BR112016019608B1

BR112016019608B1 - processo para purificação de polissacarídeos de men-c

Info

Publication number: BR112016019608B1
Application number: BR112016019608-2A
Authority: BR
Inventors: Davinder Gill; Manoj Kumar Chhikara; Sandeep Sharma; Sarmad HANIF; Neeraj Joshi
Original assignee: Msd Wellcome Trust Hilleman Laboratories Pvt. Ltd.
Priority date: 2014-02-25
Filing date: 2015-02-24
Publication date: 2021-07-06
Also published as: CN106062006B; EP3110851A1; BR112016019608A2; US10011662B2; WO2015128798A1; ZA201605453B; US20170051080A1; MY186874A; CN106062006A; KR20160127028A

Abstract

PROCESSO A JUSANTE PARA PUIFICAÇÃO DE POLISSACADRÍDEOS. A presente invenção refere-se a um novo processo para purificação de polissacarídeos bacterianos. O processo é eficiente e de produção em escala, para remoção de impurezas de polissacarídeo do sorogrupo C de Neisseria meningiditis (Men-C), o qual é capaz de ser usado como tal, numa forma derivatizada ou ligado a outras moléculas, para preparação de vacinas, mais particularmente, vacinas conjugadas para uso contra infecção causada por N. meningiditis.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção refere-se a um rápido processo para purificação de polissacarídeo de Neisseria meningitidis. Mais especificamente, a presente invenção refere-se a um processo para preparação de polissacarídeos do sorogrupo tipo C (Men-C) de N. meningitidis, capazes de serem usados como tal, ou de serem derivatizados ou combinados com outros sorogrupos, para fabricação de vacinas para N. meningitidis.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] Os polissacarídeos, especialmente, os polissacarídeos antigênicos, são usados na preparação de vacinas. Vacinas monovalentes, bivalentes e poli(multi)valentes contendo um, dois ou mais polissacarídeos e seus conjugados são disponíveis no mercado para a prevenção de determinadas doenças ou infecções causadas por diversos micro-organismos, tais como, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae e N. meningitidis, e têm provado seu valor na prevenção das respectivas doenças em significativa proporção. Dados de vigilância obtidos nos anos seguintes à introdução da vacina Prevenar claramente demonstraram uma redução da invasiva doença pneumocócica em crianças dos Estados Unidos, conforme já era esperado. Apesar de diversos estudos realizados com relação a esses polissacarídeos e conjugados, uma necessidade de melhoria dos rendimentos, assim como, da qualidade (pureza) dos polissacarídeos, sempre existe na indústria, conforme se torna evidenciado pela contínua realização de pesquisas.

[0003] A meningite é considerada como uma ameaça global e os índices de crescimento da doença ainda permanecem uma prioridade para a saúde pública. A definição clínica de meningite é a inflamação das meninges (membrana do cérebro). Caso não seja tratada, a doença pode ter consequências fatais. Um total de treze sorogrupos de N. meningitidisforam identificados e além desses treze, seis sorogrupos (A, B, C, W135, X e Y) são majoritariamente responsáveis por provocar infecções de forma global. A bactéria N. meningitidisapresenta uma ampla faixa de manifestações clínicas, variando desde dores de garganta suaves transitórias à meningite fatal ou septicemia meningocócica. A meningite e a septicemia são as formas mais comuns de apresentação da doença.

[0004] As provas coletadas através de numerosos resultados de pesquisas definem o aspecto imunogênico da vacina de polissacarídeo conjugada. Além disso, artigos de pesquisa são disponibilizados, assim como, documentos de patentes, descrevendo a produção e purificação do polissacarídeo capsular de Men-C, mas, nenhum desses artigos define um processo de purificação com linhas de tempo extremamente reduzidas, que seja robusto e de produção em escala, e que seja ainda reproduzível.

