TWI839783B - 提高純化收率的肉毒桿菌毒素複合物的純化方法 - Google Patents
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Abstract
本發明涉及一種純化純度及收率提高的肉毒桿菌毒素純化方法。當使用本發明的肉毒桿菌毒素純化方法時，能夠以非常高的收率純化肉毒桿菌毒素。
Description
本專利申請要求於2021年7月22日提交給韓國專利局的第10-2021-0096681號的韓國專利申請的優先權，上述專利申請的公開內容通過引用結合在本說明書中。
本發明涉及純化純度及收率提高的肉毒桿菌毒素複合物純化方法。
肉毒桿菌毒素是在一種被稱為肉毒桿菌(C.botulinum)的厭氧性細菌中形生的神經毒素，共有7種類型(A型至G型)，目前，其中有兩種類型肉毒桿菌A型和B型被純化並用於醫學上。肉毒桿菌毒素通過抑制作為神經遞質的乙醯膽鹼的釋放來阻斷肌肉收縮信號的傳遞，從而起到舒緩肌肉的作用。即，在神經肌肉接頭(neuromuscular junction)中通過阻斷從突出前末梢(presynaptic terminal)中分泌的作為神經遞質的乙醯膽鹼的釋放來引起神經麻痺。填充劑與肉毒桿菌毒素製劑的差異在於，填充劑是一種在皮膚立體感不足部位中填充規定物質的醫療器械，而肉毒桿菌毒素製劑是含有通過阻斷引起肌肉收縮的神經遞質的釋放來減少肌肉使用的成分的醫療藥品。
肉毒桿菌毒素主要用於抑制或去除眉間皺紋、眼周皺紋，還用於治療腦中風的上肢僵硬、眼瞼痙攣、尖足畸形等，並且適應症正在逐漸擴大。
所有肉毒桿菌毒素的血清型類似地在末梢神經的神經肌肉接頭末端中通過抑制乙醯膽鹼的釋放來阻斷神經傳遞。在正常神經肌肉接頭的信號傳遞過程中，與膽鹼能神經末梢的單糖類相結合後移入細胞內的毒素會抑制SNARE蛋白的功能。由此通過融合含有乙醯膽鹼的內質網來抑制乙醯膽鹼的釋放，從而阻斷神經肌肉的傳遞。被肉毒桿菌毒素阻斷的膽鹼能突觸會形成新的突觸來代替。並且，被阻斷的現有的突觸通過慢慢地再生來恢復原有功能，平均持續時間為3個月至4個月。
肉毒桿菌毒素複合物可通過對肉毒桿菌(C.botulinum)細胞培養物進行預處理及純化的工藝來獲得。
已知純化預處理的細胞培養物以獲得肉毒桿菌毒素複合物工藝有很多種。雖然公知以往通過依次使用離子交換色譜和/或疏水色譜來純化肉毒桿菌毒素的方法(KR10-2020-0121245A及KR10-2020-0121246A)，但該方法儘管具有較高的純度，仍存在生產收率低的問題。
本發明人為了開發具有高生產純度及收率的肉毒桿菌毒素複合物純化方法而進行了潛心研究並努力。結果發現，當使用混合模式(Mixed-mode)陰離子交換樹脂及混合模式(Mixed-mode)陽離子交換樹脂的兩步純化工藝時，可大大提高肉毒桿菌毒素的純化收率，從而完成了本發明。
因此，本發明的目的在於，提供一種純化純度及收率提高的肉毒桿菌毒
素複合物純化方法。
根據本發明的一實施方式，本發明提供肉毒桿菌毒素複合物的純化方法，包括：準備步驟(a)，準備肉毒桿菌毒素生成菌株培養液；第一次純化步驟(b)，使用混合模式(Mixed-mode)陰離子交換樹脂對準備的培養液進行純化；以及第二次純化步驟(c)，使用混合模式(Mixed-mode)陽離子交換樹脂對經過第一次純化步驟的培養液進行純化。
本發明人為了開發具有高生產純度及收率的肉毒桿菌毒素複合物純化方法而進行了潛心研究並努力。結果發現，當使用混合模式(Mixed-mode)陰離子交換樹脂及混合模式(Mixed-mode)陽離子交換樹脂的兩步純化工藝時，可大大提高肉毒桿菌毒素複合物的純化收率。
在本說明書中，術語“肉毒桿菌毒素”是指可通過從肉毒桿菌(C.botulinum)菌株中純化來獲得的毒素。並且，術語“肉毒桿菌毒素複合物”是指肉毒桿菌毒素與至少一種非毒素蛋白質相結合的狀態下的複合物質，由肉毒桿菌菌株生成肉毒桿菌毒素的尺寸約為150kDa，肉毒桿菌毒素複合物的尺寸約為300kDa至900kDa。
