KR102516203B1

KR102516203B1 - 보툴리눔 독소의 제조방법

Info

Publication number: KR102516203B1
Application number: KR1020200044719A
Authority: KR
Inventors: 김재영; 남정선; 김승호; 최승관; 임현택; 최진희
Original assignee: (주)제테마
Priority date: 2019-04-15
Filing date: 2020-04-13
Publication date: 2023-03-30
Also published as: EP3957648A1; BR112021020533A2; MX2021012523A; TWI748411B; CN114245801A; TW202104246A; KR102447441B1; US20220204957A1; KR20200121246A; WO2020213929A1; EP3957648A4; KR20200121248A

Abstract

본 발명은 클로스트리디움 독소의 제조방법에 관한 것으로, 더 상세하게는 동물 유래 산물과 주요 알레르기 유발물질이 없는 상태에서 클로스트리디움 보툴리눔을 배양하고, 배양액으로부터 보툴리눔 독소를 정제하여 고순도의 보툴리눔 독소를 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

보툴리눔 독소의 제조방법{Method for preparing Botulinum Toxin}

본 발명은 클로스트리디움 독소의 제조방법에 관한 것으로, 더 상세하게는 동물 유래 산물과 주요 알레르기 유발물질이 없는 상태에서 클로스트리디움 보툴리눔을 배양하고, 배양액으로부터 보툴리눔 독소를 정제하여 고순도의 보툴리눔 독소를 생산하는 방법에 관한 것이다.

보툴리눔 독소는 클로스트리디움 부티리쿰(Clostridium butyricum), 클로스트리디움 바라티(Clostridium baratii) 및 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum)과 같은 박테리아에 의해서 생산되는 신경독소 단백질이다. 보툴리눔 독소는 신경근육 전달을 차단하고, 인간 및 동물에게 신경-마비성 질환을 일으킨다. 특히, 보툴리눔 독소 A형은 인간에게 매우 치명적인 것으로 알려져 있다. A형 이외에도 7가지 다른 B, C1, D, E, F, G 및 H형의 보툴리눔 독소가 규명되었다. 보툴리눔 독소 각각의 유형은 각 유형 특이적 항체에 의해 구별될 수 있으며, 이들이 유발하는 마비의 중증도 및 이들이 영향을 미치는 동물 종은 서로 상이하다.

보툴리눔 독소 단백질 분자의 분자량은, 약 50kDa 경쇄에 접합된 약 100 kDa의 중쇄로 구성되어, 약 150kDa이다. 그러나, 클로스트리디움 박테리아에 의해 방출되는 보툴리눔 독소는 150kDa 독소와 하나 또는 그 이상의 비-독소 단백질(nontoxin protein)이 복합체를 형성하여 방출된다. 예를 들어, 보툴리눔 독소 는 900kDa, 500kDa 및 300kDa 복합체로 방출된다.

보툴리눔 독소는 인간에게 매우 치명적일 수 있으나, 최근에는 골격근 활동항진을 특징으로 하는 신경근육 장애를 포함하여 다양한 증상을 치료하기 위한 목적으로 보툴리눔 독소가 개발되고 있다. 예를 들어 보톡스(BOTOX®)는 알러간사(Allergan, Inc.)로부터 상업적으로 개발한 보툴리눔 독소 A의 상표로, 이는 안검경련, 사시, 경부 근긴장이상 및 미간(안면) 주름 개선 치료에 활용되고 있고, 다른 혈청형들도 그에 적합한 용도를 개발하여 임상적으로 활용하고자 하는 연구가 계속되고 있다.

임상적 용도의 보툴리눔 독소는 일반적으로 세포 배양물에서 분리되는데, 종래에는 주로 동물 유래 산물을 사용하는 배양, 발효 및 정제 공정을 통하여 보툴리눔 독소를 분리하였다. 그러나 동물 유래 산물을 사용하여 보툴리눔 독소를 생산하는 경우, 이를 환자에게 투여시 환자가 동물 유래의 다양한 병원체 또는 감염성 물질을 함께 투여받게 될 우려가 있다. 예를 들어, 프리온(prion)이 생산된 보툴리눔 독소 조성물에 함께 포함될 수 있는데, 프리온은 박테리아나 바이러스·곰팡이·기생충 등과는 전혀 다른 종류의 질병 감염인자로, 사람을 포함해 동물에 감염되면 뇌에 스펀지처럼 구멍이 뚫려 신경세포가 죽음으로써 해당되는 뇌기능을 잃게 된다. 프리온은 정상적인 단백질을 만드는 동일한 핵산 서열로부터 비정상적인 구조 이형체(abnormal coformational isoform)를 발생시킬 수 있으며, 번역후 단계에서 정상적인 이형체가 프리온 단백질 이형체로 되는 "리크루트먼트 반응(recruitment reaction)"시 감염성이 존재한다. 정상적인 내재성 세포 단백질이 병원체성 프리온 구조로 잘못 폴딩되는 것(misfold)을 유도한다. 크로이츠펠트-야콥병은 사람 전염성 해면양 뇌증(transmissable spongiform encephalopathies)의 드문 신경퇴행성 질환으로, 전염성 물질은 프리온 단백질의 비정상적인 이형체이다. 크로이츠펠트-야콥병이 있는 개체는 건강한 상태에서 6개월 이내에 무동성무언증(akinetic mutism)으로 악화될 수 있다. 그러므로 동물 유래 산물을 사용하여 얻어지는 보툴리눔 독소와 같은 생물제제를 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 경우, 크로이츠펠트-야콥병과 같은, 프리온 매개 질환을 얻게 될 위험성이 존재한다.

상기와 같은 위험성을 제거하고자, 보툴리눔 독소를 생산하는 공정에서, 예를 들면 배양용 배지에서 동물 유래 성분을 배제하고자 하는 시도가 있었다. 대표적으로 Allergan 사는 동물 유래 성분을 대체하기 위하여 식물로부터 유래한 단백질로서 대두를 포함하는 배지에서 발효를 진행하는 방법을 고안하였으나(대한민국 공개특허 10-2006-0102330), 충분한 양의 보툴리눔 독소를 생산하기 위하여 균주를 오랜 시간 배양하여야 하는 문제점이 있었다.

한편, 클로스트리듐 보툴리듐 독소를 세포 배양물에서 분리하는데는 다양한 정제 방법이 사용되고 있다.

일 예로 보툴리눔 독소는 일련의 침전 및 접선 유동 여과 단계에 의해서 복합체화된 형태(complexed form)로 정제된다. [참조: 예를 들어, Schantz E J, et al, Properties and use of botulinum toxin and other microbial neurotoxins in medicine, Microbiol Rev 1992 March 56(l):80-99] 그러나, 이러한 방법은 전형적으로는 약 10% 미만의 상대적으로 낮은 수율을 제공하였다. 그 밖의 다른 방법들은 크기 배제, 이온 교환, 및/또는 친화성 크로마토그래피를 사용하였다 [참조: 예를 들어, Schmidt J J, et al, Anal Biochem 1986 July; 156(1):213-219; Kannan K, et al,, Mov Disord 2000; 15(Suppl 2):20 (2000); Wang YC, Dermatol Las Faci Cosm Surg 2002; 58 (2002); 및 미국 특허 제2003/0008367호].

또 다른 방법은 완전하고 생물학적으로 활성인 보툴리눔 독소 단백질보다는 보툴리눔 독소의 중쇄 또는 경쇄 중의 하나를 재조합 수단에 의해서 개별적으로 합성하는 방법이 있다 [참조: 예를 들어, Zhou L, et al, Biochemistry 1995; 34(46):15175-81 (1995); 및 Johnson S K, et al, Protein Expr and Purif 2003; 32: 1-9 (2003)]. 그러나, 이러한 방법들은 완전하고 생물학적으로 활성인 보툴리눔 독소 단백질을 재형성시키기 위한 추가 단계를 필요로 하는 단점이 있다.

보다 최근의 방법으로는, 복합체로서 보툴리눔 독소를 정제하기 위한 소수성 상호작용 크로마토그래피, 혼합 모드, 및/또는 이온 교환 크로마토그래피의 사용을 포함한다[참조: 예를 들어, 미국특허 제7,452,697호 및 제7,354,740호].

이에 본 발명자들은 종래 동물 유래 성분의 배지를 대체하고 가능한 알레르기 원인물질을 배제하면서 보툴리눔 독소 생산 균주를 효과적으로 배양할 수 있는 배지를 사용하고, 간소화된 방법으로 순도 높은 보툴리눔 독소를 정제하여, 보툴리눔 독소를 생산하는 방법을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과,

포테이토 펩톤, 효모 추출물 및 글루코스를 포함하는 배지 조성물에서 클로스트리디움 보툴리눔을 배양하여 보툴리눔 독소를 생성시키고, 생성된 보툴리눔 독소를 양이온 교환수지로 SP 컬럼을 사용하고, 소수성 레진으로 Phenyl 컬럼을 사용하며, 음이온 교환수지로 Q 컬럼을 사용하여 정제하였을 때, 99% 이상의 순도를 가지는 보툴리눔 독소를 정제할 수 있는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 종래 동물 유래 성분의 배지를 대체하고 가능한 알레르기 원인물질을 배제하면서 보툴리눔 독소 생산 균주를 효과적으로 배양할 수 있는 배지를 사용하고, 간소화된 방법으로 순도 및 활성이 우수한 보툴리눔 독소를 정제하여, 보툴리눔 독소를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 보툴리눔 독소의 제조방법을 제공한다.

