CN111662883A - 一种制备及纯化溶瘤病毒的方法及重组溶瘤弹状病毒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种制备和纯化溶瘤病毒的方法及重组溶瘤弹状病毒,该制备方法利用Vero细胞制备溶瘤病毒(特别是VSV病毒),首先利用Vero细胞优化病毒扩增条件,包括优化病毒感染复数(MOI)、病毒稀释液、病毒扩增液、扩增时血清浓度、细胞培养体积、病毒收获时间等条件;进一步通过优化病毒纯化条件,包括优化离心力、蔗糖垫底离心、离心时间、分步离心等条件,发现VSV病毒粒子在3%FBS培养基中,按MOI=5的比例感染Vero细胞48h,收获病毒液,在4℃、26000×g离心1h后,进行28000×g离心(30min‑45min)确定在分步离心条件下能稳定制备出高滴度的VSV病毒。该制备方法能高效、稳定、节约成本,为后续VSV病毒的规模化生产提供了技术支持,可用于制备抗肿瘤用的病毒药物。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域,具体涉及一种制备和纯化溶瘤病毒的方法及重组溶瘤弹状病毒。
技术背景
Vero细胞是非洲绿猴肾脏细胞,是一种连续传代细胞系。该细胞的优点在于其质量和外源因子可控性高,繁殖速度快,能高密度生长,并具有微载体培养工艺化生产的优势,同时该细胞为干扰素分泌缺陷型细胞,因而对于病毒,如VSV病毒(水疱性口炎病毒)的复制影响较小,可扩增出高低度的病毒颗粒。Vero细胞可用于疫苗生产中的病毒培养基质细胞,1982年Vero细胞已被WHO批准可以用于人类疫苗的生产基质,如脊髓灰质炎疫苗和狂犬疫苗的生产。
癌症和常规的癌症治疗剂目前在情绪/身体痛苦、失去生命和增加医疗保健成本方面带来了显著的社会经济负担。常规的疗法显示出一些有益的临床效果但是伴随着产生降低患者的生活质量的毒副作用。临床治疗中需要有更有效的且更低的毒副作用的癌症疗法。
目前小分子药物、单克隆抗体等被开发应用于肿瘤的新型治疗,但治愈率不高,有待更多的研究。另外,仅用单一药物治疗可能会导致肿瘤细胞出现耐药性,因此急需开发有效的生物治疗方法。溶瘤病毒是一种通过遗传学改变而具有复制能力的病毒,经过高度稀释的减毒病毒能利用肿瘤(靶)细胞中抑癌基因的失活或缺陷,选择性地在靶细胞内复制,最终导致肿瘤细胞的溶解和死亡,而在正常细胞内它只是少量存在或不能增殖。利用这种病毒进行的肿瘤治疗称为溶瘤病毒治疗。溶瘤病毒不但自身在肿瘤细胞内复制,导致细胞溶解和死亡;而且通过死亡的细胞释放出病毒颗粒,产生一种级联效应,放大溶细胞效果,直至肿瘤细胞被清除。同时,肿瘤细胞的破裂会导致肿瘤抗原从肿瘤细胞中释放,从而诱导体内系统性的抗肿瘤免疫反应,这可能会增强病毒的溶细胞活性。溶瘤病毒进入肿瘤细胞后由于自我复制可陆续破坏宿主细胞,进而向周围扩散,进入其他肿瘤细胞。如此反复循环,可发挥有效的抗肿瘤效果。
随着 RNA 病毒遗传技术的进展,水疱性口炎病毒属载体已被开发成为一种有效的治疗制剂。VSV(水疱性口炎病毒)载体是一种高效的溶瘤弹状病毒载体,具有非常广的溶瘤范围。根据资料报道,VSV载体几乎能够侵染溶解所有的肿瘤细胞,在体外实验中VSV载体的溶瘤率都在50%以上,在体内实验中VSV载体能够显著延长荷瘤动物模型的寿命。VSV载体也被开发成为一种有效的疫苗载体,VSV载体作为疫苗载体应用到获得性免疫缺陷综合症病毒、流感病毒、丙型肝炎病毒和乙肝病毒等疫苗的研制过程中。因此水疱性口炎病毒载体具有非常好的应用前景。
VSV为弹状病毒科成员,是一种不分节段单股负链RNA病毒,病毒基因组长约11kb并且不会整合到宿主基因组内,主要以节肢动物为传播媒介,可感染大多数哺乳动物。在自然界中,VSV感染猪、牛和马,并在口和足附近导致水痘性疾病。尽管有报道表明VSV可感染人,但是VSV在人类中没有导致任何严重的症状。VSV编码5种蛋白,包括核壳蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、表面糖蛋白(G)和RNA依赖性RNA聚合酶(L)。由VSV基质蛋白(M)阻断宿主细胞蛋白合成会诱导细胞死亡。
VSV病毒颗粒呈子弹状或圆柱状,长度约为直径的3倍(150-180nm×50-70nm),病毒粒子表面有囊膜,囊膜上均匀密布短的纤突,长约10nm。VSV病毒粒子分子量为265.6×103±13.3×103KD,其中蛋白占74%,类脂质占20%,糖类占3%,RNA占3%。
