BR112020000229A2 - purificação de polissacarídeos para produção de vacinas usando enzimas líticas, filtração de fluxo tangencial e cromatografia multimodal - Google Patents

Abstract

É divulgado um processo melhorado, econômico e reduzido de purificação do polissacarídeo capsular de S. Pneumoniae, Streptococcus do Grupo B, H. Influenzae, S, Typhoid e N. meningitidis. O processo inclui um coquetel de tratamento enzimático, filtração de fluxo tangencial e purificação por cromatografia multimodal. Para bactérias Gram-negativas, o processo de remoção de endotoxina envolve resina endotrap HD. Esse processo reduzido alcançou a pureza exigida pela OMS / EP / BP para o uso na preparação de vacinas humanas, com etapas simples e maior rendimento em comparação aos processos convencionais. As etapas do processo evitam o uso de solventes orgânicos, como, por exemplo, álcool, fenol e ultracentrifugação que, de outra forma, são caros e demorados para serem executados e / ou perigos para a saúde para uso comercial. Esse processo divulgado também é simples, eficiente, não tóxico, fácil de expandir e ecológico

Description

PURIFICAÇÃO DE POLISSACARÍDEOS PARA PRODUÇÃO DE VACINAS USANDO ENZIMAS LÍTICAS, FILTRAÇÃO DE FLUXO TANGENCIAL E

CROMATOGRAFIA MULTIMODAL Referência a pedidos relacionados

[001] Este pedido reivindica prioridade ao Pedido de Patente Provisório Norte-Americano No. 62/528,683, depositado em 05 de julho de 2017, cuja totalidade é aqui incorporada por referência. Campo da Invenção

[002] A presente invenção é dirigida a processos e composições para a purificação eficaz de polissacarídeo bacteriano. Os processos são eficientes, de custo eficaz, e escalonáveis e envolvem a remoção de impurezas para a preparação de vacinas incluindo vacinas conjugadas. Antecedentes da Invenção

[003] CPS Purificados (polissacarídeos capsulares) são utilizados na produção de vacinas, e, especialmente vacinas que são eficazes contra a infecção produzida pelas bactérias a partir do qual o CPS foram derivados. Em um processo convencional, as bactérias são cultivadas em biorreatores industriais e CPS purificados para exigências de pureza pré-determinadas ou desejadas. Um processo de purificação tradicional de CPS bacteriano para a produção de vacina baseia-se em várias etapas de precipitações seletivas com solventes, tais como etanol e fenol, e os detergentes catiônicos.

[004] H. influenzae, N. meningitidis, Streptococcus do grupo B, e S. pneumonia são alguns dos mais comuns agentes de meningite, pneumonia e bacteremia em recém-nascidos e adultos imunodeficientes. Os polissacarídeos capsulares (CPS) atuam como mecanismos de defesa contra o sistema imune dos hospedeiros que lhes o principal fator de virulência destas bactérias faz. As vacinas baseadas em polissacarídeos derivados destes organismos são eficazes para a população adulta. Existem vários estudos sobre as características imunogênicas das vacinas polissacarídicas. O processo de purificação visa obter o produto com a especificação desejada, enquanto maximiza o rendimento e minimiza o custo do processo. A etapa final de purificação do processo convencional envolve uma série de etapas de purificação em que existe um-compromisso entre a eficiência da produção e remoção de contaminantes. Os contaminantes na purificação de CPS são, por exemplo, proteínas, ácidos nucleicos, polissacarídeos e pigmentos indesejados, por exemplo, polissacarídeos da parede celular de bactérias Gram- positivas ou lipopolissacarídeos (LPS) de bactérias Gram- negativas.

[005] Os processos de purificação convencionais de CPS segue um método geral de concentração / purificação por etanol e/ou precipitação seletiva por detergente aniônico, extração de proteína com fenol e, para as bactérias Gram- negativas, por ultracentrifugação para eliminar os LPS.

[006] Por exemplo, a purificação de polissacarídeos convencional a partir de N. meningitidis inclui precipitação com Cetavlon detergente catiónico, precipitado é novamente suspenso em 1 M de CaCl2, duas precipitações com etanol, de desproteinização por três etapas de extração com fenol, diálise e nova precipitação de etanol. LPS é separado a partir do CPS por ultracentrifugação.

[007] O processo de purificação convencional para S. pneumoniae DPC inclui lise de células totais com detergente desoxicolato, concentração / diafiltração, quatro etapas de precipitação com etanol, desproteinização por tratamento com fenol e carvão ativado.

