BR102014021245A2 - processo rápido para produzir e purificar hib-prp - Google Patents

Abstract

processo rápido para produzlr e purificar hib-prp - a presente invenção diz respeito a um processo rápido para produzir e purificar os polissacarídeos de fosfato de polirribosil ribitol da haemophilus influenzae tipo b (hib-prp) que satisfaz as especificações who. o processo produz os polissacarídeos de hib-prp capazes de serem usados como tais, ou de serem derivatizados ou ligados a outras moléculas para produzir uma vacina contra as infecções por haemophilus influenzae tipo b. o processo descreve um método mais simples, rápido, eficaz em custo e escalonável, em que o hib-prp é purificado em um tempo significantemente reduzido à temperatura ambiente.

Description

“PROCESSO RÁPIDO PARA PRODUZIR E PURIFICAR HIB-PRP” CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção diz respeito a um processo rápido para produzir e purificar Polissacarídeos de fosfato de polirribosil ribitol da Haemophilus influenzae tipo b (Hib-PRP). Mais especificamente, a presente invenção diz respeito a um processo para preparar Hib-PRP capaz de ser usado como tal, ou de ser derivatizado ou ligado a outras moléculas para fabricar vacinas para a prevenção de doenças invasivas causadas pela bactéria Haemophilus influenzae tipo b (Hib). FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[0002] Polissacarídeos, especialmente polissacarídeos antigênicos, são usados na preparação de vacinas. Vacinas monovalentes, divalentes e poli (multi) valentes contendo um, dois ou mais polissacarídeos estão disponíveis no mercado para a prevenção de algumas doenças ou infecções causadas por vários microorganismos. As vacinas de polissacarídeos multivalentes foram usadas pro muitos anos e se provaram de valor na prevenção de doenças tais como doenças por Pneumococcal, Meningococcal ou Haemophilus influenzae. Os dados de supervisão coletados nos anos após a introdução da vacina Prevnar demonstraram claramente a redução de doenças pneumocócicas invasivas em crianças dos Estados Unidos. Contudo, apesar dos vários estudos realizados nestes polissacarídeos, há uma necessidade quanto melhorar a produção, bem como a quantidade (pureza) dos polissacarídeos como evidenciado pela pesquisa posterior.

[0003] Haemophilus influenzae é um cocobacilo pleomórfico gram-negativo, que causa um conjunto de doenças tais como meningite, epiglotite, pneumonia, artrite séptica, e infecções do trato respiratório tais como bronquite e otite média. Este possui seis sorotipos capsulares com nomenclatura do tipo (a) até o tipo (f). O sorotipo (b) indicado como Haemophilus influenzae tipo b (Hib) foi observado como o mais invasivo. A resposta imune contra Hib foi obtida através da vacinação.

[0004] A resposta imune pode ser diferenciada como a resposta imune dependente da célula T (TD) e a resposta imune não dependente da célula T (TI). As proteínas e peptídeos são conhecidos extrair antígenos TD estimulando os linfócitos T auxiliares e gerando linfócitos T e B de memória. Ao contrário, os polissacarídeos são antígenos TI que não envolvem a ativação da célula T e não formam células B de memória, o que é um prejuízo principal enquanto procedendo com crianças conforme estas possuem um sistema imunológico imaturo.

[0005] A produção da primeira vacina de polissacarídeo Hib foi efetuada no início dos anos de 1970 conforme esta foi uma necessidade urgente para combater esta doença fatal. Depois, foi observado que as vacinas não foram muito eficazes em crianças abaixo dos dois anos de idade considerando que estas possuem um sistema imunológico pouco desenvolvido. Esta observação levou a mais pesquisas resultando na produção de vacinas conjugadas de polissacarídeo Hib-proteína no final dos anos da década de 1980.

[0006] A evidência coletada através de várias descobertas de pesquisa define o aspecto imunogênico da vacina de conjugado de polissacarídeo. Contudo, há muito pouca informação para auxiliar a produção e purificação do polissacarídeo capsular de Hib-PRP.

[0007] A produção do Hib-PRP purificado é o principal requerimento para uma conjugação eficaz com a proteína carregadora e seu desenvolvimento como uma vacina conjugada. O custo do cultivo e da purificação de Hib-PRP é geralmente alto e envolve longas horas de trabalho visto que envolve uma série de etapas de produção e purificação. Qualquer melhora em uma ou mais etapas da produção de PRP sem comprometer a qualidade traria uma mudança signíficante na produção geral da vacina conjugada e consequentemente torna o processo relativamente eficaz em custo.

[0008] Contudo, apesar dos vários estudos que foram realizados nestes polissacarídeos, sempre houve uma necessidade de melhorar o rendimento bem como a qualidade/pureza dos polissacarídeos de modo a produzir as vacinas de alta qualidade.

[0009] Estudos tais como a divulgação no artigo publicado em Applied and Environmental Microbiology, Fevereiro de 2001, p. 969-971, Vol. 67, N° 2, intitulado “Production of capsular polysaccharide of Streptococcus pneumoniae Type 14 and it’s purification by Affinity chromatography,” menciona um método que envolve uma cromatografia de troca de ânions de sorotipo específico. Este é um processo que consome tempo e tedioso com baixos rendimentos.

