CN108929864B - 用于预防鸡传染性法氏囊病的致弱病毒及用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种致弱的鸡传染性法氏囊病病毒，其保藏名称：传染性法氏囊病病毒IBDV/1F，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：V201834，保藏日期：2018年7月3日。本发明还同时提供了上述致弱的鸡传染性法氏囊病病毒的用途：用于制备疫苗，该病毒株不引起鸡的法氏囊损伤，又可以诱导产生高滴度的针对鸡传染性法氏囊病病毒的抗体；该疫苗能抵御强毒株的攻击，且对鸡只的发育没有影响。

Description

用于预防鸡传染性法氏囊病的致弱病毒及用途
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一株能有效预防传染性法氏囊病病毒感染的致弱病毒及 其用途。
背景技术
鸡传染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease，IBD)是由传染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus，IBDV)引起的一种主要危害3～6周龄雏鸡的急性、高度接触性传染病， 主要侵害病鸡的中枢免疫器官——法氏囊，以法氏囊发炎、坏死和萎缩为主要病理特征，法 氏囊内B淋巴细胞严重受损并导致严重的免疫抑制。
IBDV病毒粒子无囊膜，呈正二十面体对称，基因组由A、B两个dsRNA节段组成，编码VP1～5共五种病毒蛋白，其中，VP1、VP2和VP3是公认的结构蛋白。VP1参与基因组 dsRNA的连接和基因组的复制，是RNA依赖的RNA聚合酶，在病毒粒子中含量仅为3％左 右；VP2构成了病毒粒子的外表面，VP2是IBDV的主要中和抗原，在病毒粒子中含量超过 50％，但它的核苷酸序列容易在疫苗的选择压力下发生突变；VP3还具有dsRNA结合功能， 参与病毒粒子的组装，协助VP1蛋白介导的病毒基因组复制，行使类似核衣壳蛋白的功能， 组成了病毒粒子的外表面，约占病毒总蛋白量的35％。VP2蛋白特定位置的氨基酸序列被报 道与IBDV的毒力有关，VP1也被报道参与决定IBDV的毒力。
因病毒毒力的不同，鸡群感染后死亡率差异较大，但即使耐过鸡群也会发生显著的免疫 抑制，这对鸡群的计划免疫造成严重影响，增加鸡传染病防控的难度。IBDV已传遍我国各 地，某些地区发病率高达80％。当前，免疫接种预防依然是防控IBD最主要的方法，但开发 的IBD疫苗存在以下问题：活疫苗仍然可以导致一定的法氏囊损伤，影响鸡只生长发育，降 低肉料比；在免疫选择压力下，变异毒株不断涌现，疫苗研发滞后。
目前已有的致弱毒株都是改变或修饰IBDV病毒的中和抗原VP2蛋白的氨基酸序列而达 到致弱的目的，这具有改变病毒免疫原性不能与流行的亲本毒株完全契合的风险以及存在与 其他毒株重组产生新毒株的可能性。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一株IBDV致弱病毒株，该毒株不引起法氏囊损伤，又可 以诱导产生高滴度的抗体，以及抵御强毒株的攻击并且对鸡只的发育没有任何影响。
为了解决上述技术问题，本发明提供一株致弱的传染性法氏囊病病毒，保藏名称：传染 性法氏囊病病毒IBDV/1F，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉 大学，保藏编号：CCTCC NO：V201834，保藏日期：2018年7月3日。
本发明还同时提供了上述致弱的传染性法氏囊病病毒的用途：用于制备疫苗，该病毒株 不引起鸡的法氏囊损伤，又可以诱导产生高滴度的针对鸡传染性法氏囊病病毒的抗体。
本发明还同时提供了上述致弱的传染性法氏囊病病毒的另一种用途：该疫苗能抵御强毒 株的攻击，且对鸡只的发育没有影响。
本发明的毒株IBDV/1F可以在其病毒蛋白VP1的C末端融合表达一个小分子标签Flag， 与野生型毒株相比，在感染鸡源细胞DF-1时，利用Flag抗体可以检测到融合蛋白的存在， 且在相同位置还可以检测到VP1的表达(图1)。与此同时，本发明对IBDV/1F的基因组进 行抽提，经RT-PCR扩增与DNA测序发现，在vp1基因的3'端存在编码Flag标签的序列(图2)。
