1細胞を、前もつてCaCl2で処理するこ
とにより受容性（competent）とし、−70℃に
おいて貯蔵した。結合溶液を、200μの融解
した大腸菌細胞に加え、生ずる混合物を42℃に
１分間加熱して、形質転換を完結した。大腸菌
のこの形質転換手順は、J.Mol.Biol．、52：159
−163、1870中に詳述されている。 次いで、この混合物を2.0mlのPenassy肉汁
で希釈した。この懸濁液を37℃で２時間保温し
て、プラスミド暗号化するアンピシリン抵抗性
遺伝子の表現を許した。次いで、細胞を50μ
ｇ／mlのアンピシリンを含有するTBAB
（Tryptose Blood Agar Base、Difco
Laboratories、Detroit、Michiganから入手で
きる）上で平板培養した。プラスミドDNAに
より形質転換された細胞のみは、この初期の選
択において生長した。 生ずる形質転換体を、29μｇ／mlのテトラサ
イクリンを含有するTBABのペトリ皿上で、複
製−平板培養によりスクリーニングした。テト
ラサイクリンに感受性である細胞は、テトラサ
イクリン抵抗性の遺伝子中に挿入されたバチル
ス・リケニホルミスDNAを含有するプラスミ
ドを収容し、これによりこの遺伝子を不活性化
する。こようにして、表現型ApR、TcSを有す
るプラスミドを収容するクロンのが、同定さ
れ、かつ、保護される。 次ぎの式を使用して、全バチルス・リケニホ
ルミスゲノムが得られたクロン中に表現され
る、99％の確率を確保するために必要な、クロ
ンの数を計算した［J.Mol.Biol.、53：159
（1970）参照］、 Ｐ＝１−（１−Ｆ）N Ｎ＝ln（１−Ｐ）／ln（１−Ｆ）99％の割率に
ついて、 仮定：3Mdの断片の部位 ３×109ダルトン＝B.licheniformisのゲノムの
大きさ、 Ｎ＝4600 ここで、 Ｆ＝各断片により表現された合計のゲノムの
フラクシヨン、そして、 Ｐ＝独特のDNA配列がＮの形質転換体のコ
ロニーの集団中に存在する確率。 合計5595のコロニーは、AmpR、TcSである
として、同定された。この5595のコロニーを
個々に肉汁培地中で生長させ、30の組にプール
し、そしてプラスミドDNAを各組から単離し
た。プラスミドDNAの単離は、洗浄剤の溶
解、引き続くエタノール沈澱により達成した
［Rroc.Nat.Acad.Sci.USA、62：1159−1166
（1969）参照］。 次いで、プラスミドのプールを共与体DNA
として使用して、選択可能な遺伝標識、すなわ
ち、Amy-、CmS細胞、を含有しない、受容宿
主枯草菌細胞をCmRに形質転換し、そして後
のＥ節において説明するように、CmR形質転
換体をα−アミラーゼを生産する能力
（Amy+）についてスクリーニングした。プラス
ミドDNAによる受容（competent）枯草菌の形
質転換は、Molecular and General
Genetics、167：251−258（1979）中に記載さ
れている。 別法として、本来受容性（competent）でな
いバチルス属の株について、原形質体の形質転
換手順を使用できる。この手順は、微生物のリ
ソチーム処理、引き続くDNAのポリエチレン
グリコールを仲介する吸収を含む。［Genetic
Exchange、Genetic and Cellular
Technology、Vol.I、97−105（1982）参照］。 Ｅ CmS、Amy+枯草菌微生物についてのスクリ
ーニング手順 宿主枯草菌（BGSC株1A289）は、初めCmS
であり、かつα−アミラーゼをつくる能力に欠
乏していた（Amy-）。 Amy-細胞の大きい集団の中から比較的少小
さい数のAmy+を検出できる、好ましいアミラ
ーゼのペトリ皿膜検出測定（amylase plate
menbrane detection assay）を開発した。 TBAB、0.1％のカサミノ酸類（casamino
