CN101376880A - 表达狂犬病病毒糖蛋白(GP蛋白)的重组新城疫LaSota弱毒疫苗株 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种表达狂犬病病毒糖蛋白(GP蛋白)的重组新城疫LaSota弱毒疫苗，更具体地，重组新城疫LaSota弱毒疫苗是rL－ERAGP。本发明还公开了制备所述重组新城疫LaSota弱毒疫苗的方法和该重组新城疫LaSota弱毒疫苗在制备预防狂犬病和新城疫的双价疫苗中的应用。

Description

表达狂犬病病毒糖蛋白(GP蛋白)的重组新城疫LaSota弱毒疫苗株

技术领域

本发明涉及重组病毒疫苗领域，更具体地，本发明涉及一种表达狂犬病病毒糖蛋白(GP蛋白)的重组新城疫LaSota弱毒疫苗，更具体地，重组新城疫LaSota弱毒疫苗是rL-ERAGP。本发明还公开了制备所述重组新城疫LaSota弱毒疫苗的方法和该重组新城疫LaSota弱毒疫苗在制备预防狂犬病和新城疫的双价疫苗中的应用。

背景技术

狂犬病即疯狗症，又名恐水症，是由狂犬病病毒引起的、侵害中枢神经系统的急性病毒性人兽共患性传染病。几乎所有的温血动物都对狂犬病病毒易感。犬类动物在传播人狂犬病过程中起主要作用，是本病的主要宿主之一。此外，猫、浣熊、狐狸和蝙蝠等也会患病并传播病毒。狂犬病传播途径主要是通过动物咬伤后，唾液中的狂犬病病毒经破损皮肤侵入机体。此外，还可通过消化道、呼吸道以及动物密切接触等途径传播。狂犬病是迄今为止人类病死率最高的急性传染病，一旦发病，病死率可高达100％^[1]。据世界卫生组织报道全世界每年约有3.5万～5万人死于狂犬病，主要分布在亚洲、非洲和拉丁美洲等发展中国家。中国也是受狂犬病危害最为严重的国家之一。

近年来，随着中国家养宠物数量猛增，狂犬病正在重新成为严重危害我国公共卫生的重大疫病。因此，防治狂犬病的形势变得更加严峻。狂犬病的预防主要通过疫苗免疫的方式进行。狂犬病疫苗种类繁多，效果不一。科研工作者一直不间断地对狂犬病疫苗进行改进和创新，取得了丰硕的成果，但仍然存在很多不足^[2～4]。

1885年，法国科学家巴斯德首次用兔脑脊髓制备成狂犬病弱毒疫苗，应用于人体治疗并获得了成功^[6]。我国目前生产ERA株和Flury株活疫苗。狂犬病弱毒疫苗在体内的增殖过程与病原感染机体的过程相似，能诱导产生细胞免疫和体液免疫，且产生的免疫反应较强，持续时间较长，在我国狂犬病防制工作中曾起到一定的积极作用。但有的疫苗毒株本身对乳鼠致病，对怀孕动物、免疫机能不全的动物和幼小动物使用不安全，而且存在毒力回升、返祖的潜在危险。

鉴于弱毒活疫苗在使用过程中存在较大的安全隐患，WHO建议使用狂犬病灭活疫苗代替弱毒疫苗^[7]。主要有神经组织灭活苗、鸭胚疫苗、—细胞培养苗等，由于神经组织疫苗注射量大，接种次数多，抗体产生慢、水平低，含有神经麻痹因子，易引发变态反应，而且疫苗中易残留有感染性的活病毒。鸭胚疫苗抗体效价低，而且需要进行病毒提纯，最终被市场淘汰。细胞苗生产工艺复杂，价格昂贵，同样限制了在生产实践中的广泛应用。