[0010] Além disso, o Pedido PCT N° WO 2011148382 A1 descreve o método de preparar polissacarídeo capsular puro usando fosfato de alumínio com álcool para a purificação de polissacarídeos capsulares de Haemophilus influenzae b, Neisseria meningitidis tais como os sorotipos A, C, Y, W- 135 e outros polissacarídeos capsulares similares relacionados produzidos de microorganismos tanto gram-negativos quanto gram-positivos usando fosfato de alumínio com álcool. Outra Patente US 7.582.459 B2 descreve um método para produzir um polissacarídeo capsular para o uso nas vacinas conjugadas usando brometo de hexa cetil trimetilamônio (CTAB), etanol e desoxicolato de sódio levando um tempo total de 56 a 72 horas.

[0011] No presente, os vários métodos usados para a produção e purificação de Hib-PRP levam um tempo de cultivo e purificação relativamente longo de cerca de 40 horas a 72 horas, deste modo aumentando o custo de produção e tornando o processo comercialmente impraticável visto que este não pode ser aumentado de uma maneira eficaz em custo.

[0012] Além das técnicas anteriores acima divulgadas, que ensinam um método que é mais eficaz em baixa temperatura, deste modo requerendo um ambiente controlado levando à adição de custos na pesquisa e produção. Além disso, alguns dos presentes métodos divulgam o uso de etapas de cromatografia que levam à produção de um polissacarídeo com baixos rendimentos que podem aumentar o custo de produção durante o aumento, deste modo aumentando o tempo de processo até uma grande extensão.

OBJETIVO DA INVENÇÃO

[0013] O objetivo principal da invenção é fornecer um processo rápido para a produção e purificação de polissacarídeo de Hib-PRP enquanto elimina as impurezas em um curto espaço de tempo através de um método simples, eficiente, melhorado e comercialmente escalonávei.

[0014] Ainda outro objetivo da invenção é fornecer um processo de purificação que pode ser realizado à temperatura ambiente ao contrário dos métodos de produção usados no estado existente de técnica onde os processos de purificação são principalmente conduzidos em temperaturas muito baixas.

[0015] Ainda outro objetivo da presente invenção é produzir polissacarídeo de alta qualidade com alto rendimento que satisfaça as especificações WHO (OMS -Organização Mundial da Saúde).

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0016] Assim, a presente invenção diz respeito ao processo de produção e purificação de Hib-PRP. A invenção divulga um processo rápido, simples e ainda eficaz em custo e escalonável, em que o Hib-PRP é purificado em um tempo significantemente reduzido. Outra característica importante da presente invenção é que o processo de purificação é completado à temperatura ambiente.

[0017] O processo da presente invenção começa com a seleção da cepa bacteriana que tem o potencial de fornecer resultados consistentes ou reprodutíveis. Para a propagação da cepa, neste caso, a cultura de estoque em glicerol é preparada usando processos conhecidos e a cepa bacteriana é inoculada no meio de propagação. A cepa bacteriana inoculada é depois incubada em uma temperatura pré-definida para um período de tempo ótimo. A cepa bacteriana selecionada é incubada e depois cultivada no meio de cultivo no fermentador e depois colhida. O meio de cultivo é aperfeiçoado para efetuar um crescimento mais elevado da cepa bacteriana. A colheita ou a ‘colheita fermentada’ é clarificada para obter o caldo fermentado ou o sobrenadante. Este sobrenadante fermentado é submetido à ultrafiltração usando membranas de corte de peso molecular para obter o sobrenadante concentrado.

[0018] O sobrenadante concentrado ultra-filtrado é depois precipitado com um dos detergentes catiônicos selecionados que leva à formação da pelota de polissacarídeo pelotizado. Estas pelotas são depois coletadas e dissolvidas na solução salina. O polissacarídeo nesta solução salina é precipitado e tratado com solvente orgânico, preferivelmente etanol. O polissacarídeo precipitado deste modo obtido é depois tratado com um dos detergentes aniônicos selecionados junto com acetato de sódio e etanol. O sobrenadante deste modo obtido é submetido à filtração e precipitação/tratamento de etanol. O precipitado obtido após o tratamento de etanol é dissolvido em água MilliQ (MQW) e diafiltrado para obter os polissacarídeos purificados em um tempo significantemente reduzido.

[0019] O processo apresenta várias vantagens sobre a técnica anterior, tal como fornecer um método rápido e robusto de preparar o polissacarídeo de Hib tendo uma estrutura de fósforo. O processo também é eficaz em custo considerando que este reduz o número total de etapas, não requer a triagem cromatográfica e pode ser realizado à temperatura ambiente. Uma vantagem adicionai é que este processo é inteiramente escalonávei.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DAS FIGURAS

[0020] A Figura 1 representa o fluxo de processo para a produção de PRP. O fluxograma descreve as etapas envolvidas a partir da seleção da cepa bacteriana até a coleta do caldo de fermentação.

[0021] A Figura 2 representa a curva de crescimento de H. influenzae tipo b.

[0022] A Figura 3 representa o esquema de purificação de PRP.

[0023] A Figura 4 representa o perfil de HPLC do PRP purificado.

[0024] A Figura 5 representa a RMN do PRP purificado.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO COM REFERÊNCIA ÀS FIGURAS E AOS EXEMPLOS

[0025] Portanto, a invenção diz respeito ao processo de produzir e purificar HiB-PRP de diversas variedades claramente diferentes de polissacarídeos bacterianos capsulares e de submeter o dito HiB-PRP a um processo aperfeiçoado de purificação. A invenção não precisa ser limitada somente a estes polissacarídeos bacterianos capsulares.

[0026] A invenção divulga uma série de etapas que foram aperfeiçoadas de uma nova maneira inventiva para permitir a preparação e purificação do Hib-PRP em um tempo consideravelmente reduzido de menos do que 25 horas onde os processos são realizados à temperatura ambiente e com um rendimento comparável a um ou ais do que no estado existente dos processos da técnica. Além disso, o PRP purificado desta maneira produzido e purificado satisfaz as especificações WHO.

