JP5951490B2 - 非複合ボツリヌス神経毒素を精製するための方法およびシステム - Google Patents
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Description
図1Aに示すように、非複合ボツリヌス毒素は、一般的には、発酵培養物から精製される。本明細書で使用される場合、「発酵培養物」とは、少なくとも1種のボツリヌス毒素を合成しており、および/または少なくとも1種のボツリヌス毒素を合成した、細胞および/またはその成分を含む培養物または培地をいう。例えば、Clostridium botulinumなどのクロストリジウム細菌は、あたたかい嫌気性雰囲気中などの、細菌増殖に誘導的な環境において、寒天プレート上で培養されてもよい。典型的には、培養工程は、所望の形態および得られる他の特性を有するクロストリジウムコロニーを可能にする。次いで、選択された培養されたクロストリジウムコロニーは、発酵培養として適切な培地中で発酵できる。培養細胞は、宿主細胞として、E.coli(大腸菌)または酵母細胞などの非クロストリジウム種を含んでもよく、これらは、組換え技術によって、ボツリヌス毒素を生合成可能にされる。適切な発酵培養条件は、使用される宿主細胞に依存し得、一般的には当該分野において公知である。
ある実施形態において、発酵培地から得られたサンプルは、1回以上のクロマトグラフィー前精製に供される。クロマトグラフィー前精製は、接線流ろ過、ヌクレアーゼ消化、ならびに清澄化遠心分離および/またはろ過の少なくとも1つを含み得る。本発明によって意図されるクロマトグラフィー前精製を含有するプロセスフローの非限定的な例は図1Aに提供される。上記のように、好ましい実施形態において、クロマトグラフィー前手順は、図1Bに図示されるプロセスにおけるような発酵培養それ自体またはそこに由来するろ液ではなく、ボツリヌス毒素を含む発酵培養の沈殿物(または不溶性画分)に対して実行される。すなわち、本発明の好ましい実施形態において、クロマトグラフィー前(清澄化)工程は酸沈殿(不溶性画分)から開始する。
図1Aはまた、本発明の特定の実施形態に従う、クロマトグラフィー精製工程を図示する。本発明の1つの実施形態に従って、非複合ボツリヌス毒素を精製するためのクロマトグラフィー方法は、高度に精製され、高い効力があり、非複合体型の神経毒を得るために、ボツリヌス毒素を含むサンプルを複数のクロマトグラフィーカラムに通すことを含む。
本明細書に記載される方法およびシステムは、高純度の、高収率である、そして高活性を有する非複合ボツリヌス毒素を提供するために有用である。以下の実施例1を参照のこと。この産物はまた、安全な薬学的組成物の調製のために、容易に安定化され、簡便に使用される。
本発明に従って精製された非複合ボツリヌス毒素は、薬学的組成物からの利益を受ける任意の被験体への投与のための活性成分としてこの毒素を含むこのような薬学的組成物の調製において使用できる。好ましい実施形態において、治療される被験体は、哺乳動物、好ましくはヒトである。本明細書で使用される場合、「薬学的組成物」とは、活性成分がボツリヌス毒素であり得る製剤をいう。この製剤は、少なくとも1種のさらなる成分を含有し、ヒト患者などの被験体への診断的、治療的、および/または美容的投与のために適切である。この薬学的組成物は液体または固体であり得;単一成分系または複数成分系、例えば、生理食塩水などの希釈剤で再構築された凍結乾燥組成物であり得る。
本発明の範囲内にあるプロセス(「本発明のプロセス」)を使用する非複合A型ボツリヌス毒素の精製は、非複合型を提供するためにクロマトグラフィー工程の追加によってさらに改変された、従来的なSchantzアプローチ(改変Schantzプロセス)に基づく精製と直接比較された。手短かに述べると、Clostridium botulinum細菌は培養され、発酵が完了するまで増殖された(通常、接種から収穫まで約72〜約120時間)。次いで、精製後手順の各々において、30Lの量の発酵培養物が使用された。
Claims (78)
