JPS62151185A - 組換えｄｎａ分子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のクローニン
グベクター、組換えＤＮＡ分子、このようなりＮＡ分子
で組換えたバチルス・サブチリスの形質転換株、異種Ｄ
ＮＡの配列の発現及び異種ＤＮＡの配列で遺伝暗号化さ
れた蛋白質の産生および分泌の方法に関する。

特に本発明は、異種ＤＮＡの配列の発現およびバチルス
・サブチリスにおける前記配列により遺伝暗号化された
蛋白質の産生、分泌のためにクローニングベクターを用
いること、このようなりローニングベクターで形成され
、中性ブロテーセ遺伝子内に存在する制限部位でうまく
切断されかつこの問題の蛋白質を遺伝暗号とする異種Ｄ
ＮＡの配列を有する組換えＤＮＡ分子、この組換えＤＮ
Ａ分子で形質転換せしめられ、異種ＤＮＡの配列を発現
できかつこの配列によって遺伝暗号化された蛋白質を産
生、分泌するバチルス・サブチリスの菌株、さらには問
題の異種蛋白質を発現、産生、分泌する方法に関する。

本発明によるクローニングベクター、組換えＤＮＡ分子
、この組換えＤＮＡ分子で形質転換したバチルス・サブ
チリス菌株および異種蛋白質を産生、分泌する方法は、
異種ＤＮＡの配列を発現させることおよびこの配列で遺
伝暗号化された蛋白質を高収率で産生、分泌することを
可能にする。

このようにして得た蛋白質は、通常ならば化学合成で得
ている薬品類、食品類、さら（こはそのような製品の製
法の分野において有用である。

ダラム陰性のバクテリア、たとえば大腸菌（Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈ’ｉａ　ｃｏｌｉ３ｈ（異種遺伝子を発現する
能力があることは知られている。

しかしながら、エシェリシア・コリを異種蛋白質の産生
のための宿主として用いることには、数々の欠点がある
。すなわちエシェリシア・コリは病原性のダラム陰性菌
であって、普通は人体、または動物の腸管系内で生存し
ており、さらにはこの菌株のうちには菌体内毒素を生産
するものがある。

形質転換したエシェリシア・コリの菌体が用いられる異
種蛋白質の培養生産法は密閉系内で行ない、汚染、感染
をさけるようにしなければならない。このことはすべて
生産コストの上昇につながることである。

さらに、エシェリシア・コリで合成した生成物は細胞内
に保持されている。

従って、培養過程の終りに細胞を破裂させるか、溶解さ
せて生成物を回収することが必要なのである。

このような処理は、所望の生成物を取り出すばかりか、
望ましくない物質までも取り出すこととなる。従って、
後から分離、精製を行なって、目的の生成物のみを、人
間または動物に用い得る形で得るようにすることが必要
である。

エシエリシア・コリによるこれらの欠点のすべては、バ
チルス・サブチリスを宿主とすることで解決できる。バ
チルス・サブチリスは異種蛋白質の産生に特に好適であ
る。

事実、バチルス・サブチリスは非病原性、ダラム陽性の
バクテリアであって、菌体内毒素を産生じない。

さらに、バチルス・サブチリスの細胞は細胞周辺腔を有
せず、合成された生成物は培地中に直接しみ出すので、
これは汚染や精製の問題が殆どなく、培地から回収でき
るのである。

云うまでもなく、バチルス・サブチリスによる場合には
数々の利点もあるのであるが、これを異種蛋白質の産生
のための宿主としてもちいることは、異種遺伝子の発現
の効率が低いことおよびこの遺伝子によってコード化さ
れた蛋白質を得る収量が低いことの２つの理由により、
まれにしか行なわれてない。

事実、バチルス類の他の菌から得られる遺伝子はバチル
ス・サブチリス内で発現される［スローマ、ニー（Ｓｌ
ｏｍａ、　Ａ、）その他の報文［バチルス・セレアス（
Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ）から得たタイプ■β
−ラクタマーゼ遺伝子の分子クローニングおよびヌクレ
オチド配列」核酸研究（Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ
、）　Ｕ（１９８３）４９９７−５００４ページおよび
グレイ、オー（Ｇｒａｙ。

０、）その他の報文［ニジエリア・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ
）およびバチルス・サブチリス（Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉＳ
）中のバチルス・リチェニフオルミス（Ｂ、Ｌｉｃｈｅ
ｎｉ「ｏｒｍｉｓ）の分子クローニングおよびその発現
」ジャーナル・オブ・バタテリオロジイ（Ｊ、Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ、）１４５（１９８１）、４２２−４２８ペ
ージ］が、異種遺伝子のクローニングおよび発現はわず
か数例が技術誌に報告されているにすぎない［バーディ
、ケイ（Ｉｌａｒｄｙ、　Ｋ、）その他の報文「バチル
ス・サブチリス中におけるヘパチチスＢコア抗原および
高蹄疫つィルス主抗原の生産」ネイチュアー（Ｎａｔｕ
ｒｅ）２９３（１９８１）４８１−４８３ページ］。

このような制限された使用法の理由の１つは、中でも、
異種遺伝子を効率よく発現させ、この異種遺伝子によっ
て遺伝暗号化された蛋白質の生産性を高めることを許容
するクローニングベクターがないことである。

イタリー国特許出願第Ａ／８５２０９３号では、本出願
人はハイブリッドプラスミドｐＳＭ１２７について記述
した。このハイブリッドプラスミドはバチルス・サブチ
リス５Ｍ５ＩＯＩＩＩ　ＮＲＬＬＢ　１５８９８の細胞
内に導入されると濃度２００ｍｇ／ｉ２をこえる中性プ
ロテアーゼ（蛋白質分解酵素）の発現、産生が可能であ
る。

第１図に遺伝子地図を示したこのハイブリッドプラスミ
ドは、中性プロテアーゼ遺伝子とプラスミドｐＵＢｌｌ
Ｏとで形成されている。このプラスミドはバチルス・サ
ブチリス中で９３Ｍ１２７の複製を保証し、カナマイシ
ン耐性の遺°伝暗号を有する遺伝子である。

