CN102533676B - 新城疫病毒重组疫苗a-ndv-lx/i4及构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种表达基因VII型F和HN重组新城疫弱毒疫苗A-NDV-LX/I4，它的保藏号是CGMCCNO：3844。本发明构建的致弱病毒A-NDV-LX/I4免疫试验鸡两周后，鸡血清HI的平均效价为2⁷；LaSota免疫组攻毒4天后，SPF鸡喉气管和泄殖腔的棉拭样品的病毒分离率分别为10%和30%；商品鸡喉气管和泄殖腔的棉拭样品的病毒分离率分别为40%和20%；V4免疫组攻毒4天后，SPF鸡喉气管和泄殖腔的棉拭样品的病毒分离率分别为30%和10%；商品鸡喉气管和泄殖腔的棉拭样品的病毒分离率分别为30%和20%，与常规疫苗相比，本发明重组弱毒疫苗能够提供更加坚实的免疫保护效率。

Description

新城疫病毒重组疫苗A-NDV-LX/I4及构建方法

技术领域

本发明涉及应用反向遗传技术和免疫学技术，产生一种表达基因VII型F和HN重组新城疫弱毒疫苗A-NDV-LX/I4，用于制造疫苗。

背景技术

反向遗传操作技术(Reverse genetics manipulation technique)是指在体外通过构建RNA病毒的感染性分子克隆，将病毒基因组RNA逆转录成cDNA，在DNA分子水平上对其进行各种体外人工操作，由病毒基因组cDNA和各种辅助蛋白来组装新的RNA病毒的一项研究技术[Neumann G， Whitt M A，Kawaoka Y. Adecadeafter the generation of a negative-sense RNA virus from cloned cDNA-what have we learned？Journal of General Virology，2002，83(11)：2635-2662.]，也叫全长感染性cDNA克隆技术，又常被称为“病毒拯救”。由于最终“拯救”出的RNA病毒来源于cDNA克隆，因此，可通过中间过程中人为加入的DNA环节，在DNA水平上对RNA病毒基因组进行各种体外人工操作，如进行基因突变、基因敲除(缺失)、基因插入、基因置换和基因互补(即构建嵌合病毒)等改造，解决了对RNA病毒基因组难以操作这一难题，极大地方便了人们进行病毒各基因的功能、致病机理和病毒病防制策略的研究，同时为新型疫苗的研制和开发提供了新的思路[Huang，Z.，Elankumaran，S.，Panda，A.& Samal，S.K.Recombinant Newcastle disease virus as a vaccinevector.Poultry Science，2003，82：899-906.]。新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)是新城疫(ND)的病原体。ND是鸡的高度接触性传染病，可引起鸡100％发病和死亡。新城疫病毒在分类上属单链负股RNA病毒目(Mononegavirales)，副黏病毒科(Paramyxoviridae)、副黏病毒亚科(Paramyxovirinae)的禽腮腺炎病毒属(Avulavirus)的成员。病毒有囊膜，基因组为单股、负链、不分节段的RNA病毒，基因组结构模式为：3′-NP-P-M-F-HN-L-5′，依次编码6种结构蛋白：核衣壳蛋白(NP)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素-神经氨酸酶蛋白(HN)和大分子蛋白(L)即核蛋白(NP)，P，M，F，HN和L蛋白。另外两个蛋白，V和W蛋白由P基因编辑后表达[Alexander JA.Newcastle disease virus and otheravian paramyxoviruses.In：Swayne，D.，Glisson，J.R.，Jackwood，M.W.，Pearson，J.E.，Reed，W.M.(Eds.).A Laboratory Manual for the Isolation and Identification of Avian Pathogens，fourth edAmerican Association of Avian Pathologists，Kennett Square，PA 1998.]。

