CN114245801A - 纯化肉毒杆菌毒素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种纯化肉毒杆菌毒素的方法，该方法包括：(a)预先处理含有肉毒杆菌毒素的培养基溶液，(b)利用阳离子交换色谱来纯化预先处理的肉毒杆菌毒素，(c)利用疏水色谱来纯化所述肉毒杆菌毒素，以及(d)使用阴离子交换色谱来纯化所述肉毒杆菌毒素。所述方法能够纯化肉毒杆菌毒素，该肉毒杆毒素具有高纯度和高活性，因此该方法可用于肉毒杆菌毒素的生产。
Description
发明背景
发明领域
本发明涉及一种用于纯化肉毒杆菌毒素的方法，更具体地，涉及一种能够通过阳离子交换色谱、疏水色谱和阴离子交换色谱的简单方法获得高纯度和活性的肉毒杆菌毒素的纯化方法。
相关技术概述
肉毒杆菌毒素是由细菌诸如丁酸梭菌(Clostridium butyricum)、巴氏梭菌(Clostridium baraffi)和肉毒杆菌(Clostridium botulinum)产生的一种神经毒蛋白。肉毒杆菌毒素阻断神经肌肉的传导，并且造成人类和动物的神经麻痹疾病。特别地，已知A型肉毒杆菌毒素对于人类而言具有很强的致死性。除了A型肉毒杆菌毒素，已经鉴定出B型、C1型、D型、E型、F型、G型和H型6种其它肉毒杆菌毒素。每种类型的肉毒杆菌毒素都可以通过相应的类型特异性抗体来区分，不同种类的肉毒杆菌毒素所造成的麻痹的严重程度和受其影响的动物种类不同。
肉毒杆菌毒素的蛋白分子的分子量约为150kD，包括一条约为50kD的轻链和一条与该轻链缀合的约100kD的重链。然而，从肉毒杆菌释放的肉毒杆菌毒素是以150kD的毒素蛋白与至少一种非毒素蛋白的复合物的形式释放的。例如，肉毒杆菌毒素以900kD、500kD和300kD的复合物形式释放。
肉毒杆菌毒素对于人类而言可能是非常致命的，但最近开发出的肉毒杆菌毒素用于治疗多种症状，包括以骨骼肌过度活动(skeletal muscle hyperactivity)为特征的神经肌肉障碍。例如，
是Allergan公司商业化开发的肉毒杆菌毒素A的商标，其用于缓解或治疗眼睑痉挛、斜视、颈部肌张力障碍和眉间(面部)皱纹，并且目前正在研究开发适用于其他血清型的应用以及在临床上利用这些血清型。
供临床使用的肉毒杆菌毒素一般是从细胞培养物中分离出来的。在这种情况下，使用多种纯化方法。
例如，通过一系列的沉淀和切向流过滤步骤以复合形式纯化肉毒杆菌毒素。[参见：例如，Schantz E.J.等人，Microbiol.Rev.1992年3月56(1)：80-99]。然而，此方法通常提供低于约10％的相对低的产率。其他使用的方法包括尺寸排阻、离子交换和/或亲和色谱[参见，例如，SchmidtJ.J.等人，Anal.Biochem.156：213，1986；Kannan K.等人，Mov.Disord.2000；15(Suppl 2)：20(2000)；Wang Y.C.，Dermatol.Las.Fami.C.，Dermatol.Faci.C.，Dermatol.Las.Cosm.2002：58，2002；和美国专利号2003/0008367]。
另一种方法是通过重组方式独立合成肉毒杆菌毒素的重链或轻链之一，而不是合成完整且具有生物活性的肉毒杆菌毒素蛋白[参见，例如，Zhou L.等人，Biochemistry，34(46)：15175(1995)；和Johnson S.K.等人，Protein Expr.and Purif.2003.；32：1-9，(2003)]。然而，这些方法不利地需要重新形成完整且具有生物活性的肉毒杆菌毒素蛋白的额外步骤。
最近的方法涉及使用疏水相互作用色谱、混合模式和/或离子交换色谱来纯化作为复合物的肉毒杆菌毒素(参见，例如：美国专利号7,452,697和7,354,740)。