通過純化獲得的肉毒桿菌毒素複合物不僅可抑制或改善眉間皺紋、眼周皺紋，還可用於多種醫療目的。
在本發明的一實例中，本發明的肉毒桿菌毒素生成菌株為肉毒桿菌(C.botulinum)。更具體地，可使用A型肉毒桿菌(Clostridium botulinum Type A，ATCC 19397)菌株，但不限於此。
以下，將詳細說明本發明的每個步驟。
準備步驟(a)：準備肉毒桿菌毒素生成菌株培養液
準備肉毒桿菌毒素生成菌株培養液的步驟可通過使用現有已知的多種預處理工藝來進行，沒有特別限制。
具體地，例如，可通過培養菌株、一次或兩次以上的沉澱、過濾、再溶解工藝來準備經過純化過程之前的培養液。上述的培養可由種培養及主培養組成，上述的沉澱可通過酸處理工藝來實施。
菌株的種培養及主培養可使用在本領域中公知且被本領域普通技術人員顯而易見的理解為適合培養肉毒桿菌的多種培養基，具體地，例如，可以適當使用已知包含2%的蛋白腖(peptone)、1%的酵母提取物(Yeast extract)及1%的葡萄糖(Glucose)的PYG培養基。上述的培養基可在菌株接種前進行滅菌處理，在此情况下，具體地，例如，可使用高壓蒸汽滅菌器進行滅菌。優選地，滅菌的培養基通過在厭氧條件下初始化來保持。當種培養時，具體地，例如，可通過將菌株以約1/50至1/200的比例、1/50至1/150的比例、1/80至1/120的比例接種到培養基中來實施，更具體地，可通過以約1/100的比例接種來實施，但並不一定限制於此。當肉眼確認整個培養基變得不透明時，可判斷為種培養已經完成。
主培養也與種培養同樣，優選在培養基滅菌後進行。主培養可在接種種培養液後，再培養約60小時~75小時，更具體地，約63小時~72小時後結束，主培養的條件可依據本領域普通技術人員的技術常識根據培養環境適當地進行調整。
在本發明的一實例中，本發明的步驟(a)包括：培養步驟(a-1)，在培養基中培養肉毒桿菌毒素；第一沉澱步驟(a-2)，添加硫酸進行反應；
酶處理步驟(a-3)，添加核酸酶進行反應；第二沉澱步驟(a-4)，回收經過酶處理步驟的溶液的上清液，並添加磷酸進行反應；以及再溶解步驟(a-5)，使用緩衝液再溶解沉澱物。
在本發明的一實例中，在使用硫酸的第一沉澱步驟中，通過在完成主培養的培養液中使用5N硫酸來滴定使pH值達到約3.5，待確認到米黃色漂浮物後，可通過放置半天至一天來實施。
在本發明的一實例中，在酶處理步驟中，可通過添加核酸酶來實施，在核酸酶處理前，可用鹽酸苯脒水合物進行預處理。在酶處理後，例如，可通過反應2小時~10小時、3小時~8小時、4小時~7小時來回收酶處理液，在離心分離後通過僅收集上清液來進行作為下一步的第二沉澱步驟。
根據本發明的一實例，在酶處理後，可通過使用磷酸來進行第二沉澱。更具體的，可通過添加10%的磷酸使pH值達到約3.5來進行磷酸沉澱。在完成磷酸沉澱後，將沉澱液放置半天至一天。
根據本發明的一實例，將磷酸沉澱液進行離心分離後去除上清液，僅回收顆粒(pellet)並使用緩衝溶液進行再溶解來準備培養液。
在本發明的一實例中，上述步驟(a-5)之後，還可進一步包括通過離心分離去除沉澱物的步驟。
第一次純化步驟(b)：使用混合模式(Mixed-mode)陰離子交換樹脂對準備的培養液進行純化
本發明的步驟(b)的第一次純化步驟是使用混合模式(Mixed-mode)陰離子交換樹脂對通過步驟(a)準備的肉毒桿菌毒素生成菌株培養液進行純化的步驟。
在本發明的一實例中，本發明的混合模式陰離子交換樹脂具有疏水性相互作用與離子相互作用相結合的混合模式選擇性。
在本發明的一具體例中，本發明的混合模式陰離子交換樹脂可使用選自由TOYOPEARL NH2-750F(陰離子交換層析填料)、HyperCel STAR AX Resin(離子交換填料)、或POROS XQ(强陰離子交換樹脂)組成的組中。更具體地，例如，可使用TOYOPEARL NH2-750F。上述的具體的例示是作為有助於容易地實施本發明的例示，對本領域普通技術人員而言，可適當使用具有類似或等同的物性的混合模式陰離子交換樹脂是顯而易見的。