狂犬病病毒的中和抗体表位主要位于病毒糖蛋白上，糖蛋白介导病毒的感染并与病毒毒力直接相关，可诱导机体产生中和抗体；核蛋白的氨基酸序列高度保守，可诱导机体产生细胞免疫^[1]，目前狂犬病基因工程疫苗主要围绕糖蛋白和核蛋白展开^[8～11]，主要有DNA疫苗、亚单位疫苗和重组活载体疫苗等，免疫试验证明具有一定的免疫效果。但由于种种原因，DNA疫苗和亚单位疫苗没能够大面积推广使用。重组活载体疫苗中以痘苗病毒为载体的VRG曾经取得良好的免疫效果。但痘苗重组病毒接种人类后，可长期抑制再次免疫接种，因此狂犬病重组痘苗载体疫苗的使用范围有一定限制。

新城疫病毒(NDV)载体系统是近年进展迅速的活病毒载体系统，作为外源基因的表达载体具有非凡的优势。NDV可同时诱导体液免疫、细胞免疫和粘膜免疫，是所有疫苗形式中最为理想的免疫方式；经过多年的临床应用检验，NDV遗传相对稳定，毒株间发生重组及毒力返强可能性极小，使用安全、方便；NDV具有高滴度的鸡胚生长特性，生产成本低廉，便于规模化生产。以新城疫病毒LaSota株为载体表达H5亚型高致病力禽流感病毒HA基因的活载体疫苗rL-H5株已经上市，在我国高致病性禽流感的防控工作中发挥着重要的作用^[5]。NDV作为疫苗载体具有广阔的应用空间和巨大的经济意义。

负链RNA病毒的反向遗传操作(Reverse genetic)是通过操作病毒基因组cDNA制造新病毒的过程，其基本过程是：①组装完整的病毒基因组(或重组型基因组)cDNA克隆，5’末端精确地缀于T7启动子后，3’末端精确缀于自我剪切的核酸酶序列和T7转录终止信号之前，构成基因组cDNA转录模板；②以基因组cDNA转录模板与启动病毒复制必须的转录相关功能结构蛋白如核蛋白(NP)、磷酸蛋白(P)和聚合酶蛋白(L)的表达质粒(T7启动子)一起，共转染整合表达T7聚合酶的病毒复制许可细胞；③24-72小时后收获培养上清，过滤后继续敏感细胞传代或接种鸡胚尿囊腔救获(rescue)病毒。对基因组cDNA进行突变、缺失或外源基因插入修饰后，通过反向遗传操作系统(reverse genetic system，RGS系统)可获得相应的突变或重组的负链RNA病毒。

申请人之前获得授权的中国专利“新城疫LaSota疫苗株反向遗传操作系统及其应用”(ZL200510097997.8，CN1293195C，申请日2005年9月2日)已经建立了一种新城疫LaSota弱毒疫苗株的反向遗传操作系统，并且成功救获了野生型病毒株，并且为进一步开展新城疫病毒活载体疫苗研制及NDV病毒相关基础奠定了坚实的基础。

发明内容

本研究以LaSota弱毒疫苗株为载体，通过反向遗传操作技术，构建了表达狂犬病病毒ERA株糖蛋白(GP)基因的重组NDV LaSota疫苗株，为防制狂犬病重组基因工程活载体疫苗的研制与应用奠定了基础。

因此，本发明的一个目的是提供一种表达编码狂犬病病毒糖蛋白(GP蛋白)的基因的重组新城疫LaSota弱毒疫苗(即表达狂犬病病毒糖蛋白(GP蛋白)的新城疫LaSota弱毒疫苗)。

