KR20160127028A

KR20160127028A - 다당류를 정제하는 신규한 다운스트림 방법

Info

Publication number: KR20160127028A
Application number: KR1020167025139A
Authority: KR
Inventors: 다빈더 길; 마노즈 쿠마르 치카라; 산딥 샤르마; 사르마드 하니프; 니라지 조시
Original assignee: 엠에스디 웰컴 트러스트 힐레맨 랩스 피브이티. 리미티드
Priority date: 2014-02-25
Filing date: 2015-02-24
Publication date: 2016-11-02
Also published as: EP3110851A1; ZA201605453B; BR112016019608B1; WO2015128798A1; CN106062006A; CN106062006B; MY186874A; BR112016019608A2; US20170051080A1; US10011662B2

Abstract

본 발명은 세균성 다당류를 정제하는 새로운 방법에 관한 것이다. 본 발명은 백신, 더욱 특히 수막염균(N. meningitidis) 감염용 접합체 백신을 제조하기 위해 그 자체로 또는 유도체화된 형태로 사용될 수 있거나 다른 분자에 연결될 수 있는, 수막염균(Neisseria meningitidis) 혈청그룹 유형 C (MenC) 다당류로부터 불순물을 제거할 수 있는 효과적이고 규모 확장 가능한 방법에 관한 것이다.

Description

다당류를 정제하는 신규한 다운스트림 방법{A NOVEL DOWNSTREAM PROCESS FOR PURIFYING POLYSACCHARIDES}

본 발명은 수막염균(Neisseria meningitidis) 다당류의 신속한 정제 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게, 본 발명은 그 자체로 또는 유도체화 형태로 사용되거나 다른 혈청그룹과 조합되어 수막염균용 백신을 제조할 수 있는 수막염균(N. meningitidis) 혈청그룹 유형 C(MenC) 다당류의 제조방법에 관한 것이다.

다당류(polysaccharide), 특히 항원성 다당류는 백신의 제조에 사용되고 있다. 하나 이상의 다당류 및 이들의 접합체를 함유하는 일가, 이가 및 다가 백신은 폐렴연쇄상구균(Streptococcus pneumoniae), 헤모필루스 인플루엔자균(Haemophilus influenzae) 및 수막염균(N. meningitidis)과 같은 다양한 미생물에 의해 야기되는 특정 질병 또는 감염의 예방용으로 시장에서 입수가능하며 또한 각각의 질병을 유의적인 정도로 예방하는데 가치가 있음이 입증되었다. 백신 프리베나(Prevenar)의 도입 후에 수년간 모여진 감시자료는 예상되는 바와 같이 미국(US) 유아들에 있어서 침습적 폐렴구균 질환의 감소를 명확하게 입증하고 있다. 이들 다당류 및 접합체에 대해 수행된 다수의 연구들에도 불구하고, 계속적인 연구로 입증되는 바와 같이 다당류의 수율 뿐만 아니라 품질(순도)를 향상시킬 필요성이 당해 분야에 항상 존재하고 있다.

수막염(meningitis)은 세계적 위협으로 간주되며 이의 질병부담은 공중보건 우선순위로 여전히 남아있다. 수막염의 임상적 정의는 수막(뇌의 막)의 염증이다. 치료하지 않으면, 이 질병은 치명적인 결말을 가질 수 있다. 수막염균(N. meningitidis)에는 총 13개의 혈청그룹이 동정되었는데, 이들 13개 중에서 6개의 혈청그룹(A, B, C, W135, X 및 Y)이 전세계적인 전염을 야기하는 것에 대한 대부분의 책임이 있다. 수막염균은 일과성 경증 인후염에서부터 치명적 수막염 또는 수막구균성 패혈증까지, 광범위한 임상 증상을 갖고 있다. 수막염 및 패혈증은 이 질병의 가장 일반적인 양상이다.