虽然利用Vero细胞制备某些病毒的工艺已经相对成熟稳定,但VSV对各种理化因子的抵抗力不强。58℃ 30min、可见光、紫外线、脂溶剂(乙醚、氯仿)、高的离心力、高盐等条件都能使其失活。因而对VSV病毒的生产浓缩工艺提出了较高的要求。
病毒纯化过程是临床转移治疗中的一个重要步骤,就纯度和滴度而言与安全性和功效直接相关。特别是在严格的监管规则下,对病毒疫苗产品中宿主细胞的污染物有强制要求,如宿主细胞蛋白质和DNA水平、牛血清白蛋白、抗生素、支原体、菌体等;在大多数小规模的实验应用中,可采用离心技术通过相对简单的方法来浓缩和纯化病毒载体。
在过去的几十年里,大量的技术进步显著增加了病毒生产工艺的生产效率和可扩展性。相比之下,由于回收率通常很低,病毒纯化技术仍须提升。目前,病毒的纯化,主要包括PEG浓缩、超速离心浓缩、柱浓缩(离子交换柱、亲和柱、分子筛等)、超滤浓缩、透析等,其中PEG浓缩法虽然能够获得较高的病毒回收率,但是PEG的存在却限制了溶瘤病毒的后期应用,如病毒的安全性评价实验等。而柱浓缩和超滤浓缩因为价格昂贵,不适用于实验室阶段的研究,并且柱浓缩需要一定量的高盐溶液洗涤,这会造成VSV病毒极大的失活,从而导致感染性病毒粒子的回收率偏低。总的来说,这些操作方法造成了病毒的大量损失,极大的增加了病毒疫苗生产成本。为了提升效率和可扩展性,病毒生产工艺技术不断优化,病毒颗粒的纯化成为病毒疫苗生产领域重大的技术诀窍。
病毒制备方法一般包括从稳定细胞系制备病毒和使用例如色谱法、蔗糖梯度离心法等纯化病毒。并且在工业过程中,通常使用至少一个超滤步骤或离心步骤以浓缩病毒和/ 或交换保持病毒载体的缓冲液。
综上所述,一种能够稳定、高效、节约成本的VSV制备方法及高速离心纯化VSV病毒的生产工艺,将会具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明旨在基于现有技术中存在的问题,提供一种利用Vero细胞高效稳定制备溶瘤病毒的方法以及一种能有效纯化溶瘤病毒的方法。
本发明采用的技术方案为,一种制备溶瘤病毒的方法,将病毒按MOI=5用PBS、DMEM-0或opti-MEM培养基作为病毒稀释液稀释后感染Vero细胞1-3h;然后吸弃病毒液,更换成含体积百分比为3%的FBS的PBS、DMEM或opti-MEM完全培养基作为病毒扩增液,培养36-48h后收获病毒液。
进一步地,该方法包括以下具体步骤:
S1、在培养板的N个孔中的N-1个孔中加入Vero-E6细胞(ATCC)悬液,体积为2mL,使细胞量达到4×105个/孔,37℃,体积百分比为5%CO2培养 16 h;
S2、取其中一孔中的细胞消化后进行计数,其余孔的细胞分别按MOI=5将
病毒用DMEM-0作为病毒稀释液稀释至1mL并吸弃掉培养基,将经过细胞消化后的液体分别加入到其余孔中,在37℃,体积百分比为5% CO2条件下感染1h-3h,其中所述病毒为弹状病毒科水疱性口炎病毒属,具备特异性杀伤肿瘤细胞特性,并且可以在Vero细胞中扩增和复制,具备反复侵染Vero细胞的能力;
S3、 吸弃病毒液,加入含体积百分比为3-10%FBS的DMEM完全培养基0.5-2mL作为病毒扩增液,在37℃、体积百分比为5% CO2的条件下培养36-48h, 离心、并使用滤器进行过滤备用。
进一步地,其中S3中,吸弃病毒液,加入含重量体积浓度为3%的FBS的DMEM培养基0.75-1mL,在37℃、体积百分比5% CO2的条件下培养36h,收集病毒液2500rpm 离心15min,并使用0.22μm滤器进行过滤备用。
进一步地,所述病毒为重组溶瘤弹状病毒,选自水疱性口炎病毒。
进一步地,所述病毒为重组溶瘤弹状病毒,选自水疱性口炎病毒印第安纳株。
进一步地,所述病毒为重组溶瘤病毒,选自VSV MuddSummer亚型株。
本发明的另一目的在于进一步地提供一种纯化溶瘤病毒的方法,该方法根据上述方法制备溶瘤病毒,其中,制备中所用的培养容器替换为适合贴壁细胞培养的反应器;制备中所用的病毒稀释液的体积及病毒扩增液的体积以等比例扩大,为制备中体积的2.5-20倍;过滤后的上清在含3 mL 重量体积百分比为30%蔗糖垫底下进行高速离心。
进一步地,所述高速离心为在 3 mL 重量体积百分比为30%蔗糖垫底下30000×g高速离心1h。
进一步地,所述高速离心为为两步离心法:第一步:用3 mL 重量体积百分比为30%蔗糖垫底下26000×g离心1h,第二步:继续28000×g离心30-45min。