根据对鸡的毒力，NDV毒株可以为强毒(Velogenic)、中等毒力(mesogenic)和弱毒(Lentogen)。已开展广泛的试验来阐明病毒致病性的分子决定因素[HuangZ，Krishnamurthy S，Panda A，Samal SK.Newcastle disease virus V protein is associated withviral pathogenesis and functions as an alpha interferon antagonist.Journal of virology，2003，77(16)：8676-8685.]。大部分研究是关于F和HN蛋白对致病性的作用，研究结果一致认为F蛋白裂解位点处的氨基酸序列是病毒毒力的主要决定因素[Seal BS.Nucleotide and predicted amino acid sequence analysis of the fusion protein andhemagglutinin-neuraminidase protein genes among Newcastle disease virus isolates.Phylogeneticrelationships among the Paramyxovirinae based on attachment glycoprotein sequences.FunctIntegr Genomics，2004，4(4)：246-257.]。NDV毒力差异的分子基础主要决定于F0蛋白的蛋白酶裂解位点的氨基酸序列，强毒的裂解位点有聚碱性氨基酸序列，其模式基序为¹¹²GR/K-R-Q-K/R-R-F¹¹⁷；弱毒的裂解位点则缺少聚碱性氨基酸序列，其模式基序为¹¹²-E/G-R/K-Q-E/G-R-L¹¹⁷。在感染过程中，NDV HN蛋白首先与敏感细胞表面的唾液酸受体结合，这种结合作用可以引起吸附蛋白HN和融合蛋白F构象发生变化；于是后者的融合肽被释放出来，使病毒的包膜与细胞膜发生融合[McGinnes，L.W.，Sergel，T.，Chen，H.，Hamo，L.，Schwertz，S.，Li，D.& Morrison，T.G.Mutational Analysis of the Membrane Proximal Heptad Repeat of the Newcastle Disease VirusFusion Protein.Virology，2001，289：343-352.]，强毒F蛋白的裂解位点为多个碱性氨基酸连续排列，可被机体多个组织器官的多种蛋白酶裂解，因此，可导致全身性感染。弱毒株在该区域的碱性氨基酸则被中性氨基酸所代替，使相应序列由R/K¹¹²-R-Q-K/R¹¹⁵-R-L¹¹⁷变为G/E¹¹²-R-Q-G/E¹¹⁵-R-L¹¹⁷，这种F蛋白前体仅能被有限的组织或器官分泌的胰样蛋白酶裂解，感染性很低或无感染性。因此，F蛋白是NDV毒力和致病性的主要决定因素[Peeters，B.P.，de Leeuw，O.S.，Koch，G.&Gielkens，A.L. Rescue of Newcastle disease virus from cloned cDNA：Evidence that cleavabilityof the fusion protein is a major determinant for virulence.Journal of Virology，1999，73(6)：5001-5009.]。不少研究已经通过反向遗传技术将弱毒株F蛋白裂解位点突变成强毒株的裂解位点而使弱毒株变成了强毒株，这已被这些重组病毒的致病性试验结果所证实；反之亦然。然而关于HN蛋白对毒力的作用的结果还没有定论。在一些试验中，弱毒骨架中插入编码强毒HN蛋白的嵌合体病毒致病性有了明显增加，例如根据MDT和ICPI指标判断重组病毒的致病性从弱毒增强为中等毒力；而在另一些试验中用相同的试验方法，在弱毒的骨架中置换强毒HN蛋白，但是重组病毒的毒力没有上升[de Leeuw OS，Koch G， Hartog L，Ravenshorst N，Peeters BP.Virulenceof Newcastle disease virus is determined by the cleavage site of the fusion protein and by both thestem region and globular head of the haemagglutinin-neuraminidase protein.The Journal ofgeneral virology，2005，86(Pt 6)：1759-1769.]。有人认为，弱毒ND病毒载体骨架用于构建重组病毒，很难提供合适的表达强毒HN蛋白基因的全部信息[Estevez C，King D，Seal B，Yu Q.Evaluation of Newcastle disease virus chimeras expressing theHemagglutinin-Neuraminidase protein of velogenic strains in the context of a mesogenicrecombinant virus backbone.Virus research，2007，129(2)：182-190.]。