このハイブリッドプラスミドｐＳＭ１２７を含むバチル
ス・サブチリス５Ｍ５１０８の細胞は米国イリノイ州ペ
オーリアのＮＲＲＣにＮＲＬＬＢ　１５９００として寄
託しである。７６５塩基対（ｂｐ）のこのプラスミドｐ
ＳＭ１２７のＢｃＱ　ｌ−ＨｌｎｄＩ［Ｉ断片中に、ｎ
ｐｒＲ２で示されるＤＮＡ領域を認めたのである。この
ＤＮＡ領域は中性プロテアーゼ産生が高く、中性プロテ
アーゼ遺伝子の５′末端に位置する。

これによれば、本発明の目的は、異種ＤＮＡの発現およ
び配列およびこの異種ＤＮＡの配列により遺伝暗号化さ
れた蛋白質の高収率産生のためにバチルス・サブチリス
のクローニングベクターとしてハイブリッドプラスミド
ｐＳＭ１２７を用いることにある。

本発明の目的はさらに、このクローニングベクターｐＳ
Ｍ１２７（これはバチルス・サブチリスと適合するｐＵ
Ｂ１１０のレプリコンとカナマイシン耐性の遺伝暗号を
有する遺伝子とを含む）と、目的の蛋白質の遺伝暗号を
有する異種ＤＮＡの配列とによって形成された組換えＤ
ＮＡの分子を提供するにある。上述の異種ＤＮＡの配列
は中性プロテアーゼ遺伝子ｐＳＭＬ２７に存在する制限
部位に挿置され、プロモーター領域、リボゾーム認識部
位、中性プロテアーゼ信号配列の制御の下にある。本発
明の他の目的は、上述の組換えＤＮＡ分子で形質転換さ
れ、異種ＤＮＡの配列を発現でき、この配列によって遺
伝暗号化された蛋白質を産生ずるバチルス・サブチリス
の菌株を提供することにある。

本明細書において用いる用語の定義。　　′■　　これ
は４ＤＮＡ断片または遺伝子が蛋白質を産生ずるプロセ
スを云うものとする。これは転写のプロセス、すなわち
ＤＮＡ断片からのｍＲＮＡの生産およびほん訳、すなわ
ちｍＲＮＡからの蛋白質の生産、のプロセスによってお
こる。

バチルス・サブチリスのクローニングベクターこれは、
バチルス・サブチリスの宿主細胞内で複製されることを
可能にするレプリコンを有するプラスミドであり、この
ベクターは１つまたはそれ以上の制限部位で主要生物活
性を損なうことなく切断することができる。好適には、
このベクターたとえばカナマイシン耐性であるとか、ク
ロラムフェニコール耐性のような形質転換細胞の識別に
役立つマーカーを有するものとする。

組換えＤＮＡ分子　　これは細胞の外部から互いに付着
せしめた各種ゲノムで形成されたＤＮＡ分子であり、宿
主細胞内に維持できる能力を有する。

ハイブリッドプラスミドｐＳＭ１２７における中性プロ
テアーゼの過生産に責任ある領域の存在および７６５塩
基対のＢａＩ２　ｌ−ＨｌｎｄｌＩ［断片内におけるそ
の位置は次のようにすることによって証明された。

クロラムフェニコール耐性の遺伝暗号を有するクロラム
フェニコールアセチルトランスフアーゼ（ＣＡＴ）遺伝
子はプラスミドｐｃ１９４の１０３１ｂｐのＨｐａＩＩ
−Ｍｂｏｌ断片内に含有されており、このプラスミドｐ
Ｃ１９４をＨｐａ　ＩＩ制限酵素で処理し、このように
線状化したプラスミドをｐＥ１９４の５８７ｂｐの断片
へ付着せしめることにより単離した。この断片はプラス
ミドｐＥ１９４（ＢＧＳＣＩＥ７）をＴａｑ　Ｉ制限酵
素およびＭｂｏ　Ｉ制限酵素で資化することで得たもの
である。

ｐｃ１９４の線状分子は、このｐｃ１９４のＨｐａＩＩ
付着端及びｐＥ１９４のＴａｑ　！付着端が互いに付着
するものとすれば、３４９７ｂｐの線状分子を形成する
ようにしてｐＥ１９４のＴａｑ　Ｉ　−Ｍｂｏ　ｒ断片
に付着される。

３４９７ｂｐのこの分子はこのようにしてＭｂｏ　Ｉ制
限酵素で処理され、ｐｃ１９４の１０３１ｂ＋）のＭｂ
ｏｌ断片及びｐＥ１９４の５８７ｂｐのＴａｑ　Ｉ　−
Ｍｂｏ　Ｉ断片によって形成される１６１８ｂｐのＤＮ
ＡのＭｂｏ　Ｉ　−Ｍｂｏ　Ｉ線状断片の単離がなされ
る。

このようにして得た１６１８ｂｐの線状断片は次いで、
ｐＳＭ１２７をＢｃＱ　Ｉ制限酵素で切断した後ハイブ
リッドプラスミドｐＳＭ１２７に付着せしめられる。次
いでプラスミドｐＳＭ１５３はＢａｍＨＩ酵素で切断さ
れて、２つの断片を生じる。そのうちの一方はｐＵＢ１
１０の全配列を担持する大略５０００ｂｐのものであり
、他方は中性プロテアーゼの遺伝暗号を有する遺伝子と
クロラムフェニコール耐性の遺伝暗号を有するＣＡＴ遺
伝子とを有する大略４７００ｂｐのものである。

４７００ｂｐの断片は、次いで、バチルス・サブチリス
ＢＧＳＣＩＡＩの細胞の形質転換に用いられる。バチル
ス・サブチリスＢＧＳＣＩ＾１はクロラムフェニコール
に感応し、中性プロテアーゼを生産することのすくない
菌株であって、形質転換菌株のクロラムフェニコール耐
性（ＣＩＩＩＲ）を選別するのである。