然而，在技术领域中仍然需要一种用于分离稳定且具有生物活性的完整肉毒杆菌毒素的改善的纯化方法。因此，经由广泛努力开发一种利用简化方式分离高纯度和活性的肉毒杆菌毒素的纯化方法，本发明人发现，可以使用阳离子交换色谱、疏水性色谱和阳离子交换色谱的简化方法来生产高纯度和活性的肉毒杆菌毒素，特别地，使用SP柱作为阳离子交换树脂且使用苯基柱作为疏水性树脂且使用Q柱作为阴离子交换树脂，可以将肉毒杆菌毒素纯化至99％或更多的纯度。基于该发现，已经完成本发明。
现有技术文件
专利文件
美国专利公开号2003/0008367
美国专利号7,452,697
美国专利号7,354,740
非专利文件
Schantz E J等人，Properties and use of botulinum toxin and othermicrobial neurotoxins in medicine，Microbiol.Rev.1992March 56(l)：80-99
Schmidt J.J.等人，Purification of type E botulinum neurotoxin by high-performance ion exchange chromatography，Anal.Biochem.1986July；156(1)：213-219
Kannan K.等人，Methods development for the biochemical assessment ofNeuroBloc(botulinum toxin type B)，Mov.Disord.2000；15(Suppl 2)：20
Wang Y.C.，The preparation and quality of botulinum toxin type A forinjection(BTXA)and its clinical use，Dermatol.Las.Faci.Cosm.Surg.2002；58ZhouL.et al.，Expression and purification of the light chain of botulinumneurotoxin A：A single mutation abolishes its cleavage of SNAP-25andneurotoxicity after reconstitution with the heavy chain，Biochemistry 1995；34(46)：15175-81
Johnson S.K.等人，Scale-up of the fermentation and purification of therecombination heavy-chain fragment C of botulinum neurotoxin serotype Fexpressed in Pichia pastoris，Protein Expr.and Purif.2003；32：1-9
发明内容
因此，鉴于上述问题，完成了本发明，本发明的目的是提供一种使用简单方法纯化高纯度和活性的肉毒杆菌毒素的方法。
根据本发明的一个方面，上述和其他目的可以通过提供一种纯化肉毒杆菌毒素的方法来完成，该方法包括：(a)预先处理含有肉毒杆菌毒素的培养基溶液；(b)利用阳离子交换色谱来纯化预先处理的该肉毒杆菌毒素；(c)利用阳离子交换色谱来纯化该肉毒杆菌毒素，以及(d)使用阴离子交换色谱纯化所述肉毒杆菌毒素。
发明效果
本发明可以提高纯化后的肉毒杆菌毒素的纯度，并且可以仅使用包括阳离子交换色谱、疏水性色谱和阳离子交换色谱的简单方法来保持其活性，因此，可用于肉毒杆菌毒素的生产。
附图简述
在以下结合多个附图所进行的详细描述中，将更清楚地理解本发明的上述目的及其他目的、特征和其他优点，其中：
图1示出根据本发明的一个实施方案，经过阴离子交换色谱后的洗脱液中的肉毒杆菌毒素的FPLC和SDS-PAGE分析的结果；