(a) 포테이토 펩톤(potato peptone), 효모 추출물(yeast extract) 및 글루코스(glucose)를 포함하는 클로스트리디움 보툴리눔 배양용 배지 조성물에서 클로스트리디움 보툴리눔을 배양하여 보툴리눔 독소를 생성시키는 단계;

(b) 보툴리눔 독소를 포함하는 배양액을 전처리하는 단계;

(c) 전처리된 보툴리눔 독소를 양이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 정제하는 단계;

(d) 소수성 크로마토그래피를 이용하여 정제하는 단계; 및

(e) 음이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 보툴리눔 독소를 정제하는 단계.

본 발명에 따르면, 동물 유래 성분과 주요 알레르기 유발물질을 배제하여 보툴리눔 독소를 생산함으로써, 단시간 내에 보툴리눔 독소 생산 균주가 최대 성장량에 도달할 수 있도록 유도하여, 보툴리눔 독소 생산 공정에서의 생산 시간을 단축시키고 생산 단가를 절감할 수 있는 효과가 있으며, 정제과정에 있어서, 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피 및 음이온 교환 크로마토그래피의 단순 공정으로도 보툴리눔 독소의 정제 후 순도를 개선하고 그 활성 또한 우수하게 유지시킬 수 있어, 보툴리눔 독소 생산에 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 구성요소에 대하여 8가지 농도범위로 요인실험을 진행하고, 그 결과에 기초하여 정규분포 분석을 진행한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 구성요소에 대하여 8가지 농도범위로 요인실험을 진행하고, 그 결과에 기초하여 pareto 분석을 진행한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 구성요소에 대하여 요인실험, 중심점 실험, 축점 실험결과를 바탕으로 모델 적합성 분석을 진행한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 구성요소에 대하여 요인실험, 중심점 실험, 축점 실험결과를 바탕으로 표면분석법을 진행한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명에 따른 구성요소에 대한 표면분석법 결과를 바탕으로 최적화 비율을 설정한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명에 따른 최적화 비율에서 글루코스 농도를 변인으로 하여 독소량과 균주 성장에 따른 흡광도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 최적화된 배지 조성물에서 클로스트리디움 보툴리눔을 배양하며 시간에 따른 독소량과 균주 성장에 따른 흡광도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일실시예에 따른 양이온 교환 크로마토그래피 후 용리액에서 보툴리눔 독소를 FPLC 및 SDS-PAGE로 분석한 결과이다.
도 9는 본 발명의 일실시예에 따른 소수성 크로마토그래피 후 용리액에서 보툴리눔 독소를 FPLC 및 SDS-PAGE로 분석한 결과이다.
도 10은 본 발명의 일실시예에 따른 음이온 교환 크로마토그래피 후 용리액에서 보툴리눔 독소를 FPLC 및 SDS-PAGE로 분석한 결과이다.
도 11는 본 발명에 따른 보툴리눔 독소와 상업적으로 구입한 보툴리눔 독소의 정제 효과를 SDS-PAGE로 분석한 결과이다.
도 12는 한국 출원번호 10-2013-0092024의 정제방법으로 정제된 보툴리눔 독소의 순도를 확인한 결과이다.
도 13은 미국 출원번호 11/932789의 정제방법으로 정제된 보툴리눔 독소의 순도를 확인한 결과이다.
도 14는 본 발명에 따라 정제한 보툴리눔 독소의 순도를 확인한 결과이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명에서는 클로스트리디움 보툴리눔 균주를 동물 유래 성분 및 알레르기 유발 물질이 배제된 배양배지로써 포테이토 펩톤(potato peptone), 효모 추출물(yeast extract) 및 글루코스(glucose)를 포함하는 배지에서 배양하였을 때, 상기 균주가 매우 짧은 시간 내에 최대 성장량에 도달하여, 배양 속도가 현저히 향상되는 것을 확인하였다.

본 발명에서는 보툴리눔 독소 배양액을 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피 및 음이온 교환 크로마토그래피의 순서로 정제하는 경우, 기존의 방법으로 생산된 보툴리눔 독소에 비해 순도가 높고 활성이 우수한 900kDa의 균일한 형태의 보툴리눔 독소가 분리 및 정제되는 것을 확인하였으며, 특히, 양이온 교환수지로 SP 컬럼을 사용하고, 소수성 교환수지로 Phenyl 컬럼을 사용하며, 음이온 교환수지로 Q 컬럼을 사용하였을 때, 99% 이상의 순도를 가지는 보툴리눔 독소를 정제할 수 있는 것을 확인하였다.

따라서 본 발명은 다음 단계를 포함하는 보툴리눔 독소의 제조방법에 관한 것이다:

(b) 보툴리눔 독소를 포함하는 배양액을 전처리하는 단계;

(d) 소수성 크로마토그래피를 이용하여 정제하는 단계; 및

본 발명에서 사용되는 보툴리눔 독소 생산 균주는 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum) 또는 이의 변이체로써, 가장 바람직하게는 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum)type A, NCTC13319일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 보툴리눔 독소 생산이 가능한 어떠한 균주라도 사용 가능함은 통상의 기술자에게는 자명할 것이다.

본 발명에 있어서, 포테이토 펩톤은 2~5%(w/v), 효모 추출물은 0.5~2%(w/v), 글루코스는 0.75~1.5%(w/v)로 상기 배지 조성물에 포함되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 가장 바람직하게는 포테이토 펩톤은 3%(w/v), 효모 추출물은 1%(w/v), 글루코스는 1%(w/v)로 상기 배지 조성물에 포함되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

한편, 본 발명에서는 상기 배지 조성물을 사용하여 클로스트리디움 보툴리눔 균주를 배양하는 경우 배양 속도가 향상됨에 따라 보툴리눔 독소를 생산하는 과정에서 회수 시기를 현저히 단축할 수 있음을 확인하였다. 즉, 대두 펩톤을 사용한 클로스트리디움 보툴리눔의 배양에 있어서, 클로스트리디움 보툴리눔이 24시간 이후 최대 성장량을 보이는 반면, 본 발명에서는 약 14~18시간 사이에 최대 성장량을 보이고 있으며, 독소 회수 시점도 기존 클로스트리디움 보툴리눔 배양에서는 적어도 48시간 배양 이후에 최대 독소 생산량에 도달한 반면, 본 발명에서는 48시간 이내, 약 37시간에서 최대 독소 생산량에 도달하였다(도 7참조). 상기와 같은 효과는 특히 펩톤으로 포테이토 펩톤을 사용하는 경우 발휘되는 효과로 판단된다.

본 발명에 있어서, 상기 배양용 배지 조성물은 동물유래 산물 및 알레르기 원인이 배제된 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 포테이토 펩톤은 2~5%(w/v), 효모 추출물은 0.5~2%(w/v), 글루코스는 0.75~1.5%(w/v)로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기와 같은 구성성분의 조성비는 본 발명의 구성성분의 최적 조성비인 포테이토 펩톤 3%(w/v), 효모 추출물 1%(w/v), 글루코스 1%(w/v)를 함유하는 배지 조성물에서의 독소 생성량을 100%로 가정하였을 때, 상기 독소 생성량의 90%를 생성할 수 있는 구성성분의 조성비를 minitab 프로그램의 최적화 농도 설정 프로그램을 기반으로 한 표면분석법으로 도출한 결과이다. 즉, 포테이토 펩톤은 2~5%(w/v), 효모 추출물은 0.5~2%(w/v), 글루코스는 0.75~1.5%(w/v)로 배지 조성물에 포함되는 경우, 포테이토 펩톤 3%(w/v), 효모 추출물 1%(w/v), 글루코스 1%(w/v)를 함유하는 배지 조성물에서 생성하는 독소 생성량의 90%의 독소 생성량을 달성할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 포테이토 펩톤은 3%(w/v), 효모 추출물은 1%(w/v), 글루코스는 1%(w/v)로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계는 클로스트리디움 보툴리눔을 배양 시작 후 48시간 이내에 회수하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 상기 (b) 단계는 클로스트리디움 보툴리눔을 배양 시작 후 40시간 이내에 회수하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 양이온 교환 크로마토그래피는 SP 컬럼인 것이 바람직하고, 상기 소수성 레진은 phenyl 컬럼인 것이 바람직하며, 상기 음이온 교환 수지는 Q 컬럼인 것이 바람직하다.

본 발명에서, 상기 SP 컬럼은 설포프로필 기능기를 포함하는 물질이 충진되어 있는 컬럼을 의미하고, 상기 phenyl 컬럼은 phenyl 기능기를 포함하는 물질이 충진되어 있는 컬럼을 의미하며, 상기 Q 컬럼은 4차 암모니움(Q) 기능기를 포함하는 물질이 충진되어 있는 컬럼을 의미한다.

본 발명의 (b) 단계에서 보툴리눔 독소를 포함하는 배양액은 당업계에 공지된 통상의 방법을 사용하여 수득된 클로스트리디움 보툴리눔 균주의 배양액을 사용할 수 있으며, 배양을 위해 사용될 수 있는 통상적인 배지를 이용하여 배양이 가능하나, 특히 동물 유래 성분이 배제된 배지를 이용하여 배양하는 것이 바람직하며, 예를 들어, PYG 배지(Potato peptone 3%, Yeast extract 1%, Glucose 1%)를 이용하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 사용되는 보툴리눔 독소 생산 균주는 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum) 또는 이의 변이체이고 가장 바람직하게는 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum) type A, NCTC13319 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 보툴리눔 독소 생산이 가능한 어떠한 균주라도 사용가능함은 통상의 기술자에게는 자명할 것이다.

