CN114645024B

CN114645024B - 降低狂犬病病毒产品中细胞蛋白及dna残留的方法

Info

Publication number: CN114645024B
Application number: CN202210367709.XA
Authority: CN
Inventors: 喻志远; 朱绍荣; 刘海东
Original assignee: SHANGHAI RONGSHENG BIOLOGICAL PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: SHANGHAI RONGSHENG BIOLOGICAL PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2022-04-08
Filing date: 2022-04-08
Publication date: 2023-06-06
Anticipated expiration: 2042-04-08
Also published as: CN114645024A

Abstract

本发明提供了一种降低降低狂犬病病毒产品中细胞蛋白及DNA残留的方法。所述方法包括在生物反应器培养病毒阶段持续将罐内病毒上清液使用连续流离心机循环离心后再灌流进入生物反应器培养体系，同时收获罐内上清液通过适当的过滤装置进行过滤。采用本发明所述方法处理后，病毒收获液中病毒生产细胞的蛋白质残留、DNA残留极为显著地降低，再经超滤浓缩、柱层析纯化病毒液，制备冻干疫苗检测到Vero细胞蛋白质残留量远低于现有技术标准。同时，本发明的方法有效降低了下游纯化成本，以及有效确保了病毒制品中无其它物质如核酸酶的残留，适于规模化。

Description

降低狂犬病病毒产品中细胞蛋白及DNA残留的方法

技术领域

本发明属于病毒学和疫苗领域，更具体地，本发明涉及降低狂犬病病毒产品中细胞蛋白及DNA残留的方法。

背景技术

狂犬病是一种由狂犬病病毒引起的人畜共患疾病，在全球分布广泛，每年死于狂犬病的人数超过5.5万人，其中约95％发生在亚洲和非洲。大多数死亡事件均是被狂犬病毒感染的狗咬伤所致，受害者中30～60％为15岁以下儿童。狂犬病的预防和治疗通常采用接种狂犬病疫苗。

在狂犬疫苗生产中，经生物反应器固定床贴壁培养细胞后接种病毒，病毒感染细胞后的上清液中含有目标物狂犬病毒。杂质主要有宿主细胞碎片、蛋白质以及Vero细胞蛋白质、Vero细胞DNA，另外，溶液主要是培养基成分，这些杂质都是需要去除的。狂犬疫苗安全性的关键是杂质Vero细胞蛋白质、Vero细胞DNA的含量。

现有的技术对去除疫苗中杂质Vero细胞蛋白质的工艺路线主要在分离纯化阶段进行，如采用凝胶过滤色谱法、等密度梯度离心法等。其中使用等密度梯度离心法对于目标物质抗原回收率较小，国内使用此方法的较少，凝胶过滤色谱法是目前最有效的纯化方法。但是仅通过此方法纯化，Vero细胞蛋白质含量虽然可达到中国药典要求，但Vero细胞蛋白质含量仍然较高，一般在4-6μg/剂。

本发明人此前的工艺中，采用将病毒上清液收获后经连续流离心再使用澄清过滤，再经超滤浓缩、凝胶过滤色谱法纯化或等密度梯度离心法纯化后制备原液。虽然其也经过连续流离心，结果却依然不能有效去除溶解到上清液中的杂质；而若是通过增大离心力来促进杂质的去除，则又导致病毒抗原损失过大)。同时，这一工艺在澄清过滤阶段滤器易堵塞，导致频繁更换滤器，无菌操作风险较大。滤器的堵塞导致抗原被部分截留，抗原回收率较低。此工艺方法生产的疫苗Vero细胞蛋白质一般在4-6ug/剂，Vero细胞DNA含量一般在3-5ng/剂，且批次间稳定性较差，从而较难连续生产出可满足中国药典要求的疫苗。

细胞来源的DNA片段属于线性生物活性大分子，因DNA等电点约4.0在溶液中带强负电荷且分子量与抗原相当，导致部分会和目标产物抗原结合。而Vero细胞蛋白质与狂犬病毒表面糖蛋白属于同源蛋白质，同样较容易发生结合从而导致较难去除。