图2示出根据本发明的一个实施方案，经过疏水性色谱后的洗脱液中的肉毒杆菌毒素的FPLC和SDS-PAGE分析的结果；
图3示出根据本发明的一个实施方案中，经过阴离子交换色谱后的洗脱液中的肉毒杆菌毒素的FPLC和SDS-PAGE分析的结果；
图4示出一种用于确定根据本发明的肉毒杆菌毒素和可商业获得的肉毒杆菌毒素的纯化效果的SDS-PAGE分析的结果；
图5示出根据韩国专利申请号10-2013-0092024的纯化方法来纯化的肉毒杆菌毒素的纯度的测定结果；
图6示出根据美国专利申请号11/932789的纯化方法来纯化的肉毒杆菌毒素的纯度的测定结果；以及
图7示出根据本发明纯化的肉毒杆菌毒素的纯度的测定结果。
发明详述
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域中的技术人员所理解含义相同的含义。一般来说，本文使用的命名法是本领域中众所周知的，并且也是常用的。
在本发明中，发现当通过使用阳离子交换色谱、疏水性色谱和阴离子交换色谱的一系列过程来纯化肉毒杆菌毒素培养液时，相较于通过常规方法制备的肉毒杆菌毒素，可以分离并纯化高纯度和活性的约900kDa的肉毒杆菌毒素。特别地，本发明发现当使用SP柱作为阳离子交换树脂和使用苯基柱作为疏水性树脂和使用Q柱作为阴离子交换树脂时，肉毒杆菌毒素可以纯化到99％或更高的纯度。
因此，在一个方面，本发明涉及一种纯化肉毒杆菌毒素的方法，该方法包括：(a)预先处理含有肉毒杆菌毒素的培养基溶液；(b)利用阳离子交换色谱来纯化预先处理的该肉毒杆菌毒素，(c)利用疏水性色谱来纯化该肉毒杆菌毒素，以及(d)使用阴离子交换色谱来纯化该肉毒杆菌毒素。
在本发明中，所述阳离子交换色谱树脂优选为SP柱，所述疏水性色谱树脂优选为苯基柱，并且所述阴离子交换树脂优选为Q柱。
在本发明中，该SP柱是填充有含有磺丙基官能团的材料的柱，所述苯基柱是装有含有苯基基团的材料的柱，且该Q柱是填充有包含四级铵(Q)官能基团的材料的柱。
在本发明的步骤(a)中，含有肉毒杆菌毒素的培养液可以是使用本领域公知的常规方法获得的肉毒杆菌菌株的培养液，也可以通过使用用于培养的常规培养基来进行培养而获得，特别地，使用排除动物源性成分的培养基，优选地，例如，PYG培养基(含有3％的马铃薯蛋白胨、1％的酵母萃取物和1％的葡萄糖)。
本发明中使用的产生肉毒杆菌毒素的菌株可以是肉毒杆菌或其变种，最优选的菌株是A型肉毒杆菌，NCTC13319，但不限于上述菌株。对于本领域技术人员而言，显然可以使用能够产生肉毒杆菌毒素的任何菌株。
在一个具体的实施方案中，本发明的步骤(a)中的预先处理该培养液可以是酸沉淀或超滤经过灭菌(例如，通过深层过滤和/或灭菌过滤)的培养液，但不限于此。
酸沉淀可以是使用硫酸的沉淀或使用盐酸的沉淀，但不限于此。即，本发明的步骤(a)中的酸沉淀可以是在一个实施方案中使用酸(诸如硫酸)或在另一个实施方案中使用盐酸对含有肉毒杆菌毒素的培养液进行酸沉淀，使得，在完成培养之后，将pH调节至3.0至4.5，优选调节至3.3至4.0，以及最优选调节至3.4至3.6。
超滤膜可以是盒型膜或中空纤维膜，但不限于此。即，在本发明的步骤(a)中，超滤可以是使用大小为50kDa至500kDa，优选为100kDa至300kDa的膜以收集合有肉毒杆菌毒素的培养液的超滤。
此外，可以任选地使用DNase、RNase、核酸酶和/或Benzonase以便在预先处理期间去除核酸，但本发明不限于此。
本发明可以包括额外的纯化，以便增加所得肉毒杆菌毒素的纯度。本发明中的纯化是从酸沉淀物中另外去除杂质的步骤，并且可以通过常规方法(诸如已知的微过滤、超过滤、精密过滤或深层过滤)来进行。在本发明的一个实施方案中，可以使用0.1至0.4μm的中空纤维膜来进行微过滤。
