NO170594B - Fremgangsmaate for heterolog kloning av gen i bacillus mikroorganisme - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører fremgangsmåte for heterolog kloning av gen i Bacillus mikroorganisme.

Mikrobielle 1 enzymer blir stadig viktigere innen forskjellige områder som medisin, jordbruk og fremstilling av organiske kjemikalier. Slekten Bacillus omfatter en gruppe bakterier som lett kan oppbevares og dyrkes, men som likevel er svært hete-rogene men hensyn til egenskaper. Alle de 48 artene av Bacillus-slekten som er oppført i Bergey's Manual of Determinativ Bac-teriology utskiller oppløselige enzymer.

Klassisk genetisk manipuleringsteknikk, d.v.s. ultrafiolett stråling og mutasjonsseleksjon, har vært brukt for å forbedre utbyttet og egenskapene til enzymer slik soma -amylaser. I løpet av 1960-årene utnyttet molekylærbiologer bakterier, hovedsaklig Escherichi coli og virusen som infiserer disse, desifererte denne genetiske koden, fastslo den molekulære basis for mutasjon, oppdaget fremgangsmåter hvorved deoksyri-bonukleinsyre (DNA) kunne overføres fra en celle til en annen og klarla i nøyaktig detalj måten som levende mikroorganismer kan kontrollere ekspresjon eller aktiviteten av bestemte gener. Denne informasjonen ble anvendt i 1970-årene for å danne grunnlag for genteknikk-industrien, deriblandt rekombinant DNA-teknologi.

Rekombinant DNA teknologi omfatter overføringen av genetisk materiale (gener eller DNA fragmenter) fra en mikroorganisme til en annen mikroorganisme og deretter formering av det kombinerte genetiske materialet.

Det bestemte genet, f.eks.DNA-sekvensen, som bærer det ønskede genetiske trekket, kan enten isoleres ved hjelp av fysikalsk-kjemiske fremgangsmåter eller syntetiseres kjemisk. Denne DNA-frekvensen bindes så kovalent til et lite ringformet DNA-stykke, kalt et plasmid. Utformingen av plasmidmolekylet er slik at det kan åpnes i et bestemt punkt ved spalting med en type molekylære enzymer d.v.s. restriksjons endonukleaser,

og det "fremmede" stykket med DNA innføres hvorved det frem-bringes et rekombinant plasmid. Vellykkede rekombinant DNA-teknikker krever at DNA innføres på et sted i plasmidet som

tillater genetisk aktivitet i en vert-mikroorganisme.

Et område av interesse innen rekombinante DNA teknikker omfatter kloning av gener som koder for enzymer, slik som a-amylaser, proteaser, amyloglukosidase og glukose isomeraser. Strukturen til disse enzymene og det genetiske systemet til mikroorganismene som produserer slike enzymer, er ikke blitt karakterisert i noen utstrakt grad.

Ettersom det ikke foreligger noen mulighet for å isolere

slike gener av interesse og ingen teknikk som gir anledning til direkte seleksjon med hensyn på dets nærvær eller nærværet av genproduktene, d.v.s. de aktuelle enzymene, er ofte "haglegevær" -kloning, d.v.s. kloning av hele genomer til den aktuelle organismen, nødvendig.

Av forskjellige grunner er "haglegevær"- kloning direkte på

en Bacillus-vert, slik som B.subtilis, upraktisk. Noen av grunnene er: knapphet på ønskelige kloningsvektorer (plasmider) hos B. subtilis, ineffektivitet ved transformasjon og svært begrenset transformasjonsevne hos rekombinante plasmidmolekyler fra en ligerings-blanding. Det må derfor velges en kloningsstrategi etter nøye vurdering for å gjøre sannsynligheten for kloning og identifisering av det ønskede genet i løpet av et minimalt antall trinn størst mulig.

Det er kjent at gener som koder for eller regulerer a-amylase

i en Bacillus-stamme kan innføres i en annen Bacillus-stamme dersom de to stammene er tilstrekkelig nært beslektet, d.v.s. dersom det foreligger utstrakt genetisk homologi mellom de to stammene. Dette henvises til som homolog transformasjon. F.eks. beskriver J. Bacteriol., 120;1144-1150 (1974) innfør-ingen av DNA fra B.subtillus var.amylosac-chariticus med eksepsjonelt høy a-amylase-aktivitet i en genetisk lik (homolog) mikroorganisme med forholdsvis lav a-amylase-aktivitet (B.subtilis 168 Marburg). De transformerte mikroorganismene som ble fremstilt, fikk høy a-amylase-aktivitet.

De fleste Bacillus-arter er imidlertid ikke tilstrekkelig beslektet med B-subtilis, d.v.s. de er ikke tilstrekkelig homologe, til å la DNA erholdt fra en Bacillus-stamme innføres effektivt i en ulik Bacillus-stamme. J. Bacteriol., 111; 705-716 (1972).

Appl. Environ Microbiol., 39:274-276 (1980) fastslo at virkningen av å inkorporere beslektede gener for a-amylase-produksjon og protease i en stamme, ga en økning i a-amylase-produksjon som var av synergistisk beskaffenhet. Den totale fremgangsmåten omfatter den trinnvise innføringen av genene i en mottaker-mikroorganisme, B.subtilis Marburg 6160, ved hjelp av en trinnvis transformasjons-fremgangsmåte. For-fatterne antyder at ettersom transformasjonsfremgangsmåten krever kromosomal homologi, må en foreslått alternativ fremgangsmåte som kan utnytte kromosomal heterologi, omfatte ut-viklingen av vektorer for å klone genene og innføre dem i en modifisert mottaker, d.v.s.en "mor-celle", i en renere form.

Litteraturen angir at det er vanskelig å bruke vanlige trans-formas jonsteknikker ved en heterolog transformasjon,f.eks. for å innføre gener fra B. amyloliquefaciens H i B. subtilis. Som angitt i J. Bacteriol., 111:705-716 (1972), særlig tabell 2, ga transformasjon av en B. subtilis 168 stamme (BR151) med DNA fra en homolog B.subtilis 16 8 stamme tusen ganger flere transformanter når det gjelder tre undersøkte steder enn DNA fra en heterologisk kilde, B.amyloliquefaciens

H.

