KR20230009178A - 비-독소 단백질이 제거된 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 단백질의 정제방법 - Google Patents
비-독소 단백질이 제거된 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 단백질의 정제방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 비-독소 단백질이 제거된, 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 단백질의 정제방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 비-독소 단백질이 제거된 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 단백질의 정제방법에 관한 것이다.
보툴리눔 독소는 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum)과 같은 박테리아에 의해서 생산되는 신경독소 단백질의 일종으로, 시냅스전 신경말단에 비가역적으로 부착하여 신경접합부에 아세틸콜린의 분비를 억제함으로써 근육의 수축을 차단하여 이차적으로 근육의 이완효과를 나타내는 작용을 한다. 이러한 기능으로, 보툴리눔 독소는 1989년 미국 FDA 승인 이후, 치료 또는 미용 목적으로 사용되고 있다(KR 10-2010-0107475 A, KR 10-2008-0049152 A 등).
치료 목적으로는 사시 (strabismus), 사경(torticollis) 또는 안면 경련(blepharospasm)과 같은 신경근육질환에, 미용 목적으로는 주름, 찌푸린 주름 제거 및 사각턱 치료, 다한증(hyperhidrosis) 또는 편두통(migraine) 치료에 주사제로 사용되고 있다. 부작용으로는 연하곤란(dysphagia), 목소리 변화(voice change), 구강건조 (dry mouth) 및 몽롱 (blurred vision) 등과 같은 사례들이 보고되었으나, 아직 보툴리눔 독소로 인한 직접적인 사망사고가 없어 적절하게 사용하면 매우 안전한 약품으로 평가받고 있다.
특히, 보툴리눔 독소에서 비-독소(non-toxic) 단백질을 제외한 순수 신경독소 단백질은 반복적인 투여가 필요한 적응증에도 유용하게 사용될 수 있는바, 안정하고 생물학적으로 활성을 나타내는 보툴리눔 신경독소 단백질의 분리를 위한 개선된 정제방법이 요구되고 있는 실정이다.
본 발명의 목적은 비-독소 단백질이 제거된 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 단백질의 정제방법을 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 발명에 기재된 본 발명의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
본 발명의 하나의 양태는 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 단백질의 정제방법을 제공한다.
구체적으로, 상기 정제방법은, 배양액으로부터 분리된 클로스트리디움 보툴리눔 (Clostridium botulinum) 독소 단백질을 포함하는 용액을,
(a) 소수성 상호작용 컬럼에 로딩하여, 상기 독소를 포획하고 불순물을 통과시키는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 포획된 독소를 분리하여, 상기 독소를 포함하는 용리액을 수득하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계에서 수득한 용리액에 포함된 독소 단백질에서 비-복합체 형태의 신경독소 단백질을 수득하는 단계;
(d) 상기 (c) 단계에서 수득한 비-복합체 형태의 신경독소 단백질을 포함하는 용액을, 3급 아민을 포함한 수지로 충전된 음이온 교환수지 컬럼에 로딩하는 단계; 및
(e) 상기 (d) 단계에서 포획된 비-복합체 형태의 신경독소 단백질을 분리하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에서 "(a), (b), (c), (d)…"와 같은 단계 사이에는 시간적인 간격이 없거나, 동시에 수행되거나, 수 초, 수 분, 수 시간 등 임의의 간격을 두고 수행될 수 있다.
본 발명에서, 용어 "클로스트리디움 보툴리눔 독소" 는 "보툴리눔 독소(Botulinum toxin)" 로도 지칭되며, 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum) 유래 단백질의 일종으로, 시냅스전 신경말단에 비가역적으로 부착하여 신경접합부에 아세틸콜린의 분비를 억제함으로써 근육의 수축을 차단하여 이차적으로 근육의 이완효과를 나타내는 작용을 하는 단백질을 지칭한다.
보툴리눔 독소 단백질은 혈청학적 특징에 따라 A에서 G까지의 7가지 형으로 나뉜다. 보툴리눔 독소 A형은 인간에 대해서 알려진 가장 치명적인 천연물질이며 혈청형 A 이외에도, 6 가지의 다른 일반적으로 면역학적으로 상이한 보툴리눔 독소, 즉 보툴리눔 독소 혈청형 B, C, D, E, F, 및 G가 규명되었다. 상이한 혈청형은 형-특이적 항체에 의한 중화에 의해서 식별될 수 있으며, 이들이 유발하는 마비의 중증도 및 이들이 가장 영향을 미치는 동물 종은 상이하다.
보툴리눔 독소 단백질 분자의 분자량은, 알려진 보툴리눔 독소 혈청형 7가지 모두에서, 약 150kD이다. 한편, 클로스트리디움계 박테리아에 의해서 보툴리눔 독소는 관련된 비-독소 단백질과 함께 150kD 보툴리눔 독소 단백질 분자를 포함하는 복합체로서 방출된다. 그러므로, 보툴리눔 독소 타입 A 복합체는 클로스트리디움계 박테리아에 의해서, 900kD, 500kD 및 300kD 형으로 생성될 수 있다. 보툴리눔 독소 타입 B 및 C는 500kD 복합체로, 보툴리눔 독소 타입 D는 300kD 및 500kD 복합체로 생성될 수 있다. 보툴리눔 독소 타입 E 및 F는 약 300kD 복합체로 생성될 수 있다. 이 복합체들(즉, 분자량이 약 150kD 보다 큰 것)은 비독성 적혈구응집소 단백질 및 비-독소 및 비독성 비적혈구응집소 단백질을 포함하는 것으로 여겨진다.