acids）（Difco Laboratories、Detroit、
Michigan）および５μｇ／mlのクロランフエ
ニコール、1.0％（ｗ／ｖ）のでんぶんを含
む、の寒天培地を、調製した。適当なでんぷん
は、「ダイアスタチス粉末およびα−アミラー
ゼ定量に特異的（Specific for Diastatis
Powder and α−amylase Determination）］
なでんぷん（American Society of Brewing
Chemists、Inc.、St.Paul、Minnesota 55121）
である。培地の15mlの部分を、100ml容のペト
リ皿（plate）お中に入れた。ペトリ皿を、密
閉したプラスチツクのスリーブの中に４℃にお
いて３週間まで、劣化作用なしに、貯蔵するこ
とができた。 0.45μｍの孔サイズの半透膜を、次ぎのよう
に使用した。適当な膜は、ミリポア・コーポレ
ーシヨン（Millipore Corporation、Bedford、
Massachusetts）から表示Hybridization
Menbrane Filter Discsで商業的に入手するこ
とができる。 ２枚の切断物、長さほぼ５mm、を互いに直角
にし、膜をでんぷん寒天平板培養基上への位置
決めのための配向マークとして役立たせた。灰
分のない濾紙を薄いストリツプ（ほぼ５mm×50
mm）に切り、滅菌の間、膜の間に配置した。重
ねた膜をガラスのペトリ皿内の水中に沈め、
120℃で30分間オートクレーブ処理した。 無菌の膜を、でんぷんの平板の寒天表面上
に、無菌のフイルターピンセツトで、無菌的に
移した。平板のターテーブル上で、無菌のガラ
ス棒を使用して、膜と寒天表面との間の緊密な
接触を妨げる、しわや気泡を除去した。フイル
ターの刻み目の位置を、各板の底部において標
識付けた。でんぷん板はできるだけ新鮮であり
かつ気泡が存在しないようにして、膜を寒天の
すべての区域と緊密に接触させることが、測定
の効率に対して重要である。 バチルス属宿主微生物のプラスミド形質転換
の後、0.1mlの細胞、ほぼ１×105／mlのコロニ
ー形成単位を含有する、をフイルター上へ直接
かぶせた。板を37℃において18〜24時間、板の
右側を上にして、保温した。保温期間後、膜を
無菌的にフイルターピンセツトで除去した。膜
を除去し、無菌のペトリ皿へ移し、適当に標識
を付した。このようにして、コロニーはそれら
自体、高濃度で致死的である、ヨウ素の蒸気に
暴露されなかつた。各でんぷん−寒天板を手袋
で直接ヨウ素蒸気の上に４〜７秒間保持し、次
いで光源の上に配置して、ブルーのでんんぷん
−ヨウ素のバツクグラウンドに対して、でんぷ
んの加水分解の透明ゾーンを可視化した。１×
105のAmy-コロニーの場における１つのアミ
ラーゼ生産性コロニーは、この技術により検出
することができた。板のヨー素による現像直後
に、ゾーンの位置を板の底に直接マークした。
これは、着色は７〜15秒後に退色し始めるから
であつた。ヨウ素蒸気工程の代わりに、２mlの
ヨウ素水溶液（２％のヨウ化カリウム、0.2％
のヨウ素）を使用してゾーンを可視化すること
ができる。この方法におけるヨウ素の適用は、
蒸気法よりも長く保持される着色を生ずる。 アミラーゼ生産性コロニーを回収する目的
で、Amy+細胞を含有する膜を同定し、そして
適切な整合を達成するためにフイルター中の刻
み目を用いて、前記膜をそのもとのでんぷん−
ヨウ素寒天板へ移してもどした。板を光源の上
方で保持することにより、フイルターを通して
見て、フイルター上のコロニーと関係ずけるこ
とができた。 コロニーを小ようじでかき取ることにより除
去し、細胞を1.0mlのTBB肉汁（Tryptose
Beef Broth：1.0％のトリプトース、0.3％の牛
肉エキス、0.5％のNaClおよび0.1％のカサミノ
酸類）中に懸濁させた。系統的希釈を実施し、
そして0.1mlの細胞をフイルター上のTBAB＋
