JPS62155080A - 新規な大腸菌宿主 - Google Patents
新規な大腸菌宿主Info
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- JPS62155080A JPS62155080A JP60295140A JP29514085A JPS62155080A JP S62155080 A JPS62155080 A JP S62155080A JP 60295140 A JP60295140 A JP 60295140A JP 29514085 A JP29514085 A JP 29514085A JP S62155080 A JPS62155080 A JP S62155080A
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- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/57—IFN-gamma
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
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- C12R2001/19—Escherichia coli
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
本発明は、外来性のタンパク又はポリペプチド（以下、
１１にタンパクと略す）を高発現しうるベクターの宿主
として新規な大腸菌及び該大腸菌を宿主とした形質転換
体からタンパクを高収率で得る方法を提供する。具体的
には、ヒト免疫インターフェロン分解活性を欠失した新
規な大腸菌を提供し、この大腸菌を宿主とした形質転換
体からヒト免疫インターフェロン活性をもつタンパクを
効率良く得る方法を提供する。
１１にタンパクと略す）を高発現しうるベクターの宿主
として新規な大腸菌及び該大腸菌を宿主とした形質転換
体からタンパクを高収率で得る方法を提供する。具体的
には、ヒト免疫インターフェロン分解活性を欠失した新
規な大腸菌を提供し、この大腸菌を宿主とした形質転換
体からヒト免疫インターフェロン活性をもつタンパクを
効率良く得る方法を提供する。
［従来の技術］
近年、逍伝子工学、とりわけ組換えＤＮＡ技術の急速な
進歩に伴ない、それまで、生物体からの分離・精製に頼
っていた多くの生理活性タンパクを微生物を用いて大量
に生産させることが可能となった。これにより、従来は
、その存在が知られるのみであった生理活性タンパクを
医薬品あるいは農薬などの薬剤に使用することも可能と
なってきた。
進歩に伴ない、それまで、生物体からの分離・精製に頼
っていた多くの生理活性タンパクを微生物を用いて大量
に生産させることが可能となった。これにより、従来は
、その存在が知られるのみであった生理活性タンパクを
医薬品あるいは農薬などの薬剤に使用することも可能と
なってきた。
又、組換え技術に関しては、これまで、いかに効率良く
目的物質を生産させるかという点に多くの工夫がなされ
、改良技術が提案されてぎた。例えば、ベクターの改良
、新しいホスト−ベクター系の開発、培地・培養条件の
改良、更に最近では、プロティンエンジニアリングを用
いたより安定なアミノ酸配列をもつタンパクの開発など
が行なわれている。
目的物質を生産させるかという点に多くの工夫がなされ
、改良技術が提案されてぎた。例えば、ベクターの改良
、新しいホスト−ベクター系の開発、培地・培養条件の
改良、更に最近では、プロティンエンジニアリングを用
いたより安定なアミノ酸配列をもつタンパクの開発など
が行なわれている。
黙しながら、高発現される生理活性タンパクも、その形
質転換体からの抽出・精製段階には、多くの工程を要し
ているのが現状である。有用物質を生産する形質転換体
から該物質を容易に、かつ効率良く抽出・ｙＪ製する技
術を確立することが、産業上有用であることは言をまた
ない。
質転換体からの抽出・精製段階には、多くの工程を要し
ているのが現状である。有用物質を生産する形質転換体
から該物質を容易に、かつ効率良く抽出・ｙＪ製する技
術を確立することが、産業上有用であることは言をまた
ない。
組換え微生物（形質転換体）が生産する目的タンパクを
抽出・精製するにＪ５いては、通常まず培養微生物を殺
菌剤を用いて死菌としだ後（抽出工程を完全に密閉して
行なうことができる場合、口の工程は除かれることもあ
る）、菌体を破砕し、その破砕懸濁液を遠心分離して、
その上清又は沈渣のいずれかを精製過程に付すという形
式で行なわれている。しかし、一般に、該、ｉ：清また
は沈渣からの抽出液はプロテアーゼ活性が強いため、目
的タンパクが分解されることが多い。
抽出・精製するにＪ５いては、通常まず培養微生物を殺
菌剤を用いて死菌としだ後（抽出工程を完全に密閉して
行なうことができる場合、口の工程は除かれることもあ
る）、菌体を破砕し、その破砕懸濁液を遠心分離して、
その上清又は沈渣のいずれかを精製過程に付すという形
式で行なわれている。しかし、一般に、該、ｉ：清また
は沈渣からの抽出液はプロテアーゼ活性が強いため、目
的タンパクが分解されることが多い。
例えば、と１〜免疫インターフエロン（以下、旧［Ｎ−
γと略す）を大腸菌を用いて生産する場合、菌体により
生産されたｈｒＦＮ−γを抽出する際、菌体を破砕する
と、本来目的としている１４６アミノ酸より成るペプチ
ドのＣ末端側が切断された１３１アミノ酸より成るペプ
チドが多く得られる。このＣ末端側の切断を抑え、１４
６アミノ酸よりなるペプチドとして得るためにこれまで