自1926年发现新城疫(ND)以来，ND已发生了四次大的流行，而且每一次流行都有不同基因型的毒株出现，尤其是90年代之后出现了新的基因VII型NDV，给我国的养禽业造成了巨大的经济损失。在控制疫病的过程中，使用疫苗是最有效最经济的方法，新城疫的疫苗已使用了几十年，由于ND疫苗的广泛使用，此病已基本上得到了较好的控制，但是临床上非典型ND的发生十分普遍，ND仍然成为威胁养禽业的主要疾病之一，也就是说，常规的疫苗对于NDV强毒的攻击并不能提供理想的保护。从近十年来的ND流行特点来看，临床上所分离到的NDV毒株大多数属于基因VII型[Liu XF，Wan HQ，Ni XX，Wu YT & Liu WB.Pathotypical and genotypical characterization of strain of Newcastle disease isolated fromoutbreaks in chicken and goose flocks in some regions of China during 1985-2001.Archives ofVirology，2003，148(7)：1387-1403.]，而常规的ND疫苗株的基因型主要为I和II型(如V4、LaSota等)，因此，在遗传距离上当前NDV分离株与常规ND疫苗株相差较远。

2000年黄勇等在发病的鹅群中，成功分离到了基因VII型新城疫强毒ZJ1株，并进行了全基因组测序，登录号为AF431744[Huang Y，Wang HQ，Liu H Q，Wu YT& Liu XF.Genomic sequence of an isolate of Newcastle disease virus isolated from an out breakin geese：a novel six nucleotide insertion in the non-coding region of the nucleoprotein gene.Archives of Virology，2004，149：1445-1457.]。在此基础上，2005年胡顺林等建立了NDV强毒株的反向遗传操作平台，成功拯救出了鹅源强毒ZJ1株，并对该毒株进行了致弱，但是获救病毒的EID₅₀和HA效价均较低，不适合于大规模的生产[胡顺林，孙庆，吴艳涛，刘秀梵.用反向遗传技术致弱基因VIId型鹅源新城疫病毒ZJ1株.微生物学报，2007，47(2)：197-200.]。

Huang等人分别以弱毒株LaSota和强毒株Beaudette C(BC)为骨架，通过HN基因置换而构建了两株重组嵌合病毒rlaSoBCHN和rBCLaSoHN[Huang Z，Elankumaran S，Yunus AS，Samal SK.A recombinant Newcastle disease virus(NDV)expressingVP2 protein of infectious bursal disease virus (IBDV)protects against NDV and IBDV.Journal ofvirology，2004，78(18)：10054-10063.]。rlaSoBCHN是用弱毒株LaSota的HN置换了骨架病毒BCHN的重组嵌合病毒。致病性试验结果表明，rlaSoBCHN的毒力比骨架病毒有显著上升，而rBCLaSoHN的毒力比骨架病毒有明显下降，而且重组嵌合病毒的组织嗜性与HN的来源有关，这说明HN是影响NDV毒力的一个重要决定因子[Huang Z，Elankumaran S，Panda A，Samal SK.Recombinant Newcastle disease virusas a vaccine vector.Poultry science，2003，82(6)：899-906.]。但是Wakamatsu等人用BC强毒株的HN置换LaSota骨架病毒而得到的重组嵌合病毒，其致病指数或对鸡致病的严重程度与LaSota相比均未改变[Wakamatsu N，King DJ，Seal BS，Samal SK，Brown CC.The pathogenesis of Newcastle disease：a comparison of selected Newcastle diseasevirus wild-type strains and their infectious clones.Virology，2006，353(2)：333-343.]。Estevez等人以中毒株Anhinga为骨架病毒，用嗜内脏和嗜神经强毒株的HN进行置换而得到的重组嵌合病毒，其毒力与骨架病毒相比也没有发生明显改变[Estevez C，KingD，Seal B，Yu Q.Evaluation of Newcastle disease virus chimeras expressing theHemagglutinin-Neuraminidase protein of velogenic strains in the context of a mesogenicrecombinant virus backbone.Virus research，2007，129(2)：182-190.]。

NDV/LX株是我们从健康鸡群中分离到的一株NDV弱毒。初步研究表明，NDV/LX具有良好的免疫原性，能在呼吸道和消化道很好的复制，诱导产生高滴度的特异抗体和粘膜免疫应答。NDV/LX病毒的ICPI值为0.12，MDT为110h，按照OIE标准测得HA效价10.5log2。基因VII型强毒分离株JS-5-05-Go分离自发病鸭群，其F和HN基因序列号分别为EU044798、EU044816，其ICPI和MDT分别是1.91和46小时，HA效价平均为8log2。