[008] O processo de purificação convencional para H. Influenzae PRP começa com a inativação das células por fenol, formaldeído ou timerosal e a separação do caldo de cultura por centrifugação. O sobrenadante clarificado é então concentrado por ultrafiltração de fluxo tangencial com um corte de 50-100kDa membrana, precipitada com detergente catiônico Cetavlon e o complexo PRP-Cetavlon solubilizada com cloreto de cálcio seguido por várias precipitações com etanol e desproteinização por extração com fenol e precipitação com etanol adicional. Os lipopolissacarídeos são separados a partir do PRP por ultracentrifugação.

[009] Um certo número de procedimentos de purificação está atualmente disponíveis que são dirigidos para a remoção de proteínas e de outras impurezas, tais como a parede celular do polissacarídeo C de polissacarídeos capsulares. Por exemplo, a Patente Norte-Americana N° US 4,242,501 é dirigida para a purificação de polissacarídeo capsular pneumoccal e refere-se a um método para a remoção de proteínas e de outras impurezas (polissacarídeo C) a partir de polissacarídeos capsulares microbianos. 1572 M UM / 2010. As Patentes US Nos. 5,,714354, 5,847,112, e 4,242,501 são cada uma dirigida a processos de purificação de polissacarídeo pneumococos. A Publicação Internacional No.

WO 2006/082527 refere-se a um processo de purificação para o polissacarídeo capsular de S. agalactiae que envolve a precipitação com um detergente catiônico. A Publicação Internacional No. WO 2008/045852 refere-se a um processo para a purificação de polissacarídeo pneumocócico, em que o processo de aquecimento e precipitação a pH baixo foram empregados.

[0010] A Publicação Internacional No. WO 2012/127485 refere-se a um álcool e CTAB livre método para a purificação de polissacarídeos de pneumococos. Outras publicações relativas a purificações CPS incluem "purificação de polissacarídeo capsular Produzido por Streptococcus pneumoniae do serotipo 19 Um" J. Microbiol. Biotechnol, 21 (7), 734-738, 2011; "Produção de polissacarídeo capsular de Streptococcus pneumoniae tipo 14 e sua purificação por cromatografia de afinidade", Appl Environ Microbiol, 67 (2): 969-971, fevereiro de 2011.

[0011] Os processos de purificação convencionais de CPS são longos e complicados, e exigem que os indivíduos sejam altamente treinados e utilizam um número de materiais e composições dispendiosos. Além disso, o risco de erros é grande e erro ocorrem frequentemente tornando o processo altamente ineficiente em termos de tempo e recursos. Assim, continua a haver uma necessidade de procedimentos de purificação de polissacarídeo eficientes e eficazes. Sumário da invenção

[0012] A presente invenção ultrapassa os problemas e desvantagens associados com as estratégias e concepções atuais e proporciona novas composições e procedimentos para a purificação de polissacarídeos.

[0013] Uma concretização da invenção é dirigida a processos de purificação de polissacarídeos da superfície das células bacterianas, compreendendo: proporcionar uma coleta de fermentação de bactérias Gram-positivas e / ou Gram-negativas. A coleta de fermentação clarificada, de um modo preferido com desoxicolato ou um funcionalmente semelhante a um pH ácido, tais como de pH 3,5 - 5,0. O polissacarídeo clarificado é preferencialmente concentrado por diafiltração e tratado com uma enzima para a remoção de impurezas, tais como proteínas do hospedeiro de células, ácidos nucleicos, e polissacarídeo da parede celular que podem ser associadas ao peptidoglicano e / ou outras estruturas de membranas celulares. A enzima é precipitada, preferencialmente, com ácido acético e a enzima tratada polissacarídeo é concentrado por diafiltração e passado através de resina cromatográfica multimodal no fluxo de passagem modo, filtração de fluxo tangencial, e / ou filtração através de uma resina de adesão CAPTO™. De preferência, o polissacarídeo de superfície celular bacteriana compreende um polissacarídeo capsular e / ou um exopolissacarídeo. De preferência, a coleta das bactérias compreende S. pneumoniae, Streptococcus Grupo B, H. influenzae, S. typhimurium ou N. meningitis. De preferência, a clarificação é seguida por ajustamento de pH a pH ácido 3,5 – 5,0 usando ácido acético ou abaixo de pH 3,5 ou abaixo de pH 4,5 usando ácido acético 2M. De preferência, a enzima é selecionada a partir do grupo que consiste de Benzonase, Mutanolisina / lisozima, glucosaminidase β-DN-acetilo e proteinase K.