보툴리눔 독소 단백질은 약 150 kD의 순수 신경독소 성분과 아울러 비-독소 단백질을 포함하는 고분자량의 복합체 형태를 포함한다. 따라서, 복합체화된 형태는 보툴리눔 신경독소 단백질 및 하나 또는 그 이상의 비-독소 헤마글루티닌 단백질 및/또는 하나 또는 그 이상의 비-독소 비-헤마글루티닌 단백질을 포함할 수 있다. 구체적으로, 보툴리눔 독소 복합체 단백질은 보툴리눔 신경독소(BoNT; Botulinum neurotoxin), 비독성 비헤마글루티닌(NTNHA; nontoxic nonhemagglutinin), 및 헤마글루티닌(HA) 단백질의 복합체일 수 있다. 상기 복합체의 분자량은 약 150 kD보다 클 수 있다. 예를 들어, 보툴리눔 독소 A형의 복합체화된 형태는 약 900 kD, 약 500 kD 또는 약 300 kD의 분자량을 가질 수 있다.
일 구현예로, 본 발명의 보툴리눔 독소는 A형 독소일 수 있다.
본 발명의 보툴리눔 신경독소(BoNT) 단백질은 달리 지시하지 않는 한, 비독성 비헤마글루티닌, 헤마글루티닌 등 임의의 조합된 비-독소 단백질과 조합되어 있지 않은 보툴리눔 신경독소 단백질을 지칭한다. 이는 "비-복합체 형태의 보툴리눔 신경독소 단백질", "순수 신경독소 단백질" 또는 "비-독소 단백질이 제거된(reduced) 보툴리눔 신경독소 단백질"로도 칭해질 수 있다.
일 구현예로, 본 발명의 보툴리눔 신경독소 단백질은 약 50 kD 내지 150 kD의 분자량을 갖는 단백질일 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 보툴리눔 신경독소 단백질은 이황화 결합에 의해 약 50 kD 경쇄(LC, Light Chain)에 접합된 약 100 kD 중쇄(HC, Heavy Chain) 형태이거나, 신경독소 성분의 약 150 kD의 단쇄 전구체 단백질 형태를 모두 포함한다.
본 발명에서, 용어 "약(about)"은 용어 뒤에 기재되는 정확한 숫자뿐만 아니라, 거의 그 숫자이거나 그 숫자에 가까운 범위까지 포함한다. 그 숫자가 제시된 문맥을 고려하여, 언급된 구체적인 숫자와 가깝거나 거의 그 숫자인지 여부를 결정할 수 있다. 일 예로, 용어 "약"은 숫자 값의 -10% 내지 +10% 범위를 지칭할 수 있다. 다른 예로, 용어 "약"은 주어진 숫자 값의 -5% 내지 +5% 범위를 지칭할 수 있다. 그러나 이에 제한되지 않는다.
전술한 구현예 중의 어느 하나의 구현예로, 본 발명의 클로스트리디움 보툴리눔 (Clostridium botulinum) 독소 단백질은 클로스트리디움 보툴리눔 (Clostridium botulinum) 배양액으로부터 수득한 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 단백질은 클로스트리디움 보툴리눔 (Clostridium botulinum) 배양액으로부터 분리한 것일 수 있다.
따라서, 본 발명의 정제 방법에 있어서, 정제를 위한 크로마토그래피 단계 이전에, 클로스트리디움 보툴리눔 (Clostridium botulinum)을 배양하는 단계를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 배양 단계에 있어서, 클로스트리디움 보툴리눔 균주의 배양은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 구체적으로 클로스트리디움 보툴리눔 균주는 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물 등을 함유한 통상의 배지 내에서, 혐기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.
예를 들어, 배양은 혐기 조건에서 약 25℃ 내지 40℃, 구체적으로는 27℃ 내지 40℃일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 배양 기간은 독소 단백질의 원하는 생성량이 수득될 때까지 계속될 수 있으며, 구체적으로는 약 12 내지 150시간 동안 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
전술한 구현예 중의 어느 하나의 구현예로, 본 발명의 클로스트리디움 보툴리눔 (Clostridium botulinum) 독소 단백질을 포함하는 용액은 크로마토그래피 단계 이전에 침전 처리된 것일 수 있다.