、プロテアーゼインヒビターを添加して分解を抑える（
米国特許第４．４７６、０６９号）、蛋白変性剤を用い
て、目的ペプチドも含めた菌体タンパクを菌体破砕と同
［、′ｉに凝集・沈澱さけた後、精製する（特開昭５９
−１６１３２１号）雪の技術が開示され、本出願人も先
に銅又は亜鉛の塩とポリエチレンイミンとを０１川して
ｈＩＦＮ−γを効率良く抽出・精製する方法を開発して
いる。
γと略す）を大腸菌を用いて生産する場合、菌体により
生産されたｈｒＦＮ−γを抽出する際、菌体を破砕する
と、本来目的としている１４６アミノ酸より成るペプチ
ドのＣ末端側が切断された１３１アミノ酸より成るペプ
チドが多く得られる。このＣ末端側の切断を抑え、１４
６アミノ酸よりなるペプチドとして得るためにこれまで
、プロテアーゼインヒビターを添加して分解を抑える（
米国特許第４．４７６、０６９号）、蛋白変性剤を用い
て、目的ペプチドも含めた菌体タンパクを菌体破砕と同
［、′ｉに凝集・沈澱さけた後、精製する（特開昭５９
−１６１３２１号）雪の技術が開示され、本出願人も先
に銅又は亜鉛の塩とポリエチレンイミンとを０１川して
ｈＩＦＮ−γを効率良く抽出・精製する方法を開発して
いる。
一方、近年、目的とするタンパクをｍ胞外（ペリプラズ
ム又ｔよ培地中）に分泌・生産させることにより、抽出
液中の不純物を少なくし、或いはプロテアーゼによる分
解をできるだけ少なくし、目的物質の精製を容易にしに
うとする試みもなされているが、効率良く分泌ざＵる技
術や、分泌過程でＪ′３こる１πｉ駆体の正しいプロセ
シング（通常、分泌ペプチド又はタンパクはその前駆体
が何らかの分解過程を経て分泌される）などにおいて、
未だ実用化できる迄には至っていない。
ム又ｔよ培地中）に分泌・生産させることにより、抽出
液中の不純物を少なくし、或いはプロテアーゼによる分
解をできるだけ少なくし、目的物質の精製を容易にしに
うとする試みもなされているが、効率良く分泌ざＵる技
術や、分泌過程でＪ′３こる１πｉ駆体の正しいプロセ
シング（通常、分泌ペプチド又はタンパクはその前駆体
が何らかの分解過程を経て分泌される）などにおいて、
未だ実用化できる迄には至っていない。
［発明が解決しようとする問題点］
本発明者らは、大腸菌で発現される旧ｒＮ−７が、特に
１８万菌体からの抽出工程において分解され易いという
問題点に鑑み、鋭意？ｔｌｌ究のれ一宋、ある特定のプ
ロプアーゼ活性を欠損した大腸菌を宿主として用いるこ
とにより上記の問題を解決しうろことを兄出し、本発明
を完成づ−るに至った。
１８万菌体からの抽出工程において分解され易いという
問題点に鑑み、鋭意？ｔｌｌ究のれ一宋、ある特定のプ
ロプアーゼ活性を欠損した大腸菌を宿主として用いるこ
とにより上記の問題を解決しうろことを兄出し、本発明
を完成づ−るに至った。
［問題点を解決するための手段］
本発明の宿主として使用できる目的変異株はジイソプロ
ピルフルオロフォスフエイト、フェニルメブールスルフ
ォニルフルンライド、Ｎ−α−トシル−Ｌ−リシルクロ
ロメブルケトン、Ｎ−トシル−［、−フェニルアラニン
ク【コ自メチルケトン、エヂレンジアミン四１．１１
（ＥＤＴＡ） 、ロイペプチン、アンチパイン、Ｃ２−
マクログロブリンおよび一モスタチンによって阻害され
ず、塩化亜鉛および塩化銅で阻害されるプロテアーゼ活
性が欠損した大腸菌であり、更に好ましくはヒト免疫イ
ンターフｓ［１ン活性を有するポリペプチドを分解する
プロテアーゼ活性が欠損している大腸菌である。
ピルフルオロフォスフエイト、フェニルメブールスルフ
ォニルフルンライド、Ｎ−α−トシル−Ｌ−リシルクロ
ロメブルケトン、Ｎ−トシル−［、−フェニルアラニン
ク【コ自メチルケトン、エヂレンジアミン四１．１１
（ＥＤＴＡ） 、ロイペプチン、アンチパイン、Ｃ２−
マクログロブリンおよび一モスタチンによって阻害され
ず、塩化亜鉛および塩化銅で阻害されるプロテアーゼ活
性が欠損した大腸菌であり、更に好ましくはヒト免疫イ
ンターフｓ［１ン活性を有するポリペプチドを分解する
プロテアーゼ活性が欠損している大腸菌である。
本発明の目的変異株は次のようにして得られる。
まず、組換え微生物の宿主となる大腸菌に変異誘導処理
を施す。次に、例えばこの変異誘導処理を施した菌体を
培養し、菌体破砕液（＋ｙｓａｔｅ）に、対象となるタ
ンパクを添加後、ＳＯ３−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動（以下５Ｏ３−ＰＡＧＥ：ど略す）でそのタンパク
の分解の有無を解析することにより、目的タンパク（例
えばｈｔｒ’Ｎ−γ）分解活性の欠損した変異株を選択
する。もし大！ｌｌ菌が目的タンパクを高生産する形質
転換体である場合は、該形質転換体の破砕液又は菌体の
培養液その・ｂのを直接５Ｏ３−ＰＡＧＥで解析するこ
とによっても目的とする変異株を得ることができる。こ
の様にして得られた突然変異株を宿主として目的タンパ
ク（ｈｌＦＮ−γ）発現ベクターを導入し、形質転換を
行ない、得られた形質転換株を培養して目的タンパク（
ｈＩＦＮ−γ）を生産させ、この培￥［体を破砕し、目
的タンパク（ｈｌＦＮ−γ）を抽出・精製する。本発明
では、宿主が目的タンパク（ｈＩＦＮ−γ）分解活性を
欠損しているため、プロテアーゼインヒビターや蛋白変
性剤を抽出工程で全く用いなくても、目的タンパク（ｈ
ｌＦＮ−γ）は分解されることなく得られる。
を施す。次に、例えばこの変異誘導処理を施した菌体を
培養し、菌体破砕液（＋ｙｓａｔｅ）に、対象となるタ
ンパクを添加後、ＳＯ３−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動（以下５Ｏ３−ＰＡＧＥ：ど略す）でそのタンパク
