BR102015002980A2 - processo para purificar polissacarídeo bacteriano - Google Patents

Abstract

processo para purificar polissacarídeo bacteriano" a presente invenção diz respeito a um novo processo para purificar polissacarídeo bacteriano na temperatura ambiente. o mesmo é um processo eficiente e ajustável à escala para remover impurezas do polissacarídeo de neisseria meningitidis sorogrupo a (men-a) que é capaz de ser usado como tal em uma forma derivatizada ou ligada a outras moléculas, para a preparação de vacinas, mais particularmente vacinas conjugadas para a infecção de n. meningitidis.

Description

“PROCESSO PARA PURIFICAR POLISSACARÍDEO BACTER1ANO” PREÂMBULO PARA A DESCRIÇÃO [0001] O relatório descritivo que segue particularmente descreve a invenção e a maneira em que deve ser realizada.

CAMPO DA INVENÇÃO

[0002] A presente invenção diz respeito a um novo processo para purificar polissacarídeo bacteriano. Mais particularmente a presente invenção diz respeito a um processo rápido para purificar polissacarídeo de Neisseria meningitidis sorogrupo A (Men-A) na temperatura ambiente (TA) capaz de ser usado como tai ou em uma forma derivatizada ou ligado a outras moléculas, para a preparação de vacinas, mais particularmente vacinas conjugadas para a infecção de N. meningitidis. FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO [0003] As vacinas monovalentes, bivalentes e poli (multi) valentes contendo um, dois ou mais polissacarídeos estão disponíveis no mercado para a prevenção de certas doenças ou infecções causadas por vários microorganismos. N. meningitidis, frequentemente aludida como meningococo é uma bactéria gram negativa, que causa uma série de doenças tais como meningite e septicemia. Com base no tipo de polissacarídeo capsular presente na N. meningitidis, treze sorogrupos foram identificados e os sorogrupos mais prevalecentes que causam as infecções são A, B, C,W,XeY. [0004] N. meningitidis com sorogrupo A (daqui em diante ‘Men-A’) é o patógeno mais frequentemente implicado em doenças epidêmicas na África subsaariana, ao passo que, os sorogrupos B e C foram descobertos serem responsáveis pela vasta maioria de casos de doenças epidêmicas nos países desenvolvidos tais como os Estados Unidos da América. [0005] As vacinas de polissacarídeo mono- ou multívalentes estão facilmente disponíveis no mercado para a prevenção de certas doenças ou infecções causadas por vários microorganismos. As vacinas de polissacarídeo multívalentes foram usadas por muitos anos e têm se mostrado valiosas na prevenção de doenças tais como Pneumocócícas, Meningocócicas ou Haemophiíus inffuenza. {0006] A produção da primeira vacina de polissacarídeo contra a meningite foi realizada em 1978 visto que houve uma necessidade urgente para combater esta doença fatal. Mais tarde foi observado que as vacinas não foram muito eficientes em crianças abaixo de dois anos de idade. Estas observações levaram à pesquisa adicional que revelou que as crianças têm um sistema imune imaturo. {0007]A resposta imune pode ser caracterizada como resposta imune dependente de célula T (TD) e resposta imune independente de célula T (TI). As proteínas e peptídeos são antígenos de TD que estimulam iinfócitos T auxiliares para evocar resposta imune. Os antígenos TD geram resposta imune de longa duração devido à formação de plasma e células de memória B. Ao contrário, os polissacarídeos são antígenos TI que não envolvem a ativação de célula T e não formam nenhuma das células B de memória, que é uma desvantagem principal ao se lidar com crianças visto que eles têm um sistema imune imaturo. {0008] Assim houve uma necessidade de conjugar o polissacarídeo bacteriano a um carregador de proteína que induz uma resposta imune dependente de célula T caracterizada pela ímunogenicidade aumentada entre as crianças, duração prolongada de proteção e na redução de transportados nasofaríngeos de meníngococos. Esta necessidade foi satisfeita em 1999 quando o Reino Unido tornou-se o primeiro país a introduzir a vacina conjugada do sorogrupo C meningocócico. [0009] As vacinas meníngocócicas conjugadas são disponíveis como vacinas do sorogrupo A e sorogrupo C monovafentes; sorogrupos A, C bívaientes e sorogrupos A, C, Y, W-135 tetravalentes. Evidência coletada através de numerosas descobertas de pesquisa define o aspecto imunogênico da vacina conjugada de polissacarídeo. Entretanto, existe muito pouca informação para ajudar a purificação rápida do polissacarídeo capsular de Men-A. [0010] A produção de Men-A purificado é a exigência principal para uma conjugação eficaz com a proteína carregadora e o seu desenvolvimento como uma vacina conjugada. O custo para o cultivo e a purificação de Men-A é no gerai alto e envolve longas horas de trabalho visto que envolve uma série de etapas de produção e purificação, A melhora em uma ou mais das etapas de cultivo e purificação pode levar a uma mudança significante na produção de vacina conjugada global e consequentemente torna o processo reíativamente econômico. [0011] Existem várias patentes, que descrevem o processo para a purificação de políssacarídeos Men-A. O estado da técnica existente descrito na patente US N° 7.491.517 B2 para precipitar políssacarídeos Men-A com CTAB envolve a incubação durante a noite a 4 °C. Além disso, o processo também requer a filtração em gel para a purificação dos políssacarídeos Men-A. O procedimento global requer tempo significante para a purificação e também o processo torna-se caro por causa do uso da cromatografia. [0012] O pedido de Patente Européia N° 2,277,539 A2 divulga 12 horas de incubação para a precipitação de políssacarídeos de Men-A com CTAB. A patente também descreve 16 a 20 horas de extração com etanoi depois precipitação com CTAB. O problema com a invenção é o tempo sígníficantemente alto (26 a 28 horas) requerido para purificar o políssacarídeo. [0013}Também a publicação de patente internacional WO 2011/148382 A1 descreve o método de preparar políssacarídeo capsuiar puro usando fosfato de alumínio e álcooi para a purificação de políssacarídeos capsuiares de H influenzae b, N. meníngitidis tal como dos sorogrupos A, C, Y, W-135 e outros políssacarídeos capsuiares relacionados similares produzidos a partir de microorganismos tanto gram negativos quanto gram positivos. A dita técnica anterior publicada divulga um tempo de 16 a 20 horas para a purificação dos políssacarídeos. [0014] Atualmente, os vários métodos usados para a produção e purificação de Men-A levam tempos de cultivo e purificação relativamente longos de aproximadamente 24 a 40 horas aumentando deste modo o custo de produção e tornando o processo comercialmente menos praticável visto que eles não podem ter a escala ampliada {sçaled up) em uma maneira econômica e em tempo hábil. [0015] Além disso, as técnicas anteriores expostas acima divulgam um método que envolve o tratamento de políssacarídeos com enzimas que resulta na adição de custos em pesquisa e produção. Além disso, alguns dos métodos correntes debatem o uso de etapas de cromatografía que ievam à produção de um poiissacarídeo com rendimentos baixos e podem aumentar o custo de produção em escalas grandes ou durante o aumento, Estes métodos aumentam ainda o tempo de processo total a um grau maior. (0016] A despeito de vários estudos e pesquisa realizados sobre estes polissacarídeos, existe uma necessidade a muito sentida para desenvolver um processo industrial que pudesse ser completado em um período curto de tempo, O presente processo fornece os polissacarídeos com melhor rendimento e qualidade realçada.