일 구현예로, 상기 침전은 산(acid) 침전일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 그 예로, 상기 산 침전은 pH 3.0 내지 pH 4.0, 구체적으로 pH 3.3 내지 3.5, 보다 구체적으로 pH 3.4 내지 3.5가 되도록 산(acid)을 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 상기 산 침전에는 당업계에 공지된 산성 용액, 예를 들어 황산 또는 염산 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
전술한 구현예 중의 어느 하나의 구현예로, 본 발명의 클로스트리디움 보툴리눔 (Clostridium botulinum) 독소 복합체 단백질을 포함하는 용액은 소수성 크로마토그래피 단계 이전에 여과 처리된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 용액은 산 침전 후 여과 처리되는 것일 수 있다.
상기 여과(filtration) 단계는 종래의 공지된 미세여과, 한외여과, 정밀여과, 심층여과 등의 공정으로 진행될 수 있으며, 여과 단계에서 불순물이 제거될 수 있다.
일 구현예로, 상기 여과 처리에서 사용하는 장치는 약 0.1 ㎛ 내지 0.3 ㎛, 구체적으로 약 0.2 ㎛의 공극 크기를 가지는 필터를 포함할 수 있다. 그러나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 정제 방법에 있어서, 클로스트리디움 보툴리눔 (Clostridium botulinum) 독소 단백질을 포함하는 용액을 (a) 소수성 상호작용 컬럼에 로딩하여, 상기 독소를 포획하고 불순물을 통과시키는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계에서 포획된 독소를 분리하여, 상기 독소를 포함하는 용리액을 수득하는 단계는, 클로스트리디움 보툴리눔 (Clostridium botulinum) 독소 단백질을 포함하는 용액을 이용해 소수성 상호작용 크로마토그래피(Hydrophobic interaction chromatography)를 수행하는 단계로 칭해질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 "크로마토그래피"는, 혼합물의 성분이 상이한 속도로 매질을 통하여 통과되도록 혼합물을 매질을 통하여 통과시켜 혼합물의 성분을 분리하는 임의의 프로세스를 지칭한다.
본 발명의 크로마토그래피는 컬럼 크로마토그래피, 플래너(planar) 크로마토그래피, 박층 크로마토그래피, 가스 크로마토그래피, 액체 크로마토그래피, 신속 단백질 액체 크로마토그래피(FPLC), 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 를 포함한다. 본 발명의 정제공정의 각 단계에서 예시적인 타입의 크로마토그래피 공정 또는 장치에 대해 개시하며, 이는 전술한 모든 타입의 크로마토그래피에 대해 적용할 수 있다.
본 발명에서, "소수성 크로마토그래피"또는 "소수성 상호작용 크로마토그래피"는 비극성 정지상과의 소수성 상호반응의 상대 강도에 기초하여 분자를 분리하는 방법이다. 소수성 크로마토그래피는 염 농도가 높을수록 비극성 정지상과 분리하고자 하는 물질 간의 상호작용이 강하게 일어나고, 완충액의 이온 강도 또는 염 농도가 낮아질수록 상호작용이 약해지는 원리를 이용한다. 따라서 염 농도의 하향 구배를 이용하는 경우 소수성이 작은 물질일수록 먼저 용출되고, 소수성이 강한 물질일수록 나중에 용출될 수 있다.
일 구현예로, 본 발명의 정제 방법의 (a)단계에서 소수성 상호작용 컬럼은 에터(ether), 아이소프로필(isopropyl), 부틸(butyl), 옥틸(octyl), 페닐(phenyl) 등의 리간드를 가지는 컬럼을 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 정제 방법의 (a)단계에서 소수성 상호작용 컬럼은 부틸 세파로스 또는 페닐 세파로스 컬럼일 수 있다. 구체적으로, 상기 소수성 상호작용 컬럼은 페닐 세파로스 컬럼일 수 있다. 보다 구체적으로 상기 소수성 상호작용 컬럼은 부틸 세파로스 HP(butyl sepharose high performance), 부틸 세파로스 고속 유동(Butyl sepharose Fast Flow), 및 페닐 세파로스 HP(Phenyl sepharose high performance), 페닐 세파로스 고속 유동(Phenyl sepharose Fast Flow) 컬럼으로 구성된 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않고 소수성 상호작용 컬럼에 속하는 것이면 제한 없이 사용할 수 있다.
전술한 구현예 중의 어느 하나의 구현예로, 본 발명의 정제 방법의 (a) 단계 이전에, 완충액을 이용해 컬럼을 평형화하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 평형화(equilibration)는 정제하고자 하는 단백질이 컬럼에 주입되기 전에, 환경의 변화에 의해 단백질이 응집되거나 활성이 소실되는 것을 방지하기 위하여 완충액으로 컬럼을 안정화하는 단계를 지칭할 수 있다.
상기 (a) 단계 이전의 평형화 단계에서 완충액을 흘려주는 유속, 온도, 시간 및 전도도 등의 조건은 적절히 조절될 수 있다.
일 예로, 상기 완충액으로는 인산 완충액, 시트르산 완충액 또는 아세트산 완충액을 사용할 수 있다. 일 예로, 상기 컬럼 완충액은 인산 완충액일 수 있고, 예를 들어 인산나트륨일 수 있다. 일 예로, 컬럼 완충액의 농도는 5mM 내지 100 mM, 예를 들면, 25mM 내지 75 mM, 또는 40mM 내지 60 mM로 조절할 수 있다.
일 예로, 상기 유속은 약 1.0㎖/분 내지 20.0㎖/분일 수 있다. 일 예로, 상기 전도도는 약 170 내지 220 mS/cm 일 수 있다. 그러나, 이에 제한되지 않는다.
전술한 구현예 중의 어느 하나의 구현예로, 본 발명의 정제 방법의 (a) 단계는 pH 4 내지 pH 8 조건하에 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
전술한 구현예 중의 어느 하나의 구현예로, 본 발명의 정제 방법의 (a) 단계는 약 170 내지 220 mS/cm 전도도 조건하에 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 (a) 및/또는 (b) 단계에서, 용액을 흘려주는 유속, 온도, 시간 등의 조건은 적절히 조절될 수 있다.
일 예로, 컬럼 완충액으로는 인산 완충액, 시트르산 완충액 또는 아세트산 완충액을 사용할 수 있다. 일 예로, 상기 컬럼 완충액은 인산 완충액일 수 있고, 예를 들어 인산나트륨일 수 있다. 일 예로, 컬럼 완충액의 농도는 5mM 내지 100 mM, 예를 들면, 25mM 내지 75 mM, 또는 40mM 내지 60 mM로 조절할 수 있다. 일 예로, 이동상의 유속은 약 1.0㎖/분 내지 20.0㎖/분일 수 있다. 그러나, 이에 제한되지 않는다.
전술한 구현예 중의 어느 하나의 구현예로, 상기 (b) 단계에서 독소 단백질을 포함하는 용리액을 수득하는 단계에 있어서, 적절한 용출 용매를 사용할 수 있다.
상기 (b)단계는 농도구배(concentration gradient)를 이용할 수 있다. 예를 들어 단계식 염 구배 (stepwise salt gradient) 또는 연속식 염 구배 (continuous salt gradient)로 독소 복합체 단백질을 용출시킬 수 있다.
상기 (b) 단계는 이온 세기를 감소시키거나 pH를 증가시키는 것을 포함할 수 있다. 용리 단계에서는, 예를 들어, 역염 기울기를 시작하여 염농도를 감소시킴으로써 정지상에 흡착되어 있던 단백질의 소수성 부분이 이동상으로 탈착될 수 있다. 구체적으로, 상기 용리 단계에서는 완충제의 감소하는 농도 구배(하향 구배, descending gradient) 를 이용할 수 있다. 그 예로 약 5.0M 내지 약 0.0M, 약 4.0 내지 약 0.0M, 약 3.5M 내지 약 0.0M, 약 3.0M 내지 약 0.0M의 의 농도 범위를 가지는 농도구배의 완충제를 사용할 수 있다. 상기 완충제는 예를 들어 황산나트륨 (Na2S04), 염화나트륨 (NaCl), 염화칼륨 (KCl), 암모늄 아세테이트 (NH4OAc) 등을 사용할 수 있고, 구체적으로 상기 용리 단계에서는 염화나트륨(NaCl)의 농도구배를 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않고 당업계에 공지된 범위에서 적절하게 선택하여 사용할 수 있다.
전술한 구현예 중의 어느 하나의 구현예로, 본 발명의 정제 방법의 (b) 단계에서 수득한 용리액은 침전 처리할 수 있다. 예를 들어, 상기 침전은 산 침전일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 산 침전은 산(acid)을 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 산 침전은 용리액에 황산암모늄을 첨가하는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 산 침전은 용리액에 황산암모늄을 최종 포화도 30 내지 50%가 되도록 첨가하는 것일 수 있다. 그 예로, 상기 포화도에서 황산암모늄의 농도는 약 19.6g/100ml 내지 31.3g/100ml일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 침전 처리된 용리액은 추가적인 정제 공정을 거칠 수 있으며, 예를 들어 여과 및/또는 원심분리 등의 공정을 거칠 수 있다. 수득된 침전물은 추가적인 정제 공정을 위해 재용해될 수 있다. 예를 들어, 상기 침전물은 pH 5.0 내지 7.0의 용액을 이용해 용해될 수 있고, 그 예로 약 40 내지 60mM 농도의 인산나트륨 완충액을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 정제 방법에 있어서, (c) 상기 (b) 단계에서 수득한 용리액에 포함된 독소 단백질에서 비-복합체 형태의 신경독소 단백질을 수득하는 단계는, 클로스트리디움 보툴리눔 독소 단백질을 비-독소 단백질과 순수 신경독소 단백질로 해리하는 것일 수 있다.
상기 (c) 단계는 순수 신경독소 단백질과 비-독소 단백질을 분리하기 위한 임의의 통상적인 단백질 분리 방법으로 수행될 수 있다.
