CN105392795B - 生产肉毒杆菌毒素的方法 - Google Patents

生产肉毒杆菌毒素的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105392795B
CN105392795B CN201480012202.6A CN201480012202A CN105392795B CN 105392795 B CN105392795 B CN 105392795B CN 201480012202 A CN201480012202 A CN 201480012202A CN 105392795 B CN105392795 B CN 105392795B
Authority
CN
China
Prior art keywords
botulin toxin
toxin
botulin
anion
buffer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201480012202.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105392795A (zh
Inventor
金清世
宋琯荣
闵庚旼
安荣德
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Big Bear
Original Assignee
Big Bear
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=49987856&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CN105392795(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Big Bear filed Critical Big Bear
Publication of CN105392795A publication Critical patent/CN105392795A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105392795B publication Critical patent/CN105392795B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/33—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Clostridium (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/18—Ion-exchange chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/30—Extraction; Separation; Purification by precipitation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/36—Extraction; Separation; Purification by a combination of two or more processes of different types
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/24—Metalloendopeptidases (3.4.24)
    • C12Y304/24069—Bontoxilysin (3.4.24.69), i.e. botulinum neurotoxin

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及生产肉毒杆菌毒素的方法，更具体地涉及一种用于制备肉毒杆菌毒素的方法，该方法包括步骤：(a)用酸处理肉毒杆菌毒素生产株的培养物，以沉淀肉毒杆菌毒素；(b)向沉淀的肉毒杆菌毒素中加入缓冲液，接着用蛋白酶抑制剂和核酸酶处理，从而提取肉毒杆菌毒素；(c)用酸处理提取出的肉毒杆菌毒素以沉淀肉毒杆菌毒素并在缓冲液中溶解沉淀物；和(d)通过阴离子交换色谱纯化肉毒杆菌毒素。使用本发明的生产肉毒杆菌毒素的方法能够通过简单的过程生产出高纯度的肉毒杆菌毒素，这表明本发明的方法是非常经济有效的。相比于通过常规方法生产的肉毒杆菌毒素，通过本发明方法生产的肉毒杆菌毒素具有高纯度，并因此具有在局部作用增加的能力。因此，会导致副作用的肉毒杆菌毒素的体循减少，安全性增加。因此，本发明的肉毒杆菌毒素可用于各种目的，包括治疗神经肌肉障碍，去除皱纹，和治疗痉挛性偏瘫和脑瘫。