バチルス・サブチリスＢＧＳＣＩ＾１の形質転換は菌染
色体内にこの断片の組込みが生じた場合にのみおこるの
である。

この組込みは、ｐＳＭ１５３のＢａｍＨＴ断片上に、中
性プロテアーゼ遺伝子によって構成される染色体ＤＮＡ
と同質の領域が存在する場合のみに生ずる。

第４図に示すように、ＣＡＴ遺伝子の上下に位置する領
域においては染色体ＤＮＡとプラスミドＤＮＡとの間で
二重乗換が生ずる。このことは、ＣＡＴ遺伝子の挿入に
つながる。このＣＡＴ遺伝子は染色体レベルにおいてＣ
ｆｆ１耐性を遺伝暗号とするものであって、この結果バ
チルス・サブチリスＢＧＳＣ１＾１（ＣＩＩＩＲ）のＣ
ｍ耐性細胞が得られるのである。

このＣＡＴ遺伝子の組込みに加えて、二重乗換はｎｐｒ
Ｒ２領域の組込みを生じる。この結果、中性プロテアー
ゼがプラスミドル３Ｍ１２フ上に存在するとしても、こ
の中性プロテアーゼの過産生を管理するのである。

この理由から、このバチルス・サブチリスの菌株ＢＧＳ
ＣＩＡＩは中性プロテアーゼの産生が少なく、１ｐｒＲ
２領域の染色体レベルにおける組込みはこの菌株の蛋白
質分解活性を実質的に高める。

事実、このＣＩＩＩＲバチルス・サブチリス菌株の８０
％は親菌株ＢＧＳＣＩＡＩに比べて１００倍もの蛋白質
分解酵素活性を示した。かくして、ｐＳＭ１２７におけ
るｎｐｒＲ２領域の存在およびこの領域と中性プロテア
ーゼの過産生との間の相関関係が確認されたのである。

第２Ａ図はｎｐｒＲ２領域のＤＮＡの配列を示し、第２
Ｂ図はＤＮＡの同じ領域の配列がＢＧＳＣＩＡＩという
バチルス・サブチリスの菌株における中性プロテアーゼ
遺伝子の前にあることを示している。

これらの配列を見るとわかるように、ｎｐｒＲ２領域は
、この遺伝子の開始点から１２４ｂｐの距離のところで
６６塩基対が欠除しているので、バチルス・サブチリス
ＢＧＳＣＩＡＩのｎｐｒＲ２領域とは異なっているので
ある。

本発明によれば、ハイブリッドプラスミドｐＳＭ１２７
は異種ＤＮＡの配列の発現のためのクローニングベクタ
ーとして用いられ、バチルス・サブチリスのこの配列に
よって遺伝暗号化された蛋白質産生は高収率のものとな
る。

ハイブリッドプラスミドｐＳＭＬ２７（第１図）は、中
性プロテアーゼ遺伝子内に制限部位を呈する。この部位
においては、ｎＰｒＲ２コントロール配列をそこなうこ
となく、プロモーター、リボゾーム認識部位（ＲＢＳ）
、及び中性プロテアーゼの産生に関係ある信号配列（Ｐ
ＲＥ）を切断できる。

特に、クローニングベクターが切断される制限部位は旧
ｎｄＩ［Ｉであって、これはＰＲＯ領域に位置する。こ
のＰＲＯ領域は、中性プロテアーゼを遺伝暗号化する配
列の上方に位置する。８ｇ＋２１１部位およびＥｃｏＲ
Ｉ部位は、中性プロテアーゼを遺伝暗号化するＤＮＡ領
域に存在する。

このようにして切断したクローニングベクターは次いで
、融合遺伝子すなわち中性プロテアーゼ遺伝子の部分と
クローニングベクター中に挿入した異種ＤＮＡの配列（
第５図および第６図）とにより構成される融合遺伝子を
形成するように、異種ＤＮＡの好適な配列に付着せしめ
られる。

このようにして得た組換えＤＮＡ分子はバチルス・サブ
チリスに適合するｐＵ８１１０のレプリコンとカナマイ
シン耐性の遺伝暗号を有する遺伝子とを含むクローニン
グベクターｐＳＭ１２７と、発現がプロモーターの存在
とＲＢＳ配列の存在とにより保証されかつ過産生と分泌
がそれぞれｎｐｒＲ２領域とＰＲＥ領域との存在で保証
される融合遺伝子とにより形成されているのである。

この組換えＤＮＡ分子によって形質転換せしめられたバ
チルス・サブチリスの菌株は、異種ＤＮＡの配列を発現
でき、かつこの配列により遺伝暗号化された蛋白質を高
収率で産生じ分泌できるのである。

このクローニングベクター、組換えＤＮＡ分子、バチル
ス・サブチリス宿主細胞および本発明方法は、異種ＤＮ
Ａの配列の発現、およびこの配列によって遺伝暗号化し
た蛋白質の産生、分泌を果すものである。

このような蛋白質の例としては、β−ラクタマーゼ、生
長ホルモンおよび、ひとカルシトニンがあげられる。

本発明によって、プラスミドｐＳＭ１２７が、ひとカル
シトニンの遺伝暗号を有する遺伝子のクローニングに適
用された。

ひとカルシトニンは血液中のカルシウムのレベルを支配
するホルモンである。

このホルモンは現在では化学合成によって製造されてい
る。

本発明によれば、ひとつのＤＮＡ断片は以下の特性を有
するものとして合成される。

−このひとホルモンを構成する３２のアミノ酸の遺伝暗
号とするヌクレオチド配列を含むこと。

−プラスミド９３Ｍ１２７上の中性プロテアーゼ遺伝子
中に存在するＢｇσ■制限部位内への挿入を可能にする
末端群を有すること。

一カルシトニンの末端アミノ酸の遺伝暗号のあとに無意
味なトリプレット暗号を有すること。

−ヌクレオチド配列が、一旦ＤＮＡ断片をＢｇ１２■制
限部位に挿入した後、カルシトニン配列が中性プロテア
ーゼと同じ読み出し方向に並んでいるようになっている
こと。