在本发明的步骤(b)中，所述阳离子交换色谱包括将溶解在缓冲液中的预先处理的肉毒杆菌毒素与阳离子交换树脂柱结合，该缓冲液具有合适的浓度和pH值以使该肉毒毒素与该柱结合，然后使用具有增加盐浓度的缓冲液来进行洗脱。在阳离子交换色谱中，去除了非复合形式的肉毒杆菌毒素。
在根据本发明的用于纯化肉毒杆菌毒素的方法中，用于阳离子交换色谱的柱优选为填充有具有以下官能团的树脂的柱，该官能团选自由羧甲基(CM)、磺乙基(SE)、磺丙基(SP)、磷酸盐(P)组成的组。
在本发明中，从去除杂质并保持肉毒杆菌毒素的高活性的观点来看，阳离子交换色谱可使用SP柱，优选为SP琼脂糖HP柱、SP琼脂糖FF柱、Capto S柱或其相似物，并且更优选为SP琼脂糖HP柱进行，但不限于此。
在本发明中，SP琼脂糖HP柱是填充含有磺丙基官能团的树脂的柱，该树脂具有6％球形、交联的琼脂糖基质形式，并且基于核糖核酸酶A，具有55mg/mL的DBC，且粒径为34μm。
步骤(b)中的肉毒杆菌毒素溶解在pH为4.5至5.3的10至30mM的柠檬酸钠缓冲液中，然后注入SP柱中。
用补充有0.5至1.5M的氯化钠且pH为4.5至5.5的10至30mM的柠檬酸钠缓冲液来洗脱步骤(b)中的肉毒杆菌毒素，但不限于此。
在本发明的步骤(c)中，该疏水性色谱包括将溶解于缓冲液经由步骤(b)的阳离子交换色谱而洗脱的含有肉毒杆菌毒素的溶液与疏水性色谱柱结合，该缓冲液具有适合的浓度以及使该溶液结合到疏水性色谱柱的pH，然后用具有降低的盐浓度的缓冲液来进行洗脱。在该疏水性色谱中，进一步去除非复合形式的肉毒杆菌毒素。
在本发明的用于纯化肉毒杆菌毒素的方法中，用于疏水性色谱的柱是填充有树脂的柱，该树脂具有选自由乙醚、异丙基、丁基、辛基和苯基组成的组的官能团，但不限于此。
在本发明中，为了有效分离该非复合的蛋白质，可以使用苯基柱来进行疏水性色谱，优选为苯基琼脂糖HP柱、苯基琼脂糖FF(快速流动)柱、Capto苯基柱或其相似物，且更优选为苯基琼脂糖HP柱，但不限于此。
本发明中使用的苯基琼脂糖HP柱是填充树脂的柱，该树脂具有6％的高度交联的琼脂糖基质形式并且具有25μmol苯基/mL的取代程度和粒径为34μm。
在步骤(c)中，该肉毒杆菌毒素溶于补充有1.8至2.2M氯化钠且pH为5.7至6.7的30至70mM磷酸钠缓冲液中，并且可注入苯基柱中，但不限于此。
在步骤(c)中，利用pH为5.7至6.7的30至70mM磷酸钠缓冲液来洗脱该肉毒杆菌毒素，但不限于此。
在本发明的步骤(d)中，该阴离子交换层析法包括将溶解于缓冲液经由疏水性色谱而洗脱的肉毒杆菌毒素与阴离子交换色谱柱结合，该缓冲液具有适合的浓度以及使该肉毒杆菌毒素结合到该柱的pH，然后使用具有增加的盐浓度的缓冲液来进行洗脱。在阴离子交换色谱中，去除其他杂质并且增加900kDa的肉毒杆菌毒素的纯度。
在本发明的用于纯化肉毒杆菌毒素的方法中，用于阴离子交换色谱的柱是填充有树脂的柱，该树脂具有选自由二乙氨乙基(DEAE)、四氨基乙基(QAE)和四级铵(Q)组成的组的官能团，但不限于此。
在本发明中，为了去除其他杂质并且特别增加900kDa的肉毒杆菌毒素的纯度，可以使用Q柱进行阴离子交换色谱，优选为Capto Q ImpRes柱、Toyopearl Super Q 650M柱、Q琼脂糖FF柱、Q琼脂糖高性能(Q琼脂糖HP)柱等，且更优选为Capto QImpRes柱。
本发明中使用的Capto Q ImpRes柱是填充有树脂的柱，该树脂具有包含四级铵(Q)的官能团的高流动性琼脂糖基质，基于BSA的总离子容量为0.15至0.18mmol(Cl-)/mL，以及粒径为40μm。
步骤(d)中的肉毒杆菌毒素溶于pH为5.7至6.7的40至60mM磷酸钠缓冲液中，然后注入Q柱中，但不限于此。
在步骤(d)中，可以用pH为5.7至6.7的40至60mM的柠檬酸钠缓冲液来洗脱肉毒杆菌毒素，该缓冲液补充有0.8至1.2mM氯化钠，但不限于此。
