KR20200024896A

KR20200024896A - 용해 효소, 접선방향 유동 여과, 및 다중모드 크로마토그래피를 이용한, 백신 제조를 위한 다당류 정제

Info

Publication number: KR20200024896A
Application number: KR1020207003121A
Authority: KR
Inventors: 수브하쉬 브이. 카프레; 아누프 케이. 다타
Original assignee: 인벤트프라이즈 엘엘씨
Priority date: 2017-07-05
Filing date: 2018-06-29
Publication date: 2020-03-09
Also published as: KR102472936B1; JP2020526198A; MX2020000224A; CA3068983A1; CN111295450A; US10435433B2; JP7111799B2; MY187934A; WO2019010080A1; EP3649247A1; ZA202000167B; BR112020000229A2; US20190010187A1; EP3649247A4

Abstract

S. 뉴모니애(S. pneumoniae), B군 스트렙토코커스(Group B Streptococcus), H. 인플루엔자(H. Influenzae), S. 티포이드(S, Typhoid) 및 N. 메닝기티디스(N. meningitidis)의 피막 다당류의, 개선되고 비용 효과적이며 단축된 정제 공정이 개시된다. 이 공정은 효소 처리 칵테일, 접선방향 유동 여과, 및 다중모드 크로마토그래피 정제를 포함한다. 그람-음성 박테리아의 경우, 내독소 제거 과정에 엔도트랩 HD 수지를 사용한다. 이 단축된 공정은 인간 백신 제조에 사용하기 위해 WHO/EP/BP가 요구하는 순도와 함께, 기존 공정에 비해 간단한 단계와 높은 수율을 달성한다. 공정의 각 단계들은, 비용이 많이 들고 수행하는데 시간이 걸리며 상업적 사용에 건강 위험이 있는 초원심분리 및 유기용매, 예를 들어 알코올과 페놀을 사용하지 않는다. 개신된 공정은 또한 간단하고 효율적이고 무독성이고 확장이 용이하며 환경 친화적이다.

Description

용해 효소, 접선방향 유동 여과, 및 다중모드 크로마토그래피를 이용한, 백신 제조를 위한 다당류 정제

관련 출원에 대한 참조

본 출원은 2017년 7월 5일자로 출원된 미국 가출원 번호 62/528,683에 대한 우선권을 주장하며, 이의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.

발명의 기술분야

본 발명은 박테리아 다당류의 효과적인 정제를 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 상기 방법은 효과적이고, 비용 효율적이고, 확장 가능하며, 접합체 백신을 포함하는 백신의 제조를 위한 불순물 제거와 관련된다.

정제된 CPS (capsular polysaccharide, 피막 다당류)는 백신, 특히 CPS가 유래된 박테리아에 의한 감염에 대해 효과적인 백신의 제조에 사용된다. 통상적인 공정에서, 박테리아는 산업용 생물반응기에서 배양되고 CPS는 미리 정해진 또는 원하는 순도 요건으로 정제된다. 백신 제조를 위한 박테리아 CPS의 전통적인 정제 공정은 에탄올 및 페놀과 같은 용매 및 양이온성 계면활성제를 이용한 몇 가지 선택적 침전 단계를 기반으로 한다.

H. 인플루엔자(H. Influenzae), N. 메닝기티디스(N. meningitidis), B군 스트렙토코커스(Group B Streptococcus) 및 S. 뉴모니아(S. pneumonia)는 영아 및 면역결핍 성인에서 수막염, 폐렴 및 균혈증의 가장 흔한 원인 중 일부이다. 피막 다당류(CPS)는 숙주의 면역체계에 대한 방어 메커니즘으로 작용하여 이들 박테리아의 주요 독성 인자가 된다. 이들 유기체로부터 유래된 다당류에 기초한 백신은 성인 집단에 효과적이다. 다당류 백신의 면역원성 특성에 대한 몇 가지 연구가 있다. 정제 공정은 수율을 최대화하고 공정 비용을 최소화하면서 원하는 사양으로 제품을 얻는 것을 목표로 한다. 종래의 절차의 최종 정제 단계는 생산 효율성과 오염물질 제거 간의 균형이 이루어지는 일련의 정제 단계를 포함한다. CPS의 정제에서 오염물질은, 예를 들어, 단백질, 핵산, 색소 및 원치 않는 다당류, 예를 들어, 그람 양성 박테리아의 경우 세포벽 다당류 또는 그람 음성 박테리아의 경우 지질 다당류 (LPS)이다.

CPS의 통상적인 정제 공정은 에탄올 및/또는 음이온성 계면활성제 선택적 침전, 페놀에 의한 단백질 추출, 및 그람-음성 박테리아의 경우 LPS를 제거하는 초원심분리에 의한 단백질 추출에 의한 농축/정제의 일반적인 방법을 따른다.