の分解の有無を解析することにより、目的タンパク（例
えばｈｔｒ’Ｎ−γ）分解活性の欠損した変異株を選択
する。もし大！ｌｌ菌が目的タンパクを高生産する形質
転換体である場合は、該形質転換体の破砕液又は菌体の
培養液その・ｂのを直接５Ｏ３−ＰＡＧＥで解析するこ
とによっても目的とする変異株を得ることができる。こ
の様にして得られた突然変異株を宿主として目的タンパ
ク（ｈｌＦＮ−γ）発現ベクターを導入し、形質転換を
行ない、得られた形質転換株を培養して目的タンパク（
ｈＩＦＮ−γ）を生産させ、この培￥［体を破砕し、目
的タンパク（ｈｌＦＮ−γ）を抽出・精製する。本発明
では、宿主が目的タンパク（ｈＩＦＮ−γ）分解活性を
欠損しているため、プロテアーゼインヒビターや蛋白変
性剤を抽出工程で全く用いなくても、目的タンパク（ｈ
ｌＦＮ−γ）は分解されることなく得られる。
以下、旧「Ｎ−γタンパクの分解活性を欠損した大腸菌
およびそれを宿主としたｈｒｒＮ−γ発現ベクターによ
る形質転換体について詳述するが、本発明の範囲は、ｉ
Ｔｉに述べた性質をもつ分解酵素を欠損した大腸菌であ
れば、この限りでないことは言うまでもない。
およびそれを宿主としたｈｒｒＮ−γ発現ベクターによ
る形質転換体について詳述するが、本発明の範囲は、ｉ
Ｔｉに述べた性質をもつ分解酵素を欠損した大腸菌であ
れば、この限りでないことは言うまでもない。
尚、本発明により得られた新規大腸菌は、５Ｂ８２８２
と命名され、工業技術員微生物工業技術研究所に微工研
奇菌第８４５５号（ＦＥＲ）ＩＰ−８４５５）として寄
託されている。
と命名され、工業技術員微生物工業技術研究所に微工研
奇菌第８４５５号（ＦＥＲ）ＩＰ−８４５５）として寄
託されている。
旧「Ｎ−γ生産菌である−３１１０（８２５）／ ｐＩ
Ｎ５Ｔ４（特開昭６０−２４１８７に開示されたプラス
ミドｐｌＨ５ＧＩＦ５４上のアンピシリン耐性遺伝子（
八〇ｒ）をテトラサイクリン耐性遺伝子（ＴＣ’ ）に
置ぎ換えたプラスミドｐｌＮ５Ｔ４で形質転換された大
腸菌）をＬ８培地（０，５％酵母エキス、１％バクトー
トリブトン、０．５％Ｎａ ＣＪ 、ｐＨ７、ｏ）中、
３７℃で一晩培養し、菌体を１０．ＯＯＯｒｐｍ 、
５分間遠心分離して菌体を集菌した侵、Ｈ９培地（０，
１％ＮＨ４Ｃｊ 、 ０．６％ Ｎａ ２ Ｆ１
０Ｐ４ 、 ０．３％ ＫＨ２ＰＯ４、０，０５％
Ｎａ Ｃｊｌ 、Ｄｔ１７．４に調整したものに、１Ｍ
ＭＵ ８０４を２ｄ／ｆＪ、２０％グルコースを１０ｄ
／Ｊ、ＩＭ ＣａＣ１）２を０．１ｄ／Ｊ加える）で
菌体を洗浄し、同培地に懸濁した。これに変異誘導剤と
してニド臼ソグアニジン（以下１４１Ｇと略す）を、５
０μ９／威の濃度となる様に添加し、３０分間ｔｌｉ買
した後、１０，０ＯＯｒｌ）ｌ 、５分間遠心分離して
菌体を集菌した。この菌体をＬＢ培地を用いて洗浄した
後、同培地に植菌した。これを３１℃で一晩培養した後
、プレートに出現したコロニーを、ＬＢ培地５００ ｍ
を入れたヂ」−ブに１白金耳ずつ植菌し、３１℃で一晩
培養した。１ｏ、ｏｏｏｒｐｍ ５分間遠心分離後、Ｌ
ｙｓｏｚｙｍｅ −ＥＤＴΔ溶液（５００μ７ ／ ｄ
Ｌｙｓｏｚｙｍｅ。
Ｎ５Ｔ４（特開昭６０−２４１８７に開示されたプラス
ミドｐｌＨ５ＧＩＦ５４上のアンピシリン耐性遺伝子（
八〇ｒ）をテトラサイクリン耐性遺伝子（ＴＣ’ ）に
置ぎ換えたプラスミドｐｌＮ５Ｔ４で形質転換された大
腸菌）をＬ８培地（０，５％酵母エキス、１％バクトー
トリブトン、０．５％Ｎａ ＣＪ 、ｐＨ７、ｏ）中、
３７℃で一晩培養し、菌体を１０．ＯＯＯｒｐｍ 、
５分間遠心分離して菌体を集菌した侵、Ｈ９培地（０，
１％ＮＨ４Ｃｊ 、 ０．６％ Ｎａ ２ Ｆ１
０Ｐ４ 、 ０．３％ ＫＨ２ＰＯ４、０，０５％
Ｎａ Ｃｊｌ 、Ｄｔ１７．４に調整したものに、１Ｍ
ＭＵ ８０４を２ｄ／ｆＪ、２０％グルコースを１０ｄ
／Ｊ、ＩＭ ＣａＣ１）２を０．１ｄ／Ｊ加える）で
菌体を洗浄し、同培地に懸濁した。これに変異誘導剤と
してニド臼ソグアニジン（以下１４１Ｇと略す）を、５
０μ９／威の濃度となる様に添加し、３０分間ｔｌｉ買
した後、１０，０ＯＯｒｌ）ｌ 、５分間遠心分離して
菌体を集菌した。この菌体をＬＢ培地を用いて洗浄した
後、同培地に植菌した。これを３１℃で一晩培養した後
、プレートに出現したコロニーを、ＬＢ培地５００ ｍ
を入れたヂ」−ブに１白金耳ずつ植菌し、３１℃で一晩
培養した。１ｏ、ｏｏｏｒｐｍ ５分間遠心分離後、Ｌ
ｙｓｏｚｙｍｅ −ＥＤＴΔ溶液（５００μ７ ／ ｄ
Ｌｙｓｏｚｙｍｅ。
１ ｍＨＥＤＴＡ） ２００μρを加え、凍結溶融法に
より菌体を破砕した。これに１１１１９７ａｌｌの８１
度に調整したｈ１１’Ｎ−γ溶液１００μｍを加え、３
７℃、１時間イン１ユベートシ、５ＤＳＩｆンブル溶液
（１０％グリヒリン、５％ ２−メルトカプトエタノー
ルＳ １６２．５ ｍＭ トリス−塩酸バｙ ７ Ｆ
− 、 ｐＨＧ．８）１５０μｐを加え、１００℃５分
間処理した後、１０、０００ｒｔｕｎ １０分間遠心分
離し、−上清をＳＯＳ−ＰＡＧＥにかり、１４６アミノ
酸からなる旧ＩＮ− γ（分子量約１８、０００）の残
存量を検討した。この様にして、約２、０００株のうち
から、旧「Ｎ−γ分解活性のない変？２株を１株１すた
。
より菌体を破砕した。これに１１１１９７ａｌｌの８１
度に調整したｈ１１’Ｎ−γ溶液１００μｍを加え、３
７℃、１時間イン１ユベートシ、５ＤＳＩｆンブル溶液
（１０％グリヒリン、５％ ２−メルトカプトエタノー
ルＳ １６２．５ ｍＭ トリス−塩酸バｙ ７ Ｆ
− 、 ｐＨＧ．８）１５０μｐを加え、１００℃５分
