BR102015002980B1

BR102015002980B1 - processo para purificar polissacarídeo bacteriano

Info

Publication number: BR102015002980B1
Application number: BR102015002980-2A
Authority: BR
Inventors: Davinder Gill; Sandeep Sharma; Sarmad HANIF; Nitin Kumar
Original assignee: Msd Wellcome Trust Hilleman Laboratories Pvt. Ltd
Priority date: 2014-02-17
Filing date: 2015-02-10
Publication date: 2021-07-06
Also published as: BR102015002980A2; ZA201501075B

Abstract

PROCESSO PARA PURIFICAR POLISSACARÍDEO BACTERIANO. A presente invenção diz respeito a um novo processo para purificar polissacarídeo bacteriano na temperatura ambiente. O mesmo é um processo eficiente e ajustável à escala para remover impurezas do polissacarídeo de Neisseria meningitidis sorogrupo A (Men-A) que é capaz de ser usado como tal em uma forma derivatizada ou ligada a outras moléculas, para a preparação de vacinas, mais particularmente vacinas conjugadas para a infecção de N. meningitidis.

Description

PREÂMBULO PARA A DESCRIÇÃO

[0001] O relatório descritivo que segue particularmente descreve a invenção e a maneira em que deve ser realizada.

CAMPO DA INVENÇÃO

[0002] A presente invenção diz respeito a um novo processo para purificar polissacarídeo bacteriano. Mais particularmente a presente invenção diz respeito a um processo rápido para purificar polissacarídeo de Neisseria meningitidis sorogrupo A (Men-A) na temperatura ambiente (TA) capaz de ser usado como tal ou em uma forma derivatizada ou ligado a outras moléculas, para a preparação de vacinas, mais particularmente vacinas conjugadas para a infecção de N. meningitidis.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[0003] As vacinas monovalentes, bivalentes e poli (multi) valentes contendo um, dois ou mais polissacarídeos estão disponíveis no mercado para a prevenção de certas doenças ou infecções causadas por vários microorganismos. N. meningitidis, frequentemente aludida como meningococo é uma bactéria gram negativa, que causa uma série de doenças tais como meningite e septicemia. Com base no tipo de polissacarídeo capsular presente na N. meningitidis, treze sorogrupos foram identificados e os sorogrupos mais prevalecentes que causam as infecções são A, B, C, W, X e Y.

[0004] N. meningitidis com sorogrupo A (daqui em diante ‘Men-A’) é o patógeno mais frequentemente implicado em doenças epidêmicas na África subsaariana, ao passo que, os sorogrupos B e C foram descobertos serem responsáveis pela vasta maioria de casos de doenças epidêmicas nos países desenvolvidos tais como os Estados Unidos da América.

[0005] As vacinas de polissacarídeo mono- ou multivalentes estão facilmente disponíveis no mercado para a prevenção de certas doenças ou infecções causadas por vários microorganismos. As vacinas de polissacarídeo multivalentes foram usadas por muitos anos e têm se mostrado valiosas na prevenção de doenças tais como Pneumocócicas, Meningocócicas ou Haemophilus influenza.

[0006] A produção da primeira vacina de polissacarídeo contra a meningite foi realizada em 1978 visto que houve uma necessidade urgente para combater esta doença fatal. Mais tarde foi observado que as vacinas não foram muito eficientes em crianças abaixo de dois anos de idade. Estas observações levaram à pesquisa adicional que revelou que as crianças têm um sistema imune imaturo.

[0007] A resposta imune pode ser caracterizada como resposta imune dependente de célula T (TD) e resposta imune independente de célula T (TI). As proteínas e peptídeos são antígenos de TD que estimulam linfócitos T auxiliares para evocar resposta imune. Os antígenos TD geram resposta imune de longa duração devido à formação de plasma e células de memória B. Ao contrário, os polissacarídeos são antígenos TI que não envolvem a ativação de célula T e não formam nenhuma das células B de memória, que é uma desvantagem principal ao se lidar com crianças visto que eles têm um sistema imune imaturo.

[0008] Assim houve uma necessidade de conjugar o polissacarídeo bacteriano a um carregador de proteína que induz uma resposta imune dependente de célula T caracterizada pela imunogenicidade aumentada entre as crianças, duração prolongada de proteção e na redução de transportados nasofaríngeos de meningococos. Esta necessidade foi satisfeita em 1999 quando o Reino Unido tornou-se o primeiro país a introduzir a vacina conjugada do sorogrupo C meningocócico.