Description

生产肉毒杆菌毒素的方法
技术领域
本发明涉及生产肉毒杆菌毒素的方法，更具体地涉及一种用于制备肉毒杆菌毒素的方法，该方法包括步骤：(a)用酸处理肉毒杆菌毒素生产株的培养物，以沉淀肉毒杆菌毒素；(b)向沉淀的肉毒杆菌毒素中加入缓冲液，接着用蛋白酶抑制剂和核酸酶处理，从而提取肉毒杆菌毒素；(c)用酸处理提取出的肉毒杆菌毒素以沉淀肉毒杆菌毒素并在缓冲液中溶解沉淀物；和(d)通过阴离子交换色谱纯化肉毒杆菌毒素。
背景技术
自19世纪90年代已发现各种分泌神经毒素的梭菌属(Clostridium sp.)的菌株，并且在过去的70年已对从这些菌株分泌的毒素进行了表征(Schant,E.J.et al.,Microbiol.Rev.,56:80,1992)。
源自梭菌属菌株的神经毒素，即肉毒杆菌毒素，根据它们的血清学性质被分为七种类型(类型A至G)。每种毒素具有约150KDa大小的毒素蛋白并且天然含有几种非毒性蛋白的复合物。中等复合物(300kDa)由毒素蛋白和无毒的非血凝素蛋白组成，大复合物(450kDa)和非常大的复合物(900kDa)由结合到血凝素的中等复合物组成(Sugiyama,H.,Microbiol.Rev.,44:419,1980)。已知这种非毒性的血凝素蛋白是用于保护毒素免受肠道内的低pH值和各种蛋白酶的作用。
在细胞中，毒素被合成为具有约150kDa的分子量的单个多肽，然后通过胞内蛋白酶作用或用人造酶如胰蛋白酶处理，在从N-末端开始的1/3位置裂解成两个单位：轻链(L；分子量：50kDa)和重链(H；分子量：100kDa)。相比于单个多肽，裂解的毒素具有大大增加的毒性。两个单位通过二硫键彼此连接并具有不同的功能。重链结合至靶细胞的受体(Park.M.K.,et al.,FEMS Microbiol.Lett.,72:243,1990)并用于在低pH值(pH 4)与生物膜相互作用，以形成通道(Mantecucco,C.et al.,TIBS.,18:324,1993)，轻链具有药理活性，因此通过例如电穿孔导入细胞时，利用洗涤剂赋予细胞渗透性或干扰神经递质的分泌(Poulain,B.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,85:4090,1988)。
毒素在神经肌肉接头的胆碱能神经突触前处抑制乙酰胆碱的胞吐作用，造成乏力。已认为用非常少量的毒素进行处理展现毒性，这表明毒素具有任何酶活性(Simpson,L.L.et al.,Ann.Rev.Pharmaeol.Toxicol.,26:427,1986)。
根据最近的报道，毒素具有金属肽酶活性，并且其底物由小突触、突触融合蛋白、25KDa的突触相关蛋白(SNAP25)等组成，它们是胞吐机械复合物的单位蛋白。每种类型的毒素使用上述三种蛋白质之一作为底物，并且已知B、D、F和G型毒素在特定位点裂解小突触，A型和E型毒素在特定位点裂解SNAP25，和C型在特定位点裂解突触融合蛋白(Binz,T.etal.,J.Biol.Chem.,265:9153,1994)。
特别是，已知A型肉毒杆菌毒素可溶于pH为4.0-6.8的稀释水溶液。已知稳定的非毒性蛋白质在pH大约为7或更高时从神经毒素中分离，并且结果是，毒性逐渐丧失。特别是，已知毒性随pH和温度的增加而减少。
肉毒杆菌毒素即使少量对人体也是致命的并且易于大量产生。因此，它与炭疽杆菌、鼠疫和天花病毒一起构成四大生物恐怖武器。然而发现，当A型肉毒杆菌毒素在以不全身影响人体的剂量注射时，它可以在注射部位使局部肌肉麻痹。根据这个特点，A型肉毒杆菌毒素可以在广泛的应用中使用，包括除皱纹药剂，治疗痉挛性偏瘫和脑瘫的药剂等。因此对于A型肉毒杆菌毒素的需求增加，并且已积极地进行对生产肉毒杆菌毒素以满足该需求的方法的研究。
目前典型的商品化产品是购自美国Allergan公司的(纯化的A型肉毒杆菌毒素的神经毒素复合物)。100单位小瓶的由约5ng的纯化的A型肉毒杆菌毒素的神经毒素复合物，0.5mg人血清白蛋白和0.9mg氯化钠组成并且用不含防腐剂的无菌盐水(注射0.9％氯化钠)重构。其他商品化产品包括购自Ipsen Ltd.,UK,MyoBlocTM的(A型肉毒杆菌毒素和血凝素的复合物，其在含有肉毒杆菌毒素的药物组合物中具有乳糖和人血清白蛋白并在使用前用0.9％氯化钠重构)，(可注射溶液(pH约5.6)，包含B型肉毒杆菌毒素、人血清白蛋白、琥珀酸钠和氯化钠)，购自Solstice Neurosciences,Inc.。常规用于生产肉毒杆菌毒素的方法包括酸沉淀法、盐沉淀法和色谱法。
例如，日本专利公开号1994-192296公开了一种通过培养肉毒梭菌细菌，接着进行酸沉淀，提取，添加核酸酶和结晶来生产结晶A型肉毒杆菌毒素的方法。此外，美国专利5696077公开了一种通过培养肉毒梭菌细菌，接着进行酸沉淀，提取，离子交换色谱，凝胶过滤色谱和结晶来生产结晶B型肉毒杆菌毒素的方法。
Simpson等人通过重力流色谱，随后通过HPLC，使用亲和树脂、大小排阻色谱，和包括使用两种不同的离子交换柱的离子(阴离子和阳离子)交换色谱的捕获来纯化肉毒神经毒素，生产A型肉毒杆菌毒素(Method in Enzymology,165:76,1988)，王等人使用沉淀和离子色谱来纯化A型肉毒杆菌毒素(Dermatol Las Faci Cosm Surg.,2002:58,2002)。
此外，美国专利6818409公开了使用离子交换和乳糖柱纯化肉毒杆菌毒素，和美国专利号7452697公开了一种通过离子交换色谱和疏水色谱的A型肉毒杆菌毒素。韩国专利公开号2009-0091501公开了通过酸沉淀和阴离子交换色谱纯化肉毒杆菌毒素的方法，以及美国公开号2013-0156756公开了通过阴离子交换色谱和阳离子交换色谱纯化肉毒杆菌毒素的方法。
然而，传统方法的问题在于使用阴离子交换色谱不利地影响肉毒杆菌毒素的凝胶条带图案(美国专利号7452697)，并且问题还在于这些常规方法由于纯化时间长而难以商业上应用。另外，由于作为肉毒杆菌毒素生产菌株的肉毒杆菌是一种厌氧细菌，存在着细菌发酵应在厌氧系统中执行的问题，因此难以大量生产肉毒杆菌毒素。此外，存在着通过上述纯化方法纯化的活性成分肉毒杆菌毒素并未清楚地分离和鉴定的问题，并因此含有杂质。此外，生产肉毒杆菌毒素的传统方法存在着必需要进行过滤或透析过程以纯化高纯度的肉毒杆菌毒素的问题，这表明纯化过程是复杂且困难的。
因此，本发明人进行了广泛的努力，以解决现有技术中存在的上述问题，并且结果发现，当肉毒杆菌毒素生产株的培养物用酸处理以形成肉毒杆菌毒素沉淀物并且通过阴离子交换色谱纯化所形成的沉淀物时，可以省略过滤、透析和乙醇沉淀步骤，并且生产所述肉毒杆菌毒素的工艺非常容易，并且通过该生产方法可以生产具有98％或更高纯度的肉毒杆菌毒素，从而完成了本发明。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种通过简单的工艺来生产高纯度肉毒杆菌毒素的方法。