发明内容

本发明的第一个目的在于发明一种表达基因VII型F和HN重组新城疫弱毒疫苗，从而解决当前所用疫苗株与流行株基因型不一致的问题。

本发明表达基因VII型F和HN重组新城疫弱毒疫苗A-NDV-LX/I4，于2010年5月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC NO：3844。

本发明的第二个目的在于发明一种表达基因VII型F和HN重组新城疫弱毒疫苗A-NDV-LX/I4的构建方法：

本发明在建立鸡源新城疫病毒NDV/LX株(CGMCC NO：3843)的反向遗传操作平台基础上，将中国主要流行的NDV基因VII型分离株JS-5-05-Go的囊膜糖蛋白基因F基因的强毒裂解位点裂解为弱毒位点，再将JS-5-05-Go的致弱的囊膜糖蛋白基因F基因和HN基因片段与NDV/LX株基因组的对应部分进行替换，拯救构建出致弱的表达基因VII型F和HN重组新城疫弱毒疫苗A-NDV-LX/I4。

本发明利用反向遗传技术成功拯救出了基因I型骨架替换上基因VII型流行毒株JS-5-05-Go致弱的F基因和HN基因，该病毒具有弱毒和在鸡胚上具有较高的繁殖滴度的特性，适合于疫苗的大规模生产，另外，该重组致弱毒株A-NDV-LX/I4的F蛋白和HN蛋白为基因VII型与当前我国NDV流行株的基因型相一致，因此，同常规疫苗(基因I和II型)相比，重组致弱毒株A-NDV-LX/I4在控制当前新城疫的发病和流行方面显示出了广阔的应用前景。

本发明所述新城疫弱毒疫苗A-NDV-LX/I4的构建方法如下：

1)构建重组质粒pA-NDV-LX/I4，构建含有分离株NDV/LX的F基因和HN基因的质粒pLI4，将分离株JS-5-05-Go致弱的F基因和HN基因替换到质粒pLI4上，用Sal I和Spe I将质粒mTh1上的酶切片段替换到质粒pLI4中，获得质粒FP；将质粒FP上裂解位点突变的F基因和HN基因替换NDV/LX株基因组的对应部分，获得质粒pA-NDV-LX/I4；

2)重组致弱毒株A-NDV-LX/I4的拯救，将质粒PA-NDV-LX/I4与表达NDVZJ1毒株NP、P和L基因的pCI-NP、pCI-P和pCI-L三个真核表达质粒共转染BSR-T7/5细胞，转染18h后加入终浓度为10％的SPF鸡胚尿囊液，转染60h后将转染样品接种9～11日龄SPF鸡胚，即获得表达基因VII型F和HN重组新城疫弱毒疫苗A-NDV-LX/I4；

3)重组致弱毒株A-NDV-LX/I4的免疫保护效率的测定，将A-NDV-LX/I4株与骨架病毒NDV/LX、供体病毒JS-5-05-Go株[Hu，ZL，Hu，SL，Meng C，Wang，XQ，Zhu，J，Liu，XF.Generation of a genotype VII Newcastle disease virusvaccine candidate with high yield in embryonated chicken eggs.″Avian diseases 55(3)：391-397.)]和常规疫苗株进行免疫保护效率的比较。

经过囊膜糖蛋白基因的替换和F基因裂解位点的突变，成功拯救出一株毒价高且高度致弱的表达基因VII型F和HN重组新城疫弱毒疫苗A-NDV-LX/I4株。

经试验表明：本发明构建的致弱病毒A-NDV-LX/I4免疫试验鸡两周后，鸡血清HI的平均效价为2⁷；La Sota免疫组攻毒4天后，SPF鸡喉气管和泄殖腔的棉拭样品的病毒分离率分别为10％和30％；商品鸡喉气管和泄殖腔的棉拭样品的病毒分离率分别为40％和20％；V4免疫组攻毒4天后，SPF鸡喉气管和泄殖腔的棉拭样品的病毒分离率分别为30％和10％；商品鸡喉气管和泄殖腔的棉拭样品的病毒分离率分别为30％和20％，上述病毒的分离率均显著高于A-NDV-LX/I4免疫组，从而证明：与常规疫苗相比，重组弱毒疫苗能够提供更加坚实的免疫保护效率。