[0027] O processo de produção como mostrado na figura 1 começa com a etapa de seleção de uma cepa bacteriana apropriada. A cepa bacteriana é geralmente selecionada com base na imunogeneicidade com uma preferência para a cepa imunologicamente ativa e sua capacidade de fornecer resultados consistentes ou reprodutíveis. A etapa seguinte no processo envolve a preparação do meio no qual as cepas bacterianas selecionadas devem ser propagadas. O dito meio tem vários fatores nutricionais e fatores de crescimento bem como os agentes que estabilizam o pH que podem sustentar de maneira ótima a cultura bacteriana selecionada e acelera sua propagação. Alguns destes fatores e agentes de estabilização incluem cloreto de potássio (KCI), cloreto de sódio (NaCI), extratos de levedura, etc.

[0028] Uma vez que o meio para a propagação bacteriana está preparado, as cepas bacterianas selecionadas são inoculadas em frascos contendo a quantidade necessária do meio de propagação acima mencionado. A inoculação é realizada em temperaturas de aproximadamente 36° C em um pH de 7,2. Esta cultura de sementes é periodicamente testada quanto sua densidade ótica. Tão logo a densidade esteja dentro da faixa de 0,8 a 1,0, a cultura de sementes da cepa bacteriana com a densidade ótica máxima é selecionada e transferida ao fermentador para a etapa de fermentação.

[0029] A fermentação é realizada no fermentador que é equipado com controle automático da temperatura, pH, concentração de oxigênio dissolvido (DO), bomba peristáltica para a adição de alimentação, álcali para o controle do pH, anti-espuma bem como adição de inóculo. A cultura de sementes selecionada da cepa do estágio de inoculação é deixada cultivar nos componentes do meio que fornecer os requerimentos nutricionais à cepa. Os componentes de meio aperfeiçoados resultam no crescimento significante da bactéria Hib.

[0030] A produção do PRP capsular também é dependente da consideração física, tal como pH e temperatura e apresenta uma fase de crescimento exponencial com os parâmetros dentro de uma faixa específica. O meio de fermentação otimizado incluindo os componentes como ácido L-glutâmico, L-cisteína, Hemina etc, e o protocolo do parâmetro do processo resultam no produto desejado.

[0031] Após o término da fase de crescimento, a fermentação vem para seu estágio de terminação que é indicado pela diminuição na densidade ótica da cepa. O término é trazido ao tratamento com formaldeído (HCHO) para predefinir o tempo de preferivelmente 15 minutos. A temperatura do fermentador é depois mantida a 35° C por 15 minutos e o caldo de fermentação é coletado em garrafas. O caldo fermentado é submetido à centrifugação e o sobrenadante resultante da centrifugação é coletado.

[0032] O sobrenadante assim coletado é depois submetido à diafiltração para a remoção das impurezas indesejadas e o material recuperado deste modo obtido é então processado para outra purificação.

Processo de purificação: [0033] O esquema de purificação mostrado na Figura 3 é muito dependente das propriedades físico-químicas do PRP, a quantidade das impurezas a ser removidas e o tempo levado para completar o processo todo.

[0034] O caldo de cultura tendo o PRP bruto é processado com um detergente catiônico para remover as impurezas. O detergente catiônico é preferivelmente, mas não limitado a, CTAB (brometo de cetiltrimetil-amônio). Este caldo de cultura precipita os polissacarídeos como uma pelota enquanto removendo a maioria dos contaminantes que formam o sobrenadante. A pelota precipitada é depois tratada à temperatura ambiente cada uma com três tratamentos/cortes de solvente orgânico preferivelmente etanol, começando com 74 % de etanol, 34 % de etanol e 66 % de etanol respectivamente.

[0035] Estes tratamentos/cortes de etanol melhoram as características de purificação do polissacarídeo conforme facilita a remoção dos Lipo-polissacarídeos (LPS). A pelota de polissacarídeo purificada é depois submetida à zeta filtração que é obtida por carvão ativado no sobrenadante, facilitando a descoloração e eliminação dos ácidos nucleicos.

[0036] O 1o e o 3o cortes de tratamento/precipitação de etanol produzem pelotas indicadas como primeira pelota de polissacarídeo de Hib e segunda pelota de polissacarídeo de Hib respectivamente, enquanto o 2o tratamento de etanol seguido pela centrifugação produz o sobrenadante. Outra concentração e diafiltração da segunda pelota de polissacarídeo de Hib é realizada para facilitar a remoção das proteínas e outras impurezas. A amostra de PRP deste modo obtida a partir da segunda pelota de polissacarídeo de Hib é depois lavada com MQW. Consequentemente, a filtração estéril é realizada para obter o Hib-PRP purificado em um ambiente de pH controlado de 6 e 7. Tanto a produção quanto os processos de purificação são conduzidos à temperatura ambiente.

[0037] O Hib-PRP deste modo produzido e purificado é de uma qualidade que satisfaz a especificação WHO. A corroboração dos procedimentos utilizados acima pode ser convenientemente entendida a partir da Tabela 1 que claramente mostra que as especificações do PRP purificado satisfazem o padrão WHO.

Tabela 1: Testes de PRP purificado vis a vis as especificações WHO para Hib-PRP. Ό038] Todas as etapas de procedimento acima mencionada resultam na formação de pelota purificada dos polissacarídeos que podem ser novamente utilizados na produção tanto das vacinas de polissacarídeo quanto nas vacinas conjugadas.