これにより、カルシトニンの合成を得ることが可能とな
る。カルシトニンそれ自体の開始トリプレット暗号の前
にはストップコドンはない。

合成りＮＡ断片はプラスミド９６Ｍ１３１内でクローン
がつくられる。その構造はイタリー国特許第Ａ７８５２
１３４号に記述されているとおりであって、保存、配列
、増殖が可能であるように１つだけのＢｇＱＩＩ制限部
位の存在をもって特徴としている。

次いで、ｐＳＭ１３１と合成りＮＡ断片とで構成されて
いるハイブリッドプラスミドｐＳＭ１７０を浄化して、
クローン断片の配列をマキサム・ギルバート法［「メソ
ッヅ・イン・エンツイーモロジイ（Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ
　Ｅｎｚｙｍｏｌｇｙ）Ｊ（１９８０）Ｖｏｌ、６５．
４９９−５６０ページ］によって確認した。

このプラスミドｐＳＭ１’７０から単離した合成りＮＡ
断片を酵素Ｔ４リガーゼの存在の下で、１４℃の温度テ
１６時間’）ローニングベクターｐＳＭ１２７をＢｇＱ
　ＩＩ制限酵素で部分的に資化せしめた後、このクロー
ニングベクターｐＳＭ１２７へ付着せしめた。このやり
方で得たりガーゼ混合物を用いて、コンタンテ・デュブ
ノー法［ｒＭｏｌ、Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、Ｊ　１６７（
１９７９）　２５１−２５８］に従って適宜得たバチル
ス・サブチリスＳＭＳ１０ｇ（ＮＲＬＬ１５１！ｔ９８
）の細胞を形質転換した。

形質転換された細胞は、ＮＢ培養基上にひろげて、カナ
マイシン耐性（ＫｍＲ）により、またカゼイノリテイン
ク活性の不存在により選別した。

プラスミドは、カナマイシン耐性のバチルス・サブチリ
ス５Ｍ５１０８（ＮＲＲＬＢ１５８９８）、ＫｍＲのコ
ロニー（リングをもたない）から急速抽出法で抽出し、
合成りＮＡ断片を含むことを確認する目的で分析した。

この分析は、ＢｇＱ　ＩＩ制限酵素でこのプラスミドを
資化することにより行なわれ、この資化反応で得た断片
を７，５％アクリルアミドゲル上で分離した。

供試プラスミド中にプラスミドｐＳＭ１７４が確認され
た。これは９３Ｍ１２７とカルシトニンのＤＮＡ断片と
から形成されており、配列（第７図）の正しい読み取り
を得るようにして配向していた。

このバチルス・サブチリスの菌株ＳＭＳ１０８（ＰＳＭ
１７４）はＡＴＣＣに１９８５年６月２６日付で寄託さ
れた。

このバチルス・サブチリスの菌株ＳＭＳ１０８（ｐＳＭ
１７４）がひとカルシトニンを発現し分泌する能力のあ
ることは、この菌株を３７℃においてＶＹ培養基（ＤＩ
ＦＣＯ）内で培養し、同位元素標識免疫定量分析（ＲＩ
Ａ）によって、様々な時間間隔で上澄のアリクオツドを
分析することによって確認した。

以下に記載する実験例は単に例示のためのものであって
、本発明自体を同等制限するものではない。

牡 Ａ、Ｃ１９４のクロラムフェニコールアセチルトランス
フアーゼ（ＣＡＴ）遺伝子を担持するＭｂｏ　Ｉ断片の
単離 プラスミドｐｃ１９４（ＢＧＳＣＩＥ１７）　５　μ９
をＨｐａ　ＩＩ制限酵素（ヘーリンゲルーマンハイム）
５単位（Ｕ）でこの酵素の供給会社の推奨する条件で５
０μｅ反応容積中で解離した。

次いで、この溶液を、ＴＥ（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ２．１ｍＭＥＤＴＡ）で飽和せしめた等量のフェノー
ルで処理し、プラスミドＤＮＡを３Ｍ酢酸ナトリウム１
／１ｏ容量、９５％エタノール２．５容量で沈澱せしめ
た。

反応混合物を毎分１０，０００回転で１０分間遠心分離
し、このＤＮＡを取り、真空乾燥してから、６６ｎ＋Ｍ
ＴｒｉｓｌｌＣ１２（ｐＨ７，５）、６＋ｎＭ　Ｍｇｃ
Ｑ２．１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭアデノシン
ミリン酸（ＡＴＰ）、プラスミドｐＥ１９４（ＢＧＳＣ
ＩＥ７）の５８７塩基対（ｂｐ）のＴａｑ　’１−Ｍｂ
ｏ　Ｉ断片５μ９、およびＴ４ＤＮＡリガーゼＩＯＵを
含有する溶液１００μρ中に再懸濁せしめた。

リガーゼ反応は１４°Ｃの温度で１８時間溶液を維持す
ることで行なわれた。

ｐＥ１９４（ＢＧＳＣＩＥ７）の５８７ｂｐの断片はこ
のプラスミド２０μりをＴａｑ　Ｉ酵素およびＭｂｏ　
Ｉ酵素２０Ｕで、供給会社（ベーリンゲルーマンハイム
）の仕様書に従っ　　　。

て操作することで資化せしめて得て、次いでこれをマキ
サム・ギルバート法［「メソッヅ・イン・エンツィーモ
ロジイＪＶｏ１．６５．　（１９８Ｇ）４９９−５６０
ページ］に記載されたようにして５％アクリルアミドゲ
ルで純化した。

ｐｃ１９４の線状分子は、ｐＥ１９４のＴａｑ　Ｉ　−
Ｍｂｏ　Ｉ断片に付着せしめられ、このようにして３４
９７ｂｐの線状分子が形成された。この線状分子中には
Ｈｐａ　ＵおよびＴａｑ　Ｔ付着端が互いに付着してい
る。

