JPH0829083B2 - 中性プロテア−ゼの産生法 - Google Patents
中性プロテア−ゼの産生法Info
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- JPH0829083B2 JPH0829083B2 JP60230887A JP23088785A JPH0829083B2 JP H0829083 B2 JPH0829083 B2 JP H0829083B2 JP 60230887 A JP60230887 A JP 60230887A JP 23088785 A JP23088785 A JP 23088785A JP H0829083 B2 JPH0829083 B2 JP H0829083B2
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- bacillus subtilis
- neutral protease
- dna
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
- C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、分子生物学の分野に属し、特には遺伝子
工学技術により大量の蛋白を産生する株の形成に関す
る。
工学技術により大量の蛋白を産生する株の形成に関す
る。
更に詳細には、外分泌性の中性プロテアーゼの産生法
に関する。その特徴は、中性プロテアーゼをコードする
遺伝子を含む組換体ハイブリドプラスミドを形成するこ
と、枯草菌の変異株を調製すること、前記ハイブリドプ
ラスミドを前記変異株に導入すること、前記ハイブリド
プラスミドを含むコローンを単離すること、好気条件下
で液体培地中にてクローンを増殖させること、および培
地から中性プロテアーゼを単離することである。
に関する。その特徴は、中性プロテアーゼをコードする
遺伝子を含む組換体ハイブリドプラスミドを形成するこ
と、枯草菌の変異株を調製すること、前記ハイブリドプ
ラスミドを前記変異株に導入すること、前記ハイブリド
プラスミドを含むコローンを単離すること、好気条件下
で液体培地中にてクローンを増殖させること、および培
地から中性プロテアーゼを単離することである。
産業上、例えば食料および化学工業の分野特に界面活
性剤の製造の面で、細菌起源の中性プロテアーゼを使用
することは周知である。発酵によりこれらの酵素を産生
させることも知られている。その発酵法とは、酵素をコ
ードする遺伝子を天然に含む微生物を、適当な培地中で
増殖させることである。プロテアーゼを産生する微生物
中ではパチルス（Bacillus）属に属するものが特に興味
がある。これら既知の方法は、数多くの段階を踏まなけ
ればならず、とりわけ回収率が低いため好ましいとは言
えない。
性剤の製造の面で、細菌起源の中性プロテアーゼを使用
することは周知である。発酵によりこれらの酵素を産生
させることも知られている。その発酵法とは、酵素をコ
ードする遺伝子を天然に含む微生物を、適当な培地中で
増殖させることである。プロテアーゼを産生する微生物
中ではパチルス（Bacillus）属に属するものが特に興味
がある。これら既知の方法は、数多くの段階を踏まなけ
ればならず、とりわけ回収率が低いため好ましいとは言
えない。
組換えDNA技術の出現に伴なって、今や多量の蛋白を
産生する微生物をつくり出せるようになっている。米国
特許第4237224によれば、特定の蛋白をコードする遺伝
子が供与体株から単離され、ベクターと呼ばれる特殊な
DNAの使用により適当な宿主細胞へ導入された。遺伝子
工学の実験に使用されるベクター分子は、宿主細胞中で
自律的に複製し得る。その結果、一般的に30ないし50コ
ピーが末端に存在するようになる。外来遺伝子がベクタ
ーに挿入され、修飾されたベクター（すなわち組換体ハ
イブリドプラスミド）が宿主細胞に導入されると、細胞
内での遺伝子のコピー数はベクターのそれと等しくな
る。この結果、「遺伝子量」として知られる現象により
クローニング産物の合成が高まる。
産生する微生物をつくり出せるようになっている。米国
特許第4237224によれば、特定の蛋白をコードする遺伝
子が供与体株から単離され、ベクターと呼ばれる特殊な
DNAの使用により適当な宿主細胞へ導入された。遺伝子
工学の実験に使用されるベクター分子は、宿主細胞中で
自律的に複製し得る。その結果、一般的に30ないし50コ
ピーが末端に存在するようになる。外来遺伝子がベクタ
ーに挿入され、修飾されたベクター（すなわち組換体ハ
イブリドプラスミド）が宿主細胞に導入されると、細胞
内での遺伝子のコピー数はベクターのそれと等しくな
る。この結果、「遺伝子量」として知られる現象により
クローニング産物の合成が高まる。
周知のことではあるが、DNAは細胞内でRNAポリメラー
ゼによりmRNAに転写され、続いて、これがリボソーム上
で蛋白に翻訳される。特定遺伝子のコピー数が増加し
て、細胞の転写および翻訳の効率が高まれば、遺伝子産
物の産生もそれに伴って増大する。
ゼによりmRNAに転写され、続いて、これがリボソーム上
で蛋白に翻訳される。特定遺伝子のコピー数が増加し
て、細胞の転写および翻訳の効率が高まれば、遺伝子産
物の産生もそれに伴って増大する。
従って、この発明の主題はａ）中性プロテアーゼをコ
ードする遺伝子を含む組換体ハイブリドプラスミドを構
成し、 ｂ） 枯草菌の突然変異株を調製し、 ｃ）前記組換体ハイブリドプラスミドを前記突然変異体
中に導入し、 ｄ）ハイブリドプラスミドを含むクローンを単離し、 ｅ）前記クローンを液体培地中で培養し、 ｆ）前記培地中から中性プロテアーゼを単離する工程か
ら成ることを特徴とする中性プロテアーゼの産生法であ
る。
ードする遺伝子を含む組換体ハイブリドプラスミドを構
成し、 ｂ） 枯草菌の突然変異株を調製し、 ｃ）前記組換体ハイブリドプラスミドを前記突然変異体
中に導入し、 ｄ）ハイブリドプラスミドを含むクローンを単離し、 ｅ）前記クローンを液体培地中で培養し、 ｆ）前記培地中から中性プロテアーゼを単離する工程か
ら成ることを特徴とする中性プロテアーゼの産生法であ
る。
この発明によれば、組換体ハイブリッドプラスミドは
天然に存在する供与体微生物からDNAを用いて既知の方
法により調整される。その微生物は、天然の中性プロテ
アーゼをコードする遺伝子を含んでいるものである。従
って、この発明の特徴はア）クロモゾームDNAを供与体
微生物から単離および精製し、 イ）前記DNAを制限酵素で部分的に切断し、 ウ）適当な長さ1.5ないし４×103塩基対のクロモゾーム
DNAのフラグメントを単離し、 エ）あるプラスミドを特異的制限酵素で切断し、DNAフ
ラグメントのそれと同一の粘着末端を形成し、 オ）ウ）段階で得られたDNAフラグメントとエ）段階で
得られた直鎖DNAとをリガーゼにより結合して、組換体
ハイブリドプラスミドを調製することである。
天然に存在する供与体微生物からDNAを用いて既知の方
法により調整される。その微生物は、天然の中性プロテ
アーゼをコードする遺伝子を含んでいるものである。従
って、この発明の特徴はア）クロモゾームDNAを供与体
微生物から単離および精製し、 イ）前記DNAを制限酵素で部分的に切断し、 ウ）適当な長さ1.5ないし４×103塩基対のクロモゾーム
DNAのフラグメントを単離し、 エ）あるプラスミドを特異的制限酵素で切断し、DNAフ
ラグメントのそれと同一の粘着末端を形成し、 オ）ウ）段階で得られたDNAフラグメントとエ）段階で
得られた直鎖DNAとをリガーゼにより結合して、組換体
ハイブリドプラスミドを調製することである。
この目的に適した供与体微生物はバチルス属に属する
ものである。この中でも枯草菌（B.subtilis）が好まし
い。特に好ましい株は、枯草菌BGSC（米国、オハイオ
州、バチルス遺伝子貯蔵センターから入手）である。こ
の細菌はそのクロモゾーム上に中性プロテアーゼをコー
ドしている遺伝子を有する。この株のクロモゾームDNA
を、既知の方法のどれか１つの方法により単離、精製す