다수의 연구 결과를 통해 수집된 증거는 다당류 접합체 백신의 면역원성 측면을 규정한다. 더욱이, Men C의 협막 다당류의 제조 및 정제를 기술하는 연구 문헌 뿐만 아니라 특허들이 있지만, 이들 중 어느 것도 극도로 감소된 스케쥴(timeline)을 가지면서 강하고 규모 조절가능하고 재현가능한 정제공정을 규정하지 못하고 있다.

정제된 Men C의 제조는 접합체 백신으로서 캐리어 단백질과의 유효한 접합체 및 이의 발현을 위한 최우선 필요조건이다. Men C의 배양 및 정제를 위한 비용은 일반적으로 높고, 일련의 제조 및 정제 단계들을 포함하기 때문에 긴 작업 시간을 수반한다. 다당류의 제조 단계들 중의 하나 이상이 향상되면 접합체 백신의 전체 제조 공정에도 상당한 변화를 가져올 것이며, 그 결과 이 방법을 비교적 비용 효율적으로 만들게 된다.

그러나, 이들 다당류에 대해 수행되어진 다수의 연구에도 불구하고, 고품질의 백신을 제조하기 위해 다당류의 수율 뿐만 아니라 품질/순도를 향상시킬 필요성이 항상 존재하고 있다.

Men C 다당류의 정제 방법을 기술하는 특허들이 다수 존재한다. Men-C 다당류를 CTAB로 침전시키는 미국특허 7,491,517 B2에 기술되어 있는 현재의 기술수준은 4℃에서 하룻밤 인큐베이션을 포함하는 것으로 나타난다. 또한 오염물의 제거에 비싼 효소 프로테이나제 케이의 사용을 필요로 한다. 그 이외에도, 이 방법은 Men-C 다당류의 정제를 위해 겔 여과를 또한 필요로 한다. 전체적인 과정은 정제를 위해 상당한 시간을 필요로 하며, 또한 공정은 효소의 사용으로 인해 비용이 높아진다.

또, 국제출원 WO2011/148382 Al는 헤모필루스 인플루엔자균 B형(Haemophilus influenzae b), 혈청그룹 A, C, Y, W-135와 같은 수막염균의 협막성 다당류의 정제를 위해 알루미늄 포스페이트 및 알콜을 사용하여 순수한 협막성 다당류를 제조하는 방법을 기술하고 있는데, 제조된 다른 유사한 협막성 다당류는 그램 음성 및 그램 양성 미생물 둘 모두를 형성한다. 상기 발표된 선행기술은 다당류의 정제를 위해 16 내지 20시간을 개시하고 있다.

다른 특허 EP 0658118B1는 평균시간 16시간으로 그룹 C 수막구균성 다당류(GCMP)를 O-탈아세틸화하는 방법을 기술하고 있다. 이 방법은 또한 상당한 정제 시간을 요구한다.

현재, Men C 다당류의 제조 및 정제를 위해 사용되는 다양한 방법들은 배양 및 정제 시간이 비교적 길며 또한 고가의 효소들의 사용을 수반한다. 비록 이런 종류의 공정들이 순수한 다당류를 제공하지만, 이들은 스케일-업 시에 제조 비용을 동시에 증가시킬 것이다.

더욱이, 상기 개시된 선행기술들은 저온에서 더욱 효율적이고 이에 따라 제어된 환경을 필요로 하여 연구 및 제조 시에 비용의 추가를 초래하는 방법을 교시하고 있다.

따라서 본 발명의 주목적은 Men C 다당류를 정제하는 신규한 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 간단하고, 효율적이고 향상되고 상업적으로 규모 확장 가능한 방법에 의해 매우 짧은 시간 내에 불순물을 제거하면서 Men C 다당류를 신속하게 정제하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또다른 목적은 관련 WHO 규격을 충족하는 고품질 다당류를 제조하는 것이다.

본 발명은 Men C 다당류의 정제방법에 관한 것이다. 이 방법은 Men C 다당류가 상당히 감소된 시간으로 정제되는, 신규하고, 신속하고, 비용 효율적이고 규모 확장가능한 방법을 기술한다.