- 非複合A型ボツリヌス毒素(ボツリヌス毒素A)を精製するための方法であって、前記方法は、
(a)粗非複合ボツリヌス毒素Aを含む混合物を提供することであって、前記粗非複合ボツリヌス毒素Aはネイティブ非毒素タンパク質から解離され、前記混合物は、
(i)ボツリヌス毒素Aを含む発酵培養物を酸沈殿に供し、不溶性酸沈殿物を産生するステップ;
(ii)ステップ(i)からの酸沈殿物を濃縮し、濃縮されたサンプルを産出するステップ;
(iii)宿主細胞核酸含量を減少させ、ボツリヌス毒素A及び非毒素タンパク質の複合体
を維持する条件下で、前記サンプルをヌクレアーゼ消化に供するステップ;
(iv) ステップ(iii)からの前記サンプルから細胞細片を除去し、清澄化されたサンプルを産出するステップ;
(v)疎水性相互作用カラムによるボツリヌス毒素A複合体の捕捉、及び不純物が前記カラムを素通りすることを可能にする条件下で、ステップ(iv)からの前記清澄化されたサンプルを前記疎水性相互作用カラムにローディングするステップ;
(vi)ステップ(v)の前記疎水性相互作用カラムから前記ボツリヌス毒素A複合体を溶出するステップ;及び
(vii)ステップ(vi)で得られた前記ボツリヌス毒素A複合体を前記複合体を破壊する
条件下で解離し、前記ネイティブ非毒素タンパク質から解離された粗非複合ボツリヌス毒素Aを含む混合物を産出するステップ;
によって得られ;
(b)アニオン交換カラムによる前記非複合ボツリヌス毒素Aの捕捉を可能にする条件下で、前記アニオン交換カラムにステップ(a)からのネイティブ非毒素タンパク質から解離された前記粗非複合ボツリヌス毒素Aを含む混合物をローディングすること;
(c)ステップ(b)の前記アニオン交換カラムから前記非複合ボツリヌス毒素Aを溶出して、前記非複合ボツリヌス毒素Aを含む溶離液を得ること;
(d)カチオン交換カラムによる非複合ボツリヌス毒素Aの捕捉を可能にする条件下でステップ(c)の前記アニオン交換カラムからの溶離液を前記カチオン交換カラムにローディングすること;および
(e)ステップ(d)の前記カチオン交換カラムから、精製非複合ボツリヌス毒素Aを溶出すること
を含む、方法。 - ステップ(ii)の濃縮されたサンプルが、
酸沈殿物に対して接線流ろ過を実施して前記沈殿物を濃縮すること
によって得られる、請求項1に記載の方法。 - ステップ(iii)のサンプルが、5〜7のpHでヌクレアーゼ消化に供される、請求項1
に記載の方法。 - ヌクレアーゼが非動物源に由来する、請求項3に記載の方法。
- ステップ(iv)において、細胞細片が遠心分離及び/又は濾過によって除去され、清澄化されたサンプルを産出する、請求項1に記載の方法。
- ステップ(vii)において、ボツリヌス毒素A複合体が、7.0〜8.4のpHを有する
緩衝液中で解離され、ネイティブ非毒素タンパク質から解離された粗非複合ボツリヌス毒素Aを含む混合物を得る、請求項1に記載の方法。 - ボツリヌス毒素A複合体が、pH7.8でTris緩衝液中で解離される、請求項6に記載の方法。
- 方法が、動物由来の産物を含まない、請求項1に記載の方法。
- 精製非複合ボツリヌス毒素Aが少なくとも95%純粋である、請求項1に記載の方法。
- 精製非複合ボツリヌス毒素Aが少なくとも200 LD50単位/ngの活性を有する、
請求項1に記載の方法。 - 発酵培養物1リットル(L)あたり少なくとも2mgの精製非複合ボツリヌス毒素Aの収率を生じる、請求項1に記載の方法。
- 発酵培養物1リットル(L)あたり少なくとも1mgの精製非複合ボツリヌス毒素Aの収率を生じる、請求項1に記載の方法。
- ステップ(v)において疎水性相互作用カラムにローディングする前に、ステップ(iv)のサンプルが、硫酸アンモニウム及びリン酸をpH6で含む緩衝液と組み合わされる、請求項1に記載の方法。
- 疎水性相互作用カラムが、ブチルセファロース、フェニルセファロース、又はオクチルセファロースから選択されるマトリックスを含む、請求項1に記載の方法。