[0005] A produção de Men-c purificado é o principal requisito para uma efetiva conjugação com a proteína transportadora e seu desenvolvimento como vacina conjugada. O custo da cultura e da purificação do Men-C é geralmente alto e envolve longas horas de trabalho, na medida em que envolve uma série de etapas de produção e purificação. A melhoria de uma ou mais etapas da produção do polissacarídeo irá proporcionar uma significativa mudança na produção global da vacina conjugada e, consequentemente, tornar o processo de custo relativamente eficaz.

[0006] No entanto, apesar de diversos estudos realizados com relação a esses polissacarídeos, existe sempre uma necessidade de melhoria dos rendimentos, assim como, da qualidade/pureza dos polissacarídeos, a fim de produzir vacinas de alta qualidade.

[0007] Existe um determinado número de patentes que descreve o processo para a purificação de polissacarídeos de Men-C. O estado da técnica existente, o qual é descrito na Patente U.S. No. 7.491.517, B2 para precipitação de polissacarídeos de Men-c com CTAB, é descrito envolvendo a incubação durante a noite à temperatura de 4°C. Também, a remoção de contaminantes exige o uso da dispendiosa enzima proteinase K. Além disso, o processo também exige a filtração com gel para purificação dos polissacarídeos de Men-C. O procedimento global exige uma perda significativa de tempo para a purificação e, além disso, o processo se torna de alto custo devido ao uso de enzimas.

[0008] Também, o Pedido de Patente WO 2011/148382 A1 descreve o método de preparação de um polissacarídeo capsular puro, usando fosfato de alumínio com álcool para a purificação de Haemophilus influenzaeb, N. meningitidis, tais como, os sorogrupos A, C, Y, W-135 e de outros polissacarídeos capsulares similares, produzidos a partir de micro-organismos gram-negativos e gram-positivos. O referido estado da técnica publicado divulga um tempo de 16-20 horas para a purificação dos polissacarídeos.

[0009] Em outra Patente, o documento EP 0658118 B1, se descreve um método para O-desacetilação de polissacarídeo meningocócico do grupo C (GCMP) com uma média de tempo de 16 horas. Esse processo também exige um significativo gasto de tempo para realização da purificação.

[0010] Atualmente, os diversos métodos usados para a produção e purificação de polissacarídeos de Men-C exigem tempos de cultura e purificação relativamente longos, como, também, envolvem o uso de enzimas de alto custo. Conquanto que esses tipos de processos proporcionem polissacarídeos puros, irá ocorrer um aumento simultâneo dos custos de produção durante a produção em escala.

[0011] Além disso, o estado da técnica acima divulgado ensina métodos que são mais eficientes quando realizados sob baixa temperatura, porém, exigem um ambiente controlado, o que acarreta a adição de custos na pesquisa e na produção.

OBJETIVO DA INVENÇÃO

[0012] Assim, o principal objetivo da presente invenção é proporcionar um novo processo para purificação de polissacarídeo de Men-C.

[0013] Outro objetivo da presente invenção é proporcionar um processo rápido de purificação de polissacarídeo de Men-C, ao mesmo tempo em que elimina as impurezas em curto período de tempo mediante um método simples, eficiente, aperfeiçoado e comercialmente em escala.

[0014] Um adicional objetivo da presente invenção é de produzir um polissacarídeo de alta qualidade que atenda as relevantes especificações de WHO.

RESUMO DA INVENÇÃO

[0015] A presente invenção refere-se a um processo para purificação de um polissacarídeo de Men-C. O processo descreve um método novo, rápido, rentável e aceitável, em que o polissacarídeo de Men-C é purificado com um tempo significativamente reduzido.

[0016] O processo da presente invenção envolve a seleção de uma linhagem bacteriana imunologicamente ativa, preparando o meio para a propagação da dita linhagem imunologicamente ativa e inoculando a linhagem bacteriana selecionada em uma cultura de matéria-prima de glicerol, com seguinte incubação da mesma a uma temperatura previamente definida por um ótimo período de tempo, e com posterior centrifugação em predefinidas rotações por minuto (RPM). A linhagem bacteriana selecionada é cultivada em um meio de cultura otimizado em um dispositivo fermentador, e o processo prossegue realizando a centrifugação do material colhido fermentado, de modo a clarificar o caldo da fermentação (FB) dos fragmentos celulares, seguido da concentração do FB por ultrafiltração, usando membranas de separação de peso molecular.