对杂质Vero细胞DNA的去除工艺路线最有效的是使用非限制性核酸内切酶将DNA片段打断成小分子DNA片段后再通过凝胶过滤色谱法将DNA去除。但使用核酸酶处理后会导致产品中有核酸酶残留，需对核酸酶残留进行检测，对使用核酸酶的安全风险也尚需全面评估。

综上，本领域还需要进一步优化降低狂犬病病毒产品中病毒生产细胞蛋白及DNA残留的方法，以期简化工艺、提高产品质量、降低安全风险。

发明内容

本发明的目的在于提供一种降低狂犬病病毒产品中细胞蛋白及DNA残留的方法。

在本发明的第一方面，提供一种在制备过程中降低狂犬病病毒产品中细胞蛋白及DNA残留的方法，所述方法包括：

(a)将狂犬病病毒接种于Vero细胞，进行灌流式培养；灌流式培养的同时，将培养上清进行连续流离心；

(b)培养结束后，将经连续流离心的病毒液以孔径0.6±0.15μm的过滤装置过滤，去除直径超过所述孔径的物质，收获病毒液；

(c)以(b)获得的病毒液制备病毒制品，所述病毒制品具有低的细胞蛋白及DNA残留；

其中，步骤(a)～(c)中，不添加蛋白酶和/或核酸酶。

在一种或多种实施方式中，(a)中，所述连续流离心的离心流速为500±100ml/min；较佳地为500±60ml/min；更佳地为500±40ml/min。

在一种或多种实施方式中，所述连续流离心的离心流速为400～600ml/min，如420、440、460、480、520、540、560、580ml/min。

在一种或多种实施方式中，所述连续流离心的离心力为8000～12000g，如8500、9000、9500、10000、10500、11000、11500g。

在一种或多种实施方式中，(a)中，所述灌流式培养时，按2L/H～10L/H进行灌流，以生物反应器内葡萄糖浓度不低于0.4g/L为准。

在一种或多种实施方式中，(a)中，所述连续流离心时，离心力为10000±200g(即8000～12000g，如8500、9000、9500、10000、10500、11000、11500g)(至约2～18天结束培养，如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17天)。

在一种或多种实施方式中，(a)中，所述连续流离心时，在起始至第3～5天(如4天)离心力为10000±200g；之后离心力为15000±200g(如13000、13500、14000、14500、15500、16000、16500或17000g)(至约12～18天结束培养，如13、14、15、16或17天)。

在一种或多种实施方式中，(a)中，所述连续流离心时，在起始至第3～5天(如5天)离心力10000±200g；之后至第8～10天(如9天)离心力15000±200g；之后至结束培养(至约12～18天结束培养，如13、14、15、16或17天)离心力20000±200g(如18000、18500、19000、19500、20500、21000、21500或22000g)。

在一种或多种实施方式中，所述10000±200g的离心力，较佳地为10000±150g；更佳地为10000±100g；更佳地为10000±50g。

在一种或多种实施方式中，所述15000±200g的离心力，较佳地为15000±150g；更佳地为15000±100g；更佳地为15000±50g。

在一种或多种实施方式中，所述20000±200g的离心力，较佳地为20000±150g；更佳地为20000±100g；更佳地为20000±50g。

在一种或多种实施方式中，(b)中，培养结束后，将经连续流离心的病毒液以孔径0.6±0.1μm，较佳地孔径0.6±0.05μm的过滤装置过滤。

在一种或多种实施方式中，(b)中收获病毒液后，还包括浓缩的步骤；较佳地，所述浓缩为超滤浓缩；较佳地，将病毒液浓缩2～200倍。

在一种或多种实施方式中，将病毒液浓缩5～150倍，如8、10、12、15、20、30、40、50、60、80、90、100或120倍等。

在一种或多种实施方式中，(b)中收获病毒液以及浓缩后，还包括病毒灭活的步骤。

在一种或多种实施方式中，以β-丙内酯灭活。

在一种或多种实施方式中，β-丙内酯后续可被水解。

在一种或多种实施方式中，(b)中收获病毒液以及浓缩后，还包括纯化的步骤。

在一种或多种实施方式中，进行凝胶过滤纯化。

在一种或多种实施方式中，以琼脂糖凝胶4FF层析柱进行凝胶过滤纯化；较佳地，收集第一峰，加入稳定剂以制备病毒原液；较佳地，所述稳定剂为人血白蛋白；较佳地按1％～2％比例添加。

