CN117512031A - 一种肺炎球菌荚膜多糖的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药领域,涉及一种细菌荚膜多糖的纯化方法,具体来说,特别涉及肺炎球菌荚膜多糖的纯化方法。本发明公开了一种纯化肺炎球菌荚膜多糖的工艺。步骤包括:肺炎球菌经无动物源成分的培养基发酵培养、溶解灭活、澄清、超滤浓缩等步骤得到肺炎球菌多糖粗提溶液,通过组合酸化和层析工艺,去除不同血清型的肺炎球菌荚膜多糖纯化过程中的杂质,得到符合要求的肺炎球菌荚膜多糖。本发明在不使用有毒有害物质苯酚、易燃易爆物质乙醇、导致工艺繁琐的物质CTAB的情况下和外源酶(蛋白酶、核酸酶)等物料的添加的条件下,有效去除杂质并获得符合药典标准要求的细菌荚膜多糖产品。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域,涉及一种细菌荚膜多糖的纯化方法,具体来说,特别涉及肺炎球菌荚膜多糖的纯化方法。
背景技术
肺炎球菌是世界范围内引起死亡的重要因素之一,且是肺炎、脑膜炎、中耳炎、菌血症等侵袭性和非侵袭性感染的重要病原体。肺炎链球菌根据荚膜多糖的不同,可分为90种以上的血清型。包裹在肺炎球菌表面的一层荚膜多糖,能够诱导机体产生特异性抗体。荚膜多糖是一种重要的抗原,不同血清型的肺炎球菌的荚膜多糖具有不同的成分和结构。
获得荚膜多糖的首要步骤,是获得数量巨大的肺炎球菌。在过去的生产工艺中,培养肺炎球菌的培养基中含有动物源性成分,而当前生物制品行业发展的趋势是基于产品高安全性要求的考虑,需要尽可能避免含有动物源性成分原材料的使用。
在使用生物反应器大规模发酵培养肺炎球菌的过程中,会产生大量的代谢产物。为了满足最终疫苗产品的安全、有效和质量可控的要求,发酵液需要通过多个纯化步骤的处理,在获得高纯度的肺炎球菌荚膜多糖抗原的同时,将蛋白、核酸和内毒素等对后续接种疫苗可能引起副反应的杂质去除。
细菌荚膜多糖纯化的工艺经过了多年的发展,有许多专利和非专利文献描述了细菌荚膜多糖的生产和纯化方法,这些已报道的荚膜多糖纯化方式多种多样,且相同纯化方法也有处理顺序的不同。这些方法包括冷苯萃取法、乙醇分级沉淀法、色谱法和发酵液酸化法等,涉及到的关键处理步骤包括:细菌裂解后离心或微滤将固体杂质去除;通过调节pH或者使用蛋白酶、核酸酶等将杂蛋白和核酸去除;使用活性碳进一步去除杂质;通过乙醇或CTAB沉淀荚膜多糖,再用层析法或苯酚抽提法获得精制荚膜多糖等。
使用以上所述细菌荚膜多糖的纯化方法的任何一种时,都会存在如下一种或几种的技术问题:
1)收获细菌并对其进行初步澄清处理时普遍采用传统杯式离心机,每次只能离心小量料液,离心后弃去上清收获沉淀。传统杯式离心机存在人员操作量大、开口次数多、产品不均一等劣势。因此,需要一种简单易行的操作方案收获并处理细菌发酵液,从而节省物料,降低成本、降低污染风险,从而保证制品均一。
2)在去除蛋白质等杂质的过程中会使用到苯酚,但苯酚具有毒性和腐蚀性,除了会危害工作人员健康,同时也会对环境造成严重的危害。
3)使用乙醇纯化细菌荚膜多糖时,需要使用大量的乙醇。作为一种易燃易爆试剂,乙醇的大量使用将导致生产成本急剧上升,具体表现为基于安全考虑,厂房和设施等需要做专门的防火和防爆设计,对操作人员需要进行更高要求和更多频次的培训、监督和管理。