De um modo preferido, o tratamento enzimático é sequencialmente quer singularmente ou em combinação.

De preferência, a coleta compreende fermentação bacteriana Gram-negativas e tratou-se a enzima e o polissacarídeo diafiltrado é passado através de filtração de fluxo tangencial utilizando tampão de um desoxicolato / EDTA / Ca- sal.

De preferência, a filtração de fluxo tangencial inclui passagem do polissacarídeo através de uma membrana 50- 100kDa.

De preferência a coleta de fermentação compreende Gram-positivo bacteriano e tratou-se a enzima e o polissacarídeo diafiltrado é passado através de cromatografia multimodal com resina de adesão CAPTO ™. De preferência a coleta de fermentação compreende a remoção compreendendo bacteriana e mais Gram-negativa de endotoxina utilizando cromatografia de resina mais especificamente resina EndoTrap HD num fluxo através do modo.

De preferência, a coleta compreende fermentação de S. pneumoniae que compreende um ou mais serotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A , 19F, 20, 22F, 23F, 24, 33F e 35B ou mais serotipos utilizados na preparação da vacina.

De preferência a coleta de fermentação compreende Streptococcus do Grupo B compreende um ou mais dos serotipos Ia, Ib, II, III, IV, V, VI, VII, VIII e IX.

De preferência a coleta de fermentação compreende H. influenzae compreendendo sub-cepas de serotipos a, b, c, d, e, f.

De preferência a coleta de fermentação compreende S. typhi Vi compreendendo-polissacarídeo.

De preferência a coleta de fermentação compreende N. meningite compreendendo de um ou mais serotipos A, B, C, X, Y e W-135.

[0014] Outra concretização da invenção compreende um polissacarídeo purificado pelo método da invenção como aqui descrito.

[0015] Outra concretização da invenção compreende uma composição imunológica, tal como uma vacina que incorpora ou é derivado do polissacarídeo purificado da invenção. As vacinas preparadas de acordo com esta divulgação podem ou não compreender adjuvantes.

[0016] Outras concretizações e vantagens da invenção são apresentados em parte na descrição, que se segue, e em parte, podem ser óbvias a partir desta descrição, ou podem ser conduzidas a partir da prática da invenção. Breve Descrição das Figuras

[0017] A Figura 1 mostra análises de 'H RMN de polissacarídeos purificados que mostra polissacarídeo são livres da parede celular polissacarídica (CWPS) usando a estratégia de purificação - 1. O polissacarídeo tipo 3 de S. pneumoniae, tamanho reduzido de polissacarídeo, a distribuição de tamanho molecular por SEC-HPLC- <50 kDa (C -polissacaríde não detectado em 3,2 ppm).

[0018] A Figura 2 mostra análises de 1H RMN de polissacarídeos purificados que mostra polissacarídeo são livres da parede celular polissacarídica (CWPS) usando a a estratégia de purificação - 1. O polissacarídeo tipo 1 de S. pneumoniae - tamanho reduzido de polissacarídeo, distribuição de tamanho molecular por SEC-HPLC- <50 kDa (polissacarídeo C não detectado em 3,2 ppm). Descrição Detalhada da Invenção

[0019] Separações de sólidos a partir de líquidos baseiam-se em centrifugação contínua no DPC purificados são utilizados na produção de vacinas contra essas bactérias. Separações de sólidos a partir de líquidos baseiam-se em centrifugação contínua em instalações à prova de explosão.

[0020] Um método para a purificação do CPS tem sido desenvolvido surpreendentemente que elimina as precipitações com etanol, o uso de fenol, e as etapas de ultracentrifugação de procedimentos convencionais. O processo da presente divulgação inclui uma etapa de ultrafiltração utilizando membranas com valores de corte de peso molecular desejados, tais como, por exemplo, 30-100kDa e elimina proteínas residuais e ácidos nucleicos por digestão enzimática e filtrações de fluxo tangencial (TFF) com, de preferência, 30-100kDa corte de membranas. O CPS purificado resultante tem um rendimento superior a 70% com menos do que ou igual a 1% de proteína e menos do que ou igual a 1% de ácido nucleico relacionado com CPS total. Os CPS purificadas são isentos de atividade enzimática proteolítica e passam nos testes de qualidade necessários.