在一种或多种实施方式中，(c)中，所述病毒制品为疫苗。

在一种或多种实施方式中，所述病毒制品为冻干制品。

在一种或多种实施方式中，所述的疫苗包括成品或半成品。

在一种或多种实施方式中，所述的疫苗包括病毒疫苗或蛋白疫苗。

在一种或多种实施方式中，所述的疫苗包括病毒或来自病毒的蛋白，以及佐剂。

在一种或多种实施方式中，(a)中，所述的狂犬病病毒为PM毒株。

在一种或多种实施方式中，接种病毒前，以无血清培养基培养Vero细胞。

在一种或多种实施方式中，无血清培养基培养Vero细胞时，细胞的接种密度：(1～9)×10E+6个/ml。

在一种或多种实施方式中，以MOI 0.01～0.1接种病毒。

在一种或多种实施方式中，以普通199培养基作为病毒维持培养基。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、本发明的工艺优化前的病毒生产的工艺步骤流程示意图。

图2、本发明的工艺步骤流程示意图。

具体实施方式

如本文所用，除非另外说明，所述的“细胞”或“病毒生产细胞”是指适用于进行狂犬病毒病毒扩增/繁殖的细胞，其被在适当的培养基找中培养，感染狂犬病毒病毒后，可为狂犬病毒病毒提供适当的组装环境。所述的细胞较佳地为Vero细胞。

如本文所用，“传代”通常包括：使狂犬病毒病毒在细胞培养物中复制；例如从培养物上清液收集复制的病毒；和将收集的复制病毒转移到未感染的细胞培养物中。可重复该过程。

如本文所用，所述的“灌流式培养”是把细胞(包括接种病毒的细胞)和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，不断地将部分条件培养基取出，同时又连续不断地灌注新的培养基。

如本文所用，所述的“连续流离心”是将样品液在离心过程中连续导入、离心，沉淀被留在离心仓内，上清液被不断排出的一种离心技术。本发明中，将培养罐内的上清进行所述的“连续流离心”。

如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

如本文所用，所述的“基本上”不排除“完全”，例如“基本上无”Y的组合物可完全无Y。该词语“基本上”可视需要从本发明定义中省去。

本发明人长期致力于优化狂犬病毒病毒的生产工艺。在工艺优化前，采用将病毒上清液收获后经连续流离心再使用过滤装置(尝试过多种孔径，如0.45-0.65μm孔径)澄清过滤，再经超滤浓缩、凝胶过滤色谱法纯化或等密度梯度离心法纯化后制备原液(图1)。本发明人发现，这一方法的缺点一方面是细胞/病毒培养过程中的杂质已经溶解到上清液中，虽然经过连续流离心，依然不能有效去除溶解到上清液中的杂质(离心力过大，病毒抗原损失过大)，澄清过滤阶段滤器还是较易堵塞，导致频繁更换滤器，无菌操作风险较大。另外滤器的堵塞导致抗原被部分截留，抗原回收率较低。上述工艺方法生产的疫苗Vero细胞蛋白质一般可在4-6ug/剂，Vero细胞DNA含量一般可在3-5ng/剂，且批次间稳定性较差，从而较难连续生产出可满足中国药典要求的疫苗。可能是因为DNA片段属于线性生物活性大分子，因DNA等电点约4.0在溶液中带强负电荷且分子量与抗原相当，导致部分会和目标产物抗原结合。而Vero细胞蛋白质与狂犬病毒表面糖蛋白属于同源蛋白质，同样较容易发生结合从而导致较难去除。凝胶过滤色谱法、等密度梯度离心法分离纯化原理是根据相对分子质量大小进行分离的，导致常规的物理分离方法较难去除DNA。故在病毒培养阶段去除此两种Vero细胞杂质的关键在于其释放至上清液的同时使用物理手段将其立即去除，确保上清液收获时液体内Vero细胞蛋白质、Vero细胞DNA含量降至最低。