본 발명의 (b) 단계에서의 배양액을 전처리하는 단계는 구체적 실시 양태로서 제균(예를 들어, 심층여과 및/또는 제균여과 등에 의해)된 배양액을 산 침전 또는 한외여과하는 단계일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

산 침전은 황산 침전 또는 염산 침전인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 즉, 본 발명의 (b) 단계에서 산 침전은 배양을 종료한 뒤 pH가 3.0 내지 4.5, 바람직하게는 pH가 3.3 내지 4.0, 가장 바람직하게는 pH가 3.4 내지 3.6이 되도록 산, 일 양태로서 황산 또는 또 다른 양태로서 염산을 첨가하여 보툴리눔 독소를 포함하는 배양액을 산 침전시키는 것일 수 있다.

한외여과 막으로는 카세트 타입(cassette type) 또는 중공막(hallow fiber)을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 즉, 본 발명의 (b) 단계에서 한외여과는 막크기가 50kDa 내지 500kDa, 바람직하게는 100kDa 내지 300kDa의 막크기로 한외여과하여 보툴리눔 독소를 포함하는 배양액을 회수하는 것일 수 있다.

또한, 선택적으로 전처리 단계에서 핵산을 제거하기 위해 DNase, RNase, nuclease 및/또는 benzonase를 사용할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명은 보툴리눔 독소의 정제 순도를 높이기 위하여, 추가의 정화 단계를 포함할 수 있다. 본 발명에서의 정화 단계는 산 침전물에서 불순물을 추가로 제거하는 공정으로, 종래의 공지된 미세여과, 한외여과, 정밀여과, 심층여과 등의 공정으로 진행될 수 있다. 본 발명의 일 양태로서, 미세여과는 0.1~0.4㎛의 hollow fiber를 이용하여 수행될 수 있다.

본 발명의 (c) 단계에서 양이온 교환 크로마토그래피는 전처리된 보툴리눔 독소를 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 결합시키는데 적정한 농도와 pH의 완충액에 용해시켜 상기 컬럼에 결합시키고, 이후 염 농도가 강화된 완충액을 이용하여 용리시키는 단계로, 양이온 교환 크로마토그래피 단계에서 비-복합체 형태(non-complex from)의 보툴리눔 독소가 제거된다.

본 발명에 따른 보툴리눔 독소 정제방법에 있어서, 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 사용되는 컬럼은 카복시메틸(CM), 설포에틸(SE), 설포프로필(SP), 포스페이트(P) 및 설포네이트(S)로 구성된 군에서 선택되는 기능기를 갖는 레진이 장착된 컬럼일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 불순물 제거 및 보툴리눔 독소의 높은 활성 유지의 관점에서 상기 양이온 교환 크로마토그래피는 SP 컬럼을 이용하여 수행하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 SP sepharose HP 컬럼, SP sepharose FF 컬럼, Capto S 등을 이용하여 수행할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 SP sepharose HP 컬럼을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명에서, SP sepharose HP 컬럼은 설포프로필 기능기를 포함하고, 6% spherical, cross-linked agarose Matrix 형태이며, DBC는 ribonuclease A 기준으로 55 mg/mL, Particle size 는 34 μm인 레진이 장착된 컬럼이다.

상기 (c) 단계에서 보툴리눔 독소는 pH 4.5~5.3의 10~30mM 구연산 나트륨 완충액에 용해시켜 SP 컬럼에 주입되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

상기 (c) 단계에서 보툴리눔 독소는 0.5~1.5M 염화나트륨이 첨가된 pH 4.5~5.5의 10~30mM 구연산 나트륨 완충액으로 용리되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명의 (d) 단계에서 소수성 크로마토그래피는 (c) 단계에서 양이온 교환 크로마토그래피에서 용리된 보툴리눔 독소를 포함하는 용액을 소수성 크로마토그래피 컬럼에 결합시키는데 적절한 농도의 염을 포함하는 일정 pH의 완충액에 용해시켜 상기 컬럼에 결합시키고, 이후 염 농도가 약화된 완충액을 이용하여 용리시키는 단계로, 소수성 크로마토그래피 단계에서 비-복합체 형태(non-complex from)의 보툴리눔 독소가 추가로 제거된다.

본 발명에 따른 보툴리눔 독소 정제방법에 있어서, 소수성 크로마토그래피에 사용되는 컬럼은 에테르(ether), 이소프로필(isopropyl), 부틸(butyl), 옥틸(octyl) 및 페닐(phenyl)로 구성된 군에서 선택되는 작용기를 갖는 레진이 장착된 컬럼일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 비-복합체 형태의 단백질을 효과적으로 분리하기 위하여, 상기 소수성 크로마토그래피는 Phenyl 컬럼을 이용하여 수행하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 Phenyl sepharose HP 컬럼, Phenyl sepharose FF (Fast Flow) 컬럼, Capto Phenyl 컬럼 등을 사용할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 Phenyl sepharose HP 컬럼을 이용하여 수행되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명에서 사용되는 Phenyl sepharose HP 컬럼은 Highly cross-linked agarose 6% Matrix를 갖고, 25 umol phenyl groups/mL의 치환도 (Degree of substitution)를 나타내며, 34 um의 Bead size를 갖는 레진이 장착된 컬럼이다.

상기 (d) 단계에서 보툴리눔 독소는 1.8~2.2M 염화나트륨이 첨가된 pH 5.7~6.7의 30~70mM 인산나트륨 완충액으로 용해시켜 Phenyl 컬럼에 주입되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

상기 (d) 단계에서 보툴리눔 독소는 pH 5.7~6.7의 30~70mM 인산나트륨 완충액으로 용리되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명의 (e) 단계에서 음이온 교환 크로마토그래피는 소수성 크로마토그래피로 용리된 보툴리눔 독소를 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 결합시키는데 적정한 농도와 pH의 완충액에 용해시켜 상기 컬럼에 결합시키고, 이후 염 농도가 강화된 완충액을 이용하여 용리시키는 단계로, 음이온 교환 크로마토그래피 단계에서 기타 불순물을 제거하고 900kDa의 보툴리눔 독소의 순도를 증가시키게 된다.

본 발명에 따른 보툴리눔 독소 정제방법에 있어서, 음이온 교환 크로마토그래피에 사용되는 컬럼은 디에틸아미노에틸(DEAE), 4차 아미노에틸(QAE) 및 4차 암모니움(Q)로 구성된 군에서 선택되는 기능기를 갖는 레진이 장착된 컬럼일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 기타 불순물을 제거하고 특히 900kDa의 보툴리눔 독소의 순도를 증가시키기 위하여 상기 음이온 교환 크로마토그래피는 Q 컬럼을 이용하여 수행하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 Capto Q ImpRes 컬럼, Toyopearl Super Q 650M 컬럼, Q sepharose FF 컬럼, Q Sepharose High Performance (Q Sepharose HP) 등을 사용할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 Capto Q ImpRes 컬럼 을 이용하여 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서 사용된 상기 CaptoQ ImpRes 컬럼은 4차 암모니움(Q) 기능기를 포함하는 High-flow agarose Matrix를 가지고, total ionic capacity는 0.15~0.18 mmol(Cl-)/mL Media이며, DBC는 BSA 기준으로 55 mg/mL이고, Bead size는 40 um인 레진이 장착된 컬럼이다.

상기 (e) 단계에서 상기 보툴리눔 독소는 pH 5.7~6.7의 40~60mM 인산나트륨 완충액에 용해시켜 Q 컬럼에 주입되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

상기 (e) 단계에서 보툴리눔 독소는 0.8~1.2M 염화나트륨이 첨가된 pH 5.7~6.7의 40~60mM 인산나트륨 완충액으로 용리되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

상기 방법으로 정제된 보툴리눔 독소는 순도 99% 이상의 보툴리눔 독소 A형인 것을 특징으로 할 수 있으며, 이와 같이 정제된 보툴리눔 독소는 기존 방법으로 정제된 보툴리눔 독소에 비해 높은 순도를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서 "동물 유래 성분이 없는"은 "실질적으로 동물 유래 성분이 없는" 또는 "실질적으로 동물 단백질이 없는"의 의미로, 혈액 유래, 혈액 풀드(blood pooled) 및 다른 동물 유래 산물들 또는 화합물들이 없거나 실질적으로 없다는 것을 의미한다. "동물"은 포유류(사람과 같은), 조류, 파충류, 어류, 곤충, 거미 또는 다른 동물종들을 의미한다. "동물"은 박테리아와 같은 미생물은 포함하지 않는다. 따라서, 본 발명의 범주에 드는 동물 산물이 없는 배지 또는 방법 또는 실질적으로 동물 산물이 없는 배지 또는 방법은 보툴리눔 독소 또는 클로스트리디움계 보툴리눔 박테리아를 포함할 수 있다. 예를 들어, 동물 산물이 없는 방법 또는 실질적으로 동물 산물이 없는 방법은, 면역글로불린, 고기 소화물, 고기 부산물 및 젖 또는 낙농 산물 또는 소화물과 같은 동물 유래 단백질이 실질적으로 없거나 본질적으로 없거나 완전히 없는 방법을 의미한다. 따라서, 동물 산물이 없는 방법의 예로는 고기 및 낙농 산물 또는 고기 또는 낙농 부산물을 배제한 방법(박테리아 배양 또는 박테리아 발효 방법과 같은)이 있다.

"보툴리눔 독소"는 클로스트리디움 보툴리눔에 의해서 생성된 신경독 뿐아니라, 비-클로스트리디움계 종에 의해서 재조합적으로 제조된 보툴리눔 독소(또는 이의 경쇄 또는 중쇄)를 의미한다. 본 명세서에서 사용된 것과 같이, "보툴리눔 독소"라는 용어는 보툴리눔 독소 세로타입 A, B, C, D, E, F, G 및 H (Weller C (15 October 2013). "New Botulinum Toxin Deemed Deadliest Substance Ever: Sniffing 13-Billionths of a Gram Can Kill". Medical Daily.)를 포함한다. 본 명세서에서 사용된 것과 같이, 보툴리눔 독소는 또한 보툴리눔 독소 복합체(즉, 300, 600 및 900kDa 복합체) 뿐아니라 순수한 보툴리눔 독소(즉, 약 150kDa)를 모두 포함한다. "순수한 보툴리눔 독소"는 보툴리눔 독소 복합체를 형성하는 단백질들을 포함하는, 다른 단백질들로부터 분리된, 또는 실질적으로 분리된 보툴리눔 독소로서 정의된다. 순수한 보툴리눔 독소는 순도가 95% 이상일 수 있으며, 바람직하게는 99% 이상이다.