예를 들어, N. 메닝기티디스 유래 다당류의 통상적인 정제는, 양이온성 계면활성제 세타블론(cetavlon)을 이용한 침전으로서 침전물이 1M CaCl₂에서 재현탁되는 침전, 에탄올을 이용한 2 회 침전, 페놀을 이용한 3회의 추출 단계에 의한 탈단백질화(deproteinization), 투석 및 추가적인 에탄올 침전을 포함한다. LPS는 초원심분리에 의해 CPS로부터 분리된다.

S. 뉴모니아 CPS의 통상적인 정제 공정은 계면활성제 데옥시콜레이트를 이용한 총 세포 용해, 농축/정용여과(diafiltration), 4단계의 에탄올 침전, 페놀 처리 및 활성탄에 의한 탈단백질화를 포함한다.

H. 인플루엔자 PRP의 통상적인 정제 공정은 페놀, 포름알데히드 또는 티메로살에 의한 세포의 불활성화 및 원심 분리에 의한 배양액의 분리로 시작된다. 그 후, 청정화된 상청액을 50-100kDa 컷오프 막을 갖는 접선방향 유동 한외여과(tangential flow ultrafiltration)에 의해 농축시키고, 양이온성 계면활성제 세타블론과, 염화칼슘으로 가용화된 복합체 PRP-세타블론을 이용하여 침전시키고, 이어서 여러 번의 에탄올 침전과, 페놀을 이용한 추출에 의해 탈단백질화, 및 추가적인 에탄올 침전이 수행된다. 지질다당류는 초원심분리에 의해 PRP로부터 분리된다.

피막 다당류로부터 단백질 및 세포벽 C-다당류와 같은 기타 불순물들을 제거하기 위한 많은 정제 공정들이 현재 이용 가능하다. 예를 들어, 미국 특허 제4,242,501호는 폐렴구균성 피막 다당류의 정제에 관한 것으로 미생물의 피막 다당류에서 단백질 및 기타 불순물들 (C- 다당류)을 제거하는 방법에 관한 것이다. 1572 MUM/2010. 미국 특허 제5,714,354호, 제 5,847,112호 및 제 4,242,501호는 각각 폐렴구균성 다당류의 정제공정에 관한 것이다. 국제출원 공개공보 WO 2006/082527은 양이온성 계면활성제에 의한 침전을 포함하는 S. 아갈락티애(S. agalactiae)의 피막 다당류의 정제 공정에 관한 것이다. 국제출원 공개공보 WO 2008/045852는 가열 및 낮은 pH 침전 공정이 사용 된 폐렴구균성 다당류의 정제 공정에 관한 것이다. 국제출원 공개공보 WO 2012/127485는 폐렴구균성 다당류의 정제를 위한 알코올 및 CTAB 무첨가 방법에 관한 것이다. CPS 정제에 관한 다른 공개 간행물들로는 "Purification of Capsular Polysaccharide Produced by Streptococcus pneumoniae Serotype 19A" J. Microbiol. Biotechnol, 21(7), 734-738, 2011; "Production of Capsular Polysaccharide of Streptococcus pneumoniae Type 14 and Its Purification by Affinity Chromatography," Appl Environ Microbiol, 67(2): 969-971, Feb. 2011 이 포함된다.

종래의 CPS 정제 공정은 길고 복잡하며, 고도로 훈련된 인력을 필요로 하며 많은 값비싼 공급물 및 조성물을 이용한다. 또한, 오류의 위험이 크고 오류가 자주 발생하여 시간과 자원 모두에서 공정이 매우 비효율적이다. 따라서, 효율적이고 효과적인 다당류 정제 공정이 여전히 요구된다.

본 발명은 현재의 전략 및 설계와 관련된 문제 및 단점을 극복하고, 다당류를 정제하기 위한 새로운 조성물 및 공정을 제공한다.