る。得られたDNAを、続いて特異的制限酵素により消化
させる。制限酵素MboIが特に好ましい。
ものである。この中でも枯草菌（B.subtilis）が好まし
い。特に好ましい株は、枯草菌BGSC（米国、オハイオ
州、バチルス遺伝子貯蔵センターから入手）である。こ
の細菌はそのクロモゾーム上に中性プロテアーゼをコー
ドしている遺伝子を有する。この株のクロモゾームDNA
を、既知の方法のどれか１つの方法により単離、精製す
る。得られたDNAを、続いて特異的制限酵素により消化
させる。制限酵素MboIが特に好ましい。
クロモゾームDNAの部分消化により、様々な大きさの
フラグメントが生じる。この中から、目的の遺伝子を含
む1.5ないし４×103塩基対のフラグメントを、ショ糖密
度勾配法により単離する。宿主微生物に有効に入るどの
ようなベクターでも、この発明の組換体ハイブリドプラ
スミドを形成することができる。このようなプラスミド
は、ベクターにマーカーがあれば容易に固定することが
できる。抗生物質に耐性を示すマーカーを含むベクター
が特に好ましい。このベクターのうち、黄色ブドウ球菌
から単離されたプラスミドが好ましいが、これらのうち
カナマイシン耐性を示す遺伝子を含むプラスミドpUB−1
10（BGSC 1E6）が好ましい。前記プラスミドは制限酵素
BamHIにより切断され、粘着末端を生じる。これは制限
酵素MboIにより生じる末端と同じであり、続いてこれら
を結合させることができる。この発明によれば、５）段
階の反応すなわち一定の長さのDNAフラグメントと直線
プラスミドpUB−110との結合反応は、リガーゼ存在下で
既知の方法により実施する。この目的に適するリガーゼ
として、市販のT4DNAリガーゼが挙げられる。反応を上
記の条件下で進め、組換体ハイブリドプラスミドを得
る。続いて、これを用いて適当な微生物の宿主細胞を形
質転換する。この発明によれば、この目的に特に適する
宿主細胞として、枯草菌BGSC 1A341の突然変異から得ら
れるものが挙げられる。
フラグメントが生じる。この中から、目的の遺伝子を含
む1.5ないし４×103塩基対のフラグメントを、ショ糖密
度勾配法により単離する。宿主微生物に有効に入るどの
ようなベクターでも、この発明の組換体ハイブリドプラ
スミドを形成することができる。このようなプラスミド
は、ベクターにマーカーがあれば容易に固定することが
できる。抗生物質に耐性を示すマーカーを含むベクター
が特に好ましい。このベクターのうち、黄色ブドウ球菌
から単離されたプラスミドが好ましいが、これらのうち
カナマイシン耐性を示す遺伝子を含むプラスミドpUB−1
10（BGSC 1E6）が好ましい。前記プラスミドは制限酵素
BamHIにより切断され、粘着末端を生じる。これは制限
酵素MboIにより生じる末端と同じであり、続いてこれら
を結合させることができる。この発明によれば、５）段
階の反応すなわち一定の長さのDNAフラグメントと直線
プラスミドpUB−110との結合反応は、リガーゼ存在下で
既知の方法により実施する。この目的に適するリガーゼ
として、市販のT4DNAリガーゼが挙げられる。反応を上
記の条件下で進め、組換体ハイブリドプラスミドを得
る。続いて、これを用いて適当な微生物の宿主細胞を形
質転換する。この発明によれば、この目的に特に適する
宿主細胞として、枯草菌BGSC 1A341の突然変異から得ら
れるものが挙げられる。
得られた突然変異体は、SMS108と呼ばれるが、２つの
基本的な性質を有する。
基本的な性質を有する。
１）ゲノム中に中性プロテアーゼの構造遺伝子に突然変
異が起きている。
異が起きている。
２）枯草菌中で対応する組換が起きないようなrecE4突
然変異が生じている。
然変異が生じている。
中性プロテアーゼの構造遺伝子に突然変異が生じる
と、中性プロテアーゼマイナスゲノタイプ（npr-）とな
る。これは、その株が中性プロテアーゼをコードする遺
伝子を含む組換体ハイブリドプラスミドにより形質転換
されたとき、容易にその株を同定することができること
を意味する。
と、中性プロテアーゼマイナスゲノタイプ（npr-）とな
る。これは、その株が中性プロテアーゼをコードする遺
伝子を含む組換体ハイブリドプラスミドにより形質転換
されたとき、容易にその株を同定することができること
を意味する。
微生物の染色体遺伝子をクローニングするには、方法
の１つとして「ショトガン法」として知られるものが使
用される。この方法は、制限酵素で染色体DNAを切断
し、得られたフラグメントを適当な制限酵素で切断され
たベクターであるプラスミドにT4 DNAリガーゼを用いて
結合させるものである。この方法によれば、プラスミド
DNAと１つ以上の染色体DNA断片により構成される多数の
ハイブリド分子が得られる。
の１つとして「ショトガン法」として知られるものが使
用される。この方法は、制限酵素で染色体DNAを切断
し、得られたフラグメントを適当な制限酵素で切断され
たベクターであるプラスミドにT4 DNAリガーゼを用いて
結合させるものである。この方法によれば、プラスミド
DNAと１つ以上の染色体DNA断片により構成される多数の
ハイブリド分子が得られる。
前記の分子を宿主細胞に挿入することにより単離す
る。挿入は、既知の方法により、ハイブリドプラスミド
を微生物細胞すなわち前記宿主細胞に接触させることに
より行なうことができる。プラスミドDNAは、細胞壁お
よび細胞膜を通過し、細胞質に入る。そこで機能を発現
する。このような場合を細胞の形質転換という。プラス
ミドによる形質転換の効率は低く、平均してただ１つの
組換体ハイブリドプラスミドが、単一細胞の中で機能す
るようになる。このようにして、単一の組換体ハイブリ
ドプラスミドを有し、固体培地中でコロニーを形成し得
る細胞集団を得ることができる。目的の遺伝子含むコロ
ニーの同定が簡単であればあるほど、選択テストはより
効果的でかつ迅速になる。
る。挿入は、既知の方法により、ハイブリドプラスミド
を微生物細胞すなわち前記宿主細胞に接触させることに
より行なうことができる。プラスミドDNAは、細胞壁お
よび細胞膜を通過し、細胞質に入る。そこで機能を発現
する。このような場合を細胞の形質転換という。プラス
ミドによる形質転換の効率は低く、平均してただ１つの
組換体ハイブリドプラスミドが、単一細胞の中で機能す
るようになる。このようにして、単一の組換体ハイブリ
ドプラスミドを有し、固体培地中でコロニーを形成し得
る細胞集団を得ることができる。目的の遺伝子含むコロ
ニーの同定が簡単であればあるほど、選択テストはより
効果的でかつ迅速になる。
特に、中性プロテアーゼの遺伝子を含む組換体ハイブ
リドプラスミドの入った形質転換コロニーの同定を容易
にするために、構造遺伝子に突然変異が起きているので
中性プロテアーゼを産生し得ない枯草菌1A341の突然変
異株を用いれば有利であると考えられている。細菌の増
殖に必要な成分にカゼインを加えた固型培地上で増殖す
るこの突然変異株のコロニーは、肉眼で見える典型的な
ハローを形成しない。一方、親株BGSC1A341のコロニー
の回りにはハローが形成される。突然変異株がカゼイン
分解活性を欠くということは、中性プロテアーゼをコー
ドする遺伝子に機能的な欠陥があるということである。
リドプラスミドの入った形質転換コロニーの同定を容易
にするために、構造遺伝子に突然変異が起きているので
中性プロテアーゼを産生し得ない枯草菌1A341の突然変
異株を用いれば有利であると考えられている。細菌の増
殖に必要な成分にカゼインを加えた固型培地上で増殖す
るこの突然変異株のコロニーは、肉眼で見える典型的な
ハローを形成しない。一方、親株BGSC1A341のコロニー
の回りにはハローが形成される。突然変異株がカゼイン
分解活性を欠くということは、中性プロテアーゼをコー
ドする遺伝子に機能的な欠陥があるということである。
この発明において、これらの突然変異細胞が形質転換
過程に用いられると、その中に中性プロテアーゼをコー
ドする遺伝子を含む組換体ハイブリドプラスミドが存在
するかは、カゼインを含む固型培地の上でコロニーの回
りにハローが現われるかどうかで分かる。