[0009] As vacinas meningocócicas conjugadas são disponíveis como vacinas do sorogrupo A e sorogrupo C monovalentes; sorogrupos A, C bivalentes e sorogrupos A, C, Y, W-135 tetravalentes. Evidência coletada através de numerosas descobertas de pesquisa define o aspecto imunogênico da vacina conjugada de polissacarídeo. Entretanto, existe muito pouca informação para ajudar a purificação rápida do polissacarídeo capsular de Men-A.

[0010] A produção de Men-A purificado é a exigência principal para uma conjugação eficaz com a proteína carregadora e o seu desenvolvimento como uma vacina conjugada. O custo para o cultivo e a purificação de Men-A é no geral alto e envolve longas horas de trabalho visto que envolve uma série de etapas de produção e purificação. A melhora em uma ou mais das etapas de cultivo e purificação pode levar a uma mudança significante na produção de vacina conjugada global e consequentemente torna o processo relativamente econômico.

[0011] Existem várias patentes, que descrevem o processo para a purificação de polissacarídeos Men-A. O estado da técnica existente descrito na patente US N° 7.491.517 B2 para precipitar polissacarídeos Men-A com CTAB envolve a incubação durante a noite a 4 °C. Além disso, o processo também requer a filtração em gel para a purificação dos polissacarídeos Men-A. O procedimento global requer tempo significante para a purificação e também o processo torna-se caro por causa do uso da cromatografia.

[0012] O pedido de Patente Européia N° 2,277.539 A2 divulga 12 horas de incubação para a precipitação de polissacarídeos de Men-A com CTAB. A patente também descreve 16 a 20 horas de extração com etanol depois precipitação com CTAB. O problema com a invenção é o tempo significantemente alto (26 a 28 horas) requerido para purificar o polissacarídeo.

[0013] Também a publicação de patente internacional WO 2011/148382 A1 descreve o método de preparar polissacarídeo capsular puro usando fosfato de alumínio e álcool para a purificação de polissacarídeos capsulares de H. influenzae b, N. meningitidis tal como dos sorogrupos A, C, Y, W-135 e outros polissacarídeos capsulares relacionados similares produzidos a partir de microorganismos tanto gram negativos quanto gram positivos. A dita técnica anterior publicada divulga um tempo de 16 a 20 horas para a purificação dos polissacarídeos.

[0014] Atualmente, os vários métodos usados para a produção e purificação de Men-A levam tempos de cultivo e purificação relativamente longos de aproximadamente 24 a 40 horas aumentando deste modo o custo de produção e tornando o processo comercialmente menos praticável visto que eles não podem ter a escala ampliada (scaled up) em uma maneira econômica e em tempo hábil.

[0015] Além disso, as técnicas anteriores expostas acima divulgam um método que envolve o tratamento de polissacarídeos com enzimas que resulta na adição de custos em pesquisa e produção. Além disso, alguns dos métodos correntes debatem o uso de etapas de cromatografia que levam à produção de um polissacarídeo com rendimentos baixos e podem aumentar o custo de produção em escalas grandes ou durante o aumento. Estes métodos aumentam ainda o tempo de processo total a um grau maior.

[0016] A despeito de vários estudos e pesquisa realizados sobre estes polissacarídeos, existe uma necessidade a muito sentida para desenvolver um processo industrial que pudesse ser completado em um período curto de tempo. O presente processo fornece os polissacarídeos com melhor rendimento e qualidade realçada.

OBJETIVO DA INVENÇÃO

[0017] O objetivo principal da presente invenção é fornecer um novo processo para purificar polissacarídeo bacteriano.

[0018] Um outro objetivo da invenção é fornecer um processo rápido para purificar polissacarídeo bacteriano enquanto se elimina as impurezas em um tempo muito curto na temperatura ambiente pelo processo simples e eficiente.

[0019] Ainda um outro objetivo significante da presente invenção é realizar a purificação do polissacarídeo sem tratamento enzimático resultando em um processo eficaz em custo e comercialmente ajustável à escala.

[0020] Já um outro objetivo da presente invenção é produzir polissacarídeo de alta qualidade com rendimento mais alto que atinja as especificações da Organização Mundial da Saúde (OMS).