リガーゼ反応の終了時、混合物はフェノールで処理され
４ＤＮＡは沈澱せしめられ、上述のようにして取り出さ
れる。

次いでこのＤＮＡを、７５ｍＭ　Ｎａｃ１２．１０ｍＭ
　Ｔｒｉｓｌ（Ｃ１２（ｐＨ７，４）、１０ｎ＋Ｍ　Ｍ
ｇＣＱｔおよび１ｍＭジチオスレイトールを含有する溶
液５０μρ内に再懸濁せしめ、Ｍｂｏ　’ｆ制限酵素２
Ｕで３７℃、１時間処理した。

この処理後、このＤＮＡは５％アクリルアミドゲルへ載
荷され、１６１８ｂｐの線状断片を得た。これはｐｃ１
９４の１０３１ｂｐのＭｂｏ　Ｉ　−Ｈｐａ　Ｉｆ断片
から、またｐＥ１９４（第３図）の５８７ｂｐのＴａｑ
　Ｉ　−Ｍｂｏ　Ｉ断片から形成されている。

供給会社（ベーリンゲルーマンハイム）の仕様書に従っ
てＢｃｌＩ制限酵制限酵素ｌ化したプラスミドｐＳＭ１
２７０．５μりを、６６ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ２（ｐ
Ｈ７，５）、６．６ｍＭＭｇｃｆ２ｚ　、１０ｍＭジチ
オスレイトール、１　ｍＭ　ＥＤＴＡ。

上記Ａ）で得たＤＮＡ断片１μ９、およびＴ４ＤＮＡリ
ガーゼＩＵを含有する溶液１０μｅ中に懸濁せしめた。

反応は１４℃の温度で１８時間行なわれ、それから６５
℃の温度で１０分間酵素の不活性化を行なった後、この
混合物を用いてクロラムフェニコールおよびカナマイシ
ン感受性のバチルス・サブチリス５Ｍ５１０８（ＮＲＬ
ＬＢ　１５ｇ９ｇ）の細胞の形質転換を行なった。

この際コンタンテおよびデュブノ−（Ｃｏｎｔｅｎｔｅ
ａｎｄ　Ｄｕｂｎａｕ）によって記載［ｒＭｏｌ、Ｇｅ
ｎ、Ｇｅｎｅｔ、　ＪＬ６７（１９７８）２５１−２５
８］された手法に従って行なわれた。

形質転換細胞の選び出しは、ＮＢ板上で行なわれた。こ
のＮＢ板の構成については例２に記載のごとく、゛１％
カゼイン、５μ９のカナマイシン、５μ９のクロラムフ
ェニコールを含有するものである。

第３図に地図を示したプラスミドｐＳＭ１５３はカナマ
イシン感受性（Ｋ＋ｎＲ）、クロラムフェニコール耐性
（ＣｍＲ）のコロニーの１つから単離した。

このプラスミドｐＳＭ１５３は、９３Ｍ１２７のＤＮＡ
から、およびＣＡＴ遺伝子を含有する１６１８ｂｐのＭ
ｂｏ　Ｔ　−Ｍｂｏ　ｒ断片から形成されている。

ｐＳＭ　１５３内で見出される定位でＭｂｏ　Ｉ　−Ｍ
ｂｏ　Ｔ断片を挿入することは、中性プロテアーゼ遺伝
子の近位部分からＢｃＱ　Ｉ部位を再構成することを許
容する。

事実、ｐＥＬ９４のＭｂｏｒ部位の４つの付着基部ＧＡ
ＴＣにはアデニン（Ａ）が後に続く。この結果、９３Ｍ
１２７のＢｃｆ２　Ｉ付着端およびＭｂｏ　Ｉはこれら
自身中で対をなし、配列ＴＧＡＴＣＡを形成する。これ
はＢｃσｌ酵素で認識され、切断される。

ＢｃＱ　ｒ プラスミドＩ）ＳＭ１５３１μ２を、１０μＱの反応容
積内でＢａｆｆ１旧制限酵素ＩＵで資化せしめた。これ
はこの酵素の供給会社（ベーリンゲルーマンハイム）の
仕様書どおりに行なった。

このようにＢａｍ１１１部位で切断して２つの断片を得
た。その一方は大略５（ｌＱＱｂｐで、１）ｔｌＢＩＩ
Ｑの全配列を担持しており、他方は大略４７００ｂｐで
、中性プロテアーゼ遺伝子とＣＡＴの遺伝暗号を有する
１６１８ｂｐの断片とを有する。

このようにして資化したＤＮＡはバチルス・サブチリス
ＢＧＳＣＩＡＩの細胞を形質転換するのに用いられた。

これはニス・コンタンテ（Ｓ、Ｃｏｎｔｅｎｔｅ）およ
びディー・デュブノー（Ｄ、Ｄｕｂｎａｕ）によって記
載されたようにして行なわれ、クロラムフェニコール耐
性で形質転換細胞を選別した（ＮＢ媒基３μｇ／ｍσ）
。

線状ＤＮＡ分子は、これが細菌染色体に組込まれない限
りバチルス・サブチリスの細胞を形質転換するものでは
ない。

従って、Ｃｍ”コロニーだけを選別した。このコロニー
では、中性プロテアーゼ遺伝子を含有しかツＣＡＴ遺伝
子より優位にある２３５０ｂｐのＢａｍ１ｌ　Ｉ断片と
ＣＡＴ遺伝子の後に続く大略７５０ｂｐの断片との細菌
染色体のそれぞれ同質領域に対する組換えが生じていた
。

このようにして得たＣｍ”コロニーの約８０％は、親菌
株バチルス・サブチリスＢＧＳＣＩＡＩに見出されるカ
ゼイノリチック活性よりも高いカゼイノリチック活性を
示した。

カゼイノリチック活性はカゼインを含有するＮＢ板上で
、リングの寸法を調べることで確かめられる。酵素活性
の増加はｐＳＭ１５３．従って９３Ｍ１２７．に存在す
るＤＮＡ断片のｎｐｒＲ２領域を確認するものである。

例２ ｐＳＭＬ７４の調製 プラスミドｐＳＭ１３Ｌ　０．１μ２を、２Ｏｎ＋Ｍグ
リシンーＮａＯＨ，１０ｍＭ　ＭｇＣＬ、７ｍＭβ−メ
ルカプトエタノール（ｐＨ９，５）ノ溶液２０μａ中テ
Ｂｇ（２ＩＩ酵素０．１単位（Ｕ）（ベーリンゲルーマ
ンハイム）と共に３７℃の温度で１時間資化した。