为了达到上述目的，本发明提供了用于生产肉毒杆菌毒素的方法，该方法包括以下步骤：(a)用酸处理肉毒杆菌毒素生产株的培养物，以沉淀肉毒杆菌毒素；(b)向沉淀的肉毒杆菌毒素中加入缓冲液，接着用蛋白酶抑制剂和核酸酶处理，从而提取肉毒杆菌毒素；(c)用酸处理提取出的肉毒杆菌毒素以沉淀肉毒杆菌毒素并在缓冲液中溶解沉淀物；和(d)通过阴离子交换色谱纯化肉毒杆菌毒素。
附图说明
图1是示出根据本发明的生产肉毒杆菌毒素的过程的示意图。
图2示出测量通过初级阴离子交换色谱对肉毒杆菌毒素进行纯化后的纯度结果。
图3示出测量通过二次阴离子交换色谱对肉毒杆菌毒素进行纯化后的纯度结果。
图4示出测量用本发明方法生产的肉毒杆菌毒素和(Allergan)处理所造成的复合肌肉动作电位振幅的增加或减少的结果。N：无注射液；S：盐水注射；B2：BTX-A-1，两个单位；D2：BTX-A-2，两个单位；B4：BTX-A-1，四个单位；D4：BTX-A-2，四个单位；B8：BTX-A-1，八个单位；和D8：BTX-A-2，八个单位。
图5示出测量用本发明方法生产的肉毒杆菌毒素和(Allergan)处理所造成的传导速度的结果。N：无注射液；S：盐水注射；B2：BTX-A-1，两个单位；D2：BTX-A-2，两个单位；B4：BTX-A-1，四个单位；D4：BTX-A-2，四个单位；B8：BTX-A-1，八个单位；和D8：BTX-A-2，八个单位。
具体实施方式
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属技术领域的普通技术人员的通常理解具有相同的含义。大体上，将在下面描述的本文中使用的命名法和实验方法是本领域公知的且通常采用的。
在一个方面，本发明涉及一种生产肉毒杆菌毒素方法，该方法包括步骤：(a)用酸处理肉毒杆菌毒素生产株的培养物，以沉淀肉毒杆菌毒素；(b)向沉淀的肉毒杆菌毒素中加入缓冲液，接着用蛋白酶抑制剂和核酸酶处理，从而提取肉毒杆菌毒素；(c)用酸处理提取出的肉毒杆菌毒素以沉淀肉毒杆菌毒素并在缓冲液中溶解沉淀物；和(d)通过阴离子交换色谱法纯化肉毒杆菌毒素(图1)。
通过本发明的方法生产所得的肉毒杆菌毒素可以用各种方法保存，包括冷冻储藏和冻干储藏。
本发明的方法可以在步骤(d)后进一步包括步骤：(e)用硫酸铵处理含有肉毒杆菌毒素的阴离子交换色谱级分，以形成沉淀物，并将沉淀物在缓冲液中溶解；和(f)通过阴离子交换色谱纯化肉毒杆菌毒素。
在本发明中，肉毒杆菌毒素生产株优选肉毒杆菌(Clostridium botulinum)，但并不限于此，对本领域技术人员显而易见的是在本发明中可以使用能够生产肉毒杆菌毒素的任何菌株。
如本文所用的术语“肉毒杆菌毒素”旨在不仅包括由肉毒梭菌菌株生产的神经毒素，也包括修饰的、重组的、杂合的和嵌合的肉毒杆菌毒素。重组肉毒杆菌毒素可具有由非梭菌物种以重组方式生产的轻链和/或重链。此外，本文所用术语“肉毒杆菌毒素”旨在包括肉毒杆菌毒素血清型A、B、C、D、E、F和G，肉毒杆菌毒素复合物(即，300、600和900kDa复合物)，以及纯肉毒杆菌毒素(即，150kDa的神经毒性分子)，它们在本发明的实践中都是有用的。
如本文所用的术语“生产的肉毒杆菌毒素”是指纯肉毒杆菌毒素或肉毒杆菌毒素复合物，其与从培养物或发酵过程中收集肉毒杆菌毒素时，伴随肉毒杆菌毒素的其他蛋白质或杂质是分离或基本上分离的。因此，生产的肉毒杆菌毒素的纯度为至少90％，优选至少95％，最优选至少98％。特别是，在本发明中生产的肉毒杆菌毒素可以是具有至少98％的纯度的A型肉毒毒素蛋白质。
用于生产肉毒杆菌毒素的肉毒杆菌菌株可以使用本领域中已知的常规方法进行培养并且可用常规培养基进行培养。
作为非限制性实例，用于肉毒梭菌菌株培养的培养基可包括酪蛋白水解物、酵母提取物、葡萄糖等，并且培养是在25-40℃的温度进行90-180小时，并且优选100-150小时。
步骤(a)的酸沉淀可以通过向菌株的培养物中加入酸，优选硫酸或盐酸来进行，以使由pH传感器测量的培养物的pH值达到3.0-4.5，优选3.3-4.0，且最优选3.4-3.6。
步骤(a)的酸沉淀是基于这样的原则，其中向含有多种蛋白质的培养物中加入酸降低了培养物的pH，同时杀死了在培养后残留的肉毒杆菌，使得蛋白质达到沉淀的等电点。它包括广义上的结晶，并且与关注于以高纯度纯化所需物质的结晶不同，沉淀法是以混合状态大致分离所期望物质的方法。在沉淀法中，与所需物质具有类似结构的杂质也被沉淀。在此，将pH调节至约3.0-4.5。肉毒杆菌毒素的回收率随着pH值降低而增加。如果pH为3.0或更低，这将影响肉毒杆菌毒素本身，如果pH为4.5或更高，肉毒杆菌毒素的回收率会降低。由于这些原因，pH值优选在上述特定范围内。
具体地，pH最优选3.4-3.6，因为肉毒杆菌毒素的回收率在该pH范围是最高的。当肉毒菌株培养物的pH在加酸后达到适当的范围时，将酸加入到培养物中直到不再出现pH变化，然后将培养物在室温静置15-30小时，然后除去上清液。
提取肉毒杆菌毒素的步骤(b)包括将从步骤(a)得到的毒素在磷酸盐缓冲液中溶解，优选磷酸钠缓冲液，并除去沉淀物。这里，磷酸盐缓冲液的pH优选为约4.0至约7.0。可以通过加入碱，优选氢氧化钠将所得的pH调节至4.5-6.5，优选5.0-6.0，并且可以在上述规定的pH范围进行毒素的提取。
此外，用于步骤(b)的核酸酶可以是DNase和RNase，并且用于步骤(b)的蛋白酶抑制剂优选苯甲脒盐酸，但并不限于此，本领域中已知的任何能够抑制蛋白酶活性的物质都可在本发明中使用。通过在提取肉毒杆菌毒素的步骤(b)中用核酸酶处理，可以分解由在步骤(a)的酸所形成的沉淀物中所含的杂质如DNA和RNA。如果用酶处理的步骤进行1.5小时或更少，DNA和RNA的分解可能不充分。出于这个原因，用酶处理的步骤进行1.5-7小时，优选3-6小时，并且DNase和RNase优选以0.05-1.0g/l的浓度添加，优选0.1-0.5g/l。
因为通过酶处理得到的提取物中含有肉毒杆菌毒素和与肉毒杆菌毒素具有类似极性的蛋白质，应该进行用盐酸沉淀蛋白质的步骤。具体地，步骤(c)用盐酸沉淀优选通过离心经酶处理过的提取物来进行，通过加入盐酸(HCl)调节上清液pH至pH为2.5至4.5，优选为3.0-4.0，然后于4℃在冰箱中用盐酸沉淀上清液中的蛋白质。特别是，在用盐酸沉淀的步骤中的pH最优选调节至3.3-3.8，以保持毒素的活性和回收率在高水平。如果用盐酸沉淀的步骤是在上述pH范围进行，肉毒杆菌毒素的效价会高达90％以上，并且将显著降低蛋白质的凝固。接着，用盐酸的沉淀物可以在缓冲液中溶解，并可执行随后的步骤。
作为最重要步骤的步骤(d)是在用盐酸沉淀的步骤完成后通过使用阴离子交换树脂的色谱法来进行的，以除去A型肉毒杆菌毒素以外的大多数主要杂质。用于步骤(d)的阴离子交换树脂可以是用二乙氨基乙基(DEAE)或季铵(Q)基团取代的树脂，但不限于此。例如，阴离子交换树脂可以是DEA-Sephadex，如美国专利号5,696,077、国际专利公开号WO96/05222和美国专利号5,846,929描述的。优选地，它是具有强碱性的季铵基团或弱碱性二乙氨基乙基(DEAE)基团的阴离子交换树脂中的任何一种。