附图说明

图1NDV/LX株全长克隆prLX构建模式图。

图2重组质粒p LI4构建模式图。

图3F蛋白裂解位点突变模式图。

图4重组质粒pA-NDV-LX/I4构建模式图。

具体实施方式

本发明表达基因VII型F和HN重组新城疫弱毒疫苗A-NDV-LX/I4，于2010年5月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC NO：3844。

实施例一、NDV/LX株全长克隆prLX构建。

构建模式如图1所示。

步骤一：NDV/LX株的获得

从健康家禽肠道分离到一批新城疫病毒弱毒株，对其生物学特性：血凝价、ICPI、EID50进行分析，在这些弱毒株中筛选出血凝价高、复制能力强的疫苗候选株；并对候选株进行免疫原性分析，免疫2周龄SPF鸡，免疫后测定血清中抗新城疫病毒的效价以及消化道和呼吸道粘膜免疫水平，最终获得能在呼吸道和消化道很好的复制，诱导产生高滴度的特异抗体和粘膜免疫应答的新城疫弱毒株NDV/LX(基因I型新城疫病毒弱毒NDV/LX株)。

通过EID50测定，获得10^8.7EID50/0.1mL NDV/LX病毒，ICPI值为0.12，MDT为110h。

本发明基因I型新城疫病毒弱毒NDV/LX株，于2010年5月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC NO：3843。

步骤二：NDV/LX株基因组的修饰

设计8对引物用于扩增NDV/LX株基因组全长序列，并进行测序，每个片段大小约2000bp左右，引物序列如下：

用8对引物分别构建阳性质粒P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7和P8，利用目的片段两端添加的酶切位点酶切，将质粒P8中目的基因片段克隆到TVT7R(0.0)载体(由美国Alabama大学L. Andrew Ball教授惠赠)中，构建质粒T8。质粒P1目的片段两端添加的酶切位点将基因片段克隆到T8载体中，构建质粒T18。质粒P5、P6和P7相互连接构建质粒P567，Spe I和mlu I酶切胶回收567片段，并与T18连接，构建质粒T3-2。利用质粒P2、P3、P4经目的片段两端添加的酶切位点，将三个片段在pCR2.1T载体中依次相连，进而构建了质粒P234，利用Sac II和Spe I酶切胶回收234片段，与T3-2连接，构建基因I型NDV/LX株病毒全基因组克隆prLX。

步骤三：NDV/LX的拯救

生物材料准备：

质粒：La Sota株的pCI-NP、pCI-P、pCI-L真核表达质粒[胡顺林，孙庆，吴艳涛，刘秀梵.用反向遗传技术致弱基因VIId型鹅源新城疫病毒ZJ1株.微生物学报，2007，47(2)：197-200.]由扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室构建、保存。

1、共转染

将La Sota株pCI-NP、pCI-P和pCI-L 3个真核表达质粒与含有NDV/LX基因组cDNA全长的转录载体(prLX)共转染BSR-T7/5细胞，转染方法同上，60h后将转染样品用封口膜(parafilm)封好，转移到-70℃低温冰箱反复冻融2次，然后将转染细胞轻轻刮下，与细胞上清充分混合后接种9～11日龄SPF鸡胚，每个样品接种3枚，0.4mL/枚，37℃孵育。定时照胚，弃去24h内死亡胚。取出24h后死亡胚置于4℃充分冷却，待鸡胚血管收缩后收集尿囊液。

2、HA和HI的测定

收集的尿囊液均按OIE标准进行HA测定，所用的红细胞为新鲜制备的1％鸡红细胞。HA和HI试验中均以NDV/LX母本毒株为阳性对照做同样检测。HA和HI检测均为阳性的尿囊液样品用无菌PBS作10^-4稀释后继续接种SPF鸡胚，每个稀释度接种3枚，0.2mL/枚，按上述方法培养后收集尿囊液同样做HA和HI检测。