본 발명은 적어도 감소된 수준의 동물 또는 낙농 부산물을 포함하는, 바람직하게는 동물 또는 낙농 부산물이 실질적으로 없는 배지를 제공한다. "동물 또는 낙농 부산물"은 in vivo 또는 in vitro 에서, 동물(박테리아 제외) 세포 중의 또는 그에 의해서 제조된 화합물 또는 화합물들의 조합을 의미한다. 단백질, 아미노산, 및 질소와 같은 배지 성분의 바람직한 비-동물 소스(source)로는 식물, 미생물(효모와 같은) 및 합성 화합물을 포함한다.

본 발명에 따른 배지는 클로스트리디움 보툴리눔의 소량 또는 대량 발효를 위한 배지, 시드(1차) 배지 및 발효(2차) 배지를 접종하는 데 사용되는 클로스트리디움 보툴리눔의 성장 및 배양을 위한 배지뿐 아니라 클로스트리디움 보툴리눔 배양물의 장기간 저장을 위해 사용되는 배지(예를 들어, 스톡 배양물)를 포함하나 이에 한정되지는 않는다.

본 발명의 특정한 바람직한 실시 양태로서, 클로스트리디움 보툴리눔의 성장 및 보툴리눔 독소의 생성을 위한 배지는 동물 유래 성분을 대체하는 포테이토 유래 성분, 바람직하게는 포테이토 펩톤을 포함할 수 있다.

본 발명은 동물 유래 성분이 실질적으로 없는 배지를 사용하여, 최단 시간 내에 보툴리눔 독소의 생성을 최대화하는 클로스트리디움 보툴리눔의 성장을 위한 방법을 제공한다. 동물 유래 성분을 포테이토 펩톤으로 대체한 배지 조성물을 이용하여 클로스트리디움 보툴리눔을 성장시킬 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시형태에서, 클로스트리디움 성장은 2단계(시드 성장 및 발효)로 진행된다. 이 두 단계 모두 혐기성 환경에서 진행되는 것이 바람직하다. 시드 성장 단계는 일반적으로 저장된 배양물로부터 미생물의 양을 "스케일-업(scale-up)"하는 데 사용된다. 시드 성장 단계의 목적은 발효에 사용할 수 있는 미생물의 양을 증가시키는 것이다. 또한, 시드 성장 단계는 저장된 배양물 내의 상대적으로 휴지상태인 미생물이 원기를 회복하여 활발히 성장하는 배양물로 성장하도록 해준다. 또한, 발효 배지를 접종하는 데 사용되는 생육 가능한 미생물의 부피 및 양은, 저장된 배양물에서 보다 활발히 성장하는 배양물에서 더욱 정밀하게 제어될 수 있다. 따라서, 발효 배지에 접종하기 위한 시드 배양물의 성장이 바람직하다. 또한, 발효 배지에 접종하기 위한 클로스트리디움 보툴리눔 양을 스케일-업 하는 시드 배지에서의 성장을 포함하는 연속되는 몇 번의 단계들을 사용할 수 있다. 발효 단계에서의 클로스트리디움 보툴리눔의 성장은 저장된 배지로부터 직접 접종에 의해 실시될 수도 있다.

발효 단계에서, 시드 성장물로부터 클로스트리디움 보툴리눔을 포함하는 시드 배지의 일부분 또는 시드 배지 전체를 발효 배지에 접종하는 데 사용할 수 있다. 바람직하게, 시드 성장 단계로부터 클로스트리디움 보툴리눔을 가지는 시드 배지의 약 1-10%를 발효 배지를 접종하는 데 사용한다. 발효는 큰 스케일의 혐기성 환경에서 최대량의 미생물을 생성시키는 데 사용된다.

상기 방법에 의해 배양된 균주의 배양액에 포함된 보툴리눔 독소는 단백질 정제 기술분야의 당업자에게 공지된 단백질 정제 방법을 사용하여 분리 및 정제할 수 있다.

클로스트리디움 보툴리눔의 성장은 하나 이상의 단계로 진행될 수 있다. 바람직하게, 성장은 두 단계로 진행된다. 첫번째 단계인 시드 성장에서, 클로스트리디움 보툴리눔을 본 발명에 따른 배지 조성물 중에 현탁하고, 혐기성 환경 하에 34±1℃에서 10-24시간 동안 배양한다. 바람직하게, 시드 성장은 약 14시간 동안 진행된다. 어떤 단계에서든 시드 배지에서의 성장은, 시드 배지에서의 최종 성장물로 발효 배지를 접종하기 전에, 세포 용해를 야기하지 않는 것이 또한 바람직하다.

이후, 클로스트리디움 보툴리눔을 더욱 성장시키며 보툴리눔 독소를 회수하기 위하여 시드 성장한 배지의 일부분 또는 전체를 사용하여 본 발명의 배지 조성물에 접종하여 두번째 단계인 발효를 진행한다. 접종 후에, 역시 혐기성 환경 하에 34±1℃에서 약 4일 동안 배양하며, 배지의 광학 밀도(OD)를 측정하여 성장을 모니터링한다. 바람직하게, 본 발명에 따른 배지 조성물을 이용한 발효 단계에서는 약 14~18시간 사이에 최대 성장량을 보인 후 세포가 용해되며 OD 값이 감소하는데, 이로써 발효 단계에서의 클로스트리디움 보툴리눔을 배양 시작 후 48시간 이내에, 더욱 바람직하게 40시간 이내, 보툴리눔 독소를 회수하게 된다.

본 발명의 바람직한 실시 양태로서, 클로스트리디움 보툴리눔의 장기간 보관 및 시드 배지의 접종을 위해 사용되는 클로스트리디움 보툴리눔의 배양물은 4℃에서 저장되기 전에, 보툴리눔 독소의 생성 전체에 걸쳐 동물 부산물이 실질적으로 없는 배지를 유지하기 위해서, 클로스트리디움 보툴리눔은 저장용 배지(포테이토 펩톤 3%, 효모추출물 1%, 글루코스 1%, 글리세롤 25%) 에 저장하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 사용되는 용어 "분획(fraction)"은 하나 이상의 불순물과 함께 생물약학적 제제에 함유되는 적어도 하나의 표적 분자(예컨대 보툴리눔 독소)가 하나 이상의 불순물과 결합하는 물질을 통하여 통과하며, 상기 표적 분자는 보통 결합하지 않는(즉, 플로우 쓰루 하는) 또는 결합 후 용리되는 분리 방법에서, 표적 분자를 포함하여 통과된 물질이 각각 분리되어 수집되어 있는 그룹을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "정제"는 어떤 물질로부터 혼재해 있는 불순물을 제거하여 순도를 높이는 조작을 의미하며, 본 명세서에 있어서 정제는 보툴리눔균의 배양액으로부터 보툴리눔균이 과성장한 후 사멸되면서 생산한 보툴리눔 독소를 분리해내는 것이며, 보툴리눔 독소 생산 과정 중의 순도를 향상시키기 위한 방법으로 사용되는 공정을 의미한다.

실시예

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 배양 시료 준비 및 균 배양

1-1. 시료준비

본 발명에서 사용한 보툴리눔 균주는 Clostridium botulinum type A, NCTC13319이고, 실험군 및 대조군의 배지 제조를 위해 사용된 시료는 다음과 같다: Phytone peptone (BD, 211906), Tryptone (BD, 211705), Yeast extract (BD, 212750), Potato peptone E210 (Organotechnie, 19425), Pea peptone A482 (Organotechnie, AI275), Plant peptone E1 (Organotechnie, 19025), Select phytone UF (BD, 210931), Peptone from soybean (Sigma, 70178), Hy-Soy (Kerry, 5X59022), Hy-peptone (Kerry, 5X01111), Soy peptone A2SC (Organotechnie, 19649), Soy peptone A3SC (Organotechnie, 19685), Soy peptone E110 (Organotechnie, 19885), Soy peptone K200 (Organotechnie, 19749), Glucose (Sigma, G5767), Sodium thioglycolate (Sigma, T0632), 정제수 (Ultrapure water 또는 동등 이상의 품질을 가진 물).

1-2. 균 배양

초저온냉동고에 보관되어 있는 클로스트리디움 보툴리눔 균주 1바이알을 37℃ 배양기에서 30분 동안 녹였다. BSC에서 클로스트리디움 보툴리눔 균주를 3~5회 균질화하고, 균질화된 클로스트리디움 보툴리눔 균주 0.1 mL을 배지에 접종한 후 혐기성 배양기에서 34±1℃로 배양하였다. 배양 종료 후 분광광도계를 이용해서 OD600 값을 측정하였다.

1-3. 독소량 측정

독소량 측정 방법은 Botulinum Neurotoxin Type A DuoSet ELISA(R&D system)의 시험법을 제조자 방식에 따라 사용하였다. PBS에 capture antibody를 희석하여 준비하고, 96 well Microplates의 각 웰에 100μL씩 분주하여 16시간 이상 코팅한 후, 각 웰을 wash buffer로 세척하는 과정을 총 3번 반복하였다. 각 웰을 reagent diluent로 blocking하고, 각 웰을 wash buffer로 세척하는 과정을 총 3번 반복하였다.