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0021] Consequentemente, a presente invenção divulga um novo processo para a purificação de polissacarídeo bacteriano, mais especificamente o “polissacarídeo Men-A”. O processo diz respeito a um método rápido, econômico e ajustável à escala, para a purificação do polissacarídeo bacteriano Men-A em um tempo significantemente reduzido e é realizado na temperatura ambiente.

[0022] O processo da presente invenção envolve o uso de caldo fermentado de cepa bacteriana adequada que neste caso é o sorogrupo A de N. meningitidis. Este caldo fermentado é preparado pelo processo conhecido que envolve as etapas tais como a preparação de meio, inoculação da dita cepa bacteriana em cultura de estoque de glicerol e incubação em temperatura predefinida por um período de tempo ideal em revoluções por minuto (rpm) pré-definidas. A cepa bacteriana selecionada é cultivada no meio de cultivo otimizado no fermentador para obter o caldo fermentado que é depois usado no novo processo de purificação.

[0023] O caldo fermentado assim obtido é submetido à centrifugação na faixa de 4000 rpm/3000 x g a 6000 rpm/6750 x g para clarificar o caldo fermentado por 30 minutos seguido pela concentração do sobrenadante fermentado pela ultrafiltração usando membrana com peso molecular de corte.

[0024] O sobrenadante concentrado ultrafiltrado tendo o polissacarídeo Men-A bruto (MenA-PS) é precipitado misturando-o com um detergente catiônico de alta concentração. O detergente catiônico preferido, mas limitado ao Brometo de Hexa Cetil Trimetilamônio (CTAB) é usado para realizar o processo de purificação. O pélete de CTAB precipitado com o MenA-PS bruto é liquefeito em solução de etanol de concentração muito alta preferivelmente na faixa de 76 % (v/v) a 96 % (v/v) seguido pela filtração em carbono. O sobrenadante obtido da filtração em carbono é precipitado com CaCl2. Este precipitado é dissolvido em água MilliQ (MQW) e depois diafiltrado e concentrado com CaCl2 e subsequentemente com MQW.

[0025] O processo exibe várias vantagens em relação à técnica anterior, tal como fornecer um processo robusto e rápido de preparar polissacarídeo Men A tendo cadeia principal de fósforo. O processo também é econômico visto que o mesmo reduz o tempo para a purificação e pode ser realizado na temperatura ambiente. Uma vantagem adicional é que este processo é completamente ajustável à escala. DESCRIÇÃO RESUMIDA DOS DESENHOS

[0026] Figura 1 Representa o fluxo de processo para a purificação e recuperação de MenA-PS.

[0027] Figura 2 Representa o Cromatograma de HPLC de MenA-PS

[0028] Figura 3 Representa o espectro de RMN de MenA-PS.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO COM REFERÊNCIA AOS DESENHOS E EXEMPLOS

[0029] A invenção divulga uma série de etapas que foram otimizadas para possibilitar a purificação de polissacarídeo bacteriano em menos tempo e na temperatura ambiente.

[0030] A cepa de polissacarídeo bacteriano é inoculada no fermentador contendo componentes de meio apropriados requeridos para o crescimento bacteriano. Depois de obter uma certa densidade óptica pré-determinada o crescimento bacteriano é submetido à finalização pela adição de formaldeído e o caldo de fermentação (CF) resultante é obtido.

[0031] O caldo de fermentação (CF) obtido a partir do fermentador é coletado nas garrafas e o CF é submetido à centrifugação para obter o sobrenadante. O sobrenadante resultante é concentrado e diafiltrado usando membrana com peso molecular de corte de preferivelmente mas limitado a cassetes de 100 KDa 0,1 m2 de seção. Depois da concentração e diafiltração o material recuperado é depois processado para purificação.

[0032] O CF diafiltrado e concentrado tendo o polissacarídeo bruto é tratado com detergente catiônico e é incubado na temperatura ambiente durante período de tempo predeterminado resultando na formação de pélete precipitado de polissacarídeo, isto é, primeiro pélete. O primeiro pélete assim obtido é homogeneizado em rpm predeterminado por tempo predeterminado. O primeiro pélete homogeneizado é depois liquefeito em solvente orgânico, mais preferivelmente etanol seguido pela filtração em carbono. O sobrenadante filtrado é tratado com agente de precipitação resultando em precipitados. Os precipitados assim obtidos são centrifugados para obter o segundo pélete. Os segundos péletes são depois dissolvidos em MQW. Os péletes dissolvidos são depois submetidos à concentração e diafiltração com volumes predeterminados de CaCl2 e água MilliQ (MQW). Consequentemente a filtração estéril é realizada para obter o polissacarídeo bacteriano purificado.