通过上述方法纯化的肉毒杆菌毒素可以是纯度至少为99％的A型肉毒杆菌毒素，并且纯化的肉毒杆菌毒素可以具有比通过常规方法纯化的肉毒杆菌毒素更高的纯度。
该肉毒杆菌毒素可衍生自A型肉毒杆菌，NCTC13319，但不限于此。
如本文所用，术语″级分″是指包含至少一种目标分子的一组穿透物质，其通过分离方法进行分离和收集，其中生物药剂中包含该至少一种目标分子(诸如肉毒杆菌毒素)和一种或多种杂质，该至少一种目标分子穿过结合到一种或多种杂质的物质，并且该目标分子通常不与该物质结合(即，流经该物质)或与该物质结合，然后被洗脱。
如本文所用，术语″纯化″是指通过从某种物质中去除共存的杂质来提高纯度的操作，并且在本说明书中，纯化是指从肉毒杆菌的培养物中分离出当生长过度的肉毒杆菌死亡时产生的肉毒杆菌毒素，以及意指在肉毒杆菌毒素生产过程中提高纯度的过程。
实施例
在下文中，将参考多个实施例更详细地描述本发明。然而，对于本领域技术人员而言，显而易见的是提供的这些实施例仅出于阐明本发明的目的，而不应解释为限制本发明的范围。
实施例1：样品和实验材料的制备
1-1、样品制备
本发明中使用的肉毒杆菌菌株是A型肉毒杆菌，NCTC13319，并且该菌株首先接种到500mL的PYG培养基(马铃薯蛋白胨3％、酵母提取物1％、葡萄糖1％)中，并且在厌氧条件下在34±1℃在ReadytoProcess WAVE 25培养箱中培养12到24小时。培养后，当该菌株的生长达到对数期时，将100mL的菌株接种到5L的PYG培养基中，并在厌氧条件下在ReadytoProcess WAVE 25培养箱中培养40至72小时。使用灭菌过滤器对该培养液进行灭菌，仅回收该培养液。使用3N硫酸将该培养液滴定至pH 3.5，观察沉淀，然后将所得物以冷藏状态保存16小时或以上。
1-2、实验材料的制备
本发明中使用的实验材料如下：纯水(超纯水或质量等于或高于超纯水的水)、丁基琼脂糖HP(GE Healthcare，175432)、Q-琼脂糖-HP(GE Healthcare，171014)、苯基琼脂糖HP(GE Healthcare，171082)、Q-琼脂糖-FF(GE Healthcare，170510)、SP-琼脂糖-FF(GEHealthcare，170729)、DEAE-FF(GE Healthcare，170709)、SP-琼脂糖-HP(GE Healthcare，171087)、Capto Q ImpRes柱(GE Healthcare，175470)、柠檬酸(Merck，1.37002.5000)、脱水柠檬酸三钠(Merck，1.37042.5000)、磷酸二氢钠(Merck，1.06349.1000)、磷酸氢二钠(Merck，1.06585)以及氯化钠(Merck，1.37017.5000)。
实施例2：肉毒杆菌毒素的纯化
2-1、微过滤
打开微过滤设备，AKTA flux 6(GE Healthcare)，并且将0.2μm的中空纤维连接至该微过滤设备。将5L的蒸馏水加入至该微过滤设备中，并且以0.3的TMP将设备和中空纤维洗涤两次。将实施例1-1中制备的5L肉毒杆菌毒素培养液的硫酸沉淀物注入至微过滤设备中，并在0.3的TMP下以两步骤浓缩至1L，将2L的DW添加至该浓缩物中，且在将2L的DW添加至该浓缩物之后，重复5次以进一步从3L浓缩至1L。添加500mL的200mM柠檬酸钠(pH 5.5)，并通过循环进行提取1小时30分钟。该提取物通过该微过滤设备的渗透线(permeate line)回收，并将300kDa截短的中空纤维连接到该微过滤设备。将提取物加入至该微过滤设备中，并以0.3bar的TMP浓缩至500mL、回收并在4℃下保存。
2-2、阳离子交换色谱