本发明的再一目的在于提供一种重组溶瘤弹状病毒,所述重组溶瘤弹状病毒根据上述方法得到,所述重组溶瘤弹状病毒包含改性基质蛋白(M),所述改性基因蛋白(M)与减毒弹状病毒的M蛋白同样存在可正常维持蛋白质的功能的保守突变,编码所述改性基质蛋白(M)的氨基酸序列与减毒弹状病毒的M蛋白(SEQ ID NO:1所示)的氨基酸序列相比,具有至少80%,优选至少90%,更优选至少95%,最优选至少98%相同的序列;并且,所述氨基酸序列和减毒弹状病毒的M蛋白(SEQ ID NO:1所示)相比,在第51位置、第221位置、第226位置同时具有氨基酸替换,或者编码所述改性基质蛋白(M)的氨基酸序列与减毒弹状病毒的M蛋白(SEQ ID NO:1所示)所示的氨基酸序列相比,在第21位置、第51位置、第111位置和第221位置同时具有氨基酸替换。
在一个实施方案中,本公开涉及一种重组溶瘤弹状病毒的改性基质蛋白(M),其特征在于,编码所述改性基质蛋白(M)的氨基酸序列与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比,具有至少80%,优选至少90%,更优选至少95%,最优选至少98%相同的序列;并且,所述氨基酸序列和SEQ ID NO:1相比,在第51位置、第221位置、第226位置同时具有氨基酸替换。
在另一个实施方案中,编码所述改性基质蛋白(M)的氨基酸序列与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比,在第21位置、第51位置、第111位置和第221位置同时具有氨基酸替换。
在一个实施方案中,本公开涉及一种改性基质蛋白(M),其中,所述重组溶瘤弹状病毒选自VSV病毒水疱性口炎病毒;优选的,所述重组溶瘤弹状病毒选自VSV病毒的水疱性口炎病毒MuddSummer株。
在一个实施方案中,本公开涉及一种重组溶瘤弹状病毒,其中,所述重组溶瘤弹状病毒包含改性基质蛋白(M),其中,所述改性基质蛋白(M)的氨基酸序列为如上所示的氨基酸序列;优选的,所述重组溶瘤弹状病毒为减毒的溶瘤弹状病毒。
在一些优选的实施方案中,本公开的溶瘤弹状病毒是野生型水泡性病毒(vesiculovirus)或重组水泡性病毒,例如野生型或重组VSV、金迪普拉,Maraba或Carajas,包括其变体。在其他实施方案中,溶瘤弹状病毒是野生型或重组非水泡性病毒,例如MuirSprings、Farmington或大巴伊亚病毒病毒,包括其变体。
在特别优选的实施方案中,本公开的表达肿瘤抗原的溶瘤病毒是野生型Maraba株弹状病毒或其变体,其任选地经遗传修饰,例如以提高肿瘤选择性。
在一些优选的实施方案中,复制型溶瘤病毒为例如水疱性口炎病毒(VSV)或Maraba弹状病毒等弹状病毒,其优选包含一种或多种遗传修饰从而增加病毒对癌症细胞的选择性。
在本公开的一个实施方案中,选取的溶瘤病毒包括减毒弹状病毒以及包含减毒弹状病毒的组合物,所述减毒弹状病毒编码与减毒弹状病毒的M蛋白(即如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列)具有20%、30%、40%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%以及这些数值之间所有范围和百分数的氨基酸同一性的变异M蛋白。上述减毒弹状病毒的M蛋白具有特定百分数的同一性指的是,减毒弹状病毒的M蛋白存在可正常维持蛋白质的功能的保守突变。保守突变的代表性例子为保守置换。此外,上述减毒弹状病毒的M蛋白的同一性突变还包括起因于基因所来源的弹状病毒的个体差异、株、种的差异时等的天然产生的突变。
在一个实施方案中,本公开涉及溶瘤VSV病毒的制备方法,具体方法如下:
1、在6孔培养板中每孔加入Vero-E6细胞悬液2mL,使细胞量达到4×105个/孔,共5个孔,37℃,5%CO2培养 16 h。
2、取其中一孔中的细胞消化后进行计数,其余孔的细胞分别按MOI=5将VSV病毒用DMEM-0稀释至1mL,并将其加入到吸弃掉培养基的相对应的孔中,37℃,5% CO2感染1h-3h。
3、 移液管去除病毒液,加入含体积百分比为3%FBS的DMEM培养基0.5-2mL,优选1.5mL,更优选的0.75mL、1mL,更优选的0.75-1mL中间的值,37℃,体积百分比为5% CO2培养36- 48h,优选36h,收集病毒液2500rpm 离心15min,并使用0.22μm滤器进行过滤备用。
在另一个实施方案中,本公开涉及溶瘤VSV病毒的纯化,进一步地本公开涉及一种利用高速离心法纯化VSV溶瘤病毒的方法,具体方法如下:
1、按前述方法进行VSV病毒的制备,其中,病毒生产所用的培养容器可以为10cm板,T175等,或其他适合贴壁细胞培养的适宜容器。
2、按前述方法进行VSV病毒的制备,其中,病毒浓缩纯化所用的病毒稀释液体积及病毒扩增液体积为制备中所用的病毒稀释液及扩增液体积的等比例扩大,扩大比例为2.5-20倍。具体的,如10cm培养板所用病毒稀释液为5mL,病毒扩增时含3%FBS的DMEM体积为5-10mL,优选的7.5mL,更优选的5mL,最优选的5mL-7.5mL中间的值。
3、过滤后的上清进行高速(含3 mL 30%蔗糖垫底)离心。
其中,优选的,上述蔗糖垫底离心条件为30000×g在重量体积百分比为30%蔗糖垫底下离心1h,进一步地本公开涉及一种用重量体积百分比为30%蔗糖垫底分步离心的方法;具体的,26000×g离心1h+28000×g离心30min;优选的26000×g离心1h+28000×g离心45min;更优选的26000×g离心1h+28000×g离心30min-45min之间的任一时间点,所述分步离心法的病毒回收率在80%左右。
有益效果:本发明制备溶瘤病毒的方法,采用Vero细胞稳定制备高滴度溶瘤病毒特别是VSV病毒,而且进一步通过高速离心纯化溶瘤VSV病毒,根据本发明的方法制备的溶瘤病毒粒子可应用于生物医药技术研究,并可借鉴到良好操作规范(×GMP)生产条件下进行大规模生产时,降低成本显著提高产品得率。
本发明的有益效果主要体现在以下几个方面:第一,与目前的VSV病毒生产相比,本公开能大幅缩减成本,体积百分比为3%的FBS浓度培养条件下就能收获同等量的病毒;进一步地,在同样的培养体系中,本公开通过减少病毒培养液体积,能够获得同等量或更多量的病毒粒子,更利于后续的纯化等步骤。
第二,与一步离心法相比,本公开的两步离心法能够更加稳定有效的回收VSV病毒,一步离心法,需要在相对较高的离心力条件下离心较长时间,易导致VSV病毒的失活,而分步离心法,是在相对较低的离心力下离心一段时间,以便病毒逐步沉淀到底部,之后通过相对高速的短时间离心,加快病毒的完全沉淀,从而使病毒的失活率得到极大的控制。
附图说明
通过对以下列出的它们各自的附图的以下描述更深入地示出本公开的实施方案。
图1所示的是VSV减毒溶瘤病毒制备及纯化的流程图。
图2所示的是不同起始病毒接种的MOI值对病毒滴度的影响。
图3所示的是不同病毒稀释液对病毒生产的滴度的影响。
图4所示的是不同血清浓度对病毒扩增的影响。
图5所示的是病毒扩增时的培养体积对病毒产量的影响。
图6所示的是不同扩增时间条件下的病毒的产量。
图7所示的是病毒高速离心浓缩最适离心力的选择确定。
图8所示的是病毒高速离心下最适离心时间的确定。
图9所示的是两步法离心法条件下的病毒回收率的比较。
具体实施方案
定义:
如本领域技术人员都能理解的那样,除非另有说明,否则本节和其他节中描述的定义和实施方案旨在应用于本文所述申请的所有实施案例。
在理解本申请的范围时,如本文所使用的术语“包含”及其衍生词旨在是开放式术语,其指定存在所述特征,元素,组分,组,整数和/或步骤,但不排除存在其他未说明的功能、元素、组分、组、整数和/或步骤。前述内容也适用于具有相似含义的词语,例如术语“包括”、“具有”及其衍生词。本文使用的术语“由......组成”及其衍生词旨在是封闭式术语,其指定存在所述特征、元素、组分、组、整数和/或步骤,但排除存在其他未说明的特征的存在、元素、组分、组、整数和/或步骤。如本文所用的,术语“基本上由......组成”旨在指定存在所述特征、元素、组分、组、整数和/或步骤以及不会实质上影响特征、元素、组分、组、整数和/或步骤的基本和新颖特征的那些。
本文使用的诸如“基本上”、“约”和“近似”的程度术语意为修饰术语的合理偏差量,这个改变不会导致结果产生显著变化。如果该偏差不会否定其修饰的词的根本含义的话,这些程度术语的使用应被限定为偏离修饰的术语的定义控制范围在正负百分之五。
如在本申请中所使用的,单数形式“一个/种(a/an)”和“所述(the)”包括复数指代,除非内容另有明确说明。例如,包括“一个T细胞”的实施方案应理解为具有一种物质或两种及两种以上其他物质的组分。
在包含“另一”或“第二”组分,例如另一或第二细胞因子的实施方案中,如本文所用的第二组分在化学上不同于其他组分或第一组分。“第三”组分与其他组分、第一组分和第二组分不同,并且进一步列举的与“另一”组分不同的相似点。
本文所用的术语“和/或”是指所列出的项单独存在或组合使用。实际上,该术语意为所列项中已经存在或者在使用的“至少一个/种”或“一个/种或多个/种”。