当杂质Vero细胞DNA残留较多时，对其进行去除的工艺路线最有效的是使用非限制性核酸内切酶将DNA片段打断成小分子DNA片段后再通过凝胶过滤色谱法将DNA去除，以期将杂质DNA残留控制在规定的范围内。但使用核酸酶处理后会导致产品中有核酸酶残留，需对核酸酶残留进行检测，对使用核酸酶的安全风险也需全面评估，整体上提高了病毒制品(如疫苗)的风险性因素。

在以上研究分析的基础上，本发明人经由多角度的研究分析和比较实验分析，揭示了一种很大程度地降低狂犬病病毒产品中细胞蛋白及DNA残留的方法，尤其涉及一种去除人用狂犬病疫苗(Vero细胞)产品中Vero细胞蛋白质、Vero细胞DNA的方法。

本发明的方法包括了两个关键步骤：其一，细胞/病毒培养过程中，对反应器内上清液使用连续流离心机进行离心，优选的离心流速500ml/min左右，优选的离心力10000g左右。再将离心后上清液补入生物反应器，从而实现对细胞/病毒培养；其二，经连续流离心后的上清液再经0.6um左右的滤器在线过滤，进一步去除上清液中Vero细胞蛋白质及Vero细胞DNA残留。所述步骤与本发明的整体方案中的其它步骤相配合，从而极为有效地促进了病毒制品中Vero细胞蛋白质及Vero细胞DNA残留。

连续流离心的原理主要是：将一定流速的料液输送进入离心转子腔内，一定的离心力下，大分子物质被捕获沉淀在离心转子腔收集装置内，同时料液以一定的流速输送出离心转子腔。从而实现连续输送和输出料液的目的。本发明中在发酵罐病毒生产阶段就将料液短时间内多次进行连续流离心，从而有效促进病毒生产阶段的病毒生产效率以及有效配合后续步骤，实现优异效果。

本发明人深入试验分析后发现，Vero细胞蛋白质、Vero细胞DNA来源于疫苗生产基质Vero细胞，狂犬病毒在Vero细胞内组装、复制、释放过程中会导致细胞脱落和凋亡，脱落的细胞长时间悬浮于上清液中无法存活导致凋亡，凋亡后细胞碎片、细胞质、细胞核会释放至上清液中，尽管在本领域的多数发酵工艺中可忽视此类物质、对反应结果影响不大，然而对于本发明的生产对象而言，本发明人发现这些物质造成了极显著的影响、直接与后续工艺中细胞蛋白或细胞DNA的残留密切相关，去除此类物质是关键的。采用连续流对生物反应器培养体系中病毒培养上清液实时进行适当条件的循环离心可实现最大限度地克服这一问题导致的Vero细胞蛋白质、Vero细胞DNA的残留。从而实现在病毒培养阶段将上清液中Vero细胞蛋白质、Vero细胞DNA及时的去除。在发酵后，经在线0.6μm滤器澄清过滤后的检测数据显示，绝大部分病毒培养过程产生的Vero细胞蛋白质、Vero细胞DNA被有效去除。这也有效提高了后续生产步骤的效率，例如有效降低凝胶过滤色谱法层析阶段的纯化(杂质去除)难度。这一方案在提高Vero细胞蛋白质、Vero细胞DNA去除率的同时，还维持了高的抗原含量(抗原基本无损失)。本发明的方法制备的病毒制品，其细胞蛋白和DNA残留远低于中国药典的标准要求。

在此前的工艺中，由于DNA较多的残留，在下游步骤中离不开核酸酶的应用，从而病毒制品中存在核酸酶的残留，需要进一步进行工艺涉及来去除，易于导致安全性风险。而本发明中，由于在整个过程中对于的病毒生产细胞的蛋白和DNA有效控制，所以在下游加工过程中无需使用核酸酶，从而病毒制品中无核酸酶残留，安全环保。