将SP-HP树脂装载在HiScale 50/20柱(GE Healthcare，28964445)中，装载高度为8至12cm，然后安装在AKTA纯化系统中。经由流动平衡/洗涤缓冲液(20mM柠檬酸钠，pH 4.8)来平衡该柱。利用1M柠檬酸将实施例2-1中制备的样品的pH调节至4.8，并在2,000mL的蒸馏水中稀释5倍。以15mL/min注入该样品。注入样品后，用380mL的平衡/洗涤缓冲液(20mM柠檬酸钠，pH 4.8)来洗涤该柱。洗涤后，根据步骤(1)5CV、30％梯度(线性梯度)和步骤(2)3CV、100％梯度(步长梯度)注入平衡/洗脱缓冲液，并且依次获得多个50mL级分(参见表1)。依次获得总共31个级分，并通过SDS-PAGE鉴定每个级分。
表1
| 柱树脂 | SP琼脂糖HP |
| 柱体积 | 190mL |
| 结合和洗涤缓冲液 | 20mM柠檬酸钠/0.5M氯化钠，pH 4.8 |
| 洗脱缓冲液 | 20mM柠檬酸钠/1M氯化钠，pH 4.8 |
结果如图1所示。从总共31个级分中的级分10至21中检测到HA33，并从相应级分中纯化出900kDa的复合物形式的肉毒杆菌毒素。
2-3、疏水性色谱
将苯基-HP树脂装载在HiScale 26/20柱(GE Healthcare，28964514)中，装载的高度为7至11em，然后安装在AKTA纯化系统中。经由流动平衡/洗涤缓冲液(50mM磷酸钠、2M氯化钠，pH 6.2)来平衡该柱。收集到总共600mL从实施例2-2的SP琼脂糖HP柱洗脱的级分10至21，并且用1M磷酸氢二钠溶液将pH调节至6.2。在pH为6.2的情况下，以8mL/min注入添加了600 mL的50mM磷酸钠和4M氯化钠的样品。注入后，利用94mL平衡/洗涤缓冲液(50mM磷酸钠，2M氯化钠，pH 6.2)来洗涤柱。洗涤后，根据步骤(1)10CV、100％梯度(线性梯度)和步骤(2)3CV、100％的梯度(步长梯度)注入该平衡/洗脱缓冲液，并且依次获得总共27个23mL级分，并通过SDS-PAGE来鉴定每个级分。
表2
| 柱树脂 | 苯基琼脂糖HP |
| 柱体积 | 47mL |
| 结合和洗涤缓冲液 | 50mM磷酸钠/2M氯化钠，pH 6.2 |
| 洗脱缓冲液 | 50mM磷酸钠，pH 6.2 |
结果如图2所示，在总共27个级分中，从级分16至23中检测到900kDa的肉毒杆菌毒素复合物。
2-4、阴离子交换色谱
将Capto-Q ImpRes树脂装载在Omnifit 6.6/25柱(Diba，006EZ0625AA)中，堆栈的高度为8至12cm，然后安装在AKTA纯化系统中。使用透析膜(Spectra/Por，132680)，利用50mM磷酸钠(pH 6.2)缓冲液对从实施例2-3的苯基琼脂糖HP柱中洗脱的总共16mL的级分16至23进行100次透析过滤(DF)。经由流动平衡/洗涤缓冲液(50mM磷酸钠，pH 6.2)来平衡该柱。以1mL/min注入实施例2-3中制备的样品。注入后，利用1mL平衡/洗涤缓冲液(50mM磷酸钠，pH 6.2)来洗涤柱。洗涤后，根据步骤(1)2CV、15％的步长梯度、步骤(2)2CV、20％的步长梯度、步骤(3)2CV、30％的步长梯度和步骤(4)2CV、100％的步长梯度注入平衡/洗脱缓冲液，然后进行洗脱。依次获得总共29个1mL的级分，并通过SD S-PAGE来鉴定每个级分。
表3
| 柱树脂 | 卡普托Q伊普瑞斯 |
| 柱体积 | 3.6mL |
| 结合和洗涤缓冲液 | 50mM磷酸钠，pH 6.2 |
| 洗脱缓冲液 | 50mM磷酸钠/1M氯化钠，pH 6.2 |
结果如图3所示，在总共29个级分中，在级分7至10中检测到不合杂质(红色圆圈)的900kDa复合物肉毒杆菌毒素。
实施例3、标准产品与纯化产品的比较