本第一次純化步驟可通過將通過步驟(a)準備的培養液裝入(loading)到填充有混合模式(Mixed-mode)陰離子交換樹脂的柱來進行。在裝入完成後，可通過現有已知的方法來進行清洗及洗脫的過程。
第二次純化步驟(c)：使用混合模式(Mixed-mode)陽離子交換樹脂對經過第一次純化步驟的培養液進行純化
本發明的步驟(c)的第二次純化步驟是通過使用混合模式(Mixed-mode)陽離子交換樹脂來2次純化通過步驟(b)1次純化的純化溶液的步驟。
在本發明的一實例中，本發明的混合模式陽離子交換樹脂具有疏水性相互作用與離子相互作用相結合的混合模式選擇性。
在本發明的一具體例中，本發明的混合模式陽離子交換樹脂可使用選自由TOYOPEARL Sulfate-650F(陽離子交換填料)、TOYOPEARL MX-Trp-650M(混合模式層析填料)、Eshmuno CPS(層析填料)、或POROSXS(强陽離子交換樹脂)組成的組中。更具體地，例如，可使用TOYOPE
ARL Sulfate-650F。上述的具體的例示是作為有助於容易地實施本發明的例示，對本領域普通技術人員而言，可適當使用具有類似或等同的物性的混合模式陽離子交換樹脂是顯而易見的。
本第二次純化步驟可通過將通過步驟(b)第一次純化的純化液裝入(loading)到填充有混合模式(Mixed-mode)陽離子交換樹脂的柱來進行。在裝入完成後，可通過現有已知的方法來進行清洗及洗脫的過程。
本發明的技術特徵在於，在第一次純化步驟中使用混合模式(Mixed-mode)陰離子交換樹脂，依次在第二次純化步驟中使用混合模式(Mixed-mode)陽離子交換樹脂。
當純化肉毒桿菌毒素複合物時，與使用本發明的一實例的兩步工藝相比，在依次使用一般陰離子交換樹脂、陽離子交換樹脂等而不是混合模式交換樹脂的情况下，確認到具有非常低的純化收率，此外，即使在進一步使用疏水性交換樹脂的三步純化的情况下，也確認到與本發明的純化工藝相比具有非常低的純化收率。
本發明的特徵及優點概括如下：
(a)本發明提供肉毒桿菌毒素複合物的純化方法。
(b)當使用本發明的肉毒桿菌毒素複合物的純化方法時，能夠以非常高的收率純化肉毒桿菌毒素複合物。
以下，將通過實施例對本發明進行更詳細的說明。對本領域普通技術人員顯而易見的是，這些實施例僅用於更具體地說明本發明，根據本發明的
主旨，本發明的範圍不被這些實施例而限制。
實施例1：種培養
1.1.培養基配製
通過添加2%的蛋白腖(Sigma公司，29185)、1%的酵母提取物(Merck公司，1.03753)及1%的葡萄糖(Merck公司，1.37048)來配製用於種培養的培養基。使用高壓蒸汽滅菌器來對培養基進行滅菌。將滅菌後的培養基放置在厭氧培養箱中，通過在36℃及厭氧條件下初始化來保持。
1.2.接種及培養
通過使用保持在36±1℃及厭氧條件(O2，1.0%以下)的厭氧培養箱的傳遞窗(pass box)來向厭氧培養箱內移入A型肉毒桿菌菌株。菌株在厭氧培養箱內溶解後，將菌種以1/100比例接種到培養基中。在36±1℃及厭氧條件下靜置培養24小時後，通過肉眼確認整個培養基變得不透明時，判斷為種培養完成。
實施例2：主培養
2.1.培養基配製
通過添加2%的蛋白腖(Sigma公司，29185)、1%的酵母提取物(Merck公司，1.03753)及1%的葡萄糖(Merck公司，1.37084)來配製用於主培養的培養基。在主培養之前，對發酵器(Fermenter)中使用的傳感器進行校準，將混濁度(Turbidity)傳感器和pH及pO2傳感器安裝在培養箱中。將配製的主培養培養基放入發酵器中，在121℃的溫度條件下進行滅菌20分鐘。滅菌完成後，保持在厭氧條件(pO2，5.0%以下)下。
2.2.主培養
從厭氧培養箱中取出種培養液。打開接種線，將種培養液接種到培養箱內部。從主培養開始培養72小時後，結束主培養。
實施例3：硫酸沉澱
通過在主培養後的發酵器中使用5N硫酸來滴定使pH值達到3.5。將pH值調節為3.5±0.1後，在常溫條件下放置12小時。