4)虽然两次层析法工艺已用于肺炎球菌荚膜多糖的纯化,但也带来了操作繁琐、操作时间长和因填料大量使用而导致生产成本高的缺点。
5)虽然使用CTAB做到了无乙醇条件下对肺炎球菌荚膜多糖进行了成功纯化,但具有工艺繁多且复杂,目的产物收获率低的缺点。
6)发酵液酸化法,即降低细菌荚膜多糖的发酵液的pH值,也被用于了肺炎球菌荚膜多糖的纯化。但是仅用此方法制备出的荚膜多糖仅是粗糖,很难符合药典所要求的质量标准。
7)在公布的无乙醇无苯酚纯化工艺中(具体见任克明等,“5型肺炎球菌荚膜多糖无乙醇无苯酚纯化工艺的建立”,《微生物学免疫学进展》2020年2月第48卷第1期),虽然采用了酸沉法去除蛋白,但在其纯化过程中加入了2次脱氧胆酸钠,增加了工艺成本,且在工艺过程中进行了3次超滤浓缩,延长了工艺流程。
8)中国专利申请CN114106209A中,虽然采用了柱层析进行荚膜多糖纯化,但在层析前发酵液处理中引入了CTAB、NaI等工艺相关杂质,且在其工艺过程中多次离心与超滤延长了工艺操作时间。
基于现有技术的以上诸多不足,目前急需一种更加安全(无人员毒害)、环保(无环境污染)、高效(工艺简单)、经济的肺炎球菌荚膜多糖的获得方法。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足,提供一种纯化肺炎球菌荚膜多糖的改进方法,该方法的主要特征为:步骤简单、操作简便、目的产物回收率高、生产成本低和产品均一性好。
本发明的第一个关键技术是组合使用发酵液酸化法和一步层析法对肺炎球菌荚膜多糖进行纯化,避免了有毒有害试剂苯酚、易燃易爆试剂乙醇和导致工艺繁琐的试剂CTAB的使用。
本发明的第二个关键技术是使用连续流碟片式离心机替代传统杯式离心机对细菌发酵液进行处理,减少了人员的繁琐操作,降低出错率,缩短操作时间,提高了生产效率。
本发明的第三个关键技术是使用非动物源的植物蛋白和酵母提取物作为重要营养成分配制成培养基,对肺炎球菌进行大规模发酵培养。
本发明中,解决技术问题的技术方案如下:
一种肺炎球菌荚膜多糖的纯化方法,包括如下步骤:
1)在装有不含动物源性成分的培养基的发酵罐中培养肺炎球菌;
其中,不含动物源性成分的培养基为现有常规的培养基,可采用植物蛋白胨、酵母提取物与少量碳源、无机盐与氨基酸组合配制而成。其具体配方可以参考申请号“2017112354392”,名称为“肺炎链球菌的液体培养基”的中国专利申请中的实施例1;
2)将发酵培养获得的肺炎球菌发酵液加入终浓度0.05-0.5%的脱氧胆酸钠(DOC)于4-30℃灭活0.25-24h,得到细菌溶解液,其中含有多糖、细胞碎片、蛋白质和核酸等。优选地,将培养获得的肺炎球菌发酵液加入终浓度0.2%的脱氧胆酸钠(DOC)于25℃溶解15min;
3)使用连续流碟片式离心机以不低于10000G相对离心力离心步骤2)裂解后的细菌发酵液,再微滤去除沉淀物后得到发酵澄清液;
4)对步骤3)获得的发酵澄清液进行超滤浓缩并换液,获得去除大部分可溶性蛋白质、核酸和大颗粒杂质的荚膜多糖溶液;
5)在步骤4)获得的荚膜多糖溶液加酸调节pH值,静置0.5-4h后,在20℃下以不低于10000G相对离心力离心1h,弃去存在于沉淀中的蛋白质和核酸等杂质,收集含有荚膜多糖成分的上清液;
6)配制平衡缓冲液与梯度洗脱液,使用平衡缓冲液平衡层析柱至基线稳定;将步骤5)中获得的上清液进行色谱层析,检测206nm紫外吸收峰,收集流穿峰,收获后使用梯度洗脱液洗脱,收获洗脱峰,合并后获得纯化的荚膜多糖溶液;