在一个实施方案中，所述狂犬病病毒糖蛋白(GP蛋白)的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

在另一个实施方案中，所述编码狂犬病病毒糖蛋白(GP蛋白)的基因的序列如SEQID No.2所示。

在另一个实施方案中，所述重组新城疫LaSota弱毒疫苗为rL-ERAGP。

本发明还有一个目的是提供本发明的重组新城疫LaSota弱毒疫苗在制备预防狂犬病和新城疫的双价疫苗中的应用。

本发明还有一个目的是提供一种生产本发明的重组新城疫LaSota弱毒疫苗的方法，该方法包括：

(1)构建转录质粒，该转录质粒包括其中插入编码编码狂犬病病毒糖蛋白(GP蛋白)的基因的所述新城疫LaSota弱毒疫苗的基因组cDNA序列；

(2)构建一个或多个转录辅助质粒，该辅助质粒包括编码所述新城疫LaSota弱毒疫苗的核蛋白(NP)的cDNA序列、编码所述新城疫LaSota弱毒疫苗的磷酸蛋白(P)的cDNA序列、和编码所述新城疫LaSota弱毒疫苗的大聚合酶蛋白(L)的cDNA序列；

(3)将所述转录质粒和转录辅助质粒共转染所述新城疫LaSota弱毒疫苗复制许可的宿主细胞，培养转染后的宿主细胞；

(4)收获上清液，过滤后继续敏感细胞传代或接种鸡胚尿囊腔救获重组病毒株。

在一个实施方案中，所述转录质粒是pBRN-FL-ERAGP。

在另一个实施方案中，所述转录辅助质粒是质粒pBSNP、pBSP和pBSL。

在另一个实施方案中，所述宿主细胞是稳定表达T7聚合酶的细胞系，如BHK-21。

本发明还有一个目的是提供根据本发明的方法制备的重组新城疫LaSota弱毒疫苗，优选为rL-ERAGP。

应当理解，上述实施方案中的技术特征可以任意组合，并且该组合对于本领域技术人员是显而易见的。

本发明在新城疫病毒LaSota弱毒疫苗株反向遗传操作系统的基础上，构建了表达狂犬病病毒GP基因的重组NDV基因组cDNA克隆，经间接免疫荧光鉴定成功拯救重组病毒rL-ERAGP。重组病毒鸡胚平均致死时间(MDT)≥168小时，雏鸡脑内致病指数(ICPI)及鸡静脉内致病指数(IVPI)均为0。重组病毒保持了LaSota弱毒疫苗亲本毒株对鸡胚良好的高滴度生长适应和低致病特性。以5x10⁸EID₅₀(半数感染量(EID₅₀))病毒量腹腔注射接种BalB/C小鼠，免疫后21天采血，以NDV抗原进行AIV特异HI抗体检测，测定针对NDV的HI抗体滴度；同时以200PFU的ERA为病毒抗原进行病毒中和试验，检测小鼠血清中针对ERA的中和抗体滴度，证明血清具有较高抗病毒中和抗体。为了检验rL-ERAGP加强免疫效果，在一免3周后以相同剂量进行加强免疫，免疫后3周采血，以ERA株为抗原进行病毒中和试验，二免小鼠抗体水平明显升高，证明加强免疫效果显著。重组病毒rL-ERAGP具有作为预防狂犬病的活载体疫苗应用的潜力。

附图说明

图1.新城疫病毒重组狂犬病病毒糖蛋白基因组cDNA的构建。空白矩形框代表NDV LaSota基因，ERAGP基因为灰色阴影矩形，经Pme I位点插入rLaSota载体(pBRN-FL-PmeI)，图上部为GP基因开放阅读框，大括号表示插入外源基因的核酸序列，边框部分表示基因起始信号和基因终止信号序列，基因间隔序列见标示，HA基因起始密码子ATG和终止密码子TAA以下划线标示，HA基因其余部分用逗点表示，Kozak序列用斜体表示；

图2.重组病毒感染BHK细胞GP基因表达的检测。重组病毒感染BHK-21细胞，A-C为rLaSota感染组，D-F为rL-ERAGP感染组，A、D组以抗NDV血清为一抗，B、E组以抗ERA为一抗，C、F以BALB/c小鼠阴性血清为一抗进行免疫荧光检测；