[0039] De interesse particular é a observação de que o tempo necessário para purificar o Hib-PRP é significantemente inferior do que aquele divulgado no estado existente da literatura da técnica e prática. Além disso, o protocolo de processo de purificação da presente invenção é escalonável com o rendimento estando de acordo com os padrões WHO determinados.

Procedimentos analíticos: [0040] O PRP obtido em diferentes etapas é constantemente monitorado e analisado quanto sua pureza e rendimento. Diferentes procedimentos analíticos são indicados, mas os preferidos são como resumido abaixo: [0041] A concentração de PRP é medida pelo método de Bial modificado, usando ribose como padrão. Na reação de Bial, a ribose, como uma pentose, reage com uma solução concentrada de HCI-Cloreto férrico para produzir uma cor verde com absorção a 670 nm.

[0042] A concentração de fósforo é determinada pelo ensaio colorimétrico. Neste ensaio, as amostras são inicialmente acidificadas, depois oxidadas com ácido perclórico ou nitrato de magnésio para ativar e hidrolisar o polissacarídeo antes da lavagem do material em alta temperatura.

[0043] Na segunda parte do ensaio, ácido ascórbico age para produzir um complexo de fosfomolibdato para um composto de cor azul. A absorvência é tomada a 820 nm com D-ribose-5-fosfato dissódico desidratado como um reagente padrão contra a concentração real do fósforo presente no PRP sendo analisado. O fósforo compreende de 8,3 a 8,5 % de PRP, e o ensaio pode detectar de 5 a 10 nmoles de fósforo, ou uma unidade monomérica de PRP. O lipopolissacarídeo (LPS) é determinado usando Endosafe®-PTS® compacto e puro. Este é um espectrofotômetro de mão que utiliza cartuchos descartáveis licenciados de FDA para um teste de endotoxina preciso e conveniente. Os resultados de endotoxina quantitativos são disponíveis em 15 minutos. A impureza proteica é determinada pelo método de Lowry usando albumina de soro bovino (BSA) como um padrão e a absorvência é tomada a 750 nm. O ensaio pode detectar proteína até 6,25 pg e olhando a sensibilidade do ensaio, a amostra é testada em concentração alta/pura. Os ácidos nucleicos (NA) são estimados a 260 nm e a quantidade é calculada assumindo uma absorvência de 1,0 A = 50 pg/ml.

[0044] O tamanho molecular médio relativo (Mw) do PRP é determinado usando HPLC como mostrado na Tabela 2. As colunas usadas são da Tosoh Bioscience, PWXL-3000 e PWXL-4000 em série, usando uma faixa de 5 kD a 800 kD Pululanos como padrão. O tampão usado é 0,1 M de nitrato de sódio com um tempo de operação de 30 min em uma taxa de fluxo de 1 ml/min. A identidade de um polissacarídeo é realizada usando um teste de aglutinação de látex rápido (Remei Wellcogen Bacterial Antigen Kit). Como a especificação WHO para determinar a pureza e para caracterizar se o polissacarídeo tem base na base em peso seco, os polissacarídeos são primeiro liofilizados e depois testados. O teor de umidade é deste modo subtraído para extrair o peso seco. O teor de umidade da torta liofilizada é determinado pelo thermo Gravimetric Analyser (TGA) da Perkin Elmer.

[0045] O dito polissacarídeo Hib purificado é secado e pode ser usado para a preparação das vacinas conjugadas de polissacarídeo-proteína.

[0046] Vários aspectos da invenção descrita em detalhes acima são agora ilustradas com exemplos não limitantes: Exemplo 1: Seleção da cepa bacteriana: [0047] Haemophilus influenza tipo b (Hib) cepa #10211, é obtida da ATCC (American Tipe Cell Collection) EUA. A cultura de Hib é mantida em glicerol a 10 % e armazenada abaixo de -70° C. O meio de cultura usado para manter a cultura consiste de Caldo de Mueller Hinton como 21,0 g/l (Becton Dickinson), Hemina como 0,015 g/l (Sigma Aldrich), extrato de levedura como 5,0 g/l (Fluka), Iso Vitale X como 10 ml (Becton Dickinson), e água milliQ (MQW) como 900 ml.

Exemplo 2: Preparação do meio de propagação: [0048] O meio é preparado para a propagação da cepa bacteriana, que é mantida com base ou ácido quando deste modo requerido no valor constante de pH equivalente a 7,2 ± 0,1.

[0049] O meio para a propagação bacteriana consiste de hidrogeno fosfato de sódio como 2,5 g/l, KCI como 0,5 g/l, NaCI como 3,3 g/l, NH4CI como 0,70 g/l, Extrato de levedura como 2,0 g/l, MgS04 como 0,60 g/l, L-cisteína como 0,015 g/l, ácido L-glutâmico como 1,2 g/l, D-glicose como 5,0 g/l, Hemina como 0,020 g/l, NAD como 0,010 g/l.

Exemplo 3: Preparação do meio de propagação: [0050] O meio é preparado para a propagação da cepa bacteriana que é mantida com base ou ácido quando deste modo requerido no valor constante de pH equivalente a 7,2 ± 0,1.

[0051] O meio para a propagação bacteriana consiste de hidrogeno fosfato de sódio Di como 2,5 g/l, KC! como 0,5 g/l, NaCI como 3,3 g/l, NH4CI como 0,7g/l, Peptona bacteriológica como 15,0 g/l, Extrato de levedura como 2,0g/l, L-cisteína como 0,015 g/l, D-glicose como 5,0 g/l, ácido L-glutâmico como 1,2 g/l, NAD como 0,010 g/l, Exemplo 4: Preparação do meio de propagação: [0052] O meio é preparado para a propagação da cepa bacteriana, que é mantida com base ou ácido quando deste modo requerido no valor constante de pH equivalente a 7,2 ± 0,1.