OBJETIVO DA INVENÇÃO {0017]O objetivo principal da presente invenção é fornecer um novo processo para purificar poiissacarídeo bacteriano. {0018] Um outro objetivo da invenção é fornecer um processo rápido para purificar poiissacarídeo bacteriano enquanto se elimina as impurezas em um tempo muito curto na temperatura ambiente pelo processo simples e eficiente. {0019JAinda um outro objetivo significante da presente invenção ê realizar a purificação do poiissacarídeo sem tratamento enzimático resultando em um processo eficaz em custo e comerciaímente ajustável à escala. {0020] Já um outro objetivo da presente invenção é produzir poiissacarídeo de alta qualidade com rendimento mais alto que atinja as especificações da WHO.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO {00213 Consequentemente, a presente invenção divulga um novo processo para a purificação de poiissacarídeo bacteriano, mais especificamente o “poiissacarídeo Men-A”. O processo diz respeito a um método rápido, econômico e ajustável à escala, para a purificação do poiissacarídeo bacteriano Men-A em um tempo significantemente reduzido e é realizado na temperatura ambiente. {0022] O processo da presente invenção envolve o uso de caldo fermentado de cepa bactéria na adequada que neste caso é o sorogrupo A de N. meningitidis. Este caldo fermentado é preparado pelo processo conhecido que envolve as etapas tais como a preparação de meio, inoculação da dita cepa bacteriana em cultura de estoque de gíicerol e incubação em temperatura predefinida por um período de tempo ideai em revoluções por minuto (rpm) pré-definidas, A cepa bacteriana selecionada é cultivada no meio de cultivo otimizado no fermentador para obter o caldo fermentado que é depois usado no novo processo de purificação, {0023]O caldo fermentado assim obtido é submetido à centrifugação na faixa de 4000 rpm/3000 x g a 6000 rpm/6750 x g para clarificar o caído fermentado por 30 minutos seguido pela concentração do sobrenadante fermentado pela uitrafiltração usando membrana com peso molecular de corte. [0024] O sobrenadante concentrado ultrafiltrado tendo o pofissacarídeo Men-A bruto (MenA-PS) é precipitado misturando-o com um detergente catiônico de alta concentração. O detergente catiônico preferido, mas limitado ao Brometo de Hexa Cetil Trimetilamônio (CTAB) é usado para realizar o processo de purificação. O péiete de CTAB precipitado com o MenA-PS bruto é liquefeito em solução de etano! de concentração muito alta preferivelmente na faixa de 76 % (v/v) a 96 % (v/v) seguido pela fiítração em carbono. O sobrenadante obtido da filtração em carbono é precipitado com CaCE. Este precipitado è dissolvido em água MilliQ (MQW) e depois díafiltrado e concentrado com CaCÍ2e subsequentemente com MQW.