間処理した後、１０、０００ｒｔｕｎ １０分間遠心分
離し、−上清をＳＯＳ−ＰＡＧＥにかり、１４６アミノ
酸からなる旧ＩＮ− γ（分子量約１８、０００）の残
存量を検討した。この様にして、約２、０００株のうち
から、旧「Ｎ−γ分解活性のない変？２株を１株１すた
。
この分解活１／Ｉの欠損変異がプラスミド由来のもので
はなく宿主由来の変異であることを確かめるため、次に
プラスミドのキユアリング（ｃｕｒｉｎｇ）を行なった
。即ら、プラスミド（ｐｌＮ５Ｔ４）上にある遺伝子に
よってテトラサイクリン耐性を示す上記変異株を、テト
ラサイクリンを含まない培地で培養し、テトう１ノイク
リン感受性（丁ｃｓ）株となった株を、プラスミドの脱
落した株として選択した。この株について、既述のよう
に菌体破砕液にｈｌＦＮ−γタンパクを加えＳＯＳ−Ｐ
ＡＧＬにより、ｈｌＦＮ−γタンパクの分解の有無を調
べた結果、全く分解活性はみられなかった。この結果は
、本変箕株が宿主染色体の変異によるものであることを
示している。次に、このプラスミドが脱落した株に再び
、ｈｌｒＮ〜γを発現ケる様）立伝子の組込Ｊ［れたプ
ラスミドであるｐｌＮ４Ｔ４ （既述）を常法に従って
形質転換した。テトラサイクリン耐性をマーカーとして
、形質転換株を選択し、その形質転換株の菌体破砕・抽
出液におけるｈｌＦＮ−γの分解の有無をＳＯＳ−ＰＡ
Ｇ［で調べた結果、旧［Ｎ−γは全く分解されていなか
った。
はなく宿主由来の変異であることを確かめるため、次に
プラスミドのキユアリング（ｃｕｒｉｎｇ）を行なった
。即ら、プラスミド（ｐｌＮ５Ｔ４）上にある遺伝子に
よってテトラサイクリン耐性を示す上記変異株を、テト
ラサイクリンを含まない培地で培養し、テトう１ノイク
リン感受性（丁ｃｓ）株となった株を、プラスミドの脱
落した株として選択した。この株について、既述のよう
に菌体破砕液にｈｌＦＮ−γタンパクを加えＳＯＳ−Ｐ
ＡＧＬにより、ｈｌＦＮ−γタンパクの分解の有無を調
べた結果、全く分解活性はみられなかった。この結果は
、本変箕株が宿主染色体の変異によるものであることを
示している。次に、このプラスミドが脱落した株に再び
、ｈｌｒＮ〜γを発現ケる様）立伝子の組込Ｊ［れたプ
ラスミドであるｐｌＮ４Ｔ４ （既述）を常法に従って
形質転換した。テトラサイクリン耐性をマーカーとして
、形質転換株を選択し、その形質転換株の菌体破砕・抽
出液におけるｈｌＦＮ−γの分解の有無をＳＯＳ−ＰＡ
Ｇ［で調べた結果、旧［Ｎ−γは全く分解されていなか
った。
尚、キユアリングした変異株である−３１１０（Ｈ２Ｓ
）は、ＳＢＭ ２８２と命名され、微生物工業技術院研
究所に寄託されている（ＦＥＢＮ Ｐ− ８４５５＞。
）は、ＳＢＭ ２８２と命名され、微生物工業技術院研
究所に寄託されている（ＦＥＢＮ Ｐ− ８４５５＞。
又、変異誘導処理による変異株の作製・選択は、ベクタ
ーの導入されていない大腸菌に変異誘導処理を施し、目
的の変異株を選択し、これに目的タンパク発現ベクター
を導入しても得ることができる。
ーの導入されていない大腸菌に変異誘導処理を施し、目
的の変異株を選択し、これに目的タンパク発現ベクター
を導入しても得ることができる。
２、 、パ．処理Ｃ、られた − の−次に、実施例の
上記１に示した変異誘導処理により得られたｌｌｒＦＮ
−γ分解活性欠損変異株が、どの様なプロテアーゼを欠
損している株であるかを調べた。その結果、以下に示す
様に、一般的トリプシン様醇累阻害剤を用いても阻害さ
れず、一方、銅の塩や亜鉛の塩によっては阻害される様
なプロテアーゼ活性が欠損している変異株であった。変
異処Ｊｑ＋をしない親株（ Ｗ３１１０）を宿主とした
、■「Ｎ−γを生産する形質転換体であるＷ３１１０
／ ｐｌＮ５Ｔ４を、ＬＢ培地１００−の入った５００
ｍ容マイヤーフラス：ｌＴー３７℃１ｒＵａ７ｓシｔ；
−ｖａ、８， ０００ｒｐｍ、１０分間ｉｕ心分離して
集菌した。得られた湿菌体１ｇを５０ｍＨ１”Ｊス−Ｆ
Ｆａｌ＜ッＶ７ （ｐＨ７、５）３０ｄｋ−懸濁後、
フレンチプレスホモジナイザーを用いて２０， ０００
ｐｓｉでホモジナイズし、８． ０００ｒｐｎ＋、２０
分間遠心分離した。
上記１に示した変異誘導処理により得られたｌｌｒＦＮ
−γ分解活性欠損変異株が、どの様なプロテアーゼを欠
損している株であるかを調べた。その結果、以下に示す
様に、一般的トリプシン様醇累阻害剤を用いても阻害さ
れず、一方、銅の塩や亜鉛の塩によっては阻害される様
なプロテアーゼ活性が欠損している変異株であった。変
異処Ｊｑ＋をしない親株（ Ｗ３１１０）を宿主とした
、■「Ｎ−γを生産する形質転換体であるＷ３１１０
／ ｐｌＮ５Ｔ４を、ＬＢ培地１００−の入った５００
ｍ容マイヤーフラス：ｌＴー３７℃１ｒＵａ７ｓシｔ；
−ｖａ、８， ０００ｒｐｍ、１０分間ｉｕ心分離して
集菌した。得られた湿菌体１ｇを５０ｍＨ１”Ｊス−Ｆ
Ｆａｌ＜ッＶ７ （ｐＨ７、５）３０ｄｋ−懸濁後、
フレンチプレスホモジナイザーを用いて２０， ０００
ｐｓｉでホモジナイズし、８． ０００ｒｐｎ＋、２０
分間遠心分離した。
第１表に示す種々のプロテアーゼ阻害物質を、各最終温
度になる様溶解した０．１Ｍトリス−Ｊｐ酸バッファ
− （ｐＨ７．５） ７００μｇに上記上清５０μｇを
加え、これにｈｌＦＮ−γ溶液（ＩＱ／ａｔり ２５
０μｇを加えた後′、３７℃１時間インキュベーション
した。
度になる様溶解した０．１Ｍトリス−Ｊｐ酸バッファ
− （ｐＨ７．５） ７００μｇに上記上清５０μｇを
加え、これにｈｌＦＮ−γ溶液（ＩＱ／ａｔり ２５
０μｇを加えた後′、３７℃１時間インキュベーション
した。
この溶液を、ＳＯＳ−ＰＡＧＥにかけ、旧ＦＭー７分解