일 구현예로, 상기 (c) 단계는 UF 다이아필트레이션(UF diafiltration), pH 적정(pH titration), 투석(dialysis), 침전(precipitation), 적혈구 처리, 심층 여과(depth filtration, DF), 정밀여과(microfiltration, MF), 한외여과(ultrafiltration, UF), 멸균 여과(sterile filtration), 분획(fraction), HPLC, 및/또는 원심분리 등 기타 단백질로부터 단백질을 추출하는 방법을 사용할 수 있으나, 순수 신경독소 단백질을 수득할 수 있는 방법이면 제한 없이 사용될 수 있다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 (c) 단계는 투석(dialysis)을 사용할 수 있다. 상기 투석은 (b) 단계에서 수득한 용리액을 투과막(membrane)에 넣고 적절한 온도 및/또는 pH 조건에서 완충액을 이용하여 실시할 수 있다. 상기 투석의 횟수는 적절히 조절될 수 있으며, 예를 들어 3회 실시할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
일 예로, 상기 온도는 약 0℃ 내지 10℃, 구체적으로는 약 2℃ 내지 8℃ 일 수 있다. 일 예로, 상기 투석은 pH 6 내지 10의 완충액에서 수행될 수 있다. 일 예로, 상기 완충액은 인산 완충액, 시트르산 완충액 또는 아세트산 완충액을 사용할 수 있고, 구체적으로는 인산나트륨을 사용할 수 있다. 상기 완충액의 농도는 적절하게 조정할 수 있으며, 예를 들어 약 10 mM 내지 70mM일 수 있다. 그러나, 전술한 예시에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 정제 방법에 있어서, (d) 상기 (c) 단계에서 수득한 비-복합체 형태의 신경독소 단백질을 포함하는 용액을, 음이온 교환수지 컬럼에 로딩하는 단계; 및 (e) 상기 (d) 단계에서 포획된 비-복합체 형태의 신경독소 단백질을 분리하는 단계는, 비-복합체 형태의 신경독소 단백질을 포함하는 용액을 이용해 음이온 교환 크로마토그래피(anion-exchange chromatography)를 수행하는 단계로 칭해질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, "음이온 교환 크로마토그래피(anion-exchange chromatography)"는 양으로 하전된 지지체에 음으로 하전된 (또는 산성) 분자를 결합시키는 것에 의해 분자들을 이들의 전하에 따라 분리할 수 있는 것으로서, 분자들의 동족체 (산성, 염기성 및 중성)는 이 기법에 의해 쉽게 분리할 수 있다.
본 발명의 정제 방법에 있어서, (d) 단계의 음이온 교환 크로마토그래피에 사용될 수 있는 수지는 2급 또는 3급 아민을 작용기(functional group)로 포함하는 약음이온 교환 수지일 수 있다.
일 구현예로, 상기 음이온 교환 크로마토그래피에 사용될 수 있는 수지는 3급 아민(Tertiary amine) 을 포함하는 수지일 수 있다. 구체적으로, 상기 수지는 DEAE (DiEthylAminoEthyl) 를 포함하는 수지일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 전술한 구현예 중의 어느 하나의 구현예로, 본 발명의 음이온 교환수지 컬럼은 DEAE 세파로스 HP(DEAE Sepharose high performance) 또는 DEAE 세파로스 고속 유동(DEAE Sepharose Fast Flow) 컬럼일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
전술한 구현예 중의 어느 하나의 구현예로, 본 발명의 정제 방법의 (d) 단계 이전에, 완충액을 이용해 음이온 교환 수지를 평형화하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 (d) 단계 이전의 평형화 단계에서 완충액을 흘려주는 유속, 온도, 시간 및 전도도 등의 조건은 적절히 조절될 수 있다.
일 예로, 컬럼 완충액으로는 인산 완충액, 시트르산 완충액 또는 아세트산 완충액을 사용할 수 있다. 구체적으로, 상기 컬럼 완충액은 인산 완충액일 수 있고, 예를 들어 인산나트륨일 수 있다. 일 예로, 컬럼 완충액의 농도는 5mM 내지 100 mM, 예를 들면, 5mM 내지 35 mM, 또는 10mM 내지 30 mM로 조절할 수 있다.
일 예로, 상기 유속은 0.1㎖/분 내지 20.0㎖/분일 수 있다. 일 예로, 상기 전도도는 약 0.1 내지 10mS/cm일 수 있다. 그러나, 이에 제한되지 않는다.
상기 (d) 및/또는 (e) 단계에서, 용액을 흘려주는 유속, 온도, 시간, 전도도 등의 조건은 적절히 조절될 수 있다.
일 예로, 상기 완충액으로는 인산 완충액, 시트르산 완충액 또는 아세트산 완충액을 사용할 수 있다. 일 예로, 상기 컬럼 완충액은 인산 완충액일 수 있고, 예를 들어 인산나트륨일 수 있다. 일 예로, 컬럼 완충액의 농도는 5mM 내지 100 mM, 예를 들면, 5mM 내지 35 mM, 또는 10mM 내지 30 mM로 조절할 수 있다.
일 예로, 상기 유속은 약 0.1㎖/분 내지 20㎖/분일 수 있다. 일 예로, 상기 전도도는 약 0.1 내지 10mS/cm일 수 있다. 그러나, 이에 제한되지 않는다.