{0025] O processo exibe várias vantagens em relação à técnica anterior, tal como fornecer um processo robusto e rápido de preparar polissacarídeo Men A tendo cadeia principal de fósforo. O processo também é econômico visto que o mesmo reduz o tempo para a purificação e pode ser realizado na temperatura ambiente, Uma vantagem adicional é que este processo é completamente ajustável à escala, DESCRIÇÃO RESUMIDA DOS DESENHOS [0026] Figura 1 Representa o fluxo de processo para a purificação e recuperação de MenA-PS, [0027] Figura 2 Representa o Cromatograma de HPLC de MenA-PS [0028] Figura 3 Representa o espectro de RMN de MenA-PS.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO COM REFERÊNCIA AOS DESENHOS EEXEMPLOS [0029] A invenção divulga uma série de etapas que foram otimizadas para possibilitar a purificação de polissacarideo bacteriano em menos tempo e na temperatura ambiente. [0030] A cepa de polissacarideo bacteriano é inoculada no fermentador contendo componentes de meio apropriados requeridos para o crescimento bacteriano. Depois de obter uma certa densidade óptica pré-determinada o crescimento bacteriano é submetido à finalização pela adição de formafdeído e o caldo de fermentação (CF) resultante é obtido. [0031] O caldo de fermentação (CF) obtido a partir do fermentador é coletado nas garrafas e o CF é submetido à centrifugação para obter o sobrenadante, O sobrenadante resultante é concentrado e díafiltrado usando membrana com peso molecular de corte de preferivelmente mas limitado a cassetes de 100 KDa 0,1 m2 de seção. Depois da concentração e diafiltração o material recuperado é depois processado para purificação. £0032]O CF díafiltrado e concentrado tendo o polissacarideo bruto é tratado com detergente catiônico e é incubado na temperatura ambiente durante período de tempo predeterminado resultando na formação de pélete precipitado de polissacarideo, isto é, primeiro pélete, O primeiro pélete assim obtido é homogeneizado em rpm predeterminado por tempo predeterminado. O primeiro pélete homogeneizado é depois liquefeito em solvente orgânico, mais preferivelmente etanoí seguido pela filtração em carbono. O sobrenadante filtrado é tratado com agente de precipitação resultando em precipitados. Os precipitados assim obtidos são centrifugados para obter o segundo pélete. Os segundos péletes são depois dissolvidos em MQW. Os péletes dissolvidos são depois submetidos à concentração e diafiltração com volumes predeterminados de CaCI2 e água MilliG (MQW). Consequentemente a filtração estéril é realizada para obter o polissacarideo bacteriano purificado. [0033] O polissacarideo bacteriano purificado assim obtido é analisado quanto ao fósforo, O-actila, proteína, ácido nucléico, endotoxina e peso molecular médio relativo. [0034] Em uma forma de realização preferida, MenA (Neissería meningitidis (Albrecht e Ghon) Murray (ATCC® 13077*) é obtido da ATCC {American Type Culture Collection), USA e é ainda inocuiada no fermentador contendo componentes de meio apropriados requeridos para o crescimento bacteriano. Depois da conciusão da fase de crescimento que é determinada peio início do aumento no pH e diminuição na densidade óptica (quando comparado à OD máxima alcançada), a fermentação é terminada pela adição de 0,2 % de formaldeído (HCHO) e a temperatura do fermentador é mantida a 35 °C por 15 minutos, [0035] O caldo de fermentação obtido do fermentador é coletado nas garrafas e o caldo fermentado é submetido à centrifugação para obter o sobrenadante. O sobrenadante resultante é concentrado e diafiltrado. Depois da concentração e diafiitração o material recuperado é depois processado para a purificação. [0036] O esquema de purificação como mostrado na Figura 1 é amplamente dependente das propriedades fisico-químícas do polissacarídeo, quantidade de impurezas, que são requeridas a serem ainda removidas, e o tempo levado para completar o processo inteiro. [0037] O caldo diafiltrado e concentrado tendo o polissacarídeo bruto de Men A é tratado com detergente catiônico CTAB e é incubado na temperatura ambiente por um período de tempo de 1 hora a 6 horas, mais preferivelmente por 1 hora resultando na formação do primeiro péiete precipitado isto é, o pêlete de CTAB com o polissacarídeo Men-A bruto. O péiete de CTAB assim obtido é semelhante à borracha por natureza e altamente viscosa. O péiete de CTAB é liquefeito em etanol em uma faixa de concentração de 76 % a 96 %, porém mais preferivelmente homogeneizado por 20 minutos a 1000 rpm em volume mínimo de 96 % de etanol e depois disso algum volume mais de etanol a 96 % é adicionado ao péiete de CTAB homogêneo sob agitação contínua por 40 minutos. Este processo resulta na redução da viscosidade do péiete de CTAB a um grau maior. Esta redução na viscosidade é suficiente para o péiete de CTAB tornar-se dissolvido em etanol a um grau maior levando à purificação rápida de MenA-PS. Esta solução homogênea é depois submetida à centrifugação para separar qualquer material não dissolvido. A solução homogeneizada é filtrada