배양이 종료된 배양액을 0.2μm syringe filter를 사용하여 제균하고, 이를 희석하여 각 웰에 100μL씩 첨가하고 2시간 반응시킨 후, 각 웰을 wash buffer로 세척하는 과정을 총 3번 반복하였다. Detection antibody 희석액을 각 웰에 100μL씩 첨가하고 2시간 반응시킨 후, 각 웰을 wash buffer로 세척하는 과정을 총 3번 반복하였다. Streptavidin-HRP 희석액을 각 웰에 100μL씩 첨가하고 20분간 반응시킨 후, 각 웰을 wash buffer로 세척하는 과정을 총 3번 반복하였다. 각 웰에 Substrate Solution 100μL를 첨가하고 20분을 반응시킨 후, 각 웰에 Stop Solution 50μL를 첨가하고 적절히 shaking하여 효소반응을 중지시켰다. 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 각 웰에서 450nM 흡광도를 측정하였다.

실시예 2. TPYG 배지 대체용 펩톤 선정

종래 보툴리눔 독소 생산용 배지로 많이 사용하는 casein peptone, yeast extract, glucose, sodium-thioglycolate로 구성된 TPYG 배지를 식물성 peptone, yeast extract, glucose, sodium-thioglycolate로 구성된 PYG 배지로 대체하고자 하였다.

Peptone은 식물성 peptone을 비롯한 다양한 후보군을 선정하여, soy 유래 배지와 그 외 plant 유래 배지 중 TYPG 배지와 독소생성량이 유사한 plant 유래 배지를 1차 선정하고자 하였다.

2-1. 비교예: TPYG 배지의 제조

Casein peptone, Tryptone, Yeast extract, Sodium thioglycolate를 각각 weighing dish를 이용하여 2 g, 1 g, 1 g, 0.1 g으로 칭량하고, 250 mL 비이커에 정제수 50 mL을 넣고 칭량된 배지성분을 넣어 완전히 용해될 때까지 교반하였다. 1N NaOH를 이용하여 pH를 7.2로 조정하고, 비이커의 배지를 100 mL 메스실린더에 옮긴 후 정제수를 첨가하여 최종 액량이 95 mL이 되도록 한 후, 제조된 배지와 Magnetic bar를 100 mL glass bottle에 옮겨 뚜껑을 닫아두었다.

Glucose를 weighing dish를 이용하여 1 g을 칭량하고, 칭량된 glucose를 정제수 약 3 mL이 담긴 15 mL conical tube에 넣고 vortexing하여 충분히 녹인 후, conical tube에 정제수를 첨가하여 최종액량이 5mL이 되도록 맞추어 주었다.

제조된 배지와 glucose의 뚜껑을 살짝 열고 호일로 감싼 뒤 autoclave에서 121℃ 20분 멸균하고, 멸균이 완료된 배지와 glucose를 BSC에서 충분히 식힌 후 glucose를 배지에 옮겨 섞어주었다.

2-2. 실험예: PYG 배지의 제조

표 1의 12가지 배지성분을 칭량하여 50 mL 정제수에 녹인 뒤 1N NaOH를 이용하여 pH를 7.2로 조정 후 정제수를 첨가하여 최종액량을 표 1에 따라 맞추고, 제조된 배지와 Magnetic bar를 100 mL glass bottle에 옮긴 후 뚜껑을 닫아 주었다.

배지명	성분(g)			최종액량 (mL)
배지명	Peptone		Yeast extract	최종액량 (mL)
PYG1	Phytone peptone	3	1	95 mL
PYG2	Potato peptone E210	3		95 mL
PYG3	Pea peptone A482	3		95 mL
PYG4	Plant peptone E1	3		95 mL
PYG5	Select phytone UF	3		95 mL
PYG6	Peptone from soybean	3		95 mL
PYG7	Hy-soy	3		95 mL
PYG8	Hy-peptone	3		95 mL
PYG9	Soy peptone A2SC	3		95 mL
PYG10	Soy peptone A3SC	3		95 mL
PYG11	Soy peptone E110	3		95 mL
PYG12	Soy peptone K200	3		95 mL

Glucose를 weighing dish를 이용하여 13g을 칭량하고, 칭량된 glucose를 정제수 65 mL에 녹였다. 제조된 glucose 용액을 100 mL glass bottle에 옮긴 후 뚜껑을 닫아주었다.

제조된 배지와 glucose를 121℃, 20분 멸균하고, 멸균이 완료된 배지와 glucose를 BSC에서 충분히 식힌 후 각 배지에 glucose 용액을 5mL씩 옮겨 섞어주었다.

2-3. 펩톤 선정

실시예 2-1 또는 실시예 2-2에서 제조된 배지에 클로스트리디움 보툴리눔 균주를 실시예 1-2의 방법으로 배양하여 배양 종료시점의 OD600 값을 확인하고, 1-3의 방법으로 ELISA를 통한 독소 생성량을 확인하였다.

배지명	TPYG	PYG1	PYG2	PYG3	PYG4
OD600	0.437	0.463	0.385	0.309	0.013
독소량(mg/L)	22.7	21.5	25.4	2.7	15.6
독소량(상대치)	100	94.7	111.9	11.9	68.7

배지명	TPYG	PYG5	PYG6	PYG7	PYG8
OD600	0.447	0.360	0.372	0.414	0.532
독소량(mg/L)	28.8	27.0	16.6	18.5	18.5
독소량(상대치)	100	93.8	57.6	64.2	64.2

배지명	TPYG	PYG9	PYG10	PYG11	PYG12
OD600	0.396	0.147	0.526	1.980	2.120
독소량(mg/L)	27.3	17.2	8.7	15.9	7.2
독소량(상대치)	100	63.0	31.9	58.2	26.4

그 결과, 배양 종료 후 OD600과 독소 생성량은 표 2와 같이 나타났으며, TPYG배지와 비교하여 유사한 독소량과 균주가 최대한 용해되어 1 미만의 OD600을 보여주는 배지는 세 가지(PYG1, PYG2, PYG5)로 나타났다. 이와 같은 결과는 반복 시험을 통해 재확인하였는데, 표 3에서와 같이 반복 시험에서도 PYG1, PYG2, PYG5가 TPYG와 유사한 독소생성량을 보여주는 것이 확인되었으며, 이 중 동물 성분과 주요 알레르기 유발물질이 배제된 PYG2 배지를 이용하여 최상의 배지 조성물을 도출하고자 하였다.

배지명	TPYG	PYG1	PYG2	PYG5
OD600	0.541	0.514	0.650	0.433
독소량(mg/L)	27.4	28.4	24.7	22.3
독소량(상대치)	100	103.6	90.1	81.4

실시예 3. 배지 조성 최적화

배지 선별시험을 통해 결정된 Potato peptone, Yeast extract, Glucose의 최적화된 농도를 찾기 위하여 DoE를 통한 농도 범위 시험을 진행하였으며 요인실험, 중심점 실험, 축점 실험 결과를 토대로 최적 조성을 구하고자 하였다.

3-1. 요인실험

표 4와 같은 8가지 농도범위의 성분을 포함하는 배지 성분을 이용하여 요인실험을 진행하였다. 배지는 표 4에 포함된 성분을 이용하여 2-2와 동일한 방법으로 제조하였고, 이와 같이 제조된 배지에 클로스트리디움 보툴리눔 균주를 실시예 1-2 방법으로 배양하여 배양 종료시점의 OD600 값을 확인하고, 1-3의 방법으로 ELISA를 통한 독소 생성량을 확인하였다.

배지명	성분			최종액량 (mL)
배지명	Potato peptone E210(g)	Yeast Extract(g)	Glucose(mL)	최종액량 (mL)
요인실험1	2	0.5	10	90
요인실험2	5	0.5	2.5	97.5
요인실험3	2	2	2.5	97.5
요인실험4	5	2	10	90
요인실험5	2	0.5	2.5	97.5
요인실험6	5	2	2.5	97.5
요인실험7	5	0.5	10	90
요인실험8	2	2	10	90

그 결과, 표 5에서와 같이 OD600과 독소량을 확인할 수 있었으며, 이를 기초로 한 정규분포 분석 결과, 3차 교호작용은 배제하고 1차 및 2차 교호작용을 포함하여 분석했을 때 peptone, yeast, glucose 1차 및 2차항에서 peptone*glucose 교호작용을 제외한 나머지 요인이 독소생성량에 유의미한 것으로 확인되었고(도 1), Pareto 분석에서도 정규분포 분석에서와 동일한 분석결과를 확인하였다(도 2).

배지명	배지조성	OD600	독소량(mg/L)
요인실험1	Potato peptone 2%Yeast extract 0.5% Glucose 2%	4.560	20.0
요인실험2	Potato peptone 5%Yeast extract 0.5% Glucose 0.5%	0.805	3.0
요인실험3	Potato peptone 2%Yeast extract 2% Glucose 0.5%	0.447	3.0
요인실험4	Potato peptone 5%Yeast extract 2% Glucose 2%	7.600	9.6
요인실험5	Potato peptone 2%Yeast extract 0.5% Glucose 0.5%	0.267	5.2
요인실험6	Potato peptone 5%Yeast extract 2% Glucose 0.5%	0.838	4.5
요인실험7	Potato peptone 5%Yeast extract 0.5% Glucose 2%	6.350	14.3
요인실험8	Potato peptone 2%Yeast extract 2% Glucose 2%	5.080	13.0

3-2. 중심점 실험

중심점 실험을 위한 배지로, Potato peptone E210, Yeast extract, Sodium thioglycolate를 각각 weighing dish를 이용하여 24.5g, 8.75g, 0.7g으로 칭량하고, 1 L 비이커에 정제수 550 mL을 넣고 칭량된 배지성분을 넣어 완전히 용해될 때까지 교반하였다. 1N NaOH를 이용하여 pH를 7.2로 조정하고, 비이커의 배지를 1 L 메스실린더에 옮긴 후 정제수를 첨가하여 최종 액량이 656.25mL이 되도록 맞춘 후 1L 비이커에 다시 옮겨 약 5분간 교반하였다. 배지를 93.75mL씩 총 6개의 100 mL glass bottle에 옮긴 후 magnetic bar를 넣고 뚜껑을 닫고, 각 배지를 중심점 1~6으로 명명하였다.