- 疎水性相互作用カラムが、Butyl Sepharose(登録商標)疎水性相互作用カラム、Phenyl Sepharose(登録商標)疎水性相互作用カラム、Phenyl Sepharose(登録商標)Fast Flow高置換疎水性相互作用カラム、Phenyl Sepharose(登録商標)Fast Flow低置換疎水性相互作用カラム、及びOctyl Sepharose(登録商標)疎水性相互作用カラムからなる群から選択される、請求項14に記載の方法。
- 疎水性相互作用カラムが、酢酸、クエン酸、2−(N−モルホリノ)エタンスルホン酸(MES)、ヒスチジン、ピペラジン、及びマロン酸から選択される緩衝液を含む、請求項14又は15に記載の方法。
- 疎水性相互作用カラム緩衝液のpHが、pH4.0〜7.0の範囲内である、請求項16に記載の方法。
- 疎水性相互作用カラム緩衝液のpHが、pH4.5〜6.5の範囲内である、請求項17に記載の方法。
- 結合されたボツリヌス毒素A複合体が、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、及び酢酸アンモニウムからなる群から選択される溶出緩衝液の下降勾配で疎水性相互作用カラムから溶出される、請求項14〜18のいずれかに記載の方法。
- 溶出緩衝液が、硫酸アンモニウムである、請求項19に記載の方法。
- 下降勾配溶出緩衝液の濃度範囲が、0.6M〜0.0Mである、請求項19又は20に記載の方法。
- 下降勾配溶出緩衝液の濃度範囲が、0.5M〜0.0Mである、請求項19又は20に記載の方法。
- 下降勾配溶出緩衝液の濃度範囲が、0.4M〜0.0Mである、請求項19又は20に記載の方法。
- 下降勾配溶出緩衝液の濃度範囲が、0.25M〜0.0Mである、請求項19又は20に記載の方法。
- 疎水性相互作用カラム緩衝液のpHが、pH6である、請求項14〜24のいずれかに記載の方法。
- 結合されたボツリヌス毒素A複合体が、0.4M〜0.0Mの濃度範囲の、pH6の硫酸アンモニウム溶出緩衝液の下降勾配で疎水性相互作用カラムから溶出される、請求項19に記載の方法。
- アニオン交換カラムが、正味の負電荷を有するマトリックスを含み、Q Sepharose(登録商標)HPアニオン交換カラム、Q Sepharose (登録商標)Fast Flowアニオン交換カラム、およびQ XL Sepharose(登録商標)アニオン交換カラムからなる群より選択され、カチオン交換カラムが、正味の正電荷を有するマトリックスを含み、SP Sepharose(登録商標)カチオン交換カラム、SP Sepharose(登録商標)HPカチオン交換カラム、SP Sephrose(登録商標)Fast Flowカチオン交換カラム、Mono S(商標)カチオン交換カラム、Source−S(登録商標)カチオン交換カラム、Source−30S(商標)カチオン交換カラム、およびSource−15S(商標)カチオン交換カラムからなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
- 非複合ボツリヌス毒素Aが、アニオン交換カラムに、Tris、ビス−Tris、トリエタノールアミン、およびN−メチルジエタノールアミンからなる群より選択される緩衝液中でローディングされる、請求項1に記載の方法。
- 緩衝液が7.2〜8.6のpHで使用される、請求項28に記載の方法。
- 緩衝液が、7.4〜8.2のpHで使用される、請求項28に記載の方法。
- 非複合ボツリヌス毒素Aが、カチオン交換カラムに、リン酸ナトリウム、2−(N−モルホリノ)エタンスルホン酸(MES)、およびHEPESからなる群より選択される緩衝液中でローディングされる、請求項1に記載の方法。
- 緩衝液が6.0〜7.0のpHで使用される、請求項31に記載の方法。
- アニオン交換カラムのpHが7.4〜8.2である、請求項1に記載の方法。
- カチオン交換カラムのpHが6.8〜7.0である、請求項1に記載の方法。
- アニオン交換カラムからの非複合ボツリヌス毒素Aを溶出させるための溶出緩衝液の濃度勾配が、塩化ナトリウムの上昇濃度勾配および塩化カリウムの上昇濃度勾配からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