当在权利要求和/或说明书中与术语“包含”联用时,词语“一(a)”或“一(an)”可以指“一个”,但也可以指“一个或多个”、“至少一个”以及“一个或多于一个”。
如在权利要求和说明书中所使用的,词语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是指包括在内的或开放式的,并不排除额外的、未引述的元件或方法步骤。
在整个申请文件中,术语“约”表示:一个值包括测定该值所使用的装置或方法的误差的标准偏差。
虽然所公开的内容支持术语“或”的定义仅为替代物以及“和/或”,但除非明确表示仅为替代物或替代物之间相互排斥外,权利要求中的术语“或”是指“和/或”。
病毒生产具体实施例:
本公开采用的试剂及耗材如下:PBS (Hyclone SH30256.01),DMEM高糖培养基 (GibcoC11995500),RPMI1640 (Gibco C22400500CP),双抗体 (Gibco 15140-122),胎牛血清(Gibco 10099141),Opti-MEM® I Reduced Serum Medium (Gibco 31985-070),96孔细胞培养板 (Corning 3599),6孔细胞培养板 (Corning 3516),0.22um滤器 (Millipore SLGP033rb),DMSO (Macklin D806645)。
细胞系:
将Vero细胞的培养维持在37℃、含5% CO2的特定培养环境中(Thermo 150i 细胞培养箱),采用DMEM高糖完全培养基进行培养。
病毒:
在一个技术方案中,所述重组水泡性口炎病毒MuddSummer亚型株的改性基质蛋白(M)选自第21位置、第51位置、第111位置和第221位置同时具有氨基酸替换,所述氨基酸替换方式为:第21位甘氨酸G替换为谷氨酸E,第51甲硫氨酸M替换为丙氨酸A,第111位亮氨酸L替换为苯丙氨酸F,第221位缬氨酸V替换为苯丙氨酸F。
实施例1 不同MOI值的接毒量感染Vero生产细胞,比较生产扩增得到的病毒滴度的总量变化情况。
在Vero细胞中,用opti-MEM更换原有的完全培养基,然后将VSV病毒分别按MOI=1、5、10、20感染Vero细胞,1h-3h后更换成完全培养基,待细胞完全裂解后(约60h),收集上清检测不同原始病毒接种(MOI)情况下,制备得到的病毒滴度(TCID50)变化情况,整体实验流程参照图1中描述的具体实施方案。
上述实验过程的具体步骤如下:
1、 在6孔培养板中每孔加入Vero-E6细胞悬液2 mL,使细胞量达到4×105个/孔,共5个孔,37℃,体积百分比为5%CO2培养16 h。
2、取其中一孔中的细胞消化后进行计数,其余4孔细胞分别按MOI=1、5、10、20将VSV病毒用opti-MEM稀释至2mL,并将其加入到吸弃掉培养基的相对应的孔中,37℃,体积百分比为5% CO2感染2h-3h。
3、 吸弃病毒液,加入完全培养基后37℃,5% CO2培养 48h,收集病毒液并使用0.22μm滤器进行过滤。
4、 在1.5mL EP管中将步骤2中收获的上清作连续10倍的稀释,从10-1-10-11,共11个滴度。
5、 将稀释好的上清接种到96孔培养板中,每一稀释度接种一列共8孔,每孔接种100 µl,设正常细胞对照组一列。
6、 48h后观察每孔细胞荧光情况,有荧光则记为此孔被感染。
7、 按Karber法计算TCID50。
上述病毒的滴度检测结果如图2所示:
从图2中的检测结果可以发现:病毒滴度随着首次接种的MOI值的增加先增高随后下降,在感染复数MOI=5时病毒产毒量最高,因此表明针对VSV溶瘤病毒的规模化制备时,病毒起始接种量即MOI为5。
实施例2 进一步为了增强病毒对细胞的感染能力,特选择PBS、DMEM-0、opti-MEM作为U400病毒感染的稀释液进行细胞的感染时的溶剂(MOI=5),
在Vero细胞中分别用PBS、DMEM-0、opti-MEM更换原有的培养基,然后按MOI=5加入VSV病毒感染2h后更换成完全培养基,48h后收集上清检测病毒株产生的病毒的滴度(TCID50)。
检测上述病毒的滴度的具体操作步骤如下:
1、 在6孔培养板中每孔加入Vero-E6细胞悬液2 mL,使细胞量达到4×105个/孔,共4个孔,37℃,体积百分比为5% CO2培养16 h。
2、取其中一孔中的细胞消化后进行计数,其余3孔细胞按MOI=5将U400病毒分别用PBS、DMEM-0、opti-MEM稀释至2mL,并将其加入到吸弃掉培养基的相对应的孔中,37℃,体积百分比为5% CO2感染2-3h。