の有無を検問した。その結果を第１表に丞した。
の有無を検問した。その結果を第１表に丞した。
第１表に掲げた物質中、ｈｌＦＮ−γ分解活性を阻害し
たのはＣＯＣｆＪ ２及びＺｎＣρ２のみで、一般にト
リプシン様酵素の阻害剤と考えられている他の物質では
ｈｌｒＮ−γ分解活性は１ｉ１１害されなかった。
たのはＣＯＣｆＪ ２及びＺｎＣρ２のみで、一般にト
リプシン様酵素の阻害剤と考えられている他の物質では
ｈｌｒＮ−γ分解活性は１ｉ１１害されなかった。
３、 ’ＴＴｆ’ （７）ｈｌｒＨ−＋７）次に
、野生株を宿主とした形質転換体Ｗ３１１０ ／ｐＩＮ
５丁４と上記変異株を宿主とした形質転換株Ｗ３１１０
（Ｈ２Ｓ＞／ ｐＩＮ５Ｔ４について、ｈｌｌ’Ｎ−γ
生産性と、各形質転換株培養菌体の破砕後のｈＩＦＮ−
γの分解の経時的変化の検討を行なった。
、野生株を宿主とした形質転換体Ｗ３１１０ ／ｐＩＮ
５丁４と上記変異株を宿主とした形質転換株Ｗ３１１０
（Ｈ２Ｓ＞／ ｐＩＮ５Ｔ４について、ｈｌｌ’Ｎ−γ
生産性と、各形質転換株培養菌体の破砕後のｈＩＦＮ−
γの分解の経時的変化の検討を行なった。
即ち、讐３１１０ ／ｐｌＮ５丁４及びＷ３１１０（８
２５）／ ｐｌＮ５丁４を先述と同様に培養・集菌し、
バッファーに懸濁した。この懸濁液（Ｗ）、懸濁液をフ
レンチプレスにより国体破砕後遠心分離した沈澱（Ｐ）
、及び、遠心力！１１１１後０．１５．３０．６０分後
の各上清について、既述の５ＯＳ−ＰＡＧＥを用いて、
分解されない旧［Ｎ−γタンパク（分子ａ約１８，００
０） ｍと分解されたタンパク（分子旧約１６，０００
） ｆｆｉとを検討した。
２５）／ ｐｌＮ５丁４を先述と同様に培養・集菌し、
バッファーに懸濁した。この懸濁液（Ｗ）、懸濁液をフ
レンチプレスにより国体破砕後遠心分離した沈澱（Ｐ）
、及び、遠心力！１１１１後０．１５．３０．６０分後
の各上清について、既述の５ＯＳ−ＰＡＧＥを用いて、
分解されない旧［Ｎ−γタンパク（分子ａ約１８，００
０） ｍと分解されたタンパク（分子旧約１６，０００
） ｆｆｉとを検討した。
結果を第１図に示した。
Ｗ３１１０ ／ρｌＮ５Ｔ４については、１５分以内に
上清で５０％が、６０分以内にはほぼ１００％のｈｌｒ
Ｎ−γが分離されているのに対し、誓３１ ｔｏ（８２
５）／ ０ＩＮ５Ｔ４では、６０分後でも分解はほとん
ど見られず、分子良約１８、０００のｈ［Ｉ’Ｎ−γは
安定に保たれていた。又、■［Ｎ−γの生産性には認め
られなかった。
上清で５０％が、６０分以内にはほぼ１００％のｈｌｒ
Ｎ−γが分離されているのに対し、誓３１ ｔｏ（８２
５）／ ０ＩＮ５Ｔ４では、６０分後でも分解はほとん
ど見られず、分子良約１８、０００のｈ［Ｉ’Ｎ−γは
安定に保たれていた。又、■［Ｎ−γの生産性には認め
られなかった。
Ｗ３１１０ ／１）ＩＮ５Ｔ４及Ｕ Ｗ３１１０（８２
５）／ ｌ］Ｉｔ４５Ｔ４を、３゜認容ジャーファーメ
ンタ−中、２０愛 ［Ｂ培地で３０’０ ３６時間培ｉ
Ｌ ／Ｃ０１ｒＪ ラｔＬ タＪｆｊ 養液ヲａ、
０００ｒＤ＋ｎ、１０分間遠心分離して集菌した。この
湿菌体各１ Ｋ９を２（１ｍＨＩ” ！Ｊ スー塩酸バ
ッフ １− （１１１１７，５） ７．００（１ｍに懸
濁し、これをマントンゴーリン社製本ＬジナイザーＭ１
５を用いて８，０００ｐｓｉで菌体破砕した。尚、Ｗ３
１１０ ／ｐＩＮ５Ｔ４にライては、２０ｍＨ１−リス
ー塩耐バッファーの代わりに、１１＋１Ｈ２ｎＣ，Ｉ）
２を合む同バッフ？−を用いた。この破砕液を、７．０
００ ｒｐｎ＋ 。
５）／ ｌ］Ｉｔ４５Ｔ４を、３゜認容ジャーファーメ
ンタ−中、２０愛 ［Ｂ培地で３０’０ ３６時間培ｉ
Ｌ ／Ｃ０１ｒＪ ラｔＬ タＪｆｊ 養液ヲａ、
０００ｒＤ＋ｎ、１０分間遠心分離して集菌した。この
湿菌体各１ Ｋ９を２（１ｍＨＩ” ！Ｊ スー塩酸バ
ッフ １− （１１１１７，５） ７．００（１ｍに懸
濁し、これをマントンゴーリン社製本ＬジナイザーＭ１
５を用いて８，０００ｐｓｉで菌体破砕した。尚、Ｗ３
１１０ ／ｐＩＮ５Ｔ４にライては、２０ｍＨ１−リス
ー塩耐バッファーの代わりに、１１＋１Ｈ２ｎＣ，Ｉ）
２を合む同バッフ？−を用いた。この破砕液を、７．０
００ ｒｐｎ＋ 。
２０分間遠心分離して１９られた上清に１５％ポリエチ
レンイミン（ｐｌ＋８．０ 、ＨＣｊｌで調整）を最終
濃度０．７５％となる様に加え、１０分間撹拌復、４℃
２時間放置し、生じた沈澱を７．００Ｏｒ（１１１，２
０分間遠心分離して除去した。この上清により、以下の
様にしてｈｌＦＮ−γを精製した。
レンイミン（ｐｌ＋８．０ 、ＨＣｊｌで調整）を最終
濃度０．７５％となる様に加え、１０分間撹拌復、４℃
２時間放置し、生じた沈澱を７．００Ｏｒ（１１１，２
０分間遠心分離して除去した。この上清により、以下の
様にしてｈｌＦＮ−γを精製した。
即ち、上記上清を、２０１８ Ｎ−２−ヒドロキシエ
ヂルピペラジン−Ｎ′−３−プロパンスルフオン酸バッ
ファー（ＥＰＰＳバッファー） ｐｔ（８，６で平衡化
したＱ＾［セファデックス＾−２５（ファルマシア社製
）カラムにかけて得られた素通り画分を、０．１％２−
メルトカプトエタノール ＩＩＩＨトリス−塩酸バッファーｐＨ７、４で平衡化し
たＣｌファロースＣＬ６Ｂ （ファルマシア社製）カラ
ムに、この素通り画分をかけ吸着した両分を、０〜０、
５ＭのＮａＣ．０直線部度勾配で溶出し、イン、ターフ
エロン活性の高い区分を集めた。なお、インターフェロ
ン活性は特開昭５８ − ２０１９９５＠公報に記載し
た方法に準じて測定した。続いてこの両分に５０％飽和
となる様に硫酸アンモニウムを添加し、塩析を行い、７