본 발명의 방법은 면역학적으로 활성인 박테리아 균주를 선택하고, 상기 면역학적으로 활성인 균주의 증식용 배지를 준비하고, 선택된 박테리아 균주를 글리세롤 스톡 배양 배지에 접종하고, 이를 소정의 온도에서 최적 시간 동안 미리 설정된 분당회전수(rpm)로 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 상기 선택된 박테리아 균주는 발효기에서 최적 배양 배지 상에서 배양되며, 이 공정은 발효된 산물의 원심분리를 수행하여 세포 잔사들의 발효 브로스(FB)를 정화시킨 다음, 분자량 컷오프 멤브레인을 이용하여 한외여과에 의해 FB를 농축함으로써 진행된다.

다음에 상기 한외여과된 농축 상층액 또는 처리된 FB를 고농도 알카리 용액의 존재 하에 고온에서 탈아세틸화 한다. 탈아세틸화된 조 다당류는 접선유동여과(Tangential Flow Filtration, TFF)를 통해 버퍼 교환을 수행한다. 투석여과된 탈아세틸화 조 다당류를 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)로 추가로 정제한 다음, 투석여과(diafiltration) 및 농축하여 최종 정제된 다당류를 얻는다. 농축된 추출물 및/또는 단리된 박테리아 세포를 염기성 용액으로 처리하는 단계를 포함하는 본 발명에 따른 방법이 특히 관련이 있다. CPS를 추출하는 것 외에도, 염기 추출은 N-아세틸기의 탈아세틸화를 또한 야기한다. 탈세틸화의 정도는 반응 조건을 조절함으로써 변화될 수 있다. 이어서 추출된 CPS는 세포 성분들로부터 분리하여, 바람직하게는 크로마토그래피 분리에 의해 CPS를 수득한다.

본 방법은 Men C 다당류의 새로운 및 신속한 제조방법을 제공하는 등 선행기술보다 여러가지 이점을 나타낸다. 본 방법은 총 공정수를 감소시키고 단일 크로마토그래피 스크리닝을 필요로 하기 때문에 비용효율이 높다. 추가의 이점은 이 방법은 전체적으로 규모확장 가능하다는 점이다.

도 1은 MenC-PS 정제 및 회수를 위한 공정 흐름을 도시한다.
도 2는 MenC-PS의 HPLC 크로마토그램을 도시한다.
도 3은 MenC-PS의 NMR 스펙트럼을 도시한다.

본 발명은 도 1에 도시된 바와 같이 MenC 다당류(MenC-PS)의 정제를 더 적은 시간으로 가능하게 할 수 있도록 최적화된 2단계를 개시한다.

세균성 다당류의 균주는 세균증식에 요구되는 적절한 배지 성분들을 함유하는 발효기에서 접종한다. 실질적인 세균증식을 나타내는 8 내지 10 범위에서 최대 광학 밀도를 달성한 후에, 미리 필요한 농도의 포름알데히드를 첨가하여 정지시키고 그 결과 FB를 수득한다. 다음에, FB를 고속으로 원심분리하여 세포 잔사의 FB를 정화한 다음, 분자량 컷오프 멤브레인을 이용하여 투석여과(diafiltration) 및 농축한다.

조 다당류를 갖는 투석여과 및 농축된 FB는 탈아세틸화를 위해 예를들어 최대 80℃의 고온에서 NaOH로써 처리한다. 조 다당류의 농축 및 투석여과는 밀리큐 워터(milliQ water, MQW) 및 폴리에테르 술폰(PES) 멤브레인을 사용하여 수행한 다음, 트리스 HCl 완충액 pH 7.4 ± 0.1을 사용하여 수행된다. 투석여과 후, 조다당류를 농축하고 0.22㎛ 필터로 여과한다.

탈아세틸화된 조 다당류를 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 기법으로 더 정제한다.