em carbono mais preferivelmente com filtros de carbono zeta. O sobrenadante filtrado é tratado com CaCl2 na faixa de 0,05 M a 0,2 M e mantido de lado para precipitação durante tempo predeterminado na temperatura ambiente resultando em precipitados. Os precipitados resultantes são submetidos à centrifugação a 4000 rpm/3000 x g a 6000 rpm/6750 x g para obter o segundo pétete, O segundo pélete é depois dissolvido em MQW. Os péletes dissolvidos são depois submetidos à concentração e díafiltração com volumes predeterminados de CaCÍ2 e água MilliQ (MQW). Consequentemente a filtração estéril é realizada para obter o MenA-PS purificado. [0038]O MenA-PS é analisado por uma série de testes analíticos e os resultados são apresentados na Tabela 1 Tabela 1: As especificações do políssacarídeo Men-A purificado de acordo com a especificação da WHO são mostradas abaixo: ;0039]0 políssacarídeo bacteriano purificado é depois armazenado a -20 °C e è capaz de ser usado como tal ou em uma forma derivatizada ou ligada a outras moléculas, para a preparação de vacinas, mais particularmente vacinas conjugadas para a infecção de N. meningitidis. [00401 Portanto, a presente invenção fornece um processo novo, rápido e ajustáveí à escala para purificar os pofíssacarídeos de Men-A em tempo signíficantemente reduzido quando comparado com aqueles divulgados nas técnicas anteriores que pode ser completado em menos do que 9 horas e está de acordo com o padrão estabelecido da WHO. [0041] Procedimentos analíticos; [0042] A concentração de fósforo para Men-A é determinada pelo ensaio colorímétrico. Neste ensaio, as amostras são inícialmente acidificadas, depois oxidadas com ácido percíórico (método de Chen) (Chen Jr et al., 1956) ou nitrato de magnésio (método de Ames) (Ames, 1966) para ativar e hidrolisar o polissacarídeo antes de transformar o material em cinzas em alta temperatura. Na segunda parte do ensaio, o ácido ascórbico atua para reduzir um complexo de fosfomoíibdato para um composto de cor azul. A absorbância é levada até 820 nm com D-ribose-5-fosfato díssódtco díidratado como um padrão. O teor de O-acetila do polissacarídeo MenA é determinado pelo método colorímétrico (Hestrin, 1949). O ensaio está fundamentado na descoberta de que a hidroxilamína em um pH alcalino em água rapidamente converte acetilcolína estequiometricamente em ácido hidroxâmico através de uma ampla faixa de concentração de éster. A densidade da cor púrpura-marrom é determinada a 540 nm. [0043] O lipopolissacartdeo (LPS) é determinado usando Endosafe®-PTS® compacto e simples. A impureza de proteína é determinado pelo método de Lowry (Lowry et al., 1951) usando albumina séríca bovina (BSA) como um padrão e a absorbância é tirada a 750 nm. Os ácidos nucléícos (NA) são estimados a 260 nm e a quantidade é calculada assumindo uma absorbância de 1,0 A = 50 pg/mf (Frasch, 1990). [0044] O peso molecular médio relativo (Mw) é determinado usando HPLC (Alliance, Waters) como mostrado na Figura 2. As colunas usadas são PWXL-4000 e PWXL-5000 na série para Men-A. Além disso, uma faixa de 5 kD a 800 kD de Pululanos (Shodex) é usada como padrões para MenA. Também o tampão usado é de 0,1 M de Nitrato de Sódio com um tempo de condução de 30 min a uma taxa de fluxo de 1 ml/m. A identidade de MenA-PS é verificada pela espectroscopia de 1H-RMN como mostrado na Figura 3. A RMN produz um espectro de núcleos magnéticos sensíveis {por exemplo, 1H, 13C e 31P). Também o MenA-PS é identificado sorologicamente pela combinação com os antí-soros específicos contra o poiíssacarídeo. Visto que as especificações da WHO [WHO, 2006] para determinar a pureza e para caracterizar o poiíssacarídeo estão fundamentadas com base em peso seco, o pofissacarídeo é primeiro liofilizado e depois testado. O teor de umidade é assim subtraído para obter o peso seco exato. O teor de umidade da torta iiofiiizada é determinado pelo Analisador Termo gravimétrico (TGA) da Perkin Elmer. [0045] Vários aspectos da invenção descrita em detalhes acima são agora ilustrados com exemplos não limitantes: [0046] Exemplo 1 10047]O caldo de fermentação (CF) clarificado da cultura de MenA é concentrado e diafiitrado com água MilíiG (MQW) usando cassetes de 100 KDa 0,1 m2 de seção. O detergente catiônico, a saber, o Brometo de Hexa Cetít Trimetiiamônio (CTAB) preferivelmente na concentração final de 0,5 a 2 % (p/v) é adicionado no CF e deixado para a precipitação durante a noite de 2 a 8 °C. A centrífugação é feita a 5000 rpm/4690 x g por 30 minutos no final da precipitação com CTAB para obter o pélete. O péiete de CTAB é liquefeito em volume mínimo de solução de etanol (preferivelmente em uma faixa de concentração de 78 a 96 %). A dissolução é realizada por 8 horas com incubação de 2 a 8 °C. A centrífugação é mais uma vez realizada a 5000 rpm/4690 x g por 30 min. Consequentemente o sobrenadante obtido foi processado ainda usando filtração em carbono com filtros de carbono zeta até que a OD260nm atinja 0,2 ou menos. Isto é seguido pela filtração a 0,22 pm. Além disso, CaCI2 (solução