CN116218791B - 一种基于体内外交叉的狂犬病疫苗病毒的培养方法、及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供基于体内外交叉的狂犬病疫苗病毒的培养方法，包括体内筛选、体外筛选两个过程，重复2次，即仅需传4代，滴度明显提高，从实施例数据可以看出PM病毒滴度从2.5 logLD50/mL升至7.3 logLD50/mL以上，PV病毒滴度从2.0 logLD50/mL升至7.5 logLD50/mL以上，传代次数少、耗时短，成本低，毒种滴度明显提高；2）病毒滴度稳定性好，可以满足长期存放的需求；3）本发明制备的毒种PM株传代稳定性也进行了相应的验证，结果显示，对比E0代病毒毒种的基因序列（如SEQ ID NO 1所示），第11代毒种进行全基因序列（如SEQ ID NO 2所示）未发现有任何突变。

Description

一种基于体内外交叉的狂犬病疫苗病毒的培养方法、及应用
技术领域
本发明涉及一种基于体内外交叉的狂犬病疫苗病毒的培养方法、及应用，属于疫苗预防狂犬病技术领域。
背景技术
狂犬病（rabies）是由狂犬病病毒（rabies virus，RABV）引起的人兽共患病，据WHO统计，全球150多个国家和地区存在狂犬病，全球每年因狂犬病致死人数高达6万人。其中95%发生于亚洲和非洲，中国是狂犬病发病第二大国，仅次于印度。RABV专门侵染神经系统，人感染后一旦出现神经症状，致死率几乎100%，目前尚无有效治疗药物。目前国内兽用疫苗推广难度大，疫苗覆盖率低，传染源难控制，因此对于人用狂犬疫苗的需求居高不下。
狂犬病毒属于弹状病毒科（Rhabdoviridae）狂犬病毒属（Lyssavirus），是一种由大约12000个核苷酸组成的包膜型负链RNA病毒。病毒呈子弹状，长130-250nm，直径60-100nm，核衣壳呈螺旋对称，表面具有包膜，内含有单链RNA。病毒包膜包含糖基化的G蛋白，G蛋白上的树突可以结合在细胞上。基质（M）蛋白位于内病毒包膜内部，靠近里面的病毒核蛋白（N）紧紧地将病毒RNA结合在一起形成核衣壳核。这个核心和一个大的转录酶L蛋白以及磷酸化的P蛋白，是狂犬病毒核衣壳（RNP）。
目前市场上的人用狂犬病疫苗品种主要有四种：鸡胚、鸭胚疫苗，地鼠肾细胞原代培养疫苗，Vero细胞疫苗，人二倍体疫苗。其中，前两种疫苗产量限制，且有可能存在外源毒性因子的问题；第三种疫苗不能保证细胞基质本身存在的安全性和致瘤性问题，且需要严格控制其DNA残留量；第四种不含外源污染因子和致瘤性，且残留DNA无危险性，是WHO公认的金标准疫苗。以细胞为基质生产的狂犬病疫苗的制备过程主要是细胞培养、病毒增殖，然后收获病毒液、灭活、浓缩、纯化处理制备出半成品，最后制剂、冻干即得成品。
云南沃森在在中国专利公开号CN103468649A中公开了一种人用狂犬疫苗毒种在人二倍体细胞上的快速适应方法，将新鲜狂犬病毒接种人二倍体细胞上，带毒传代，传代12~15代，病毒滴度从第P1代的3.0 logLD50/mL升至P15代的7.0 logLD50/mL以上。北京天坛生物在中国专利公开号CN103397000A的专利中提供了一种狂犬病病毒人二倍体细胞适应株及其制备方法，是指一种狂犬病病毒aG株人二倍体细胞（2BS）适应株。浙江普康在中国专利公开号CN102093983A中是将狂犬病固定毒CTN-1V5株连续在人二倍体细胞（KMB17）中传代，并以终末稀释法筛选出滴度较高的病毒，从而获得适应于KMB17细胞并具有良好免疫原性和传代稳定性的狂犬病毒株，培育出可在KMB17细胞高效增殖的狂犬病疫苗毒种（CTN-DK株）。
但上述狂犬病疫苗存在如下几个问题：1）狂犬疫苗供不应求，尤其是人二倍体狂犬病疫苗，由于其不含外源污染因子、细胞无致瘤性、残留DNA无危险，故更具安全性，但其传代周期较长，达12-15代，病毒滴度才达至7.0 logLD50/mL；2）狂犬病疫苗为灭活苗，其抗原回收率低，故需要前期毒种的滴度较高；3）毒种在-80℃下保存，冻融后滴度会有所下降。
发明内容
本发明为了解决现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供了一种基于体内外交叉的狂犬病疫苗病毒的培养方法、及应用。
为解决上述技术问题，本发明提供一种基于体内外交叉的狂犬病疫苗病毒的培养方法，包括以下步骤：
S1体内筛选：将E0代狂犬病毒毒种在流水中融化、倍比稀释后，小鼠脑内接种，取发病小鼠鼠脑分离出病毒，对分离出的病毒进行滴度检测，符合滴度要求的记为E1代病毒；
S2体外筛选：
将体外筛选所用的细胞复苏后，在细胞瓶中进行消化、传代，35～37℃培养箱静置培养3-7天，至长成致密单层；
将E1代病毒离心处理后取上清按照MOI 0.001-0.1接种于细胞瓶中的单层细胞，补加细胞培养液至覆盖细胞表面，35～37℃培养箱中孵育1-2h；同时，取离心处理后的E1代病毒按照MOI 0.001-0.1接种于长满单层细胞的96孔板中用于细胞病变检测；