可以在本发明中使用的强碱性阴离子交换基团的例子可包括Q Sepharose FastFlow，Q Sepharose High Performance，Resource Q，Source15Q，Source 30Q，Mono Q，MiniQ，Capto Q，Capto Q ImpRes，Q HyperCel，Q Cermic HyperD F，Nuvia Q，UNOsphere Q，Macro-Prep High Q，Macro-Prep 25Q，Fractogel EMD TMAE(S)，Fractogel EMD TMAEHicap(M)，Fractogel EMD TMAE(M)，Eshmono Q，Toyopearl QAE-550C，Toyopearl SuperQ-650C，Toyopearl GigaCap Q-650M，Toyopearl Q-600C AR，Toyopearl SuperQ-650M，Toyopearl SuperQ-650S，TSKgel SuperQ-5PW(30)，TSKgel SuperQ-5PW(20)或TSKgelSuperQ-5PW，但不限于此，也可以使用本领域中已知的阴离子交换树脂。
用于步骤(d)的柱缓冲液可以是磷酸钠缓冲液或柠檬酸盐缓冲液。优选使用磷酸钠缓冲液。柱缓冲液的浓度控制在30-70mM，优选约40-60mM。柱的pH控制为约3.5-7.5，并且流动相的流速控制为0.5-5.0ml/min，优选1.0-3.0ml/min。另外，缓冲液的电导率调节至3-30mS/cm，并在完成柱平衡后注入样品。将毒素作为流过物洗脱，而吸附最主要的杂质。具体地，在通过阴离子交换色谱纯化的步骤(d)中，A型肉毒杆菌毒素不吸附于阴离子交换树脂，而最主要的杂质通过吸附被除去。
在本发明中，步骤(d)的阴离子交换色谱优选在pH为3.5-7.5，优选4.5-7.0，和电导率为3-30mS/cm，优选5-20mS/cm时进行。
为了完全除去步骤(d)的阴离子交换色谱后残留的杂质，如果有必要，根据本发明生产肉毒杆菌毒素的方法还包括以下步骤：(e)用硫酸铵处理含有肉毒杆菌毒素的阴离子交换色谱级分，以形成沉淀物，并在缓冲液中溶解沉淀物；和(f)通过阴离子交换色谱纯化肉毒杆菌毒素。
在步骤(e)中，用硫酸铵处理含有肉毒杆菌毒素的阴离子交换色谱级分以形成沉淀物，将形成的沉淀物在缓冲液中溶解。用硫酸铵沉淀的步骤对应于盐析过程，其中将易于溶解在水中的盐(硫酸铵等)加入到蛋白质混合物中以提高离子强度，从而形成蛋白质沉淀物。如果所需蛋白质主要在用30％(w/v)硫酸铵饱和时沉淀，那么所需蛋白质可以通过在30％或更低的硫酸铵饱和浓度下析出除了所需蛋白以外的蛋白来沉淀，然后添加硫酸铵至30％的饱和浓度(w/v)，并可以通过离心收集。盐析操作经常被用作初始手段。用于步骤(e)的硫酸铵溶液可具有10-50％的硫酸铵浓度(w/v)，优选20-40％(w/v)。
接着，在步骤(f)中，可以通过阴离子交换色谱纯化肉毒杆菌毒素。根据本发明的高纯度肉毒杆菌毒素的纯化主要由步骤(d)的阴离子交换色谱(初级阴离子交换色谱)来执行，并且执行步骤(f)的阴离子交换色谱(二次阴离子交换色谱)以除去残留的杂质，并且步骤(f)的阴离子交换色谱可以以与步骤(d)的阴离子交换色谱相同的方式进行。
可以对通过上述纯化方法获得的所得含有A型肉毒杆菌毒素的级分灭菌和过滤，以制备粗液。制得的粗液可以冷冻保存直至使用。
在另一个方面，本发明涉及通过本发明方法生产的肉毒杆菌毒素。分析经HPLC纯化的肉毒杆菌毒素的纯度，结果可以看出，经过初级阴离子交换色谱后肉毒杆菌毒素的纯度为98.38％(图2)，这比购自Allergan Inc.的的纯度(约95％)更高，这表明在初级阴离子交换色谱步骤中除去了大多数杂质。另外也示出了二次阴离子交换色谱后的肉毒杆菌毒素的纯度为98.99％(图3)。
此外，根据本发明的生产肉毒杆菌毒素的方法具有的优点在于可省略过滤、透析和乙醇沉淀的步骤，因此生产肉毒杆菌毒素的方法容易简单。特别是，本发明的方法的优点在于，可以省略在用于生产Allergan Inc.的的方法中的过滤和乙醇沉淀的步骤(美国专利公开号2012-0156756；非APF方法)，因而可以减少纯化步骤的数目(从五个步骤到三个步骤)，以减少生产肉毒杆菌毒素的粗液的周期(从4周至2周)。
在本发明的另一实例中，为了确认由本发明方法生产的A型肉毒杆菌毒素蛋白(DWP450)的安全性，进行了与(Allergan)的安全性比较的实验。结果表明，由本发明方法生产的肉毒杆菌毒素(DWP450)对于雌性显示出60U/kg的NOAEL值，这表明它比显示出30U/kg的NOAEL值的(Allergan)安全多一倍。通过本发明方法生产的肉毒杆菌毒素的安全性多一倍被认为是因为本发明的肉毒杆菌毒素具有高纯度，因而在局部作用时具有增加的能力，使得会导致副作用的肉毒杆菌毒素的全身循环减少。
通过本发明方法生产的肉毒杆菌毒素被用作药物组合物的有效成分。肉毒杆菌毒素可用于治疗表征为骨骼肌活动过度的神经肌肉病症。此外，它可以用于各种症状，包括头痛、偏头痛、紧张性头痛、窦性头痛、颈源性头痛、出汗障碍、腋窝多汗症、手掌多汗症、跖多汗症、弗雷氏综合征、运动过度皮肤线、面部皱纹、眉间皱纹、鱼尾纹、木偶线、鼻唇沟、皮肤病症、食道失弛缓症、斜视、慢性肛裂、眼睑痉挛、肌肉骨骼疼痛、纤维肌痛、胰腺炎、心动过速、前列腺肥大、前列腺炎、尿潴留、尿失禁、膀胱过动症、肌痉挛、震颤、肌阵挛、胃肠功能紊乱、糖尿病、流涎、逼尿肌-括约肌协同失调、中风后痉挛、伤口愈合、少年脑瘫、平滑肌痉挛、再狭窄、局部肌张力障碍、癫痫症、颈部肌张力障碍、甲状腺疾病、高钙血症、强迫症、关节痛、雷诺氏症、萎缩纹、腹腔粘连、血管痉挛、流涕、肌肉挛缩、损伤的肌肉、喉肌张力障碍、书写痉挛和腕管综合征。
如本文所用的术语“药物组合物”是指包含肉毒杆菌毒素作为有效成分的制剂，并且该制剂除了肉毒杆菌毒素活性成分外，可以在药物组合物中包含至少一种额外的成分(赋形剂)。所述额外的成分可以选自白蛋白、人血清白蛋白、重组人血清白蛋白、明胶、蔗糖、海藻糖、羟乙基淀粉、胶原蛋白、乳糖、蔗糖氯化钠、多糖、辛酸盐、聚乙烯吡咯烷酮和钠组成的组，但并不限于此。另外，制备包含肉毒杆菌毒素作为有效成分的药物组合物的方法包括将肉毒杆菌毒素与额外的成分(赋形剂)结合的步骤，并且结合步骤可以选自由冷冻干燥、冻干和真空干燥组成的工艺。
因此，药物组合物是适用于诊断、治疗或美容施用(例如，通过肌内或皮下注射或通过插入贮库(depot)或植入物)受试者(如人类患者)的制剂。药物组合物可以是：在冻干或真空干燥的条件下，用盐水或水对冻干或真空干燥的药物组合物重构后形成的溶液；或作为不需要重构的溶液。活性成分可以是肉毒杆菌毒素血清型A、B、C1、D、E、F或G或肉毒杆菌毒素中的一种，所有这些都可以通过梭菌细菌本身制成。如上所述，药物组合物可以是液体或固体，例如真空干燥的。配制肉毒杆菌毒素活性成分的药物组合物的示例性方法公开于2002年11月5日公布的美国专利公开号2003-0118598。