[0053] O meio para a propagação bacteriana consiste de Hidrogeno fosfato de sódio Di como 2,5 g/l, KCI como 0,5 g/l, NaCI como 3,3 g/l, NH4CI como 0,7 g/l, Peptona bacteriológica como 15,0 g/l, Extrato de levedura como 2,0 g/l, ácido L-glutâmico como 1,2 g/l, L-cisteína como 0,015 g/l, D-glicose como 5,0 g/l, Hemina como 0,020 g/l, NAD como 0,010 g/l.

Exemplo 5: Procedimento para Inoculação: [0054] A cepa Hib deste modo obtida é submetida à inoculação. O inóculo de Hib é preparado em três frascos cônicos de 250 ml, cada frasco tendo 100 ml do dito meio de propagação bacteriana no estado líquido. O meio é inoculado com 0,5 ml de cultura de estoque de glicogênio e incubado a 35° C, por 4 a 6 horas por 150 revoluções por minuto (rpm). Estes frascos de Hib-inóculo são constantemente avaliados quanto sua densidade ótica a 550 nm usando o Espectrofotômetro de UV (Densidade ótica (OD) 55οηηη). Tão logo a densidade ótica dos frascos de inóculo tenha atingido de 0,8 a 1,0, a cultura de sementes com OD máximo é selecionada e usada para inoculação no fermentador.

Exemplo 6: Procedimento de Cultivo/Processo de Fermentação: [0055] A fermentação do frasco agitado acima preparado é realizada em um fermentador de vidro Biostat B Sartorius de 5 litros equipado com controle automático de temperatura, pH, concentração de oxigênio dissolvido (DO), quatro bombas peristálticas para adição de alimentação, álcali para o controle do pH, anti-espuma e para inóculo. Os componentes do meio usado para o cultivo estão a seguir na sua concentração preferida: [0056] O meio para o cultivo bacteriano consiste de hidrogeno fosfato de sódio como 2,5 g/l, KCI como 0,5 g/l, NaCI como 3,3 g/l, NH4CI como 0,7 g/l, Peptona bacteriológica como 15,0 g/l, Extrato de levedura como 2,0 g/l, ácido L-glutâmico como 1,2 g/l, L-cisteína como 0,015 g/l, Hemina como 0,020 g/l, NAD como 0,010 g/l, D-glicose como 5,0 g/l. Todos os componentes do meio de cultivo listados são esterilizados e resfriados a 35° C.

[0057] Os vários parâmetros de processo são controlados durante a operação de fermentação automatizada. Por exemplo, o pH do meio é controlado a 7,2 + 0,1 pela adição de 2 M de NaOH, a temperatura é mantida a 35° C, taxa de fluxo de ar é 2L/M, DO é mantida a 30 % pelo modo de cascata do fermentador e a velocidade de agitação é entre 100 a 150 rpm. A cultura de sementes com densidade ótica máxima (OD) é inoculada no fermentador. OD da cultura é medida cada hora a 550 nm usando o espectrofotômetro de UV 1800 (Shimadzu). Tão logo o OD da cultura atingiu um nível de 0,8 a 1,0, o nível de DO é mantida pelo oxigênio puro em uma taxa de fluxo de 0,2 a 0,5 l/min, pulso de glicose e extrato de levedura são depois iniciados e o nível na cultura é mantido entre 0,2 g/l a 0,5 g/l. O processo de fermentação que vai ao máximo por 10 horas com uma OD obtida de 8,10 durante a fase de crescimento é trazido a esta terminação pelo tratamento com formalina pela simples adição durante a fase de declínio.

[0058] Após o tratamento com formalina, formaldeído a 0,2 % (HCHO) é adicionado. A temperatura do fermentador é mantida a 35° C por 15 minutos e o caldo de fermentação é coletado em garrafas de centrífuga de 1 I pré-esterilizadas. A centrifugação do caldo fermentado é realizada em garrafas pré-esterilizadas de centrífuga a 8000 g por 30 minutos usando uma centrífuga RC 6+ Thermo Scientific.

[0059] Após a centrifugação, o sobrenadante é coletado em uma garrafa de vidro estéril e a pelota é coletada em bolsas biorresiduais e descontaminado em autoclave que é mantido preferivelmente a 134° C for um período de tempo de cerca de 10 minutos antes do descarte.

Exemplo 7: Concentração de Colheita pela Filtração de Fluxo Tangencial: [0060] Após a centrifugação, o sobrenadante coletado com uma massa que varia de 5,5 I a 6,0 I é concentrado até 1:10 volumes usando-se a membrana de fatia de Poli Éter Sulfona (PES) com 100Kda da película de corte em 0,11m2 (Millipore).

[0061] O sobrenadante concentrado é diafiltrado de 4 a 5 times com um volume igual de MQW ou com 0,01 M de PBS em um pH de 7,2 ± 0,1 para remover contaminantes de baixo peso molecular. A pressão de transmembrana (TMP) do sistema é mantida preferivelmente a 0,2 bar por todo o processo. Após a diafiltração, o material é recuperado e novamente processado para a purificação do polissacarídeo capsular.