전술한 구현예 중의 어느 하나의 구현예로, 본 발명의 정제 방법의 (d) 단계는 pH 4 내지 pH 10 조건하에 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
전술한 구현예 중의 어느 하나의 구현예로, 상기 (e) 단계는 적절한 용출 용매를 사용하여 이온 세기 또는 pH를 변화시키는 것을 포함할 수 있다.
상기 (e) 단계는 농도구배(concentration gradient)를 이용할 수 있다. 예를 들어 단계식 염 구배 (stepwise salt gradient) 또는 연속식 염 구배 (continuous salt gradient)로 용출 시킬 수 있다. 구체적으로, 상기 용리 단계에서는 컬럼에 결합되어 있던 단백질을, 증가하는 농도 구배(상향 구배, ascending gradient)의 완충액을 이용하여 용리할 수 있다. 그 예로, 약 0.0M 내지 3.0M, 약 0.0M 내지 2.0M, 약 0.0M 내지 1.0M의 범위를 가지는 농도구배의 완충제를 사용할 수 있다. 일 구현예로, 상기 용리 단계에서 사용할 수 있는 완충용액은 염화나트륨 (NaCl), 염화칼륨 (KCl), 인산나트륨(sodium phosphate), 인산칼륨(potassium phosphate) 또는 트리스 (Tris) 등을 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 용리 단계에서는 염화나트륨(NaCl)의 농도구배를 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않고 당업계에 공지된 범위에서 적절하게 선택하여 사용할 수 있다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 본 발명의 정제 방법은 신경독소 단백질을 포함하는 용액을 양이온 교환수지 컬럼에 로딩하는 단계를 필수 구성으로서 포함하지 않는 것일 수 있다. 그러나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 정제 방법에 따라 분리된 신경독소 단백질은 높은 순도를 가질 수 있다. 구체적으로, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 97.5% 이상, 또는 약 98% 이상의 순도를 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 정제 방법을 사용함으로써 경제적이고 효율적으로 고순도 보툴리눔 신경독소 단백질을 수득할 수 있다.
도 1은 정제된 150kD의 보툴리눔 신경독소의 SDS-PAGE 즉, 소디움 도데실설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis) 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 정제된 150kD의 보툴리눔 신경독소의 HPLC 즉, 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography: SEC-HPLC) 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 음이온 크로마토그래피를 수행하는 단계에서 3급 아민을 포함한 DEAE 컬럼 또는 4급 암모늄을 포함한 Q 컬럼을 사용하는 경우, 수득된 시료의 순도를 전기영동으로 확인한 결과이다. (HC: Heavy chain, LC: Light chain)
도 2는 정제된 150kD의 보툴리눔 신경독소의 HPLC 즉, 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography: SEC-HPLC) 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 음이온 크로마토그래피를 수행하는 단계에서 3급 아민을 포함한 DEAE 컬럼 또는 4급 암모늄을 포함한 Q 컬럼을 사용하는 경우, 수득된 시료의 순도를 전기영동으로 확인한 결과이다. (HC: Heavy chain, LC: Light chain)
이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 보툴리눔 균의 배양 및 독소의 분리
-80℃에서 보관되어 있던 클로스트리디움 보툴리눔(clostridium botulinum)을 해동하여, 종 배양액에 넣고 37℃혐기 조건에서 24시간 동안 배양하여 균 수를 증가시켰다. 상기의 균 수가 증가된 배양액을 본 배양액에 넣고 35℃ 혐기 조건 하에서 92 내지 100 시간 동안 추가 배양한 후 pH 3.4가 되도록 산 침전을 통한 바이러스 불활화를 실시하였다. 침전이 완료되면, 완충액으로 보툴리눔 독소를 용출한 후 멸균된 0.2㎛ 필터를 통하여 외부와 접촉없이 여과하였다.
실시예 2. 보툴리눔 독소의 정제
2-1. 소수성 상호작용 크로마토그래피
상기 실시예 1의 보툴리눔 A형 독소가 포함되어 있는 여과된 액을 Phenyl Sepharose 소수성 상호작용 크로마토그래피 수지가 충진된 컬럼에 로딩하였다. 상기 로딩 전 평형/용출 완충액 (50 mM 인산나트륨, 3M 염화나트륨, pH 6.0) 을 유속 5ml/분, 전도도 188mS/cm 조건으로 흘려 평형화/세척을 실시하였다.
상기 실시예 1의 보툴리눔 A형 독소가 포함되어 있는 여과된 액을 Phenyl Sepharose 컬럼에 로딩 후, 유속 5ml/분, 전도도 188mS/cm 조건으로 50 mM 인산나트륨, pH 6.0의 완충제로 감소되는 염 단계 변화(3.0M-0.0M 염화나트륨 농도구배)를 이용하여 컬럼으로부터 보툴리눔 독소를 용리하였다.