[0017] O sobrenadante concentrado ultrafiltrado ou o FB processado é depois desacetilado na presença de uma alta concentração de solução alcalina, sob alta temperatura. O polissacarídeo bruto desacetilado é submetido à mudança de tampão por meio de Filtração Tangencial de Fluxo (TFF). O polissacarídeo bruto diafiltrado desacetilado é posteriormente purificado mediante cromatografia de interação hidrofóbica (HIC), obtendo-se o polissacarídeo final purificado. De particular importância é o método de acordo com a invenção, o qual compreende o tratamento de um extrato concentrado e/ou de células bacterianas isoladas com uma solução básica. Além da extração dos CPS, a extração básica também causa a desacetilação dos grupos de N-acetila. O grau de desacetilação pode ser variado mediante ajuste das condições reacionais. Os CPS extraídos são depois separados dos componentes celulares, de modo a se obter o CPS, preferivelmente, através de separação cromatográfica.

[0018] O processo demonstra numerosas vantagens em relação ao estado da técnica, como, por exemplo, a provisão de um método novo e rápido de preparação de polissacarídeo de Men-C. O processo é rentável e reduz o número total de etapas, exigindo uma única purificação cromatográfica. Uma adicional vantagem é que esse processo é totalmente possível de produzido em escala.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0019] A figura 1 ilustra um fluxograma do processo para purificação e recuperação de polissacarídeos de Men-C.

[0020] A figura 2 ilustra um cromatograma de HPLC de polissacarídeos de Men- C.

[0021] A figura 3 ilustra o espectro de NMR de polissacarídeos de Men-C.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0022] A presente invenção divulga duas etapas que foram otimizadas de modo a possibilitar a purificação de polissacarídeo de Men-C (MenC-PS) em um menor espaço de tempo, conforme mostrado na figura 1.

[0023] A linhagem de polissacarídeo bacteriano é inoculada no dispositivo fermentador, contendo apropriados componentes do meio de inoculação, exigidos para o crescimento bacteriano. Após obtenção da máxima densidade ótica, numa faixa de 8 a 10, o que ilustra um substancial crescimento bacteriano, a cultura é submetida à fase terminal mediante adição de uma predefinida concentração de formaldeído, e o resultante FB é obtido. O FB é depois centrifugado a uma alta velocidade, de modo a clarificar o FB dos fragmentos celulares, seguido de diafiltração e concentração, usando membranas de corte de peso molecular.

[0024] O FB diafiltrado e concentrado contendo o polissacarídeo bruto é tratado com NaOH em alta temperatura, por exemplo, temperatura de até 80°C, para desacetilação. A concentração e diafiltração do polissacarídeo bruto é realizada com uma membrana de polieterssulfona (PES), com água de MilliQ (MQW), seguido de tampão de Tris-HCl, pH de 7,4 ± 0,1. Após a diafiltração, o polissacarídeo bruto é concentrado e filtrado com um filtro de malha de 0,22 μ m.

[0025] O polissacarídeo bruto desacetilado é posteriormente purificado por meio da técnica cromatográfica de interação hidrofóbica (HIC).

[0026] A separação de dois ou mais componentes de uma mistura baseada em diferenças de polaridade é bem conhecida pelos especialistas versados na técnica. Por exemplo, usando cromatografia de interação hidrofóbica, os compostos de hidrofobicidade relativamente maior são retidos por mais tempo na coluna, se comparado com os compostos que são mais hidrofílicos. Contrariamente, usando cromatografia de interação hidrofílica, os compostos hidrofílicos são retidos por mais tempo na coluna, se comparado com os compostos que são mais hidrofóbicos. Através do uso de ambos os métodos consecutivamente, é possível a remoção de impurezas que são menos polares e mais polares, em relação ao composto de interesse.