６５℃で１０分間この酵素を不活性化した後、この資化
混合物２ａ（ＩｃプラスミドＤ　Ｎ　Ａ　ＬＱｎｇ）に
、６６ｍＭＴｒｉｓ−１１（ｊ２（ＰＨ７，６）、６．
６ｍＭ　ＭｇＣＱｔ、１０ｍＭジチオスレイトールおよ
び１　ｍＭ　ＡＴＰの溶液１８μρ中にカルシトニンの
合成断片１０ｎｇおよび酵素Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ベー
リンゲルーマンハイム）０．ＩＵを含有させたものを加
えた。

リガーゼ反応は１４℃において１６時間行なわれた。

この酵素を６５℃で１０分間不活性化処理した後、リガ
ーゼ混合物１０μＱはマンデル（Ｍａｎｄｅｌ）および
ヒガ（１１ｉｇａ）［Ｊ、Ｍｏｔ、Ｂｉｏｌ、５３（１
９７Ｑ）１５９−１６２コによって記載された方法に従
って、ニジエリシア・コリ１１８ＩＯＩの細胞を形質転
換するのに用いた。形質転換細胞の選別はテトラサイク
リン（Ｔｃ）　１５μ９／１ａ（１を含有するし寒天（
ＤＩＦＣＯ）のプレート上で行なわれた。

ＴｃＲコロニーからプラスミドｐｓｇｔ７ｏだけを取出
した。このプラスミドは合成カルシトニン断片を含有し
ている。

クローン断片の配列はマキサム・ギルベルト法［ｒＭｅ
ｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙＪ　Ｖｏｌ、
６５　（１９８０）　４９９−５６０コを適用して証明
された。

プラスミドｐＳＭＬ７（１３０μ９を、２０ｍＭグリシ
ン−ＮａＯＨ，１０ｍＭ　ＭｇＣ（ｂおよび７ｍＭβ−
メルカプトエタノール（ｐＨ９，５）を含有する溶液１
５０μｅ中において８ｇ１２　ＩＩ酵素３０Ｕで１時間
資化せしめた。このようにして得たプラスミドＤＮＡ断
片を７．５％アクリルアミドゲル上で分離し、１３４塩
基対のこのＤＮＡ断片はマキサムおよびギルバートによ
って記載された方法［ｒＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙＪ　（１９８０）Ｖｏｌ、８５，５２６
−５２７１に従って溶離せしめられた。

ＰＳＭＬ２７１　ｕ９を、２０ｍＭグリシン−ＮａＯＨ
１ｌｏｍＭＭｇＣム、７ｍＭβ−メルカプトエタノール
（ｐＨ９、５）を含有する溶液５０μＱ中で８ｇ１２　
ＩＩ酵素ＩＵで１時間資化した。

１３４ｂｐのＤＮＡ断片１２０ｎｇを加えた後このＤＮ
Ａを３ＭＮ￥酸ナトリウム（ｐＨ５，５）オヨヒ９８％
エタノール１５０μｑを加えて一８０℃で２０分間沈降
処理した。

沈澱したＤＮＡは毎分ｔｏ、ｏｏｏ回転で１０分間遠心
分離することにより反応混合物から分離せしめられ、乾
燥後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼＩＵを含有する、６０ｍＭ　
Ｔｒｉｓ−１１Ｃｊ（ＰＨ７，６）、４６．８ｍＭ　Ｍ
ｇＣ（ｈ、１０ｍＭジチオスレイトールおよびｌ　ｍＭ
　ＡＴＰの溶液ｌＯμρ中に再＠濁せしめた。

この混合物を１４℃で１６時間培養した後、酵素を６５
°Ｃ１１０分間の処理で不活性化し、リガーゼ混合物５
μＱをコンタンテ・デュブノー法［ｒＭｏｌ　、Ｇｅｎ
、Ｇｅｎｅｔ、Ｊ　１６７（１９７９）　２５１−２５
８１によってバチルス・サブチリスＳＭ８１０８（ＮＲ
ＲＬＢ１５ｇ９ｇ）の細胞を形質転換するのに用いた。

次いで、形質転換した細胞は、カナマイシン耐性、およ
び下記の成分を有するＮＢ媒地のプレート上でのカゼイ
ノリチック活性の不存在によって選別した。

ディフコ　ヌートリエント　ブロス ８．００９ Ｍｇ５Ｏａ・７ＨｔＯＯ，２５ｇ ＫＣＱ１．００ｇ ディフコ寒天　　　　　　　１５，００９ＰｅＳＯ，−
７Ｈ，ＯＯ，２８ｇ ＭｎＣＱ＊　　　　　　　　　　　　１．２５＋ｎ９Ｃ
ａ（ＮＯ３）ｔ　　　　　　　　　　１６４．００ｍｇ
カゼイン　　　　　　　　　　１０．００９カナマイシ
ン　　　　　　　　５ｍ９ Ｈ２０１リツトル プラスミドはリングのないＫｍＲコロニーから、ロドリ
ゲス（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ）およびテート（Ｔａｉｔ）
によって記載された方法［ｒＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　
Ｄ　Ｎ　Ａ　Ｔｅｃｈ−ｎｉｑｕｅｓ：　ａｎ　１ｎｔ
ｒｏｄｕｃｔｉｏｎＪ　（Ｌ９Ｈ）、Ａｄｄｉｓｏｎ−
Ｗｅｓｌｅｙ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ
コに従って取り出された。次いで、この合成断片を含有
するプラスミドをＢｇＱ　Ｉ［酵素による資化および７
．５％アクリルアミドゲル上においてプラスミドＤＮＡ
断片を分離することにより確認した。

ｐＳＭ１２７中における合成カルシトニンの定位は、Ｂ
ｓｔＥＩＩ酵素でこのプラスミドを資化することで証明
された。この酵素の制限部位は合成断片と中性プロテア
ーゼ遺伝子との中に位置する。