[0033] O polissacarídeo bacteriano purificado assim obtido é analisado quanto ao fósforo, O-actila, proteína, ácido nucléico, endotoxina e peso molecular médio relativo.

[0034] Em uma forma de realização preferida, MenA (Neisseria meningitidis (Albrecht e Ghon) Murray (ATCC® 13077®) é obtido da ATCC (American Type Culture Collection), USA e é ainda inoculada no fermentador contendo componentes de meio apropriados requeridos para o crescimento bacteriano. Depois da conclusão da fase de crescimento que é determinada pelo início do aumento no pH e diminuição na densidade óptica (quando comparado à OD máxima alcançada), a fermentação é terminada pela adição de 0,2 % de formaldeído (HCHO) e a temperatura do fermentador é mantida a 35 °C por 15 minutos.

[0035] O caldo de fermentação obtido do fermentador é coletado nas garrafas e o caldo fermentado é submetido à centrifugação para obter o sobrenadante. O sobrenadante resultante é concentrado e diafiltrado. Depois da concentração e diafiltração o material recuperado é depois processado para a purificação.

[0036] O esquema de purificação como mostrado na Figura 1 é amplamente dependente das propriedades físico-químicas do polissacarídeo, quantidade de impurezas, que são requeridas a serem ainda removidas, e o tempo levado para completar o processo inteiro.

[0037] O caldo diafiltrado e concentrado tendo o polissacarídeo bruto de Men A é tratado com detergente catiônico CTAB e é incubado na temperatura ambiente por um período de tempo de 1 hora a 6 horas, mais preferivelmente por 1 hora resultando na formação do primeiro pélete precipitado isto é, o pélete de CTAB com o polissacarídeo Men-A bruto. O pélete de CTAB assim obtido é semelhante à borracha por natureza e altamente viscosa. O pélete de CTAB é liquefeito em etanol em uma faixa de concentração de 76 % a 96 %, porém mais preferivelmente homogeneizado por 20 minutos a 1000 rpm em volume mínimo de 96 % de etanol e depois disso algum volume mais de etanol a 96 % é adicionado ao pélete de CTAB homogêneo sob agitação contínua por 40 minutos. Este processo resulta na redução da viscosidade do pélete de CTAB a um grau maior. Esta redução na viscosidade é suficiente para o pélete de CTAB tornar-se dissolvido em etanol a um grau maior levando à purificação rápida de MenA-PS. Esta solução homogênea é depois submetida à centrifugação para separar qualquer material não dissolvido. A solução homogeneizada é filtrada em carbono mais preferivelmente com filtros de carbono zeta. O sobrenadante filtrado é tratado com CaCl2 na faixa de 0,05 M a 0,2 M e mantido de lado para precipitação durante tempo predeterminado na temperatura ambiente resultando em precipitados. Os precipitados resultantes são submetidos à centrifugação a 4000 rpm/3000 x g a 6000 rpm/6750 x g para obter o segundo pélete. O segundo pélete é depois dissolvido em MQW. Os péletes dissolvidos são depois submetidos à concentração e diafiltração com volumes predeterminados de CaCl2 e água MilliQ (MQW). Consequentemente a filtração estéril é realizada para obter o MenA-PS purificado.

[0038] O MenA-PS é analisado por uma série de testes analíticos e os resultados são apresentados na Tabela 1Tabela 1: As especificações do polissacarídeo Men-A purificado de acordo com a especificação da OMS são mostradas abaixo:

[0039] O polissacarídeo bacteriano purificado é depois armazenado a -20 °C e é capaz de ser usado como tal ou em uma forma derivatizada ou ligada a outras moléculas, para a preparação de vacinas, mais particularmente vacinas conjugadas para a infecção de N. meningitidis.

[0040] Portanto, a presente invenção fornece um processo novo, rápido e ajustável à escala para purificar os polissacarídeos de Men-A em tempo significantemente reduzido quando comparado com aqueles divulgados nas técnicas anteriores que pode ser completado em menos do que 9 horas e está de acordo com o padrão estabelecido da OMS.