過程に用いられると、その中に中性プロテアーゼをコー
ドする遺伝子を含む組換体ハイブリドプラスミドが存在
するかは、カゼインを含む固型培地の上でコロニーの回
りにハローが現われるかどうかで分かる。
親株である枯草菌BGSC 1A341を突然変異させること
は、当該分野で知られている突然変異誘起物質のどれか
１つで処理すればよい。特に、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニト
ロ−ニトロソグアニジンを用いるのがよい。該化合物で
の処理は、37℃にて約30分間緩衝液（pH6.0）中で行な
う。表現型として中性プロテアーゼが現われない遺伝子
突然変異は、形質転換によって枯草菌SMS003の細胞に伝
達される。このようにしてnpr-を得る。枯草菌SMS003株
は、フェデラル・リサーチ・コレクション、ノース・セ
ントラル・リージョン、ノーザン・リージョナル・リサ
ーチ・センサ（the Federal Research Collection,Noet
h Central Region,Northern Regional Research Cente
r）（イリノイ州、ペオリア）に1984年９月４日、番号N
NRL−Ｂ−15897として寄託された。
は、当該分野で知られている突然変異誘起物質のどれか
１つで処理すればよい。特に、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニト
ロ−ニトロソグアニジンを用いるのがよい。該化合物で
の処理は、37℃にて約30分間緩衝液（pH6.0）中で行な
う。表現型として中性プロテアーゼが現われない遺伝子
突然変異は、形質転換によって枯草菌SMS003の細胞に伝
達される。このようにしてnpr-を得る。枯草菌SMS003株
は、フェデラル・リサーチ・コレクション、ノース・セ
ントラル・リージョン、ノーザン・リージョナル・リサ
ーチ・センサ（the Federal Research Collection,Noet
h Central Region,Northern Regional Research Cente
r）（イリノイ州、ペオリア）に1984年９月４日、番号N
NRL−Ｂ−15897として寄託された。
本発明によれば、突然変異種npr-は枯草菌において同
種組換えを防止するrecE4突然変異の導入によりさらに
修飾される。枯草菌の細胞中に外生DNAを導入したと
き、これが染色体DNAと同種の領域を有するとき、recE
遺伝子生産物の存在下で組換えされ易くなる。
種組換えを防止するrecE4突然変異の導入によりさらに
修飾される。枯草菌の細胞中に外生DNAを導入したと
き、これが染色体DNAと同種の領域を有するとき、recE
遺伝子生産物の存在下で組換えされ易くなる。
この組換えは外生DNA断片の細胞ゲノムへの挿入を生
じさせる。
じさせる。
枯草菌recE+の細胞を形質転換させるのに使われるプ
ラスミド中に同種DNA断片が挿入されると、このプラス
ミドは組換えにより、このDNA断片を放出することがで
きる。
ラスミド中に同種DNA断片が挿入されると、このプラス
ミドは組換えにより、このDNA断片を放出することがで
きる。
しかし、rec−Ｅ遺伝子の機能が宿主細胞中で破壊さ
れた場合は同種DNAは雑種（ハイブリド）DNAの分子上に
保持され、染色体DNAから分離されたままとなる。した
がって、この発明により同種組換えを防止するrecE4突
然変異を突然変異種SMS003npr-中に導入することが極め
て有利であることが見出された。
れた場合は同種DNAは雑種（ハイブリド）DNAの分子上に
保持され、染色体DNAから分離されたままとなる。した
がって、この発明により同種組換えを防止するrecE4突
然変異を突然変異種SMS003npr-中に導入することが極め
て有利であることが見出された。
recE4突然変異体は枯草菌種BGSC1A46の染色体DNAから
公知の方法により分離され、そののち形質転換により突
然変異種SMS003に導入される。
公知の方法により分離され、そののち形質転換により突
然変異種SMS003に導入される。
この得られた種は“his",“leu",“met",recE4,npr-
マーカーで特徴づけられ、SMS108として指名されて、寄
託番号NNRL−Ｂ−15898を以って1984年９月４日付けで
北部地区リサーチセンタのFederal Research Collectio
n（ペオリア、イリノイ州、米国）に寄託されている。
マーカーで特徴づけられ、SMS108として指名されて、寄
託番号NNRL−Ｂ−15898を以って1984年９月４日付けで
北部地区リサーチセンタのFederal Research Collectio
n（ペオリア、イリノイ州、米国）に寄託されている。
本発明によれば上述のようにして得られた雑種組換型
プラスミドはステージ（ｃ）において、文献Mol.Gen.Ge
net.167，（1979），第251〜258頁（S.Contenteおよび
D.Dubnau）に記載された方法により被感染能力をもたせ
た枯草菌SMS108の細胞中に導入される。
プラスミドはステージ（ｃ）において、文献Mol.Gen.Ge
net.167，（1979），第251〜258頁（S.Contenteおよび
D.Dubnau）に記載された方法により被感染能力をもたせ
た枯草菌SMS108の細胞中に導入される。
中性プロテアーゼについての遺伝子を持ったクローン
はカナマイシンおよびカゼインを添加して適当な培養媒
体（培地）を有するプレート上にて選択される。
はカナマイシンおよびカゼインを添加して適当な培養媒
体（培地）を有するプレート上にて選択される。
この方法によればカナマイシンに対する抵抗について
の決定素を有する雑種組換型プラスミドを含む細胞のみ
を得ることができ、これからハロの存在で特定できる
（第１図参照）中性プロテアーゼについての遺伝子を有
する細胞を容易に分離することができる。の中性プロテ
アーゼについての遺伝子を含む雑種組換型プラスミドは
ついでハロにより囲まれた２つのクローンから分離され
る。このプラスミドはpSM126およびpSM127として指名さ
れ、第２図に示す如き制限酵素切断地図を示す。
の決定素を有する雑種組換型プラスミドを含む細胞のみ
を得ることができ、これからハロの存在で特定できる
（第１図参照）中性プロテアーゼについての遺伝子を有
する細胞を容易に分離することができる。の中性プロテ
アーゼについての遺伝子を含む雑種組換型プラスミドは
ついでハロにより囲まれた２つのクローンから分離され
る。このプラスミドはpSM126およびpSM127として指名さ
れ、第２図に示す如き制限酵素切断地図を示す。
枯草菌SMS108（pSM126）および枯草菌108（pSM127）
と指名された上記プラスミドを分離させる細胞はそれぞ
れ寄託番号NNRL−Ｂ−15899およびNNRL−Ｂ−15900を以
って1984年９月４日付けで北部地区リサーチセンタのFe
deral Research Collection（ペオリア、イリノイ州、
米国）に寄託されている。
と指名された上記プラスミドを分離させる細胞はそれぞ
れ寄託番号NNRL−Ｂ−15899およびNNRL−Ｂ−15900を以
って1984年９月４日付けで北部地区リサーチセンタのFe
deral Research Collection（ペオリア、イリノイ州、
米国）に寄託されている。
これらSMS108（pSM126）およびSMS108（pSM127）につ
いて炭素源、窒素源、鉱物塩類の存在下、37℃で、液状
培養培地中、好気性条件下で中性プロテアーゼが高収率
で得られるまで育成される。この培養培地に用いられる
炭素源としては同化性のものであれば特に制限はない。
いて炭素源、窒素源、鉱物塩類の存在下、37℃で、液状
培養培地中、好気性条件下で中性プロテアーゼが高収率
で得られるまで育成される。この培養培地に用いられる
炭素源としては同化性のものであれば特に制限はない。
同じく窒素源としては有機および無機アンモニウム