3、RT-PCR验证获救病毒

将HA和HI检测均为阳性的尿囊液在SPF鸡胚上传两代后，收集尿囊液抽提病毒的RNA，用于RT-PCR反应，用引物M1和M2扩增NDV/LX M基因区域长度约为1.0kb的片段，M基因ORF内的966位核苷酸有一个G→A的突变，从而证明病毒的基因组源于转录载体prLX。

引物序列为：

M1：5’-ACAAGACACAGGGGACGGGAAGAAG-3’(SEQ ID NO.17)

M2：5’-AGTTGAAGGGATTGTATTTGGCA-3’(SEQ ID NO.18)。

实施例二

构建步骤一：构建重组质粒pA-NDV-LX/I4

1、构建含有分离株NDV/LX的F基因和HN基因的质粒用于扩增的引物序列如下：

QDr2F：5’-GCTCGAGACTCGGTATTCATCACCACCTAT-3’(SEQ ID NO.19)   Xho I

LXrg2R：5’-CGTCTCGGTCTACCTCCACATCAATAGTGAC-3’(SEQ ID NO.20) BsmB I

QDr3F：5’-TACTTGAAGACGTAGACCCGAAGA-3’(SEQ ID NO.21)         Bbs I

QDr3R：5’-GTCGACACAGATCATTATTTAGTGTCATGG-3’(SEQ ID NO.22)   Sal I

LX3F2：5’-GTCGACIACTTATAGTTAGTTCGCCTG-3’(SEQ ID NO.23)      Sal I

5’-CGTCTCGTCGAGATATCAAGATTGCCTGTCAC  A-3’(SEQ ID

LXrg3R：                                                      BsmB I

NO.24)

LXrg4F  5-ACGTCGACTGAGCTTGGGAATGTCAACAACTC-3(SEQ ID NO.25)    Sal I

LXrg4R  5-CAGTTGACTCAACCGGCTAGACCTGGCTTC-3(SEQ ID NO.26)      Spe I

以含有NDV/LX株基因组全长的克隆prLX作模板，用引物QDr2F和LXrg2R扩增分离株NDV/LX株基因组3547-3935nt之间的片段FH2；用引物QDr3F和QDr3R扩增NDV/LX株基因组3930-4450nt之间的片段FH3A；用引物LX3F2和LXrg3R扩增NDV/LX株基因组4457-5937nt之间的片段FH3B；FH3A和FH3B两片段分别在3′端和5′端有Sal I酶切位点；用引物LXrg4F/R扩增NDV/LX株基因组5933-8157nt的片段P4；

再将克隆出的FH3A和FH3B两片段在质粒pCR2.1(购于美国英杰生命技术有限公司上海办事处)载体中通过Sal I酶切位点相连成FH3；然后，将FH2、FH3和P4质粒用其末端的限制性内切酶依次相连的片段亚克隆到pCR2.1T载体中，获得质粒pLI4；重组质粒p LI4构建模式如图2。

2、将分离株JS-5-05-Go致弱的F基因和HN基因替换质粒pLI4相应基因生物材料准备：

mTh1质粒：扬州大学农业部畜禽传染病实验室保存和构建[Hu，ZL，Hu，SL，Meng C，Wang，XQ，Zhu，J，Liu，XF.Generation of a genotype VII Newcastledisease virus vaccine candidate with high yield in embryonated chickeneggs.″Avian diseases55(3)：391-397.)]。

mTh1质粒突变方法参照胡顺林[胡顺林，孙庆，吴艳涛，张艳梅，刘秀梵.用反向遗传技术致弱基因VIId型鹅源新城疫病毒ZJI株.微生物学报，2007(2)：197-200]的方法进行，如图3，通过引物经Overlap PCR方法，将分离株JS-5-05-Go[Hu，ZL，Hu，SL，Meng C，Wang，XQ，Zhu，J，Liu，XF.Generation of a genotype VII Newcastledisease virus vaccine candidate with high yield in embryonated chicken eggs.″Avian diseases 55(3)：391-397.)]的F基因裂解位点处的核苷酸进行突变，从而使相应编码的氨基酸由R¹¹²-R-Q-K¹¹⁵-R-F¹¹⁷变为弱毒特征的氨基酸序列：G¹¹²-R-Q-G¹¹⁵-R-L¹¹⁷；