由于前期的细胞蛋白和DNA残留控制较好，下游凝胶柱纯化可以高效进行，从而减少了下游纯化的复杂性，在成本上易于控制。鉴于柱纯化常常是限制规模化生产的瓶颈(例如其溶剂及填料成本高、不易于放大)，在柱纯化方面效率的提高以及成本的降低将大大有利于规模化生产，例如工业级的生产。

因此，本发明克服了现有技术中的缺点，提供了一种有效去除人用狂犬病疫苗(Vero细胞)Vero细胞蛋白质、Vero细胞DNA的工艺方法。包括在生物反应器培养病毒阶段持续将罐内病毒上清液使用连续流离心机循环离心后再灌流进入生物反应器培养体系，同时收获罐内上清液通过0.6μm左右孔径的微滤过滤器进行在线过滤。采用本发明所述方法处理后，病毒收获液中Vero细胞蛋白质残留量至少比处理前降低60％，Vero细胞DNA残留量至少比处理前降低80％，再经超滤浓缩、柱层析纯化病毒液，制备冻干疫苗检测到Vero细胞蛋白质残留量不高于2ng、宿主DNA残留量不高于1ng(qPCR法)，完全符合药典中Vero细胞蛋白质残留量、Vero细胞DNA残留量分别低于6.0ug/剂、3ng/剂的标准。同时，本发明的方法也有效降低了下游纯化成本，以及有效确保了病毒制品中无其它物质如核酸酶的残留。本发明的方法具有良好的工业应用前景。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、以Vero细胞制备人用狂犬病疫苗及Vero细胞蛋白质、DNA的去除方法

1、实验材料和设备

应用篮式生物反应器和片状载体培养技术培养Vero细胞后接种病毒培养，制备病毒液，所用的材料如表1。

表1

名称	材料
		Vero细胞	接种密度：5×10E+6个/ml
毒株	狂犬病病毒PM毒株
		细胞培养基	Gibco无血清培养基(VP SFM AGT)
病毒维持培养基	普通199培养基
		滤芯	0.6μm微孔孔径

2、实验用仪器与设备

病毒液经300KD膜包超滤浓缩后得病毒浓缩液，灭活水解后经分子筛层析后加入稳定剂得原液。所用的设备如表2。

表2

设备名称	型号	商购厂家
			生物反应器	50L	日泰
连续流离心机	contifuge-stratos	赛默飞
			超滤系统	AUFS200	苏州利穗
层析系统	APPS process	苏州利穗
			Sepharose 4FF凝胶层析柱	EAC-Bio	苏州利穗
滤器	0.65-1μm	MILLIPORE

3、检验用仪器与设备

对每一工序阶段中间品取样检测Vero细胞蛋白质含量、Vero细胞DNA含量。所用的设备如表3。

表3

设备名称	型号	商购厂家
			酶标仪	Multiskan FC	赛默飞
qPCR仪	Applied Biosystems^TM	赛默飞

4、操作方法

参照图2的方法进行。具体如下：

(1)细胞接种

将Vero细胞复苏、传代至一定的代次(140代左右)，消化后接种至50L生物反应器贴壁培养(采用无血清培养基)，接种密度5×10E+6个/ml。

(2)细胞培养、病毒培养

Vero细胞培养一定的天数(6～7天)后按相同MOI(0.01～0.1)接种PM毒株至生物反应器中，采用灌流的方式进行病毒培养(普通199培养基)。

(3)罐内病毒上清液循环离心

按2L/H～10L/H进行灌流，以生物反应器内葡萄糖浓度不低于0.4g/L为标准。同时，使用连续流离心机对罐内病毒上清液循环离心，离心力为10000g，离心流速分别为100ml/min(序号1)、250ml/min(序号2)、500ml/min(序号3)进行对比实验。离心去除沉淀。