- 上昇勾配の濃度範囲が、0.0M〜0.6Mである、請求項35に記載の方法。
- 上昇勾配の濃度範囲が、0.0M〜0.5Mである、請求項35に記載の方法。
- 塩化ナトリウムの上昇濃度勾配が、0.0M〜0.6Mの濃度範囲を有する、請求項35又は36に記載の方法。
- アニオン交換カラムが、7.4〜8.4のpHで溶出される、請求項35〜38のいずれかに記載の方法。
- カチオン交換カラムから非複合ボツリヌス毒素Aを溶出させるための勾配が、塩化ナトリウムの上昇濃度勾配および塩化カリウムの上昇濃度勾配からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
- 塩化ナトリウムの上昇勾配の濃度範囲が、0.0M〜1Mである、請求項40に記載の方法。
- 塩化カリウムの上昇勾配の濃度範囲が、0.0M〜0.5Mである、請求項40に記載の方法。
- カチオン交換カラムが、6.0〜7.0のpHで溶出される、請求項35〜42のいずれかに記載の方法。
- カチオン交換カラムのpHが、pH7である、請求項34に記載の方法。
- 清澄化されたサンプルが、疎水性相互作用カラムにローディングする前に、硫酸アンモニウム溶液と組み合わせられる、請求項1に記載の方法。
- 疎水性相互作用カラムが、ブチルセファロース、フェニルセファロース、又はオクチルセファロースから選択されるマトリックスを含み、
アニオン交換カラムが、正味の負電荷を有するマトリックスを含み、Q Sepharose(登録商標)HPアニオン交換カラム、Q Sepharose (登録商標)Fast Flowアニオン交換カラム、及びQ XL Sepharose(登録商標)アニオン交換カラムからなる群より選択され、かつ
カチオン交換カラムが、正味の正電荷を有するマトリックスを含み、SP Sepharose(登録商標)カチオン交換カラム、SP Sepharose(登録商標)HPカチオン交換カラム、SP Sephrose(登録商標)Fast Flowカチオン交換カラム、Mono S(商標)カチオン交換カラム、Source−S(商標)カチオン交換カラム、Source−30S(商標)カチオン交換カラム、及びSource−15S(商標)カチオン交換カラムからなる群より選択される、請求項1に記載の方法。 - 疎水性相互作用カラムが、Butyl Sepharose(登録商標)疎水性相互作用カラム、Phenyl Sepharose(登録商標)疎水性相互作用カラム、Phenyl Sepharose(登録商標)Fast Flow高置換疎水性相互作用カラム、Phenyl Sepharose(登録商標)Fast Flow低置換疎水性相互作用カラム、及びOctyl Sepharose(登録商標)疎水性相互作用カラムからなる群から選択される、請求項46に記載の方法。
- 疎水性相互作用カラムのローディング又は平衡緩衝液が、酢酸、クエン酸、2−(N−モルホリノ)エタンスルホン酸(MES)、ヒスチジン、ピペラジン、及びマロン酸から選択される、請求項46又は47に記載の方法。
- 非複合ボツリヌス毒素Aが、Tris、ビス−Tris、トリエタノールアミン、及びN−メチルジエタノールアミンからなる群より選択される緩衝液中でアニオン交換カラムにローディングされる、請求項46〜48のいずれかに記載の方法。
- 非複合ボツリヌス毒素Aが、リン酸ナトリウム、2−(N−モルホリノ)エタンスルホン酸(MES)、及びHEPESからなる群より選択される緩衝液中でカチオン交換カラムにローディングされる、請求項46〜49のいずれかに記載の方法。
- 疎水性相互作用カラム緩衝液のpHが、pH4.0〜7.0の範囲内である、請求項48に記載の方法。
- 疎水性相互作用カラム緩衝液のpHが、pH5.5〜6.5の範囲内である、請求項51に記載の方法。
- アニオン交換カラム緩衝液のpHが、pH7.0〜8.4の範囲内である、請求項49に記載の方法。
- アニオン交換カラム緩衝液のpHが、pH7.4〜8.2の範囲内である、請求項53に記載の方法。
- カチオン交換カラム緩衝液のpHが、pH4.0〜8.0の範囲内である、請求項50に記載の方法。