[0041] Procedimentos analíticos:

[0042] A concentração de fósforo para Men-A é determinada pelo ensaio colorimétrico. Neste ensaio, as amostras são inicialmente acidificadas, depois oxidadas com ácido perclórico (método de Chen) (Chen Jr et al., 1956) ou nitrato de magnésio (método de Ames) (Ames, 1966) para ativar e hidrolisar o polissacarídeo antes de transformar o material em cinzas em alta temperatura. Na segunda parte do ensaio, o ácido ascórbico atua para reduzir um complexo de fosfomolibdato para um composto de cor azul. A absorbância é levada até 820 nm com D-ribose-5-fosfato dissódico diidratado como um padrão. O teor de O-acetila do polissacarídeo MenA é determinado pelo método colorimétrico (Hestrin, 1949). O ensaio está fundamentado na descoberta de que a hidroxilamina em um pH alcalino em água rapidamente converte acetilcolina estequiometricamente em ácido hidroxâmico através de uma ampla faixa de concentração de éster. A densidade da cor púrpura-marrom é determinada a 540 nm.

[0043] O lipopolissacarídeo (LPS) é determinado usando Endosafe®-PTS® compacto e simples. A impureza de proteína é determinado pelo método de Lowry (Lowry et al., 1951) usando albumina sérica bovina (BSA) como um padrão e a absorbância é tirada a 750 nm. Os ácidos nucléicos (NA) são estimados a 260 nm e a quantidade é calculada assumindo uma absorbância de 1,0 A = 50 μg/ml (Frasch, 1990).

[0044] O peso molecular médio relativo (Mw) é determinado usando HPLC (Alliance, Waters) como mostrado na Figura 2. As colunas usadas são PWXL-4000 e PWXL- 5000 na série para Men-A. Além disso, uma faixa de 5 kD a 800 kD de Pululanos (Shodex) é usada como padrões para MenA. Também o tampão usado é de 0,1 M de Nitrato de Sódio com um tempo de condução de 30 min a uma taxa de fluxo de 1 ml/m. A identidade de MenA-PS é verificada pela espectroscopia de 1H-RMN como mostrado na Figura 3. A RMN produz um espectro de núcleos magnéticos sensíveis (por exemplo, 1H, 13C e 31P). Também o MenA-PS é identificado sorologicamente pela combinação com os anti-soros específicos contra o polissacarídeo. Visto que as especificações da OMS [OMS, 2006] para determinar a pureza e para caracterizar o polissacarídeo estão fundamentadas com base em peso seco, o polissacarídeo é primeiro liofilizado e depois testado. O teor de umidade é assim subtraído para obter o peso seco exato. O teor de umidade da torta liofilizada é determinado pelo Analisador Termo gravimétrico (TGA) da Perkin Elmer.

[0045] Vários aspectos da invenção descrita em detalhes acima são agora ilustrados com exemplos não limitantes:

[0046] Exemplo 1

[0047] O caldo de fermentação (CF) clarificado da cultura de MenA é concentrado e diafiltrado com água MilliQ (MQW) usando cassetes de 100 KDa 0,1 m2 de seção. O detergente catiônico, a saber, o Brometo de Hexa Cetil Trimetilamônio (CTAB) preferivelmente na concentração final de 0,5 a 2 % (p/v) é adicionado no CF e deixado para a precipitação durante a noite de 2 a 8 °C. A centrifugação é feita a 5000 rpm/4690 x g por 30 minutos no final da precipitação com CTAB para obter o pélete. O pélete de CTAB é liquefeito em volume mínimo de solução de etanol (preferivelmente em uma faixa de concentração de 76 a 96 %). A dissolução é realizada por 8 horas com incubação de 2 a 8 °C. A centrifugação é mais uma vez realizada a 5000 rpm/4690 x g por 30 min. Consequentemente o sobrenadante obtido foi processado ainda usando filtração em carbono com filtros de carbono zeta até que a OD260nm atinja 0,2 ou menos. Isto é seguido pela filtração a 0,22 μm. Além disso, CaCl2 (solução de estoque a 2 M) em uma concentração de trabalho entre 0,05 e 0,2 M é adicionado no sobrenadante filtrado e mantido para precipitação por 4 horas min de 2 a 8°C. A centrifugação é feita a 5000 rpm/4690 g por 30 min para obter o pélete. Finalmente o pélete é dissolvido em MQW, e diafiltração de 300 KDa é feita com 10 a 15 volumes de CaCl2 50 mM e depois com 10 a 15 volumes de MQW. O polissacarídeo Men A obtido é filtrado com filtro de 0,22 μm, e armazenado a -20 °C ou menos para uso mais adiante.