Den nærmeste tidligere kjente teknikk synes å være den beskrevet av Rapoport, et.al. in Mol. Gen. Genet., 176:239245

(1979) og Palva, et.al. in Gene 15:43-51 (1981).

Rapoport et.al. beskriver bruken av et bifunksjonelt plasmid (pHV33) for å konstruere en koloni-bank av E. coli som inneholder plasmider med DNA-fragmenter svarende til hele genomet til B. subtilis. Rapoport et.al. involverte en homolog kloning av DNA fra Bacillus subtilis i en annen Bacillus subtilis-vert av den samme art. Rapoport et.al. fikk store fragmenter av DNA erholdt ved hjelp av mekanisk kutting og anga at fullstendig oppkutting med en restriksjons endonu-clease er uønsket fordi det kan forårsake tap av genetisk aktivitet ved spalting av DNA innenfor det ønskede struk-turelle genet.

Rapoport et.al. identifiserte de rekombinante klonene ved

å komplementere auksotrofe mutasjoner av visse B. subtilis vert-stammer. Denne fremgangsmåten utnytter direkte selek-sjonsteknikker for å identifisere nærværet av det ønskede genet eller geneproduktet. Ved denne fremgangsmåten var Rapoport et.al. begrenset til bare å søke etter klonede gener som kodet for ernæringsmessige krav hos B.subtilis mutanter. Klonede gener som kodet for enzymene ovenfor kunne ikke selekteres og identifiseres ved hjelp av denne fremgangsmåten.

Palva et.al., beskriver kloningen av a-amylase-genet fra

B. amyloliquifasiens i en plasmid vektor puBHO. Dette arbeidet omfatter heterolog kloning i B.subtilis som vert-mikroorganisme, men vektoren som ble brukt var ikke bifunk-sjonell.

A. Klier et al. publiserte en artikkel i "The Embo Journal", Vol. 1, nr. 7, 1982, s. 791-799, med tittel: "Cloning and expression of the crystal protein genes from Bacillus thuringiensis strain Berliner 1715", som beskriver en fremgangsmåte som anvender innskuddsinaktivering.

En innskuddsinaktivering er også beskrevet av B. Michel et al., i "Gene", Vol. 12, 1880, s. Iø47-154, Elsevier/North-Holland Biomedical Press, med tittel "DNA cloning in Bacillus subtilis. III. Efficiency of randomsegment cloning and insertional inactivation vectors".

Ingen av litteraturhenvisningene omtalt ovenfor beskriver fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse, hvorved det oppnås heterolog kloning av et gen som koder for a-amylase,. protease, amyloglukosidase eller glukose isomerase.

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig en fremgangsmåte for kloning og isolering av et gen som koder for et enzym valgt fra gruppen bestående av a-amylase, protease, amyloglukosidase og glukoseisomerase fra en Bacillus mikroorganisme inn i en Bacillus verts-mikrooganisme av en annen art, ved at følgende trinn utføres: a) spalting av et bifunksjonelt plasmid som har evne til å replikere i både E. coli og B. subtilis, idet plasmidet inneholder minst to selekterbare markører, med en endonuklease for å fremstille et rettkjedet plasmidmolekyl; b) generering av DNA-fragmenter som inneholder genet og inkorporering av DNA-fragmentene i plasmidet ifølge (a) slik at innskuddsinaktiveringen av en av de selekterbare markørene for å fremstille en ikke-funksjonell markør oppstår, idet det forblir tilstede minst én funksjonell selekterbar markør for å fremstille en blanding inneholdende rekombinante hybridplasmider og som et biprodukt, de bifunksjonelle plasmidene ifølge (a); c) inkorporering av blandingen ifølge (b) inn i E. coli mikroorganismer som ikke har de selekterbare markørene ifølge (a) for å transformere nevnte E. coli; d) selektering av E. coli transformanter inneholdende nevnte plasmider ifølge (b) ved hjelp av den funksjonelle selekterbare markøren; e) identifisering av transformanter inneholdende nevnte rekombinante plasmider ved screening av nevnte transformanter ifølge (d) for nærvær av nevnte ikke-funksjonelle innskudds-inaktiverte markør, f) ekstrahering av plasmid DNA fra nevnte E. coli transformanter ifølge (e), g) transformering av nevnte Bacillus verts-mikroorganismer som ikke inneholder de selekterbare markørene

ifølge (a) med nevnte plasmid DNA fra (f);

h) selektering av nevnte Bacillus vertstransformanter inneholdende rekombinante plasmider ved hjelp av

nevnte funksjonelle selekterbare markør, kjennetegnet ved

i) screening av nevnte Bacillus verts-mikroorganismer valgt i trinn (h) ved belegging av en steril semipermeabel membran på overflaten av et agarmedium inneholdende en forbindelse som kan bli omsatt med nevnte enzym, dyrking av nevnte transformerte mikroorganismer på nevnte membran og muliggjøre at nevnte enzym går inn i nevnte agar mens de transformert mikroorganismene blir holdt igjen på membranene, fjerning av nevnte membran fra agaroverflaten, og kontakting av agaren med en forbindelse som fremstiller en påvisbar reaksjon mellom enzymet og forbindelsen, og

j) isolering derifra en Bacillus verts-mikroorganisme som kan fremstille nevnte enzym kodet av genet på plasmidet.