극성의 차이에 기초하여 혼합물의 두 개 이상의 성분들을 분리하는 것은 당업자들에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 소수성 상호작용 크로마토그래피를 이용하면, 상대적으로 더 많은 소수성을 갖는 화합물들이 더욱 친수성인 화합물들에 비해 컬럼 상에 더 길게 잔류한다. 역으로, 친수성 상호작용 크로마토그래피를 이용하면, 친수성 화합물들은 더욱 소수성인 화합물들에 비해 컬럼 상에 더 길게 잔류한다. 이들 두 가지 방법을 연속적으로 사용하면, 대상 화합물에 비해 더 적은 극성을 갖는 불순물과 더 많은 극성을 갖는 불순물의 제거를 가능하게 한다.

베이스 추출제 중에 존재하는 추출된 CPS는 세포 성분들로부터 생기는 불순물로부터 크로마토그래피로 분리할 수 있다. 크로마토그래피 분리방법의 비제한적인 예로는 이온교환(양이온 또는 음이온), 친수성-상호작용, 소수성-상호작용 또는 겔-투과 크로마토그래피가 있다. 페닐 세파로스에서의 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)가 더욱 바람직한데, 이것은 대부분의 고분자량, UV 활성 오염물들을 베이스 추출물로부터 제거할 것이다. 협막성(capsular) 다당류는 초기에 용출되지만, 더 많은 소수성 단백질 및 핵산들이 잔류할 것이다. 본 발명에서 바람직한 방법은 소수성 상호작용 크로마토그래피이다.

다당류의 추가 농축 및 투석여과를 수행하여 단백질 및 다른 불순물들의 제거를 촉진한 다음, 다당류 시료를 MQW로 세척한다.

그 결과, 살균 여과를 수행하여 도 2 및 도 3에 도시된 정제된 Men C 다당류를 수득한다.

상기에서 사용된 과정들의 확인은 정제된 다당류 규격이 WHO 기준을 충족한다는 것을 명확하게 보여주는 표 1로부터 편리하게 이해될 수 있다.

WHO 규격에 따른 정제된 Men C 다당류 규격은 이하에 나타낸다.
시험	Men C-PS	WHO 규격
다당류 함량	4mg/ml	실제 수치
시알산 함량	100%	Men C의 시알산 함량은 건조중량의 80% 이상
엔도톡신	<0.06 EU/㎍	100 EU/㎍ 미만
단백질 %	0.14%	1% 이하
핵산 %	0.42%	1% 이하
평균 상대분자량	351kd	HPLC 실측치
동정	양성	특정 혈청들과의 양성 응집 반응; ¹H-NMR 스펙트럼으로 정의

Men C 다당류를 정제하는데 요구되는 시간이 선행기술에 개시된 것들보다 유의적으로 더 적으며, 본 발명의 특징은 6±1 시간 내에 종료할 수 있는 신규하고, 신속하고 규모확대 가능한 정제 공정 프로토콜이고, 이렇게 하여 제조된 PS가 WHO 설정 표준에 부합한다는 관찰 결과가 특히 흥미롭다.

분석 절차:

상이한 단계들에서 수득된 다당류는 그들의 순도 및 수율에 대해 항상 모니터링하고 분석한다. 상이한 분석절차들이 보고되어 있지만, 바람직한 것은 이하에 요약된다:

Men C-PS의 총 시알산은 비색법(colorimetric method)으로 결정된다. 어세이는 염산 및 구리(II) 이온의 존재 하에 100℃에서 30분 동안 시알산 및 레조르시놀의 반응에 기반하며; 이것은 564 nm에서 강한 흡광도를 나타내는 청자색 복합체의 형성을 유도한다. 시알산 총농도는 일련의 시알산 표준 [(Svennerholm, 1957)]을 사용하여 수득된 검정 곡선으로부터 결정된다. 리포다당류(LPS)는 소형의 간단한 Endosafe^®-PTS^TM를 이용하여 결정한다. 단백질 불순물은 표준으로 소혈청 알부민을 사용하는 로리법[(Lowry et ah, 1951)]에 의해 결정되며 또한 흡광도는 750 nm에서 얻는다. 핵산(NA)은 260nm에서 평가하며, 그 양은 흡광도 1.0 A = 50 ㎍/mL를 가정하여 계산한다 [(Frasch, 1990)].