[0048] Exemplo 2

[0049] O CF clarificado de cultura MenA é concentrado e diafiltrado com MQW usando cassetes de 100 KDa 0,1 m2 de seção. O detergente catiônico, CTAB preferivelmente na concentração final de 0,8 a 1,6 % (p/v) é adicionado no CF e deixado para precipitação durante a noite de 2 a 8 °C. A centrifugação é feita a 5000 rpm/4690 x g por 30 minutos no final da precipitação com CTAB para obter o pélete. O pélete de CTAB é liquefeito em volume mínimo de solução de etanol (preferivelmente em uma faixa de concentração de 86 a 96 %). A dissolução é realizada por 4 horas com incubação na temperatura ambiente. A centrifugação é mais uma vez realizada a 5000 rpm/4690 x g por 30 min. Consequentemente o sobrenadante obtido é processado ainda mais usando filtração em carbono com filtros de carbono zeta até que a OD260nm atinja 0,2 ou menos. Isto é seguido pela filtração em 0,22 μm. Além disso, CaCb (solução de estoque de 2 M) em uma concentração de trabalho entre 0,09 e 0,18 M é adicionado no sobrenadante filtrado e mantidos para a precipitação por 3 horas min de 2 a 8 °C. A centrifugação é feita a 5000 rpm/4690 g por 30 min para obter o pélete. Finalmente o pélete é dissolvido em MQW, e a diafiltração em 300 KDa é feita com 10 a 15 volumes de CaCl2 50 mM e depois com 10 a 15 volumes de MQW. O polissacarídeo Men A obtido é filtrado com filtro 0,22 μm, e armazenado a -20 °C ou menos para uso mais adiante.

[0050] Exemplo 3

[0051] O CF clarificado de cultura MenA é concentrado e diafiltrado com MQW usando cassetes de 100 KDa 0,1 m2 de seção. O detergente catiônico CTAB preferivelmente em concentração final de 1 a 1,5 % (p/v) é adicionado no CF e deixado por 6 horas na temperatura ambiente. A centrifugação é feita a 5000 rpm/4690 x g por 30 minutos no final da precipitação com CTAB para obter o pélete. O pélete de CTAB é liquefeito em volume mínimo de solução de etanol (preferivelmente em uma concentração de 90 a 96 %). A dissolução é realizada por 3 horas com incubação na temperatura ambiente. A centrifugação é mais uma vez realizada a 5000 rpm/4690 x g por 30 min. Consequentemente, o sobrenadante obtido é processado ainda usando filtração em carbono com filtros de carbono zeta até que a OD260nm atinja 0,2 ou menos. Isto é seguido pela filtração a 0,22 μm. Depois da filtração, CaCl2 (solução de estoque de 2 M) em uma concentração de trabalho entre 0,10 e 0,15 M é adicionado no sobrenadante filtrado e mantido para precipitação por 2 horas na temperatura ambiente. A centrifugação é feita a 5000 rpm/4690 g por 30 min para obter o pélete. Finalmente o pélete é dissolvido em MQW, e diafiltração de 300 KDa é feita com 10 a 15 volumes de CaCl2 50 mM e depois com 10 a 15 volumes de MQW. O polissacarídeo Men A obtido é filtrado com filtro de 0,22 μm, e armazenado a -20 °C ou menos para uso mais adiante.

[0052] Exemplo 4

[0053] O CF clarificado da cultura de MenA é concentrada e diafiltrada com MQW usando cassetes de 100 KDa 0,1 m2 de seção. O detergente catiônico, CTAB, preferivelmente na concentração final de 1,2 % (p/v) é adicionado no CF e deixado para precipitação por 1 hora na temperatura ambiente seguido pela centrifugação a 5000 rpm/4690 x g por 30 minutos para obter o pélete. O pélete de CTAB é homogeneizado por 20 minutos a 1000 rpm em volume mínimo de etanol a 96 % e depois disso algum volume mais de etanol a 96 % é adicionado ao pélete de CTAB homogêneo sob agitação contínua agitando por 40 minutos. A dissolução total é realizada por 1 hora com incubação na temperatura ambiente. O pélete de CTAB, que é semelhante à borracha por natureza e altamente viscoso, perde a sua viscosidade a um grau maior durante a homogeneização permitindo deste modo a mistura apropriada e rápida de etanol dentro de uma hora. A centrifugação é mais uma vez realizada a 5000 rpm/4690 x g por 30 min. Consequentemente o sobrenadante obtido é processado ainda mais usando a filtração em carbono com filtros de carbono zeta até que a OD260nm atinja 0,2 ou menos. Isto é seguido pela filtração de 0,22 μm. Depois da filtração, CaCl2 0,15 M (usando solução de estoque de 2 M) é adicionado no sobrenadante filtrado e mantido para precipitação por 30 m na temperatura ambiente. A centrifugação é feita a 5000 rpm/4690 x g por 30 min para obter o pélete. Finalmente o pélete é dissolvido em MQW, e diafiltração de 300 KDa é feita com 8 a 10 volumes de CaCl2 50 mM e depois com 8 a 10 volumes de MQW. O polissacarídeo Men A assim obtido é filtrado com filtro de 0,22 μm, e armazenado a -20 °C para uso mais adiante.