Oppfinnelsen omfatter videre en fremgangsmåte for kloning og isolering av et a-amylasegen fra en Bacillus mikroorganisme inn i en Bacillus verts-mikroorganisme fra en annen art, ved at følgende trinn utføres: a) spalting av et bifunksjonelt plasmid som kan replikere i både E. coli og B. subtilis, idet plasmidet inneholder minst to selekterbare markører med en endonuklease for å fremstille et rettkjedet plasmidmolekyl,

b) generering av DNA-fragmenter inneholdende nevnte gen og inkorporering av nevnte DNA-fragmenter inn i

nevnte plasmid ifølge (a) slik at innskuddsinaktivering av en av nevnte selekterbare markører for å fremstille en ikke-funksjonell markør oppstår, idet det forblir tilstede minst én funksjonell selekterbar markør for å fremstille en blanding inneholdende rekombinante hybridplasmider, og som et biprodukt, nevnte bifunksjonelle plasmider ifølge (a),

c) inkorporering av blandingen ifølge (b) inn i E. coli mikroorganismer, som ikke har nevnte selekterbare

markører ifølge (a) for å transformere nevnte E. coli,

d) selektering av E. coli transformanter, inneholdende nevnte plasmider ifølge (b) ved hjelp av nevnte

funksjonelle selekterbare markør,

e) identifisering av transformanter inneholdende nevnte rekombinante plasmider ved screening av nevnte

transformanter ifølge (d) for nærvær av nevnte ikke-funksjonelle innskudds-inaktiverte markør,

f) ekstrahering av plasmid DNA fra nevnte E. coli transformanter ifølge (e), g) transformering av nevnte Bacillus vertsorganismer som ikke inneholder nevnte selekterbare markører ifølge (a) med nevnte plasmid DNA fra (f); h) selektering av nevnte Bacillus verts-transformanter inneholdende rekombinante plasmider ved hjelp av

nevnte funksjonelle selekterbare markør, kjennetegnet ved

i) screening av nevnte transformerte Bacillus verts-mikroorganismer valgt fra trinn (h) ved belegging av en steril semipermeabel membran på overflaten av et agarmedium inneholdende stivelse, dyrking av nevnte transformerte mikroorganismer på nevnte membran og muliggjøre at nevnte a-amylase går inn i nevnte agar mens nevnte transformerte mikroorganismer blir holdt tilbake på nevnte membran, fjerning av nevnte membran fra nevnte agaroverflate, kontakting av nevnte agar med et iod-inneholdende reagens og observering av en detekterbar reaksjon mellom a-amylase og stivelses-iod, og

j) isolering derfra en Bacillus verts-mikroorganisme som

kan produsere a-amylase.

Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en vei for heterologisk kloning av et gen som koder for a-amylase-, protease-,amyglukosidase- eller glukose-isomerase enzymer inn i en Bacillus-vert-mikroorganisme. Ved hjelp av foreliggende fremgangsmåte kan et enkelt gen eller flere

. genlcopier klones.

I den følgende beskrivelse er forskjellige mikroorganismer angitt å haATCC- eller BGSC-nummer. Hver ATCC-betegnede mikroorganisme tilgjengelig fra American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, hver BGSObetegnede mikroorganisme er tilgjengelig fra Bacillus Genetic Stock Center, Ohio State Univer-sity, Columbus, Ohio.

Foreliggende oppfinnelse kan lettere forstås ved hjelp av den følgende illustrasjon av innføringen av et fremmed DNA-fragment i et plasmid-DNA-molekyl.

Først velges det ut et bifunksjonelt <p>lasmid som replikerer i

*både E. coli og B. subtilis, og som har de følgende kjennetegn. Plasmidet koder for genene for ampicillin resistens (Ap ), tetra-sykliner resistens (Tc R ), og kloramfenikol resistens (Cm R),

R R R R

slik at Ap , Tc , og Cm alle virker i E.coli, mens bare Cm virker i B.subtilis.

Disse genene virker som selekterbare markører.

Plasmidmolekylene brytes opp ved hjelp av en restriksjons endo-nuclease som kutter på et bestemt sted innenfor Tc -genet. Slik 'oppkutting resulterer i rettkjedede plasmidmolekyler. Disse rettkjedede molekylene blandes så med de fremmede DNA-fragmentene som også er blitt fremstilt ved oppkutting med den samme restriksjons endonucleasen. De fremmede DNA-molekylene og de rettkjedede plasmid-DNA-molekylene har de samme "sticky ends" 'og disse endene vil knyttes til hverandre slik at det dannes rekombinante hybridmolekyler. De sammenknyttede endene "forseg-les" så ved virkningen av DNA-ligase enzymet.

Ligeringsreaksjonen gir en blanding av plasmid-DNA-molekyler 'ettersom genereringen av de rekombinante molekylene er en ineffektiv prosess. Plasmidmolekylene kan være av de følgende typene: (a) det opprinnelige bifunksjonelle plasmidet, som ikke har reagert med noen fremmede gener - fragmenter, av fenotypen Ap R , Tc R 'Cm R, og (b) rekombinante hybridplasmider som inneholder

R R S

et fremmed DNA-fragment i Tc -stedet, av fenotypen Ap , Tc (tetracyklin sensitiv), Cm R. Følgelig gjøres tetracyklin-genet inaktivt ved innføringen av det fremmede DNA-fragmentet og blir

en ikke-funksjonell selekterbar markør.

Blandingen av plasmidmolekyler beskrevet ovenfor inn-korporeres ved transformasjon i E.coli mikroorganismer

g

som opprinnelig ikke har disse markørene, d.v.s.Ap (ampisilin sensitiv),Tc .E.coli cellene som nå inneholder et plasmidmolekyl enten av type(a) eller (b) beskrevet ovenfor, kan velges ut blandt cellene som ikke er blitt transformerte (transformering er en ineffektiv prosess)

ut fra deres Ap -fenotype. Utvelgelsen gjøres ved å

dyrke alle cellene på medium som inneholder ampisilin.

Bare Ap -cellene vil vokse.

E.coli-cellene som inneholder rekombinante hybridplasmider [(b) i omtalen ovenfor]i kontrast til de som inneholder det opprinnelige plasmid [(a) i omtalen ovenfor] erholdes ved å lete gjennom Ap R -transformantene etter Tc S-fenotypen.

Utsorteringen gjøres ved å dyrke alle Ap -cellene på medium som inneholder tetrasyklin. Tc S-cellene vil ikke vokse på dette mediet, men kan utvinnes fra et kopisett av celler dyrket på medium som inneholder ampisilin(replika-utplating).