[0021] As vantagens gerais da presente invenção incluem o fornecimento de um processo rápido, eficiente e eficaz para a purificação de polissacarídeo capsular de superfície celular bacteriana (CPS) que purifica polissacarídeos, enquanto elimina as impurezas num tempo muito curto pela simples, eficiente e comercialmente etapas escalonáveis deste modo produzindo polissacarídeo de alta qualidade que atende ou excede as especificações da OMS relevantes e outros padrões de qualidade.

[0022] Uma concretização da invenção é dirigida para o processo de purificação do polissacarídeo. O processo descreve um novo, rápido, de custo eficaz, e escalável método, em que o polissacarídeo é purificado com o tempo significativamente reduzido. A cepa bacteriana selecionada é cultivada em meios de cultura otimizadas no fermentador e o processo prossegue fazendo a centrifugação da coleta fermentada para remover os detritos celulares, seguido por TFF utilizando membranas de corte de peso molecular. O processo da invenção apresenta várias vantagens sobre a o estado da técnica, tais como o fornecimento de um método novo e rápido para a preparação de polissacarídeo. O processo é rentável, uma vez que reduz o número total de etapas e exige seleção cromatográfica única. Uma vantagem adicional é que este processo é totalmente escalonável.

[0023] Embora a purificação de qualquer polissacarídeo possa ser realizada em conformidade com os métodos desta divulgação, em particular, os métodos preferidos envolvem a purificação de polissacarídeos a partir de N. meningitidis, S. pneumoniae, H. influenzae tipo B, S. typhimurium, e de Streptococcus do Grupo B para a produção de vacinas. O método compreende fornecer uma coleta de fermentação de bactérias ou outra fonte de polissacarídeo, uma clarificação da coleta de fermentação com desoxicolato a, por exemplo, um pH de cerca de 3,5 - 5,0, a concentração do polissacarídeo clarificada por uma primeira diafiltração e tratamento do primeiro polissacarídeo diafiltrado com uma enzima para remover as impurezas, a precipitação da enzima com ácido acético, tal que o polissacarídeo permaneça no sobrenadante, concentração do polissacarídeo do sobrenadante por uma segunda diafiltração, passagem do segundo polissacarídeo diafiltrado, através de uma resina cromatográfica multimodal e / ou de resina de remoção de endotoxina por filtração de fluxo tangencial com tampão de desoxicolato / EDTA / Ca-sal, e a coleta do polissacarídeo purificado.

[0024] Os métodos da presente invenção eliminam a necessidade de utilização de etanol, fenol, e as precipitações de detergente, e, em vez envolvem o tratamento enzimático lítico sucessivo seguida por ultrafiltração e, se desejado, de um modo preferido purificação adicional por cromatografia de interação hidrofóbica ou cromatografia em resina de troca iónica de modo misto.

[0025] A nucleasse, benzonase, hidrolisa o DNA genômico e RNA residual e os oligonucleotídeos de baixa massa molecular resultantes são filtrados através de membrana na segunda TFUF. Peptidoglicano e polissacarídeo da parede celular (CWPS ou Grupo B Hidrato de carbono) atribuem ao peptidoglicano são degradados e / ou tamanho reduzido por combinação enzimática do coquetel Mutanolisina / lisozima / BDN-acetil glucosaminidase (razão de unidade ativa: 1:1:0,1). Proteína e LPS são eliminados após o tratamento enzimático e uma segunda concentração / diafiltração com TFUF 30-100kDa. A eliminação de LPS, para as bactérias Gram- negativas, é realizado, de preferência, com TFUF na presença de detergente e um agente quelante, de preferência, DOC / EDTA. O detergente desoxicolato, DOC, a intervalos de interação hidrofóbica dos ácidos graxos da parte lipídica, desestabilizam o agregado e produz baixa massa molecular de monômeros de LPS que podem ser filtrados livremente na membrana de 30-100kDa.

[0026] Os processos de purificação da invenção são, em parte, com base no tamanho molecular. No primeiro TFUF, moléculas com tamanho de poro menor do que o ponto de corte são eliminados, a maioria deles a partir do meio de cultura. Depois das enzimas de reduzir o tamanho dos contaminantes, proteínas e ácidos nucleicos, e a segunda TFUF fornece para a sua eliminação. Baixa massa molecular a partir de monómeros de LPS são ultrafiltrados na presença de detergente e agente quelante.