Exemplo 8: Purificação e recuperação de PRP: [0062] O caldo de fermentação (FB) clarificado da cultura de Haemophilus influenzae tipo b (Hib) é concentrado e diafiltrado com água MilliQ (MQW) usando cassetes e fatia de 0,1m2 de 100 KDa. O detergente catiônico CTAB preferivelmente na concentração final de 0,5 a 1,5 % (p/v) é adicionado ao caído de fermentação e deixado durante a noite para precipitação na faixa de temperatura de 2o C a 8o C. A solução é submetida à centrifugação a 5000 rpm/4690 xg por 30 minutos no final da precipitação de CTAB para obter a pelota.

[0063] A pelota de CTAB é liquefeita em um volume mínimo de solução de NaCI, preferivelmente em uma concentração final de 4 % a 7 % p/v. Em seguida, o etanol (EtOH) é adicionado em três etapas diferentes para precipitar e purificar o polissacarídeo. Estas adições ou cortes de etanol são indicadas como 1o corte de precipitação de EtOH, 2o tratamento de EtOH e 3o corte de precipitação de EtOH. No 1o corte de precipitação de EtOH, o etanol é adicionado à solução liquefeita preferivelmente na faixa de concentração de 60 % a 90 % v/v. O pH da solução é ajustado com 8M de ácido acético na faixa de 6,7 a 6,9. A solução é depois submetida à incubação durante a noite em temperaturas de 2o C a 8o C. Subsequentemente, a centrifugação é realizada a 5000 rpm/4690 xg por 30 minutos para obter a primeira pelota de polissacarídeo de Hib.

[0064] A primeira pelota de polissacarídeo de Hib precipitada obtida do 1o corte de precipitação de EtOH é dissolvida em MQW. O detergente aniônico adequado usado é desoxicolato de sódio (DOC) para remover as impurezas proteicas e é usado preferivelmente em uma faixa de concentração de 0,5 a 1,5 % p/v com de 5 % a 20 % p/v de acetato de sódio. Após a remoção das proteínas, etanol é novamente adicionado em uma faixa de concentração de 10 % a 50 % v/v à solução que é indicada como 2o tratamento de EtOH. O pH do 2o tratamento de EtOH é ajustado com 8M de ácido acético na faixa de 6,3 a 6.5. A solução é incubada durante a noite na temperatura de 2o C a 8o C. A solução incubada é depois submetida à centrifugação a 5000rpm/4690 xg por 30 minutos para obter o sobrenadante.

[0065] O sobrenadante do 2o tratamento de EtOH é submetido à filtração de carbono (zeta). A filtração de carbono zeta é seguida pela filtração em 0,22 pm. A densidade ótica (OD) da solução resultante é analisada a 260 nm em um tempo constante e mantida abaixo de 0,2. Após determinar a OD necessária, a solução é submetida ao etanol preferivelmente na faixa de concentração de 40 % a 80 % v/v para a solução que é indicada como o 3o corte de precipitação de EtOH. O pH do 3o corte de precipitação de EtOH é ajustado com 8M de ácido acético e mantido de 6,1 a 6,3. A solução é incubada durante a noite na temperatura de 2o C a 8o C e em seguida a solução é submetida à centrifugação a 5000 rpm/4690 xg por 30 minutos para obter a segunda pelota de polissacarídeo de Hib.

[0066] A segunda pelota de polissacarídeo de Hib então coletada após o tratamento com o etanol é misturada com MQW para obter uma solução não viscosa. Finalmente, a solução é submetida à diafiltração de 100 kDa e lavada com 10 a 20 volumes de MQW. O volume de aproximadamente até 1 I é preparado com MQW para a solução diafiltrada acima e novamente submetido à filtração através de um filtro de 0,22 pm para obter o polissacarídeo de Hib purificado.

Exemplo 9: Purificação e recuperação de PRP: [0067] O FB clarificado da cultura Hib concentrado e diafiltrado com MQW usando 100 KDa de cassetes de fatia de 0,1 m2. O detergente catiônico CTAB preferivelmente na concentração final de 0,8 a 1,2 % (p/v) é adicionado no FB. A solução é incubada por de 8 a 10 horas para precipitação na temperatura de 4o C. A solução é submetida à centrifugação a 5000 rpm/4690 xg por 30 minutos para obter a pelota.

[0068] A pelota é depois liquefeita em um volume mínimo de solução de NaCI, preferivelmente na concentração finai de 5 % a 6 % p/v. A solução liquefeita é submetida ao tratamento com etanol para o primeiro corte de precipitação de EtOH preferivelmente em uma faixa de concentração de 65 % a 75 % v/v para obter a primeira pelota de polissacarídeo de Hib. O pH da solução é ajustado com 8M de ácido acético na faixa de 6,7 a 6,9. A solução é depois incubada por 8 a 10 horas para a precipitação em temperaturas de 4o C. Subsequentemente, a centrifugação é realizada a 5000 rpm/4690 xg por 30 minutos para obter a primeira pelota de polissacarídeo de Hib.

[0069] A primeira pelota precipitada de polissacarídeo de Hib assim obtida no 1o corte de EtOH é dissolvida em água destilada isenta de pirógeno ou MQW. O detergente aniônico desejado tendo a propriedade de remover as proteínas indesejáveis é usado preferivelmente DOC. O detergente aniônico assim usado está na faixa de concentração de 0,9 % a 1,2 % p/v junto com 10 a 15 % p/v de acetato de sódio. A solução obtida após o tratamento com detergente aniônico é submetida ao 2o tratamento de EtOH e tratada com etanol preferivelmente na faixa de concentração de 20 % a 40 % v/v. A solução é depois incubada por 8 a 10 horas a 4o C e o sobrenadante é coletado após centrifugar a solução por 5000 rpm/4690 xg por 30 minutos.