7)将步骤6)获得的荚膜多糖溶液进行超滤浓缩和洗滤,并进行无菌过滤、保存。
进一步地,所述步骤1)中发酵时pH控制7.4±0.2,控制温度在35-37℃培养。
进一步地,所述步骤3)中微滤所用微滤膜的膜孔径为0.22,0.45,0.65,1.0μm中的任意一种。
进一步地,所述步骤5)中所加的酸是磷酸、乙酸、柠檬酸、盐酸、硝酸或硫酸中的一种或几种。
进一步地,所述步骤5)中pH值的范围是3.0-6.5。
进一步地,所述步骤6)中梯度洗脱设置梯度洗脱液B泵流速所占百分比为100%,上样流速3ml/min,检测206nm紫外吸收峰,收集洗脱峰。
进一步地,所述步骤6)中所使用的层析填料为强阴离子交换填料、弱阴离子交换填料及复合模式层析填料中的一种。
进一步地,所述步骤4)与步骤7)中所使用的超滤膜是分子量为10kD至500kD范围内的任意一种。
进一步地,所述步骤4)和7)中,洗滤所用溶液为纯水、缓冲液或者盐溶液或它们的混合液。
本发明的肺炎球菌荚膜多糖的纯化方法,可用于不同血清型的肺炎球菌,此处只是举例,而不限于这些血清型,包括:
1,2,3,4,5,6A,6B,7F,8,9N,9V,10A,11A,12F,14,15B,17F,18C,19A,19F,20,22F,23F和33F。
本发明的优点在于:
1)使用无动物源性成分的培养基对肺炎球菌进行发酵后,再通过碟片式离心机处理发酵液、组合使用酸化发酵液和层析方法等纯化工艺,在不使用有毒有害物质苯酚、易燃易爆物质乙醇、导致工艺繁琐的物质CTAB的情况下和外源酶(蛋白酶、核酸酶)等物料的添加的条件下,有效去除杂质并获得符合药典标准要求的细菌荚膜多糖产品。本发明具有工艺简单、操作简便、安全环保、杂质去除率高、目标产物回收率高、产品质量均一性好和生产成本低等优点。
2)采用了连续流碟片式离心机进行发酵液与酸沉后的超滤浓缩液的离心处理,与传统杯式离心机相比无需复杂的分装操作,按100L料液为例,工艺时间可由原来的10-15h缩减为2h之内,大大提升了生产效率。
3)从具体实施方式中的表2可以看出,本发明与现有的乙醇分级沉淀提纯法相比,多糖回收率明显提升,且在蛋白和核酸去除率上也有较大提升,能够稳定获得符合标准的荚膜多糖产品。
附图说明
图1为实施例1中1型肺炎球菌多糖层析图谱。
图2为实施例2中3型肺炎球菌多糖层析图谱。
图3为实施例3中7F型肺炎球菌多糖层析图谱。
图4为实施例4中8型肺炎球菌多糖层析图谱。
图5为实施例5中14型肺炎球菌多糖层析图谱。
图6为实施例6中5型肺炎球菌多糖层析图谱
图7为本发明的肺炎球菌荚膜多糖的纯化方法的流程图。
具体实施方式
下面结合具体实施例子,进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
本发明实施例1-6所用的不含动物源成分的培养基,其具体配方可以参考申请号“2017112354392”,名称为“肺炎链球菌的液体培养基”的中国专利申请中的实施例1。
本发明实施例1-6的各种肺炎球菌购自中国医学细菌保藏管理中心。
本发明实施例1-6的平衡缓冲液与梯度洗脱液,配方如下表:
其中磷酸氢二钠与磷酸二氢钠购自国药集团化学试剂有限公司,氯化钠购自河北华晨药业有限公司。