用Sal I和Spe I将质粒mTh1上的酶切片段替换到质粒pLI4中，获得质粒FP；

3、将质粒FP上裂解位点突变的F基因和HN基因替换NDV/LX株基因组的对应部分

将质粒FP上AVR II和Spe I的酶切片段替换到prLX中，获得质粒pA-NDV-LX/I4；构建模式如图4。

步骤二：重组致弱病毒A-NDV-LX/I4株的拯救

生物材料准备：

质粒：表达NDV ZJ1毒株的NP、P和L基因的真核表达质粒(pCI-NP、pCI-P和pCI-L)由扬州大学农业部畜禽传染病重点开发实验室自行构建。[胡顺林，孙庆，吴艳涛，刘秀梵.用反向遗传技术致弱基因VIId型鹅源新城疫病毒ZJ1株.微生物学报，2007，47(2)：197-200.]。

BSR-T7/5细胞：购自哈尔滨兽医研究所。

1、共转染与HI鉴定

将NDV ZJ1毒株的pCI-NP、pCI-P和pCI-L 3个真核表达质粒与含有NDV基因组cDNA全长的转录载体(pA-NDV-LX/I4)共转染BSR-T7/5细胞，转染方法参照SuperFect transfection Reagent说明书进行。转染样品于60h后接种9～11日龄SPF鸡胚，120h后将所接种鸡胚冻死，收取鸡胚尿囊液进行HA测定，其效价为9log2，且能被针对NDVHN蛋白的单克隆抗体(6B1)所抑制。

2、获救病毒的PCR鉴定

将HA和HI检测均为阳性的尿囊液在SPF鸡胚上传两代后，收集尿囊液，抽提RNA用于RT-PCR反应，扩增F基因长度约为527bp大小的片段，回收目的片段进行测序鉴定，扩增片段的测序结果显示F基因为基因VII型JS-5-05-Go株序列且裂解位点为弱毒位点：G¹¹²-R-Q-G¹¹⁵-R-L¹¹⁷。用于扩增的引物序列为：

F11：5’-GGTAGAAGAGTCTGGATCC-3’(SEQ ID NO.27)

F22：5’-TGGTTGCAGCAATGCTCTCCT-3’(SEQ ID NO.28)

转染后尿囊液检测为阳性的病毒命名为A-NDV-LX/I4。重组新城疫疫苗A-NDV-LX/I4，于2010年5月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC NO：3844。

步骤三、重组致弱毒株A-NDV-LX/I4的生物学特性鉴定

1、MDT与ICPI的测定

用灭菌生理盐水分别连续10倍(10^-3、10^-4......10^-7)递增稀释致弱病毒A-NDV-LX/I4，每个稀释度接种5只9～11日龄SPF鸡胚，37℃孵育5d，计算病毒的MDT；致弱病毒的尿囊液以灭菌生理盐水10倍稀释后经脑内接种10只1日龄的SPF鸡，按OIE标准方法计算病毒的ICPI。

病毒5个稀释度的接种鸡胚在120h内没有发生死亡，说明该毒株的MDT值大于120h；尿囊液经脑内接种SPF鸡后，接种鸡没有发生死亡，ICPI的测定值仅为0.16，表明获救病毒的毒力完全符合弱毒株的标准。

2、细胞感染性试验

重组病毒株A-NDV-LX/I4株作10^-4稀释后，接种鸡胚成纤维细胞48h后，细胞没有出现病变，而母本病毒JS-5-05-Go感染细胞则出现了拉网和脱落现象，形成了明显的空斑。说明拯救后病毒的F蛋白在CEF上不能有效裂解，进一步表明获救病毒的毒力已明显减弱。

步骤四：重组致弱毒株A-NDV-LX/I4的免疫效力试验

将1日龄商品蛋鸡和SPF鸡随机分组，10只/组，进行隔离饲养，2周龄时经滴鼻点眼分别接种致弱毒株A-NDV-LX/I4、V4和LaSota，10⁶EID₅₀/只；滴鼻点眼接种A-NDV-LX/I4弱毒苗，同时设PBS接种组作为对照。每只试验鸡于免疫后4周用10⁶ELD₅₀的新城疫VII型强毒I4株攻毒。攻毒后连续观察14天，统计发病和死亡情况，并于攻毒后第4d采集气管与泄殖腔棉拭样品用于病毒的分离。