- カチオン交換カラム緩衝液のpHが、pH5.0〜7.5の範囲内である、請求項55に記載の方法。
- カチオン交換カラム緩衝液のpHが、pH6.0〜7.0の範囲である、請求項56に記載の方法。
- 結合されたボツリヌス毒素A複合体が、硫酸アンモニウム緩衝液中で、0.6M〜0.0Mの下降濃度勾配で疎水性相互作用カラムから溶出される、請求項46〜57のいずれかに記載の方法。
- 結合されたボツリヌス毒素A複合体が、0.5M〜0.0Mの下降濃度勾配で疎水性相互作用カラムから溶出される、請求項58に記載の方法。
- 結合されたボツリヌス毒素A複合体が、0.4M〜0.0Mの下降濃度勾配で疎水性相互作用カラムから溶出される、請求項58に記載の方法。
- 結合されたボツリヌス毒素A複合体が、硫酸アンモニウム溶出緩衝液中で0.6M〜0.0Mの下降濃度勾配で疎水性相互作用カラムから溶出される、請求項58に記載の方法。
- 結合されたボツリヌス毒素A複合体が、硫酸アンモニウム溶出緩衝液中で0.5M〜0.0Mの下降濃度勾配で疎水性相互作用カラムから溶出される、請求項58に記載の方法。
- 結合されたボツリヌス毒素A複合体が、6.0のpHで疎水性相互作用カラムから溶出される、請求項58〜62のいずれかに記載の方法。
- 非複合ボツリヌス毒素Aが、塩化ナトリウム又は塩化カリウムから選択される緩衝液中で、0.0M〜0.6Mの上昇濃度勾配でアニオン交換カラムから溶出される、請求項46〜63のいずれかに記載の方法。
- 非複合ボツリヌス毒素Aが、0.0M〜0.4Mの濃度範囲の塩化ナトリウムの上昇濃度勾配でアニオン交換カラムから溶出される、請求項64に記載の方法。
- 非複合ボツリヌス毒素Aが、0.0M〜0.5Mの濃度範囲の塩化ナトリウムの上昇濃度勾配でアニオン交換カラムから溶出される、請求項64に記載の方法。
- 非複合ボツリヌス毒素Aが、0.0M〜0.6Mの濃度範囲の塩化ナトリウムの上昇濃度勾配でアニオン交換カラムから溶出される、請求項64に記載の方法。
- 非複合ボツリヌス毒素Aが、7.4〜8.4のpHでアニオン交換カラムから溶出される、請求項64〜67のいずれかに記載の方法。
- 非複合ボツリヌス毒素Aが、0.0M〜1.0Mの濃度範囲の塩化ナトリウムの上昇濃度勾配でカチオン交換カラムから溶出される、請求項46〜68のいずれかに記載の方法。
- 非複合ボツリヌス毒素Aが、0.0M〜0.5Mの濃度範囲の塩化カリウムの上昇濃度勾配でカチオン交換カラムから溶出される、請求項46〜68に記載の方法。
- 非複合ボツリヌス毒素Aが、6〜7のpHでカチオン交換カラムから溶出される、請求項69又は70に記載の方法。
- 精製非複合ボツリヌス毒素Aが、少なくとも200 LD50単位/ngの活性を有する
、請求項46〜71のいずれかに記載の方法。 - 発酵培養物1リットル(L)あたり少なくとも2mgの精製非複合ボツリヌス毒素Aの収率を生じる、請求項46〜72のいずれかに記載の方法。
- 発酵培養物1リットル(L)あたり少なくとも1mgの精製非複合ボツリヌス毒素Aの収率を生じる、請求項46〜72のいずれかに記載の方法。
- 発酵培養物1リットル(L)あたり1〜2mgの収率を生じる、請求項1、又は46〜74のいずれかに記載の方法。
- 150kDの純粋な非複合ボツリヌス毒素Aを産出する、請求項46〜75のいずれかに記載の方法。
- ステップ(i)において、ボツリヌス毒素Aを含む発酵培養物が、硫酸と酸沈殿される、請求項1又は46に記載の方法。
- 疎水性相互作用カラムが、Phenyl Sepharose(登録商標)HP疎水性相互作用カラムであり、アニオン交換カラムが、Q XL Sepharose(登録商標)アニオン交換カラムであり、かつカチオン交換カラムが、Source−S(商標)カチオン交換カラムであり、前記疎水性相互作用カラムが、硫酸アンモニウムの下降勾配で溶出され、前記アニオン及びカチオン交換カラムが、塩化ナトリウムの上昇勾配で溶出される、請求項1〜77のいずれかに記載の方法。
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