．００Ｏｒｌ）ＩＩ， ２０分間遠心分離して沈澱を４
りだ。これを、０．３Ｍ ＮａＣ！Ｊ及び０．１％２
−Ｈ［を含む２０ｍＨリン酸ナトリウムバッファー（Ｐ
ＳＢ）ｐＨ７，４に溶解し、同バッファーで１７衡化し
たけファクリルＳ−２００（ファルマシア社製）カラム
にかけ、９９％以１ニの純度を有する最終精製品を１ｒ
、ｌり。Ｗ３１１０ ／ｐｌＮ５Ｔ４トＷ３１１０
（Ｈ２Ｓ）／ｐｌＮ５Ｔ４１．：よって生産されたｈ［
ＦＮ−γの最終収率は各々、５％、１２％であった。
ヂルピペラジン−Ｎ′−３−プロパンスルフオン酸バッ
ファー（ＥＰＰＳバッファー） ｐｔ（８，６で平衡化
したＱ＾［セファデックス＾−２５（ファルマシア社製
）カラムにかけて得られた素通り画分を、０．１％２−
メルトカプトエタノール ＩＩＩＨトリス−塩酸バッファーｐＨ７、４で平衡化し
たＣｌファロースＣＬ６Ｂ （ファルマシア社製）カラ
ムに、この素通り画分をかけ吸着した両分を、０〜０、
５ＭのＮａＣ．０直線部度勾配で溶出し、イン、ターフ
エロン活性の高い区分を集めた。なお、インターフェロ
ン活性は特開昭５８ − ２０１９９５＠公報に記載し
た方法に準じて測定した。続いてこの両分に５０％飽和
となる様に硫酸アンモニウムを添加し、塩析を行い、７
．００Ｏｒｌ）ＩＩ， ２０分間遠心分離して沈澱を４
りだ。これを、０．３Ｍ ＮａＣ！Ｊ及び０．１％２
−Ｈ［を含む２０ｍＨリン酸ナトリウムバッファー（Ｐ
ＳＢ）ｐＨ７，４に溶解し、同バッファーで１７衡化し
たけファクリルＳ−２００（ファルマシア社製）カラム
にかけ、９９％以１ニの純度を有する最終精製品を１ｒ
、ｌり。Ｗ３１１０ ／ｐｌＮ５Ｔ４トＷ３１１０
（Ｈ２Ｓ）／ｐｌＮ５Ｔ４１．：よって生産されたｈ［
ＦＮ−γの最終収率は各々、５％、１２％であった。
［発明の効果］
以上に示した様に、本発明よる方法を用いれば、菌体内
で同じ発現Ｗでありながら目的タンパク（旧「Ｎ−γ）
を２イ８以上の収率で）ｑろことができる。又、目的タ
ンパク（ｈｌＦＮ−γ）が菌体破砕後も分解されないた
め、プロテアーゼインヒビターや蛋白変性剤を用いる必
要はなく、抽出・粘に／！段階の簡素化・効率化を計る
ことができる。
で同じ発現Ｗでありながら目的タンパク（旧「Ｎ−γ）
を２イ８以上の収率で）ｑろことができる。又、目的タ
ンパク（ｈｌＦＮ−γ）が菌体破砕後も分解されないた
め、プロテアーゼインヒビターや蛋白変性剤を用いる必
要はなく、抽出・粘に／！段階の簡素化・効率化を計る
ことができる。
第１図は、旧「Ｎ−γタンパクの分解の経１目的変化を
調べるための５Ｏ３−ＰＡＧＥを示す。図中、Ｗは培養
菌体の破砕前回濁液、］〕は、該懸濁液を破砕・遠心処
理して得られた沈澱物、Ｏ’ 、 １５’ 、 ３０’
。 ６０′ はそれぞれ、菌体破砕後の遠心上清をＱ、Ｉｓ
。 ３０、６０５）間３７℃でインキュベーションした後の
各秤タンパクのパターンを示す。ａは旧ｒＮ−７のクン
バクに相当ザるバンド、ｂは旧［Ｎ−γブ）落物に相当
するタンパクのバンドである。 １）ム１出願人 サン１へり一株１（会社覧こｍ−、＝
二、Ｉ’、、ｌ１ 手 続 補 正 書 ′ 昭和６１年８月７３日 ２、発明の名称 新規な大腸菌宿主及びその利用 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 住所 名称 （１９０）サントリー株式会社４、代理人 明細書の〔発明の詳細な説明〕の欄 ６、補正の内容 明細書の記載を下記の通り訂正する。 ９ １４ Ｓ ＢＭ ２８２ Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＳＢＭ９ １５ 工業技術
員 工業技術院９ １６ 微工研寄菌第８４５５号
微工研条寄第１０９７号（ＦＥＢＭＰ−８４５５）
（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９７）１０ 下１
ｓｏｏｍｌ ５００μ１１１２ ２〜６ 株を
、プラスミドの・・・ 株を選択し、プラスミド・・・
選択した。 の脱落を確認した。 １２ １０ ｐＩＮ４Ｔ４ ｐＩＮ
５Ｔ４１２ 下４ Ｓ ＢＭ ２８２ Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＳＢＭ１２ 下４〜下
６微生物・・・研究所 工業技術院微生物工業技術研究
所 １６ 下３ ＦＥＲＭＰ−８４５５ＦＥＲＭＢＰ−
１０９７１７６生産性には 生産性には差は以上
調べるための５Ｏ３−ＰＡＧＥを示す。図中、Ｗは培養
菌体の破砕前回濁液、］〕は、該懸濁液を破砕・遠心処
理して得られた沈澱物、Ｏ’ 、 １５’ 、 ３０’
。 ６０′ はそれぞれ、菌体破砕後の遠心上清をＱ、Ｉｓ
。 ３０、６０５）間３７℃でインキュベーションした後の
各秤タンパクのパターンを示す。ａは旧ｒＮ−７のクン
バクに相当ザるバンド、ｂは旧［Ｎ−γブ）落物に相当
するタンパクのバンドである。 １）ム１出願人 サン１へり一株１（会社覧こｍ−、＝
二、Ｉ’、、ｌ１ 手 続 補 正 書 ′ 昭和６１年８月７３日 ２、発明の名称 新規な大腸菌宿主及びその利用 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 住所 名称 （１９０）サントリー株式会社４、代理人 明細書の〔発明の詳細な説明〕の欄 ６、補正の内容 明細書の記載を下記の通り訂正する。 ９ １４ Ｓ ＢＭ ２８２ Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＳＢＭ９ １５ 工業技術
員 工業技術院９ １６ 微工研寄菌第８４５５号
微工研条寄第１０９７号（ＦＥＢＭＰ−８４５５）