塩、たとえば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝
酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、こはく酸アンモニ
ウム、尿素等を通常用いることができる。さらに上記無
機質塩類としてはりん酸カリウム、りん酸ナトリウム、
硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム、硫酸第一鉄、硫酸
マグネシウム、硫酸亜鉛等を用いることができる。
塩、たとえば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝
酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、こはく酸アンモニ
ウム、尿素等を通常用いることができる。さらに上記無
機質塩類としてはりん酸カリウム、りん酸ナトリウム、
硫酸マグネシウム、炭酸カルシウム、硫酸第一鉄、硫酸
マグネシウム、硫酸亜鉛等を用いることができる。
これら塩類の使用量は通常の発酵プロセスにおいて用
いられる程度でよい。本発明において好ましい培養培地
はVY（veal infusion broth）（ディフコ社）であり、
これにイースト抽出物（ディフコ社）が添加される。
いられる程度でよい。本発明において好ましい培養培地
はVY（veal infusion broth）（ディフコ社）であり、
これにイースト抽出物（ディフコ社）が添加される。
発酵反応の終りにおいて、細胞は反応雰囲気から、ろ
過又は遠心分離により取り除かれ、得られた中性プロテ
アーゼは上澄液中において、H.Vheara等の方法（J.Bact
eriol,119,82−91,1971）により酵素活性の測定により
決定される。SMS108（pSM126）およびSMS108（pSM127）
について得られた値はそれぞれ1895（単位/ml）および2
097（単位/ml）であった。
過又は遠心分離により取り除かれ、得られた中性プロテ
アーゼは上澄液中において、H.Vheara等の方法（J.Bact
eriol,119,82−91,1971）により酵素活性の測定により
決定される。SMS108（pSM126）およびSMS108（pSM127）
について得られた値はそれぞれ1895（単位/ml）および2
097（単位/ml）であった。
この上澄液の画分をドデシル硫酸ナトリウム（SDS）
−ポリアクリルアミドのゲル上での分析をLaemnli U.K.
（Nature 277,680（1970））の方法でおこなった結果、
これら双方の種について、枯草菌BGSC 1A341により得ら
れる中性プロテアーゼのものと同等の分子量、MW 39,00
0を有するタンパク質の存在を示した。
−ポリアクリルアミドのゲル上での分析をLaemnli U.K.
（Nature 277,680（1970））の方法でおこなった結果、
これら双方の種について、枯草菌BGSC 1A341により得ら
れる中性プロテアーゼのものと同等の分子量、MW 39,00
0を有するタンパク質の存在を示した。
この中性プロテアーゼのコードを示す遺伝子のヌクレ
オチド連鎖が本発明により決定された。この分析はプラ
スミドpSM127中に存在する中性プロテアーゼについての
遺伝子の制限断片A,B,C（第２図）をベクターM13mp8お
よびM13mp9（New England Nuclearから得られたもの）
中に挿入し、F.Sanger等（PNAS74,5463−5467,1977）の
方法およびM,Poncz等（PNAS79,4298−4302,1982）の手
法により連鎖させることによりおこなわれた。
オチド連鎖が本発明により決定された。この分析はプラ
スミドpSM127中に存在する中性プロテアーゼについての
遺伝子の制限断片A,B,C（第２図）をベクターM13mp8お
よびM13mp9（New England Nuclearから得られたもの）
中に挿入し、F.Sanger等（PNAS74,5463−5467,1977）の
方法およびM,Poncz等（PNAS79,4298−4302,1982）の手
法により連鎖させることによりおこなわれた。
枯草菌の細胞外中性プロテアーゼの最初の16のアミノ
酸の末端アミノ連鎖について、P.MantsalaおよびH.Zalk
inはJ.Bacteriol,14,493−501（1980）において、Ala−
Ala−Ala−Thr−Gly−Ser−Gly−thr−Thr−Leu−Lys−
Gly−Ala−Thr−Val−Proであると報告している。
酸の末端アミノ連鎖について、P.MantsalaおよびH.Zalk
inはJ.Bacteriol,14,493−501（1980）において、Ala−
Ala−Ala−Thr−Gly−Ser−Gly−thr−Thr−Leu−Lys−
Gly−Ala−Thr−Val−Proであると報告している。
本発明者等が決定したヌクレオチド連鎖（第３図に示
す）をこのデータと比較すると、この中性プロテアーゼ
中の16のアミノ酸の連鎖が上記DNAから得られたタンパ
ク質中においてアミノ酸残基222から始まる部分に存在
することが理解できる。このことは本発明者等がクロー
ン培養し、枯草菌SMS108として表わした遺伝子が中性プ
ロテアーゼのものであることを示唆している。この酵素
は枯草菌SMS108により先駆物質の形で合成され、のちに
221−222の位置で切断され、成熟したプロテアーゼとす
ることができる。
す）をこのデータと比較すると、この中性プロテアーゼ
中の16のアミノ酸の連鎖が上記DNAから得られたタンパ
ク質中においてアミノ酸残基222から始まる部分に存在
することが理解できる。このことは本発明者等がクロー
ン培養し、枯草菌SMS108として表わした遺伝子が中性プ
ロテアーゼのものであることを示唆している。この酵素
は枯草菌SMS108により先駆物質の形で合成され、のちに
221−222の位置で切断され、成熟したプロテアーゼとす
ることができる。
実施例１ 突然変異種枯草菌SMS108の製造 中性プロテアーゼを形成する枯草菌BGSC 1A341の細胞
を37℃で一晩、攪拌下でVY培養培地100ml中で培養し
た。なお、このVY培養培地は予め120℃で15分間滅菌し
たものであって、下記組成のものであった。
を37℃で一晩、攪拌下でVY培養培地100ml中で培養し
た。なお、このVY培養培地は予め120℃で15分間滅菌し
たものであって、下記組成のものであった。
（組成） ・DIFCO子牛浸出液汁 25g/l （Veal Infusion broth） ・DIFCOイースト抽出液 5g/l ・H2O １ 得られた培養物を100倍量のVY培養培地で稀釈し、37
℃、攪拌下で育成させた。この育成ののち、分光光度計
（Perkin−Elmerモデル551S）を用い、光路1cm,1ml細胞
中における650nmでの光学密度（O.D.）を測定した。0.7
又は約0.7のO.D650の値で、培養物10mlをベックマン
（モデル4226）遠心分離機により5,000rpmで20分間遠心
分離した。ついで細胞を5mlのトリスマレート（TM）緩
衝液で洗った。なおこの緩衝液（１中）の組成は以下
の通りであった。
℃、攪拌下で育成させた。この育成ののち、分光光度計
（Perkin−Elmerモデル551S）を用い、光路1cm,1ml細胞
中における650nmでの光学密度（O.D.）を測定した。0.7
又は約0.7のO.D650の値で、培養物10mlをベックマン
（モデル4226）遠心分離機により5,000rpmで20分間遠心
分離した。ついで細胞を5mlのトリスマレート（TM）緩
衝液で洗った。なおこの緩衝液（１中）の組成は以下
の通りであった。
（組成） トリス 0.05M マレイン酸 0.05M (NH4)2SO4 1g MgSO4・7H2O 0.1g Ca(NO3)2 0.25mg FeSO4・7H2O 0.25mg pH6.0 次に、これをＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロ
ソグアニジン300μg/mlを含むTM緩衝液10ml中に再懸濁
させ、これを攪拌下、37℃にて30分間保った。
ソグアニジン300μg/mlを含むTM緩衝液10ml中に再懸濁
させ、これを攪拌下、37℃にて30分間保った。
反応の終点において、懸濁液を遠心分離し、細胞を5m
lのTMバッファーで洗浄し、そして50mlのVY培養培地中
に再懸濁させた。
lのTMバッファーで洗浄し、そして50mlのVY培養培地中
に再懸濁させた。
次に、懸濁液を1mlづつ50の部分に分割し、それぞれ
を攪拌しつつ37℃で１晩成長させた。次に、それぞれの
分割液に200μｌの無菌グリセロールを加え、ドライア
イス−エタノール浴中で冷凍した後−80℃に維持した。
を攪拌しつつ37℃で１晩成長させた。次に、それぞれの
分割液に200μｌの無菌グリセロールを加え、ドライア
イス−エタノール浴中で冷凍した後−80℃に維持した。
突然変異体を単離するために、種々の分割液を37℃に
昇温し、次いでスピツィーツエン（Spizizen）ミネラル
培地で稀釈し、それぞれの稀釈液を１あたり次の組成
を有する培地皿に入れた。
昇温し、次いでスピツィーツエン（Spizizen）ミネラル
培地で稀釈し、それぞれの稀釈液を１あたり次の組成
を有する培地皿に入れた。
DIFCO栄養液 8 g MgSO4・7H2O 0.25 g KCl 1 g DIFCO寒天 15 g FeSO4・7H2O 0.28 g MnCl2 1.25mg Ca(NO3)2 164mg カゼイン 10 g H2O １ 培養皿を48℃で１晩インキューベートして、ハローで
囲まれていないコロニーを選択した。選択された約13,0
00のコロニーの中で、わずか10のコロニーが中性プロテ
アーゼを産生しない突然変異体であることがわかった。
囲まれていないコロニーを選択した。選択された約13,0
00のコロニーの中で、わずか10のコロニーが中性プロテ
アーゼを産生しない突然変異体であることがわかった。
これらの突然変異体の１つは、SMS104と名づけられ
た。
た。
中性プロテアーゼ表現型に帰因する遺伝子突然変異
は、次いで形質転換によって、本発明者の研究所で単離
された菌株B.サブチリスSMS003のコンピテント細胞に転
換した。
は、次いで形質転換によって、本発明者の研究所で単離
された菌株B.サブチリスSMS003のコンピテント細胞に転
換した。
公知の方法で単離され、かつ実施例２に記載された菌
株SMS104の染色体DNAを、１μg/mlの濃度の、コンピテ
ントとされた菌株SMS003の細胞に加えた。次に適切な濃
度の形質転換混合物をカゼイン皿上に置いた。37℃で１
晩インキュベートした後、得られた500のコロニーのう
ちの１つは、カゼイン活性のハローに囲まれたものでは
なかった。突然変異RecE4をSMS107と命名されたこのク
ローンに導入した。B.サブチリスBGSC1A46（TrpC2,recE
4,Thr−５）の染色体DNAを抽出し、公知の方法で精製
し、濃度１μg/mlでSMS107のコンピテント細胞に形質転
換するために用いた。
株SMS104の染色体DNAを、１μg/mlの濃度の、コンピテ
ントとされた菌株SMS003の細胞に加えた。次に適切な濃
度の形質転換混合物をカゼイン皿上に置いた。37℃で１
晩インキュベートした後、得られた500のコロニーのう
ちの１つは、カゼイン活性のハローに囲まれたものでは
なかった。突然変異RecE4をSMS107と命名されたこのク
ローンに導入した。B.サブチリスBGSC1A46（TrpC2,recE
4,Thr−５）の染色体DNAを抽出し、公知の方法で精製
し、濃度１μg/mlでSMS107のコンピテント細胞に形質転
換するために用いた。
次いで形質転換混合物を50μg/mlのヒスチジンおよび
ロイシンが追加された最小の培地（スピツィ−ツエンミ
ネラル培地）に加えた。このようにして、メチオニンな
しで培地に生育可能なSMS107細胞が選別された。
ロイシンが追加された最小の培地（スピツィ−ツエンミ
ネラル培地）に加えた。このようにして、メチオニンな
しで培地に生育可能なSMS107細胞が選別された。
実施例２ 菌株B.サブチリスBGSC1A341の染色体DNAの単離および
精製 3lのアーレンメイヤー（Erlenmeyer）フラスコ中の１
のVY液体培養培地をB.サブチリスBGSC1A341の16時間
培地10mlを用いてインキュベートした。
精製 3lのアーレンメイヤー（Erlenmeyer）フラスコ中の１
のVY液体培養培地をB.サブチリスBGSC1A341の16時間
培地10mlを用いてインキュベートした。
懸濁液を激しく攪拌しつつ37℃に維持した。パーキン
エルマー（Perkin Elmer）モデル55ISのスペクトルホ
トメーターを用いて光学的密度（O.D.）の測定を行な
い、生育を確認した。この場合、1cmの光路で1mlの細胞
において650nmであった。OD650値が１のとき、モデルGS
3のローターを具備するソルバール（Sorvall）遠心分離
機により、培地を5,000rpmで20分間遠心分離した。次
に、細胞を0.1Mのテトラ酢酸エチレンジアミン（EDTA）
と0.05MのNaCl（pH6.9）の溶液10ml中に再懸濁し、その
後、この懸濁液に0.1MのEDTA、0.05MのNaCl（pH6.9）お
よび10mg/mlのリソジム（Boehringer Manheimから得ら
れた）を含む溶液1mlを加えた。
エルマー（Perkin Elmer）モデル55ISのスペクトルホ
トメーターを用いて光学的密度（O.D.）の測定を行な
い、生育を確認した。この場合、1cmの光路で1mlの細胞
において650nmであった。OD650値が１のとき、モデルGS
3のローターを具備するソルバール（Sorvall）遠心分離
機により、培地を5,000rpmで20分間遠心分離した。次
に、細胞を0.1Mのテトラ酢酸エチレンジアミン（EDTA）
と0.05MのNaCl（pH6.9）の溶液10ml中に再懸濁し、その
後、この懸濁液に0.1MのEDTA、0.05MのNaCl（pH6.9）お
よび10mg/mlのリソジム（Boehringer Manheimから得ら
れた）を含む溶液1mlを加えた。
懸濁液を攪拌しつつ37℃に30分間維持した。この期間
の終点でソジウムドデシツサルフェートの10％溶液1ml
を加え、懸濁液を65℃に10分間維持した。このようにし
て得た溶液に、あらかじめ0.15M NaClと0.015Mクエン酸
ナトリウムを含む溶液（SSC）中で37℃で30分間インキ
ュベートされたプロナーゼ（Boehringer Manheimから得
た）を加え、最終濃度1mg/mlとした。
の終点でソジウムドデシツサルフェートの10％溶液1ml
を加え、懸濁液を65℃に10分間維持した。このようにし
て得た溶液に、あらかじめ0.15M NaClと0.015Mクエン酸
ナトリウムを含む溶液（SSC）中で37℃で30分間インキ
ュベートされたプロナーゼ（Boehringer Manheimから得
た）を加え、最終濃度1mg/mlとした。
完全に清澄化するまで溶液を37℃に維持し、最終濃度
1MまでNaClを加えた。
1MまでNaClを加えた。
析出したDNAをガラス棒上に採取し、３容量部の冷エ
タノールを含む100mlのビーカー中に懸濁させた。次
に、DNAを10mlのSSC0.1Xに再懸濁させ、ゆるやかに攪拌
しつつ室温（20〜25℃）に１晩保った。
タノールを含む100mlのビーカー中に懸濁させた。次
に、DNAを10mlのSSC0.1Xに再懸濁させ、ゆるやかに攪拌
しつつ室温（20〜25℃）に１晩保った。
この期間の終了時に、スイ臓RNAse（10μg/ml）およ
びRNAse Tl（５μユニット/ml）を加え、混合物を37℃
で30分間インキュベートした。
びRNAse Tl（５μユニット/ml）を加え、混合物を37℃
で30分間インキュベートした。
混合物中に存在するタンパクをSSCで飽和した等量の
フェノールで２回抽出して除去し、DNAを含む溶液をSSC
バッファーに対し透析した。
フェノールで２回抽出して除去し、DNAを含む溶液をSSC