A-NDV-LX/I4、LaSota及V4免疫组鸡均未发病，而攻毒对照组鸡在攻毒后5d全部死亡(见表1)。SPF鸡的情况大致相同。

表1免疫效力试验结果

虽然攻毒后三种疫苗的免疫保护率均达到100％，但在病毒分离率上，各免疫组的情况却不相同，LaSota、V4免疫组鸡的病毒分离率明显高于A-NDV-LX/I4免疫组(见表2)，另外，对照组鸡攻毒后喉气管和泄殖腔的病毒分离率均为10/10。

表2攻毒后第4d病毒分离结果

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  扬州大学

 

<120>  新城疫病毒重组疫苗A-NDV-LX/I4及构建方法

 

<130> 

 

<160>  28   

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  36

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

cgtctcgtat agggaccaaa cagagaatcc gtaagg                               36

 

 

<210>  2

<211>  34

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

tgactagttg tgttcgcgtc tgtgacctgg tttc                                 34

 

 

<210>  3

<211>  30

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  3

ggcatcatca acgtctgact caacaacagg                                      30

 

 

<210>  4

<211>  31

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  4

cgtctcggtc tacctccaca tcaatagtga c                                    31

 

 

<210>  5

<211>  31

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  5

gaagactaga cccgaagagc ccgttggtca a                                    31

 

 

<210>  6

<211>  32

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  6

cgtctcgtcg agatatcaag attgcctgtc ac                                   32

 

 

<210>  7

<211>  32

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  7

acgtcgactg agcttgggaa tgtcaacaac tc                                   32

 

 

<210>  8

<211>  30

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  8

cagttgactc aaccggctag acctggcttc                                      30

 

 

<210>  9

<211>  26

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  9

gcattgccga aatatccaat accctc                                          26

 

 

<210>  10

<211>  28

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  10

gactctaaga actctatcaa gagacggt                                        28

 

 

<210>  11

<211>  26

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  11

tacgacccta tcaccaatct gagcat                                          26

 

 

<210>  12

<211>  26

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  12

cctcattatc ctctgtatgc acgcca                                          26

 

 

<210>  13

<211>  29

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  13

tggaaatgga gattgggcca gtctgtgta                                       29

 

 

<210>  14

<211>  30

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  14

ccacgcgtcg agtgcaagag actaatagtt                                      30

 

 

<210>  15

<211>  31

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  15

tcactagtca atcacgacgg gtcacaccaa c                                    31

 

 

<210>  16

<211>  34

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  16

cgtctctacc caccaaacaa agatttggtg aatg                                 34

 

 

<210>  17

<211>  25

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  17

acaagacaca ggggacggga agaag                                           25

 

 

<210>  18

<211>  23

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  18

agttgaaggg attgtatttg gca                                             23

 

 

<210>  19

<211>  30

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  19

gctcgagact cggtattcat caccacctat                                      30

 

 

<210>  20

<211>  31

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  20

cgtctcggtc tacctccaca tcaatagtga c                                    31

 

 

<210>  21

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  21

tacttgaaga cgtagacccg aaga                                            24

 

 

<210>  22

<211>  30

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  22

gtcgacacag atcattattt agtgtcatgg                                      30

 

 

<210>  23

<211>  27

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  23

gtcgactact tatagttagt tcgcctg                                         27

 

 

<210>  24

<211>  32

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  24

cgtctcgtcg agatatcaag attgcctgtc ac                                   32

 

 

<210>  25

<211>  32

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  25

acgtcgactg agcttgggaa tgtcaacaac tc                                   32

 

 

<210>  26

<211>  30

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  26

cagttgactc aaccggctag acctggcttc                                      30

 

 

<210>  27

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  27

ggtagaagag tctggatcc                                                  19

 

 

<210>  28

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  28

tggttgcagc aatgctctcc t                                               21

 

 

Claims (1)

1.一种新城疫重组致弱毒株A-NDV-LX/I4，其保藏号是CGMCC NO：3844。

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