Glucose를 weighing dish를 이용하여 8g을 칭량하고, 칭량된 glucose를 정제수 40 mL에 완전히 녹였다.

제조된 배지와 glucose를 121℃ 20분 멸균하고, 멸균이 완료된 배지와 glucose를 BSC에서 충분히 식힌 후 glucose용액을 각 배지 6.25mL씩 옮겨 섞어주었다.

이와 같이 제조된 배지에 클로스트리디움 보툴리눔 균주를 실시예 1-2 방법으로 배양하여 배양 종료시점의 OD600 값을 확인하고, 1-3의 방법으로 ELISA를 통한 독소 생성량을 확인하였다.

배지명	배지조성	OD600	독소량(mg/L)
중심점1	Potato peptone 3.5%Yeast extract 1.25% Glucose 1.25%	3.360	20.2
중심점2	Potato peptone 3.5%Yeast extract 1.25% Glucose 1.25%	1.630	21.1
중심점3	Potato peptone 3.5%Yeast extract 1.25% Glucose 1.25%	4.810	16.4
중심점4	Potato peptone 3.5%Yeast extract 1.25% Glucose 1.25%	4.300	16.2
중심점5	Potato peptone 3.5%Yeast extract 1.25% Glucose 1.25%	4.830	15.9
중심점6	Potato peptone 3.5%Yeast extract 1.25% Glucose 1.25%	5.010	15.1

하나의 농도의 중심점 실험을 6회 반복하였으며, 그 결과 값은 표 6과 같았다. 중심점 실험 결과를 바탕으로 그래프의 곡선 유무를 판단해 보았을 때 p-value가 0.001로 유의미하다고 판단하는 기준인 0.05 미만이므로 곡선이 있음을 확인하고 표면분석법을 수행하기 위한 추가시험을 진행하였다.

3-3. 축점 실험

축점 실험을 위한 배지로, 표 9와 같이 6 가지 배지 성분을 칭량하여 50 mL 정제수에 녹인 뒤 1N NaOH를 이용하여 pH를 7.2로 조정하고, 정제수를 첨가하여 최종액량을 표 8과 같이 맞추어 주었다. 제조된 각 배지와 Magnetic bar를 100 mL glass bottle에 옮긴 후 뚜껑을 닫아 두었다.

배지명	성분			최종액량 (mL)
배지명	Potato peptone E210(g)	Yeast Extract(g)	Glucose(mL)	최종액량 (mL)
축점1	3.5	1.25	12.5	87.5
축점2	1	1.25	6.25	93.75
축점3	6	1.25	6.25	93.75
축점4	3.5	0.025	6.25	93.75
축점5	3.5	2.5	6.25	93.75
축점6	3.5	1.25	0.125	99.875

Glucose를 weighing dish를 이용하여 8g을 칭량하고, 칭량된 glucose를 정제수 40 mL에 완전히 녹였다. 제조된 배지와 glucose를 121℃, 20분 멸균하고, 멸균이 완료된 배지와 glucose를 BSC에서 충분히 식힌 후 각 배지에 glucose 용액을 표 8에 기재된 양만큼 첨가하였다.

이와 같이 제조된 배지에 클로스트리디움 보툴리눔 균주를 실시예 1-2 방법으로 배양하여 배양 종료시점의 OD600 값을 확인하고, 1-3의 방법으로 ELISA를 통한 독소 생성량을 확인하였다. 그 결과, 축점 분석 값은 표 9와 같이 확인되었다.

배지명	배지조성	OD600	독소량(mg/L)
축점1	Potato peptone 3.5%Yeast extract 1.25% Glucose 2.5%	5.53	7.2
축점2	Potato peptone 1%Yeast extract 1.25% Glucose 1.25%	2.550	12.8
축점3	Potato peptone 6%Yeast extract 1.25% Glucose 1.25%	0.416	20.0
축점4	Potato peptone 3.5%Yeast extract 0.025% Glucose 1.25%	2.240	8.1
축점5	Potato peptone 3.5%Yeast extract 2.5% Glucose 1.25%	0.447	21.2
축점6	Potato peptone 3.5%Yeast extract 1.25% Glucose 0.025%	0.986	0.3

3-4. 표면분석법을 통한 최적 농도 분석

요인실험, 중심점, 축점 실험결과를 바탕으로 표면분석법을 진행하였다. 모델 적합성 분석을 위해 정규확률도, 히스토그램, 대적합치 및 대 순서 그림으로 분석하였으며, 정규확률도가 직선으로 확인되고, 히스토그램이 정규분포 모양으로 나왔으며, 대적합치 및 대순서 그림에서는 패턴이 없다는 점을 근거로 선택한 모델이 적절했다고 판단하였다(도 3).

배양 조성을 설정하기 위하여 표면분석법을 이용하여 결과를 분석하였고, 그 결과는 도 4와 같으며, 이를 최적화한 비율은 도 5와 같이 산출되어, 이를 적용시킨 최적의 농도는 표 10과 같이 정리하였다.

성분명	Potato peptone	Yeast extract	Glucose
최적농도(%)	3%	1%	1.5%

3-5. 최적 조성비 도출

표면분석법을 통한 최적화 농도는 독소 생성량을 기준으로 설정되었고, 최종 목표는 독소 생성량이 가장 높고, 배양 후 OD600의 농도는 1이하인 조성이므로 독소 생성량과 OD600에 가장 큰 영향을 미치는 것으로 판단되는 Glucose 농도를 0.75, 1, 1.25, 1.5%로 변화시키며 최적 배양비를 도출하고자 하였고, 그 결과는 표 11 및 도 6과 같이 나타나, 최적의 배지 조성물을 배지조성을 3% Potato peptone, 1% Yeast extract, 1% Glucose로 설정하였다.

배지명	배지조성	OD600	독소량(mg/L)
0.75%	Potato peptone 3%Yeast extract 1% Glucose 0.75%	0.343	1.500
1%	Potato peptone 3%Yeast extract 1% Glucose 1%	0.877	24.72
1.25%	Potato peptone 3%Yeast extract 1% Glucose 1.25%	3.230	18.95
1.5%	Potato peptone 3%Yeast extract 1% Glucose 1.5%	6.580	10.65

실시예 4. 최적 배양 조성물에 따른 균주 배양 실험

초저온냉동고에 보관되어 있는 클로스트리디움 보툴리눔 균주 1 바이알을 37℃ 배양기에서 30분 동안 녹여주었다. BSC에서 클로스트리디움 보툴리눔 균주를 3~5회 균질화하고, PYG 배지 500mL에 클로스트리디움 보툴리눔 균주 1 mL을 2 L Cell bag에 접종한 후 배양기(WAVE25)에서 34±1℃로 혐기조건에서 배양하였다. 10-24시간 사이에 균주 용해되기 전에 5 L PYG 배지에 100 mL 접종하였다. 이후 600 nm 파장의 흡광도와 독소량을 측정하면서 시간에 따른 흡광도 및 독소량을 측정하였다. 각 시료는 흡광도 측정 후 0.2 μm 제균필터를 사용하여 배양액만 회수한 후 1-3의 방법으로 독소량을 측정하였다.

상기와 같이 설정된 배양 조성물을 이용하여 배양을 진행하며 시간에 따른 OD 변화와 독소 생성량을 측정해 본 결과, 본 발명에 따른 배양 조성물은 약 14~15시간 만에 균주 배양의 OD600이 최대값에 도달하여, 기존의 클로스트리디움 보툴리눔 배지 조성물에 비해 배양 시간을 현저히 단축시킬 수 있는 것을 확인하였고, 이와 더불어, 독소 생성량도 35℃에서는 약 28시간, 33℃에서는 약 37시간에 그 최대치를 확인할 수 있었다.

실시예 5. 최적 배양 조성물 및 기타 배양 조성물의 배양 효과 비교

실시예 3에서 도출된 최적 조성비 이외의 범위 및 소이 펩톤을 사용하였을 때의 배양 효과를 확인해 보고자 하였다. 이를 위하여 표 12에 기재된 조성비를 함유하도록 각각 배양용 배지를 만들고 배양 효과를 확인하였다. 그 결과, 표 13에서 볼 수 있는 바와 같이, 실험군이 비교예에 비해 독소 생산량 또는 세포 배양 시간면에서 유리한 것을 확인할 수 있었다. 구체적으로는, 비교예 1에서 포테이토 펩톤을 사용하는 경우 최대 Cell Mass 도달 시간은 현저히 단축되었으나, 해당 조성비에서의 최대 독소 생산량은 실험군에 훨씬 못미치는 것으로 나타났다. 한편, 비교예 2에서 소이 펩톤을 사용하는 경우 최대 Cell Mass 도달 시간이 실험군에 비해 현저히 오래 소요되는 것으로 확인되었다.