バッファーに対し透析した。
次に高分子量DNA（染色体DNA）を、1/10容量部の3MCH
3COONH4,1mMのEDTA（pH7.5）および0.54容量部にイソプ
ロパノールを加えることによって精製した。こうして得
たDNAを回収し、SSCバッファー中に再懸濁させて最終濃
度1mg/mlとし、４℃に維持した。
3COONH4,1mMのEDTA（pH7.5）および0.54容量部にイソプ
ロパノールを加えることによって精製した。こうして得
たDNAを回収し、SSCバッファー中に再懸濁させて最終濃
度1mg/mlとし、４℃に維持した。
実施例３ Mbolによる染色体DNAの部分消化およびそのフラクシ
ョネーション 実施例２に示す方法により得た染色体DNA100μｇを、
100ユニットの酵素Mbol（BRL）の存在下で、トリス−HC
l（pH7.4）,100mMのNaClおよび6mMのMgCl2の6mM溶液1ml
中に懸濁させた。
ョネーション 実施例２に示す方法により得た染色体DNA100μｇを、
100ユニットの酵素Mbol（BRL）の存在下で、トリス−HC
l（pH7.4）,100mMのNaClおよび6mMのMgCl2の6mM溶液1ml
中に懸濁させた。
37℃で30分間反応を実施し、次いでブロックし、10分
間温度を65℃に保った。
間温度を65℃に保った。
部分的に消化したDNAを含む溶液を３つに分割し、30m
Nのトリス−（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩
（トリス−HCl）（pH8.1）、10mMのEDTA,1MのNaClの存
在下で、プリフォームされた10−40％のサッカロース密
度勾配上に積層させ、そしてベックマン（Beckmann）型
SW27遠心分離機により25,000rpmで20時間遠心分離し
た。
Nのトリス−（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩
（トリス−HCl）（pH8.1）、10mMのEDTA,1MのNaClの存
在下で、プリフォームされた10−40％のサッカロース密
度勾配上に積層させ、そしてベックマン（Beckmann）型
SW27遠心分離機により25,000rpmで20時間遠心分離し
た。
種々の長さの染色体DNAのフラグメントを含む2mlのフ
ラクションを回収した。それぞれのフラクションを適切
な分子量標準を用いたアガローゼゲルにより分析し、個
々のフラクション中に存在するDNAフラグメントの長さ
を決定した。
ラクションを回収した。それぞれのフラクションを適切
な分子量標準を用いたアガローゼゲルにより分析し、個
々のフラクション中に存在するDNAフラグメントの長さ
を決定した。
1.5×103〜４×103塩基対（bp）の寸法を有するDNAフ
ラグメントを含むフラクションを一緒にし、等量の水で
稀釈した。この溶液に２容量部の水を加えた。溶液をド
ライアイス−エタノール浴（Ｔ＝−80℃）中で15分間維
持した。析出したDNAを10,000rpmで遠心分離して混合物
から分離した。
ラグメントを含むフラクションを一緒にし、等量の水で
稀釈した。この溶液に２容量部の水を加えた。溶液をド
ライアイス−エタノール浴（Ｔ＝−80℃）中で15分間維
持した。析出したDNAを10,000rpmで遠心分離して混合物
から分離した。
得たDNAを70％のエタノールで洗浄し、真空乾燥し
た。
た。
実施例４ 中性プロテアーゼのための遺伝子を含むハイブリッド
プラスミドの構造 カナマイシンに対する耐性のための決定物質を含む５
μｇのプラスミドpUB110（BGSC 1E6）を、6mMのトリス
−HCl（pH7.4）,100mMのNaClおよび6mMのMgCl2を含む50
μｌの溶液中で、限定酵素Bam HI（BRLにより供給）を
用いて、37℃で１時間直線状にした。
プラスミドの構造 カナマイシンに対する耐性のための決定物質を含む５
μｇのプラスミドpUB110（BGSC 1E6）を、6mMのトリス
−HCl（pH7.4）,100mMのNaClおよび6mMのMgCl2を含む50
μｌの溶液中で、限定酵素Bam HI（BRLにより供給）を
用いて、37℃で１時間直線状にした。
実施例３に示す方法で得た５μｇの1.5×103〜４×10
3b.p.の長さの染色体DNAフラグメントと上述のpUB 110
5μｇとを、20mMのトリス−HCl（pH7.6）,10mMのMgCl2,
10mMのジチオトレイトールおよび0.6mMのアデノシント
リフォスフェート（ATP）を含む溶液100μｌ中で混合
し、DNAリガーゼT4の10Uを用いてリンクさせた。混合物
を室温（20〜25℃）で３時間保持した。
3b.p.の長さの染色体DNAフラグメントと上述のpUB 110
5μｇとを、20mMのトリス−HCl（pH7.6）,10mMのMgCl2,
10mMのジチオトレイトールおよび0.6mMのアデノシント
リフォスフェート（ATP）を含む溶液100μｌ中で混合
し、DNAリガーゼT4の10Uを用いてリンクさせた。混合物
を室温（20〜25℃）で３時間保持した。
実施例５ B.サブチリスSMS108細胞の形質転換 B.サブチリスSMS108の細胞をデゥブナウ（Dubnau）他
（ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J.
Mol.Biol.）56,209−221,1971）の方法によって形質転
換させた。
（ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J.
Mol.Biol.）56,209−221,1971）の方法によって形質転
換させた。
実施例４と同様にして得た連結反応混合物20μｌを、
コンピテントの状態にされたB.サブチリスSMS108細胞1m
lを形質転換させるために用いた。
コンピテントの状態にされたB.サブチリスSMS108細胞1m
lを形質転換させるために用いた。
上記形質転換混合物を37℃で30分間保ち、実施例１に
組成が示されているガゼイン培地を含むプレート上に散
布した。
組成が示されているガゼイン培地を含むプレート上に散
布した。
上記プレートを37℃で16時間インキュベートした。こ
の時間の終りに、コロニーが生成し、そのいくつかはハ
ローによって取り囲まれていた。これらは、カナマイシ
ン耐性の決定基と、存在するカゼインの酵素加水分解を
誘起する細胞外中性プロテアーゼ用遺伝子とを有するハ
イブリドプラスミドを含有するB.サブチリスSMS108のコ
ロニーであった。130,000のトランスフォーマントのう
ち、12個がカゼイン分解（caseinolytic）活性のハロー
によって取り囲まれていた。
の時間の終りに、コロニーが生成し、そのいくつかはハ
ローによって取り囲まれていた。これらは、カナマイシ
ン耐性の決定基と、存在するカゼインの酵素加水分解を
誘起する細胞外中性プロテアーゼ用遺伝子とを有するハ
イブリドプラスミドを含有するB.サブチリスSMS108のコ
ロニーであった。130,000のトランスフォーマントのう
ち、12個がカゼイン分解（caseinolytic）活性のハロー
によって取り囲まれていた。
実施例６ 中性プロテアーゼをコードする遺伝子を含有するハイ
ブリドプラスミドの単離と特性決定 実施例５で得たカゼイン分解活性を有する２つのトラ
ンスフォーマントから、グリッツアン（Gryczan）他の
方法（ジャーナル・オブ・バクテリオロジー134,318,32
9−1978）によってバイブリドプラスミドpSM126およびp
SM127（この制限地図は第２図に示してある）を単離し
た。
ブリドプラスミドの単離と特性決定 実施例５で得たカゼイン分解活性を有する２つのトラ
ンスフォーマントから、グリッツアン（Gryczan）他の
方法（ジャーナル・オブ・バクテリオロジー134,318,32
9−1978）によってバイブリドプラスミドpSM126およびp
SM127（この制限地図は第２図に示してある）を単離し
た。
これらプラスミドは約2400の塩基対（bp）のDNAの共
通領域を有していた。こうして単離されたプラスミドB.