본 발명의 일 구체예는 그람-양성 및/또는 그람-음성 박테리아의 발효 수확물을 제공하는 단계를 포함하는, 박테리아의 세포 표면 다당류를 정제하는 방법에 관한 것이다. 발효 수확물은, 바람직하게는 pH 3.5 내지 5.0과 같은 산성 pH에서 데옥시콜레이트 또는 이와 기능적으로 유사한 것을 사용하여 청정화(clarifying)된다. 청정화된 다당류는 바람직하게는 정용여과(diafiltration)에 의해 농축되고, 펩티도글리칸 및/또는 다른 세포막 구조물에 부착될 수 있는 숙주 세포 단백질, 핵산, 및 세포벽 다당류와 같은 불순물들의 제거를 위한 효소로 처리된다. 효소는 바람직하게는 아세트산을 이용하여 침전되고, 효소 처리된 다당류는 정용여과에 의해 농축되고, 유동-통과　모드(flow-through mode), 접선방향 유동 여과(tangential flow filtration) 및/또는 CAPTO™ Adhere 수지를 통해 다중모드 크로마토그래피 수지를 통과한다. 바람직하게는, 박테리아의 세포 표면 다당류는 피막 다당류 및/또는 세포외 다당류(exopolysaccharide)를 포함한다. 바람직하게는, 박테리아의 수확물은 S. 뉴모니애(S. pneumoniae), B군 스트렙토코커스(Group B Streptococcus), H. 인플루엔자(H. Influenzae), S. 티피뮤리움(S. typhimurium) 또는 N. 메닝기티스(N. meningitis)를 을 포함한다. 바람직하게는, 청정화 후 아세트산을 사용하여 산성 pH 3.5-5 로 pH를 조정하거나 2M 아세트산을 사용하여 pH 3.5 미만 또는 pH 4.5 미만으로 pH를 조정한다. 바람직하게는, 효소는 벤조나제(Benzonase), 뮤타놀리신/리소자임(Mutanolysin/lysozyme), β-D-N-아세틸 글루코사미니다제(β-D-N-acetyl glucosaminidase) 및 프로테이나제 K(Proteinase K) 로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 효소 처리는 순차적으로, 단독으로 또는 조합하여 수행된다. 바람직하게는, 발효 수확물은 그람-음성 박테리아를 포함하고, 효소 처리되고 정용여과된 다당류는 데옥시콜레이트/EDTA/Ca-염 완충액을 사용하여 접선방향 유동 여과를 통과한다. 바람직하게는, 접선방향 유동 여과는 50-100kDa 막을 통한 다당류의 통과를 포함한다. 바람직하게는, 발효 수확물은 그람-양성 박테리아를 포함하고, 효소 처리되고 정용여과된 다당류는 CAPTO™ Adhere 수지를 사용하여 다중모드 크로마토그래피를 통과한다. 바람직하게는, 발효 수확물은 그람-음성 박테리아를 포함하고, 유동 통과 모드에서 수지 크로마토그래피, 보다 구체적으로는 EndoTrap HD 수지를 이용하여 내독소를 제거하는 것을 추가로 포함한다. 바람직하게는, 발효 수확물은 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 24, 33F 및 35B 중 하나 이상 또는 백신 제조에 사용되는 다른 혈청형들을 포함하는 S. 뉴모니애를 포함한다. 바람직하게는, 발효 수확물은 혈청형 Ia, Ib, II, III, IV, V, VI, VII, VIII 및 IX 중 하나 이상을 포함하는 B군 스트렙토코커스를 포함한다. 바람직하게는, 발효 수확물은 아균주(sub-strain) a, b, c, d, e 및 f 혈청형을 포함하는 H. 인플루엔자를 포함한다. 바람직하게는, 발효 수확물은 Vi-다당류를 포함하는 S. 티피(S. typhi)를 포함한다. 바람직하게는, 발효 수확물은 혈청형 A, B, C, X, Y 및 W-135중 하나 이상을 포함하는 N. 메닝기티스를 포함한다.

본 발명의 다른 구체예는 본원에 기술된 바와 같은 본 발명의 방법에 의해 정제된 다당류를 포함한다.

본 발명의 다른 구체예는 본 발명의 정제된 다당류를 포함하거나 이로부터 유래된 백신과 같은 면역학적 조성물을 포함한다. 본 개시에 따라 제조된 백신은 면역증강제(adjuvant)를 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.

본 발명의 다른 실시예 및 장점은 이하의 설명에서 부분적으로 명시되는데, 부분적으로는, 이 설명으로부터 명백하거나 본 발명의 실시로부터 배울 수 있다.

도 1. 다당류에 세포벽 다당류 (cell wall polysaccharide, CWPS)가 없음을 보여주는, 정제 전략 1을 사용하여 정제된 다당류의 ¹H NMR 분석. S. 뉴모니애 타입 3 다당류, 크기 감소된 다당류, SEC-HPLC- <50kDa 에 의한 분자 크기 분포 (3.2 PPM에서 검출되지 않은 C-다당류).
도 2. 다당류에 세포벽 다당류 (CWPS)가 없음을 보여주는, 정제 전략 1을 사용하여 정제된 다당류의 ¹H NMR 분석. S. 뉴모니테 타입 1 다당류 - 크기 감소된 다당류, SEC-HPLC- <50kDa 에 의한 분자 크기 분포 (3.2 PPM에서 검출되지 않은 C-다당류).

액체로부터 고체의 분리는 정제된 CPS에서의 연속적인 원심분리에 기초하여 이들 박테리아에 대한 백신의 생산에 사용된다. 액체로부터 고체를 분리하는 것은 방폭 설비에서 지속적인 원심 분리에 기초한다.

기존 공정의 에탄올 침전, 페놀의 사용 및 초원심분리 단계들을 제거한 CPS 정제 방법이 놀랍게도 개발되었다. 본 발명의 공정은, 예를 들어 30-100kDa와 같은 원하는 분자량 컷오프 값을 가진 막을 사용하는 한외여과(ultrafiltration) 단계를 포함하고, 효소 분해 및 바람직하게는 30-100kDa 컷오프 막을 사용하는 접선방향 유동-여과 (tangential flow-filtration, TFF)에 의해 잔류 단백질 및 핵산을 제거한다. 그 결과 정제된 CPS는 총 CPS와 관련된 핵산의 1 % 이하 및 단백질의 1 % 이하이면서 70 % 이상의 수율을 갖는다. 정제된 CPS는 단백질 분해효소 활성이 없으며 필요한 품질 테스트를 통과한다.