	Glucose	Yeast extract	peptone
실험군	1	1	3(potato)
비교예 1	1	0.1	1(potato)
비교예 2	1	1	3(soy)

	최대 Cell mass(AU)	최대 Cell mass 도달시간	최대 독소생산량(mg/L)	최대 독소생산량 도달 시간
실험군	7.92	14h	24.8	37h
비교예 1	2.74	21h	8.52	47h
비교예 2	7.64	31h	18.25	52h

실시예 6. 보툴리늄 독소 정제를 위한 시료 및 실험 재료 준비

6-1. 시료 준비

이 후 실시예에서 사용한 보툴리눔 균주는 Clostridium botulinum type A, NCTC13319으로, 상기 균주는 500mL PYG 배지(Potato peptone 3%, Yeast extract 1%, Glucose 1%)에 1차 접종 후 혐기성 조건에서 12시간~24시간 ReadytoProcess WAVE 25 배양기로 34 ±1

에서 배양하였다. 배양 후 균주의 성장이 대수증식기(log phase) 단계일 때 5L PYG 배지에 100mL 접종하고, 혐기성 조건에서 ReadytoProcess WAVE 25 배양기로 40~72시간 배양하였다. 배양액은 제균필터를 사용하여 제균하고 배양액만 회수하였다. 배양액에 3N 황산을 이용하여 pH 3.5로 적정하고, 침전 되는 것을 확인한 후 냉장조건에서 16시간 이상 보관하였다.

6-2. 실험 재료 준비

본 발명에서 사용된 실험 재료는 다음과 같다: 정제수 (Ultrapure water 또는 동등 이상의 품질을 가진 물), Butyl sepharose HP (GE Healthcare, 175432), Q- sepharose-HP(GE Healthcare, 171014), Phenyl sepharose HP (GE Healthcare, 171082), Q-sepharose-FF(GE Healthcare, 170510), SP-sepharose-FF(GE Healthcare,170729), DEAE-FF(GE Healthcare,170709), SP-sepharose-HP(GE Healthcare,171087), Capto Q ImpRes (GE Healthcare, 175470), Citric acid (Merck, 1.37002.5000), Tri - sodium citrate dehydrate (Merck, 1.37042.5000), Sodium phosphate monobasic (Merck, 1.06349.1000), Sodium phosphate dibasic (Merck, 1.06585), Sodium chloride (Merck, 1.37017.5000).

실시예 7. 보툴리눔 독소의 정제

7-1. 미세여과(Microfiltration)

미세여과 장비 AKTA flux 6(GE healthcare)를 켜고 0.2㎛ hollow fiber를 연결하였다. 증류수 5 L를 넣고 TMP 0.3 조건으로 장비 및 hollow fiber를 2회 세척하였다. 실시예 1-1에서 준비된 보툴리눔 독소 배양액 황산침전물 5 L를 미세여과 장비에 넣고 TMP 0.3 조건으로 1 L까지 농축한 후, 농축액에 2 L의 DW를 넣고 3 L에서 1 L까지 추가 농축하는 두 과정을 5회 반복하였다. 200 mM sodium citrate(pH 5.5)를 500 mL 넣고 1시간 30분 동안 순환하여 추출(extraction)하였다. 추출액은 미세여과장비의 Permeate line으로 회수하고 미세여과 장비에 300 kDa cut off hollow fiber를 연결하였다. 상기 추출물을 넣고 TMP 0.3bar 조건으로 500mL까지 농축하여 회수한 후, 4

에 보관하였다.

7-2. 양이온 교환 크로마토그래피

HiScale 50/20 컬럼 (GE Healthcare, 28964445)에 SP-HP 수지(Resin)를 8~12 cm 높이가 되도록 패킹 (packing)한 다음, AKTA Pure에 장착하였다. 평형/세척 완충액 (20 mM sodium citrate pH 4.8)을 흘려 컬럼을 평형화 하였다. 실시예 2-1에서 준비한 시료를 1M 구연산(citric acid)를 이용하여 pH 4.8로 맞추어 주고, 증류수 2000 mL을 넣어 5배 희석하였다. 상기 시료를 컬럼에 15mL/분으로 주입하였다. 주입이 끝나면 380 mL 의 평형/세척 완충액 (20 mM sodium citrate pH 4.8)을 흘려 컬럼을 세척하였다. 세척 후 평형 및 용출 완충액을 단계 1) 5 CV, 30 % 구배 (Linear gradient), 단계 2) 3 CV, 100 % 구배 (Step gradient)로 주입하고 분획 (Fraction)을 50 mL씩 순차적으로 수득하였다(표 14 참조). 순차적으로 총 31 개 분획이 수득되었고, 상기 분획은 각각 SDS-PAGE로 확인하였다.

Column Resin	SP Sepharose HP
Column Volume	190 mL
Binding 및 Washing Buffer	20 mM sodium citrate pH 4.8
Elution Buffer	20 mM sodium citrate/ 1 M sodium chloride, pH 4.8

그 결과는 도 8과 같으며, 총 31개 분획 중 10 내지 21번째 분획에서 HA33이 확인되는바, 900 kDa 복합체 형태의 보툴리눔 독소가 해당 분획에서 정제되었음을 확인할 수 있었다.

7-3. 소수성 크로마토그래피

HiScale 26/20 컬럼 (GE Healthcare, 28964514)에 Phenyl-HP 수지(Resin)를 7~11 cm 높이가 되도록 패킹 (packing)한 다음, AKTA Pure에 장착을 하였다. 평형/세척 완충액 (50 mM sodium phosphate, 2 M sodium chloride pH 6.2)을 흘려 컬럼을 평형화 하였다. 실시예 2-2의 SP sepharose HP 컬럼에서 용리된 10 ~ 21 번째 분획 총 600mL 을 모은 후, 1 M sodium phosphate dibasic으로 pH 6.2으로 맞추어 주었다. 50 mM sodium phosphate, 4 M sodium chloride pH 6.2를 600 mL 첨가한 시료를 8mL/분으로 주입하였다. 주입이 끝나면 94 mL 의 평형/세척 완충액 (50 mM sodium phosphate, 2 M sodium chloride pH 6.2)을 흘려 컬럼을 세척하였다. 세척 후 평형 및 용출 완충액을 단계 1) 10 CV, 100 % 구배 (Linear gradient), 단계 2) 3 CV, 100 % 구배 (Step gradient)로 주입하고 분획 (Fraction)을 23 mL씩 순차적으로 총 27 개 수득하고, 분획은 각각 SDS-PAGE로 확인하였다.

Column Resin	Phenyl Sepharose HP
Column Volume	47 mL
Binding 및 Washing Buffer	50 mM sodium phosphate/ 2 M sodium chloride, pH 6.2
Elution Buffer	50 mM sodium phosphate, pH 6.2

그 결과는 도 9와 같으며, 총 27개 분획 중 16 내지 23번재 분획에서 900 kDa 복합체 형태의 보툴리눔 독소가 확인되었다.

7-4. 음이온 교환 크로마토그래피

Omnifit 6.6/25 컬럼 (Diba, 006EZ0625AA)에 Capto-Q ImpRes 수지(Resin) 를 8~12 cm 높이가 되도록 패킹 (Packing)한 다음, AKTA Pure에 장착을 하였다. Dialysis Membrane (Spectra/Por, 132680)를 이용하여 실시예 2-3의 Phenyl sepharose HP 컬럼에서 용리된 분획 16 ~ 23번째 분획 총 168 mL 을 50 mM sodium phosphate (pH 6.2) 완충액으로 100 배, 다이아필트레이션(Diafiltration, DF)을 하였다. 평형/세척 완충액 (50 mM sodium phosphate, pH 6.2)을 흘려 컬럼을 평형화 하였다. 상기 실시예 2-3으로부터 준비된 시료를 1mL/분으로 주입하였다. 주입이 끝나면 18 mL 의 평형/세척 완충액 (50 mM sodium phosphate, pH 6.2)을 흘려 컬럼을 세척하였다. 세척 후 평형 및 용출 완충액을 단계 1) 2 CV, 15 % 구배(Step gradient), 단계 2) 2 CV, 20 % 구배 (Step gradient), 단계 3) 2 CV, 30 % 구배 (Step gradient), 단계 4) 2 CV, 100 % 구배 (Step gradient)를 주입하고 용출하였다. 분획 (Fraction)을 1 mL씩 순차적으로 총 29 개 수득하고, 상기 분획은 각각 SDS-PAGE로 확인하였다.

Column Resin	Capto Q ImpRes
Column Volume	3.6 mL
Binding 및 Washing Buffer	50 mM sodium phosphate, pH 6.2
Elution Buffer	50 mM sodium phosphate/ 1 M sodium chloride, pH 6.2

그 결과는 도 10과 같으며, 총 29개 분획 중 7 내지 10번째 분획에서 불순물(빨간 원)이 포함되지 않은 900 kDa 복합체 형태의 보툴리눔 독소가 확인되었다.

실시예 8. 표준품과의 정제산물 비교

실시예 7에서 정제된 보툴리눔 독소를 포함하는 분획 7 내지 10을 취합하고 상업적으로 구입 가능한 보툴리눔 독소인 C-BoNT/A1 (Cat. No. #3102, miprolab)를 각각 1mg/ml의 농도가 되도록 50mM Sodium phosphate Buffer(pH 6.2)로 희석하고, 표 17과 같은 환원조건과 비환원조건으로 구분하여 로딩용 시료를 만들었다. 시료를 Novex Wedge Well 4-20% Tris-Glucine, 10 well (Invitrogen, NP04200BOX)에 전기영동하고, Instnat Blue stain reagen를 약 30 mL 붓고 Shaker에 올려 60분간 염색한 후, 염색시약을 완전히 제거하고 정제수를 약30 mL 부은 후 Shaker에 30분 동안 올려 세척하는 과정을 5회 이상 반복하였다. 배경이 충분히 제거되고 밴드 확인이 가능할 때, Image Analyzer를 이용하여 gel을 분석하였다.