サブチリスSMS108のコンピテント細胞に別々に再導入し
た。
通領域を有していた。こうして単離されたプラスミドB.
サブチリスSMS108のコンピテント細胞に別々に再導入し
た。
この形質転換混合物を、37℃で30分間増殖させた後、
既に述べた組成を有するカゼイン培地を含むプレート上
に散布した。37℃で16時間保持した後、カナマイシン耐
性を有する全てのトランスフォーマントが蛋白分解活性
を有するハローによって取り囲まれていた。
既に述べた組成を有するカゼイン培地を含むプレート上
に散布した。37℃で16時間保持した後、カナマイシン耐
性を有する全てのトランスフォーマントが蛋白分解活性
を有するハローによって取り囲まれていた。
このことは、２つのハイブリドプラスミドpSM126およ
びpSM127上に細胞外プロテアーゼをコードする遺伝子が
存在することを証明するものである。
びpSM127上に細胞外プロテアーゼをコードする遺伝子が
存在することを証明するものである。
同一の実験において、B.サブチリスSMS108細胞をカナ
マイシン耐性決定基を有するプラスミドpUB110によって
形質転換させた。
マイシン耐性決定基を有するプラスミドpUB110によって
形質転換させた。
カゼインを含有する培地を含むプレート上に散布した
ところ、形質転換された細胞は37℃で16時間経過後、ハ
ローの形成は見られなかった。このことは、これらトラ
ンスフォーマントがカゼイン分解活性をコードする遺伝
子を持たないことを示している。
ところ、形質転換された細胞は37℃で16時間経過後、ハ
ローの形成は見られなかった。このことは、これらトラ
ンスフォーマントがカゼイン分解活性をコードする遺伝
子を持たないことを示している。
実施例７ B.サブチリスSMS108（pSM126）およびB.サブチリスSM
S108（pSM127）の産生および特性決定 VY培地10mlを収容する100mlエルレンマイヤーフラス
コ４個（このうち初めの３個にはカナマイシン５μg/ml
を加えてある）に、それぞれ、B.サブチリスSMS108（pS
M126）,SMS108（pSM127）,SMS108（pUB110），およびB.
サブチリスBGSC 1A341を接種した。これらフラスコを激
しく攪拌しながら37℃で24時間保持した。
S108（pSM127）の産生および特性決定 VY培地10mlを収容する100mlエルレンマイヤーフラス
コ４個（このうち初めの３個にはカナマイシン５μg/ml
を加えてある）に、それぞれ、B.サブチリスSMS108（pS
M126）,SMS108（pSM127）,SMS108（pUB110），およびB.
サブチリスBGSC 1A341を接種した。これらフラスコを激
しく攪拌しながら37℃で24時間保持した。
24時間後、遠心によって細胞を培地から取り出し、上
澄液を、2mMの酢酸カルシウムを含有する10mMのトリス
−HCl緩衝液（pH7.5）に対して４℃で24時間透析した。
澄液を、2mMの酢酸カルシウムを含有する10mMのトリス
−HCl緩衝液（pH7.5）に対して４℃で24時間透析した。
培養ブイヨン中の各株によって再生される酵素の活性
を測定するために、各上澄液100μｌを2mMの酢酸カルシ
ウムを含む10mMのトリス−HClの緩衝液（pH7.5）で適当
に稀釈し、50mMのトリス−HCl緩衝液中0.6％カゼイン溶
液（メルク）0.5mlと混合した。
を測定するために、各上澄液100μｌを2mMの酢酸カルシ
ウムを含む10mMのトリス−HClの緩衝液（pH7.5）で適当
に稀釈し、50mMのトリス−HCl緩衝液中0.6％カゼイン溶
液（メルク）0.5mlと混合した。
この混合物を37℃で30分間インキュベートした。加水
分解されなかったカゼインを、室温（20ないし25℃）で
30分間、0.11Mのトリクロロ酢酸、0.33Mの酢酸および0.
22Mの酢酸ナトリウムを含む溶液0.5mlを添加することに
よって沈殿させた。
分解されなかったカゼインを、室温（20ないし25℃）で
30分間、0.11Mのトリクロロ酢酸、0.33Mの酢酸および0.
22Mの酢酸ナトリウムを含む溶液0.5mlを添加することに
よって沈殿させた。
30分後、沈殿物を、10,000rpmで10分間の遠心によっ
て分離し、上澄液の吸光度を275nmで測定した（ペルキ
ン・エルマー・モデル551S分光光度計を使用）。
て分離し、上澄液の吸光度を275nmで測定した（ペルキ
ン・エルマー・モデル551S分光光度計を使用）。
プロテアーゼ単位は、上に述べた条件下、37℃で１分
以内に、１μｇのトリプシンと透過の275nmにおける吸
光度の増加を引き起す酵素の量として定義した。
以内に、１μｇのトリプシンと透過の275nmにおける吸
光度の増加を引き起す酵素の量として定義した。
個々の株によって産生されたプロテアーゼの特性決定
は、同一溶液中で、中性プロテアーゼを活性およびセエ
インプロテアーゼ活性を別々に測定することによってお
こなった。
は、同一溶液中で、中性プロテアーゼを活性およびセエ
インプロテアーゼ活性を別々に測定することによってお
こなった。
初めのものは、上澄液を5mMのEDTAの存在下、０℃で
１時間予めインキュベートすることによって抑制され
た。２番目のものは、上澄液を1mMのフェニルメチルス
ルホニルフルオリド（PSMF）の存在下、０℃で１時間維
持することによって抑制された。
１時間予めインキュベートすることによって抑制され
た。２番目のものは、上澄液を1mMのフェニルメチルス
ルホニルフルオリド（PSMF）の存在下、０℃で１時間維
持することによって抑制された。
種々の株についての上澄液の分析結果を表１に示す。
表１のデータから、本発明の株は、元の株よりも５〜
６倍の収率で中性プロテアーゼを産生することがわか
る。
６倍の収率で中性プロテアーゼを産生することがわか
る。
第１図はカゼイン（ディフコ社）を有するプレートを示
す図であって、この上に中性プロテアーゼをつくるコロ
ニーがハローで囲まれた状態と、この酵素を形成しない
コロニーがハローから開放されている状態を示す図、第
２図は雑種組換型プラスミドpSM126およびpSM127の制限
酵素切断地図を示す図、第３図は中性プロテアーゼのコ
ードを示す遺伝子のヌクレオチド連鎖を示す図（なお、
破線は細胞外中性プロテアーゼの末端アミノ酸16個の連
鎖を示している）である。
す図であって、この上に中性プロテアーゼをつくるコロ
ニーがハローで囲まれた状態と、この酵素を形成しない
コロニーがハローから開放されている状態を示す図、第
２図は雑種組換型プラスミドpSM126およびpSM127の制限
酵素切断地図を示す図、第３図は中性プロテアーゼのコ
ードを示す遺伝子のヌクレオチド連鎖を示す図（なお、
破線は細胞外中性プロテアーゼの末端アミノ酸16個の連
鎖を示している）である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:125） Ｃ１２Ｒ 1:125）
Claims (14)
- 【請求項１】ａ）枯草菌BGSG 1A341のクロモゾーム（染
色体）DNAから、下記配列を有する、中性プロテアーゼ
をコードする遺伝子を単離し、 ｂ）ａ）段階で得られた遺伝子を含む組換体ハイブリド
プラスミドを構成し、 ｃ）ｂ）段階の組換体ハイブリドプラスミドを、中性プ
ロテアーゼの構造遺伝子における突然変異およびrecE4
突然変異を有する枯草菌SMS108（NRRL−Ｂ−1598）に導
入し、得られたクローンを増殖させ、 ｄ）ｃ）段階で得られた、ハイブリドプラスミドを含む
クローンを単離し、 ｅ）ｄ）段階で得られたクローンを、中性プロテアーゼ
の産生が生じる条件下において液体培地中で培養し、か
つ ｆ）前記培地中から中性プロテアーゼを単離する、 工程を包含することを特徴とする枯草菌中性プロテアー
ゼの産生法。 - 【請求項２】Ａ）中性プロテアーゼを産生し得る枯草菌
BGSG 1A341株を突然変異誘起物質で処理し、 Ｂ）達成された遺伝子突然変異を枯草菌のある株に移入
し、かつ Ｃ）recE4突然変異を、Ｂ）段階で得られる形質転換枯
草菌株に導入する、 工程により突然変異が生じる特許請求の範囲第１項記載
の方法。 - 【請求項３】前記Ａ）段階の突然変異誘起物質が、Ｎ−
メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンである
特許請求の範囲第２項記載の方法。 - 【請求項４】前記Ｂ）段階で用いられる枯草菌株が、枯
草菌SMS003（NNRL−Ｂ−15897）である特許請求の範囲
第２項記載の方法。 - 【請求項５】前記Ｃ）段階でのrecE4突然変異の導入
を、recE4突然変異を有する遺伝子で形質転換すること
により行なう特許請求の範囲第２項記載の方法。 - 【請求項６】recE4突然変異を含有する遺伝子を、枯草
菌BGSC 1A46のクロモゾームDNAから単離する特許請求の
範囲第５項記載の方法。 - 【請求項７】前記ｃ）段階での組換体ハイブリドプラス
ミドの導入を、形質転換により行なう特許請求の範囲第
１項ないし第６項のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項８】前記ｄ）段階でのハイブリドプラスミドを