Plasmid-DNA-n ekstraheres fra disse Ap R , Tc S E.coli-cellene og inkorporeres i B.subtilis-vertceller, som opprinnelig ikke har de tidligere beskrevne markørene, ved transformasjon. B.subtilis-cellene som inneholder plasmider, velges ut blandt de som ikke inneholder plasmider, ved hjelp av deres Cm fenotyper.

Denne seleksjonen gjøres ved å dyrke alle B.subtilis-cellene på mediet som inneholder kloramfenicol. Bare cellene som

R R

er Cm vil vokse. Alle disse Cm -cellene inneholder rekombinante hybridplasmider.

Egnede plasmider er plasmider som er bifunksjonelle, d.v.s. er i stand til replikering i to bakteriearter, slik som i mikroorganismene Bacillus subtilis og E.coli. Slike bifunksjonelle plasmider omfatter pHV33, ATCC 39217 og pHVll, beskrevet i Proe. Nati. Acad. Sei. USA 15( 3):1433-1436 (1978).

Slike plasmider må inneholde minst to "selekterbare" markø-rer. Tilstedeværelsen av en selekterbar markør muliggjør bruken av en primær seleksjonsteknikk, f.eks. dersom en transformert mikroorganisme er resistent mot et bestemt anti-biotikum, kan mikroorganismen dyrkes i nærvær av antibiotikumet og mikroorganismene som overlever kan velges ut som levedyktige transformanter. Selekterbare markører er ikke begrenset til antibiotika resistens, men kan omfatte veks-krav, f.eks. kan en mikroorganisme kreve nærvær av en amino-syre, slik som treonin,lysin,tyrosin,alanin,leusin eller serin. Puriner og pyrimidiner, slik som adenin, tymin, guanin, sytosin og urasil, kan også virke som et vekstkrav, og som en selekterbar markør.

Det er også et krav at en eller flere av de selekterbare markørene er i stand til å bli "inaktivert etter innskudd", d.v.s. innskudd av et DNA fragment i plasmidet vil inaktivere en av de selekterbare markørene. Hvis f.eks. en av markørene omfatter et gen som gir legemiddelresistens, slik

R R

som kloramfenikolresistens (Cm ), ampisilin (Ap ) og tetrasyklin resistens(Tc ), kan en av markørene,d.v.s. genet, inaktivieres slik at cellen gjøres sensitiv overfor legemid-let, d.v.s. Cm S , Ap S , eller Tc s, for å tjene som en markør.

Markørene kan begge være av den samme type, d.v.s. to anti-biotikamarkører eller to vekstkrav, eller de kan være en kombinasjon av en antibiotika markør og et vekstkrav.

F.eks. kan et bifunksjonelt plasmid som inneholder et leusin gen og et gen for antibiotika-resistens, brukes på følgende måte. Innføring av et DNA-fragment i det antibiotika-resistente genet kan brukes til å inaktivere det antibiotikaresistente genet slik at det produserer en ikke-funksjonell markør, idet leusingenet forblir en funksjonell selekterbar markør. De rekombinante plasmidene som fremstilles, inkorporeres i en passende E.coli mikroorganisme (beskrevet nedenunder) som krever leusin for vekst. E.coli transformanter som inneholder rekombinante plasmider og de opprinnelige bifunksjonelle plasmider, velges ut ved å utnytte vekstkravet til leusin som en funksjonell selekterbar markør. Utvelgelsen utføres ved å dyrke mikroorgansimene i fravær av leusin og velge ut mikroorganismene som overlever. Fra disse mikroorganismene identifiseres E.coli transformantene som inneholder bare de rekombinante plasmidene, ved utsortering av transformantene etter de som inneholder et plasmid med den ikke-funksjonelle, antibiotikaresistente markøren som inaktiveres ved innskudd. Utsorteringen gjøres ved å identifisere de transformantene som ikke er i stand til å vokse i nærvær av antibiotikumet, ved å bruke replika-utplating. Plasmid DNA fra disse transformantene ekstraheres deretter ut og brukes til å transformere Bacillus vert mikroorganismer som ikke inneholder den selekterbare markøren. De- ønskede B.subtilis-transformantene som inneholder rekombinante plasmider velges ut ved å bruke den funksjonelle, selekterbare markøren, d.v.s. vekstkravet for leusin, og den ønskede, enzymproduserende mikroorganismen isoleres.

Som angitt ovenfor, anvendes de egnede Bacillus-vert mikroorganismer. Et krav til disse mikroorganismene er at de må ikke ha de selekterbare markørene til det bifunksjonelle plasmidet. Egnede Bacillus-vert mikroorganismer omfatter Bacillus subtilis 168 (ATCC 27689), B.subtilis (BGSC 1A289), B. amylolikvifasiens H (BGSC 10A2), og B.licheniformis(ATCC 28711).

På samme måte kan passende E.coli mikroorganismer velges ut blandt de som ikke har de selekterbare markørene til det bifunksjonelle plasmidet. F.eks. kan E.coli K12(ATCC 10798) og E.coli C600 (ATCC 33525) brukes.

Kromosomalt DNA fra en egnet Bacillus art, som inneholder et ønsket gen som koder for det ønskede enzymet, kan isoleres ved hjelp av de vanlig kjente teknikkene beskrevet nedenunder. Passende mikroorganismer hvorfra kromosomalt DNA kan erholdes, omfatter de følgende: a-amylase, B.cereus ATCC 21768, protease, B.amyloliquefasiens ATCC 23842 og 23844, B.alkaophilus ATCC 21522 og B.licheniformis ATCC 21424, amyloglukosidase, B. subtilis ATCC 31068 og glukoseisomerase, B.licheniformis ATCC 31667,(åpenbart i US Patent nr.4,355,103).

DNA-fragmentene kan genereres ved hjelp av vanlig kjente teknikker som omfatter spalting med et passende restriksjons-enzym, f.eks. Barn HI eller Sal I. DNA-fragmentene bør være av en størrelse som sikrer at minst et fragment inneholder hele genet som skal klones. Når det gjelder enzymene henvist til ovenfor, a-amylaser, proteaser, amyloglukosidaser og glukose siomerase, bør fragmentene være ca. to megadalton (md) eller mer i størrelse.