图3.重组病毒rL-ERAGP免疫小鼠血清病毒中和试验。A～C:分别表示免疫小鼠血清稀释倍数依次为2×2⁵，2×2⁶，2×2⁷，D为ERA病毒阳性对照孔，接毒量均为200PFU。

图4.pBRN-FL-PmeI的质粒图谱；

图5.pBRN-FL-ERAGP的质粒图谱；

图6.质粒pBSNP的序列，带下划线的斜体部分是NP基因的编码序列；

图7.质粒pBSP的序列，带下划线的斜体部分是P基因的编码序列；

图8.质粒pBSL的序列，带下划线的斜体部分是L基因的编码序列。

具体实施方式

下文将参考实施例详细描述本发明，所述实施例仅是意图举例说明本发明，而不是意图限制本发明的范围。本发明的范围由后附的权利要求具体限定。

实施例1 表达编码狂犬病病毒糖蛋白(GP蛋白)的基因的重组新城疫LaSota弱毒疫苗的构建和生物学活性

1 材料与方法

1.1 细胞和病毒

BHK-21细胞(乳仓鼠肾细胞ATCC CCL-10)、Vero-E6细胞(非洲绿猴肾细胞ATCC No.CRL-1586)，培养基为含5％胎牛血清的DMEM；狂犬病病毒(RV)ERA株(AV61)购于中国兽医药品监察所，并在Vero-E6细胞上滴定病毒滴度；稳定表达T7聚合酶的重组痘病毒vTF7-3(ATCC，VR-2153)购于ATCC；ERA免疫小鼠血清和鸡抗NDV高免性血清商购自中国兽医药品监察所。

1.2 主要试剂和仪器

FITC标记的兔抗鸡荧光二抗和抗鼠荧光二抗购自Sigma公司。工具酶均购自TaKaRa公司。RNA提取试剂Trizol，鼠源反转录酶(MLV)试剂盒，无血清培养基Opti-MEM I、磷酸钙转染试剂盒以及胎牛血清均购自Invitrogen公司，TPCK(甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮)处理胰酶购自NEB公司。质粒中量提取试剂盒购自QIAGEN公司。普通显微镜与荧光显微镜，分别购自Leica公司。PCR仪购自MJ Research公司。核酸测序采用BECKMAN CEQ 8000自动测序仪，所用试剂为BECKMAN公司产品。P2级生物安全柜购自LABCONCO公司。不同型号离心机均购自BECKMAN公司。-70℃超低温冰箱购自NBS公司。各种规格细胞培养瓶及细胞培养板均购自CORNING公司。

1.3 引物

试验中所用引物见表1。

表1 克隆质粒构建所用到的引物

注：下划线部分为病毒特异序列，黑体表示酶切位点，Kozak序列用斜体表示，基因起始信号和基因结束信号用字符边框表示。

1.4 表达GP基因的全长cDNA克隆的构建

取狂犬病病毒ERA株在Vero-E6细胞上培养的病毒液250μL，经Trizol法提取病毒基因组RNA并进行反转录，产生病毒GP基因的cDNA。运用引物GP-PF和GP-PR，在Pfu高保真DNA聚合酶作用下进行PCR，PCR产物为ERA株GP基因的完整编码框，经测序无误后以上游引物ERAGP3#PmeI-NDV-PF和下游引物ERAGP3#PmeI-NDV-PR进行下一轮PCR反应，在GP基因ORF的5′端引入Pme I限制酶识别序列和NDV自身聚合酶L识别的转录终止序列GE(TTAAGAAAAAA)及转录起始序列GS(ACGGGTAGAA)，在GP的ORF的3′端引入Pme I限制酶识别序列，并确保重组基因组cDNA全长总碱基数仍保持6的倍数。PCR产物经凝胶电泳回收后平端克隆到pBlueScript载体(Clontech)的EcoR V位点，克隆产物为pBS-ERAGP。