HibPRP의 상대적 평균 분자량(Mw)은 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)(Alliance, Waters)를 이용하여 결정된다. 사용된 컬럼은 직렬의 PWXL-4000 및 PWXL-5000(Tosoh Bioscience)이다. 더욱이, 5 kD 내지 800 kD 범위의 풀루란(Pullulan)(Shodex)을 Men C-PS용 표준으로서 사용한다. HPLC는 0.1M 소듐나이트레이트를 사용하여 실행시간 30분 및 흐름속도 1ml/분으로 수행한다. Men C-PS의 동정은 1H-NMR 분광법으로 입증된다. NMR은 자기 민감성 핵(예를 들면, 1H)의 스펙트럼을 생기게 한다.

MenC-PS는 각각의 다당류에 대해 참조 항혈청과 결합시켜 혈청학적으로 동정한다. 순도를 결정하고 다당류를 특징화하는 WHO 규격[WHO, 2004]은 건조 중량 기준을 기반으로 하기 때문에, Men C-PS를 먼저 동결건조한 다음에 시험하게 된다. 그래서 수분 함량을 감하여 정확한 건조중량을 얻는다. 동결건조된 케이크의 수분 함량은 Perkin Elmer의 열중량분석기(TGA)로 결정한다. Men C-PS의 분석결과는 표 1에 나타내며 WHO에 명시된 바에 따른다.

상기 Men C 다당류는 다당류-단백질 접합체 백신을 제조하기 위해 사용될 수 있다.

위에서 상술한 본 발명의 다양한 양태들은 이하에 비제한적인 실시예에 의거하여 설명된다.

실시예-1

음이온성 세정제 및 트리스 완충액을 사용한 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)로의 다당류 정제:

투석여과 및 농축된 조다당류를 갖는 FB를, 0.3% 내지 0.6%(w/v)의 농도의 소듐 데옥시콜레이트와 같은 음이온성 세정제로 처리하고, 50℃ 내지 60℃에서 1시간 인큐베이션하였다. 다음에, 40℃ 미만으로 냉각한 다음, 6 내지 8 부피의 밀리큐 워터(MQW) 및 0.1㎡ 폴리에테르 술폰(PES) 멤브레인을 이용하여 조다당류를 농축하고 투석여과하였다.

다음에, 조다당류에 대해 0.5M 수산화 나트륨(NaOH)을 사용하여 50℃에서 10시간 동안 탈아세틸화를 수행하였다. 그 후, 40℃ 미만으로 냉각한 다음, 6 내지 8 부피의 밀리큐 워터(MQW) 및 20mM 트리스 HCL 완충액을 동시에 사용하여 0.1㎡ PES 멤브레인으로 조다당류를 투석여과 및 농축하였다. 그 후에, 다당류를 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC), 예를 들면 페닐 세파로스 6 패스트 플로우에 의해 추가로 정제한다. 마지막으로, 상기 정제된 다당류의 농축 및 투석여과를 0.1㎡ PES 멤브레인 및 6 내지 8 부피의 MQW를 사용하여 수행하였다. 이에 따라, 살균 여과를 0.22㎛ 필터로 수행하고 최종 정제된 다당류를 -20 ℃에서 보관하였다. 상기 공정을 사용하여 HIC 크로마토그래피를 포함한 다당류를 정제하는데 걸린 총시간은 16 내지 18시간이었다.

실시예-2:

음이온성 세정제 및 HEPES 완충액(4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산)을 사용한 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)로의 다당류 정제:

투석여과 및 농축된 조다당류를 갖는 FB를, 음이온성 세정제, 예를 들면 0.3% 내지 0.6%(w/v)의 농도의 소듐 데옥시콜레이트로 처리하고, 50℃ 내지 60℃에서 1시간동안 인큐베이션하였다. 그 후, 40℃ 미만으로 냉각한 다음, 0.1㎡ 폴리에테르 술폰(PES) 멤브레인 및 6-8 부피의 MQW를 사용하여 조다당류를 농축하고 투석여과하였다.