DNA inkorporeres i det bifunksjonelle plasmidet ved hjelp

av vanlig kjente ligeringsteknikker, som omfatter bruken av T4 DNA ligase eller E.coli DNA-ligase.

Eksempel 1

A. Isolering og rensing av DNA fra B.licheniformis.

En passende mikroorganisme av arten B.licheniformis som inneholder et gen som koder for a-amylase, ble dyrket i en liter Penassay dyrkingsvæske (Antibiotika Medium nr.3, tilgjengelig i handelen fra Difco Laboratories, Detroit, Michigan) i 18 timer under lufttilførsel. Celler ble høstet ved sentrifugering og resuspendert i 50 ml av en buffer bestående av 0,15 M NaCl, 0,1 M etylendiamintetraedikksyre (EDTA) ved pH 8,0. Lyset av cellene ble utført ved tilsetning av 50 mg lysozym (krystallinsk lysozym fra eggehvite, tilgjengelig i handelen fra Miles Laboratories,Elkhart, Indiana), etterfulgt av inkubering i 30 minutter ved 37°C. Tilsetning av 150 ml av en buffer bestående av 0,1 M tris hydroksymetyl-aminometanhydroklorid (tris), o,l M NaCl, o,5% natrium dodesyl sulfat (SDS), ved pH 8,0, fullstendiggjorde lyseringstrinnet. Proteinene ble fjernet ved å ekstrahere lysåtet med 2 00 ml fenol (som var blitt ekvilibrert med 0,1 M tris, pH 9,0) og 20 ml kloroform-isoamylalkohol i et forhold på 24:1. Toppfasen ble ekstrahert ytterligere to ganger med kloroform-isoamylalkohol. Toppfasen ble gjort 0,1 M i NaCl og DNA-n ble utfelt med to volumdeler kaldt 95% etanol. DNA-n ble oppløst i 150 ml 0,1 M standard saltholdig citratbuffer (SSC) som besto av 0,15 M NaCl og o,ol5 M natriumcitrat, pH 7,0. Denne DNA-oppløsningen ble behandlet med 10 mg av RNase i to timer ved 37°C og deretter med 1,5 mg protease(Pronase, tilgjengelig i handelen fra Calbiochem LaJolla, California) i 30 minutter ved 37°C. Oppløsningen ble ekstrahert to ganger med fenol (beskrevet ovenfor), og oppløst i 6,IX SSC. Denne DNA-opp-løsningen ble dialysert mot 0,1 X SSC ved 4°C for å fjerne restfenol,SDS, og etanol.

DNA ble spaltet med Sal I restriksjon endonuklease(tilgjengelig i handelen fra Miles Laboratories,Inc. Elkhart, Indiana) under betegnelsene som er anbefalt av leverandøren. For å sikre at a-amylase genet ikke ble spaltet med enzymet, ble det opprettet slike betingelser for enzymbehandling at bare delvis spalting ble oppnådd. Betingelsene omfattet å bruke lave konsentrasjoner av enzymer i løpet av en begrenset tidsperiode. Disse betingelsen kan lett bestemmes av en fag-mann på området. De resulterende fragmentene ble adskilt ved hjelp av sucrose densitet gradient sentrifugering, og fraksjonen som inneholdt DNA-fragmenter av størrelse 2 megadalton eller større, ble valgt ut for kloning.

B. Isolering og fremstilling av pHV33 Plasmid.

Plasmid pHV33 er tilgjengelig fra ATCC i E.coli RR1 (ATCC 39217).Plasmid-DNA ble isolert i henhold til den følgende fremgangsmåte.[Se Practical Methods in Molecular Biology, Robert F. Schleif,(1981)].

Den ovenfor nevnte E.coli som inneholder pHV33 ble dyrket

i 600 ml Penassay dyrkningsvæske som inneholdt 50 yg ampicillin under lufttilførsel til midt i den eksponensielle vekstfase, omtrent 3 timer. På dette tidspunktet ble 150 mg kloramfenikol tilsatt til kulturen for å la plasmid-DNA forsterkes. Inkuberingen ble fortsatt i 23 timer. Celler ble høstet ved sentrifugering og vasket en gang i en buffer satt sammen av 0,01 M tris, 0,001 M etylendiamintetraedikksyre (EDTA), pH 8,0 (TE-buffer). De vaskede cellene ble suspendert i 5,0 ml av en buffer som inneholdt 25% sukrose, 0,05 M tris-HCl,ph 8,0 Lyset ble utført ved tilsetningen av 5 mg lysozym, fulgt av inkubering i et is-bad i lo minutter. En ml 0,25 M EDTA-oppløsning, pH 8,0, ble tilsatt og inkuberingen fortsatt i ytterligere 10 minutter. Lyset ble fullført ved tilsetningen av 3,2 ml av en detergent oppløsning, sammensatt av: 1,0% av polyoksyetylen lauryl eter, tilgjengelig fra Fisher Scientific Company, Fairhaven, New Jersey under varemerket "Brij 35;" 0,4% natrium deoksy-cholat, 0,06 M EDTA, og 0,05 M Tris-HCl, pH 8,0. Lyset-blandingen ble forsiktig omrørt med en glasstav. Lysatet ble klaret ved sentrifugering for å fjerne cellulære rester og kramoscmalt DNA. Det klarede lysatet ble gjort til gjenstand for isopyknisk cesium klorid densitets gradient sentrifugering i nærvær av etidium bromid for å adskille kovalent lukket, ringformet plasmid-DNA fra andre nuklein-syrer. Cesium klorid ble tilsatt til lysatet ved omgivelses-temperatur inntil en endelig brytningsindeks på 1.3995. Etter sentrifugering i 40 timer ved 130.000 x g, ble plasmid-DNA-båndet fjernet og ekstrahert 6 ganger med vann-mettet sekundær butanol for å fjerne etidium bromid. Toppfasen fra den siste ekstrasjonen ble oppblandet til 0,3 M med hensyn på natriumacetat, og utfelt med 2 volumdeler kald etanol over natten ved -20°C. Plasmid-DNA ble oppløst i TE-buffer og dialysert grundig mot TE-buffer ved 4°C.