将实施例2中纯化的含有肉毒杆菌毒素的级分7至10和市售的肉毒杆菌毒素C-BoNT/A1(目录号3102，miprolab)在50mM的磷酸钠缓冲液(pH 6.2)中分别稀释至1毫克/mL的浓度。在表3所示的还原和非还原条件下制备用于上样的样品。在具有4至20％顺式甘胺酸(Invitrogen，NP04200BOX)的10孔Novex楔型孔盘中对样品进行电泳，将约30mL的Instant Blue染色试剂添加至此，并将样品在振荡器上染色60分钟。完全去除染色试剂，并在振荡器上将样品洗涤5次或更多次，其中添加约30mL的纯化水，持续30分钟。当背景被充分去除并且可以检测到条带时，使用图像分析仪分析凝胶。
表4
结果，如图4所示，经由本发明的纯化方法纯化的肉毒杆菌毒素在与市售肉毒杆菌毒素相同的位置被鉴定，这表明本发明的纯化方法可以准确地纯化仅仅感兴趣的目标蛋白。
实施例4、本发明的肉毒杆菌毒素的标准产物和纯化产物之间活性的比较
比较经由实施例2纯化的肉毒杆菌毒素和市售的肉毒杆菌毒素Botoxin(Allergan公司，100单位)之间的活性。
根据每个样品的浓度，将每个样品首先稀释2×105至3×105倍，然后将1.45mL的样品在4.4mL的生理盐水中稀释。以上述相同的方式稀释10组后，将0.1mL的样品腹膜内注射到每组10只雌性ICR小鼠(18至22g)中，并检测3天的致死率。通过概率统计分析获得LD50。
结果显示，由本发明纯化的1ng肉毒杆菌毒素和Allergan公司的肉毒杆菌毒素的活性分别为40.73个单位和25.32个单位，并且根据本发明的纯化方法可以在不降低肉毒杆菌的活性的情况下进行。
实施例5、比较其它公司的纯化方法获得的纯度
本发明分析了根据由肉毒杆菌毒素的领先制造商Allergan公司提交的韩国专利申请号10-2013-0092024中描述的纯化方法纯化的肉毒杆菌毒素的纯度。结果，如图5所示，除了主峰外，还检测到较小的杂质，且900kDa的蛋白质并没有与150kDa、300kDa或500kDa的蛋白质有效分离。
此外，分析了根据Allergan公司提交的美国专利申请号第11/932789的纯化方法纯化的肉毒杆菌毒素的纯度。结果，除了主峰之外，还检测到较大的杂质，如图6所示。这意味着形成了非期望的沉淀物，并且可以预期纯化方法影响蛋白质结构。
另一方面，从图7的结果可以看出，本发明能够特异性纯化仅约900kDa的毒素，并且纯化过程中毒素的修饰也减至最小。
在表5所示的条件下，通过HPLC来分析纯化的肉毒杆菌毒素的纯度。
表5
| 项目 | 条件 |
| 柱 | PROTEIN KW-804 |
| 尺寸 | 8mm×300mm |
| 固定相 | 用于色谱R的硅胶(7μm) |
| 温度 | 25℃ |
| 流动相 | 50mM磷酸钠，pH 6.0，0.15M氯化钠 |
| 流动速率 | 1.0mL/min |
| 运行时间 | 30分钟 |
| 检测器 | UV检测器，278nm |
| 注射体积 | 20μL |
实施例6、先前专利中的三步骤色谱法与本发明的纯化方法的比较
比较了先前专利(美国专利公开号2019-0201505号和美国专利号7,452,697)中公开的用于纯化肉毒杆菌毒素的树脂的纯化方法和本发明中使用不同类型的树脂的纯化方法之间的经纯化的肉毒杆菌毒素的纯度和滴度(表6)。
根据表5的方法，通过HPLC来检测纯度，并基于小鼠试验以蛋白质浓度为1mg/mL的3天死亡小鼠的数量的结果，使用CombiStats通过Probit统计分析来计算滴度。
表6
实验实施例和比较实施例中分别使用的柱的类型和纯化条件示于表7至表8中。
表7
比较实施例1(丁基-HP→Q-HP→苯基-HP)
| 柱 | 丁基-HP(直径：0.66cm，高度：12cm) |
| 柱容积 | 4.11mL |
| 结合和洗涤缓冲液 | 50mM磷酸钠/2M氯化钠，pH 6.2 |
| 洗脱缓冲液 | 50mM磷酸钠，pH 6.2 |
| 洗脱条件 | 2-0M氯化钠10CV，0M氯化钠5CV |