[0070] O sobrenadante assim obtido do 2o tratamento de EtOH é submetido à filtração de carbono (zeta). A filtração de carbono zeta é seguida pela filtração a 0,22 pm. A densidade ótica (OD) da solução resultante é analisada a 260 nm em um tempo constante e mantida abaixo e 0,2. A OD da solução é constantemente medida a 260 nm e mantida abaixo de 0,2. A solução é depois submetida ao 3o corte de precipitação de EtOH, isto é, tratada com etanol preferivelmente na faixa de concentração de 50 % a 70 %. O pH é ajustado com 8M de ácido acético na faixa de 6,1 a 6,3. A solução é incubada por 8 a 10 horas na temperatura de 4o C e submetida à centrifugação a 5000 rpm/4690 xg por 30 minutos para obter a segunda pelota de polissacarídeo de Hib.

[0071] A segunda pelota e polissacarídeo de Hib obtida do 3o corte de precipitação de EtOH é coletada e misturada com MQW para formar um solução não viscosa. Finalmente, a solução é submetida à diafiltração de 100 kDa e lavada com 10 a 20 volumes de MQW. O volume de aproximadamente 1 litro é preparado com MQW para a solução diafiltrada acima e novamente submetido à filtração através de um filtro de 0,22 pm para obter o polissacarídeo de Hib purificado.

Exemplo 10: Purificação e recuperação de PRP: [0072] O FB clarificado da cultura de Hib é concentrado e diafiltrado com MQW usando cassetes de fatias de 0,1m2 de 100 KDa. O detergente catiônico de CTAB preferivelmente na concentração final de 0,8 a 1,2 % (p/v) é adicionado no caldo de fermentação. A solução é depois incubada por 4 a 6 horas para a precipitação à temperatura ambiente (RT). A solução é submetida e a centrifugação é realizada a 5000 rpm/4690 x g por 30 minutos para obter a pelota.

[0073] A pelota é depois liquefeita no volume mínimo da solução de NaCI, preferivelmente na concentração final de 5 % a 6 % p/v. A solução liquefeita é submetida ao etanol preferivelmente na faixa de concentração de 65 % a 75 % indicada como 1o corte de precipitação de EtOH. O pH da solução é ajustado com 8M de ácido acético na faixa de 6,7 a 6,9. A solução é incubada por de 4 a 6 horas para precipitação na RT e subsequentemente centrifugada a 5000 rpm/4690 xg por 30 minutos para obter a primeira pelota de polissacarídeo de Hib.

[0074] A primeira pelota de polissacarídeo de Hib deste modo obtida no 1o corte de precipitação de EtOH é dissolvida em água destilada isenta de pirógeno ou MQW. O detergente aniônico desejado usado é DOC (p/v) para remover as impurezas proteicas e é usado preferivelmente na faixa de concentração de 0,9 % a 1,2 % com 10 % a 15 % p/v do acetato de sódio. A solução obtida após o tratamento com detergente aniônico é submetida ao 2o tratamento de EtOH e tratado com etanol preferivelmente na faixa de concentração de 20 % a 40 % v/v. O pH da solução é ajustado com 8M na faixa de 6,3 a 6,5. A solução é incubada por 4 a 5 horas à temperatura ambiente e centrifugada a 5000 rpm/4690 xg por 30 minutos para obter o sobrenadante.

[0075] O sobrenadante do 2o tratamento de EtOH é obtido e submetido à filtração zeta no carbono ativado para a descoloração e remoção dos ácidos nucleicos e em seguida submetido a uma filtração de 0,22 pm. A OD da solução é constantemente medida a 260 nm e mantida abaixo de 0,2. A solução é depois submetida ao 3o corte de precipitação de EtOH, isto é, tratada com etanol preferivelmente na faixa de concentração de 50 % a 70 % v/v. O pH é ajustado de 6,1 a 6,3 com 8M de ácido acético. A solução é incubada por de 4 a 6 horas na RT e depois submetido à centrifugação a 5000 rpm/4690 xg por 30minutos para obter a segunda pelota de polissacarídeo de Hib.

[0076] A segunda pelota de polissacarídeo de Hib obtida do 3o corte de precipitação de EtOH é coletada e misturada com MQW para formar uma solução não viscosa. Finalmente a solução é submetida à diafiitração de 100 kDa e lavada com 10 a 20 volumes de MQW. O volume de aproximadamente to 1 litro é preparado com MQW para a solução diafiltrada acima e novamente submetido à filtração através de um filtro de 0,22 pm para obter o polissacarídeo de Hib purificado.

Exemplo 11: Purificação e recuperação de PRP: [0077] O FB clarificado de Hib é concentrado e diafiltrado com MQW usando cassetes de fatias de 0,1 m2 de 100 KDa. Além disso, 1,1 % de CTAB (p/v) é adicionado no FB e deixado para precipitação por 2 horas na RT. A centrifugação é realizada a 5000 rpm/4690 x g por 30 minutos no fim na precipitação de CTAB para obter a pelota.

[0078] A pelota de CTAB é liquefeita em um volume mínimo de NaCI tendo uma concentração de 5,85 % p/v e a solução liquefeita é submetida ao 1o corte de precipitação de EtOH, isto é, etanol de concentração a 74 % v/v é adicionado à solução liquefeita. Este é indicado como o primeiro corte de precipitação de etanol. O pH da solução é ajustado com 8M de ácido acético na faixa de 6,7 a 6,9. Em seguida, a solução é incubada à temperatura ambiente por 3 horas. A solução incubada é submetida à centrifugação a 5000 rpm / 4690 xg por 30 minutos para obter a primeira pelota de polissacarídeo de Hib.