2-2. 황산암모늄 침전 및 순수 신경독소 해리
상기 실시예 2-1의 방법으로 수집된 용리액에 황산암모늄을 최종 포화도 40% (24.3g/100ml)가 되도록 첨가하여 침전시킨 후, 원심분리하여 침전물을 수득하였다. 이 과정 역시, 독소 단백질은 무균 용기의 내부 표면과 접촉하고 있었으며, 외부와의 접촉은 일어나지 않았다. 상기 침전물을 50 mM 인산나트륨 완충액(pH 6.0)으로 용해한 후, 비-독소 단백질과 순수 신경독소 단백질로의 해리를 위해 상기 용해된 용액을 투과막(membrane)에 넣고 2 내지 8℃ 조건에서 20 mM 인산나트륨 완충액(pH 7.9) 속에서 투석하였다. 투석은 총 3회를 실시하였다.
2-3. 음이온 교환수지 크로마토그래피
상기 실시예 2-2에서 수득한 투석액을 원심분리하여 상층액을 분리하고, 분리된 상층액을 DEAE Sepharose 컬럼이 연결된 FPLC(고속 단백질 액체 크로마토그래피, Fast Protein Liquid Chromatography)에 주입하였다. 비교예로, DEAE Sepharose 컬럼 대신 Q column을 이용하여 음이온 교환수지 크로마토그래피를 수행하였다.
구체적인 실험 방법은 다음과 같다. 상기 상층액 주입 전 인산나트륨 완충액(20mM, pH 7.9)를 DEAE Sepharose 수지가 충진된 컬럼에 흘려주어 평형화하고, 상기 독소가 함유된 인산나트륨 완충액(20mM, pH 7.9)를 컬럼을 통하여 흘려 주었다. 평형 후, 상기 상층액을 주입하는 단계가 수행되었고, 신경독소가 음이온 교환 컬럼 물질에 결합되는 동안, 흐름 통과(flow through, FT) 액은 멸균된 용기에 수집되었다. 이후에 세척 단계가 이어졌고, 여기서 세척 완충제(pH 7.9의 20 mM 인산나트륨)가 음이온 교환 컬럼을 통과했다. 다음 단계는 용리 단계였고, 20 mM 인산나트륨, pH 7.9 완충제로 세척한 다음, 증가되는 염 단계 변화(0.0M-1.0M 염화나트륨 구배)를 이용하여 컬럼으로부터 보툴리눔 독소를 용리하였다. 음이온 교환수지 크로마토그래피는 전도도 3mS/cm, 유속 3ml/분의 조건에서 수행되었다.
실시예 3. 정제된 독소의 순도 분석
비-독소 단백질이 제거된 순수 신경독소를 정제하기 위해 소수성 상호작용 크로마토그래피에서 음이온 교환수지 크로마토그래피로 이어지는 정제공정을 통해 얻어진 시료에 대하여 소디움 도데실설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis: SDS-PAGE, 도 1) 와 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography: SEC-HPLC, 도 2)를 통해 순도를 분석하였다. 전기영동은 4~20% 폴리아크릴아미드 겔을 사용하여 수행하였으며, 수행 후 쿠마시블루로 염색하였다. SEC-HPLC의 이동상은 pH6.0의 250mM NaCl 이 포함된 50 mM 인산나트륨 용액을 사용하였으며, HPLC컬럼을 연결하고 실시예 2에서 수득한 보툴리눔 A형 신경독소 단백질 20 ㎍을 로딩(loading)하여 0.4 mL/min으로 60분간 흘려주었다.
그 결과, 순수 신경독소 성분 외에는 불순물 단백질 밴드가 관찰되지 않았고, 98kD(중쇄(Heavy chain)) 및 52kD (경쇄(Light chain))의 순수 신경독소 성분만이 관찰되었다(도 1). 또한 보툴리눔 신경독소의 순도는 99.86%인 것을 확인하였다(도 2).
한편, 음이온 크로마토그래피 단계에서 DEAE 컬럼 또는 Q Sepharose 컬럼을 이용하여 수득한 시료를 전기영동으로 순도를 분석한 결과(도 3), 4급 암모늄염을 포함하는 Q 컬럼을 이용한 경우에는 순수 신경독소 성분 외에 불순물 단백질 밴드가 다수 관찰되었다.
이를 통해, 4급 암모늄염을 포함하는 Q 컬럼을 이용하는 경우에 비해, 3급 아민을 포함한 DEAE 컬럼을 이용하는 것이 신경독소 단백질을 더욱 고순도로 정제할 수 있음을 확인하였다.
이와 같은 결과는, 소수성 상호작용 크로마토그래피와 DEAE 컬럼을 포함하는 음이온 교환 크로마토그래피의 2단계를 수행할 경우, 불순물이 거의 제거된 신경독소 단백질을 고순도로 정제할 수 있음을 시사하는 것이다.