でんぷん＋クロランフエニコール板の上に前述
のように、かぶせた。フイルターの検出を、前
述のように、Amy+CmS枯草菌細胞の純粋な培
養物が得られたことが確立されるまで、反復し
た。 純粋な培養物を、肉汁培地中で生長させ、α
−アミラーゼ活性について試験した。培養はあ
る生産物を生産し、この生産物は、クローニン
グされた遺伝子が誘導されるバチルス・リケニ
ホルミス微生物により生産されるα−アミラー
ゼと、同一の電気泳動移動度を示した。これら
の試験は、説明した方法がα−アミラーゼ遺伝
子のバチルス属宿主微生物へのクローニングに
有効であることを示した。 バチルス・リケニホルミスα−アミラーゼ遺
伝子の枯草菌宿主へのクローニングは、２つの
理由で望ましかつた。第１に、バチルス・リケ
ニホルミスは、標準の技術で遺伝子操作が不可
能である。したがつて、α−アミラーゼ生産の
遺伝的基礎は、よく特徴づけられた枯草菌宿主
においてより容易に研究することができる。第
２に、枯草菌は、しばしば、工業的用途におい
て、バチルス・リケニホルミスよりも望ましい
発酵微生物でありうる。 形質転換されたバチルス属宿主微生物の選択
のためのいかなる適当な選択手順をも、当業者
は使用できる。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ あるバチルス属微生物からのα−アミラー
    ゼ、プロテアーゼ、アミログルコシダーゼおよび
    グルコースイソメラーゼから成る群より選ばれた
    酵素を暗号化する遺伝子を、他の種のバチルス属
    宿主微生物にクローニングする方法であつて、 (a) 大腸菌（Escherichia coli）および枯草菌
    （Bacillus subtilis）の両者の中で複製する能
    力を有する２機能プラスミド、ここで前記プラ
    スミドは少なくとも２つの選択可能な遺伝標識
    を含有する、をエンドヌクレアーゼで消化し
    て、線状プラスミド分子を生産し、 (b) 前記遺伝子を含有するDNA断片を発生さ
    せ、そして非機能的遺伝標識を生産するための
    前記選択可能な遺伝標識の１つの挿入的不活性
    化が起こるように、前記DNA断片を(a)の前記
    プラスミド中に組み込み、少なくとも１種の機
    能的選択可能な遺伝標識を残して、組換え雑種
    プラスミドおよび副産物として、(a)の前記２機
    能プラスミドを含有する混合物を生産し、 (c) (b)の前記混合物を、(a)の前記選択可能な遺伝
    標識をもたない大腸菌微生物中に組み込んで、
    前記大腸菌を形質転換させ、 (d) (b)の前記プラスミドを含有する大腸菌形質転
    換体を、前記機能的選択可能な遺伝標識により
    選択し、 (e) 前記非機能的の挿入的に不活性化された遺伝
    標識の存在について(d)の前記形質転換体をスク
    リーニングすることにより、前記組換えプラス
    ミドを含有する形質転換体を同定し、 (f) プラスミドDNAを(e)の前記大腸菌形質転換
    体から抽出し、 (g) (a)の前記選択可能な遺伝標識を含有しない前
    記バチルス属宿主微生物を、(f)からの前記プラ
    スミドDNAで形質転換し、 (h) 前記組換えプラスミドを含有する前記バチル
    ス属宿主形質転換体を、前記機能的に選択可能
    な遺伝標識により選択し、そして (i) それから、前記プラスミド上の前記遺伝子に
    より暗号化された前記酵素を生産することがで
    きる、バチルス属宿主微生物を単離する、 ことを特徴とするバチルス属宿主微生物のクロー
    ニング方法。 ２ 前記選択可能な遺伝標識が、抗生物質耐性ま
    たは生長因子を含む特許請求の範囲第１項記載の
    方法。 ３ バチルス属宿主微生物が、枯草菌（Bacillus
    subtilis）バチルス・リケニホルミス（B.