[0027] O CPS extraído presente no reagente de extração básico pode ser separado das impurezas resultantes dos componentes celulares por meio de cromatografia. Exemplos não limitativos desses métodos de separação cromatográfica incluem os métodos de troca de íons (catiônico ou aniônico), interação hidrofílica, interação hidrofóbica ou cromatografia por permeação de gel. O método mais preferido é o de cromatografia de interação hidrofóbica (HIC) em fenil- sefarose, o qual irá remover a maior parte do alto peso molecular, contaminantes ativos de UV provenientes do extrato básico. O polissacarídeo capsular será eluído no início, enquanto a proteína mais hidrofóbica e os ácidos nucléicos serão retidos. O método preferido da invenção é de cromatografia de interação hidrofóbica.

[0028] Etapas posteriores de concentração e diafiltração do polissacarídeo são realizadas para facilitar a remoção de proteínas e outras impurezas, sendo que a amostra do polissacarídeo é depois lavada com MQW.

[0029] Por fim, uma filtração estéril é feita para se obter o polissacarídeo de Men-C purificado, conforme ilustrado nas figuras 2 e 3.

[0030] A corroboração dos procedimentos acima empregados pode ser convenientemente entendida da Tabela 1, que mostra claramente que as especificações do polissacarídeo purificado atendem ao padrão da Organização Mundial de Saúde (OMS). Tabela 1: Esta Tabela Apresenta Especificações do Polissacarídeo Purificado de Men-C, de acordo com a Especificação da OMS.

[0031] De particular interesse é a observação de que o tempo gasto requerido para purificar os polissacarídeos de Men-C é significativamente menor do que o tempo divulgado pelo estado da técnica, ao mesmo tempo em que a indicação de qualidade da presente invenção é dirigida para um protocolo de processo novo, rápido e de produção em escala, que pode ser completado dentro do período de 6 ± 1 hora, e onde o polissacarídeo assim produzido está em conformidade com os padrões estabelecidos pela OMS.

[0032] Procedimentos Analíticos

[0033] Os polissacarídeos obtidos nas diferentes etapas são constantemente monitorados e analisados com relação à pureza e rendimento. Diferentes procedimentos analíticos são relatados, sendo os mais preferidos resumidamente relatados a seguir.

[0034] O ácido siálico total dos polissacarídeos de Men-C (MenC-PS) é determinado por meio de um método calorimétrico. O ensaio é baseado na reação entre ácido siálico e resorcinol, à temperatura de 100°C, na presença de ácido clorídrico e de íons de cobre (II) durante 30 minutos; isso leva à formação de um complexo de cor azul-violeta, que exibe uma forte absorbância em 564 nm. A concentração total de ácido siálico é determinada a partir de uma curva de calibração obtida, usando uma série de padrões de ácido siálico [(Svennerholm, 1957)]. Um lipopolissacarídeo (LPS) é determinado usando um aparelho compacto e simples, o conhecido dispositivo Endosafe®-PTS™. A impureza da proteína é determinada pelo método de Lowry [(Lowry e outros, 1951)], usando albumina de soro bovino como padrão e a absorbância é medida em 750 nm. Os ácidos nucleicos (NA) são estimados em 260 nm e a quantidade é calculada supondo uma absorbância de 1,0 A = 50 μg/ mL [(Frasch, 1990)].