本发明实施例1-6中,梯度洗脱方法如下:设置梯度洗脱液B泵流速所占百分比为100%,上样流速3ml/min,检测206nm紫外吸收峰,收集洗脱峰。
实施例1
本实施例中,肺炎荚膜多糖的纯化方法,方法流程如图7所示。
包括以下步骤:
使用不含动物源成分的培养基,培养血清型1型肺炎球菌,发酵时pH控制7.4±0.2,控制温度在35-37℃培养。将培养获得的肺炎球菌发酵液加入终浓度0.2%的脱氧胆酸钠(DOC)于25℃溶解15min。之后使用碟片式离心机以不低于10000G相对离心力离心处理细菌溶解液。去除菌体后使用0.65um滤膜进行微滤、100KD膜包超滤浓缩后获得发酵浓缩液。将酸加入发酵浓缩液调节pH值至4.0,静置0.5h后,在20℃下以不低于10000G相对离心力离心1h,弃去存在于沉淀中的蛋白质和核酸等杂质,收集含有荚膜多糖成分的上清液。配制pH7.5的PB为平衡缓冲液,平衡层析柱至基线稳定,将收集的上清液进行纯化,上样体积为0.5CV,监测206nm紫外吸收峰,收集流穿峰,收获后使用pH7.5的磷酸盐缓冲溶液为梯度洗脱液洗脱,设置梯度洗脱液所在B泵流速所占百分比为100%,调节流速至3ml/min,检测206nm紫外吸收峰,收集洗脱峰,合并后获得纯化的荚膜多糖溶液。其中,层析使用的填料为强阴离子交换填料(苏州博进生物技术有限公司生产,型号为GPQHL-30)。将获得的荚膜多糖溶液使用100KD膜包进行超滤浓缩和洗滤,并进行无菌过滤、保存。
图1为实施例1中1型肺炎球菌多糖层析图谱。
实施例2
本实施例中,肺炎荚膜多糖的纯化方法,包括以下步骤:
使用不含动物源成分的培养基,培养血清型3型肺炎球菌,发酵时pH控制7.4±0.2,控制温度在35-37℃培养。将培养获得的肺炎球菌发酵液加入终浓度0.2%的脱氧胆酸钠(DOC)于25℃溶解15min。之后使用碟片式离心机以不低于10000G相对离心力离心处理细菌溶解液。去除菌体后使用0.65um滤膜进行微滤、100KD膜包超滤浓缩后获得发酵浓缩液。将酸加入发酵浓缩液调节pH值至4.0,静置0.5h后,在20℃下以不低于10000G相对离心力离心1h,弃去存在于沉淀中的蛋白质和核酸等杂质,收集含有荚膜多糖成分的上清液。配制pH7.5的PB为平衡缓冲液,平衡层析柱至基线稳定,将收集的上清液进行纯化,上样体积为0.6CV,监测206nm紫外吸收峰,收集流穿峰,收获后使用pH7.5的磷酸盐缓冲溶液为梯度洗脱液洗脱,设置梯度洗脱液所在B泵流速所占百分比为100%,调节流速至3ml/min,检测206nm紫外吸收峰,收集洗脱峰,合并后获得纯化的荚膜多糖溶液。其中,层析使用的填料为强阴离子交换填料(苏州博进生物技术有限公司生产,型号为GPQHL-30)。将获得的荚膜多糖溶液使用100KD膜包进行超滤浓缩和洗滤,并进行无菌过滤、保存。
图2为实施例2中3型肺炎球菌多糖层析图谱。
实施例3
本实施例中,肺炎荚膜多糖的纯化方法,包括以下步骤:
使用不含动物源成分的培养基,培养血清型7F型肺炎球菌,发酵时pH控制7.4±0.2,控制温度在35-37℃培养。将培养获得的肺炎球菌发酵液加入终浓度0.2%的脱氧胆酸钠(DOC)于25℃溶解15min。之后使用碟片式离心机以不低于10000G相对离心力离心处理细菌溶解液。去除菌体后使用0.65um滤膜进行微滤、100KD膜包超滤浓缩后获得发酵浓缩液。将酸加入发酵浓缩液调节pH值至4.0,静置0.5h后,在20℃下以不低于10000G相对离心力离心1h,弃去存在于沉淀中的蛋白质和核酸等杂质,收集含有荚膜多糖成分的上清液。配制pH7.5的PB为平衡缓冲液,平衡层析柱至基线稳定,将收集的上清液进行纯化,上样体积为0.5CV,监测206nm紫外吸收峰,收集流穿峰,收获后使用pH7.5的磷酸盐缓冲溶液为梯度洗脱液洗脱,设置梯度洗脱液所在B泵流速所占百分比为100%,调节流速至3ml/min,检测206nm紫外吸收峰,收集洗脱峰,合并后获得纯化的荚膜多糖溶液。其中,层析使用的填料为强阴离子交换填料(苏州博进生物技术有限公司生产,型号为GPQHL-30)。将获得的荚膜多糖溶液使用100KD膜包进行超滤浓缩和洗滤,并进行无菌过滤、保存。
图3为实施例3中7F型肺炎球菌多糖层析图谱。
实施例4
本实施例中,肺炎荚膜多糖的纯化方法,包括以下步骤:
使用不含动物源成分的培养基,培养血清型8型肺炎球菌,发酵时pH控制7.4±0.2,控制温度在35-37℃培养。将培养获得的肺炎球菌发酵液加入终浓度0.2%的脱氧胆酸钠(DOC)于25℃溶解15min。之后使用碟片式离心机以不低于10000G相对离心力离心处理细菌溶解液。去除菌体后使用0.65um滤膜进行微滤、100KD膜包超滤浓缩后获得发酵浓缩液。将酸加入发酵浓缩液调节pH值至4.0,静置0.5h后,在20℃下以不低于10000G相对离心力离心1h,弃去存在于沉淀中的蛋白质和核酸等杂质,收集含有荚膜多糖成分的上清液。配制pH7.5的PB为平衡缓冲液,平衡层析柱至基线稳定,将收集的上清液进行纯化,上样体积为0.5CV,监测206nm紫外吸收峰,收集流穿峰,收获后使用pH7.5的磷酸盐缓冲溶液为梯度洗脱液洗脱,设置梯度洗脱液所在B泵流速所占百分比为100%,调节流速至3ml/min,检测206nm紫外吸收峰,收集洗脱峰,合并后获得纯化的荚膜多糖溶液。其中,层析使用的填料为强阴离子交换填料(苏州博进生物技术有限公司生产,型号为GPQHL-30)。将获得的荚膜多糖溶液使用100KD膜包进行超滤浓缩和洗滤,并进行无菌过滤、保存。
图4为实施例4中8型肺炎球菌多糖层析图谱。
实施例5
本实施例中,肺炎荚膜多糖的纯化方法,包括以下步骤:
使用不含动物源成分的培养基,培养血清型14型肺炎球菌,发酵时pH控制7.4±0.2,控制温度在35-37℃培养。将培养获得的肺炎球菌发酵液加入终浓度0.2%的脱氧胆酸钠(DOC)于25℃溶解15min。之后使用碟片式离心机以不低于10000G相对离心力离心处理细菌溶解液。去除菌体后使用0.65um滤膜进行微滤、100KD膜包超滤浓缩后获得发酵浓缩液。将酸加入发酵浓缩液调节pH值至4.0,静置0.5h后,在20℃下以不低于10000G相对离心力离心1h,弃去存在于沉淀中的蛋白质和核酸等杂质,收集含有荚膜多糖成分的上清液。配制pH7.5的PB为平衡缓冲液,平衡层析柱至基线稳定,将收集的上清液进行纯化,上样体积为0.5CV,监测206nm紫外吸收峰,收集流穿峰,收获后使用pH7.5的磷酸盐缓冲溶液为梯度洗脱液洗脱,设置梯度洗脱液所在B泵流速所占百分比为100%,调节流速至3ml/min,检测206nm紫外吸收峰,收集洗脱峰,合并后获得纯化的荚膜多糖溶液。其中,层析使用的填料为强阴离子交换填料(苏州博进生物技术有限公司生产,型号为GPQHL-30)。将获得的荚膜多糖溶液使用100KD膜包进行超滤浓缩和洗滤,并进行无菌过滤、保存。