正しい定位であると、それぞれ大略７９００ｂｐと５６
０ｂｐとの２つの断片を生ずるが、正しい定位でないと
大略７９００ｂｐの断片と６５０ｂｐの断片とを生ずる
。

急速抽出によって得たプラスミドの資化は３０μＣの反
応容積内においてＢｓｔＥＩＩ酵素ＩＵをもって、この
酵素の供給会社（ベーリンゲルーマンハイム）によって
示された条件の下で行なわれた。

得られたプラスミドＤＮＡ断片は７．５％アクリルアミ
ドゲル上で分離された。

このようにして、正しい定位をもってｐＳＭ１２７内に
挿入された合成カルシトニン断片を呈するプラスミドｐ
ＳＭ１７４（第７図）を単離することが可能であった。

マキサム・ギルバート法を用いた配列分析で得られた構
造が正しいことを確認した。

バチルス・サブチリスＳＭＳ１０８（ｐＳＭ１７４）が
ひとカルシトニンを発現し分泌する能力は、上澄を同位
元素標識免疫定量分析（ＲＩＡ）することで証明された
。

バチルス・サブチリスＳＭＳ１０ｇ（ＰＳＭ１７４）の
菌株およびバチルス・サブチリス５Ｍ５１０８（ＮＲＲ
ＬＢ１５８９８）の菌株は、それぞれ５０ｍ＆のＶＹ（
ディフコ　ヴイールインフエクションブロス２５９／ｆ
２、酵母抽出物５９／Ｑ。

ｕｔｏｔｃ）を入れた２５０ｍ１２のエーレンマイヤー
フラスコ中で３７℃の温度で培養した。

１時間ごとに１ｍＱのアリクオツドをこの培養ブロスか
ら取り出し、４℃においてエッペンドルフ遠心分離機モ
デル５４１４で１０分間遠心分離した。

このようにして得た上澄に、プロテアーゼ阻害剤として
、フェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）
およびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を最終濃度
がそれぞれ１ｍＭおよび５ｍＭになるように加えた。

このように処理した上澄のアリクオツドをカルシトニン
のＲＩＡ試験に用いた。これには供給会社エイキンケミ
カルカンパニリミテッドのキットおよび操作仕様を用い
た。

得られた結果を第１表に示す。

第１表 時間（時）　　ＳＭ８１０８（ｐＳＭ１７４）ｎｇ／ｍ
ｃ　　ＳＭＳ１０８ｎｇ／ｍ＆２　　　　　５．０　　
　　　　０．１３　　　　　７．２　　　　　　　〃 ４　　　　１２０　、０　　　　　　　〃６　　　２２
００．０　　　　　　　〃８　　　４２５０゜０　　　
　　　〃 ２４　　　　１４０．０　　　　　　　〃

【図面の簡単な説明】

第１図は、ｐＵＢ１１０および中性プロテアーゼ遺伝子
により形成されたプラスミドｐＳＭ１２７の制限酵素地
図、第２Ａ図は中性プロテアーゼの過生産に関係あるｎ
ｐｒＲ２領域のヌクレオチド配列を示す図、第２Ｂ図は
バチルス・サブチリス菌株ＢＧＳＣＩＡＩ中における中
性プロテアーゼ遺伝子の前に存在するｎｐｒＲ２領域の
ヌクレオチド配列を示す図、第３図はｐｃ１９４のＣＡ
Ｔ遺伝子およびプラスミドｐＳＭ１２７により形成され
たプラスミドｐＳＭ１５３の構成を説明する図、第４図
はバチルス・サブチリスＢＧＳＣＩＡＩの細菌染色体と
ＣＡＴ遺伝子およびｎｐｒＲ２領域を含む４７００塩基
対のＰＳＭ１５３断片との間に生じ得るふたつの組換え
を説明する図、第５図は異種遺伝子が９３Ｍ１２７のＢ
ｇＩ２■領域部位に挿入されている組換えＤＮＡ分子の
構成を説明する図、第６図は、異種遺伝子が９３Ｍ１２
７の旧ｎｄＩ［Ｉ制限部位に挿入されている組換えＤＮ
Ａ分子の構成を説明する図、第７図はカルシトニン遺伝
子を有する合成りＮＡを含むｐＳＭ１７４（ほか１名） 図面の浄書（内容に変更なし） ＥｃｏＲｒ Ｐｖｕエエ Ｆ［ＧＬＩＲＡ　　４ ＧＡＴＣＡＣＧＣＧＧＣＡＴＣＡ八ＣＡＴＡＴＡｔｌ；
丁１：、へＡＡＡＧＣＣＧＣＣＡＧＣＡＩＩ；ＣへＣＡ
ＴＡＴＣＣＧＴ）ＧＴＡＡＧＣＧＣＴＧＧＴＧＡＡＧＴ
ＴＴＧＴＴＧＡ丁ＴＧＣ八ＣＣＴ［；［：ＴＧＡ八丁へ
八へへＴＣＡＡＣＡへＡＩＧ丁ＣＣＧＣＴＧＣＣＧＣＴ
ＴＴＡＴＴＴＴＧＧＧＡＴＧＡ丁ＧＣＡＣＣ八八へへＧ
ＡＴ八丁へＡＧＣＣＣＧＣＣ）■へＡＡＡＴＡＡＣＧＴ
ＴＣＧＡＡへＴＧＣＡＡＴＡＣＡＴＡＡＴＧＡＣＴＧへ
へＴＡへＣＴＣＣへＡＣＡＣＧＡノて ＣＴＴＴＴＣＡ八ＡＡＡＧＴへＴＣＡＡＧＡＴＧＡＡＡ
ＣＡＡＡＡＡＴＡＴＣＴＣ八丁ＣＴＴＣへＣＣＴＴＣＴ
ＴＣＣＴＧＴＣＧＣＴＧＣＴＴＣ［；ＴＴＴＡＴＧＡＧ
ＴＴＴＡＴＣＡＡＴＣＡＧＣＣＴＧＣＣＡＧＧＴＧＴ’
ＴＣＣ八ＡＡＡ八Ｔ［；ＣＧＡＴＴＧＣ（１；ＣＡＡＴ
ＣＡ（１，ＡＡＣ丁ＣＴＣへＧＣＡへＣＡＡへＴＧＡＣ
ＡＡＧＧＣ丁［ＣＣＡＡＡＡＧＧＣＴＧ 日ＧＵＲΔ　２Ａ ＋ＴＡＡＣＡＡＡＡＡ八ＴＧＣＡＧＣＡＧへＧＧＣ八Ａ
［”ＡＧＴＴＣへＴ　丁ＴＣＣ［；ＴＣＣＴＣＴＣＴＴ
ＡＡ：ＡＣＴＣＣＣＧＣＣ八（：ＣＡＧＣＡＣＡＡＴＣ
ＣＧＣＡＡＣＡＴＡＡＣＡＣＣＣＧＣＣＡ八ＧＡＡＣＡ
ＴＴ＋ＧＡ八ＣＡＡＣＡ八ＴＴＧ八ＣＣＡＴＴＧへＡＴ
ＣＡＧＣＡＧＧＧへＧＣＴＴＴへＴＣＴへＣＴＴＡＡＴ
Ａ＋ＣＡＡＣＡＡＴＣＣＴ　丁ＴＡＣＴＴＣＴＴＡＴＴ
ＡへＧＧＣＣＴＣＡ　１丁ＣＧＧＴＴＡＧＡＣＡＧＣＧ
ＧＡＣＡＧＧＣＴＧＣＴＧＡＡＧＧＴＣＡ　丁ＣＡＧＣ
ＴＴＡＡへＧＡＧＡＡＴＣＡＡＡＣＡＡＡＴＴＴＣＣＴ
Ｃ；　丁ＣＡＡＧＣＡＧＴＴＴＴＴＧＡＡＡＡへＧＡＡ
ＣＡＧＣＡＡＣＡＴＴＴＴＴＡＡＡＧ［；ＴＧＡＣＣＣ
ＴＴＥｃｏＲｒ εα甫工 ＥｃｏＲｒ 開＾５ｌｎＬ＠ｔ１ｃｏ　ｃｏｎｔａｒ＋ｏｎＬ＠手続
補正書（方式） ％式％ り事件の表示　　　特願昭６１年１６０９９８号２、発
明の名称　　　組換えＤＮＡ分子３、補正をする者　　
事件との関係　特許出願人名　称　　　エニリチェルへ
・エセ・ビ・ア４、代理人　　　　〒１００東京都千代
田区有楽町−丁目８番１号５、ｈｌｒ正命令の日付　昭
和６１年９月３０日６ｈ１１正の対象　　　（１）証明
書（住民票）（２）図面の浄書