實施例4：酶處理
4.1.pH滴定
去除硫酸沉澱液的上清液。通過在36℃及100rpm條件下添加5N氫氧化鈉溶液(Sodium hydroxide solution)(Merck公司，1.06482)來使上清液去除後的硫酸沉澱液的pH值達到6.0±0.1。
4.2.酶處理
添加鹽酸苯脒水合物(Benzamidine hydrochloride hydrate)(Sigma公司，B6506)使其濃度達到10mM/L。添加核酸酶(Benzonase)(Merck公司，1.01697)使其濃度達到50000U/L。將其在36℃及100rpm條件下反應5小時。
反應後，將回收的酶處理液在13000xg、20分鐘及4℃的條件下進行離心分離後，僅收集上清液，去除顆粒(pellet)。
實施例5：磷酸沉澱
通過在去除顆粒(Pellet)的酶處理上清液中添加10%的磷酸(AppliChem公司，147143)來滴定使pH值達到3.5。磷酸沉澱後的溶液在常溫條件下放置12小時。
實施例6：毒素再溶解
將放置後的磷酸沉澱液在13000xg、20分鐘及4℃的條件下進行離心分離後，去除上清液，回收顆粒(pellet)。使用50mM的磷酸鈉緩衝液(sodium phosphate buffer)pH6.5再溶解顆粒。再溶解的毒素液在13000xg、20分鐘及4℃的條件下進行離心分離後，回收上清液，並廢棄顆粒。
實施例7：第一次純化
確認了UV278nm和電導率(conductivity)的基線(baseline)是否穩定。通過0.22μm的瓶頂過濾器(bottle top filter)過濾再溶解後的毒素液來去除異物。將過濾的毒素液以46cm/hr的線速度裝入到填充有作為多模式(Multi modal)、混合模式陰離子交換樹脂的TOYOPEARL NH2-750F的柱中。在裝入完成後，用50mM的磷酸鈉緩衝液(sodium phosphate buffer)pH6.5來清洗500mL以上。清洗後，在將50mM的磷酸鈉緩衝液(sodium phosphate buffer)pH6.5、1M的氯化鈉緩衝液(sodium chloride buffer)以60%洗脫(elution)的過程中，各獲得5mL的餾分(fraction)。在以60%洗脫的過程中，回收各獲得5mL的餾分，基於SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)結果彙集(pooling)。
實施例8：2次純化
確認了UV278nm和電導率(conductivity)的基線是否穩定。將25mM的檸檬酸鹽緩衝液(citrate buffer)pH值為5.5添加到1次純化彙集溶液中，使pH值調節為5.5±0.1及電導率(conductivity)調節為7.0±0.5mS/cm。通過0.22um的瓶頂過濾器過濾來去除異物。將過濾的毒素液以46cm/hr的線速度裝入到填充有作為多模式(Multi modal)、混合模式陽離子交換樹脂
的TOYOPEARL Sulfate-650F柱中。在裝入完成後，用25mM的檸檬酸鹽緩衝液(citrate buffer)pH值為5.5來清洗500mL以上。清洗後，在將25mM的檸檬酸鹽緩衝液(citrate buffer)pH值為5.5、1M的氯化鈉緩衝液(sodium chloride buffer)以14%洗脫(elution)的過程中，回收各3mL的餾分(fraction)，基於SDS-PAGE結果彙集。
實施例9：過濾及細分
使用0.2μm注射器過濾器(Syringe filter)過濾第二次純化彙集溶液。將過濾後的第二次純化彙集溶液細分到儲存容器中，並在-70℃以下的溫度條件下儲存。
實施例10：純化產物蛋白質條帶分析