Plasmid-DNA ble så spaltet med Sal I restriksjon endonuklease ( for hvilket den inneholder et eneste sted) under passende betingelser slik at de ringformede molekylene ble

omdannet til rettkjedede former.

C. Ligeringsfremgangsmåte,

Plasmid-DNA-n som er gjort rettkjedet og DNA-fragmentene

fra B.licheniformis DNA ble blandet sammen på måten som er beskrevet nedenunder, hvorved man fikk en samling ringformede DNA-molekyler, som hver inneholdt pHV33 og et eller annet fragment fra genomet til B.licheniformis.

En reaksjonsblanding bestående av 10,0 Ug DNA-fragmenter

fra B.licheniformis (behandlet med Sal I), 2,8 yg Sal I-behandlet pHV33, 0,002 M adenosin trifosfat (ATP), 0,5 yg T4 DNA ligase (tilgjengelig i handelen fra Miles Laboratories ,Inc.)i en passende buffer ble inkubert ved 14,5°C

i 18 timer. Totalvolumet av reaksjonsblandingen var 80 Ul.

En slik reaksjonsblanding omfatter: pHV33-molekyler som på nytt er gjort ringformede og som ikke omsatt med DNA-frag-

R R

menter fra B.licheniformis, (Ap , Tc ) og rekombinante plasmider som inneholder et DNA-fragment fra B.licheniformis innskutt innenfor tetracyklin genet (Ap^, Tc<s>).

D. Transformasjon av E.coli med hybridplasmider.

Seksti yl av legeringsblandingen ble blandet med yl av

0,3 M CaCl2 og 30 Pl H20. E.coli RRl-cellene var på forhånd gjort kompetente ved behandling med CaCl2 og lagret ved -70°C. Ligeringsoppløsningen ble tilsatt til 200 yl opptint E.coli-celler, og den resulterende blandingen ble oppvarmet ved 42°C i et minutt for å fullføre transformasjonen. Detaljer - vedrørende denne fremgangsmåten for transformasjon av E.coli er gitt i J. Mol. Biol.,52:159-163 , 1970.

Blandingen ble så fortynnet med 2,0 ml Penassay dyrkingsvæske. Denne suspensjonen ble inkubert i 2 timer ved 37°C hvorved man fikk ekspressjon av det plasmid-innkodede

ampicillin resistente genet. Cellene ble så platet ut på

TBAB (Tryptose-blod-agar-base, tilgjengelig i handelen fra Difco Laboratories, Detroit, Michigan) som inneholdt 50Ug/ml ampicillin. Bare celler som var blitt transformert ved hjelp av plasmid-DNA-n vokste ved denne første seleksjonen.

De resulterende transformantene ble gjort til gjenstand for utsortering på TBAB-plater som inneholdt 20 Ug/ml tetrasyklin, ved replika-utplating. Celler som er følsomme overfor tetrasyklin innehar et plasmid som inneholder DNA fra B.licheniformis som er innført i genet for tetrasyklin resistens, og derved har inaktivert dette genet. På denne måten ble bare

R S

kloner som inneholdt et plasmid med fenotypen Ap ,Tc , identifisert og tatt vare på.

Den følgende formel ble brukt for å beregne antallet kloner som trengtes for å sikre en 99% sannsynlighet for at hele genomet fra B-licheniformis var representert i de erholdte klonene [Se J. Mol. Biol, 5J3:159 (1970)].

For 99% sannsynlighet.

Gitt: 3Md fragment, størrelse

Hvor

F = denne delen av hele genomet som utgjøres av hvert

fragment og

P = er sannsynligheten for at en eneste DNA-sekvens er tilstede i samlingen av N-transformantkolonier.

R S

I alt 5.595 kloner ble identifisert som Amp ,Tc . De 5.595 klonene ble dyrket hver for seg i flytende kulturer, slått sammen i sett på 30 og plasmid-DNA-n isolert fra hvert sett. Isolering av plasmid-DNA ble utført ved hjelp av detergent lyset, etterfulgt av etanolutfelling(se Proe. Nat. Acad. Sei. USA, 62:1159-1166 (1969)).

Plasmidblandingene ble så brukt som donor-DNA for å transformere kompentente B.subtilis vertceller, som ikke inneholdt de selekterbare markørene, d.v.s. Amy-, Cm S-celler,til Cm R og Cm R-transformantene ble utsortert etter evne til å produsere a-amylase (Amy+) slik som beskrevet i avsnitt E nedenunder. Transformasjon av kompetente B.subtilis-celler med plasmid-DNA er beskrevet i ( Molecular and General Gentics, 167:251-258 (1979) ).

Eventuelt kan det brukes en protoplast transformasjon for stammer av Bacillus som ikke er naturlig kompetente. Fremgangsmåten omfatter behandling av mikroorganismer med lys-azym for å danne protoplaster etterfulgt av opptak av DNA, istandbrakt ved hjelp av polyetylen glykol.( se Genetic Exchange, Genetic and Cellular Technology, Vol.I,97-105

(1982)) .

E. Fremgansmåte for utsortering av Cm' ,Amy+ B.subtilis

mikroorganismer.

Verten B.subtilis (BGSC stamme 1A289) var opprinnelig både Cm og hadde manglende evne til lage a-amylase (Amy ).

En foretrukket analyse for platemembran-påvisning av amylase ble utviklet, som gjorde påvisningen av det forholdsvis lite antall Amy<+> mulig blandt en stor populasjon av Amy celler.