    licheniformis）およびバチルス・アミロリクイフ
    アシエンス（B.amyloliquifaciens）から成る群よ
    り選ばれる特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４ プラスミドが、PHV33（ATCC39217）であ
    る特許請求の範囲第１項記載の方法。 ５ 前記形質転換されたバチルス属宿主微生物
    を、工程(h)において、前記酵素に作用されうる物
    質を含有する寒天媒質の表面上に、無菌の半透膜
    を重ね、前記形質転換された微生物を前記膜上で
    生長させ、そして前記酵素を前記寒天中に通過さ
    せ、その間前記形質転換された微生物を前記膜上
    に保持し、前記膜を前記寒天表面から除去し、そ
    して前記寒天を、前記酵素と前記物質との間の検
    出可能な反応を生成する物質と接触させることに
    よつて選択する特許請求の範囲第１項記載の方
    法。
JP58202929A 1982-11-01 1983-10-31 バチルス微生物における遺伝子の異型クロ−ニング方法 Granted JPS59130187A (ja)

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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5624829A (en) * 1984-07-03 1997-04-29 Gist-Brocades, B.V. Transformed industrial bacillus strains and methods for making and using them
CA1277931C (en) * 1984-06-05 1990-12-18 Shimon Ulitzur Detection and/or identification of microorganisms in a test sample usingbioluminescence or other exogenous genetically-introduced marker
DE3527913A1 (de) * 1985-08-03 1987-02-12 Henkel Kgaa Alkalische protease, verfahren zur herstellung von hybridvektoren und genetisch transformierte mikroorganismen
US5017477A (en) * 1985-10-25 1991-05-21 Biotechnica International, Inc. Enhancing DNA sequencies derived from the sacQ gene
JP3026567B2 (ja) * 1987-02-27 2000-03-27 ジェネンコー インターナショナル インコーポレイテッド 分子のクローニング及びタンパク分解酵素をコードする遺伝子の発現
EP0479396B1 (en) * 1987-02-27 1999-06-09 Genencor International, Inc. Transformation of alkalophilic bacillus strains
JP2001504321A (ja) * 1996-06-17 2001-04-03 マイクロサイド・ファーマシューティカルズ・インコーポレーテッド 微生物菌株プールを用いるスクリーニング方法
WO2016069432A1 (en) * 2014-10-30 2016-05-06 Merck Sharp & Dohme Corp. Bacillus megaterium recombinant protein expression system

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS56113293A (en) * 1980-01-07 1981-09-07 Univ Rochester Recomoination bacteriophage for anisogenome structure cloning of batilus microorganism and production thereof
JPS56128796A (en) * 1980-02-15 1981-10-08 Cpc International Inc Genetically transformed microbe for mass production of amylolytic enzyme and its prescription
JPS57139092A (en) * 1981-02-23 1982-08-27 Microbial Chem Res Found New antibiotic istamycin a1, b1, c1 or a2
JPS57139097A (en) * 1981-01-15 1982-08-27 Cpc International Inc Method of cloning gene coding heat-resistant alpha-amylase to colibacillus and bacillus subtilis

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2048894A (en) * 1979-05-11 1980-12-17 Gist Brocades Nv Plasmid
IL61982A (en) * 1980-02-15 1984-01-31 Cpc International Inc Genetically engineered microorganisms for massive production of amyloytic enzymes and process for preparing same using the corresponding recombinant dnas containing amylase coding genes
FI64813C (fi) * 1980-12-31 1984-01-10 Ilkka Antero Palva Foerfarande foer producering av ett utvalt aeggviteaemne och vid foerfarandet anvaenda rekombinantplasmidvektorer

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS56113293A (en) * 1980-01-07 1981-09-07 Univ Rochester Recomoination bacteriophage for anisogenome structure cloning of batilus microorganism and production thereof
JPS56128796A (en) * 1980-02-15 1981-10-08 Cpc International Inc Genetically transformed microbe for mass production of amylolytic enzyme and its prescription
JPS57139097A (en) * 1981-01-15 1982-08-27 Cpc International Inc Method of cloning gene coding heat-resistant alpha-amylase to colibacillus and bacillus subtilis
JPS57139092A (en) * 1981-02-23 1982-08-27 Microbial Chem Res Found New antibiotic istamycin a1, b1, c1 or a2

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