본 발명의 일반적인 장점은, 간단하고, 효율적이며, 상업적으로 확장 가능한 단계들에 의해 불순물들을 제거하면서 다당류를 정제하는, 박테리아 세포 표면 피막 다당류(CPS)를 정제하기 위한 신속하고 효율적이며 효과적인 공정을 제공함으로써, 관련 WHO 규격 및 기타 품질 표준을 충족하거나 초과하는 고품질의 다당류를 생산하는 것을 포함한다.

본 발명의 일 구체예는 다당류의 정제 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 다당류가 현저하게 단축된 시간에 정제되는, 신규하고, 신속하고, 비용 효율적이며, 확장 가능한 방법을 기술한다. 선택된 박테리아 균주는 발효기에서 최적화된 배양 배지에서 배양되며, 상기 방법은 발효된 수확물의 원심분리를 수행하여 세포 잔해를 제거한 다음 분자량 컷-오프 막을 사용하여 TFF를 수행함으로써 진행된다. 본 발명의 방법은 다당류를 제조하는 신규하고 신속한 방법을 제공하는 것과 같은, 종래 기술에 비해 몇 가지 장점을 나타낸다. 이 방법은 전체 단계의 수를 줄이고 단일 크로마토그래피 스크리닝을 필요로 하므로 비용 효과적이다. 추가적인 장점은 이 방법이 완전히 확장 가능하다는 것이다

대부분의 임의의 다당류의 정제가 본 발명의 방법에 따라 수행될 수 있지만, 특히 바람직한 방법은 백신 생산을 위한, N. 메닝기티디스, S. 뉴모니애, H. 인플루엔자 타입 b, S. 티피뮤리움 및 B군 스트렙토코커스로부터의 다당류의 정제를 포함한다. 상기 방법은 박테리아 또는 다른 다당류 공급원의 발효 수확물을 제공하고, 예를 들어 pH 약 3.5-5.0에서 데옥시콜레이트를 이용하여 발효 수확물을 청정화하고, 청정화된 다당류를 제1 정용 여과에 의해 농축하고, 제1 정용여과된 다당류를 효소로 처리하여 불순물을 제거하고, 효소를 아세트산을 이용하여 침전시켜 다당류가 상청액에 남아 있도록 하고, 상청액의 다당류를 제2 정용여과에 의해 농축하고, 제2 정용여과된 다당류를 데옥시콜레이트/EDTA/Ca-염 완충액을 사용한 접선방향 유동 여과에 의해 다중모드 크로마토그래피 수지 및/또는 내독소 제거 수지를 통해 통과시키고, 정제된 다당류를 수집하는 것을 포함한다.

본 발명의 방법은 에탄올, 페놀 및 계면활성제 침전의 필요성 및 사용을 제거하고, 대신 연속적인 용해 효소 처리에 이은 한외여과와, 필요한 경우, 바람직하게는 소수성 상호작용 크로마토그래피 또는 혼합 모드 이온교환 수지 크로마토그래피에 의한 추가 정제를 포함한다.

뉴클레아제인 벤조나제는 잔류 게놈 DNA 및 RNA를 가수분해하고, 그 결과 생성된 저분자량 올리고뉴클레오티드는 제2 TFUF의 막을 통해 여과된다. 펩티도글리칸 및 펩티도글리칸에 부착된 세포벽 다당류 (CWPS 또는 B군 탄수화물)는 뮤타놀리신/리소자임/β-D-N-아세틸 글루코사미니다제 (활성단위비 : 1:1:0.1) 효소 칵테일 조합에 의해 분해되고/되거나 크기가 감소된다. 단백질과 LPS는 효소 처리와, TFUF 30-100kDa를 이용한 제2 농축/정용여과 후에 제거된다. 그람-음성 박테리아의 경우, LPS의 제거는 바람직하게는 계면활성제 및 킬레이트제, 바람직하게는 DOC/EDTA의 존재 하에 TFUF를 이용하여 수행된다. 계면활성제인 데옥시콜레이트 (DOC)는 지질 부분의 지방산의 소수성 상호작용을 파괴하고, 응집물을 분해하며, 30-100kDa의 막에서 자유롭게 여과될 수 있는 LPS의 저분자량 단량체를 생산한다.

본 발명의 정제 방법은, 부분적으로는, 분자 크기에 기초한다. 첫번째 TFUF에서, 기공 컷오프보다 작은 크기의 분자가 제거되는데, 대부분이 배양 배지에서 제거된다. 효소가 오염물질, 단백질 및 핵산의 크기를 줄인 후, 두번째 TFUF가 이들을 제거한다. LPS의 저분자량 단량체는 계면활성제 및 킬레이트제의 존재 하에서 한외여과된다.