[0027] Os processos da presente invenção eliminam um número de etapas de precipitações necessárias em processos convencionais que usam álcoois, fenóis, ou detergentes catiônicos, e, em vez disso, envolve o tratamento e / ou ultrafiltração para obter produtos finais a pureza exigida ou desejada enzimática.

[0028] Comparado a ultracentrifugação, a combinação de tratamento enzimático e ultrafiltração tangencial é mais fácil para o aumento de escala e muito mais barato. As membranas de fluxo tangencial são limpas no local e armazenadas para uso repetido (por exemplo, utilizando membranas descartáveis). O método da divulgação proporciona um método simples, eficiente e ambientalmente amigável que é facilmente escalável para o desenvolvimento comercial.

[0029] Os exemplos seguintes ilustram concretizações da invenção, mas não devem ser vistos como limitando o escopo da invenção.

Exemplos Exemplo 1 Cultivo de bactérias

[0030] As culturas de bactérias foram conduzidas de um 10/05 L-fermentador contendo o meio e as condições apropriadas para cada estirpe. O caldo completo do biorreator, foi precipitado com 0,15% de desoxicolato, decantou-se e centrifugou-se. As células foram separadas a partir do caldo de cultura por microfiltração tangencial. micro filtrado livre de células foi utilizado para o CPS - purificação por S. pneumoniae e cepas adicionais também. Concentração / Defiltração

[0031] Os CPS isentos de células foram concentrados até 1 - 20 vezes por ultrafiltração de fluxo tangencial (TFUF) membranas de 30-100kDa. O concentrado foi biofiltrada com tampão. Tratamento enzimático e concentração / diafiltração

[0032] O pH de frações solúveis em CPS de Neisseria ou Streptococcus foram ajustados para um pH de 7. As enzimas recombinantes foram adicionados sucessivamente: Benzonase (Tris-HCl 50 mM, contendo 2 mM e NaCl 20 mM MGCK); Mmutanolysin / lisozima (1: 1); β-Ό-Ν acetil glucosaminidase; e proteinase K foram adicionados com um intervalo entre elas de 2 - 4hs e incubadas durante 12 - 24 horas a 37 ° C - 56 ° C, sob pH alcalino (pH 8,8-10,5) a 50 - 100 rpm. Os contaminantes de baixo peso molecular em massa resultantes da degradação e detergente de tratamento enzimático foram eliminados pela segunda membrana TFUF de 30-100kDa de corte. CPS purificado foram esterilizados por filtração através de uma membrana 0.2 μm e armazenado a menos 20 ° C.

[0033] Duas estratégias de purificação diferentes foram usadas para a purificação de polissacarídeos. Um processo de purificação foi utilizado geralmente para processo de purificação de polissacarídeo de bacteria Gram- positiva (Estratégia de purificação - 1) e um usado para processo de purificação de polissacarídeo de bacterias Gram- Negativas (estratégia de purificação- 2). Estratégia de Purificação - 1 (para as bactérias Gram- positivas)

[0034] A purificação de Polissacarídeo utilizando mistura de enzimas contendo Benzonase, Mutanolisina combinação / lisozima, β-DN-acetil-glucosaminidase, proteinase K seguido por filtração de fluxo tangencial (TFF), e finalmente cromatografia de resina de aderência CAPTO ™ Adhere resina de troca aniônica multimodal (uma resina de forma multimodal concebida para pós purificação-proteína A de anticorpos monoclonais à escala de processo).

[0035] Os serotipos de vários polissacarídeos, quer a partir de S. pneumoniae e os serotipos de estreptococos do grupo B foram purificados. Todos os polissacarídeos purificados atingidos ou excedidos o critério de critério EP OMS / ou BP / ou para a pureza de polissacarídeo. Além disso a pureza foi conseguida por peso para proteína residual, e etapas de cromatografia multimodal de ácido nucleico e endotoxina. A cromatografia multimodal também foi utilizada para remover as enzimas residuais que foram usadas durante as etapas de purificação.

Separação celular, concentração por ultrafiltração tangencial.

[0036] Após a cultura de bactérias, o líquido fermentado foi inativado por 0,15% de desoxicolato (pH foi ajustado para 4,5 - 5), as células foram removidas por decantação seguida por centrifugação, e caldo clarificado isento de células foi concentrado e diafiltrado usando membrana de 50 kDa-lOOKDa PES usando 0,9 % de solução salina seguido por tampão Tris-HCl (50 mM, pH 7,0) e tratamento enzimático e segunda concentração por ultrafiltração tangencial.