（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９７）１０ 下１
ｓｏｏｍｌ ５００μ１１１２ ２〜６ 株を
、プラスミドの・・・ 株を選択し、プラスミド・・・
選択した。 の脱落を確認した。 １２ １０ ｐＩＮ４Ｔ４ ｐＩＮ
５Ｔ４１２ 下４ Ｓ ＢＭ ２８２ Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＳＢＭ１２ 下４〜下
６微生物・・・研究所 工業技術院微生物工業技術研究
所 １６ 下３ ＦＥＲＭＰ−８４５５ＦＥＲＭＢＰ−
１０９７１７６生産性には 生産性には差は以上
Claims (10)
- （１）ジイソプロピルフルオロフォスフェイト、フェニ
ルメチルスルフォニルフルオライド、Ｎ−α−トシル−
Ｌ−リシルクロロメチルケトン、Ｎ−トシル−Ｌ−フェ
ニルアラニンクロロメチルケトン、エチレンジアミン四
酢酸（ＥＤＴＡ）、ロイペプチン、アンチパイン、α＿
２−マクログロブリンおよびキモスタチンによって阻害
されず、塩化亜鉛および塩化銅で阻害されるプロテアー
ゼ活性が欠損した大腸菌。 - （２）前記プロテアーゼ活性がヒト免疫インターフェロ
ン活性を有するポリペプチドを分解する活性であること
を特徴とする特許請求の範囲第１項記載の大腸菌。 - （３）Ｗ３１１０（Ｍ２５）で表わされる特許請求の範
囲第２項記載の大腸菌。 - （４）ジイソプロピルフルオロフォスフェイト、フェニ
ルメチルスルフォニルフルオライド、Ｎ−α−トシル−
Ｌ−リシルクロロメチルケトン、Ｎ−トシル−Ｌ−フェ
ニルアラニンクロロメチルケトン、エチレンジアミン四
酢酸（ＥＤＴＡ）、ロイペプチン、アンチパイン、α＿
２−マクログロブリンおよびキモスタチンによって阻害
されず、塩化亜鉛および塩化銅で阻害されるプロテアー
ゼ活性が欠損した大腸菌を宿主とした、外来性タンパク
又はポリペプチドを生産する形質転換体。 - （５）宿主がＷ３１１０（Ｍ２５）で表わされる特許請
求の範囲第４項記載の形質転換体。 - （６）外来性タンパク又はポリペプチドが、ヒト免疫イ
ンターフェロン活性を有することを特徴とする特許請求
の範囲第４項記載の形質転換体。 - （７）Ｗ３１１０（Ｍ２５）／ｐＩＮ５Ｔ４で表わされ
る特許請求の範囲第６項記載の形質転換体。 - （８）ジイソプロピルフルオロフォスフェイト、フェニ
ルメチルスルフォニルフルオライド、Ｎ−α−トシル−
Ｌ−リシルクロロメチルケトン、Ｎ−トシル−Ｌ−フェ
ニルアラニンクロロメチルケトン、エチレンジアミン四
酢酸（ＥＤＴＡ）、ロイペプチン、アンチパイン、α＿
２−マクログロブリンおよびキモスタチンによって阻害
されず、塩化亜鉛および塩化銅で阻害されるプロテアー
ゼ活性が欠損した大腸菌を宿主とした形質転換体を培養
して外来性タンパク又はポリペプチドを製造する方法。 - （９）外来性タンパク又はポリペプチドがヒト免疫イン
ターフェロン活性を有することを特徴とする特許請求の
範囲第８項記載の方法。 - （１０）形質転換体がＷ３１１０（Ｍ２５）／ｐＩＮ５
Ｔ４で表わされる特許請求の範囲第９項記載の方法。
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60295140A JPH0650985B2 (ja) | 1985-12-27 | 1985-12-27 | 新規な大腸菌宿主 |
| DE8686118121T DE3680093D1 (de) | 1985-12-27 | 1986-12-29 | Neue e.coli-wirtszelle und ihre verwendung. |
| EP86118121A EP0230670B1 (en) | 1985-12-27 | 1986-12-29 | Novel host e. coli and use thereof |
| AT86118121T ATE64954T1 (de) | 1985-12-27 | 1986-12-29 | Neue e.coli-wirtszelle und ihre verwendung. |
| US06/947,398 US4874697A (en) | 1985-12-27 | 1986-12-29 | Novel Host e. coli and use thereof |
| ES198686118121T ES2028785T3 (es) | 1985-12-27 | 1986-12-29 | Un procedimiento para producir interferon humano inmune. |
| GR91400213T GR3002245T3 (en) | 1985-12-27 | 1991-07-04 | Novel host e. coli and use thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60295140A JPH0650985B2 (ja) | 1985-12-27 | 1985-12-27 | 新規な大腸菌宿主 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP31225393A Division JPH0763388B2 (ja) | 1993-12-13 | 1993-12-13 | 新規な大腸菌宿主を利用したタンパク又はポリペプチドの製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62155080A true JPS62155080A (ja) | 1987-07-10 |