(4)在线微滤滤器澄清过滤

将离心后病毒液经孔径为0.6μm微滤滤器澄清过滤，截留去除超过0.6μm的颗粒。澄清过滤后病毒液收获至所需容器内，保存。

(5)超滤浓缩、灭活、水解

将病毒收获液使用300KD膜包进行浓缩，浓缩倍数为30-60倍。浓缩液加入β-丙内酯灭活24h后、37℃水解2h。该水解步骤中不再添加任何物质，纯温度条件下β-丙内酯的分解。

(6)凝胶过滤

使用Sepharose 4FF凝胶层析柱进行分离纯化，收集第一峰。加入人血白蛋白，按1％～2％比例添加，即为原液。

(7)冻干

按抗原含量5.5IU/ml进行半成品配制，经冻干后为成品。

分别在每个工序阶段取样检测抗原含量、Vero细胞蛋白质、Vero细胞DNA含量。

另将连续灌流病毒培养上清液直接收获后经离心力10000g、离心流速为500ml/min进行连续流离心再经0.6μm澄清过滤作为对照，分别在每个工序阶段取样检测抗原含量、Vero细胞蛋白质、Vero细胞DNA含量。

实施例2、多种离心流速下的蛋白质和DNA去除情况(超滤前样品)

实验组：按照实施例1的工艺，其中在“(3)罐内病毒上清液循环离心”培养48小时后，经0.6μm微滤膜过滤，此时收获病毒液进行测定(图2，超滤浓缩前)。

对照组：按照实施例1的工艺进行细胞培养、病毒培养，其中不进行“(3)罐内病毒上清液循环离心”，直接收获病毒液后再经连续流离心和0.6μm微滤膜过滤。

生物反应器培养病毒过程中，经离心力10000g，离心流速100ml/min(序号1)、250ml/min(序号2)、500ml/min(序号3)循环离心后经0.6μm微滤膜过滤(表称：实验组)后获取产物，与收获病毒液后再经连续流离心和微滤澄清过滤的病毒液进行对比(表称：对照组)。

实验组、对照组病毒液Vero细胞蛋白质、Vero细胞DNA、抗原含量如表4。

表4

根据表4，离心流速在100ml/min、250ml/min、500ml/min下循环离心后即进行0.6μm微滤膜过滤(实验组)与收获后再离心并0.6μm过滤(对照组)相比，Vero细胞蛋白质、Vero细胞DNA去除率随着离心流速的增加而增大。而经离心流速500ml/min循环离心后即进行0.6μm微滤膜过滤后Vero细胞蛋白质含量降低60％左右、Vero细胞DNA含量降低80％左右。且病毒液经连续流离心及澄清过滤后抗原含量基本无损失。

因此，循环离心后即进行0.6μm微滤膜过滤，可以极为高效地去除Vero细胞蛋白以及DNA，且基本上确保抗原无损失。

实施例3、超滤浓缩后样品的质量分析

实验组：同实施例2的实验组进行操作(离心流速500ml/min对上清液进行离心)，且在收获病毒后还进行超滤浓缩和凝胶过滤。

对照组：同实施例2的对照组进行操作(离心流速500ml/min对上清液进行离心)，且在收获病毒后还进行超滤浓缩和凝胶过滤。

实验组和对照组病毒液经浓缩倍数40倍、300KD膜包超滤浓缩后经Sepharose 4FF凝胶层析柱进行纯化，之后进行测定。

实验组、对照组原液Vero细胞蛋白质、Vero细胞DNA、抗原含量如表5所示。

表5

结果显示，使用离心流速500ml/min对上清液进行离心的实验组Vero细胞蛋白质去除率、Vero细胞DNA去除率最高，与对照组相比分别提高58.6％、79.3％。对照组平均Vero细胞蛋白质含量＞6ug/ml、Vero细胞DNA含量大于5ng/ml，实验组和对照组抗原含量相当。