Det ble fremstilt et agar medium av TBAB, 0,1% casaminosyrer (Difco Laboratories, Detroit, Michigan) og 5 Ug/ml kloramfenikol, idet 1,0% (w/v)stivelse ble innlemmet. En egnet stivelse er en stivelse "Spesifik for bestemmelse av dia-statisk kraft og a-amylase", tilgjengelig fra American Society of Brewing Chemists,Inc.,St.Paul,Minnesota 55121. 25 1 store porsjoner av mediet ble plasert i 100 mm petri skåler (plater). Platene kan lagres i lukkede plasthylser ved 4°C i inntil 3 uker uten noen skadelige virkninger.

Semipermeable membraner med en 0,45 ym porestørrelse, ble brukt på følgende måte. En egnet membran er tilgjengelig i handelen fra Millipore Corporation Bedford, Massachusetts, under handelsbetegnelsen "Hybridization Membrane Filter Discs".

Det ble gjort to kutt, omtrent 5 mm lange, i rett vinkel på hverandre for å tjene som orienteringsmerker for posisjone-ring av membranene på stivelses-agar-platene. Askefrie filterpapir ble kuttet opp i tynne strimler (omtrent 5 mm x 50 mm) og plasert mellom membranene under sterilisering.

De sammenstilte membranene ble senket ned i vann i en petriskål av glass og autoklavert i 30 minutter ved 120°C.

De sterile membranene ble lagt over på agaroverflaten av stivelseplatene ved aseptisk overføring med sterile filterpinsetter. På en flat dreieskive ble en steril glasstav brukt for å fjerne foldene og luftboblene, som forhindrer nærkontakt mellom membranen og agaroverflaten. Posisjonene for innskjæringene i filteret ble avmerket på bunnen av hver plate. Det er kritisk for effektiviteten av analysen at stivelseplatene er friske og frie for bobler, for å sikre at det er nærkontakt mellom membranen og alle områdene på agaren.

Idet man fulgte fremgangsmåten for plasmid-transformasjon av B.subtilis vert mikroorganismer, ble 0,1 ml celler, som

" 5

inneholdt omtrent 1 x 10 kolonidannende enheter pr ml, utplatet direkte på filterne. Platene ble inkubert ved 37°C

i 18-24 timer med den rette siden av platen opp. Etter inkuberingsperioden, ble membranene fjernet aseptisk med filterpinsetter. Membranene ble fjernet og overført til en steril petriskål og hensiktsmessig merket.På denne måten

ble ikke selve koloniene eksponert mot joddamp, som er døde-lig i høye konsentrasjoner. Hver stivelse-agar-plate ble holdt med hansker direkte over joddampen i 4-7 sekunder, deretter plassert på en lyskilde for å synliggjøre de klare stivelse-hydrolyse sonene mot den blå stivelse-jod-bak-grunnen. En amylase-produserende koloni i et område med 1 x 10^ Amy kolonier var påvisbar ved hjelp av denne teknikken. Sonenes beliggenhet ble avmerket direkte på plate-bunnen umiddelbart etter at platen var jod-fremkalt. Dette var nødvendig ettersom fargen begynner å forsvinne etter 7-15 sekunder. I stedet for trinnet med joddamp, kan 2 ml av en vanlig jodoppløsning (2% kalium iodid, 0,2% jod) brukes for <å> synliggjøre sonene. Anvendelse av jod på denne måten resulterer i en farge som opprettholdes lengere enn ved dampfremgangsmåten.

For å utvinne de amylaseproduserende koloniene, ble membranen som inneholdt Amy<+> cellene identifisert og overført tilbake til sin opprinnelige stivelsejod-agarplate ved å bruke innsnittene i filteret for å få korrekt innretting. Ved å holde platen over en lyskilde, kunne de mørkere sonene sees igjennom filteret, og korreleres med en koloni på filteret.

Kolonien ble fjernet fra filteret ved avskraping med en steril tannpirker, og cellene ble suspendert i 1,0 ml TBB næringsvæske (Tryptose-kjøtt-næringsvæske: 1,0% tryptose, 0,3% kjøttekstrakt, 0,5% NaCl, og 0,1% casamino syre). Det ble utført seriefortynninger og 0,1 ml celler ble platet ut på filteret over TBAB + stivelse + kloramfenikol-plater slik som ovenfor. Filterpåvisningsanalysen beskrevet ovenfor,ble gjentatt inntil det var fastslått at en ren

+ R

kultur av Amy Cm B.subtilis var erholdt.

Den rene kulturen ble dyrket i næringsvæskekultur og <p>røvet med hensyn på a-amylaseaktivitet. Kulturen produserte et produkt som oppviste den samme elektroforetiske mobilitet som a-amylase fremstilt ved hjelp av B. licheniformis mikroorganismen hvorfra det klonede genet var avledet. Disse prøvene indikerte at den beskrevne fremgangsmåte var virk-som for å klone a-amylase-genet inn i Bacillus vert mikroorganismen.

Kloning av B.licheniformis a-amylase genet inn i en B.sutilis-vert var ønskelig av to grunner. For det første, er B.licheniformis ikke mottagelig for genetisk manipul-ering ved hjelp av standard teknikker. Det genetiske grunn-laget for a-amylase produksjon kan derfor lettere studeres i den godt karakteriserte B.subtilis-vert. For det andre, kan B.subtilis ofte være en mere ønskelig fermentering-organismeenn det B.licheniformis ved industrielle anvend-elser.

Enhver egnet seleksjonsfremgangsmåte for utvelgelsen av

de transformerte Bacillus-vert mikroorganismene kan brukes av fagmenn på området.