3、 吸弃病毒液,加入完全培养基后37℃,体积百分比为5% CO2培养 48h,收集病毒液并使用0.22μm滤器进行过滤。
4、 在1.5mL EP管中将步骤2中收获的上清作连续10倍的稀释,从10-1 - 10-11,共11个滴度。
5、 将稀释好的上清接种到96孔培养板中,每一稀释度接种一列共8孔,每孔接种100 µl。设正常细胞对照组一列。
6、 48h后观察每孔细胞荧光情况,有荧光则记为此孔被感染。
7、 按Karber法计算TCID50。
上述病毒的滴度的检测结果如图3所示。
从图3中可以发现,用PBS、DMEM-0、opti-MEM作为病毒稀释液感染细胞时,所获得的病毒液滴度没有实质上的区别,为便于后续实验结果,决定以DMEM-0作为感染稀释液,维持DMEM-0无血清的培养基,降低血清对病毒下游纯化的影响。
实施例3 培养基中血清浓度对病毒滴度的影响
在传统的病毒制备的过程中会发现,一些病毒在扩增的过程中,培养基中的血清浓度会严重影响病毒的滴度的提高,为了解决这个问题,并进一步提高病毒滴度,优化病毒扩增工艺,在Vero细胞中,用DMEM-0更换原有的培养基,然后VSV病毒按MOI=5感染Vero细胞,2h-3h后分别用含体积百分比为0%、1.5%、3%、6%、9%不同浓度的FBS配置的DMEM培养基进行病毒扩增,待细胞完全裂解后,收集上清检测不同血清浓度培养情况下的病毒的滴度(TCID50)。
检测上述病毒的滴度的具体步骤如下:
1、 在6孔培养板中每孔加入Vero-E6细胞悬液2 mL,使细胞量达到4×105个/孔,共6个孔,37℃,体积百分比为5% CO2培养16 h。
2、取其中一孔中的细胞消化后进行计数,其余5孔细胞按MOI=5将U400病毒用DMEM-0稀释至2mL,并将其加入到吸弃掉培养基的相对应的孔中,37℃,体积百分比为5%CO2感染2-3h。
3、 吸弃病毒液,加入含体积百分比为0%、1.5%、3%、6%、9%FBS的DMEM培养基,37℃,体积百分比为5% CO2培养48h,收集病毒液并使用0.22μm滤器进行过滤。
4、 在1.5mL EP管中将步骤2中收获的上清作连续10倍的稀释,从10-1 - 10-11,共11个滴度。
5、 将稀释好的上清接种到96孔培养板中,每一稀释度接种一列共8孔,每孔接种100 µl。设正常细胞对照组一列。
6、 48h后观察每孔细胞荧光情况,有荧光则记为此孔被感染。
7、 按Karber法计算TCID50。
根据图4中的结果可以发现,随着血清浓度的提高,病毒滴度显著升高,当血清浓度达到体积百分比为3%以上时,病毒滴度维持在相对稳定的水平,因此,就本病毒而言,其高效扩增需要一定浓度的血清来维持,血清浓度为3%体积百分比血清浓度就足以保证VSV病毒的高效扩增。
实施例4 VSV病毒在不同扩增体积条件下的病毒颗粒数:
在同样数目的细胞扩增条件下,为了能保证病毒粒子数目不变或更多的情况下,较低的病毒液培养体积会便于后续的离心浓缩步骤,因而通过检查不同培养体积条件下的病毒颗粒数来确定病毒培养体积,具体步骤如下:
1、 在5孔培养板中每孔加入Vero-E6细胞悬液2 mL,使细胞量达到4×105个/孔,共6个孔,37℃,体积百分比为 5%的CO2培养 16 h。
2、取其中一孔中的细胞消化后进行计数,其余4孔细胞按MOI=5将U400病毒用DMEM-0稀释至1mL,并将其加入到吸弃掉培养基的相对应的孔中,37℃,5% CO2感染2-3h。
3、 吸弃病毒液,分别加入含3%FBS的DMEM培养基2mL、1.5mL、1mL、0.75mL,37℃,体积百分比为 5%的CO2培养 48h,收集病毒液并注意记录此时的病毒液实际体积,使用0.22μm滤器进行过滤。
4、 在1.5mL EP管中将步骤2中收获的上清作连续10倍的稀释,从10-1-10-11,共11个滴度。
5、 将稀释好的上清接种到96孔培养板中,每一稀释度接种一列共8孔,每孔接种100 µl。设正常细胞对照组一列。
6、 48h后观察每孔细胞荧光情况,有荧光则记为此孔被感染。
7、 按Karber法计算TCID50。
根据图5结果可知,同样的条件下,病毒液体积的减少病毒滴度增加,病毒颗粒先维持稳定,在体积较少到足够体积时,病毒颗粒数明显增加,因而可通过缩减病毒培养液体积来增加病毒滴度,进而增加病毒颗粒数,减少成本并便于后续纯化等工作。
实施例5 不同时间点收取病毒液对病毒产量的影响:
VSV病毒长时间处于37℃会导致病毒的活力下降,而较短的培养时间又会导致细胞裂解不彻底,导致病毒滴度下降,因而需要优化病毒的收获时间。具体步骤如下:
1、 在6孔培养板中每孔加入Vero-E6细胞悬液2mL,使细胞量达到4×105个/孔,共4个孔,37℃,体积百分比为 5%的CO2培养 16 h。
2、取其中一孔中的细胞消化后进行计数,其余3孔细胞按MOI=5将U400病毒用DMEM-0稀释至1mL,并将其加入到吸弃掉培养基的相对应的孔中,37℃,体积百分比为 5%的CO2感染2-3h。
3、 吸弃病毒液,分别加入含3%FBS的DMEM培养基2mL 37℃,体积百分比为 5%的CO2培养24h、36h、48h,收集病毒液并注意记录此时的病毒液实际体积,使用0.22μm滤器进行过滤。
4、 在1.5mL EP管中将步骤2中收获的上清作连续10倍的稀释,从10-1-10-11,共11个滴度。
5、 将稀释好的上清接种到96孔培养板中,每一稀释度接种一列共8孔,每孔接种100 µl。设正常细胞对照组一列。
6、 48h后观察每孔细胞荧光情况,有荧光则记为此孔被感染。
7、 按Karber法计算TCID50。
根据图6结果可知,在同样的条件下,接种相同数目的原始病毒种子,分别在相同的制备体系,进行病毒的生产扩增,可以发现当感染复数为1时,病毒在感染36h后,上清中病毒粒子数达到一个峰值,进一步证明病毒制备的最佳感染时间点在36h,超过36h后病毒的产量逐级下降,不利于规模化生产。
实施例6 VSV病毒在不同离心力离心条件下的病毒回收率:
按实施例1、2、3中所述条件和步骤进行病毒的生产,通过在不同离心力条件下高速离心1.5h,病毒沉淀用适量PBS重悬后,收集病毒液并使用0.22μm滤器进行过滤除菌,并测定病毒的滴度(TCID50),病毒回收率(%)=离心浓缩后的TCID50 /(N×病毒原液的TCID50)(其中N为浓缩倍数)。
根据图7结果可知,在不同离心力条件下(20000×g、30000×g、30000×g在体积百分比为30%的蔗糖垫底下、40000×g),30000×g离心1.5h能获得相对较优的病毒回收率,并且30000×g在30%蔗糖垫底下离心1.5h能进一步提高病毒回收率。
进一步地根据图7可知,在不同离心力(25000×g在体积百分比为 30%的蔗糖垫底下、30000×g在重量体积百分比为30%蔗糖垫底下、35000×g在重量体积百分比为30%蔗糖垫底下离心1.5h的条件下,尽管30000×g在体积百分比为 30%的蔗糖垫底下离心与35000×g在重量体积百分比为30%蔗糖垫底下离心获得同样的病毒回收率,但较低的离心速度可能对病毒的破坏更小,进而初步确定30000×g在重量体积百分比为30%蔗糖垫底下离心作为VSV病毒离心浓缩的条件,其中在离心1.5h的条件下,低于25000×g的离心条件可能致使病毒难以离心下来,而高于30000×g的离心力条件下,可能导致了病毒的迅速失活。
实施例7 VSV病毒在30000×g在30%蔗糖垫底下离心不同时间条件下的病毒回收率:
按前述所诉条件和步骤进行病毒的生产,为了进一步降低病毒失活率并提高病毒回收率,通过在30000×g在30%蔗糖垫底下离心不同时间条件下进行离心,病毒沉淀用适量PBS重悬后,收集病毒液并使用0.22μm滤器进行过滤除菌,并测定病毒的滴度(TCID50),病毒回收率(%)=离心浓缩后的TCID50 /(N×病毒原液的TCID50)×100%(其中N为浓缩倍数)。病毒残留率(%)=离心后的培养上清TCID50 /(病毒原液的TCID50)×100%。
根据图8结果可知,30000×g在重量体积百分比为30%蔗糖垫底下离心1h能获得较高的病毒回收率,并且在该条件下,培养上清中的病毒残留率也处于足够低的水平,但仍有20%左右的病毒损失。进一步地,根据图可知,30000×g在30%蔗糖垫底下离心1h仍能获得优于其他离心时间条件下的病毒得率。
实施例8 VSV病毒分步离心条件下的病毒回收率 :
由于在上述病毒浓缩过程中,病毒得率低的原因很大一部分是由于高速离心导致病毒失活,而低速离心又不足以使病毒沉淀下来。为了进一步提高病毒得率并获得较为稳定的病毒生产条件,通过两步离心法,即在相对低速离心(26000×g在重量体积百分比为30%蔗糖垫底)条件下离心1h,再提高离心速率(28000×g在重量体积百分比为30%蔗糖垫底下)离心30min-45min。病毒沉淀用适量PBS重悬后,收集病毒液并使用0.22μm滤器进行过滤除菌,并测定病毒的滴度(TCID50)。
根据图9可知,两步离心法相对于一步离心能显著增强病毒的回收率,并且该离心条件下的病毒回收率相对稳定,基本维持在80%左右。