将IBDV/1F和其亲本毒株IBDV/wt(104PFU)通过点眼的方式接种于2周龄的SPF鸡(5 只/组，2只阴性对照)，隔离饲养2周后无鸡只死亡，收集各组鸡只的体重、法氏囊重量，结 果可见，接种IBDV/wt的鸡只法氏囊发生了明显的萎缩，接种IBDV/1F的鸡只法氏囊除表面 有少许点状出血外与阴性对照组相比无明显差异(图3)；通过比较各组间法氏囊与鸡只体重 比值及法氏囊指数发现，接种IBDV/wt组鸡只的法氏囊发生了明显的萎缩而接种IBDV/1F组 鸡只法氏囊无明显变化(图3a和3b)，并且接种IBDV/wt组的鸡只体重与接种IBDV/1F和 阴性组相比也是显著下降；而且在各组法氏囊中通过Western blotting也检测到了对应的病毒 蛋白的存在。进一步，发明人又进行了IBDV免疫抑制实验，3周龄SPF鸡(接种前采集血 液分离血清作为阴性血清)通过滴鼻点眼的方式分别接种IBDV/wt和IBDV/1F(每组5只， 2×104TCID50/只)，阴性对照接种相同体积的DMEM，24小时后所有鸡只再通过滴鼻点眼的 方式接种NDV(LaSota株，106EID50)，分别在NDV疫苗接种后7天和14天分别采集鸡只 血液分析血清，测定血清中抗体的血凝抑制效价，结果显示接种IBDV/1F对于NDV疫苗的免疫没有影响，而接种IBDV/wt后显著抑制鸡体产生针对NDV的中和抗体(图5)。
本发明的毒株IBDV/1F对临床分离而来的亲本毒株A片段的编码序列不做任何改变，完 全保留了亲本毒株的免疫原性，仅在亲本毒株的B片段编码蛋白VP1的C末端融合表达一条 8个氨基酸的Flag标签而得到的致弱毒株(上述内容可从图1中明确得知)，因此本发明相对 于现有的致弱毒株而言，具有完全保留临床分离毒株免疫原性的技术优势。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1重组病毒IBDV/1F和野生型病毒IBDV/wt感染DF-1细胞时的Western blotting检测；
图2将重组病毒IBDV/1F的基因组抽提后进行RT-PCR扩增B片段部分，经测序证实在 vp1基因的3'端存在Flag标签序列。
图3接种IBDV/wt、B87、IBDV/1F与阴性鸡只(DMEM)法氏囊的外观；
a为接种B87、IBDV/wt与阴性鸡只(DMEM)的法氏囊大小的对比；
b为阴性鸡只(DMEM)与接种IBDV/1F、B87的法氏囊大小的对比；
图4接种B87、IBDV/1F和阴性鸡只(DMEM)的体重(a)、囊重比(b)、囊指数(c) 和法氏囊中对应病毒蛋白的检测(d)。
图5接种IBDV/wt、B87与阴性鸡只(DMEM)血清中抗体滴度消长规律(a)，及接种 21天后强毒攻击后鸡只生存曲线(b)。
图6接种B87、IBDV/1F与阴性鸡只(DMEM)24小时后分别再接种NDV疫苗(La Sota株)7和14天后血清中血凝抑制抗体效价分析。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1、IBDV致弱毒株的获取：
将临床分离的亲本毒株IBDV/wt(Genbank获取号：MF083701和MF083702)在鸡胚成纤维细胞系DF-1细胞上扩繁后，抽提其基因组RNA构建IBDV反向遗传学操作系统。通过 基因工程的方法将编码Flag标签的核苷酸序列融合到vp1基因的下游，将获得的质粒转染293T细胞进行IBDV拯救，转染72h之后的细胞上清在DF-1细胞上传代3次以后，反复冻 融3次裂解细胞，离心去除细胞碎片，最终获得IBDV致弱毒株IBDV/1F。
IBDV致弱毒株IBDV/1F进行了保藏，保藏信息如下：
保藏名称：传染性法氏囊病病毒IBDV/1F，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏 地址：中国武汉武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：V201834，保藏日期：2018年7月3日。
实验1、感染鸡胚成纤维细胞系DF-1
铺于6孔板中的单层DF-1细胞分别接种IBDV/wt和IBDV/1F(MOI＝1)，同时设立阴性 对照孔(Mock)。接种(接毒)后的培养条件为：37℃，5％二氧化碳，100％湿度；接毒24h后收集细胞总蛋白进行Western blotting分析，如图1所示：
在孵育Flag抗体时接种IBDV/1F的细胞样品中在95kD附近有明显的条带被检测到；
在孵育VP1抗体时接种IBDV/wt和IBDV/1F的细胞样品在95kD附近均有明显条带被检 测到，且接种IBDV/1F的细胞样品中VP1条带位置略微高于接种IBDV/wt细胞样品中VP1的条带位置；
同时在接种IBDV/wt和IBDV/1F的细胞样品均有VP3和VP4病毒蛋白被检测到；
GAPDH为内参照；
说明重组融合表达VP1-Flag的IBDV拯救成功；即，本发明获得的IBDV致弱毒株IBDV/1F具有感染DF-1细胞的能力，并可以使小标签Flag在病毒蛋白VP1的C末端融合表达。
实验2、对IBDV/1F的基因组进行抽提及DNA测序