de estoque a 2 M) em uma concentração de trabalho entre 0,05 e 0,2 M é adicionado no sobrenadante filtrado e mantido para precipitação por 4 horas min de 2 a 8°C. A centrífugação é feita a 5000 rpm/4690 g por 30 min para obter o pélete. Finalmente o péiete ê dissolvido em MQW, e diafiltração de 300 KDa é feita com 10 a 15 volumes de CaCl2 50 mM e depois com 10 a 15 volumes de MQW. O potissacarideo Men A obtido é filtrado com filtro de 0,22 pm, e armazenado a -20 °C ou menos para uso mais adiante. [0048] Exemplo 2 [0049] O CF clarificado de cultura MenA é concentrado e díafiltrado com MQW usando cassetes de 100 KDa 0,1 m2 de seção. O detergente catiônico, CTAB preferivelmente na concentração final de 0,8 a 1,6 % (p/v) é adicionado no CF e deixado para precipitação durante a noite de 2 a 8 °C. A centrifugação é feita a 5000 rpm/4690 x g por 30 minutos no final da precipitação com CTAB para obter o pélete, O pélete de CTAB é liquefeito em volume mínimo de solução de etanol (preferivelmente em uma faixa de concentração de 86 a 96 %). A dissolução é realizada por 4 horas com incubação na temperatura ambiente. A centrifugação é mais uma vez realizada a 5000 rpm/4690 x g por 30 min. Consequentemente o sobrenadante obtido é processado ainda mais usando filtração em carbono com filtros de carbono zeta até que a OD260nm atinja 0,2 ou menos. Isto é seguido pela filtração em 0,22 pm. Além disso, CaCh (solução de estoque de 2 M) em uma concentração de trabalho entre 0,09 e 0,18 M é adicionado no sobrenadante filtrado e mantidos para a precipitação por 3 horas min de 2 a 8 °C, A centrifugação é feita a 5000 rpm/4690 g por 30 min para obter o pélete. Finalmente o pélete é dissolvido em MQW, e a dsafiltração em 300 KDa é feita com 10 a 15 volumes de CaCl2 50 mM e depois com 10 a 15 volumes de MQW. O poüssacarídeo Men A obtido é filtrado com filtro 0,22 pm, e armazenado a -20 °C ou menos para uso mais adiante. [0050] Exemplo 3 [0051] O CF clarificado de cultura MenA é concentrado e díafiltrado com MQW usando cassetes de 100 KDa 0,1 m2 de seção. O detergente catiônico CTAB preferivelmente em concentração final de 1 a 1,5 % (p/v) é adicionado no CF e deixado por 6 horas na temperatura ambiente. A centrifugação é feita a 5000 rpm/4690 x g por 30 minutos no final da precipitação com CTAB para obter o pélete. O pélete de CTAB é liquefeito em volume mínimo de solução de etanol (preferivelmente em uma concentração de 90 a 96 %). A dissolução é realizada por 3 horas com incubação na temperatura ambiente. A centrifugação é mais uma vez realizada a 5000 rpm/4690 x g por 30 min. Consequentemente, o sobrenadante obtido é processado ainda usando filtração em carbono com filtros de carbono zeta até que a ODaeonm atinja 0,2 ou menos. Isto é seguido peta filtração a 0,22 pm. Depois da filtração, CaCE (solução de estoque de 2 M) em uma concentração de trabalho entre 0,10 e 0,15 M é adicionado no sobrenadante filtrado e mantido para precipitação por 2 horas na temperatura ambiente. A centrifugação é feita a 5000 rpm/4690 g por 30 min para obter o pélete. Finalmente o pélete é dissolvido em MQW, e diafiltração de 300 KDa é feita com 10 a 15 volumes de CaCb 50 mM e depois com 10 a 15 volumes de MQW, O polissacarídeo Men A obtido é filtrado com filtro de 0,22 pm, e armazenado a -20 °C ou menos para uso mais adiante. [0052] Exemplo 4 [0053] O CF clarificado da cultura de MenA é concentrada e diafiltrada com MQW usando cassetes de 100 KDa 0,1 m2 de seção. O detergente catiônico, CTAB, preferivelmente na concentração fina! de 1,2 % (p/v) é adicionado no CF e deixado para precipitação por 1 hora na temperatura ambiente seguido pela centrifugação a 5000 rpm/4690 x g por 30 minutos para obter o pélete. O pélete de CTAB é homogeneizado por 20 minutos a 1000 rpm em volume mínimo de etanol a 96 % e depois disso algum volume mais de etanol a 96 % é adicionado ao pélete de CTAB homogêneo sob agitação continua agitando por 40 minutos. A dissolução total é realizada por 1 hora com incubação na temperatura ambiente. O pélete de CTAB, que é semelhante à borracha por natureza e aítamente viscoso, perde a sua viscosidade a um grau maior durante a homogeneização permitindo deste modo a mistura apropriada e rápida de etanol dentro de uma hora, A centrifugação é mais uma vez realizada a 5000 rpm/4690 x g por 30 min. Consequentemente o sobrenadante obtido é processado ainda mais usando a filtração em carbono com filtros de carbono zeta até que a OD26onm atinja 0,2 ou menos. Isto é seguido pela filtração de 0,22 pm. Depois da filtração, CaCE 0,15 M (usando solução de estoque de 2 IV!) é adicionado no sobrenadante filtrado e mantido para precipitação por 30 m na temperatura ambiente. A centrifugação é feita a 5000 rpm/4690 x g por 30 min para obter o pélete. Finalmente o pélete é dissolvido em MQW, e diafiltração de 300 KDa é feita com 8 a 10 volumes de GaCh 50 mM e depois com 8 a 10 volumes de MQW. O polissacarídeo Men A assim obtido é filtrado com filtro de 0,22 pm, e armazenado a -20 °C para uso mais adiante.