[0079] A primeira pelota de polissacarídeo de Hib assim obtida do 1o corte de precipitação de EtOH é dissolvida em MQW. Além disso, 1 % de DOC (p/v), e 10 % de acetato de sódio (p/v) são adicionados. A solução é submetida ao 2o tratamento com Etanol em que, 34 % de EtOH é adicionado à solução liquefeita acima em uma maneira às etapas. O pH da solução é ajustado com 8M de ácido acético na faixa de 6,3 a 6,5. A solução é depois incubada na RT por 3 horas e centrifugação a 5000 rpm/4690 xg por 30 minutos é realizada para obter o sobrenadante.

[0080] O sobrenadante resultante do 2o tratamento de EtOH é obtido e deixado para a filtração de carbono (filtração zeta) para a descoloração e remoção do ácido nucleico e submetida à filtração em 0,22 pm. A OD da solução é constantemente medida a 260 nm e mantida abaixo de 0,2. A solução é depois submetida ao terceiro corte de precipitação de EtOH, isto é, tratada com 66 % de etanol. O pH do 3o corte de precipitação de EtOH é ajustado com 8M de ácido acético e mantido de 6,1 a 6,3. A solução é incubada na RT por 3 horas e a centrifugação é realizada a 5000 rpm/4690 xg por 30 minutos para obter a segunda pelota de polissacarídeo de Hib.

[0081] A segunda pelota de polissacarídeo de Hib obtida do 3o corte de precipitação de EtOH é coletada e misturada com MQW para formar uma solução não viscosa. Finalmente, a solução é submetida à diafiltração de 100 kDa e lavada com 10 a 20 volumes de MQW. O volume de aproximadamente 1 litro é preparada com MQW para a solução diafiltrada acima e novamente submetida à filtração através de um filtro de 0,22 pm para obter o polissacarídeo de Hib purificado.

REIVINDICAÇÕES

Claims (10)

1. Processo rápido para produzir e purificar Hib-PRP caracterizado pelo fato de que o dito processo compreende as seguintes etapas: (a) produzir e colher o sobrenadante concentrado de polissacarídeo de Hib através de processos conhecidos, (b) precipitar o dito sobrenadante concentrado de polissacarídeo de Hib da etapa (a) com pelo menos um detergente catiônico para obter a pelota de polissacarídeo de Hib, (c) liquefazer a dita pelota de polissacarídeo de Hib da etapa (b) na solução salina e submeter esta a um solvente orgânico para o primeiro corte de precipitação para obter a primeira pelota de polissacarídeo de Hib após a incubação, (d) tratar a primeira dita pelota de polissacarídeo de Hib obtida na etapa (c) com pelo menos um detergente aniônico na presença de acetato de sódio e o dito solvente orgânico para obter o sobrenadante após a incubação, (e) submeter o dito sobrenadante da etapa (d) à filtração e ao tratamento com o dito solvente orgânico para o terceiro corte de precipitação para obter a segunda pelota de polissacarídeo de Hib após a incubação, (f) dissolver o dito segundo precipitado de polissacarídeo de Hib em água MilliQ seguido pela diafiltração para obter o polissacarídeo purificado tal que o processo inteiro de produção e purificação de Hib-PRP é rapidamente completado dentro de 25 horas à temperatura ambiente.

2. Processo rápido de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito detergente catiônico é brometo de hexadecil trimetil amônio (CTAB) na faixa de concentração de 0,8 % a 1,2 % (p/v) e mais preferivelmente na concentração de 1,1 %.

3. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o tempo total necessário para a etapa (b) varia de 1 hora e 30 minutos a 2 horas à temperatura ambiente.

4. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita solução salina na etapa (c) é uma solução de NaCI tendo uma concentração na faixa de 5,5 % a 6,5 % (p/v) e mais preferivelmente na concentração de 5,85 %.

5. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito solvente orgânico é etanol.

6. Processo de acordo com as reivindicações 1 e 5, caracterizado pelo fato de que o dito etanol na etapa (c) tem uma concentração na faixa de 70 % a 75 % v/v, a concentração do dito etanol na etapa (d) sendo na faixa de 30 % a 40 % v/v.

7. Processo de acordo com as reivindicações 1 e 5, caracterizado pelo fato de que o dito etanol na etapa (e) tem uma concentração na faixa de 60 % a 70 % v/v.

8. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito detergente aniônico na etapa (d) compreende desoxicolato de sódio (DOC) em uma faixa de concentração de 0,8 % a 1,2 % (p/v) e mais preferivelmente com uma concentração de 1 %.

9. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o tempo de incubação na etapa (c) é 2 de horas a 3 horas à temperatura ambiente com o pH sendo mantido em 6,5 a 6,9, o tempo de incubação na etapa (d) é de 2 horas a 3 horas à temperatura ambiente com o pH sendo mantido em uma faixa de 6,3 a 6,5 e o tempo de incubação na etapa (e) é de 2 horas a 3 horas à temperatura ambiente com o pH sendo mantido na faixa de 6,1 a 6,3.

10. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito processo de purificação é terminado dentro de 9 a 15 horas, preferivelmente dentro de 12 horas tal que o dito processo inteiro de produção e purificação é terminado em uma faixa de 19 a 25 horas, preferivelmente dentro de 22 horas para produzir o Hib-PRP de alta pureza.