[0037] O pH da solução de polissacarídeo foi elevado de pH 7,0 até pH 9-9,5, foi adicionado 2 mM de MgC12 e incubou-se a 42 ° C durante 15 minutos a 50-75 rpm. A enzima Benzonase foi adicionado, 10-20 unidades por ml de solução de PS e incubou-se durante l-2h. Subsequentemente, a combinação de enzimas Mutanolisina / lisozima (1: 1) foi adicionado a 50 unidades por ml de solução e incubou-se durante 1-2 h. A enzima β-Ν-acetil-D-glucosaminidase foi adicionado a 1 unidade / l00 ml de solução de polissacarídeo. A proteinase K foi adicionada e incubada a 56 ° C, a pH 9,5- 10,5 por 2-4 h. A reação enzimática total foi completada dentro de 6-8 horas. Todas as enzimas utilizadas foram as enzimas recombinantes.

[0038] Após o tratamento enzimático, ácido acético (2 M) foi usado para reduzir o pH da solução para 3,5-4,5, os precipitados foram removidos por filtração em profundidade e o pH da solução de polissacarídeo foi ajustado para pH 7,0. A solução de polissacarídeo clarificada foi concentrado e diafiltrada através da membrana de 50 kDa-100 kDa PES utilizando-se 0,9% de solução salina, seguida por 50 mM de tampão de fosfato de sódio (50 mM, pH 7,4-7,6). Coluna cromatográfica com resina de aderência CAPTO™

[0039] A purificação final de polissacarídeo foi conseguida em simples escoamento através do modo utilizando cromatografia em resina de aderência CAPTO ™ e, finalmente, eluiu-se utilizando fosfato de sódio 50 mM + NaCl a 1,0 M a um pH de 7,4-7,6. Os resultados são mostrados na Tabela 1 e Figura 1. Tabela 1 Purificação de serotipos de polissacarídeos de Streptococcus pneumoniae e Streptococcus do grupo B % de % de WHO TRS % NA WHO SEC- Parede celular Serotipo Recuperação Proteina TRS HPLC polissacarídica % de PS (CWPS) ou Dde PS Proteína %NA kDa carboidrato Group B por 1H

NMR 3 78 0.85 7.5% 0.10 2 >800 <1% 19F 65 0.28 3% 0.04 2 >300 <1% 1 68 0.65 2 0.03 2 >300 <1.5% Ia 65 0.75 3% 0.18 2 >300 Limite de detecção baixo III 70 0.65 3% 0.33 2 >300 0.5% V 70 0.60 3% 0.35 2 >400 Limite de detecção baixo Estratégia de Purificação - 2 (para as bactérias Gram- negativas)

[0040] A purificação de polissacarídeo usando mistura de enzimas contendo benzonase, proteinase K seguido por filtração de fluxo tangencial (TFF), e cromatografia por Resina de Aderência CAPTO ™ de troca-aniônica multimodal e

/ ou remoção de LPS por resina ENDOTRAP®-HD.

[0041] Vários Serotipos de polissacarídeos, quer a partir de serotipos de H. influenzae, N. meningitis, S. typhimurium foram purificados. Todos os polissacarídeos purificados atingidos ou excedidos o critério de critério EP OMS / ou BP / ou para a pureza de polissacarídeo. As etapas de remoção de endotoxinas foram usadas para remover endotoxinas residuais. A cromatografia multimodal foi mantida opcional para remover as enzimas residuais que foram usadas durante as etapas de purificação. Separação celular, concentração por ultrafiltração tangencial.

[0042] Após a cultura de bactérias, o líquido fermentado foi inativado por 0,15% de desoxicolato ou por 0,6% de formaldeído. As células foram removidas por qualquer decantação e / ou centrifugação, e caldo clarificado isento de células foram concentradas e diafiltradas usando membrana de 50 kDa-lOOkDa PES utilizando-se 0,9% de solução salina, seguida por tampão Tris-HCl (50 mM, pH 7,0). Tratamento enzimático e segunda concentração por ultrafiltração tangencial.

[0043] O pH da solução de polissacarídeo foi elevado de 7,0 para 8,5 - 8,8, foi adicionado 2 mM de MgC12 e incubou- se a 37 ° C durante 15 minutos a 50-75 rpm. A enzima Benzonase foi adicionada em 10-20 unidades por ml de solução de PS e a solução foi incubada durante l - 2h. A proteinase K foi adicionada e incubada a 45 ° C, a pH 9,5-10,5 por 2-4 h. A reação enzimática total foi completada dentro de 6 - 8 horas. Todas as enzimas utilizadas foram enzimas recombinantes.