克隆质粒经测序无误后，pBS-ERAGP经Pme I处理，回收GP片段，并与同样经Pme I酶切的pBRN-FL-PmeI(参考文献：葛金英，温志远，王永，等。表达绿色荧光蛋白重组新城疫病毒LaSota疫苗株的构建[J].微生物学报，2006，46(4):547～551)(病毒基因组转录质粒pBRN-FL-PmeI，含有新城疫病毒的基因组全长cDNA，质粒图谱见图4)连接，构建表达GP基因重组基因组全长cDNA克隆pBRN-FL-ERAGP(其全序列见SEQ ID No.3，质粒图谱见图5)。

1.5 重组病毒的拯救

如ZL200510097997.8或参考文献：葛金英，温志远，王永，等。表达绿色荧光蛋白重组新城疫病毒LaSota疫苗株的构建[J].微生物学报，2006，46(4):547～551所述，将表达新城疫病毒(基因组序列：GenBank登录号AY845400)的核蛋白(NP)、磷酸蛋白(P)及大聚合酶蛋白(L)基因的开放阅读框架(ORF)cDNA分别紧接着克隆在pBlueScript载体(Clontech)质粒T7启动子下游，分别构建转录辅助质粒pBSNP，pBSP和pBSL(序列分别如图6至8所示)。

将表达ERAGP的重组基因组全长cDNA克隆质粒pBRN-FL-ERAGP与三个辅助质粒pBSNP、pBSP和pBSL共转染预先感染vTF7-3(ATCC，VR-2153)的BHK-21细胞拯救重组病毒，共转染的详细过程参考文献^[6]。收获鸡胚尿囊液进行HA及NDV抗血清HI检验，阳性样品分装后，-70℃冻存，用于传代、致病性测定、生物学特性研究及免疫原性试验。

1.6 RT-PCR鉴定及序列测定

重组病毒GP基因序列分析：取拯救重组病毒250μL，用Trizol提取病毒RNA，用上游引物GP-PF和下游引物GP-PR进行RT-PCR方法扩增ERA GP基因片段，对扩增的PCR产物进行序列分析，以确定拯救病毒是否为带有目的基因的重组病毒。

1.7 间接免疫荧光检测(IFA)

鸡胚尿囊腔接种扩增重组病毒尿囊液以DMEM适当倍数稀释，按感染复数MOI约为1、100μL体积感染生长于24孔板的BHK-21细胞，37℃，孵育1小时后弃去培养液，然后加入完全DMEM继续培养，20小时后用冰冷3％多聚甲醛室温固定细胞20分钟，PBST洗细胞后用1％ BSA进行封闭1小时后，以1:100稀释鸡抗NDV高免血清和抗ERA高免血清(购自中国兽医药品监察所)作为一抗，同时设相同稀释倍数的NDV高免血清和BALB/c小鼠阴性血清为对照进行间接免疫荧光检测。

2.结果

2.1 表达ERAGP基因(SEQ ID No.2)的NDV全基因组cDNA克隆的构建和重组病毒的拯救

经PCR方法，在GP基因两端引入GE、GS和Pme I酶切位点，构建成的克隆质粒命名为pBS-ERAGP。pBS-ERAGP经Pme I酶切处理后回收，并进一步亚克隆连入同样经Pme I酶切处理过的pBRN-FL-PmeI上，构建成表达GP基因的重组NDV cDNA克隆质粒pBRN-FL-ERAGP(图1)。

为了从克隆的cDNA中拯救感染性重组NDV，首先将pBRN-FL-ERAGP与表达NDV NP、P、L蛋白的辅助质粒共转染BHK-21细胞。收获转染细胞上清接种于9～11日龄的SPF鸡胚。4天后收获血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验试验呈阳性结果的鸡胚尿囊液。收获的阳性病毒尿囊液作为拯救重组病毒的F1代。进一步的RT-PCR及序列分析结果显示，重组病毒基因组带有GP基因，和预期完全相符。结果表明，通过反向遗传操作技术，利用疫苗株基因组cDNA克隆成功拯救具有感染性的子代病毒rL-ERAGP。