	환원조건	비환원조건
보툴리눔 독소(1mg/ml)	3 uL	3 uL
LDS Sample Buffer (4x)	5 uL	5 uL
Sample Reducing Agent (10x)	2 uL	0 uL
정제수	10 uL	12 uL
Total Volume	20 uL

그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이 본 발명의 정제방법이 상업적으로 구입 가능한 보툴리눔 독소와 동일한 위치에서 밴드를 확인하였으며, 이로부터 본 발명의 정제방법이 정확한 목적 단백질만 정제할 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 9. 표준품과 본 발명의 보툴리눔 독소 정제산물과의 활성 비교

실시예 7에 의해 정제된 보툴리눔 독소와 상업적으로 구입 가능한 보툴리눔 독소인 보톡스(Allergan, Inc., 100 unit)의 활성 비교를 진행하였다.

각 시료를 농도에 따라 2x10⁵배에서 3x10⁵배 내외로 1차 희석한 후 생리식염수 4.4mL에 희석된 시료 1.45mL를 희석한다. 이와 동일한 방법으로 10개 그룹으로 희석한 후 각 그룹마다 18~22g의 암컷 ICR 마우스에 10마리씩 복강 내에 0.1mL씩 주사하고 3일동안 치사율을 측정하였다. 프로빗법으로 통계처리하여 LD₅₀를 구하였다.

그 결과, 본 발명에 의해 정제된 보툴리눔 독소와 알러간 사의 보툴리눔 독소의 1ng 당 활성이 각각 40.73 unit, 25.32unit으로 나타나, 본 발명에 따른 정제방법이 보툴리눔 독소의 활성의 약화없이 정제 가능하다는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 10. 타사의 정제 공정과의 순도 비교

보툴리눔 독소의 대표적인 제조사 중 하나인 알러간 사가 한국에 출원한 특허출원번호 10-2013-0092024에 기재된 정제방법으로 정제된 보툴리눔 독소의 순도를 분석해 보았다. 그 결과, 도 12에서와 같이 주요 피크 외에 더 작은 크기의 불순물이 확인되었으며, 900kDa 단백질이 150kDa, 300kDa 또는 500kDa의 단백질과 효과적으로 분리되지 못하는 것으로 나타났다.

또한, 알러간 사의 미국 출원번호 11/932789의 정제방법으로 정제된 보툴리눔 독소의 순도를 분석해 보았다. 그 결과, 도 13에서와 같이 주요 피크 외에 더 큰 크기의 불순물이 확인되었다. 이는 원하지 않는 침전물이 생성된 것으로, 정제 과정이 단백질 구조에 영향을 미쳤음을 예상할 수 있다.

이와 대비하여 본 발명은 900kDa 독소만을 특이적으로 정제할 수 있으며, 정제 중 생길 수 있는 독소의 변형도 최대한 감소시킨 공정임을 도 14의 결과로부터 확인할 수 있다.

정제된 보툴리눔 독소의 순도 분석은 표 5의 조건을 이용하여 HPLC로 분석하였다.

Item	Condition
Column	PROTEIN KW-804
Size	8 mm Х 300 mm
Stationary phase	silica gel for chromatography R (7 μm)
Temperature	25 ℃
Mobile phase	50 mM Sodium phosphate pH 6.0, 0.15 M NaCl
Flow rate	1.0 mL/min
Running time	30 min
Detection	UV detector, 278 nm
Injection volume	20 μL

실시예 11. 선행특허의 3단계 크로마토그래피 공정과 본 발명의 정제 공정 비교

선행특허들(미국공개특허 제2019-0201505호 및 미국등록특허 제7,452,697호)에 기재된 보툴리눔 독소 정제에 사용된 레진과 본 발명의 정제방법에 사용된 레진의 다른 타입을 적용한 정제방법을 사용하여, 정제된 보툴리눔 독소의 순도 및 역가를 비교하였다 (표 19).

순도는 상기 표 18의 방법으로 HPLC로 확인하였으며, 역가는 Mouse assay 분석법으로 단백질 농도가 1mg/mL인 상태에서, 마우스의 3일간 사망 개체수 결과를 바탕으로 Combostats에 적용하여 Probit법으로 통계처리하여 역가를 계산하였다.

	1^st 컬럼 레진	2^nd 컬럼 레진	3^rd 컬럼 레진
본 발명 (실험예)	SP sepharose HP	Phenyl sepharose HP	Capto Q ImpRes
US2019-0201505 (비교예1)	Butyl sepharose HP	Q sepharose HP	Phenyl sepharose HP
US7452697 (비교예 2)	Q sepharose FF	Butyl sepharose HP	SP sepharose HP

각 실험예와 비교예에서 사용한 컬럼의 종류와 정제 조건은 표 20 및 표 21에 나타내었다.

그 결과, 표 22에 나타난 바와 같이, 본 발명의 정제 방법인 실험예로 정제된 보툴리눔 독소는 높은 순도 99.4%를 확인하였으며, 비교예 1의 방법으로 정제된 독소의 경우 실험예에 비하여 순도와 역가가 낮은 것을 확인하였으며, 비교예 2의 경우는 역가는 높으나 순도가 실험예에 비하여 낮은 것을 확인하였다. 비교예 3은 순도가 매우 낮으며, 역가 또한 낮은 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 방법에 의해 정제된 보툴리눔 독소는 기존의 방법보다 순도와 역가가 현저히 높다는 것을 확인하였다.

	순도 (SEC-HPCL, %)	역가 (Unit/mg)
본 발명 (실험예)	99.4	4.04 x 10 ⁷
US2019-0201505 (비교예1)	93.3	3.78 x 10⁷
US7452697(비교예 2)	45.2	1.0 x 10⁷ 미만

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

다음 단계를 포함하는 보툴리눔 독소의 제조방법:
(a) 포테이토 펩톤(potato peptone), 효모 추출물(yeast extract) 및 글루코스(glucose)를 포함하는 클로스트리디움 보툴리눔 배양용 배지 조성물에서 클로스트리디움 보툴리눔을 배양하여 보툴리눔 독소를 생성시키는 단계;
(b) 보툴리눔 독소를 포함하는 배양액을 산 침전 또는 한외여과하여 전처리하는 단계;
(c) 전처리된 보툴리눔 독소를 SP 컬럼을 이용하여 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하여 정제하는 단계;
(d) Phenyl 컬럼을 이용하여 소수성 크로마토그래피를 수행하여 정제하는 단계; 및
(e) Q 컬럼을 이용하여 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하여 보툴리눔 독소를 정제하는 단계.
제1항에 있어서, 상기 클로스트리디움 보툴리눔은 Clostridium botulinum, type A 인 것을 특징으로 하는 보툴리눔 독소의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 배양용 배지 조성물은 동물유래 산물 및 알레르기 원인이 배제된 것을 특징으로 하는 보툴리눔 독소의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 포테이토 펩톤은 2~5%(w/v), 효모 추출물은 0.5~2%(w/v), 글루코스는 0.75~1.5%(w/v)로 포함하는 것을 특징으로 하는 보툴리눔 독소의 제조방법.
제4항에 있어서, 상기 포테이토 펩톤은 3%(w/v), 효모 추출물은 1%(w/v), 글루코스는 1%(w/v)로 포함하는 것을 특징으로 하는 보툴리눔 독소의 제조방법.
삭제
제5항에 있어서, 상기 (b) 단계에서 클로스트리디움 보툴리눔을 배양 시작 후 40시간 이내에 회수하는 것을 특징으로 하는 보툴리눔 독소의 제조방법.
삭제
제1항에 있어서, 상기 SP 컬럼은 SP sepharose HP 컬럼, SP sepharose FF 컬럼 및 Capto S 컬럼으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 보툴리눔 독소의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 (c) 단계에서 보툴리눔 독소는 pH 4.5~5.5의 10~30mM 구연산 나트륨 완충액에 용해시켜 SP 컬럼에 주입되는 것을 특징으로 하는 보툴리눔 독소의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 (c) 단계에서 보툴리눔 독소는 0.5~1.5M 염화나트륨이 첨가된 pH 4.5~5.5의 30~70mM 구연산나트륨 완충액으로 용리되는 것을 특징으로 하는 보툴리눔 독소의 제조방법.
삭제
제1항에 있어서, 상기 Phenyl 컬럼은 Phenyl sepharose HP 컬럼, Phenyl sepharose FF (Fast Flow) 컬럼 및 Capto Phenyl 컬럼으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 보툴리눔 독소의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 (d) 단계에서 보툴리눔 독소는 1.8~2.2M 염화나트륨이 첨가된 pH 5.7~6.7의 30~70mM 인산나트륨 완충액으로 용해시켜 Phenyl 컬럼에 주입되는 것을 특징으로 하는 보툴리눔 독소의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 (d) 단계에서 보툴리눔 독소는 pH 5.7~6.7의 30~70mM 인산나트륨 완충액으로 용리되는 것을 특징으로 하는 보툴리눔 독소의 제조방법.
삭제
제1항에 있어서, 상기 Q 컬럼은 Capto Q ImpRes 컬럼, Toyopearl Super Q 650M 컬럼, Q sepharose FF 컬럼 및 Q Sepharose HP 컬럼으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 보툴리눔 독소의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 (e) 단계에서 보툴리눔 독소는 pH 5.7~6.7의 40~60mM 인산나트륨 완충액에 용해시켜 Q 컬럼에 주입되는 것을 특징으로 하는 보툴리눔 독소의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 (e) 단계에서 보툴리눔 독소는 0.8~1.2M 염화나트륨이 첨가된 pH 5.7~6.7의 40~60mM 인산나트륨 완충액으로 용리되는 것을 특징으로 하는 보툴리눔 독소의 제조방법.
제1항에 있어서, 정제된 보툴리눔 독소는 순도 99% 이상의 보툴리눔 독소 A형인 것을 특징으로 하는 보툴리눔 독소의 제조방법.