[0044] Após o tratamento enzimático, ácido acético (2 M) foi usada para reduzir o pH da solução para 3,5-4,5. Os precipitados foram removidos por filtração em profundidade e o pH da solução de polissacarídeo foi ajustado para pH 7,0. solução de polissacarídeo clarificado foi concentrado e diafiltrado através da membrana de 50 kDa-100 kDa PES usando 0,2% de DOC e 1-2 mm de EDTA, seguido de tampão de 50 mM de Na-fosfato (50 mM, pH 6,0-6,4) para reduzir endotoxina impureza. Remoção de endotoxina utilizando resina Endotrap HD

[0045] A endotoxina residual na solução de polissacarídeo foi removida usando resina ENDOTRAP®-HD (endotoxina resina de remoção; Hyglos GmbH, Alemanha) em um simples escoamento através do modo. Os tampões utilizados são ou 100-200mM TRIS ou HEPES a pH 6,4-7,4 com NaCl 50- 80mM. Os íons de cálcio e EDTA presente no tampão também reforçaram a remoção de endotoxina. A resina ENDOTRAP®-HD pode ser usada várias vezes após a regeneração. Coluna cromatográfica com resina de aderência CAPTO™

[0046] A purificação do polissacarídeo foi conseguida em simples escoamento através do modo utilizando cromatografia em resina de aderência CAPTO ™ e eluiu-se utilizando fosfato de sódio 50 mM + NaCl a 1,0 M a um pH de 7,4 - 7,6. A etapas de cromatografia foram mantidas opcionais se a atividade de enzimas residuais foi observado e também se foi observada qualquer fuga de resina ENDOTRAP®-HD. Os resultados são apresentados na Tabela 2 e Figura 2. Tabela 2 Purificação de polissacarídeo de H. influenzae tipo a / b,

N. meningitis tipo W-135 e S. typhi Serotipo % de % de %NA SEC-Endotoxina de PS Recuperação Proteína (WHO HPLCEU/µg de (WHO TRS) (WHO TRS) Kd PS (WHO TRS) TRS) H. 70 <0.3 <0.05 >400 1 Eu/µg de Influenzae (<1%) (<1%) PS tipo b (10Eu/µg) H. 75 <0.1 <0.03 >600 1 Eu/µg de Influenzae (<1%) (<1%) PS tipo a (10Eu/µg) S. typhi 65 <1.0 <0.5 >600 5 Eu/µg de (<3%) (<2%) PS (10Eu/µg) N. 75 <1.0 <0.5 >400 5 Eu/µg meningitis (<3%) (<1%) dePS W-135 (10Eu/µg)

[0047] Outras concretizações e utilizações da invenção serão evidentes para os técnicos versado no assunto a partir da consideração do relatório descritivo e prática da invenção aqui revelada. Todas as referências aqui citadas, incluindo todas as publicações, patentes US e estrangeiras e pedidos de patente, são especificamente e inteiramente incorporados por referência. Pretende-se que o relatório descritivo e os exemplos sejam considerados apenas exemplificativos sendo o verdadeiro escopo e espírito da invenção indicado pelas reivindicações seguintes. Além disso, o termo "compreendendo" inclui os termos consistindo em e 'consistindo essencialmente de'.

Claims (38)

REIVINDICAÇÕES

1. Processo de purificação de polissacarídeo, caracterizado pelo fato de que compreende: proporcionar uma colheita de fermentação de bactérias Gram-positivas e / ou Gram-negativas; clarificar a colheita de fermentação com desoxicolato; concentrar o polissacarídeo clarificado por uma primeira diafiltração; tratar o primeiro polissacarídeo diafiltrado com uma enzima para digerir impurezas; precipitar a enzima com ácido acético; concentrar o polissacarídeo por uma segunda diafiltração; passar o segundo polissacarídeo diafiltrado através de resina cromatográfica multimodal e / ou resina de remoção de endotoxina; e colheitar o polissacarídeo purificado.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polissacarídeo compreende polissacarídeo bacteriano da superfície celular.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o polissacarídeo bacteriano da superfície celular compreende polissacarídeo capsular e / ou exopolissacarídeo.

4. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a colheita de fermentação compreende S. pneumoniae, Streptococcus do Grupo B, H. influenzae, S. typhimurium e / ou N. meningite.