在本发明的另一实例中，为了确认由本发明方法生产的肉毒杆菌毒素蛋白质(DWP450)的效果，测量复合肌肉动作电位(CMAP)的幅度和传导速度(tC)。在实验中，将两种不同的A型肉毒杆菌毒素蛋白，BTX-A-1(Allergan Inc.，加利福尼亚州，美国)和由本发明的实施例2中生产的BTX-A-2(DWP450)用于四个分组中。在组1中，将0.08ml氯化钠(NaCl)施用给一个TA肌肉，另一个肌肉不作处理。在第2组中，将0.02ml BTX-A-1(两个单位)施用给一个TA肌肉而0.02ml BTX-A-2(两个单位)施用给另一个TA肌肉。在第3组中，将0.04ml BTX-A-1(4单位)施用给一个TA肌肉，而0.04ml BTX-A-2(4单位)施用给另一个TA肌肉。在组4中，将0.08ml BTX-A-1(8个单位)施用给一个TA肌肉，而0.08ml BTX-A-2(8个单位)施用给另一个肌肉。
肉毒杆菌毒素的一个单位被定义为经腹腔注射到每只重约18-20g的雌性SwissWebster小鼠的LD50。肉毒杆菌毒素的一个单位是杀死一组雌性Swiss Webster小鼠中的50％的肉毒杆菌毒素的量。
测量通过施用BTX-A-1和BTX-A-2而引起的复合肌肉动作电位(CMAP)的幅度，结果是，在2Hz的慢刺激速率，施用BTX-A-1和BTX-A-2的各组在施用后第3天、1周、2周、3周和4周显示出TA肌肉的麻痹作用(dY)(图4A)，并且在20Hz的快刺激速率，施用BTX-A-1和BTX-A-2的各组在施用后第3天、1周、2周、3周和4周显示出TA肌肉的麻痹作用(dY)(图4B)。在2Hz的慢刺激速率和20Hz的快刺激速率时，BTX-A-1和BTX-A-2之间没有显著差异(p<0.05)，并在施用BTX-A-1和BTX-A-2的各组中对TA肌肉的麻痹作用(dY)与肉毒杆菌毒素的给药剂量相关。
测量施用BTX-A-1和BTX-A-2所造成的传导速度(tC)，结果表明，在2Hz的慢刺激速率和20Hz的快速刺激速率时，施用BTX-A-1和BTX-A-2的各组并没有诱发传导速度的延迟(图5)。
具体地，由本发明方法生产的肉毒杆菌毒素表现出类似于市售(Allergan公司)的效果，并且因为它具有较高的纯度，导致肉毒杆菌毒素在全身循环特性的降低，因此安全提高了一倍。因此，可用于各种目的，包括治疗神经肌肉障碍，去除皱纹，和治疗痉挛性偏瘫和脑瘫。
以下，参照实施例对本发明进行更详细的说明。本领域的普通技术人员显而易见的是，这些实施例是说明性的目的，并且不应被解释为限制或改变本发明的范围。
实施例1：肉毒杆菌菌株的培养
1-1：用于培养物的培养基组成
使用具有包含2％酪蛋白水解物，1％酵母提取物，1％葡萄糖和0.5％巯基乙酸的组合物的培养基用于肉毒梭菌菌株的种子培养和主培养，以生产肉毒杆菌毒素。
1-2：肉毒梭菌菌株的种子培养
将20μl肉毒梭菌(韩国疾病控制和预防中心，保藏号：4-029-CBB-IS-001)接种到含有10ml具有实施例1-1中所述组成的无菌培养基的培养管中并在35℃厌氧条件下进行初级种子培养(静止培养)22-30小时。当确认了在初级种子培养中的菌株生长时，将8ml初级种子培养物接种到含有800ml的具有相同培养基组成的无菌培养基的1l培养瓶中并在35℃厌氧条件下进行二次种子培养(静止培养)8-15小时。
1-3：肉毒梭菌菌株的主培养
为了通过培养肉毒梭菌菌株生产肉毒杆菌毒素，进行菌株的主培养。具体而言，制备9.3l具有实施例1-1中所述组成的培养基并放置在10l培养箱中，接着对培养基灭菌。供给氮气以制造厌氧条件，并在35℃的温度下以50rpm的搅拌速度进行菌株生长。
在1l培养瓶中进行了实施例1-2的二次种子培养的菌株通过连接到10l培养箱的接种端口的接种线而接种到10l培养箱。在35℃和50rpm的条件下培养10l培养箱中的肉毒梭菌菌株并维持、检查和记录设定的培养条件。当菌株培养100小时以上，完成主培养。
实施例2：肉毒杆菌毒素的生产
2-1：用硫酸沉淀的步骤
用硫酸沉淀的步骤是一种蛋白分离方法，其中将硫酸添加到含有许多种蛋白质的培养物中以降低培养物的pH，同时杀死培养之后剩余的肉毒杆菌以使蛋白质达到等电点而沉淀。按实施例1-3中描述进行主培养并且在主培养结束后，通过自动泵将5N硫酸加入到培养物中，以使10l培养箱的pH传感器测得的pH达到3.4-3.6，然后将培养物通过培养箱的收集线转移至20l容器(AS ONE，目录号AS5.372.06)，并将含有硫酸沉淀物的20l容器转移至生物安全柜(BSC)。然后，在BSC中用硫酸进行沉淀。
2-2：酶处理和毒素提取
从硫酸沉淀物除去上清液后，将700ml 1M磷酸钠缓冲液(pH 5.3)加入到沉淀物中。然后，加入5N氢氧化钠(NaOH)将溶液调节到pH为5.0-6.0。为从沉淀物除去DNA和RNA，加入60ml的0.4M苯甲脒盐酸，1g DNase和1g RNase并与溶液反应约5小时，以提取肉毒杆菌毒素。
2-3：盐酸沉淀和毒素溶解
将包括毒素提取物的培养物在4℃以12000×g离心15分钟以将其分离成沉淀和上清液，将分离的上清液转移至新的10l瓶(AS ONE，目录号AS5.372.04)，然后通过加入1N盐酸(HCl)调整pH为3.4-3.6，并在4℃在冰箱中进行盐酸沉淀。将盐酸沉淀物在4℃以12000×g离心15分钟，除去上清液，在这之后向毒素沉淀中加入50ml磷酸钠缓冲液(pH 6.5)以溶解毒素。
2-4：初级阴离子交换色谱
沉淀过程完成后，为了除去A型肉毒杆菌毒素以外的大多数主要的杂质，使用离子交换树脂进行色谱。具体地，将阴离子交换树脂(Toyopearl SuperQ-650M,TosohBioscience,P/N 17228)填充到柱中，然后将在实施例2-3沉淀的样品注入到柱中，用50mM磷酸钠洗脱缓冲液洗脱该毒素。在初级纯化步骤中，A型肉毒杆菌毒素蛋白质并未吸附在阴离子交换树脂，而大多数主要的杂质通过吸附被除去。为了高纯度肉毒杆菌毒素的纯化，将样品保持在pH为4.5-7.0和电导率为5-20mS/cm。
2-5：硫酸铵沉淀
收集通过阴离子交换色谱法纯化的含有A型肉毒杆菌毒素蛋白的级分，并向其中加入浓度为20-40％(w/v)的硫酸铵，以再次沉淀该A型肉毒杆菌毒素蛋白。沉淀出的A型肉毒杆菌毒素蛋白在50mM磷酸钠(pH6.5)中再次溶解。
2-6：二次离子交换色谱
硫酸铵沉淀过程完成后，为了除去A型肉毒杆菌毒素以外的微量杂质，采用离子交换树脂再次进行色谱。具体地，将阴离子交换树脂(Toyopearl SuperQ-650M,TosohBioscience,P/N 17228)填充到柱中，在此之后，将在实施例2-5中溶解的硫酸铵沉淀物注入柱中，用50mM磷酸钠洗脱缓冲液洗脱毒素。此时，A型肉毒杆菌毒素蛋白质未被吸附，而少量杂质通过吸附被除去。