| 柱 | 苯基-HP(直径：0.66cm，高度：12cm) |
| 柱容积 | 4.11mL |
| 结合和洗涤缓冲液 | 50mM磷酸钠/2M氯化钠，pH值为6.2 |
| 洗脱缓冲液 | 50mM磷酸钠，pH值为6.2 |
| 洗脱条件 | 2至0M氯化钠10CV，0M氯化钠5CV |
表8
比较实施例2(Q-FF(FT)→丁基-HP→SP-HP)
结果，从表9中可以看出，根据实验实施例纯化的肉毒杆菌毒素(本发明的纯化方法)产生了99.4％的高纯度，并且根据比较实施例1纯化的肉毒毒素的纯度和滴度都低于实验实施例。比较实施例2具有非常低的纯度和滴度。因此，这些结果表明，通过本发明的方法纯化的肉毒杆菌毒素具有比通过常规方法纯化的肉毒杆菌毒素明显更高的纯度和滴度。
表9
尽管已经详细描述了本发明的特定配置，但本领域技术人员将理解，提供本发明是出于举例说明的目的而提出的多个优选的实施例，并且不应被解释为限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围由所附权利要求书和其等同物限定。
工业适用性
本发明通过简单的阳离子交换层析、疏水层析、阴离子交换层析等工艺，纯化后肉毒毒素的纯度得到提高，其活性也能很好地保持，将有益于肉毒杆菌毒素的生产。
Claims (14)
1.一种纯化肉毒杆菌毒素的方法，该方法包括：
(a)预先处理含有肉毒杆菌毒素的培养基溶液；
(b)使用阳离子交换色谱来纯化预先处理的肉毒杆菌毒素；
(c)使用疏水色谱来纯化该肉毒杆菌毒素；以及
(d)利用阳离子交换色谱来纯化该肉毒杆菌毒素。
2.根据权利要求1所述的方法，其中使用SP柱进行步骤(b)中的阳离子交换色谱。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述SP柱选自由SP琼脂糖HP柱、SP琼脂糖FF柱和Capto S柱组成的组。
4.根据权利要求2所述的方法，其中将步骤(b)中的肉毒杆菌毒素溶于pH为4.5至5.5的10至30mM的柠檬酸钠缓冲液中，然后注入所述SP柱中。
5.根据权利要求2所述的方法，其中利用pH为4.5至5.5的30至70mM的柠檬酸钠缓冲液来洗脱步骤(b)中的该肉毒杆菌毒素，其中该磷酸钠缓冲液补充有0.5至1.5M的氯化钠。
6.根据权利要求1所述的方法，其中使用苯基柱来进行步骤(c)中所述疏水色谱。
7.根据权利要求6所述的方法，其中该苯基柱是选自于由苯基琼脂糖HP柱、苯基琼脂糖FF(快速流动)柱和Capto苯基柱组成的组。
8.根据权利要求6所述的方法，其中将步骤(c)中的肉毒杆菌毒素溶于pH为5.7至6.7的30至70mM的磷酸钠缓冲液中，然后注入所述苯基柱中。
9.根据权利要求6所述的方法，其中利用pH为5.7至6.7的30至70mM的磷酸钠缓冲液来洗脱步骤(c)中的该肉毒杆菌毒素。
10.根据权利要求1所述的方法，其中使用Q柱来进行步骤(d)中的阳离子交换色谱。
11.根据权利要求10所述的方法，其中该Q柱选自于由Capto Q ImpRes柱、ToyopearlSuper Q650M柱、Q琼脂糖FF柱和Q琼脂糖HP柱组成的组。
12.根据权利要求10所述的方法，其中将步骤(d)中的肉毒杆菌毒素溶于pH为5.7至6.7的40至60mM的磷酸钠缓冲液中，然后注入所述Q柱中。
13.根据权利要求10所述的方法，其中利用pH为5.7至6.7的40至60mM的磷酸钠缓冲液来洗脱步骤(d)中的肉毒杆菌毒素，其中该磷酸钠缓冲液补充有0.8至1.2mM氯化钠。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述纯化的肉毒杆菌毒素是具有99％或更高纯度的A型肉毒杆菌毒素。
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