图5为实施例5中14型肺炎球菌多糖层析图谱。
实施例6
本实施例中,肺炎荚膜多糖的纯化方法,包括以下步骤:
使用不含动物源成分的培养基,培养血清型5型肺炎球菌,发酵时pH控制7.4±0.2,控制温度在35-37℃培养。将培养获得的肺炎球菌发酵液加入终浓度0.2%的脱氧胆酸钠(DOC)于25℃溶解15min。之后使用碟片式离心机以不低于10000G相对离心力离心处理细菌溶解液。去除菌体后使用0.65um滤膜进行微滤、100KD膜包超滤浓缩后获得发酵浓缩液。将酸加入发酵浓缩液调节pH值至4.0,静置0.5h后,在20℃下以不低于10000G相对离心力离心1h,弃去存在于沉淀中的蛋白质和核酸等杂质,收集含有荚膜多糖成分的上清液。配制pH7.5的PB为平衡缓冲液,平衡层析柱至基线稳定,将收集的上清液进行纯化,上样体积为0.5CV,监测206nm紫外吸收峰,收集流穿峰,收获后使用pH7.5的磷酸盐缓冲溶液为梯度洗脱液洗脱,设置梯度洗脱液所在B泵流速所占百分比为100%,调节流速至3ml/min,检测206nm紫外吸收峰,收集洗脱峰,合并后获得纯化的荚膜多糖溶液。其中,层析使用的填料为强阴离子交换填料(苏州博进生物技术有限公司生产,型号为GPQHL-30)。将获得的荚膜多糖溶液使用100KD膜包进行超滤浓缩和洗滤,并进行无菌过滤、保存。
图6为实施例6中5型肺炎球菌多糖层析图谱。
对比例1
采用现有的乙醇分级沉淀法(具体参考柴雁菁,肺炎链球菌5型发酵工艺的优化,《现代生物医学进展》,2012年第9期1660-1664),对与实施例1同样来源的血清型1型肺炎球菌进行发酵,并获得荚膜多糖。
对比例2
采用现有的乙醇分级沉淀法(具体参考柴雁菁,肺炎链球菌5型发酵工艺的优化,《现代生物医学进展》,2012年第9期1660-1664),对与实施例5同样来源的血清型14型肺炎球菌进行发酵,并获得荚膜多糖。
对比例3
采用现有的乙醇分级沉淀法(具体参考柴雁菁,肺炎链球菌5型发酵工艺的优化,《现代生物医学进展》,2012年第9期1660-1664),对与实施例6同样来源的血清型5型肺炎球菌进行发酵,并获得荚膜多糖。
实施例7
(1)检测实施例1-6产物的多糖收率、蛋白质和核酸去除率
中间过程样品依照《中国药典》2020版相关要求检测氨基己糖、糖醛酸、蛋白质和核酸含量。通过实验结果说明本发明的有益效果。
从表1可以看出本发明实施例1-6的结果:包括多糖收率、蛋白质和核酸去除率以及各项指标合格情况。
表1肺炎球菌荚膜多糖纯化结果
从表1可以看出:按本发明步骤操作,能够将肺炎荚膜多糖保持在一个高回收率的同时,去除掉大量核酸和蛋白后获得符合标准的荚膜多糖产品。
(2)对照试验
依照《中国药典》2020版相关要求,将对比例1-3获得的荚膜多糖与实施例1、5、6纯化获得的荚膜多糖分别进行对照,结果见表2。
从表2可以看出本发明实施例1、5、6与乙醇分级沉淀法的对比结果:包括多糖收率、蛋白质和核酸去除率以及各项指标合格情况。
从表2可以看出:使用现有的乙醇分级沉淀法获得的荚膜多糖中,核酸和蛋白去除率较低且有时会超出标准,还需进一步纯化。本发明的纯化方法与乙醇分级沉淀提纯法相比,多糖回收率明显提升,且在蛋白和核酸去除率上也有较大提升,能够稳定获得符合标准的荚膜多糖产品。