Claims (15)

1. Processo para purificar polissacarídeo bacteriano de uma cepa bacteriana na temperatura ambiente em ambiente estéril, o dito processo caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) clarificar o caldo de fermentação da dita cepa bacteriana por cenírífugação para obter o sobrenadante fermentado; (b) submeter o dito sobrenadante fermentado da etapa (a) à concentração e diafiltração usando uma membrana com peso molecular de corte para obter o polissacarídeo bacteriano bruto; (c) precipitar o dito polissacarídeo bacteriano bruto da etapa (b) com pelo menos um detergente catiônico seguido pela cenírífugação para obter o primeiro pélete; (d) submeter o dito primeiro pélete da etapa (c) à homogeneização em rpm predeterminado durante tempo de incubação predeterminado em pelo menos um solvente orgânico para obter o primeiro pélete homogeneizado. (e) submeter o dito primeiro pélete homogeneizado da etapa (d) à centrifugação seguida por filtração em carbono para obter sobrenadante filtrado. (f) precipitar o dito sobrenadante filtrado da etapa (e) com agente de precipitação para obter precipitado e submeter o dito precipitado à centrifugação para obter segundo pélete; (g) submeter dito segundo pélete da etapa (f) à dissolução em MQW e depois submeter os péletes dissolvidos à diafiltração e concentração para obter o polissacarídeo purificado em menos do que 9 horas em que a pureza do dito polissacarídeo purificado está de acordo com os padrões da WHO.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita cepa bacteriana é Neissería meningitidis e o dito polissacarídeo bacteriano é o polissacarídeo de Neissería meningitidis sorogrupo A (Men-A).

3. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polissacarídeo purificado é obtido preferivelmente em 6 a 9 horas.

4. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita centrifugação do caído fermentado na etapa (a) é realizada na faixa de 4000 rpm/3000 x g a 6000 rpm/6750 x g.

5. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita membrana com peso molecular de corte são cassetes de 100 KDa 0,1 m2 de seção.

6. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito detergente catiôníco é o Brometo de Hexa Cetil Trimetil amônio {CTAB) usado na faixa de concentração de 0,5 % (p/v) a 2 % (p/v).

7. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado peto fato de que o dito primeiro pétete da etapa (c) é o pélete de CTAB obtido por centrifugação a 4000 rpm/3000 x g a 6000 rpm/6750 x g por 30 min.

8. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito primeiro pétete da etapa (d) é homogeneizado a 1000 rpm durante o dito tempo de incubação de 20 minutos usando o dito solvente orgânico,

9. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito primeiro pélete homogeneizado da etapa (d) é dissolvido ainda sob agitação contínua por 40 minutos usando um solvente orgânico.

10. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito solvente orgânico é etanol na faixa de concentração de 76 % (v/v) a 96 % (v/v).

11. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita filtração em carbono da etapa (e) é realizada com filtros de carbono zela atingindo a ODzeonm abaixo de 0,2 seguido pela filtração a 0,22 pm para obter o dito sobrenadante.

12. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito agente de precipitação é CaCI2 na faixa de 0,05 M a 0,2 M que é adicionado ao sobrenadante filtrado para obter o precipitado em 30 minutos a 2 horas.

13. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita centrifugação do precipitado na etapa (f) é realizada a 5000 rpm/4690 g por 30 minutos.

14. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito segundo pélete é dissolvido em MGW.

15. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito segundo pélete é diafiltrado e concentrado com 8 a 15 volumes de CaCh 50 mM seguido por 8 a 15 volumes de MQWe filtrado ainda usando filtro de 0,22 pm para produzir MenA-PS purificado.