[0035] O peso molecular médio relativo (Mw) de HibPRP é determinado usando cromatografia líquida de alta performance (HPLC) (Alliance, Waters). As colunas usadas são PWXL-4000 e PWXL-5000, em série (Tosoh Bioscience). Além disso, uma faixa de pululanos (polissacarídeos poliméricos) de peso molecular de 5 kD a 800 kD (Shodex), é usada como padrão para os MenC-OS. O ensaio de HPLC é realizado usando nitrato de sódio 0,1M, com um tempo de processamento de 30 minutos a uma vazão de 1 mL/min. A identificação do MenC-PS é verificada por meio de espectroscopia de 1H-NMR. O ensaio de NMR produz um espectro de núcleos magnéticos sensíveis (por exemplo, 1H). Os polissacarídeos de Men-C (MenC-PS) são identificados sorologicamente através da combinação com o antissoro de referência, contra cada polissacarídeo. Na medida em que as especificações da OMS (OMS, 2004) para determinar a pureza e caracterizar o polissacarídeo são baseadas com relação ao peso seco, o MenC-PS é primeiramente liofilizado e depois testado. O teor de umidade é então subtraído para se obter o exato peso seco. O teor de umidade da torta liofilizada é determinado pelo Analisador Termogravimétrico (TGA) da Perkin Elmer. Os resultados analíticos para o MenC-PS são apresentados na Tabela 1, e se encontram de acordo e conforme especificado pela OMS.

[0036] O dito polissacarídeo de Men-C pode ser usado para a preparação de vacinas conjugadas de polissacarídeo-proteína.

[0037] Diversos aspectos da invenção aqui descritos em detalhes serão agora ilustrados por meio de exemplos não limitativos.

[0038] Exemplo 1

[0039] Purificação de polissacarídeo usando detergente aniônico com tampão Tris e Cromatografia de Interação Hidrofóbica (HIC)

[0040] O FB diafiltrado e concentrado contendo o polissacarídeo bruto é processado com detergente aniônico, tal como, desoxicolato de sódio, a uma concentração de 0,3%-0,6% (peso/volume) e incubado à temperatura na faixa de 50°C - 60°C por 1 hora. Em seguida, é resfriado para uma temperatura abaixo de 40°C, seguido de concentração e diafiltração do polissacarídeo bruto com membrana de polieterssulfona (PES) (0,1m2), com 6-8 volumes de água MilliQ (MQW).

[0041] A desacetilação é depois realizada no polissacarídeo bruto com hidróxido de sódio (NaOH) 0,5M, à temperatura de 50°C, durante 10 horas. Em seguida, o polissacarídeo é resfriado para uma temperatura abaixo de 40°C, seguido de diafiltração e concentração simultânea do polissacarídeo bruto, com 6-8 volumes de MQW e tampão de Tris-HCl 20mM, usando membrana de PES de 0,1m2. Após isso, o polissacarídeo é ainda purificado por meio de Cromatografia de Interação Hidrofóbica (HIC), como, por exemplo, Cromatografia de Fluxo Rápido de Fenil- sefarose 6. Finalmente, as etapas de concentração e diafiltração do polissacarídeo purificado são realizadas com membrana de polieterssulfona (PES) (0,1m2), com 6-8 volumes de água MilliQ (MQW). Em seguida, uma adequada filtração estéril é realizada em um filtro de malha de 0,22 μm e o polissacarídeo final purificado é então armazenado a uma temperatura de -20°C. O tempo total para purificar o polissacarídeo, incluindo a cromatografia de HIC usando o processo acima, foi de 16-18 horas.

[0042] Exemplo 2

[0043] Purificação de polissacarídeo usando detergente aniônico com tampão de HEPES [ácido(4-(2-hidroxietil)-1-piperazino-metassulfônico] e Cromatografia de Interação Hidrofóbica (HIC)

[0044] O FB diafiltrado e concentrado contendo o polissacarídeo bruto é processado com detergente aniônico, como, por exemplo, desoxicolato de sódio, a uma concentração de 0,3%-0,6% (peso/volume) e incubado à temperatura na faixa de 50°C - 60°C por 1 hora. Em seguida, é resfriado para uma temperatura abaixo de 40°C, seguido de concentração e diafiltração do polissacarídeo bruto com membrana de polieterssulfona (PES) (0,1m2), com 6-8 volumes de água MilliQ (MQW).