以上仅为本发明的实施例,并非因此限制本发明的专利范围,凡是利用本发明说明书内容所作的等效变换,或直接或间接运用在其它相关的技术领域,均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (10)
1.一种肺炎球菌荚膜多糖的纯化方法,其特征在于,包括如下步骤:
1)在装有不含动物源性成分的培养基的发酵罐中培养肺炎球菌;
2)将发酵培养获得的肺炎球菌发酵液加入终浓度0.05-0.5%的脱氧胆酸钠于4-30℃灭活0.25-24h,得到细菌溶解液;
3)使用连续流碟片式离心机以不低于10000G相对离心力离心步骤2)裂解后的细菌发酵液,再微滤去除沉淀物后得到发酵澄清液;
4)对步骤3)获得的发酵澄清液进行超滤浓缩并换液,获得去除大部分可溶性蛋白质、核酸和大颗粒杂质的荚膜多糖溶液;
5)在步骤4)获得的荚膜多糖溶液加酸调节pH值,静置0.5-4h后,在20℃下以不低于10000G相对离心力离心1h,弃去存在在于沉淀中的蛋白质和核酸等杂质,收集含有荚膜多糖成分的上清液;
6)配制平衡缓冲液与梯度洗脱液,使用平衡缓冲液平衡层析柱至基线稳定;将步骤5)中获得的上清液进行色谱层析,检测206nm紫外吸收峰,收集流穿峰,收获后使用梯度洗脱液洗脱,收获洗脱峰,合并后获得纯化的荚膜多糖溶液;
7)将步骤6)获得的荚膜多糖溶液进行超滤浓缩和洗滤,并进行无菌过滤、保存。
2.根据权利要求1所述的肺炎球菌荚膜多糖的纯化方法,其特征在于,所述步骤1)中发酵时pH控制7.4±0.2,控制温度在35-37℃培养。
3.根据权利要求1所述的肺炎球菌荚膜多糖的纯化方法,其特征在于,所述步骤3)中微滤所用微滤膜的膜孔径为0.22,0.45,0.65,1.0μm中的任意一种。
4.根据权利要求1所述的肺炎球菌荚膜多糖的纯化方法,其特征在于,所述步骤5)中所加的酸是磷酸、乙酸、柠檬酸、盐酸、硝酸或硫酸中的一种或几种。
5.根据权利要求1所述的肺炎球菌荚膜多糖的纯化方法,其特征在于,所述步骤5)中pH值的范围是3.0-6.5。
6.根据权利要求1所述的肺炎球菌荚膜多糖的纯化方法,其特征在于,所述步骤6)中梯度洗脱设置梯度洗脱液B泵流速所占百分比为100%,上样流速3ml/min,检测206nm紫外吸收峰,收集洗脱峰。
7.根据权利要求1所述的肺炎球菌荚膜多糖的纯化方法,其特征在于,所述步骤6)中所使用的层析填料为强阴离子交换填料、弱阴离子交换填料及复合模式层析填料中的一种。
8.根据权利要求1所述的肺炎球菌荚膜多糖的纯化方法,其特征在于,所述步骤4)与步骤7)中所使用的超滤膜是分子量为10kD至500kD范围内的任意一种。
9.根据权利要求1所述的肺炎球菌荚膜多糖的纯化方法,其特征在于,所述步骤4)和7)中,洗滤所用溶液为纯水、缓冲液或者盐溶液或它们的混合液。
10.如权利要求1-9任意一项所述的肺炎球菌荚膜多糖的纯化方法在纯化1,2,3,4,5,6A,6B,7F,8,9N,9V,10A,11A,12F,14,15B,17F,18C,19A,19F,20,22F,23F和33F血清型的肺炎球菌荚膜多糖的应用。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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