이어서, 0.5M 수산화 나트륨(NaOH)를 사용하여 50℃에서 10시간 동안 조다당류에 대한 탈아세틸화를 수행하였다. 그 후, 40℃ 미만으로 냉각한 다음, 6 내지 8 부피의 밀리큐 워터(MQW) 및 3M NaCl을 함유하는 20mM HEPES를 동시에 사용하여 0.1㎡ PES 멤브레인으로 조다당류를 투석여과하고 농축하였다. 그 후에, 다당류를 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC), 예를 들면 페닐 세파로스 6 패스트 플로우에 의해 추가로 정제한다. 정제된 다당류의 농축 및 투석여과를 0.1㎡ PES 멤브레인 및 6 내지 8 부피의 MQW를 사용하여 수행하였다. 이에 따라, 살균 여과를 0.22㎛ 필터로 행하고 최종 정제된 다당류를 -20 ℃에서 보관하였다. 상기 공정을 사용하여 HIC 크로마토그래피를 포함하여 다당류를 정제하는데 걸린 총시간은 16 내지 18 시간이었다.

실시예 3:

수산화나트륨 및 HEPES 완충액((4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산)를 사용한 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)로의 다당류 정제:

투석여과 및 농축된 조다당류를 갖는 FB를, 0.8M NaOH를 사용하여 6시간 동안 80℃에서 탈아세틸화하였다. 그 후, 40℃ 미만으로 냉각한 다음, 6 내지 8 부피의 MQW 및 3M NaCl을 함유하는 20mM HEPES 완충액을 동시에 사용하여 0.1㎡ PES 멤브레인으로 조다당류를 투석여과하고 농축하였다. 그 후에, 다당류를 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC), 예를 들면 페닐 세파로스 6 패스트 플로우에 의해 추가로 정제한다. 정제된 다당류의 농축 및 투석여과를 6 내지 8 부피의 MQW를 사용하여 0.1㎡ PES 멤브레인으로 수행하였다. 이에 따라, 살균 여과를 0.22㎛ 필터로 수행하고 최종 정제된 다당류를 -20℃에서 보관하였다. 상기 공정을 사용하여 HIC 크로마토그래피를 포함한 다당류를 정제하는데 걸린 총시간은 10 내지 12 시간이었다. 나아가 다당류를 상술한 공정으로 부분 정제한다. 이 방법은 다당류의 완전한 정제를 위해 몇 단계를 더 필요로 할 수 있고 비용 효율적인 공정이 아닐 수 있다.

실시예-4:

수산화 나트륨 및 트리스 완충액을 사용한 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)로의 다당류 정제:

투석여과 및 농축된 조다당류를 갖는 FB를 0.8M NaOH를 사용하여 6시간 동안 80℃에서 탈아세틸화하였다. 그 후, 40℃ 미만으로 냉각한 다음, 6 내지 8 부피의 MQW 및 20mM 트리스 HCL 완충액을 동시에 사용하여 0.1㎡ PES 멤브레인으로 조다당류를 농축하고 투석여과하였다. 그 후에, 다당류를 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC), 예를 들면 페닐 세파로스 6 패스트 플로우에 의해 추가로 정제한다. 정제된 다당류의 농축 및 투석여과를 0.1㎡ PES 멤브레인 및 6 내지 8 부피의 MQW를 사용하여 수행하였다. 이에 따라, 살균 여과를 0.22㎛ 필터로 수행하고 최종 정제된 다당류드를 -20℃에서 보관하였다. 상기 공정을 사용하여 HIC 크로마토그래피를 포함한 다당류를 정제하는데 걸린 총시간은 10 내지 12 시간이었다. 더구나, 다당류를 상술한 공정으로 부분적으로 정제한다. 이 방법은 다당류의 완전한 정제를 위해 몇 단계를 더 필요로 할 수 있고 비용 효율적인 공정이 아닐 수 있다.