2.2 重组病毒的鉴定

提取重组病毒基因组RNA，用上游引物GP-PF和下游引物GP-PR进行RT-PCR方法扩增ERA GP基因片段，对扩增的PCR产物进行序列分析，结果表明拯救病毒带有目的基因(数据未显示)。

将重组病毒感染细胞以NDV高免血清(图2D)和ERA高免血清(图2E)为一抗的细胞孔内均观察到强荧光信号；不表达HA基因的、通过反向遗传操作救获的野生型新城疫病毒LaSota疫苗病毒(rLaSota，购自哈尔滨兽医研究所或可以按照ZL200510097997.8制备)^[5]，感染细胞以NDV高免血清为一抗的细胞孔内观察到同样的荧光信号(图2A)，用ERA高免血清为一抗检测rLaSota感染细胞不能观察到阳性反应(图2B)，rLaSota和重组病毒rL-ERAGP感染细胞以SPF鸡对照血清为一抗(图2C)和以BALB/c小鼠阴性血清为一抗(图2F)的间接免疫荧光染色结果为阴性。

实施例2 重组病毒对BALB/c小鼠的免疫试验

1.材料与方法

1.1 材料

同以上实施例1。

1.2 方法

重组病毒对BALB/c小鼠的免疫试验

为了评价重组病毒对BALB/c小鼠的免疫效果，将实施例1的鸡胚扩增尿囊毒以2x10⁸EID₅₀剂量经腹腔注射途径人工免疫6周龄BALB/c小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)10只，另设非免疫对照组8只；免疫组和非免疫对照组分别饲养于空气负压过滤隔离器中。免疫后21天心脏采血分离血清按常规检测NDV特异血凝抑制(HI)抗体，以ERA为病毒抗原进行病毒中和试验检测抗ERA抗体，免疫后21天用同代次重组病毒，2x10⁸EID₅₀剂量经腹腔注射途径加强免疫BALB/c小鼠，末次免疫后3周采血，以ERA为抗原测定血清抗体滴度。

病毒中和试验具体过程为：取一次免疫小鼠血清进行10倍稀释，然后进行倍比稀释，梯度为2¹—2⁸。ERA进行稀释，将稀释好的血清与病毒等体积混合，室温孵育1h，然后取20μL加入到过夜生长的96孔Vero-E6细胞上，并保证每孔病毒量为200个PFU。每个样品作4个重复。同时设病毒对照和阴性对照。感染后72h固定细胞，以抗ERA小鼠血清为一抗，FITC标记的山羊抗小鼠血清为二抗进行间接免疫荧光检测(IFA)。

2 结果

以ERA株作为病毒中和抗原检测BALB/c小鼠一次免疫血清中和抗体，共检测8份血清。以对照孔荧光数量作为100％，以ERA株作为病毒中和抗原，在接毒后72h进行IFA检测，大部分血清在第6、7孔的荧光数量为对照组的50％，血清中和价约为2^6.63±0.52，即990倍稀释，0.01ml为一个中和价。随机选取一份血清作为代表，两种病毒经血清中和后荧光显微镜观察结果如图3所示。具体数据见表2。

BALB/c小鼠一次免疫后3周以相同剂量、相同途径进行加强免疫，3周后心脏采血，以ERA进行血清中和抗体检测。结果BALB/c小鼠血清中和抗体在2⁸以上，即血清进行2560倍稀释可以使接种200PFU病毒的细胞病变减少50％。二次加强免疫使血清抗体显著提高，加强效果明显。