培养瓶中继续补加培养液至培养瓶体积的5-8%，培养3-5天；检测感染病毒细胞的比例，病毒感染比例低于80%的培养瓶淘汰；对于高于80%的培养瓶，弃去培养液，按照1:1进行再次传代，35～37℃培养箱静置培养2-3天，弃去细胞培养液后，加入1.5-2倍的病毒培养液，置于33～35℃培养箱中培养3-7天，间隔时间段检测病毒感染细胞的比例，对于感染时间最短、感染比例最高的细胞取上清液，置于-70度以下保存，记为E2代病毒；
S3将E2代病毒重复步骤S1获得E3代病毒，将E3代病毒重复步骤S2获得细胞上清液为E4代病毒；
S4保存E4代病毒，并将步骤S3的细胞消化成细胞悬液，1:1传代培养2-3天，取上清病毒液；
S5病毒提取：将E4代病毒和步骤S4传代培养后的上清病毒液合并，在2-8度条件下，与预冷的PEG溶液以2:1的比例混合、过夜，离心后收集病毒沉淀，加入0.01M PBS过夜溶解，离心得到病毒粗提液；将病毒粗提液于50～100KD的超滤浓缩管中浓缩，后过0.22μm过滤膜过滤，获得浓缩毒种；
S6向浓缩毒种中加入15-30%的牛血清，分装保存、备用。
进一步，用于体外筛选的细胞为Vero细胞、WI-38、MRC-5、2BS或KMB-17。
进一步，细胞培养液为含2～10%牛血清和0.01～0.1%谷氨酰胺的MEM培养液，pH为6.8～7.2；病毒培养液为含1～5%牛血清、0.2～2%人血白蛋白和0.01%～0.1%谷氨酰胺的MEM培养液，pH为7.5～8.0；PEG溶液的浓度为15～30%。
进一步，步骤S1中，小鼠为11-13g的KM小鼠，每每只注射毒种0.03mL，每个稀释度接种4-6只小鼠。
进一步，步骤S1中，小鼠脑内接种后，若3-4天发现小鼠死亡，则进行无菌取鼠脑进行病毒的滴度检测；若接种15天仍不发病或接种后3日内死亡的小鼠均淘汰。
进一步，E1代病毒的滴度不低于4.0 lg CCID50/mL。
进一步，狂犬病病毒毒种为PM株或PV株。
本发明还提供一种狂犬病疫苗的制备方法，将上述培养方法获得的浓缩毒种，制备成狂犬病疫苗。
本发明所达到的有益技术效果：
1）本发明提供的方法，方法简单易操作，仅传4代，传代次数少、耗时短，成本低，从实施例数据可以看出PM病毒滴度从2.5 logLD50/mL升至7.3 logLD50/mL以上，PV病毒滴度从2.0 logLD50/mL升至7.5 logLD50/mL以上，毒种滴度明显提高；2）对本发明制备的毒种进行长达2年的长期稳定性验证检测，结果表明，滴度仍然可以达到7.0 logLD50/mL以上，下降程度小，毒种滴度稳定，能满足生产长期储存需求；3）本发明制备的毒种PM株传代稳定性也进行了相应的验证，结果显示，对比E0代病毒毒种的基因序列（如SEQ ID NO 1所示），第11代毒种进行全基因序列（如SEQ ID NO 2所示）未发现有任何突变。
SEQ ID NO 1如下所示：
ATGGATGCCGACAAGATTGTGTTCAAAGTCAATAATCAGGTGGTCTCTTTGAAGCCTGAGATTATCGTGGATCAATATGAGTACAAGTACCCTGCCATCAAGGATTTGAAAAAGCCTTGTATCACCCTAGGGAAAGCCCCCGACTTGAACAAAGCATACAAATCAGTTTTATCAGGCATGAATGCCGCCAAACTTGATCCGGATGATGTATGCTCCTACTTGGCAGCAGCAATGCAGTTCTTTGAGGGGACATGTCCGGAAGACTGGACCAGCTATGGAATCCTGATTGCACGAAAAGGAGACAGGATCACCCCAAACTCTCTAGTGGAGATAAAGCGTACTGATGTAGAAGGGAATTGGGCTCTGACAGGAGGCATGGAATTGACAAGGGACCCCACTGTCTCTGAACATGCATCTTTAGTCGGTCTTCTCCTGAGTCTGTACAGGTTGAGCAAAATATCAGGACAGAACACTGGTAACTATAAGACAAACATTGCAGATAGGATAGAGCAGATTTTCGAGACAGCACCTTTTGTTAAGATCGTGGAACACCATACCCTAATGACAACTCACAAGATGTGTGCTAATTGGAGTACTATACCGAACTTCAGATTTTTGGCCGGAACCTACGACATGTTTTTCTCACGGATTGAGCATCTGTATTCGGCAATCAGAGTGGGCACAGTCGTCACCGCTTATGAAGACTGCTCAGGACTGGTATCGTTTACAGGGTTCATAAAGCAGATCAATCTCACCGCAAGGGAAGCAATACTATATTTCTTCCACAAGAACTTTGAGGAAGAGATAAGAAGAATGTTCGAGCCAGGGCAAGAGACAGCTGTTCCTCACTCTTATTTCATCCACTTCCGTTCACTAGGCTTGAGTGGGAAGTCTCCTTATTCATCGAATGCTGTCGGTCATGTGTTCAATCTCATTCACTTTGTTGGATGCTACATGGGTCAAGTCAGATCTCTAAATGCGACGGTTATTGCTGCATGTGCCCCTCATGAGATGTCTGTTCTAGGGGGCTATTTGGGAGAGGAATTCTTCGGAAAAGGGACATTTGAAAGAAGGTTCTTCAGAGACGAGAAAGAACTTCAAGAATATGAGGCGGCTGAACTAACAAAGACCGACGTGGCACTGGCAGATGACGGAACCGTCAACTCTGATGACGAGGACTATTTCTCCGGTGAAACCAGAAGTCCAGAAGCTGTCTATACTCGAATCATGATGAATGGAGGTCGACTGAAGAGATCTCATATACGGAGATATGTCTCAGTCAGTTCCAATCATCAAGCCCGTCCAAACTCATTCGCCGAATTTTTAAACAAGACGTATTCGAATGACTCATAAGGAGTTGATTGACAGGGTGCCGGAAATCTATAGATTGTATATATCCATCATGAAAAAAACTAACACTCCTCCTTTCAAACCATCCCAAATATGAGCAAGATCTTTGTTAATCCGAGTGCAATCAGAGCCGGTCTGGCCGATCTTGAGATGGCCGAAGAGACTGTTGATCTGATCAACAGAAACATAGAAGACAATCAGGCTCATCTCCAGGGAGAACCCATAGAAGTGGACAACCTCCCTGAGGACATGAAGCGACTTCACCTGGACGATGAAAAATCGTCCAACCTTGGTGAGATGGTTAGGGTGGGAGAAGGCAAGTATCGAGAGGACTTTCAGATGGATGAGGGAGAGGACCCCAACCTCCTGTTCCAATCGTACCTGGATAATGTCGGAGTCCAAATAGTCAGACAAATGAGGTCAGGAGAGAGATTCCTCAAGATATGGTCACAGACCATAGAGGAAATTGTATCCTATGTCACGGTCAACTTTCCTAACCCTCCAAGAAGGTCTTCGGAGGATAAATCAACCCAGACTACTGGCCGAGAGCTCAAGAAGGAGACAACGTCTGCTTTCTCTCAGAGAGAAAGCCAACCTTCGAAAGCTAGGATGGTGGCTCAAGTTGCCTCTGGTCCTCCAGCCCTTGAATGGTCAGCCGCCAATGAAGAAGATGATCTATCAGTAGAGGCTGAGATCGCTCATCAGATTGCTGAAAGCTTTTCCAAGAAGTACAAGTTTCCCTCCCGATCTTCAGGAATATTCTTGTATAATTTTGAGCAACTGAAGATGaACCTTGACGACATAGTTAAAGAGGCAAAAAATGTACCGGGCGTGACCCGTCTGGCCCATGATGGATCCAAAATCCCCCTGAGATGTGTACTGGGATGGGTCGCTTTGGCCAATTCCAAAAAATTCCAATTACTAGTCGAGGCTGACAAGCTAAGCAAAATCATGCAAGATGATTTGAATCGCTATACATCCTGCTAACCGAGTTTTCGAACTCAGTCCCTCCAGATAATGAAAACTGAGATGTTATGGAGTAGACATGAAAAAAACAGGCAACACCACTGATAAAATGAACGTTCTACGCAAGATAGTGAAAAAATGTAGGGATGAGGACACTCAAAAGCCCTCTCCTGTGTCAGCCCCTCCGGATGACGATGACCTGTGGCTTCCACCTCCTGAATATGTCCCGCTGAAAGAACTCACAAGCAAGAAGAACATGAGGAACTTTTGTGTCAACGGGGATGTTAAAGCGTGTAGCCCAAATGGTTACTCATTCAGGATTTTGCGGCACATTCTGAGATCATTCAACGAGATATACTCTGGGAATCATAGGATGATTGGGTTAGTCAAAGTTGTTGTTGGACTAGCTTTATCAGGAGCTCCAGTACCTGAGGGCATGAACTGGGTATACAAATTGAGGAGAACCCTTATATTCCAGTGGGCTGATTCCAGGGGCCCTCTTGAAGGGGAGGAGTTAGAATACTCTCAAGAGATCACTTGGGATGATGATACTGAATTCGTCGGATTGCAAATAAGAGTGAGCGCAAGACAATGTCATATTCAAGGCAGGATCTGGTGTATCAACACGAACTCGAGGGCATGTCAACTATGGTCTGACATGTCTCTTCAGACACAAAGGTCTGAAGAGGACAAAGACTCTTCTCTGCTTCTAGAATAATCAGATTATATCCTGCAAGTTTATCACTTGTTTACCTCTGGAGGAGAGAGCATACAGGCTTGACTCCGATCCTTGGGAGCAATAGAACAAAAAAACACACGTTATGGTGCCGTTAAATCGCTGCATTTTATCAAAGTCAAGTTGATAACCTTTACATTTTGAGCCTCTTGGATGTGAAAAAAACTATTAACATCCCTCAAAAGACTTAAGGAAAGATGGTTCCTCAGGTTCTTTTGTTTGTACCCCTTCTGGGTTTTTCGTTGTGTTTCGGGAAGTTCCCCATTTACACGATACCAGACGAACTTGGTCCCTGGAGCCCTATTGACATACACCATCTCAGCTGTCCAAATAACCTGGTTGTGGAGGATGAAGGATGTACCAACCTGTCCGAGTTCTCCTACATGGAACTCAAAGTGGGATACATCTTAGCCATCAAAGTGAACGGGTTCACTTGCACAGGTGTTGTGACAGAGGCAGAGACCTACACCAACTTTGTTGGTTATGTCACAACCACATTCAAGAGAAAGCATTTCCGCCCCACCCCAGACGCATGTAGAGCCGCGTATAACTGGAAGATGGCCGGTGACCCCAGATATGAAGAGTCCCTACACAATCCATACCCCGACTACCACTGGCTTCGAACTGTAAGAACCACCAAAGAGTCCCTCATTATCATATCCCCAAGTGTGACAGATTTGGACCCATATGACAAATCCCTTCACTCAAGGGTCTTCCCTGGCGGAAAGTGCTCAGGAATAACGGTGTCCTCTACCTACTGCTCAACTAACCATGATTACACCATTTGGATGCCCGAGAATCCGAGACCAAGCACACCTTGTGACATTTTTACCAATAGCAGAGGGAAGAGAGCATCCAAAGGGAACAAGACTTGCGGCTTTGTGGATGAAAGAGGCCTGTATAAGTCTCTAAAAGGAGCATGCAGGCTCAAGTTATGTGGAGTTCTTGGACTTAGACTTATGGATGGAACATGGGTCGCGATGCAAACATCAGATGAGACCAAATGGTGCCCTCCAGATCAGTTGGTGAATTTGCACGACTTTCGCTCAGACGAGATTGAGCATCTCGTTGTGGAGGAGTTAGTCAAGAAAAGAGAGGAATGTCTGGATGCATTAGAGTCCATCATGACCACCAAGTCAGTAAGTTTCAGACGTCTCAGTCACCTGAGaAAACTTGTCCCAGGGTTTGGAAAAGCATATACCATATTCAACAAAACCTTGATGGAGGCTGATGCTCACTACAAGTCAGTCCGGACCTGGAATGAGATCATCCCCTCAAAAGGGTGTTTGAAAGTTGGAGGAAGGTGCCATCCTCATGTGAACGGGGTGTTTTTCAATGGTATAATATTAGGGCCTGACGGCCATGTCCTAATCCCAGAGATGCAATCATCCCTCCTCCAGCAACATATGGAGTTGTTGAAATCTTCAGTTATCCCCCTGATGCACCCCCTGGCAGACCCTTCTACAGTTTTCAAAGAAGGTGATGAGGCTGAGGATTTTGTTGAAGTTCACCTCCCCGATGTGTACAAACAGATCTCAGGGGTTGACCTGGGTCTCCCGAACTGGGGAAAGTATGTATTGATGACTGCAGGGGCCATGATTGGCCTGGTGTTGATATTTTCCCTAATGACATGGTGCAGAAGAGCCAATCGACCAGAATCGAAACAACGCAGTTTTGGAGGGACAGGGAGGAATGTGTCAGTCACTTCCCAAAGCGGAAAAGTCATACCTTCATGGGAATCATATAGGAGTGGAGGTGAGATCAGACTGTGAAGGCCGGTCATCCTTTTGACGATTCCAGTCCCGAGGATAACCTCCTCTCGGGATTGGGGGGAATCTTTGGATCCAGTAGTCCTCCTTGAACTCCGTCCAACAGAGTAGATTCAAGAGTCATAAGACTTTCATTAATCATTTCAGTTGATCAGACATGGTCGTGTAGATTCTCTTAA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SEQ ID NO 2如下所示：