高纯度肉毒杆菌毒素的纯化主要是在初级阴离子交换色谱步骤中实现，进行通过二次阴离子交换色谱的纯化步骤，以除去残留的杂质。为了高纯度肉毒杆菌毒素的纯化，维持硫酸铵沉淀物的pH为4.5-7.0和电导率为5-20mS/cm。
2-7：粗液制备
收集在实施例2-6中通过阴离子交换色谱纯化的含有A型肉毒杆菌毒素蛋白的馏分，灭菌并通过0.2μm过滤器过滤以制备粗液。制得的粗液在低于-70℃储存。将所生产的A型肉毒杆菌毒素蛋白命名为“DWP450”。
实施例3：纯化的肉毒杆菌毒素的纯度分析
通过SEC(尺寸排阻色谱)进行HPLC(e2695，Waters)。所用的流动相为100mM磷酸钠缓冲液(pH 6.5)，并将TSKgel G4000SWXL(Tosoh Bioscience,P/N 08542)柱连接到用于P/N08542的保护柱(Tosoh Bioscience,P/N 08543)，将20μg的A型肉毒杆菌毒素蛋白装入柱中并以1mL/min的速度流动30分钟。结果表明，经过初级阴离子交换色谱后的肉毒杆菌毒素的纯度为98.38％(图2)而经过二次阴离子交换色谱后的肉毒杆菌毒素的纯度为98.99％(图3)。
实施例4：纯化的肉毒杆菌毒素的安全性评价
为了确认在实施例2中纯化的A型肉毒杆菌毒素蛋白(DWP450)的安全性，进行了与(Allergan公司)的安全性的比较实验。
将SD(Sprague-Dawley)白色雄性大鼠分为以下5组，每组由10只雄性和10只雌性组成：一组施用30U/kg的测试材料(DWP450)；一组施用60U/kg的测试材料；一组施用30U/kg的比较材料(购自Allergan公司的)；一组施用60U/kg的比较材料；和对照组(盐水)。测试材料、比较材料和盐水各通过肌肉内一周施用总共五次，持续5周。
在施用60U/kg测试材料和60U/kg比较材料的组中，另外加入5只雌性和5只雄性，而在12周的恢复期进行比较毒性实验，以评估毒性的可逆性(表1)。
表1：纯化的肉毒杆菌毒素的安全性评价
结果表明，由本发明方法生产的肉毒杆菌毒素(DWP450)显示出对于雌性为60U/kg的NOAEL值，这表明它比显示出30U/kg的NOAEL值的(Allergan公司)安全多一倍。本发明的肉毒杆菌毒素的安全性多一倍被认为是因为本发明的肉毒杆菌毒素具有高纯度，因此具有在局部作用增加的能力，以使可能导致副作用的肉毒杆菌毒素的体循环减少。
实施例5：纯化的肉毒杆菌毒素的效果检查
为了检查实施例2中纯化的A型肉毒杆菌毒素蛋白(DWP450)的效果，测量复合肌肉动作电位(CMAP)的幅度和传导速度(tC)。
具体而言，将24只SD(Sprague-Dawley)白色大鼠随机分为四组，每组6只大鼠。使用两种不同的A型肉毒杆菌毒素蛋白，BTX-A-1(Allergan Inc.，加利福尼亚州，美国)和实施例2中纯化的BTX-A-2(DWP450)。两种制剂具有基本相同的特性，如下表2中所示，并且在所有过程中使用由0.9％生理盐水稀释的肉毒杆菌毒素。大鼠通过腹膜内注射10mg/kg盐酸氯胺酮来麻醉，然后向大鼠的胫骨前肌(TA)肌肉施用BTX-A-1和BTX-A-2。
表2：BTX-A-1和BTX-A-2之间的特性比较
BTX-A-1(Allergan) BTX-A-2
肉毒杆菌株 野生型 野生型
血清型 A型肉毒杆菌毒素 A型肉毒杆菌毒素
复合物分子量(kDa) 900 900
包装单位/小瓶) 100 100
赋形剂-稳定剂 人血清白蛋白 人血清白蛋白
赋形剂-等渗剂 氯化钠 氯化钠
形式 真空干燥 冻干
储存条件(℃) 2-8 2-8
保质期(月) 36 36(进行中)
pH 6.0±0.5 6.0±0.5
在组1中，将0.08ml氯化钠(NaCl)施用给一个TA肌肉，另一个TA肌肉不作处理。在组2中，将0.02ml BTX-A-1(两个单位)施用给一个TA肌肉和0.02ml BTX-A-2(两个单位)施用给另一个TA肌肉。在组3中，将0.04ml BTX-A-1(4单位)施用给一个TA肌肉，和0.04mlBTX-A-2(四个单位)施用给另一个TA肌肉。在组4中，将0.08ml BTX-A-1(8个单位)施用给一个TA肌肉，和0.08ml BTX-A-2(8个单位)施用给另一个肌肉。
采用CyberAmp380和Digidata1320(Axon Instruments.Inc,USA)测量CMAP和传导速度的延迟等级。使用鳄鱼夹将所用的电极接到皮肤。负电极连接到腘肌肉，正电极连接到耻骨后空间和股骨大粗隆。记录电极连接于胫骨前肌的肌肉腹，并且基准记录电极连接到左后跟骨腱和鞋底。
以2Hz的慢刺激速率和20Hz的快刺激速率施加1-5mA的电刺激。通过测量CMAP的峰-峰振幅(dY)确定对TA肌肉的麻痹作用，并且通过测量刺激点和负峰值点之间的时间间隔来确定传导速度的延迟。
在施用BTX-A-1和BTX-A-2之前和在施用后第3天、1周、2周、3周和4周执行电刺激分析，以及通过采用SAS(9.2版，SAS Institute Inc.,USA)的ANOVA来分析因施用BTX-A-1和BTX-A-2所造成的CMAP和传导速度。
结果观察到，以2Hz的慢刺激速度，施用BTX-A-1和BTX-A-2组在施用后第3天、1周、2周、3周和4周后显示出TA肌肉的麻痹作用(dY)(图4A)，并且以20Hz的快刺激速率，施用BTX-A-1和BTX-A-2组在施用后第3天、1周、2周、3周和4周后显示出对TA肌肉麻痹作用(dY)(图4B)。
在2Hz慢刺激速率和20Hz快刺激速率时，BTX-A-1和BTX-A-2之间没有显著差异(p<0.05)，并且在施用BTX-A-1和BTX-A-2的组中对TA肌肉的麻痹作用(dY)与肉毒杆菌毒素的施用剂量相关。
测量通过施用BTX-A-1和BTX-A-2引起的传导速度(tC)，结果表明，施用BTX-A-1和BTX-A-2的组在2Hz的慢刺激速率和20Hz的快刺激速率时并没有诱发传导速度的延迟。
具体地，发现通过本发明方法生产的肉毒杆菌毒素表现出类似于市售(Allergan公司)的效果。
工业应用性
使用本发明的生产肉毒杆菌毒素的方法能够通过简单的过程生产出高纯度的肉毒杆菌毒素，这表明本发明的方法是非常经济有效的。相比于通过常规方法生产的肉毒杆菌毒素，通过本发明方法生产的肉毒杆菌毒素具有高纯度，并因此具有在局部作用增加的能力。因此，会导致副作用的肉毒杆菌毒素的体循减少，安全性增加。因此，本发明的肉毒杆菌毒素可用于各种目的，包括治疗神经肌肉障碍，去除皱纹，和治疗痉挛性偏瘫和脑瘫。
尽管参照具体特征对本发明作了详细描述，对本领域技术人员显而易见的是该描述仅仅用于优选实施方式，而并不限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围将由所附权利要求书及其等同物来限定。