실시예-5:

투석여과 및 농축된 조다당류를 갖는 FB를 1M NaOH를 사용하여 2시간 동안 75±5℃에서 탈아세틸화하였다. 그 후, 탈아세틸화된 다당류를 40℃ 미만으로 냉각하였다. 냉각 후에, 탈아세틸화된 조다당류의 농축 및 투석여과를, 100 KDa PES 멤브레인(0.1㎡)을 통해 20 내지 25 부피의 MQW를 사용하여 수행한 다음, 8 내지 10 부피의 20mM 트리스 HCL 완충액(pH 7.4±0.1)을 사용하여 수행하였다. 이에 따라, 살균 여과는 0.22㎛ PES 멤브레인(0.1㎡)으로 수행하였다.

투석여과된 탈아세틸화 다당류를 페닐 세파로스 6 패스트 플로우(FF)로 충전된 XK-16 컬럼을 통해 크로마토그래피 시스템을 이용하여 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)로 추가 정제하였다. 컬럼을 20% 암모늄설페이트를 함유하는 20mM 트리스 HCl 완충액(pH 7.4±0.1)으로 평형화시켰다. 물질을 60 cm/hr에서 로딩하고, 정제된 다당류를 함유하는 통과획분(flow-through)을 수집하였다. 마지막으로, 컬럼을 20mM 트리스 HCl 완충액(pH 7.4±0)으로 재생하고, 추후 사용을 위해 20% 에탄올에 보관하였다. 정제된 다당류의 농축 및 투석여과를 100KDa PES 멤브레인(0.1㎡) 및 6 내지 8 부피의 MQW를 사용하여 수행하였으며, 살균 여과를 0.22㎛ 필터로 수행하고, 최종 정제된 다당류는 -20℃에서 보관한다. 다당류를 정제하는데 걸린 총시간은 6±1 시간이며 PS는 WHO 규격을 통과하였다.

Claims

Men C-다당류의 정제 방법에 있어서,
(a) 발효 산물을 원심분리하여 발효 브로스를 정화시키고;
(b) 발효 상층액을 한외여과에 의해 농축하고;
(c) 단계(b)의 농축된 상층액을 고온에서 탈아세틸화하고 인큐베이션하며;
(d) 단계(c)의 상층액을 수집하여 투석여과 및 농축하고,
(e) 단계(d)의 투석여과된 상층액을 크로마토그래피로 정제하고,
(f) 투석여과 및 농축하여 정제된 다당류를 수득하고,
(g) 상기 정제된 다당류를 살균 여과하는 단계를
포함하고, 여기서 상기 정제 방법이 6±1 시간 이내에 신속하게 완료되는,
정제방법.
제1항에 있어서, 단계 (a)에서, 상기 발효 산물의 원심분리는 4500 x g 내지 5000 x g에서 수행되는 방법.
제1항에 있어서, 단계 (b)에서, 상기 한외여과는 l00 KDa 분자 컷오프 멤브레인으로 수행되는 방법.
제1항에 있어서, 단계 (c)에서, 상기 탈아세틸화는 1 내지 1.5M 농도의 NaOH 용액으로 수행되는 방법.
제1항에 있어서, 단계 (c)에서, 상기 온도는 70 ℃ 내지 80℃ 범위인 방법.
제1항에 있어서, 단계 (c)에서 탈아세틸화를 위한 총 인큐베이션 시간은 1시간 30분 내지 2시간 30분의 범위인 방법.
제1항에 있어서, 단계 (d)에서, 탈아세틸화 후의 투석여과는 밀리-큐 워터(Milli-Q water)를 사용하여 20 내지 25회 수행한 다음, 25mM 트리스 HCl 완충액을 사용하여 8 내지 10회 수행하는 방법.
제1항에 있어서, 단계 (e)에서 상기 크로마토그래피는 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC) 페닐 세파로스 6 패스트 플로우인 방법.
제1항에 있어서, 단계 (f)에서 투석여과 및 농축은 100 KDa PES 멤브레인 (0.1㎡)으로 6 내지 8 부피의 밀리-큐 워터를 사용하여 수행되는 방법.
제1항에 있어서, 단계 (g)에서 살균 여과는 0.22㎛ PES 멤브레인으로 수행되는 방법.