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　バチルス・サブチリスのクローニングベクターｐＳ
   Ｍ１２７と目的蛋白質の遺伝暗号を有する異種ＤＮＡの
   配列とで構成された組換えＤＮＡ分子であって、前記異
   種ＤＮＡの配列はｐＳＭ１２７の中性プロテアーゼ遺伝
   子中に存在する制限部位に挿入され、プロモーター領域
   、リボゾーム認識中心、ｎｐｒＲ２および中性プロテア
   ーゼの信号配列の制御の下にある組換えＤＮＡ分子。 ２　特許請求の範囲第１項記載の組換えＤＮＡ分子であ
   って、前記異種ＤＮＡ配列がひとカルシトニンの遺伝暗
   号を有する組換えＤＮＡ分子。 ３　特許請求の範囲第１項および第２項記載の組換えＤ
   ＮＡ分子を得る方法において、前記クローニングベクタ
   ーｐＳＭ１２７を、制限酵素ＨｉｎｄIII、ＢｇｌII、
   またはＥｃｏＲ I から選んだひとつの制限酵素で切断
   し、酵素Ｔ＿４ＤＮＡリガーゼの存在の下で、目的の蛋
   白質の遺伝暗号を有する異種ＤＮＡ配列に付着せしめる
   ことを特徴とする、組換えＤＮＡ分子を得る方法。 ４　特許請求の範囲第３項記載の組換えＤＮＡ分子の製
   法において、異種ＤＮＡ配列がひとカルシトニンを遺伝
   暗号とする時、前記クローニングベクターをＢｇｌII酵
   素で切断することを特徴とする組換えＤＮＡ分子の製法
   。 ５　特許請求の範囲第１項および第２項記載の組換えＤ
   ＮＡ分子の製法に用いるクローニングベクターｐＳＭ１
   ２７であって、ｐＵＢ１１０のレプリコンと、カナマイ
   シン耐性を遺伝暗号とする遺伝子と、制限部位Ｈｉｎｄ
   III、ＢｇｌIIおよびＥｃｏＲ I と、７６５塩基対のＢ
   ｃｌ I −ＨｉｎｄIII断片中に位置するｎｐｒＲ２領域
   とを特徴とするクローニングベクター。 ６　特許請求の範囲第１項記載の組換えＤＮＡ分子で形
   質転換されたバチルス・サブチリスであって、異種ＤＮ
   Ａの配列を発現でき、前記異種ＤＮＡの配列によって遺
   伝暗号化された蛋白質を産生し分泌するバチルス・サブ
   チリス。 ７　特許請求の範囲第３項記載の組換えＤＮＡ分子で形
   質転換されたバチルス・サブチリスＳＭＳ１０８（ｐＳ
   Ｍ１７４）であって、アメリカンタイプカルチャーセン
   ター（ＡＴＣＣ）に寄託されたバチルス・サブチリス。 ８　特許請求の範囲第６項記載のバチルス・サブチリス
   の菌株を適宜の培養基中において１０℃ないし５１℃の
   温度で培養することを包含する、異種蛋白質の製法。 ９　特許請求の範囲第８項記載の異種蛋白質の製法にお
   いて、この異種蛋白質がひとカルシトニンであって、前
   記菌株がバチルス・サブチリスＳＭＳ１０８（ｐＳＭ１
   ７４）であることを特徴とする、異種蛋白質の製法。