[0045] A desacetilação é depois realizada no polissacarídeo bruto com hidróxido de sódio (NaOH) 0,5M, à temperatura de 50°C, durante 10 horas. Em seguida, o polissacarídeo é resfriado para uma temperatura abaixo de 40°C, seguido de diafiltração e concentração simultânea do polissacarídeo bruto, com 6-8 volumes de MQW e tampão de HEPES 20 mM, contendo NaCl 3M, usando membrana de PES de 0,1m2 Após isso, o polissacarídeo é ainda purificado por meio de Cromatografia de Interação Hidrofóbica (HIC), como, por exemplo, Cromatografia de Fluxo Rápido de Fenil-sefarose 6. As etapas de concentração e diafiltração do polissacarídeo purificado foram realizadas com membrana de polieterssulfona (PES) (0,1 m2), com 6-8 volumes de água MilliQ (MQW). Em seguida, uma adequada filtração estéril foi realizada em um filtro de malha de 0,22 μm e o polissacarídeo final purificado é então armazenado a uma temperatura de -20°C. O tempo total para purificar o polissacarídeo, incluindo a cromatografia de HIC usando o processo acima, foi de 16-18 horas.

[0046] Exemplo 3

[0047] Purificação de polissacarídeo usando hidróxido de sódio com tampão de HEPES [ácido(4-(2-hidroxietil)-1-piperazino-metassulfônico] e Cromatografia de Interação Hidrofóbica (HIC)

[0048] O FB diafiltrado e concentrado contendo o polissacarídeo bruto é desacetilado com NaOH 0,8M, durante 6 horas, à temperatura de 80°C. Em seguida, é resfriado para uma temperatura abaixo de 40°C, seguido de simultânea diafiltração e concentração do polissacarídeo bruto com 6-8 volumes de água MilliQ (MQW) e tampão de HEPES 20 mM, contendo NaCl 3M, usando membrana de PES de 0,1m2. Após isso, o polissacarídeo é ainda purificado por meio de Cromatografia de Interação Hidrofóbica (HIC), como, por exemplo, Cromatografia de Fluxo Rápido de Fenil-sefarose 6. As etapas de concentração e diafiltração do polissacarídeo purificado foram realizadas com membrana de polieterssulfona (PES) (0,1 m2), com 6-8 volumes de água MilliQ (MQW). Em seguida, uma adequada filtração estéril foi realizada em um filtro de malha de 0,22 μm e o polissacarídeo final purificado é então armazenado a uma temperatura de -20°C. O tempo total para purificar o polissacarídeo, incluindo a cromatografia de HIC usando o processo acima, foi de 10-12 horas. Além disso, o polissacarídeo é parcialmente purificado mediante o processo acima mencionado. O processo pode exigir mais algumas etapas para completar a purificação do polissacarídeo e, desse modo, pode ser considerado como um processo não rentável.

[0049] Exemplo 4

[0050] Purificação de polissacarídeo usando hidróxido de sódio com tampão Tris e Cromatografia de Interação Hidrofóbica (HIC)

[0051] O FB diafiltrado e concentrado contendo o polissacarídeo bruto é desacetilado com NaOH 0,8M, durante 6 horas, à temperatura de 80°C. Em seguida, é resfriado para uma temperatura abaixo de 40°C, seguido de simultânea diafiltração e concentração do polissacarídeo bruto com 6-8 volumes de água MilliQ (MQW) e tampão de Tris-HCl 20 mM, usando membrana de PES de 0,1m2. Após isso, o polissacarídeo é ainda purificado por meio de Cromatografia de Interação Hidrofóbica (HIC), como, por exemplo, Cromatografia de Fluxo Rápido de Fenil- sefarose 6. As etapas de concentração e diafiltração do polissacarídeo purificado foram realizadas com membrana de polieterssulfona (PES) (0,1m2), com 6-8 volumes de água MilliQ (MQW). Em seguida, uma adequada filtração estéril foi realizada em um filtro de malha de 0,22 μm e o polissacarídeo final purificado é então armazenado a uma temperatura de -20°C. O tempo total para purificar o polissacarídeo, incluindo a cromatografia de HIC usando o processo acima, foi de 10-12 horas. Além disso, o polissacarídeo é parcialmente purificado mediante o processo acima mencionado. O processo pode exigir mais algumas etapas para completar a purificação do polissacarídeo e, desse modo, pode ser considerado como um processo não rentável.