通過如下表中所示的還原條件來製備SDS-PAGE分析式樣。通過使用MES SDS電泳緩衝液(MES SDS Running buffer)(英杰(Invitrogen)，NP0002)來在中型蛋白預製膠(Novex 4~12% Bis-Tris gel)(英杰(Invitrogen)，NP0321BOX)上對分析式樣進行電泳。將電泳後的凝膠(Gel)使用考馬斯亮藍染色試劑(Coomassie Blue stain reagent)(Instnat Blue、expedeon、ISB1L)染色1小時，然後使用三次蒸餾水充分清洗。使用圖像分析儀(Image analyzer)(ATTO，WSE-6100)分析清洗後的凝膠(Gel)。
通過分析結果可確認到，除了已知組成A型肉毒桿菌毒素複合物的7個蛋白條帶以外，沒有觀察到雜質蛋白。(參照：圖5)。
實施例11：純化產物純度分析
高效液相凝膠色譜(SE-HPLC)分析在以下條件下進行。
分析結果，可在約7.7分鐘(約900kDa)的保留時間(Retention time)中確認到100%純度的單峰(peak)(參照：圖6)。
實施例12：通過蛋白質定量分析收率
通過在如下表所示的條件下進行BCA蛋白濃度檢測(BCA assay)(賽默飛世爾(Thermo scientific)，23227)來比較通過蛋白質定量的收率。
將在韓國申請號第2020-044716號(KR10-2020-0121245A)及韓國申請號第2020-044717號(KR10-2020-0121246A)中描述的實施方法設定為對照組，比較了最終產物的收率。
其結果確認到，相對於比較例1提高約44倍的收率，相對於比較例2提高約7倍的收率。
圖1為示出在使用混合模式(Mixed-mode)陰離子交換樹脂的第一次純化工藝後獲得的結果物的分析結果。
圖2為示出在使用混合模式(Mixed-mode)陰離子交換樹脂的第一次純化工藝後獲得的結果物的SDS-PAGE分析結果。
圖3為示出在使用混合模式(Mixed-mode)陽離子交換樹脂的第二次純化工藝後獲得的結果物的分析結果。
圖4為示出在使用混合模式(Mixed-mode)陽離子交換樹脂的第二次純化工藝後獲得的結果物的SDS-PAGE分析結果。
圖5為示出在本發明中使用的肉毒桿菌毒素複合物原液的SDS-PAGE分析結果。
圖6為示出在本發明中使用的肉毒桿菌毒素複合物原液的SE-HPLC分析結果。
圖7為示出純化收率的比較實驗結果的柱狀圖。
Claims (6)
- 一種肉毒桿菌毒素複合物的純化方法，其中，包括：準備步驟(a)，準備肉毒桿菌毒素生成菌株培養液；第一次純化步驟(b)，使用混合模式(Mixed-mode)陰離子交換樹脂對準備的培養液進行純化；以及第二次純化步驟(c)，使用混合模式(Mixed-mode)陽離子交換樹脂對經過第一次純化步驟的培養液進行純化，其中，該混合模式陰離子交換樹脂及該混合模式陽離子交換樹脂具有疏水性相互作用與離子相互作用相結合的混合模式選擇性。
- 如請求項1之肉毒桿菌毒素複合物的純化方法，其中，該肉毒桿菌毒素生成菌株為A型肉毒桿菌(C.botulinum)。
- 如請求項1之肉毒桿菌毒素複合物的純化方法，其中，該混合模式陰離子交換樹脂選自由TOYOPEARL NH2-750F、HyperCel STAR AXResin或POROS XQ組成的組中。
- 如請求項1之肉毒桿菌毒素複合物的純化方法，其中，該混合模式陽離子交換樹脂選自由TOYOPEARL Sulfate-650F、TOYOPEARL MX-Trp-650M、Eshmuno CPS、或POROS XS組成的組中。
- 如請求項1之肉毒桿菌毒素複合物的純化方法，其中，該步驟(a)包括：培養步驟(a-1)，在培養基中培養肉毒桿菌毒素；第一沉澱步驟(a-2)，添加硫酸進行反應；酶處理步驟(a-3)，添加核酸酶進行反應； 第二沉澱步驟(a-4)，回收經過酶處理步驟的溶液的上清液，並添加磷酸進行反應；以及再溶解步驟(a-5)，使用緩衝液再溶解沉澱物。
- 如請求項5之肉毒桿菌毒素複合物的純化方法，其中，在該步驟(a-5)之後，還包括通過離心分離去除沉澱物的步驟。
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