实施例4、冻干成品的质量分析

实验组：同实施例3的实验组进行操作(离心流速500ml/min对上清液进行离心)，且按抗原含量5.5IU/ml加入辅料后配制半成品，经冻干后制备成冻干成品。

对照组：同实施例2的对照组进行操作(离心流速500ml/min对上清液进行离心)，且按抗原含量5.5IU/ml加入辅料后配制半成品，经冻干后制备成冻干成品。

实验组、对照组成品Vero细胞蛋白质、Vero细胞DNA如表6。

表6

结果显示，将实验组和对照组原液按抗原含量5.5IU/ml加入辅料后配制半成品，经冻干后制备成冻干成品，检测Vero细胞蛋白质、Vero细胞DNA(原液结果换算为成品)。使用离心流速500ml/min对上清液进行离心的实验组Vero细胞蛋白质、Vero细胞DNA均远小于中国药典要求，而对照组Vero细胞蛋白质残留量符合药典要求，但Vero细胞DNA大于中国药典要求。工艺无法满足生产要求。

实施例5、核酸酶残留检测

根据实施例4，考虑到对照组残留有较多的DNA，本发明人针对对照组，在收获病毒时添加核酸酶以将DNA片段打断成小分子DNA片段后进而通过凝胶过滤色谱法(与实施例1的“(6)凝胶过滤”同步过滤)将DNA去除。

对成品进行检测时，结果显示核酸酶残留量为0.5-1.5ng/ml，这增加了用药安全性方面的问题。

因此，对照组的方法不仅需要额外设置纯化步骤、增加操作复杂性，还需要考虑后续如何去除核酸酶残留。

本发明的方法，无核酸酶残留问题，安全环保。

实施例6、病毒培养周期更长的情况下的培养分析

生物反应器培养病毒过程从病毒接种开始，病毒吸附进入细胞开始复制、组装、释放，整个产毒周期经历潜伏期、对数生长期、稳定期、衰亡期。罐内病毒数随着培养时间的延长呈现先增多，达到最大值后逐渐减少的过程。病毒收获时间通常在12-14天，整个培养阶段产毒高峰期在第5-9天。

本实验中，对比不同病毒培养阶段采用不同离心力进行连续流离心，比较Vero细胞蛋白质、Vero细胞DNA、抗原含量，从而确定病毒收获阶段连续流离心的最佳工艺参数。

根据病毒繁殖特点，在病毒收获阶段分别使用以下方式进行对比试验：

①实验组2-1：病毒接种后1-4天使用离心力10000g、离心流速500ml/min循环离心；5-14天使用15000g、离心流速500ml/min循环离心；后经0.6μm微滤膜过滤。

②实验组2-2：病毒接种后1-4天使用离心力10000g、离心流速500ml/min循环离心；5-9天使用15000g、离心流速500ml/min循环离心；10-14天使用20000g、离心流速500ml/min循环离心；后经0.6μm微滤膜过滤。

③对照组2：病毒收获全过程使用离心力10000g、离心流速500ml/min循环离心，后经0.6μm微滤膜过滤。

实验组、对照组病毒液Vero细胞蛋白质、Vero细胞DNA、抗原含量如表7。

表7

根据表中结果，实验组2-1、2-2的Vero细胞蛋白质、Vero细胞DNA去除率优于实验组2-1。实验组2-2的Vero细胞蛋白质、Vero细胞DNA去除率优于实验组2-1。在收获到的抗原含量基本相当的情况下，后期适当提高离心力有利于提高蛋白质和DNA的去除率。

实施例7、实施例6的病毒液样品的浓缩

如实施例6的方法制备病毒，实验组和对照组病毒液经浓缩倍数40倍、300KD膜包超滤浓缩后经Sepharose 4FF凝胶层析柱进行纯化。

实验组、对照组原液Vero细胞蛋白质、Vero细胞DNA、抗原含量如表8。

表8

实验组2-1、2-2的Vero细胞蛋白质去除率、Vero细胞DNA去除率分别提高15.4％/26.9％、12.5％/18.8％。在收获到的抗原含量基本相当的情况下，后期适当提高离心力有利于提高蛋白质和DNA的去除率。