본 발명의 방법은 알코올, 페놀 또는 양이온성 계면활성제를 사용하는, 기존 통상적인 방법에서 요구되는 다수의 침전 단계들을 제거하고, 대신 효소 처리 및/또는 한외여과를 통해 필요하거나 원하는 순도로 최종 생성물을 얻는다.

초원심분리와 비교하여, 효소 처리 및 접선방향 한외여과(tangential ultrafiltration)의 조합은 확장(scale-up)이 용이하고 비용이 훨씬 저렴하다. 접선방향 유동을 위한 막은 제자리에서 세척되고 반복적으로 사용할 수 있도록 저장된다 (예를 들어, 일회용 막을 사용하여). 본 발명의 방법은 상업적 개발을 위해 쉽게 확장되는, 간단하고 효율적이며 환경 친화적인 방법을 제공한다.

아래 실시예들은 본 발명의 구현예들을 예시하나, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 간주되어서는 안 된다.

실시예

실시 예 1

박테리아의 배양

박테리아의 배양은 각 균주별로 적절한 배지와 조건을 포함하는 5 ~ 10L 발효기에서 수행되었다. 생물반응기의 전체 브로쓰를 0.15% 데옥시콜레이트를 이용하여 침전시키고, 디캔팅하고 원심분리 하였다. 접선방향 미세여과(tangential microfiltration)에 의해 배양 브로쓰로부터 세포를 분리하였다. 무-세포성(cell-free) 미세 여과물을 S. 뉴모니애 및 추가 균주들에 대한 CPS-정제에 사용하였다.

농축/탈여과(defiltration)

무-세포성 CPS는 30-100kDa의 접선방향 유동 한외여과 (TFUF) 막에 의해 1-20 배로 농축하였다. 농축물을 완충액을 사용하여 바이오필터링 하였다.

효소 처리 및 농축/정용여과

나이세리아(Neisseria) 또는 스트렙토코커스로부터의 가용성-CPS 분획의 pH를 pH 7로 조정 하였다. 재조합 효소를 연속적으로 첨가하였다: 벤조나제(2mM MgCl₂ 및 20mM NaCl을 함유하는 Tris-HCl 50mM; 뮤타놀리신/리소자임 (1:1); β-D-N-아세틸 글루코사미니다제; 및 프로테이나제 K를 2-4 시간 간격으로 첨가하고 50-100 rpm에서 알칼리성 pH (pH 8.8-10.5) 하에서 37 ℃ -56 ℃에서 12-24 시간 동안 배양하였다. 효소 분해 및 계면활성제 처리로 인한 저분자량 오염물질들은 30-100kDa 컷오프의 두 번째 TFUF 막에 의해 제거하였다. 정제된 CPS를 0.2μm 막으로 멸균 여과하고 영하 20 ℃에서 보관하였다.

다당류의 정제를 위해 2가지의 상이한 정제 전략을 사용하였다. 하나의 정제 방법은 일반적으로 그람-양성 박테리아의 다당류 정제공정에 사용되고(정제 전략-1), 다른 하나는 그람-음성 박테리아 다당류 정제공정에 사용된다(정제 전략-2).

정제 전략-1 (그람-양성 박테리아의 경우)

벤조나제, 뮤타놀리신/리소자임 조합물, β-D-N-아세틸 글루코사미니다제, 프로테이나제 K를 포함하는 효소 칵테일, 이어서 접선방향 유동 여과 (TFF), 및 마지막으로 다중모드 음이온-교환기 CAPTO™ Adhere Resin Chromatography (공정 규모에서 단클론항체의 포스트-단백질 A 정제를 위해 설계된 다중모드 중간 수지)를 이용한 다당류 정제.

S. 뉴모니애 및 B군 스트렙토코커스 혈청형들로부터 여러가지 혈청형 다당류를 정제하였다. 정제된 모든 다당류는 다당류 순도에 대한 WHO/ 또는 BP/ 또는 EP 기준의 기준을 충족하거나 초과하였다. 또한 잔류 단백질, 핵산 및 내독소 다중모드 크로마토그래피 단계들에 의해 더 높은 순도가 달성되었다. 정제 단계 동안 사용된 잔류 효소를 제거하기 위해 다중모드 크로마토그래피를 또한 사용하였다.

세포 분리, 접선방향 한외여과에 의한 농축

박테리아 배양 후, 발효액을 0.15 % 데옥시콜레이트를 이용하여 불활성화시키고 (pH를 4.5-5로 조정), 세포를 디캔팅 한 후 원심 분리하여 세포를 제거하고, 무-세포성 청정화된 브로쓰를 농축하고, 0.9% 식염수를 사용하고 이어서 Tris-HCl 완충액 (50mM, pH 7.0)을 사용하여 50 KDa-100 KDa PES 막으로 정용여과시켰다.