表2 重组病毒rL-ERAGP免疫小鼠血清病毒中和试验

a.BALB/c小鼠以0.25mL的体积经腹腔注射途径免疫2×10⁸EID₅₀的重组病毒rL-ERAGP。

b.BALB/c小鼠以0.25mL的体积经腹腔注射途径二次加强免疫2×10⁸ EID₅₀的重组病毒rL-ERAGP。

c.血清样品来自经ERA免疫的BALB/c小鼠。

d.血清样品来自未经免疫的BALB/c小鼠。

本申请人目前正探索以新城疫病毒弱毒疫苗LaSota为载体表达ERA株GP基因的重组活载体疫苗的研制和开发，以期为我国狂犬病防制工作做出贡献。新城疫病毒作为载体表达外源蛋白是近年迅速发展起来的一项新技术。2004年，Samal S.^[12]等采用体内复制能力较强，免疫原性良好的LaSota疫苗株为活载体，构建了表达传染性法氏囊病毒(IBDV)变异株GLS-5的重组新城疫病毒，免疫2日龄雏鸡，结果可有效抵御IBDV变异株及新城疫强毒的攻击。2007年，zhigao B.^[5]等同样采用LaSota疫苗株为活载体，构建表达H5亚型高致病力禽流感病毒碱裂解位点突变型HA基因的重组新城疫病毒，免疫雏鸡3周可100％保护雏鸡免受高致病力禽流感病毒致死剂量的攻击，免疫鸡不发病、不死亡、不排毒。我们采用同样的策略，将ERA GP基因插入基因组P和M基因之间，重组病毒大剂量接种6周龄小鼠不会引起小鼠发病和生长阻滞，并能诱导出高水平ERA特异中和抗体反应，具有作为活载体疫苗应用的潜力。

重组新城疫病毒表达流感病毒HA糖蛋白可以被动的装配到NDV病毒粒子表面，有可能发挥其相应的生物学功能^[13，14]。IFA检测发现rL-ERAGP感染BHK-21细胞的形态与rLaSota和其它重组NDV病毒不同，这可能与ERA糖蛋白GP装配到NDV病毒粒子表面，并介导重组病毒的感染相关，详细情况有待进一步研究。

新城疫病毒反向遗传操作系统的成功建立使之成为研究外源蛋白生物学活性的完美表达载体，而作为疫苗载体更具有绝对优势。新城疫病毒作为弱毒苗在生产实践中应用多年，具有良好的安全性和有效性。适应鸡胚生长，滴度高，便于大量生产，成本低。此项研究为探索rL-ERAGP作为疫苗的进一步应用奠定了基础。

参考文献

[1].殷震，刘景华.动物病毒学(第二版)[M].北京：中国农业出版社，1997.777-810.

[2].马君，王栋。狂犬病疫苗研究进展[J]。中国兽药杂志，2006，40(8)：31～34。

[3].金宁一，郭志儒，赵怀龙，等.狂犬病毒CTN株糖蛋白重组鸡痘病毒与核酸疫苗的联合免疫[J].免疫学杂志，2004，4：277-280.

[4].Moss B.Genetically engineered poxviruses for recombinant gene expression，vaccination，and safety.Proc Natl Sci USA，1996，93:11341-11348.

[5].Jinying G，Guohua D，Zhiyuan W，et al.Newcastle Disease Virus-Based Live Attenuated VaccineCompletely Protects Chickens and Mice from Lethal Challenge of Homologous and Heterologous H5N1Avian Influenza Viruses.Journal of Virology，2007，81:150-158.

[6].中国人民解放军兽医大学.人兽共患病学(上册)[M].1993.21-45.

[7].董关木.狂犬病的防治、疫苗和抗血清的安全性探讨[A].全国人畜共患病学术研讨会论文集[C].2006.108-111.

[8].Xiang ZQ.Vaccination with a Plasmid Vector Carrying the Rabies Virus Glycoprotein Gene InducesProtective Immunity against Rabies Virus[J].Virology，1994，199(1)：132-140.

[9].Lodmell DL.Raxxon Poxvirus Recombinant Expressing the Rabies Virus Nucleoprotein Protect Miceagainst Lethal Rabies Virus Infection[J].J Virol，1991，65：3400-3405.