[0052] Exemplo 5

[0053] Purificação de polissacarídeo usando hidróxido de sódio com tampão Tris e Cromatografia de Interação Hidrofóbica (HIC)

[0054] O FB diafiltrado e concentrado contendo o polissacarídeo bruto foi desacetilado com NaOH 1M, por 2 horas, à temperatura de 75±5°C. O polissacarídeo desacetilado foi depois resfriado para uma temperatura abaixo de 40°C. Após o resfriamento, a concentração e diafiltração do polissacarídeo bruto desacetilado foi realizada por meio de membrana de polieterssulfona (PES) (0,1m2), de peso molecular de 100 kDa, com 20 a 25 volumes de MQW, seguido de 8-10 volumes de tampão de Tris-HCl 20 mM (pH 7,4 ± 0,1). Em seguida, foi realizada uma filtração estéril com a membrana de PES (0,1m2), tendo malha de 0,22 μ m.

[0055] O polissacarídeo diafiltrado desacetilado foi posteriormente purificado mediante cromatografia de interação hidrofóbica (HIC), utilizando um sistema de cromatografia de fluxo rápido (FF), contendo coluna XK-16 empacotada com fenil sefarose 6. A coluna foi balanceada com tampão de Tris-HCl 20 mM, pH 7,4 ± 0,1, contendo 20% de sulfato de amônio. O material foi introduzido com uma vazão de 60 cm/h e o fluxo direto contendo o polissacarídeo purificado foi coletado. Finalmente, a coluna foi regenerada com tampão de Tris-HCl 20 mM, pH 7,4 ± 0 e armazenada em etanol a 20% para posterior uso. As etapas de concentração e diafiltração do polissacarídeo purificado foram realizadas com membrana de polieterssulfona (PES) (0,1m2), de peso molecular de 100 kDa, com 6-8 volumes de água MilliQ (MQW), com seguinte filtração estéril realizada em um filtro de malha de 0,22 μm e o polissacarídeo final purificado foi então armazenado a uma temperatura de -20°C. O tempo total levado para purificar o polissacarídeo foi de 6±1 hora, com o polissacarídeo sendo qualificado para atender às especificações da OMS.

Claims

1. Processo para purificação de polissacarídeo de Men-C, caracterizado pelo fato de que o dito processo compreende as etapas de: (a) centrifugação da cultura fermentada para clarificar o caldo fermentado; (b) concentração do sobrenadante fermentado mediante ultrafiltração; (c) desacetilação e incubação do dito sobrenadante concentrado da etapa (b) sob uma temperatura variando de 70°C a 80°C; (d) coleta do sobrenadante da etapa (c) e submissão do mesmo aos estágios de diafiltração e concentração; (e) purificação do sobrenadante diafiltrado da etapa (d) por cromatografia de interação hidrofóbica (HIC) através de coluna XK-16 empacotada com fenil sefarose 6 de fluxo rápido utilizando um sistema de cromatografia; (f) diafiltração e concentração para obtenção dos polissacarídeos purificados são realizadas com uma membrana de polieterssulfona (PES) (0,1m2), de peso molecular de 100 kDa, com 6 a 8 volumes de água Milli-Q; e (g) filtração estéril dos ditos polissacarídeos purificados; em que o dito processo de purificação é finalizado dentro de um período de tempo máximo de 7 horas e é completado sem o uso de um detergente, em que a dita etapa de desacetilação é realizada com uma solução de NaOH, a uma concentração de 1M a 1,5M, e em que a diafiltração na etapa de coleta após a etapa de desacetilação é realizada com 20 a 25 volumes com água Milli-Q, seguido de 8 a 10 volumes com tampão de Tris-HCl 20 mM.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a incubação na etapa de desacetilação é realizada com um tempo total de incubação variando de uma hora e meia a duas horas e meia.