따라서, 상기 정제방법을 이용하면, 보툴리눔 독소 타입 A의 비-독소 단백질이 제거된 순수 신경독소 부분만을(약 150kD) 고순도로 수득할 수 있다. 이는 본 명세서에 교시된 방법 및 시스템을 사용하여 높은 효능 및 순도로 고효율의 비-독소 단백질이 제거된 순수 신경독소를 제조할 수 있음을 나타낸다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Claims (21)
- 배양액으로부터 분리된 클로스트리디움 보툴리눔 (Clostridium botulinum) 독소 단백질을 포함하는 용액을,
(a) 소수성 상호작용 컬럼에 로딩하여, 상기 독소를 포획하고 불순물을 통과시키는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 포획된 독소를 분리하여, 상기 독소를 포함하는 용리액을 수득하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계에서 수득한 용리액에 포함된 독소 단백질에서 비-복합체 형태의 신경독소 단백질을 수득하는 단계;
(d) 상기 (c) 단계에서 수득한 비-복합체 형태의 신경독소 단백질을 포함하는 용액을, 3급 아민을 포함한 수지로 충전된 음이온 교환수지 컬럼에 로딩하는 단계; 및
(e) 상기 (d) 단계에서 포획된 비-복합체 형태의 신경독소 단백질을 분리하는 단계를 포함하는, 비-복합체 형태의 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 단백질의 정제방법.
- 제1항에 있어서, 상기 음이온 교환수지 컬럼은 DEAE 세파로스 HP 또는 DEAE 세파로스 고속 유동(Fast Flow) 컬럼인, 비-복합체 형태의 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 단백질의 정제방법.
- 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계 이전에 클로스트리디움 보툴리눔 (Clostridium botulinum) 균주를 배양하는 단계를 포함하는, 비-복합체 형태의 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 단백질의 정제방법.
- 제3항에 있어서, 상기 균주의 배양액을 산 침전 및하는 단계를 더 포함하는, 비-복합체 형태의 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 단백질의 정제방법.
- 제4항에 있어서, 상기 산 침전은 pH 3.0 내지 pH 4.0이 되도록 산(acid)을 첨가하는 것을 포함하는, 비-복합체 형태의 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 단백질의 정제방법.
- 제4항에 있어서, 상기 산 침전된 용액을 여과하는 단계를 더 포함하는, 클로스트리디움 보툴리눔 독소 복합체 단백질의 정제방법.
- 제1항에 있어서, 상기 소수성 상호작용 컬럼은 부틸 세파로스 HP(butyl sepharose high performance), 부틸 세파로스 고속 유동(Butyl sepharose Fast Flow), 및 페닐 세파로스 HP(Phenyl sepharose high performance), 페닐 세파로스 고속 유동(Phenyl sepharose Fast Flow) 컬럼으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 비-복합체 형태의 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 단백질의 정제방법.
- 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계는 pH 4 내지 pH 8; 및 전도도(conductivity) 170 내지 220 mS/cm의 조건에서 수행되는 것인, 비-복합체 형태의 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 단백질의 정제방법.
- 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 컬럼 완충액은 인산 완충액인 것인, 클로스트리디움 보툴리눔 독소 복합체 단백질의 정제방법.
- 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계의 컬럼 완충액은 인산 완충액인 것인, 클로스트리디움 보툴리눔 독소 복합체 단백질의 정제방법.
- 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계는 농도구배(concentration gradient) 를 이용하는 것인, 클로스트리디움 보툴리눔 독소 복합체 단백질의 정제방법.
- 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계와 (c) 단계 사이에, (b) 단계에서 수득한 용리액을 산 침전하는 단계를 더 포함하는, 비-복합체 형태의 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 단백질의 정제방법.
- 제12항에 있어서, 상기 산 침전 단계는 용리액에 황산암모늄을 최종 포화도 30 내지 50%가 되도록 첨가하는 것을 포함하는, 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 단백질의 정제방법.
- 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계는 클로스트리디움 보툴리눔 독소 단백질을 비-독소 단백질과 순수 신경독소 단백질로 해리하는 것인, 비-복합체 형태의 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 단백질의 정제방법.
- 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계는 UF 다이아필트레이션(UF diafiltration), pH 적정(pH titration), 투석(dialysis) 및 침전(precipitation)으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는, 비-복합체 형태의 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 단백질의 정제방법.
- 제1항에 있어서, 상기 (c)단계는 인산나트륨 완충액을 이용하여 3회 투석하는 것인, 비-복합체 형태의 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 단백질의 정제방법.
- 제1항에 있어서, 상기 (e) 단계의 컬럼 완충액은 인산 완충액인 것인, 클로스트리디움 보툴리눔 독소 복합체 단백질의 정제방법.
- 제1항에 있어서, 상기 (e) 단계는 농도구배(concentration gradient) 를 이용하는 것인, 클로스트리디움 보툴리눔 독소 복합체 단백질의 정제방법.
- 제1항에 있어서, 상기 방법으로 정제된 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 단백질은 순도 98% 이상인 것인, 비-복합체 형태의 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 단백질의 정제방법.
- 제1항에 있어서, 상기 방법은 신경독소 단백질을 포함하는 용액을 양이온 교환수지 컬럼에 로딩하는 단계를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는, 비-복합체 형태의 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 단백질의 정제방법.
- 제1항에 있어서, 상기 비-복합체 형태의 신경독소 단백질은 50 kD 내지 150 kD의 분자량을 갖는 것인, 비-복합체 형태의 클로스트리디움 보툴리눔 신경독소 단백질의 정제방법.
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