[10].赵怀龙，金宁一，郭志儒，等.表达狂犬病病毒糖蛋白的重组鸡痘病毒的构建和鉴定[J]。中国兽医学报，2004，1：37-38.

[11].张德礼.狂犬病疫苗及其免疫防制的研究进展[J].生物学杂志，1995，4：15-16.

[12].Huang Z.，Elankumaran S.，Yunus A.S.，and Samal S.K.A Recombinant Newcastle Disease Virus(NDV)Expressing VP2 Protein of Infectious Bursal Disease Virus(IBDV)Protects against NDV andIBDV.Journal of General Virology.2004，78：10054-10063.

[13].Nakaya T.，Cros J.，Park M.-S.etal Recombinant Newcastle disease virus as a vaccine vector.J.Virol[J]，2001，75:11868-11873.

[14].Veits J，Wiesner D，Fuchs W.et al Newcastle disease virus expressing H5 hemagglutinin geneprotects chickens against Newcastle disease and avian influenza[J]，Proc.Natl.Acad.Sci.2006.103：8197-8202.

序列表

<110>  中国农业科学院哈尔滨兽医研究所

<120>  表达狂犬病病毒糖蛋白(GP蛋白)的重组新城疫LaSota弱毒疫苗株

<130>  IB083047

<160>  3

<170>  PatentIn version 3.1

<210>  1

<211>  524

<212>  PRT

<213>  狂犬病病毒

<400>  1

<210>  2

<211>  1575

<212>  DNA

<213>  狂犬病病毒

<400>  2

<210>  3

<211>  21632

<212>  DNA

<213>  人工

<400>  3

Claims (10)

1.一种表达编码狂犬病病毒糖蛋白(GP蛋白)的基因的重组新城疫LaSota弱毒疫苗。

2.根据权利要求1的重组新城疫LaSota弱毒疫苗，其中所述狂犬病病毒糖蛋白(GP蛋白)的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

3.根据权利要求1或2的重组新城疫LaSota弱毒疫苗，其中所述编码狂犬病病毒糖蛋白(GP蛋白)的基因的序列如SEQ ID No.2所示。

4.根据权利要求1-3中任何一项的重组新城疫LaSota弱毒疫苗，其为rL-ERAGP。

5.根据权利要求1-4中任何一项的重组新城疫LaSota弱毒疫苗在制备预防狂犬病和新城疫的双价疫苗中的应用。

6.一种生产权利要求1-4中任何一项的重组新城疫LaSota弱毒疫苗的方法，该方法包括：

(1)构建转录质粒，该转录质粒包括其中插入编码编码狂犬病病毒糖蛋白(GP蛋白)的基因的所述新城疫LaSota弱毒疫苗的基因组cDNA序列；

(2)构建一个或多个转录辅助质粒，该辅助质粒包括编码所述新城疫LaSota弱毒疫苗的核蛋白(NP)的cDNA序列、编码所述新城疫LaSota弱毒疫苗的磷酸蛋白(P)的cDNA序列、和编码所述新城疫LaSota弱毒疫苗的大聚合酶蛋白(L)的cDNA序列；

(3)将所述转录质粒和转录辅助质粒共转染所述新城疫LaSota弱毒疫苗复制许可的宿主细胞，培养转染后的宿主细胞；

(4)收获上清液，过滤后继续敏感细胞传代或接种鸡胚尿囊腔救获重组病毒株。

7.根据权利要求6的方法，其中所述转录质粒是pBRN-FL-ERAGP。

8.根据权利要求6的方法，其中所述转录辅助质粒是质粒pBSNP、pBSP和pBSL。

9.根据权利要求6-8中任何一项的方法，其中所述宿主细胞是稳定表达T7聚合酶的细胞系。

10.根据权利要求6-9中任何一项的方法制备的重组新城疫LaSota弱毒疫苗，优选为rL-ERAGP。

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