효소 처리 및 접선방향 한외여과에 의한 제2 농축

다당류 용액 pH를 pH 7.0에서 pH 9-9.5로 상승시키고, 2mM MgCl₂를 첨가하여 42 ℃, 50 rpm에서 15 분 동안 인큐베이션 하였다. 효소 벤조나제를 PS 용액 ml 당 10-20 단위(unit)로 첨가하고, 1-2시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 용액 1 ml 당 50 단위의 뮤타놀리신/리소자임 (1:1) 효소 조합물을 첨가하고 1-2 시간 동안 인큐베이션 하였다. 효소 β-D-N-아세틸 글루코사미니다제를 다당류 용액 100ml 당 1 단위로 첨가하였다. 프로테이나제 K를 첨가하고 pH 9.5-10.5 및 56 ℃에서 2-4 시간 동안 인큐베이션하였다. 6-8 시간 내에 전체 효소 반응이 완료되었으며, 사용된 모든 효소는 재조합 효소였다.

효소 처리 후, 아세트산 (2M)을 사용하여 용액의 pH를 3.5 내지 4.5로 감소시키고, 심층여과에 의해 침전물을 제거하고 다당류 용액의 pH를 pH 7.0으로 조정하였다. 청정화된 다당류 용액을 농축시키고 0.9 % 식염수를 사용하고 이어서 50mM 인산나트륨 완충액 (50mM, pH 7.4-7.6)을 사용하여 50 kDa-100 kDa PES 막으로 정용 여과시켰다.

CAPTO ™ Adhere 수지를 사용한 컬럼 크로마토그래피

다당류의 최종 정제는 CAPTO ™ Adhere 수지 크로마토그래피를 사용하여 간단한 유동-통과 모드에서 달성하였고, pH 7.4-7.6에서 50mM 인산나트륨 + 1.0M NaCl을 사용하여 최종적으로 용리하였다. 결과는 표 1 및 도 1에 나타내었다.

스트렙토코커스 뉴모니애 및 B군 스트렙토코커스 다당류 혈청형의 정제

PS 혈청형	% PS 회수율	%단백질	WHO TRS % 단백질	% NA	WHO TRS % NA	SEC-HPLC kDa	¹ H NMR에 의한 세포벽 다당류 (CWPS) 또는 B군 탄수화물
3	78	0.85	7.5 %	0.10	2	>800	<1%
19F	65	0.28	3%	0.04	2	>300	<1%
1	68	0.65	2	0.03	2	>300	<1.5%
Ia	65	0.75	3%	0.18	2	>300	검출한계미만
III	70	0.65	3%	0.33	2	>300	0.5%
V	70	0.60	3%	0.35	2	>400	검출한계미만

참고 : % PS 회수율은 발효기의 초기 크루드(crude) PS로부터 계산되었음

정제 전략 -2 (그람-음성 박테리아의 경우)

벤조나제, Proteinase K 를 함유하는 효소 칵테일과, 접선방향 유동 여과 (TFF) 및 다중모드 음이온-교환기 CAPTO™ Adhere Resin Chromatography 및/또는 ENDOTRAP®-HD 수지에 의한 LPS 제거를 이용한 다당류 정제.

H. 인플루엔자, N. 메닝기티스, S. 티피뮤리움 혈청형으로부터 여러가지 혈청형 다당류를 정제하였다. 정제된 모든 다당류는 다당류 순도에 대한 WHO/ 또는 BP/ 또는 EP 기준의 기준을 충족하거나 초과하였다. 내독소 제거 단계를 사용하여 잔류 내독소를 제거하였다. 정제 단계 동안 사용된 잔류 효소를 제거하기 위해 다중모드 크로마토그래피를 선택적으로 유지하였다.

세포 분리, 접선방향 한외여과에 의한 농축

박테리아 배양 후, 발효액을 0.15 % 데옥시콜레이트 또는 0.6 % 포름 알데히드를 이용하여 불활성화시켰다. 디캔팅 및/또는 원심분리에 의해 세포를 제거하고, 무-세포성 청정화된 브로쓰를 농축하고, 0.9 % 식염수를 사용하고 이어서 Tris-HCl 완충액 (50mM, pH 7.0)을 사용하여 50 kDa-100 kDa PES 막으로 정용여과시켰다.

효소 처리 및 접선방향 한외여과에 의한 제2 농축

다당류 용액의 pH를 7.0에서 8.5-8.8로 상승시키고, 2mM MgCl₂를 첨가하여 37 ℃, 50-75 rpm에서 15 분 동안 인큐베이션 하였다. 효소 벤조나제를 PS 용액 1 ml 당 10-20 단위(unit)로 첨가하고, 이 용액을 1-2 시간 동안 인큐베이션하였다. 프로테이나제 K를 첨가하고 45 ℃ 및 pH 9.5-10.5에서 2-4 시간 동안 인큐베이션하였다. 6-8 시간 내에 전체 효소 반응이 완료되었으며, 사용된 모든 효소는 재조합 효소였다.