ATGGATGCCGACAAGATTGTGTTCAAAGTCAATAATCAGGTGGTCTCTTTGAAGCCTGAGATTATCGTGGATCAATATGAGTACAAGTACCCTGCCATCAAGGATTTGAAAAAGCCTTGTATCACCCTAGGGAAAGCCCCCGACTTGAACAAAGCATACAAATCAGTTTTATCAGGCATGAATGCCGCCAAACTTGATCCGGATGATGTATGCTCCTACTTGGCAGCAGCAATGCAGTTCTTTGAGGGGACATGTCCGGAAGACTGGACCAGCTATGGAATCCTGATTGCACGAAAAGGAGACAGGATCACCCCAAACTCTCTAGTGGAGATAAAGCGTACTGATGTAGAAGGGAATTGGGCTCTGACAGGAGGCATGGAATTGACAAGGGACCCCACTGTCTCTGAACATGCATCTTTAGTCGGTCTTCTCCTGAGTCTGTACAGGTTGAGCAAAATATCAGGACAGAACACTGGTAACTATAAGACAAACATTGCAGATAGGATAGAGCAGATTTTCGAGACAGCACCTTTTGTTAAGATCGTGGAACACCATACCCTAATGACAACTCACAAGATGTGTGCTAATTGGAGTACTATACCGAACTTCAGATTTTTGGCCGGAACCTACGACATGTTTTTCTCACGGATTGAGCATCTGTATTCGGCAATCAGAGTGGGCACAGTCGTCACCGCTTATGAAGACTGCTCAGGACTGGTATCGTTTACAGGGTTCATAAAGCAGATCAATCTCACCGCAAGGGAAGCAATACTATATTTCTTCCACAAGAACTTTGAGGAAGAGATAAGAAGAATGTTCGAGCCAGGGCAAGAGACAGCTGTTCCTCACTCTTATTTCATCCACTTCCGTTCACTAGGCTTGAGTGGGAAGTCTCCTTATTCATCGAATGCTGTCGGTCATGTGTTCAATCTCATTCACTTTGTTGGATGCTACATGGGTCAAGTCAGATCTCTAAATGCGACGGTTATTGCTGCATGTGCCCCTCATGAGATGTCTGTTCTAGGGGGCTATTTGGGAGAGGAATTCTTCGGAAAAGGGACATTTGAAAGAAGGTTCTTCAGAGACGAGAAAGAACTTCAAGAATATGAGGCGGCTGAACTAACAAAGACCGACGTGGCACTGGCAGATGACGGAACCGTCAACTCTGATGACGAGGACTATTTCTCCGGTGAAACCAGAAGTCCAGAAGCTGTCTATACTCGAATCATGATGAATGGAGGTCGACTGAAGAGATCTCATATACGGAGATATGTCTCAGTCAGTTCCAATCATCAAGCCCGTCCAAACTCATTCGCCGAATTTTTAAACAAGACGTATTCGAATGACTCATAAGGAGTTGATTGACAGGGTGCCGGAAATCTATAGATTGTATATATCCATCATGAAAAAAACTAACACTCCTCCTTTCAAACCATCCCAAATATGAGCAAGATCTTTGTTAATCCGAGTGCAATCAGAGCCGGTCTGGCCGATCTTGAGATGGCCGAAGAGACTGTTGATCTGATCAACAGAAACATAGAAGACAATCAGGCTCATCTCCAGGGAGAACCCATAGAAGTGGACAACCTCCCTGAGGACATGAAGCGACTTCACCTGGACGATGAAAAATCGTCCAACCTTGGTGAGATGGTTAGGGTGGGAGAAGGCAAGTATCGAGAGGACTTTCAGATGGATGAGGGAGAGGACCCCAACCTCCTGTTCCAATCGTACCTGGATAATGTCGGAGTCCAAATAGTCAGACAAATGAGGTCAGGAGAGAGATTCCTCAAGATATGGTCACAGACCATAGAGGAAATTGTATCCTATGTCACGGTCAACTTTCCTAACCCTCCAAGAAGGTCTTCGGAGGATAAATCAACCCAGACTACTGGCCGAGAGCTCAAGAAGGAGACAACGTCTGCTTTCTCTCAGAGAGAAAGCCAACCTTCGAAAGCTAGGATGGTGGCTCAAGTTGCCTCTGGTCCTCCAGCCCTTGAATGGTCAGCCGCCAATGAAGAAGATGATCTATCAGTAGAGGCTGAGATCGCTCATCAGATTGCTGAAAGCTTTTCCAAGAAGTACAAGTTTCCCTCCCGATCTTCAGGAATATTCTTGTATAATTTTGAGCAACTGAAGATGaACCTTGACGACATAGTTAAAGAGGCAAAAAATGTACCGGGCGTGACCCGTCTGGCCCATGATGGATCCAAAATCCCCCTGAGATGTGTACTGGGATGGGTCGCTTTGGCCAATTCCAAAAAATTCCAATTACTAGTCGAGGCTGACAAGCTAAGCAAAATCATGCAAGATGATTTGAATCGCTATACATCCTGCTAACCGAGTTTTCGAACTCAGTCCCTCCAGATAATGAAAACTGAGATGTTATGGAGTAGACATGAAAAAAACAGGCAACACCACTGATAAAATGAACGTTCTACGCAAGATAGTGAAAAAATGTAGGGATGAGGACACTCAAAAGCCCTCTCCTGTGTCAGCCCCTCCGGATGACGATGACCTGTGGCTTCCACCTCCTGAATATGTCCCGCTGAAAGAACTCACAAGCAAGAAGAACATGAGGAACTTTTGTGTCAACGGGGATGTTAAAGCGTGTAGCCCAAATGGTTACTCATTCAGGATTTTGCGGCACATTCTGAGATCATTCAACGAGATATACTCTGGGAATCATAGGATGATTGGGTTAGTCAAAGTTGTTGTTGGACTAGCTTTATCAGGAGCTCCAGTACCTGAGGGCATGAACTGGGTATACAAATTGAGGAGAACCCTTATATTCCAGTGGGCTGATTCCAGGGGCCCTCTTGAAGGGGAGGAGTTAGAATACTCTCAAGAGATCACTTGGGATGATGATACTGAATTCGTCGGATTGCAAATAAGAGTGAGCGCAAGACAATGTCATATTCAAGGCAGGATCTGGTGTATCAACACGAACTCGAGGGCATGTCAACTATGGTCTGACATGTCTCTTCAGACACAAAGGTCTGAAGAGGACAAAGACTCTTCTCTGCTTCTAGAATAATCAGATTATATCCTGCAAGTTTATCACTTGTTTACCTCTGGAGGAGAGAGCATACAGGCTTGACTCCGATCCTTGGGAGCAATAGAACAAAAAAACACACGTTATGGTGCCGTTAAATCGCTGCATTTTATCAAAGTCAAGTTGATAACCTTTACATTTTGAGCCTCTTGGATGTGAAAAAAACTATTAACATCCCTCAAAAGACTTAAGGAAAGATGGTTCCTCAGGTTCTTTTGTTTGTACCCCTTCTGGGTTTTTCGTTGTGTTTCGGGAAGTTCCCCATTTACACGATACCAGACGAACTTGGTCCCTGGAGCCCTATTGACATACACCATCTCAGCTGTCCAAATAACCTGGTTGTGGAGGATGAAGGATGTACCAACCTGTCCGAGTTCTCCTACATGGAACTCAAAGTGGGATACATCTTAGCCATCAAAGTGAACGGGTTCACTTGCACAGGTGTTGTGACAGAGGCAGAGACCTACACCAACTTTGTTGGTTATGTCACAACCACATTCAAGAGAAAGCATTTCCGCCCCACCCCAGACGCATGTAGAGCCGCGTATAACTGGAAGATGGCCGGTGACCCCAGATATGAAGAGTCCCTACACAATCCATACCCCGACTACCACTGGCTTCGAACTGTAAGAACCACCAAAGAGTCCCTCATTATCATATCCCCAAGTGTGACAGATTTGGACCCATATGACAAATCCCTTCACTCAAGGGTCTTCCCTGGCGGAAAGTGCTCAGGAATAACGGTGTCCTCTACCTACTGCTCAACTAACCATGATTACACCATTTGGATGCCCGAGAATCCGAGACCAAGCACACCTTGTGACATTTTTACCAATAGCAGAGGGAAGAGAGCATCCAAAGGGAACAAGACTTGCGGCTTTGTGGATGAAAGAGGCCTGTATAAGTCTCTAAAAGGAGCATGCAGGCTCAAGTTATGTGGAGTTCTTGGACTTAGACTTATGGATGGAACATGGGTCGCGATGCAAACATCAGATGAGACCAAATGGTGCCCTCCAGATCAGTTGGTGAATTTGCACGACTTTCGCTCAGACGAGATTGAGCATCTCGTTGTGGAGGAGTTAGTCAAGAAAAGAGAGGAATGTCTGGATGCATTAGAGTCCATCATGACCACCAAGTCAGTAAGTTTCAGACGTCTCAGTCACCTGAGaAAACTTGTCCCAGGGTTTGGAAAAGCATATACCATATTCAACAAAACCTTGATGGAGGCTGATGCTCACTACAAGTCAGTCCGGACCTGGAATGAGATCATCCCCTCAAAAGGGTGTTTGAAAGTTGGAGGAAGGTGCCATCCTCATGTGAACGGGGTGTTTTTCAATGGTATAATATTAGGGCCTGACGGCCATGTCCTAATCCCAGAGATGCAATCATCCCTCCTCCAGCAACATATGGAGTTGTTGAAATCTTCAGTTATCCCCCTGATGCACCCCCTGGCAGACCCTTCTACAGTTTTCAAAGAAGGTGATGAGGCTGAGGATTTTGTTGAAGTTCACCTCCCCGATGTGTACAAACAGATCTCAGGGGTTGACCTGGGTCTCCCGAACTGGGGAAAGTATGTATTGATGACTGCAGGGGCCATGATTGGCCTGGTGTTGATATTTTCCCTAATGACATGGTGCAGAAGAGCCAATCGACCAGAATCGAAACAACGCAGTTTTGGAGGGACAGGGAGGAATGTGTCAGTCACTTCCCAAAGCGGAAAAGTCATACCTTCATGGGAATCATATAGGAGTGGAGGTGAGATCAGACTGTGAAGGCCGGTCATCCTTTTGACGATTCCAGTCCCGAGGATAACCTCCTCTCGGGATTGGGGGGAATCTTTGGATCCAGTAGTCCTCCTTGAACTCCGTCCAACAGAGTAGATTCAAGAGTCATAAGACTTTCATTAATCATTTCAGTTGATCAGACATGGTCGTGTAGATTCTCTTAA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附图说明
图1本发明一实施例中采用动物法检测PM株各代病毒滴度结果图谱。
图2本发明一实施例中采用直接免疫荧光法检测PM株各代病毒滴度结果图谱。
图3本发明一实施例中采用动物法检测PV株各代病毒滴度结果图谱。
图4本发明一实施例中采用直接免疫荧光法检测PV株各代病毒滴度结果图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
下面结合实施例对本发明专利进一步说明。
本发明中，试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
本发明提供一种基于体内外交叉的狂犬病疫苗病毒的培养方法，包括以下步骤：
S1体内筛选：将E0代狂犬病毒毒种在流水中融化、倍比稀释后，小鼠脑内接种，取发病小鼠鼠脑分离出病毒，对分离出的病毒进行滴度检测，对于滴度不低于4.0 lg CCID50/mL的病毒记为E1代病毒；
小鼠为11-13g的KM小鼠，每每只注射毒种0.03mL，每个稀释度接种4-6只小鼠；小鼠脑内接种后，若3-4天发现小鼠死亡，则进行无菌取鼠脑进行病毒的滴度检测；若接种15天仍不发病或接种后3日内死亡的小鼠均淘汰。
S2体外筛选：
将体外筛选所用的细胞复苏后，在细胞瓶中进行消化、传代，35～37℃培养箱静置培养3-7天，至长成致密单层；用于体外筛选的细胞为Vero细胞、WI-38、MRC-5、2BS或KMB-17。
将E1代病毒离心处理后取上清按照MOI 0.001-0.1接种于细胞瓶中的单层细胞，补加细胞培养液至覆盖细胞表面，35～37℃培养箱中孵育1-2h；同时，取离心处理后的E1代病毒按照MOI 0.001-0.1接种于长满单层细胞的96孔板中用于细胞病变检测；
培养瓶中继续补加培养液至培养瓶体积的5-8%，培养3-5天；检测感染病毒细胞的比例，病毒感染比例低于80%的培养瓶淘汰；对于高于80%的培养瓶，弃去培养液，按照1:1进行再次传代，35～37℃培养箱静置培养2-3天，弃去细胞培养液后，加入1.5-2倍的病毒培养液，置于33～35℃培养箱中培养3-7天，间隔时间段检测病毒感染细胞的比例，对于感染时间最短、感染比例最高的细胞取上清液，置于-70度以下保存，记为E2代病毒；
S3将E2代病毒重复步骤S1获得E3代病毒，将E3代病毒重复步骤S2获得细胞上清液为E4代病毒；
S4保存E4代病毒，并将步骤S3的细胞消化成细胞悬液，1:1传代培养2-3天，取上清病毒液；
S5病毒提取：将E4代病毒和步骤S4传代培养后的上清病毒液合并，在2-8度条件下，与预冷的PEG溶液以2:1的比例混合、过夜，离心后收集病毒沉淀，加入0.01M PBS过夜溶解，离心得到病毒粗提液；将病毒粗提液于50～100KD的超滤浓缩管中浓缩，后过0.22μm过滤膜过滤，获得浓缩毒种；
S6向浓缩毒种中加入15-30%的牛血清，分装保存、备用。
上述过程中，细胞培养液为含2～10%牛血清和0.01～0.1%谷氨酰胺的MEM培养液，pH为6.8～7.2；病毒培养液为含1～5%牛血清、0.2～2%人血白蛋白和0.01%～0.1%谷氨酰胺的MEM培养液，pH为7.5～8.0；PEG溶液的浓度为15～30%。
并以PM株和PV株两株狂犬病病毒毒株为例进行验证本发明培养方法的技术效果。
采用动物法和直接免疫荧光法对各代狂犬病毒滴度检测，结果如表1和表2、图1-图4所示。
表1 PM株各代病毒滴度检测表
表2 PV株各代病毒滴度检测表
从表1-2，图1-图4可以看出，对于PM株，采用不同的方法检测均显示，狂犬病病毒滴度，从E0代的2.5 logLD50/mL升至7.3 logLD50/mL以上；对于PV株，采用不同的方法检测均显示，狂犬病病毒滴度，从E0代的2.0 logLD50/mL升至7.5 logLD50/mL以上。