实施例8、实施例7的产物的冻干成品的质量分析

将实验组和对照组原液按抗原含量5.5IU/ml加入辅料后配制半成品，经冻干后制备成冻干成品，检测Vero细胞蛋白质、Vero细胞DNA(原液结果换算为成品)。

实验组、对照组成品Vero细胞蛋白质、Vero细胞DNA测定结果如表9。

表9

根据表中结果，实验组和对照组Vero细胞蛋白质、Vero细胞DNA均远小于中国药典要求，实验组2-1/2-2Vero细胞蛋白质、Vero细胞DNA去除率相对好于对照组2。

实施例总结

根据实施例1-4，在病毒培养时，循环离心生物反应器病毒培养上清液后、再收获病毒上清液经0.6μm澄清过滤，可极为显著地降低病毒液中Vero细胞蛋白质、Vero细胞DNA的含量，同时不会造成目标物质抗原的损失。并且，相同离心力作用下，适当的离心流速提高了上清液中Vero细胞杂质的去除率，使用离心力10000g、离心流速500ml/min循环离心生物反应器病毒培养上清液后，再收获病毒上清液经0.6μm澄清过滤，降低病毒液中Vero细胞蛋白质、Vero细胞DNA的含量最为显著(病毒接种后即使用连续流离心较病毒接种两天后使用连续流离心提高了上清液中Vero细胞杂质的去除率)，且不造成目标物质抗原的损失。

根据实施例6-8，在病毒收获阶段，不同收获时间适当调节(增大)循环离心时的离心力、再收获病毒上清液经0.6μm澄清过滤，降低了病毒液中Vero细胞蛋白质、Vero细胞DNA的含量，目标物质抗原基本可维持稳定。

根据实施例5，本发明的方法无核酸酶残留问题，安全环保。

总之，本发明的技术方案保证了成品Vero细胞蛋白质、Vero细胞DNA远低于中国药典规定的标准要求，疫苗安全性可大大提高，具有良好的工业应用前景。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。同时，在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。

Claims

1.一种在制备过程中降低狂犬病病毒产品中细胞蛋白及DNA残留的方法，其特征在于，所述方法包括：

(a) 以无血清培养基培养Vero细胞，将狂犬病病毒接种于Vero细胞，进行灌流式培养；灌流式培养的同时，将培养上清进行连续流离心；所述连续流离心的离心流速为500±100ml/min；所述连续流离心时，在起始至第3～5天离心力为10000±200g，之后离心力为15000±200g；或所述连续流离心时，在起始至第3～5天离心力10000±200g，之后至第8～10天离心力15000±200g，之后至结束培养离心力20000±200g；所述灌流式培养时，按2L/H～10L/H进行灌流，以生物反应器内葡萄糖浓度不低于0.4g/L为准；

(b) 培养结束后，将经连续流离心的病毒液以孔径0.6±0.15 μm的过滤装置过滤，去除直径超过所述孔径的物质，收获病毒液；

(c) 以(b)获得的病毒液制备病毒制品；

其中，步骤(a)～(c)中，不添加蛋白酶和/或核酸酶。

2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，(a)中，所述连续流离心的离心流速为500± 60 ml/min。

3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，(a)中，所述连续流离心的离心流速为500± 40 ml/min。

4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，(b)中，培养结束后，将经连续流离心的病毒液以孔径0.6±0.1 μm的过滤装置过滤。

5. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，(b)中，培养结束后，将经连续流离心的病毒液以孔径0.6±0.05 μm的过滤装置过滤。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(b)中收获病毒液后，还包括浓缩的步骤，所述浓缩为超滤浓缩。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，将病毒液浓缩2～200倍。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，(b)中收获病毒液以及浓缩后，还包括病毒灭活的步骤。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述病毒灭活以β-丙内酯灭活。

10.如权利要求6所述的方法，其特征在于，(b)中收获病毒液以及浓缩后，还包括纯化的步骤。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述纯化为进行凝胶过滤纯化。

12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述凝胶过滤纯化为：以琼脂糖凝胶4FF层析柱进行凝胶过滤纯化，收集第一峰，加入稳定剂以制备病毒原液；所述稳定剂为人血白蛋白；按1%～2%比例添加。

13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(c)中，所述病毒制品为疫苗；或，所述病毒制品为冻干制品。

14.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(a)中，所述的狂犬病病毒为PM毒株。