含むクローンの単離を、カナマイシンとカゼインが添加
された培地上に前記ｃ）段階で得られたクローンを播種
することによって行なう特許請求の範囲第１項ないし第
７項のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項９】前記ｃ）段階での増殖を、液体培地中、好
気条件下、窒素源、炭素源、鉱物塩の存在下にて20℃な
いし40℃の温度範囲で行なう特許請求の範囲第１項ない
し第８項のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１０】前記ｄ）段階で単離されたクローンが、
枯草菌SMS108（pSM126）（NNRL−Ｂ−15899）および枯
草菌SMS108（pSM127）（NNRL−Ｂ−15900）である特許
請求の範囲第１項ないし第９項のいずれか１項に記載の
方法。 - 【請求項１１】前記ｂ）段階の組換体ハイブリドプラス
ミドを、 ア）枯草菌BGSC 1A341からクロモゾームDNAを単離およ
び精製し、 イ）前記DNAを制限酵素MboIで部分的に切断し、 ウ）長さ1.5ないし４×103塩基対のクロモゾームDNAの
フラグメントを単離し、 エ）あるプラスミドを制限酵素で切断し、かつ オ）ウ）段階で得られたDNAフラグメントとエ）段階で
得られた切断プラスミドとを、T4 DNAリガーゼの存在下
において結合し、組換体ハイブリドプラスミドを得るこ
と、 により調製することを特徴とする特許請求の範囲第１項
ないし第10項のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１２】前記ウ）段階でのフラグメントの単離
を、ショ糖濃度勾配法により行なう特許請求の範囲第11
項記載の方法。 - 【請求項１３】前記エ）段階で用いられるプラスミドが
pUB110（BGSC 1E6）であり、制限酵素がBamHIである特
許請求の範囲第11項記載の方法。 - 【請求項１４】前記ｂ）段階のハイブリドプラスミド
が、枯草菌SMS108（pSM126）株から得られ、受付番号NR
RL−Ｂ−15899としてNRRLに寄託されているプラスミドp
SM126、または枯草菌SMS108（pSM127）から得られ、受
付番号NRRL−Ｂ−15900としてNRRLに寄託されているプ
ラスミドpSM127である特許請求の範囲第１項に記載の方
法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT23190A/84 | 1984-10-17 | ||
| IT23190/84A IT1176997B (it) | 1984-10-17 | 1984-10-17 | Procedimento per la produzione di proteasi neutra |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61181374A JPS61181374A (ja) | 1986-08-14 |
| JPH0829083B2 true JPH0829083B2 (ja) | 1996-03-27 |
Family
ID=11204709
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60230887A Expired - Lifetime JPH0829083B2 (ja) | 1984-10-17 | 1985-10-16 | 中性プロテア−ゼの産生法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0179025B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0829083B2 (ja) |
| AT (1) | ATE78870T1 (ja) |
| CA (1) | CA1285233C (ja) |
| DE (1) | DE3586410T2 (ja) |
| IT (1) | IT1176997B (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3484346D1 (de) * | 1983-12-28 | 1991-05-02 | Agency Ind Science Techn | Dns-basensequenz enthaltende regionen einbegriffen in der herstellung und sekretion eines proteins, rekombinante dns das ganze oder einen teil der dns-basensequenz enthaltend und verfahren zur herstellung von proteinen unter verwendung der rekombinanten dns. |
| IT1186750B (it) * | 1985-07-10 | 1987-12-16 | Eniricerche Spa | Vettore di clonaggio,molecole di dna ricombinante,ceppi di bacillus subtilis trasformati con dette molecole e metodi per l'espressione di geni eterologhi e produzione e secrezione di proteine codificate da detti geni |
| IT1239733B (it) * | 1990-02-23 | 1993-11-15 | Eniricerche Spa | Mutanti della proteasi neutra termostabili e mezzi e metodi per la loro preparazione |
| CN103865701B (zh) * | 2013-12-13 | 2016-04-06 | 湖南鸿鹰生物科技有限公司 | 一种含中性蛋白酶的啤酒复合酶 |
| CN103859169B (zh) * | 2013-12-13 | 2015-08-12 | 湖南鸿鹰生物科技有限公司 | 一种含中性蛋白酶的饲料复合酶及其制备方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5867181A (ja) * | 1981-10-16 | 1983-04-21 | Yakult Honsha Co Ltd | スタフイロキナーゼ産生遺伝情報を担うｄｎａ断片組み換え体ｄｎａおよびそれを導入した大腸菌 |
| EP0151760A1 (en) * | 1984-01-06 | 1985-08-21 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Novel DNA and use thereof |
-
1984
- 1984-10-17 IT IT23190/84A patent/IT1176997B/it active
-
1985
- 1985-09-30 AT AT85830246T patent/ATE78870T1/de not_active IP Right Cessation
- 1985-09-30 EP EP85830246A patent/EP0179025B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-09-30 DE DE8585830246T patent/DE3586410T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1985-10-02 CA CA000492088A patent/CA1285233C/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-10-16 JP JP60230887A patent/JPH0829083B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| J.BACTERIOL=1984 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IT8423190A0 (it) | 1984-10-17 |
| CA1285233C (en) | 1991-06-25 |
| DE3586410D1 (de) | 1992-09-03 |
| EP0179025A1 (en) | 1986-04-23 |
| DE3586410T2 (de) | 1993-03-04 |
| ATE78870T1 (de) | 1992-08-15 |
| JPS61181374A (ja) | 1986-08-14 |
| IT8423190A1 (it) | 1986-04-17 |
| EP0179025B1 (en) | 1992-07-29 |
| IT1176997B (it) | 1987-08-26 |
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