Claims

1. Processo para purificar polissacarídeo bacteriano de polissacarídeo de Neisseria meningitidis sorogrupo A (Men-A) na temperatura ambiente em ambiente estéril, o dito processo caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:(a) clarificar um caldo de fermentação de polissacarídeo de Neisseria meningitidis sorogrupo A (Men-A) por centrifugação para obter um sobrenadante fermentado;(b) submeter o dito sobrenadante fermentado da etapa (a) à concentração e diafiltração usando uma membrana com peso molecular de corte para obter um polissacarídeo bacteriano bruto;(c) precipitar o dito polissacarídeo bacteriano bruto da etapa (b) com pelo menos um detergente catiônico seguido pela centrifugação por 30 minutos para obter um primeiro pélete;(d) submeter dito primeiro pélete da etapa (c) à homogeneização em rpm predeterminado durante tempo de incubação predeterminado em pelo menos um solvente orgânico para obter um primeiro pélete homogeneizado;(e) submeter o dito primeiro pélete homogeneizado da etapa (d) à centrifugação seguida por filtração em carbono para obter um sobrenadante filtrado;(f) precipitar o dito sobrenadante filtrado da etapa (e) com um agente de precipitação para obter um precipitado e submeter o dito precipitado à centrifugação para obter um segundo pélete; e(g) submeter dito segundo pélete da etapa (f) à dissolução em MQW e depois submeter os péletes dissolvidos à diafiltração e concentração para obter o polissacarídeo purificado em 6 a 9 horas, em que a pureza do dito polissacarídeo purificado está de acordo com os padrões da OMS.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita centrifugação do caldo fermentado na etapa (a) é realizada na faixa de 4000 rpm/3000 x g a 6000 rpm/6750 x g por 30 minutos.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita membrana com peso molecular de corte são cassetes de 100 KDa 0,1 m2 de seção.

4. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito detergente catiônico é o Brometo de Hexa Cetil Trimetil amônio (CTAB) tendo uma concentração na faixa de 0,5 % (p/v) a 2 % (p/v).

5. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito primeiro pélete da etapa (c) é o pélete de CTAB obtido por centrifugação a 4000 rpm/3000 x g a 6000 rpm/6750 x g por 30 min.

6. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito primeiro pélete da etapa (d) é homogeneizado a 1000 rpm durante o dito tempo de incubação de 20 minutos usando o dito solvente orgânico.

7. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito primeiro pélete homogeneizado da etapa (d) é dissolvido ainda sob agitação contínua por 40 minutos usando um solvente orgânico.

8. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito solvente orgânico é etanol tendo uma concentração na faixa de 76 % (v/v) a 96 % (v/v).

9. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita filtração em carbono da etapa (e) é realizada com filtros de carbono zeta atingindo a OD260nm abaixo de 0,2 seguido pela filtração a 0,22 μm para obter o dito sobrenadante.

10. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito agente de precipitação é CaCl2 na faixa de 0,05 M a 0,2 M que é adicionado ao sobrenadante filtrado para obter o precipitado em 30 minutos a 2 horas.

11. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita centrifugação do precipitado na etapa (f) é realizada a 5000 rpm/4690 g por 30 minutos.

12. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito segundo pélete é dissolvido em MQW.

13. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito segundo pélete é diafiltrado e concentrado com 8 a 15 volumes de CaCl2 50 mM seguido por 8 a 15 volumes de MQW e filtrado ainda usando filtro de 0,22 μm para obter polissacarídeo MenA purificado.