将重组病毒IBDV/1F在DF-1细胞上传代25次后，利用超滤管(Milipore)浓缩病毒后 进行蛋白酶K消化(55℃作用1h)、酚氯仿抽提和无水乙醇沉淀IBDV基因组dsRNA，通过RT-PCR实验扩增IBDV的B片段全长，将获得的DNA片段委托苏州金维智生物科技有限公 司进行双脱氧法测序，结果发现在vp1编码序列的3'端成功融合了编码Flag标签的核苷酸序列(图2)。
综上，可得知：重组IBDV/1F传代25次后在其基因组B节段vp1基因的下游仍融合有编码Flag标签的核苷酸序列，说明遗传稳定。
实验3、IBDV/wt和IBDV/1F的致病力实验
将亲本毒株IBDV/wt通过点眼的方式接种于1周龄的SPF雏鸡6只，每只接种量为104PFU/0.2ml/次，共1次；设立IBDV中等毒力的疫苗株B87对照5只，每只通过点眼接种103ELD50/0.2ml/次，共1次；同时设立阴性对照鸡3只，每只接种DMEM 0.2ml/次，共1次。 所有鸡只常规隔离饲养14天后未出现死亡鸡只，剖杀后取法氏囊，比较各组法氏囊的大小。如图3a所示，与对照组相比，IBDV/wt接种后导致雏鸡法氏囊发生明显的萎缩，同时接种B87也导致雏鸡法氏囊萎缩。
进一步，我们又对重组毒株IBDV/1F进行了动物实验，通过点眼的方式将IBDV/1F接种 于1周龄的SPF雏鸡5只，每只接种量为104PFU/0.2ml/次，共1次；设立IBDV中等毒力的疫苗株B87对照5只，每只通过点眼接种103ELD50/0.2ml/次，共1次；同时设立阴性对照鸡 2只，每只接种DMEM 0.2ml/次，共1次。所有鸡只常规隔离饲养14天后无死亡，称量鸡只 体重后剖杀取法氏囊，发现IBDV/1F不引起雏鸡法氏囊萎缩(图3b)，电子天平称量各组法 氏囊的重量，统计各组鸡只体重、囊重比和囊指数(囊重比＝法氏囊重量/鸡只体重，囊指数＝接种组囊重比/对照组囊重比)。结果显示，IBDV/1F接种后不影响鸡只生长(图4a)，也不引起雏鸡法氏囊萎缩(图4b和4c)，同时在从法氏囊抽提的蛋白中通过Western blotting也检测 到病毒蛋白的存在(图4d)。
综上，可得知：将亲本毒和重组毒以及疫苗株B87接种1周龄雏鸡后发现，重组毒IBDV/1F 不影响鸡只生长，也不引起法氏囊萎缩。
实验4、IBDV/1F免疫保护性实验
1周龄SPF雏鸡30只，平均分成3组(接种前采集血液分离血清作为阴性血清)，3组分别通过点眼接种B87，103ELD50/0.2ml/只、IBDV/1F，104PFU/0.2ml/只和DMEM，0.2ml。 鸡只常规隔离饲养，分别于接种后7，14和21天采集血清，通过ELISA试剂盒(IDEXX) 测定血清中抗体效价，接种IBDV/1F鸡只血清中平均效价分别是680，1840和2240，接种 B87鸡只血清中的平均效价分别是880，2160和2400，统计分析后发现，接种B87组鸡只血 清效价平均值略高于接种IBDV/1F组，但差异不显著(p>0.1)(图5a)。免疫21天后，所有 鸡只使用IBDV强毒株BC6/85进行攻毒实验，每只鸡通过点眼接种2×104EID50，共1次，攻 毒后每日观察鸡只死亡情况，连续观察10天，统计死亡率，绘制生存曲线，由结果发现， IBDV/1F与B87一样可以提供对强毒株攻击的保护(图5b)。
实验5、免疫抑制实验
1周龄SPF鸡15只，平均分成3组(接种前采集血液分离血清作为阴性血清)，分别通过点眼的方式接种B87(103ELD50/0.2ml/只，接种1次)、IBDV/1F(104PFU/0.2ml/只，接种 1次)和DMDM(0.2ml/只，接种1次)，24h后，所有鸡只都通过滴鼻接种NDV疫苗(La Sota 株，106EID50/只)1次。分别于接种NDV疫苗后7天和14天，采集鸡只血液分离血清，微 量法测定血清中NDV血凝抑制效价。结果显示，与对照组相比接种IBDV/1F对于NDV疫苗 的免疫没有影响，说明IBDV/1F接种不引起雏鸡发生免疫抑制(图6)。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不 限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导 出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (2)

1.致弱的鸡传染性法氏囊病病毒，其特征是保藏名称：传染性法氏囊病病毒IBDV/1F，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：V201834，保藏日期：2018年7月3日。
2.如权利要求1所述的致弱的鸡传染性法氏囊病病毒的用途，其特征是：用于制备疫苗，该病毒株不引起鸡的法氏囊损伤，又可以诱导产生高滴度的针对鸡传染性法氏囊病病毒的抗体。
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