5. Processo, de acordo com a reivindicação 1,

caracterizado pelo fato de que a clarificação é seguido pelo ajuste do pH para cerca de pH 3,5 - 5,0.

6. Processo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o ajuste de pH compreende a adição de um ácido.

7. Processo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o ácido compreende ácido acético.

8. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a enzima compreende uma ou mais benzonase, mutanolisina / lisozima, β-D-N-acetil glucosaminidase e / ou proteinase K.

9. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o tratamento com uma enzima é realizado com várias enzimas diferentes sequencialmente, singularmente ou em combinação.

10. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as impurezas compreendem proteínas, ácidos nucléicos, componentes da parede celular e / ou peptidoglicano.

11. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a passagem através de resina cromatográfica multimodal é realizada no modo de fluxo contínuo, modo de filtração de fluxo tangencial e / ou modo de filtração.

12. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a passagem através de resina cromatográfica multimodal é realizada no modo de filtração de fluxo tangencial.

13. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a colheita de fermentação compreende bactérias Gram-negativas.

14. Processo, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de compreender ainda a passagem do primeiro polissacarídeo diafiltrado através de uma filtração de fluxo tangencial.

15. Processo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a filtração de fluxo tangencial compreende tampão de desoxicolato / EDTA / sal de Ca.

16. Processo, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a filtração de fluxo tangencial compreende ainda a passagem através de uma membrana de 50-100kDa.

17. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a colheita de fermentação compreende bactérias Gram-positivas.

18. Processo, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de compreender ainda a passagem do primeiro polissacarídeo diafiltrado através de uma filtração de fluxo tangencial.

19. Processo, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a filtração de fluxo tangencial compreende tampão de desoxicolato / EDTA / sal de Ca.

20. Processo, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a filtração de fluxo tangencial compreende ainda a passagem através de uma membrana de 50-100kDa.

21. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o segundo polissacarídeo diafiltrado é passado através da resina de remoção de endotoxina.

22. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a colheita de fermentação compreende S. pneumoniae.

23. Processo, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que S. pneumoniae compreende um ou mais dos sorotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11A, 12F, 14, 15B , 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 24, 33F e 35B.

24. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a colheita de fermentação compreende Streptococcus do Grupo B.

25. Processo, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que o Streptococcu do grupo B compreendendo um ou mais dos sorotipos Ia, Ib, II, III, IV, IV, V, VI, VII, VIII e IX.

26. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a colheita de fermentação compreende H. influenza.

27. Processo, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a H. influenza compreende um ou mais dos sorotipos a, b, c, d, e e f.

28. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a colheita de fermentação compreende S. typhi.

29. Processo, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que S. typhi compreendendo Vi- polissacarídeo.

30. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a colheita de fermentação compreende N. meningite.

31. Processo, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que a N. meningite compreende um ou mais sorotipos A, B, C, X, Y e W-135.

32. Polissacarídeo purificado caracterizado pelo fato de que é pelo método conforme definido pela reivindicação 1.

33. Composição imunológica caracterizada pelo fato de que incorpora ou é derivada do polissacarídeo purificado conforme definido pela reivindicação 32.

34. Composição imunológica, de acordo com a reivindicação 33, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um adjuvante.

35. Composição imunológica, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que não compreende um adjuvante.

36. Método para tratar uma pessoa contra uma infecção caracterizado pelo fato de que compreende administrar a composição imunológica conforme definida pela reivindicação

33.

37. Método, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que a infecção compreende S. pneumoniae, Streptococcus do Grupo B, H. influenzae, S. typhimurium e / ou N. meningite.

38. Processo de purificação de polissacarídeo, caracterizado pelo fato de que compreende: proporcionar uma colheita de fermentação de bactérias de S. pneumoniae, Streptococcus do Grupo B, H. influenzae, S. typhimurium e / ou de N. meningite; clarificação da colheita de fermentação com desoxicolato a um pH de cerca de 3,5 - 5,0; concentrar o polissacarídeo clarificado por uma primeira diafiltração; tratar o primeiro polissacarídeo diafiltrado com uma enzima para remover impurezas; precipitar a enzima com ácido acético, de modo que o polissacarídeo permaneça no sobrenadante; concentrar o polissacarídeo do sobrenadante por uma segunda diafiltração; passar o segundo polissacarídeo diafiltrado através de resina cromatográfica multimodal e / ou resina de remoção de endotoxina por filtração de fluxo tangencial com tampão de desoxicolato / EDTA / sal de Ca; e coletar o polissacarídeo purificado.