Claims (13)

1.一种生产肉毒杆菌毒素的方法，该方法包括以下步骤：
(a)用酸处理肉毒杆菌毒素生产株的培养物，以沉淀肉毒杆菌毒素；
(b)向沉淀的肉毒杆菌毒素中加入缓冲液，接着用蛋白酶抑制剂和核酸酶处理，从而提取肉毒杆菌毒素；
(c)用酸处理提取出的肉毒杆菌毒素以沉淀肉毒杆菌毒素并在缓冲液中溶解沉淀物；和
(d)通过阴离子交换色谱纯化肉毒杆菌毒素，
其中步骤(c)的酸沉淀是通过向提取出的肉毒杆菌毒素加入硫酸或盐酸，从而使提取出的肉毒杆菌毒素的pH值达到2.5-4.5来执行的。
2.根据权利要求1的方法，其中所述肉毒杆菌毒素生产株是肉毒梭菌。
3.根据权利要求1的方法，其中纯化的肉毒杆菌毒素是具有至少98％的纯度的A型肉毒毒素蛋白。
4.根据权利要求1的方法，其中步骤(a)的酸沉淀是通过向菌株的培养物中加入硫酸或盐酸，使培养物的pH值达到3.0-4.5来执行的。
5.根据权利要求1的方法，其中步骤(b)的蛋白酶抑制剂是苯甲脒HCl。
6.根据权利要求1的方法，其中步骤(b)的核酸酶是DNase和RNase。
7.根据权利要求1的方法，其中步骤(b)的肉毒杆菌毒素提取是在pH4.5-6.5进行的。
8.根据权利要求1的方法，其中步骤(c)的缓冲液是磷酸钠缓冲液。
9.根据权利要求1的方法，其中步骤(d)的阴离子交换色谱是在pH为3.5-7.5，和电导率为3-30mS/cm进行的。
10.根据权利要求1的方法，进一步在步骤(d)后包括步骤：
(e)用硫酸铵处理含有肉毒杆菌毒素的阴离子交换色谱级分，以形成沉淀物，并将沉淀物在缓冲液中溶解；和
(f)通过阴离子交换色谱纯化肉毒杆菌毒素。
11.根据权利要求10的方法，其中在步骤(e)中的硫酸铵是以10-50％的浓度(w/v)添加。
12.根据权利要求10的方法，其中在步骤(e)的缓冲液是磷酸钠缓冲液。
13.根据权利要求10的方法，其中在步骤(e)的阴离子交换色谱是在pH为3.5-7.5，和电导率为3-30mS/cm进行的。
CN201480012202.6A 2013-08-02 2014-05-07 生产肉毒杆菌毒素的方法 Active CN105392795B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020130092024A KR101339349B1 (ko) 2013-08-02 2013-08-02 보툴리눔 독소의 제조방법
KR10-2013-0092024 2013-08-02
PCT/KR2014/004003 WO2015016462A1 (en) 2013-08-02 2014-05-07 Method for production of botulinum toxin