효소 처리 후, 아세트산 (2M)을 사용하여 용액의 pH를 3.5-4.5로 감소시켰다. 심층여과에 의해 침전물을 제거하고 다당류 용액의 pH를 pH 7.0으로 조정하였다. 청정화된 다당류 용액을 농축시키고 0.2 % DOC 및 1-2mM EDTA 사용하고 이어서 50mM Na-포스페이트 완충액 (50mM, pH 6.0-6.4) 을 사용하여 50 kDa-100 kDa PES 막으로 정용 여과하여 내독소 불순물을 감소시켰다.

Endotrap HD 수지를 사용한 내독소 제거

다당류 용액 중의 잔류 내 독소를 간단한 유동-통과 모드로 ENDOTRAP®-HD 수지 (내독소 제거 수지; Hyglos GmbH, Germany)를 사용하여 제거하였다. 사용된 완충제는 50-80mM NaCl와 함께 pH 6.4-7.4의 100-200mM TRIS 또는 HEPES이다. 완충액에 존재하는 칼슘 이온 및 EDTA 또한 내독소의 제거를 향상시켰다. ENDOTRAP®-HD 수지는 재생 후 여러 번 사용할 수 있다.

CAPTO ™ Adhere 수지를 사용한 컬럼 크로마토그래피

다당류의 정제는 CAPTO™ Adhere 수지 크로마토그래피를 사용하여 간단한 유동-통과 모드에서 달성하였고, pH 7.4-7.6에서 50mM 인산나트륨 + 1.0M NaCl을 사용하여 용리하였다. 잔류 효소 활성이 관찰되는 경우와, ENDOTRAP®-HD 수지로부터의 누출이 관찰되는 경우에도 이 크로마토그래피 단계를 선택적으로 유지하였다. 결과는 표 2 및 도 2에 나타내었다.

H. 인플루엔자 타입 a/b, N. 메닝기티스 타입 W-135, 및 S. 티피 다당류의 정제

PS 혈청형	%회수율 (WHO TRS)	%단백질 (WHO TRS)	%NA (WHO TRS)	SEC-HPLC Kd	PS 의 내독소 EU/μg (WHO TRS)
H. 인플루엔자 타입 b	70	<0.3(<1%)	<0.05 (<1%)	>400	1 Eu/μg of PS (10Eu/μg)
H. 인플루엔자 타입 a	75	<0.1(<1%)	<0.03 (<1%)	>600	1 Eu/μg of PS (10Eu/μg)
S. 티피	65	<1.0(<3%)	<0.5 (<2%)	>600	5 Eu/μg of PS (10Eu/μg)
N. 메닝기티스 W-135	75	<1.0(<3%)	<0.5 (<1%)	>400	5 Eu/μg of PS (10Eu/μg)

본 발명의 다른 구현예들과 용도는 본원에 개시된 본 발명의 설명 및 실시를 고려하여 당해 기술 분야의 당업자에게 자명할 것이다. 모든 간행물, 미국 및 외국 특허 및 특허 출원을 비롯하여 본원에 인용된 모든 참조문헌들은 그 전체가 원용에 의해 구체적으로 본원에 포함된다. 본원의 설명 및 실시예는 후술한 청구항에 의해 정해지는 본 발명의 진정한 범위 및 사상내에서만 예시적인 것으로 간주되는 것으로 의도된다. 또한, 용어 "를 포함하는"은 용어 "로 구성되는" 및 "로 필수적으로 구성되는"을 포괄한다.

Claims

하기의 단계를 포함하는, 다당류를 정제하는 방법 :
그람-양성 및/또는 그람-음성 박테리아의 발효 수확물을 제공하는 단계;
발효 수확물을 데옥시콜레이트를 이용하여 청정화(clarifying)하는 단계;
청정화된 다당류를 제1 정용여과(diafiltration)에 의해 농축시키는 단계;
제1 정용여과된 다당류를 효소로 처리하여 불순물을 분해하는 단계;
효소를 아세트산을 이용하여 침전시키는 단계;
다당류를 제2 정용여과에 의해 농축시키는 단계;
제2 정용여과된 다당류를 다중모드 크로마토그래피 수지 및/또는 내독소 제거 수지에 통과시키는 단계; 및
정제된 다당류를 수집하는 단계.
제1항에 있어서, 다당류가 박테리아의 세포 표면 다당류를 포함하는 것인 방법.
제2항에 있어서, 박테리아의 세포 표면 다당류가 피막 다당류(capsular polysaccharide) 및/또는 세포외 다당류(exopolysaccharide)를 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 발효 수확물이 S. 뉴모니애(S. pneumoniae), B군 스트렙토코커스(Group B Streptococcus), H. 인플루엔자(H. Influenzae), S. 티피뮤리움(S. typhimurium) 및/또는 N. 메닝기티스(N. meningitismeningitis)를 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 청정화 후에 pH를 약 pH 3.5 내지 5.0으로 조정하는 방법.
제5항에 있어서, pH 조정이 산의 첨가를 포함하는 것인 방법.
제6항에 있어서, 산이 아세트산을 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 효소가 벤조나제(Benzonase), 뮤타놀리신/리소자임(Mutanolysin/lysozyme), β-D-N-아세틸 글루코사미니다제(β-D-N-acetyl glucosaminidase) 및/또는 프로테이나제 K(Proteinase K) 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 효소로 처리하는 것이 다수의 상이한 효소로 순차적으로, 단독으로 또는 조합하여 수행되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 불순물이 단백질, 핵산, 세포벽 성분 및/또는 펩티도글리칸을 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 다중모드 크로마토그래피 수지에 통과시키는 것이 유동-통과　모드(flow-through mode), 접선방향 유동 여과 모드(tangential flow filtration mode) 및/또는 여과 모드(filtration mode)에서 수행되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 다중모드 크로마토그래피 수지에 통과시키는 것이 접선방향 유동 여과 모드에서 수행되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 발효 수확물이 그람 음성 박테리아를 포함하는 것인 방법.
제13항에 있어서, 제1 정용여과된 다당류를 접선방향 유동 여과를 통해 통과시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제14항에 있어서, 접선방향 유동 여과가 데옥시콜레이트/EDTA/Ca-염 완충액을 포함하는 것인 방법.
제13항에 있어서, 접선방향 유동 여과가 50-100kDa 막을 통한 통과를 추가로 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 발효 수확물이 그람 양성 박테리아를 포함하는 것인 방법.
제17항에 있어서, 제1 정용여과된 다당류를 접선방향 유동 여과를 통해 통과시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제18항에 있어서, 접선방향 유동 여과가 데옥시콜레이트/EDTA/Ca-염 완충액을 포함하는 것인 방법.
제17항에 있어서, 접선방향 유동 여과가 50-100 kDa 막을 통한 통과를 추가로 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 제2 정용여과된 다당류가 내독소 제거 수지를 통해 통과하는 방법.
제1항에 있어서, 발효 수확물이 S. 뉴모니애(S. pneumoniae)를 포함하는 것인 방법.
제22항에 있어서, S. 뉴모니애가 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 9N, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F, 24, 33F 및 35B 중 하나 이상을 포함하는 방법..
제1항에 있어서, 발효 수확물이 B군 스트렙토코커스(Group B Streptococcus)를 포함하는 것인 방법.
제24항에 있어서, B군 스트렙토코커스가 혈청형 Ia, Ib, II, III, IV, V, VI, VII, VIII 및 IX 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 발효 수확물이 H. 인플루엔자(H. Influenza)를 포함하는 것인 방법.
제26항에 있어서, H. 인플루엔자가 혈청형 a, b, c, d, e 및 f 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 발효 수확물이 S. 티피(S. typhi)를 포함하는 것인 방법.
제28항에 있어서, S. 티피가 Vi-다당류를 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 발효 수확물이 N. 메닝기티스(N. meningitis)를 포함하는 것인 방법.
제30항에 있어서, N. 메닝기티스가 혈청형 A, B, C, X, Y 및 W-135 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
제1항의 방법에 의해 정제된 다당류.
제32항의 정제된 다당류를 포함하거나 이로부터 유래된 면역학적 조성물.
제33항에 있어서, 면역증강제(adjuvant)를 추가로 포함하는 면역학적 조성물.
제33항에 있어서, 면역증강제를 포함하지 않는 면역학적 조성물.
제33항의 면역학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 인간에서 감염을 치료하는 방법.
제36항에 있어서, 감염이 S. 뉴모니애, B군 스트렙토코커스, H. 인플루엔자, S. 티피뮤리움 및/또는 N. 메닝기티스를 포함하는 방법.
하기의 단계를 포함하는, 다당류를 정제하는 방법:
S. 뉴모니애, B군 스트렙토코커스, H. 인플루엔자, S. 티피뮤리움 및/또는 N. 메닝기티스 박테리아의 발효 수확물을 제공하는 단계;
발효 수확물을 약 pH3.5-5.0 에서 데옥시콜레이트를 이용하여 청정화(clarifying)하는 단계;
청정화된 다당류를 제 제1 정용여과(diafiltration)에 의해 농축시키는 단계;
제1 정용여과된 다당류를 효소로 처리하여 불순물을 제거하는 단계;
다당류가 상청액에 남도록 효소를 아세트산을 이용하여 침전시키는 단계;
상청액의 다당류를 제2 정용여과에 의해 농축시키는 단계;
제2 정용여과된 다당류를 데옥시콜레이트/EDTA/Ca-염 완충액을 이용한 접선방향 유동 여과에 의해 다중모드 크로마토그래피 수지 및/또는 내독소 제거 수지에 통과시키는 단계; 및
정제된 다당류를 수집하는 단계.