实施例2 PM株和PV株病毒滴度稳定性检测
对采用上述培养方法获得的两株病毒浓缩病毒分别在第6个月、12个月、24个月检测其滴度，结果如表3、表4所示。
表4 PM株筛选后浓缩毒种存放不同时间的滴度检测
表4 PV株筛选后浓缩毒种存放不同时间的滴度检测结果
从表3可以看出，PM株在两年内定期滴度检测，滴度均稳定在7.0 logLD50/mL以上，由此可知，采用本发明的培养方法获得的狂犬病病毒，其滴度稳定性好。从表4可以看出，PV株在两年内定期滴度检测，滴度均稳定在7.0 logLD50/mL以上，由此可知，采用本发明的培养方法获得的狂犬病病毒，其滴度稳定性好。
综上所述，采用本发明提高的狂犬病病毒培养方法：1.仅传代4次，PM株滴度上升至7.3 logLD50/mL，PV株滴度上升至7.5 logLD50/mL，滴度提高明显，且传代次数少、耗时短、大大降低了生产成本；2.通过2年的稳定性验证，两个毒株的滴度稳定性较好，能满足长期存放的需求；3.通过基因测序显示，对于PM株，传代11代后，无基因突变。
以上已以较佳实施例公布了本发明，然其并非用以限制本发明，凡采取等同替换或等效变换的方案所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

Claims (5)

1.一种基于体内外交叉的狂犬病疫苗病毒的培养方法，其特征在于：
S1体内筛选：将E0代狂犬病毒毒种在流水中融化、倍比稀释后，小鼠脑内接种，取发病小鼠鼠脑分离出病毒，对分离出的病毒进行滴度检测，符合滴度要求的记为E1代病毒；
S2体外筛选：
将体外筛选所用的细胞复苏后，在细胞瓶中进行消化、传代，35～37℃培养箱静置培养3-7天，至长成致密单层；用于体外筛选的细胞为Vero细胞、WI-38、MRC-5、2BS或KMB-17；
将E1代病毒离心处理后取上清按照MOI 0.001-0.1接种于细胞瓶中的单层细胞，补加细胞培养液至覆盖细胞表面，35～37℃培养箱中孵育1-2h；同时，取离心处理后的E1代病毒按照MOI 0.001-0.1接种于长满单层细胞的96孔板中用于细胞病变检测；
培养瓶中继续补加培养液至培养瓶体积的5-8%，培养3-5天；检测感染病毒细胞的比例，病毒感染比例低于80%的培养瓶淘汰；对于高于80%的培养瓶，弃去培养液，按照1:1进行再次传代，35～37℃培养箱静置培养2-3天，弃去细胞培养液后，加入1.5-2倍的病毒培养液，置于33～35℃培养箱中培养3-7天，间隔时间段检测病毒感染细胞的比例，对于感染时间最短、感染比例最高的细胞取上清液，置于-70度以下保存，记为E2代病毒；
S3将E2代病毒重复步骤S1获得E3代病毒，将E3代病毒重复步骤S2获得细胞上清液为E4代病毒；
S4保存E4代病毒，并将步骤S3的细胞消化成细胞悬液，1:1传代培养2-3天，取上清病毒液；
S5病毒提取：将E4代病毒和步骤S4传代培养后的上清病毒液合并，在2-8度条件下，与预冷的PEG溶液以2:1的比例混合、过夜，离心后收集病毒沉淀，加入0.01M PBS过夜溶解，离心得到病毒粗提液；将病毒粗提液于50～100KD的超滤浓缩管中浓缩，后过0.22μm过滤膜过滤，获得浓缩毒种；
S6向浓缩毒种中加入15-30%的牛血清，分装保存、备用；
狂犬病病毒毒种为PM株或PV株；细胞培养液为含2～10%牛血清和0.01～0.1%谷氨酰胺的MEM培养液，pH为6.8～7.2；病毒培养液为含1～5%牛血清、0.2～2%人血白蛋白和0.01%～0.1%谷氨酰胺的MEM培养液，pH为7.5～8.0；PEG溶液的浓度为15～30%。
2.根据权利要求1所述的基于体内外交叉的狂犬病疫苗病毒的培养方法，其特征在于：步骤S1中，小鼠为11-13g的KM小鼠，每每只注射毒种0.03mL，每个稀释度接种4-6只小鼠。
3.根据权利要求1所述的基于体内外交叉的狂犬病疫苗病毒的培养方法，其特征在于：步骤S1中，小鼠脑内接种后，若3-4天发现小鼠死亡，则进行无菌取鼠脑进行病毒的滴度检测；若接种15天仍不发病或接种后3日内死亡的小鼠均淘汰。
4.根据权利要求1所述的基于体内外交叉的狂犬病疫苗病毒的培养方法，其特征在于：E1代病毒的滴度不低于4.0 lg CCID50/mL
5.一种狂犬病疫苗的制备方法，其特征在于：将权利要求1-4任一项所述的培养方法获得的浓缩毒种，制备成狂犬病疫苗。
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狂犬病毒鼠脑复壮后的典型形态恢复及感染细胞内的形态发生学;韩小虎;邹啸环;江禹;宣华;涂长春;;微生物学报(第06期);全文 *
韩小虎 ; 邹啸环 ; 江禹 ; 宣华 ; 涂长春 ; .狂犬病毒鼠脑复壮后的典型形态恢复及感染细胞内的形态发生学.微生物学报.2008,(第06期),全文. *

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