与目前的VSV病毒生产相比,本公开的病毒扩增制备方法能大幅缩减生产成本,3%FBS浓度培养条件下就能收获同等量的病毒;在同样的培养体系中,本公开的技术方法通过减少病毒培养液体积,能够获得同等量或更多量的病毒粒子,更利于后续的纯化等步骤。
与一步离心法相比,本公开中涉及到的两步离心法能够更加稳定有效的回收VSV病毒,一步离心法,需要在相对较高的离心力条件下,同时需要离心较长时间,容易导致VSV病毒的失活,而公开中涉及到的分步离心法,是在相对较低的离心力下离心较短时间,以便病毒逐步沉淀到底部,之后通过相对高速的短时间离心,加快病毒的完全沉淀,从而使病毒的失活率得到极大的控制。
Claims (10)
1.一种制备溶瘤病毒的方法,其特征在于,将病毒按MOI=5用PBS、DMEM-0或opti-MEM培养基作为病毒稀释液稀释后感染Vero细胞1-3h;然后吸弃病毒液,更换成含体积百分比为3-10%FBS的PBS、DMEM或opti-MEM完全培养基作为病毒扩增液,培养36-48h后收获病毒液。
2.根据权利要求1所述的一种制备溶瘤病毒的方法,其特征在于,该方法包括以下具体步骤:
S1、在培养板的N个孔中的N-1个孔中加入Vero-E6细胞(ATCC)悬液,体积为2mL,使细胞量达到4×105个/孔,37℃,体积百分比5%CO2培养 16 h;
S2、取其中一孔中的细胞消化后进行计数,其余孔的细胞分别按MOI=5将
病毒用DMEM-0作为病毒稀释液稀释至1mL并吸弃掉培养基,将经过细胞消化后的液体分别加入到其余孔中,在37℃,体积百分比5% CO2条件下感染1h-3h,其中所述病毒为弹状病毒科水疱性口炎病毒属,具备特异性杀伤肿瘤细胞特性,并且可以在Vero细胞中扩增和复制,具备反复侵染Vero细胞的能力;
S3、 吸弃病毒液,加入含体积百分比为3-10%FBS的DMEM完全培养基0.5-2mL作为病毒扩增液,在37℃、体积百分比5% CO2的条件下培养36-48h, 离心、并使用滤器进行过滤备用。
3.根据权利要求2所述的制备溶瘤病毒的方法,其特征在于,其中S3中,吸弃病毒液,加入含体积百分比为3%的FBS的DMEM培养基0.75-1mL,在37℃、体积百分比5% CO2的条件下培养36h,收集病毒液2500rpm 离心15min,并使用0.22μm滤器进行过滤备用。
4.根据权利要求1所述的制备溶瘤病毒的方法,其特征在于,所述病毒为重组溶瘤弹状病毒,选自水疱性口炎病毒。
5.根据权利要求1所述的制备溶瘤病毒的方法,其特征在于,所述病毒为重组溶瘤弹状病毒,选自水疱性口炎病毒印第安纳株。
6.根据权利要求1所述的制备溶瘤病毒的方法,其特征在于,所述病毒为重组溶瘤病毒,选自VSV MuddSummer亚型株。
7.一种纯化溶瘤病毒的方法,其特征在于,该方法根据权利要求1-6任一方法制备溶瘤病毒,其中,制备中所用的培养容器替换为适合贴壁细胞培养的反应器;制备中所用的病毒稀释液的体积及病毒扩增液的体积以等比例扩大,为制备中病毒稀释液的体积及病毒扩增液的体积的2.5-20倍;过滤后的上清在含3mL+30%蔗糖垫底下进行高速离心。
8.根据权利要求7所述的纯化溶瘤病毒的方法,其特征在于,所述高速离心为在 3 mL30%蔗糖垫底下30000×g高速离心1h。
9.根据权利要求7所述的纯化溶瘤病毒的方法,其特征在于,所述高速离心为为两步离心法:第一步:用3 mL 30%蔗糖垫底下26000×g离心1h,第二步:继续28000×g离心30-45min。
10.一种重组溶瘤弹状病毒,其特征在于,所述重组溶瘤弹状病毒根据权利要求1-9任一所述方法得到,所述重组溶瘤弹状病毒包含改性基质蛋白(M),所述改性基因蛋白(M)与减毒弹状病毒的M蛋白同样存在可正常维持蛋白质的功能的保守突变,编码所述改性基质蛋白(M)的氨基酸序列与减毒弹状病毒的M蛋白(SEQ ID NO:1所示)的氨基酸序列相比,具有至少80%,优选至少90%,更优选至少95%,最优选至少98%相同的序列;并且,所述氨基酸序列和减毒弹状病毒的M蛋白(SEQ ID NO:1所示)相比,在第51位置、第221位置、第226位置同时具有氨基酸替换,或者编码所述改性基质蛋白(M)的氨基酸序列与减毒弹状病毒的M蛋白(SEQ ID NO:1所示)所示的氨基酸序列相比,在第21位置、第51位置、第111位置和第221位置同时具有氨基酸替换。
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