Claims (9)

1. Fremgangsmåte for kloning og isolering av et gen som koder for et enzym valgt fra gruppen bestående av a-amylase, protease, amyloglukosidase og glukoseisomerase fra en Bacillus mikroorganisme inn i en Bacillus verts-mikrooganisme av en annen art, ved at følgende trinn utføres: a) spalting av et bifunksjonelt plasmid som har evne til å replikere i både E. coli og B. subtilis, idet plasmidet inneholder minst to selekterbare markører, med en endonuklease for å fremstille et rettkjedet plasmidmolekyl;b) generering av DNA-fragmenter som inneholder genet og inkorporering av DNA-fragmentene i plasmidet ifølge (a) slik at innskuddsinaktiveringen av en av de selekterbare markørene for å fremstille en ikke-funksjonell markør oppstår, idet det forblir tilstede minst én funksjonell selekterbar markør for å fremstille en blanding inneholdende rekombinante hybridplasmider og som et biprodukt, de bifunksjonelle plasmidene ifølge (a); c) inkorporering av blandingen ifølge (b) inn i E. coli mikroorganismer som ikke har de selekterbare markørene ifølge (a) for å transformere nevnte E. coli; d) selektering av E. coli transformanter inneholdende nevnte plasmider ifølge (b) ved hjelp av den funksjonelle selekterbare markøren; e) identifisering av transformanter inneholdende nevnte rekombinante plasmider ved screening av nevnte transformanter ifølge (d) for nærvær av nevnte ikke-funksjonelle innskudds-inaktiverte markør, f) ekstrahering av plasmid DNA fra nevnte E. coli transformanter ifølge (e), g) transformering av nevnte Bacillus verts-mikroorganismer som ikke inneholder de selekterbare markørene ifølge (a) med nevnte plasmid DNA fra (f); h) selektering av nevnte Bacillus vertstransformanter inneholdende rekombinante plasmider ved hjelp av nevnte funksjonelle selekterbare markør, karakterisert vedi) screening av nevnte Bacillus verts-mikroorganismer valgt i trinn (h) ved belegging av en steril semipermeabel membran på overflaten av et agarmedium inneholdende en forbindelse som kan bli omsatt med nevnte enzym, dyrking av nevnte transformerte mikroorganismer på nevnte membran og muliggjøre at nevnte enzym går inn i nevnte agar mens de transformert mikroorganismene blir holdt igjen på membranene, fjerning av nevnte membran fra agaroverflaten, og kontakting av agaren med en forbindelse som fremstiller en påvisbar reaksjon mellom enzymet og forbindelsen, og j) isolering derifra en Bacillus verts-mikroorganisme som kan fremstille nevnte enzym kodet av genet på plasmidet.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den selekterbare markøren omfatter antibiotisk resistens eller en vekstfaktor.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at Bacillus verts-mikroorganismen velges fra gruppen bestående av B. subtilis, B. licheniformis og B. amyloli-quifaceins.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at plasmidet som anvendes er pHV33 (ATCC 39217).

5. Fremgangsmåte for kloning og isolering av et a-amylasegen fra en Bacillus mikroorganisme inn i en Bacillus verts-mikroorganisme fra en annen art, ved at følgende trinn utføres: a) spalting av et bifunksjonelt plasmid som kan replikere i både E. coli og B. subtilis, idet plasmidet inneholder minst to selekterbare markører med en endonuklease for å fremstille et rettkjedet plasmidmolekyl, b) generering av DNA-fragmenter inneholdende nevnte gen og inkorporering av nevnte DNA-fragmenter inn i nevnte plasmid ifølge (a) slik at innskuddsinaktivering av en av nevnte selekterbare markører for å fremstille en ikke-funksjonell markør oppstår, idet det forblir tilstede minst én funksjonell selekterbar markør for å fremstille en blanding inneholdende rekombinante hybridplasmider, og som et biprodukt, nevnte bifunksjonelle plasmider ifølge (a), c) inkorporering av blandingen ifølge (b) inn i E. coli mikroorganismer, som ikke har nevnte selekterbare markører ifølge (a) for å transformere nevnte E. coli, d) selektering av E. coli transformanter, inneholdende nevnte plasmider ifølge (b) ved hjelp av nevnte funksjonelle selekterbare markør, e) identifisering av transformanter inneholdende nevnte rekombinante plasmider ved screening av nevnte transformanter ifølge (d) for nærvær av nevnte ikke-funksjonelle innskudds-inaktiverte markør, f) ekstrahering av plasmid DNA fra nevnte E. coli transformanter ifølge (e), g) transformering av nevnte Bacillus vertsorganismer som ikke inneholder nevnte selekterbare markører ifølge (a) med nevnte plasmid DNA fra (f); h) selektering av nevnte Bacillus verts-transformanter inneholdende rekombinante plasmider ved hjelp av nevnte funksjonelle selekterbare markør, karakterisert vedi) screening av nevnte transformerte Bacillus verts-mikroorganismer valgt fra trinn (h) ved belegging av en steril semipermeabel membran på overflaten av et agarmedium inneholdende stivelse, dyrking av nevnte transformerte mikroorganismer på nevnte membran og muliggjøre at nevnte a-amylase går inn i nevnte agar mens nevnte transformerte mikroorganismer blir holdt tilbake på nevnte membran, fjerning av nevnte membran fra nevnte agaroverflate, kontakting av nevnte agar med et iod-inneholdende reagens og observering av en detekterbar reaksjon mellom a-amylase og stivelses-iod, og j) isolering derfra en Bacillus verts-mikroorganisme som kan produsere a-amylase.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at verts-mikroorganismen velges fra gruppen bestående av B. subtilis, B. licheniformis og B. amyoliquifaceins.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at plasmidet som anvendes er pHV33 (ATCC 39217).

8. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at den selekterbare markøren som anvendes omfatter antibiotikaresistens.

9. Fremgangsmåte for seleksjon av transformanter som koder for et enzym valgt fra gruppen bestående av a-amylase, protease, amyloglukosidase og glukoseisomerase fra en Bacillus mikroorganisme inn i en Bacillus verts-mikroorganisme av en annen art, karakterisert ved at i) screening av nevnte Bacillus verts-mikroorganismer utføres ved belegging av en steril semipermeabel membran på overflaten av et agarmedium inneholdende en forbindelse som kan bli omsatt med nevnte enzym, dyrking av nevnte transformerte mikoorganismer på nevnte membran og muliggjøre at nevnte enzym går inn i nevnte agar mens de transformerte mikroorganismene blir holdt igjen på membranen, fjerning av nevnte membran fra agaroverflaten og kontakting av agaren med en forbindelse som fremstiller en påvisbar reaksjon mellom enzymet og forbindelsen.