| JPH0650985B2 JPH0650985B2 (ja) | 1994-07-06 |
Family
ID=17816794
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60295140A Expired - Lifetime JPH0650985B2 (ja) | 1985-12-27 | 1985-12-27 | 新規な大腸菌宿主 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4874697A (ja) |
| EP (1) | EP0230670B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0650985B2 (ja) |
| AT (1) | ATE64954T1 (ja) |
| DE (1) | DE3680093D1 (ja) |
| ES (1) | ES2028785T3 (ja) |
| GR (1) | GR3002245T3 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6509171B1 (en) | 1988-07-01 | 2003-01-21 | Genencor International, Inc. | Aspartic proteinase deficient filamentous fungi |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IT1246296B (it) * | 1990-07-25 | 1994-11-17 | Sclavo Spa | Procedimento di estrzione e purificazione del gamma interferone umano ricombinante |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4590159A (en) * | 1981-08-21 | 1986-05-20 | University Patents, Inc. | Enhancement of expression of protein synthesis in E. coli |
| JPS59146597A (ja) * | 1983-02-08 | 1984-08-22 | Toray Ind Inc | インタ−フエロン様ポリペロチドの生産方法 |
| US4758512A (en) * | 1984-03-06 | 1988-07-19 | President And Fellows Of Harvard College | Hosts and methods for producing recombinant products in high yields |
-
1985
- 1985-12-27 JP JP60295140A patent/JPH0650985B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1986
- 1986-12-29 EP EP86118121A patent/EP0230670B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-12-29 US US06/947,398 patent/US4874697A/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-12-29 AT AT86118121T patent/ATE64954T1/de not_active IP Right Cessation
- 1986-12-29 DE DE8686118121T patent/DE3680093D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-12-29 ES ES198686118121T patent/ES2028785T3/es not_active Expired - Lifetime
-
1991
- 1991-07-04 GR GR91400213T patent/GR3002245T3/el unknown
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6509171B1 (en) | 1988-07-01 | 2003-01-21 | Genencor International, Inc. | Aspartic proteinase deficient filamentous fungi |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0230670A2 (en) | 1987-08-05 |
| EP0230670A3 (en) | 1988-11-23 |
| US4874697A (en) | 1989-10-17 |
| DE3680093D1 (de) | 1991-08-08 |
| GR3002245T3 (en) | 1992-12-30 |
| JPH0650985B2 (ja) | 1994-07-06 |
| ATE64954T1 (de) | 1991-07-15 |
| ES2028785T3 (es) | 1992-07-16 |
| EP0230670B1 (en) | 1991-07-03 |
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