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105392795A CN105392795A (zh) 2016-03-09
CN105392795B true CN105392795B (zh) 2019-11-22

Family

ID=49987856

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201480012202.6A Active CN105392795B (zh) 2013-08-02 2014-05-07 生产肉毒杆菌毒素的方法

Country Status (26)

Country Link
US (1) US9512418B2 (zh)
EP (1) EP2920199B1 (zh)
JP (2) JP6307150B2 (zh)
KR (1) KR101339349B1 (zh)
CN (1) CN105392795B (zh)
AR (1) AR096541A1 (zh)
AU (1) AU2014297167B2 (zh)
BR (1) BR112015029973B1 (zh)
CA (1) CA2912553C (zh)
CY (1) CY1120410T1 (zh)
DK (1) DK2920199T3 (zh)
ES (1) ES2665288T3 (zh)
HK (1) HK1215715A1 (zh)
HR (1) HRP20180679T1 (zh)
HU (1) HUE036840T2 (zh)
LT (1) LT2920199T (zh)
MX (1) MX362821B (zh)
NO (1) NO2920199T3 (zh)
PH (1) PH12015501855A1 (zh)
PL (1) PL2920199T3 (zh)
PT (1) PT2920199T (zh)
RU (1) RU2627159C2 (zh)
SA (1) SA515370208B1 (zh)
SG (1) SG11201509486VA (zh)
SI (1) SI2920199T1 (zh)
WO (1) WO2015016462A1 (zh)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101339349B1 (ko) * 2013-08-02 2013-12-09 주식회사 대웅 보툴리눔 독소의 제조방법
KR101723168B1 (ko) 2015-04-28 2017-04-05 주식회사 대웅 보툴리눔 독소의 제조를 위한 배지 조성물
KR101729251B1 (ko) 2015-04-28 2017-04-21 주식회사 대웅 보툴리눔 독소의 제조를 위한 배지 조성물
KR101723167B1 (ko) 2015-04-28 2017-04-05 주식회사 대웅 보툴리눔 독소의 제조를 위한 배지 조성물
KR101853463B1 (ko) * 2015-09-09 2018-06-20 휴젤(주) 보툴리눔 독소의 정제 방법
KR101775682B1 (ko) 2015-11-30 2017-09-06 주식회사 대웅 보툴리눔 독소의 제조방법
WO2017201105A1 (en) * 2016-05-16 2017-11-23 President And Fellows Of Harvard College Method for purification and activation of botulinum neurotoxin
KR102463881B1 (ko) * 2016-10-04 2022-11-07 (주)메디톡스 보툴리눔 독소 함유 용액으로부터 보툴리눔 독소를 분리하는 방법
KR101744900B1 (ko) 2017-01-20 2017-06-08 주식회사 대웅 보툴리눔 독소를 포함하는 안정한 액상 조성물
CN109646673A (zh) * 2017-10-12 2019-04-19 秀杰股份公司 肉毒杆菌毒素的微结构制剂技术
US11926853B2 (en) 2018-12-21 2024-03-12 The Research Foundation For Microbial Diseases Of Osaka University Botulinum toxin producing method
KR102516203B1 (ko) * 2019-04-15 2023-03-30 (주)제테마 보툴리눔 독소의 제조방법
KR102516204B1 (ko) * 2019-04-15 2023-03-30 (주)제테마 보툴리눔 독소의 정제방법
WO2023186016A1 (zh) * 2022-04-01 2023-10-05 重庆誉颜制药有限公司 一种肉毒毒素蛋白组合物、制备方法及其应用

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20030060150A (ko) * 2002-01-07 2003-07-16 (주)메디톡스 클로스트리디움 보툴리눔 ａ형 독소를 정제하는 방법
RU2206337C1 (ru) * 2002-10-29 2003-06-20 Общество с ограниченной ответственностью "Токсины и сопутствующие продукты" Лекарственный препарат для лечения мышечных дистоний и способ его получения
US7452697B2 (en) 2003-09-25 2008-11-18 Allergan, Inc. Chromatographic method and system for purifying a botulinum toxin
ES2479515T3 (es) * 2004-07-26 2014-07-24 Merz Pharma Gmbh & Co. Kgaa Composición terapéutica con una neurotoxina botulínica
JP4913074B2 (ja) 2005-03-03 2012-04-11 アラーガン、インコーポレイテッド 動物由来産物不含方法およびボツリヌス毒素を精製するための方法
KR101025617B1 (ko) * 2008-02-25 2011-03-30 메덱스젠 주식회사 클로스트리디움 보툴리눔으로부터 보툴리눔 독소를정제하는 방법
US8129139B2 (en) * 2009-07-13 2012-03-06 Allergan, Inc. Process for obtaining botulinum neurotoxin
US20120196349A1 (en) * 2009-10-21 2012-08-02 Revance Therapeutics, Inc. Methods and Systems for Purifying Non-Complexed Botulinum Neurotoxin
KR101434558B1 (ko) * 2011-07-21 2014-08-27 (주)메디톡스 식물 유래 성분 함유 배지 및 가요성 폐쇄 용기를 이용하여 클로스트리디움 보툴리눔 독소를 생산하는 방법
KR101339349B1 (ko) * 2013-08-02 2013-12-09 주식회사 대웅 보툴리눔 독소의 제조방법

Also Published As

Publication number Publication date
DK2920199T3 (en) 2018-05-28
CY1120410T1 (el) 2019-07-10
EP2920199B1 (en) 2018-03-07
JP2016521968A (ja) 2016-07-28
CA2912553C (en) 2018-01-02
NO2920199T3 (zh) 2018-08-04
KR101339349B1 (ko) 2013-12-09
JP2017141237A (ja) 2017-08-17
BR112015029973A2 (pt) 2017-07-25
AR096541A1 (es) 2016-01-13
RU2015151186A (ru) 2017-06-01
MX362821B (es) 2019-02-18
PL2920199T3 (pl) 2018-08-31
CA2912553A1 (en) 2015-02-05
SG11201509486VA (en) 2015-12-30
EP2920199A1 (en) 2015-09-23
AU2014297167A1 (en) 2015-12-10
WO2015016462A1 (en) 2015-02-05
LT2920199T (lt) 2018-04-10
PH12015501855B1 (en) 2015-12-07
PH12015501855A1 (en) 2015-12-07
SA515370208B1 (ar) 2017-07-08
AU2014297167B2 (en) 2016-11-17
PT2920199T (pt) 2018-05-30
CN105392795A (zh) 2016-03-09
HK1215715A1 (zh) 2016-09-09
EP2920199A4 (en) 2016-10-05
MX2015016481A (es) 2016-06-10
ES2665288T3 (es) 2018-04-25
HRP20180679T1 (hr) 2018-06-01
US9512418B2 (en) 2016-12-06
RU2627159C2 (ru) 2017-08-03
US20150337281A1 (en) 2015-11-26
BR112015029973B1 (pt) 2023-01-17
HUE036840T2 (hu) 2018-08-28
SI2920199T1 (en) 2018-06-29
JP6307150B2 (ja) 2018-04-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105392795B (zh) 生产肉毒杆菌毒素的方法
ES2643554T3 (es) Proceso y sistema para obtener neurotoxina botulínica
KR102485898B1 (ko) 보툴리눔 독소 함유 용액으로부터 보툴리눔 독소를 분리하는 방법
KR101025617B1 (ko) 클로스트리디움 보툴리눔으로부터 보툴리눔 독소를정제하는 방법
KR101853463B1 (ko) 보툴리눔 독소의 정제 방법
US11926853B2 (en) Botulinum toxin producing method
US20220267368A1 (en) Method for preparing botulinum toxin
CN107325158A (zh) 抗菌肽cnap‑ⅰ、抗菌肽cnap‑ⅱ及其制备方法和应用
US9782492B2 (en) Stabilization of therapeutic agents to facilitate administration
KR20050074806A (ko) 결정형 보툴리늄 독소의 제조방법
TWI839783B (zh) 提高純化收率的肉毒桿菌毒素複合物的純化方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1215715

Country of ref document: HK

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant