CN105251000B - 猪伪狂犬病病毒疫苗组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种猪伪狂犬病病毒疫苗组合物，该猪伪狂犬病病毒疫苗组合物含猪伪狂犬病病毒亚单位抗原，或含有重组新城疫病毒‑猪伪狂犬病病毒载体。本发明还提供了该疫苗组合物的制备方法和应用。该疫苗组合物能有效预防猪伪狂犬病病毒相关疾病和由猪伪狂犬病病毒造成的感染的相关疾病。本发明猪伪狂犬病毒疫苗组合物中免疫原性抗原的组合可诱导产生协同的免疫效果，不仅免疫效果良好，还进一步降低了免疫使用量，降低了免疫成本。

Description

猪伪狂犬病病毒疫苗组合物及其制备方法和应用

本申请为专利申请201410519314.2的分案申请，原案申请日为2014年9月30日，发明名称为猪伪狂犬病病毒疫苗组合物及其制备方法和应用。

技术领域

本发明属于兽用生物制品领域，具体地涉及猪伪狂犬病毒的疫苗组合物及其制备方法，以及将所述免疫抗原用于制备预防和/或治疗与猪伪狂犬病毒相关疾病和由猪伪狂犬病毒导致的感染的组合物的应用。

背景技术

伪狂犬病，又称Aujeszky氏病，是由疱疹病毒科(Herpesviridae)α亚科中的猪疱疹病毒Ⅰ型(Suid herpesvirus 1strain)所引起的猪、牛、羊等多种家畜、家禽和野生动物的一种以发热、奇痒(除猪外)及脑脊髓炎为主症的急性传染病。猪的伪狂犬病在我国广泛存在，危害严重，是制约规模化猪场生产的主要疫病之一。它能引起妊娠母猪流产、死胎或木乃伊胎和仔猪出现神经症状、麻痹，死亡率高。PRV具有较强的泛嗜性、神经嗜性及潜伏感染特性，在外周神经系统可以长期潜伏感染，当潜伏病毒被激活变成有感染力的病毒，被潜伏感染的宿主就会发病。

猪PRV只有一个血清型，通常认为毒株的交叉保护力很强，但目前仍存在仔猪注射商品化疫苗后发生典型猪伪狂犬病，例如长时间体温升高，精神沉郁，食欲减退，出现呼吸道和/或神经症状。突出表现为任何年龄的猪都会感染，可在猪群水平传播，潜伏期短(1～2天)，发病率在10％～100％之间，发病猪死亡率在10％～100％之间(仔猪死亡率可高达100％)，感染后可引起猪只高热(40～42℃，持续3日以上)，呼吸困难，腹泻，喘，咳嗽，打喷嚏，后肢麻痹，犬坐，突然倒地，抽搐，侧卧不起，角弓反张，泳状划水，最后衰竭而死，并可引起种公猪精液质量下降，怀孕母猪流产(高达35％)，早产，死胎，弱仔(弱仔14日龄前全部死亡)等繁殖障碍症状。现有技术的疫苗免疫猪只后不能完全抵抗野毒攻击，依然会出现高热，精神沉郁，食欲下降或废绝等症状，感染率超过80％，发病率超过30％，死亡率在10％～20％之间。现有技术还没有疫苗能够解决针对猪伪狂犬变异株引起的伪狂犬病。

本发明首次通过将猪伪狂犬病毒gB蛋白与gD蛋白组合使用，针对猪伪狂犬变异株引起的伪狂犬病有着较好的保护作用，，通过免疫效力比较试验，意外发现，两种蛋白组合使用，协同刺激机体免疫反应，有效降低了免疫剂量，大大降低了免疫成本。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种预防和/或治疗猪伪狂犬病毒感染的疫苗组合物，该疫苗组合物包含两种猪伪狂犬病毒免疫保护性抗原和佐剂。本发明提供的预防和/或治疗猪伪狂犬病毒感染的疫苗组合物包含的两种猪伪狂犬病毒免疫抗原为gB蛋白与gD蛋白。

本发明的第一方面是一种猪伪狂犬病病毒疫苗组合物，所述的疫苗组合物包括免疫量的gB蛋白、gD蛋白和佐剂。

作为本发明的一种优选实施方式，在本发明的疫苗组合物中，所述的gB蛋白蛋白序列为SEQ ID NO.3；所述的gD蛋白蛋白序列为SEQ ID NO.4。

优选地，本发明提供的预防和/或治疗猪伪狂犬病毒感染的疫苗组合物包含的猪伪狂犬病毒免疫抗原gB蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

优选地，本发明提供的预防和/或治疗猪伪狂犬病毒感染的疫苗组合物包含的猪伪狂犬病毒免疫抗原gB蛋白核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

优选地，本发明提供的预防和/或治疗猪伪狂犬病毒感染的疫苗组合物包含的猪伪狂犬病毒免疫抗原gD蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

优选地，本发明提供的预防和/或治疗猪伪狂犬病毒感染的疫苗组合物包含的猪伪狂犬病毒免疫抗原gD蛋白核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

术语“gB蛋白”又称“gB糖蛋白”，

术语“gD蛋白”又称“gD糖蛋白”，是猪伪狂犬病病毒进行感染必需的结构蛋白，是成熟的病毒粒子囊膜表面的主要糖蛋白之一，也称为“gp50蛋白”。

本发明提供的预防和/或治疗猪伪狂犬病毒感染的疫苗组合物包含的猪伪狂犬病毒免疫抗原gB蛋白、gD蛋白还可以是与其功能衍生物基本相同的氨基酸序列的多肽。

术语“佐剂”指加入到本发明的组合物中以增加组合物的免疫原性的物质。已知的佐剂包括，但不限于：油佐剂，水溶性佐剂，铝盐佐剂，细胞因子佐剂。

本发明所用术语“油佐剂”又称“油性佐剂”或“油乳佐剂”，是由包括植物油、动物油、矿物油中的一种或几种组成，用于延缓免疫原在机体内的存留时间，使之持续缓慢释放，增强巨噬细胞的吞噬与杀菌能力。

本发明所用术语“水溶性佐剂”又称“水基佐剂”或“水佐剂”，是一种聚合物水溶性分散体，用于提高水溶性疫苗的功效和安全性，可以由高分子量聚丙烯酸类合成聚合物组成。

本发明所用术语“铝盐佐剂”，又称“铝胶佐剂”或“铝佐剂”，包括氢氧化铝佐剂和磷酸铝佐剂，其主要功能为缓释，但同时具有对免疫细胞的激活作用。将抗原和氢氧化铝或磷酸铝混合注射，能够使抗原保存在注射部位，具有抗原缓释和非特异免疫刺激作用。

本发明所用术语“细胞因子佐剂”，包括IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、INF-γ、GM-CSF、TNF-α、TNF-β、TCA-3等，又称“细胞因子”或“细胞素”，是活体宿主细胞分泌的通过扩散、细胞间接触或血液循环到达宿主其他细胞，在体液中以极低浓度发挥作用的一类非免疫球蛋白、局部天然蛋白或糖蛋白，也是一类由机体活化的免疫细胞和某些非免疫细胞产生、分泌，能调节细胞生长、分化，与造血、炎症反应、免疫应答反应和创伤愈合等密切相关的高活性多功能小分子蛋白的统称，可以刺激或抑制免疫功能，在免疫应答中促进细胞发育分化、调节细胞生理功能和细胞间信息传递，在免疫系统中起着非常重要的调控作用。

本发明实施例中使用了油佐剂中的一种206佐剂。

适用于本发明的组合物的佐剂的量优选地是有效量。所述“有效量”是指佐剂在同本发明抗原联合施用时在宿主中发挥它们的免疫学作用而言必须或足够的而不导致过度副作用所必需量。待施用的佐剂的精确的量将根据因素如所用的成分和治疗的疾病的类型，待治疗的动物的类型和年龄，施用的方式，以及组合物中的其它成分而变化。

在一个实施方式中，本发明提供一种治疗和/或预防猪伪狂犬病毒感染的疫苗组合物，由猪伪狂犬病毒免疫抗原gB蛋白、gD蛋白和206佐剂组成。

作为本发明的一种优选实施方式，在本发明的疫苗组合物中，所述的gB蛋白含量为25-100μg/ml；gD蛋白含量为25-100μg/ml。

作为本发明的一种最优选实施方式，在本发明的疫苗组合物中，所述的gB蛋白含量为50μg/ml；gD蛋白含量为50μg/ml。

本发明的组合物的成分或组分的量优选地是治疗有效量。所述治疗有效量是指在组合物施用的宿主中发挥它们的免疫学作用而不导致过度副作用所必需量。所用的成分和待施用的组合物的精确的量将根据因素如治疗的疾病的类型，待治疗的动物的类型和年龄，施用的方式，以及组合物中的其它成分而变化。

优选地，对于动物猪而言，本发明疫苗组合物gB蛋白抗原有效量为25-100μg/ml；gD蛋白抗原有效量为25-100μg/ml。

更优选地，所述疫苗组合物gB蛋白抗原有效量为50μg/ml；gD蛋白抗原有效量为50μg/ml。

本发明的另一方面是一种猪伪狂犬病病毒疫苗组合物，所述的疫苗组合物包括重组新城疫病毒-猪伪狂犬病病毒载体以及佐剂。

作为本发明的一种优选实施方式，在本发明的疫苗组合物中，所述的重组新城疫病毒-猪伪狂犬病病毒载体包含一种或多种异源多核苷酸，其编码一种或多种猪伪狂犬病病毒抗原、多肽或其变体，其中，所述的猪伪狂犬病病毒抗原包括gB蛋白、gD蛋白。

术语“功能衍生物”指具有与完整蛋白/肽序列的生物活性基本类似的功能生物活性的蛋白/肽序列。换言之，其优选地指当将所述功能衍生物施用于动物时，基本上保留了激发免疫应答，如针对猪伪狂犬病毒株攻击的保护性反应的能力的多肽或其片段。

术语“片段”指这样的多核苷酸序列，其是人工构建(例如通过化学合成)或通过将天然产物裂解成多个小片段(使用限制性内切酶，或机械剪切)构建的本发明核酸的分离的部分，或通过PCR、DNA聚合酶或本领域公知的任何其他聚合技术合成的核酸的部分，或通过本领域技术人员公知的重组核酸技术在宿主细胞中表达的核酸部分。

如本文一般理解和使用，“功能性片段”指编码与完整核酸序列的生物活性基本相似的功能生物活性的核酸序列。换言之，在本发明的上下文中，其优选地指基本上保留了编码这样的多肽/蛋白质能力的核酸或其片段，所述多肽/蛋白质当施用于动物时，激发针对猪伪狂犬病毒攻击的免疫应答，和更优选地保护性反应。

当指氨基酸序列时，“基本上相同”可以理解为本发明的多肽优选地具有这样的氨基酸序列，其与SEQ ID NO：3-4中所示的序列的部分或全部具有至少70％同源性，或甚至优选地80％同源性，或甚至更优选地90％同源性，或最优选地95％同源性。

在本文中术语“同源性”还包括与参比序列相同或类似，同时提供任何氨基酸的简单替换/修饰。可以用BLAST-P(基本局部排比检索工具)，本领域技术人员公知的程序进行该方面的同源性检索。对于相应的核酸序列，同源性涉及在本领域中已知的BLASTX和BLASTN程序。

作为本发明的一种优选实施方式，在本发明的疫苗组合物中，所述的猪伪狂犬病病毒抗原gB蛋白为序列SEQ ID NO.3编码的猪伪狂犬病病毒gB蛋白，述的猪伪狂犬病病毒抗原gD蛋白为序列SEQ ID NO.4编码的gD蛋白。

所述“载体”意指重组DNA或RNA质粒、噬菌体或病毒，其包含要在体内或体外递送至靶细胞的异源多核苷酸。异源多核苷酸可包含目的序列以用于预防或治疗的目的，可选地，其为表达盒的形式。载体不需要能够在最终的靶细胞或受试者中复制。术语“载体”包括用于克隆载体，也包括病毒载体。

作为本发明的一种优选实施方式，在本发明的疫苗组合物中所述的疫苗组合物，其特征在于，所述的新城疫病毒为弱毒株，优选地，所新城疫病毒为新城疫病毒La Sota株。

新城疫病毒La Sota株购自中国兽医药品监察所。

本发明的另一方面是一种制备所述疫苗组合物的方法，所述的方法包括：1)制备gB蛋白和gD蛋白抗原的步骤；以及2)按比例混合抗原，加入佐剂，乳化的步骤。

本发明的另一个目的是提供一种治疗和/或预防猪伪狂犬病毒相关疾病或感染的疫苗组合物的制备方法，包括：

(1)制备gB蛋白和gD蛋白抗原；

(2)按比例混合抗原，加入佐剂，乳化。

抗原的制备可以通过本领域技术人员已知的多种方法进行，包括基因工程手段，例如通过包含本发明多核苷酸的克隆或表达载体。术语“载体”涉及被设计用于转导/转染一种或多种细胞类型的多核苷酸构建体。载体可以是，例如“克隆载体”，其被设计用于分离、增殖和复制插入的核苷酸；“表达载体”，其被设计用于在宿主细胞中表达核苷酸序列；或“病毒载体”，其被设计用于生产重组病毒或病毒样颗粒；或“穿梭载体”，其包含不只一种类型的载体的性质。适合制备本发明猪伪狂犬病毒抗原的公众可获得的载体包括质粒、腺病毒、杆状病毒、酵母杆状病毒、植物病毒、腺伴随病毒、反转录病毒、单纯疱疹病毒、α病毒、慢病毒等，还可以获得构建这样的载体的方法。本发明猪伪狂犬病毒抗原的制备还包括通过人工合成的方式来实现。

本发明的另一方面是一种制备所述疫苗组合物的方法，其特征在于，所述的方法包括：1)重组所述新城疫病毒基因组全长cDNA载体的步骤；2)重组表达所述新城疫病毒NP、P、L基因表达载体的步骤；3)重组表达所述猪伪狂犬病病毒抗原基因到所述新城疫病毒基因组全长cDNA重组载体的步骤；以及4)将所述表达所述猪伪狂犬病病毒抗原的新城疫病毒基因组全长cDNA重组载体和表达所述新城疫病毒NP、P、L基因重组载体共同转染细胞，进行病毒振救的步骤。

作为本发明的一种优选实施方式，在本发明的疫苗组合物制备方法中，转染细胞为BHK细胞。也可选用本领域公知的培育新城疫病毒的其他细胞系细胞。

本发明的另一方面是所述的疫苗组合物在制备预防和/或治疗猪伪狂犬病病毒相关疾病或由猪伪狂犬病病毒导致的感染的药物中的应用。

本发明的另一个目的在于提供包含猪伪狂犬病毒免疫抗原gB蛋白、gD蛋白或其功能衍生物基本相同的氨基酸序列的多肽在用于预防和/或治疗猪伪狂犬病毒相关疾病或感染的组合物和/或方法中的应用。

术语“预防”指通过给予根据本发明的疫苗组合物抑制猪伪狂犬感染或推迟疾病发作的所有行为。术语“治疗”指通过给予根据本发明的疫苗组合物使猪伪狂犬病病毒感染引起的症状减轻或转好的所有行为。

术语“保护性反应”意为在动物中预防猪伪狂犬病毒相关疾病或由猪伪狂犬病毒导致的感染的发作或减轻存在的这样的疾病的严重性。

本发明涉及的猪伪狂犬病毒多肽，其有利地激发动物中的保护性反应。具体地，本发明涉及的多肽包含与其功能衍生物基本相同的氨基酸序列。

本发明的另一个目的是提供一种疫苗组合物在制备治疗和/或预防猪伪狂犬病毒相关疾病或感染的药物的应用。

本文所用的术语“猪伪狂犬病病毒相关疾病”用于指由猪伪狂犬病毒感染引起的疾病。它的例子包括发病仔猪表现出明显的神经症状、昏睡、呜叫、呕吐、拉稀、体温升高，一旦发病，怀孕母猪可发生流产、产木乃伊胎儿或死胎或繁殖障碍，但不限于此。

本文所用的术语“猪伪狂犬病病毒相关疾病”可以进一步用于指表现为任何年龄的猪都会感染，可在猪群水平传播，潜伏期短(1～2天)，发病率在10％～100％之间，发病猪死亡率在10％～100％之间(仔猪死亡率可高达100％)，感染后可引起猪只高热(40～42℃，持续3日以上)，呼吸困难，腹泻，喘，咳嗽，打喷嚏，后肢麻痹，犬坐，突然倒地，抽搐，侧卧不起，角弓反张，泳状划水，最后衰竭而死，并可引起种公猪精液质量下降，怀孕母猪流产(高达35％)，早产，死胎，弱仔(弱仔14日龄前全部死亡)等繁殖障碍症状，但不限于此。上述症状与现有技术中感染了普通猪伪狂犬病病毒后产生的症状差异在于：感染了后会造成感染后成年猪(体重在50kg以上猪)可引起猪只高热(40～42℃，持续3日以上)，呼吸困难，腹泻，喘，咳嗽，打喷嚏，后肢麻痹，犬坐，突然倒地，抽搐，侧卧不起，角弓反张，泳状划水，最后衰竭而死；新生及4周龄以内的仔猪突然发病，发生大批死亡，死亡率达90％以上；发病仔猪主要表现为体温上升达41℃以上，食欲废绝，伴有明显的神经症状和腹泻；断奶前后仔猪主要为呼吸系统症状，表现呼吸困难、咳嗽、流鼻涕等。

本发明具有以下突出的优点：

(1)本发明疫苗组合物可通过基因工程手段或人工合成手段对疫苗组合物的组分进行大量合成表达，不仅耗时短，还可便于大规模生产；

(2)本发明猪伪狂犬病毒疫苗组合物中多免疫原性抗原的组合可诱导产生协同的免疫效果，不仅免疫效果良好，还进一步降低了免疫使用量，降低了免疫成本；

(3)本发明疫苗组合物可有效保护猪只抵抗猪伪狂犬病毒的感染，提供了一种完善预防和/或治疗猪伪狂犬病毒感染的途径，避免了传统活疫苗毒力返强及散毒风险的发生，对于净化猪伪狂犬病毒有着积极的现实意义。

附图说明

图1为gB基因PCR扩增产物电泳结果，从左至右各泳道分别为：Marker DL5000、gB基因PCR扩增产物、抽提阴性对照PCR扩增产物、PCR阴性对照；

图2为gD基因PCR扩增产物电泳结果，从左至右各泳道分别为：Marker DL5000、抽提阴性对照PCR扩增产物；3：PCR阴性对照；4：gD基因PCR扩增产物；

图3为pFastBac/HBM-TOPO-gB酶切鉴定结果，从左至右各泳道分别为：MarkerDL5000；2-5泳道：pFastBac/HBM-TOPO-gB MluⅠ和HindⅢ酶切鉴定结果；

图4为pFastBac/HBM-TOPO-gD酶切鉴定结果，从左至右各泳道分别为：MarkerDL5000；2-4泳道：pFastBac/HBM-TOPO-gD MluⅠ和HindⅢ酶切鉴定结果；

图5为Bacmid-gB和Bacmid-gD PCR鉴定结果，从左至右各泳道分别为：MarkerDL5000、Bacmid-gB PCR鉴定、Bacmid-gD PCR鉴定、Bacmid PCR阴性对照；

图6为vNDV-PRV-gB-gD构建示意图。

序列表中：

序列1为PRV HN1201株gB蛋白的核苷酸序列；

序列2为PRV HN1201株gD蛋白的核苷酸序列；

序列3为PRV HN1201株gB蛋白的氨基酸序列；

序列4为PRV HN1201株gD蛋白的氨基酸序列。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1 猪伪狂犬病毒gB、gD蛋白的制备

1.猪伪狂犬病毒gB、gD基因的扩增

在生长良好的PK15细胞上接种PRV HN1201病毒或其不同代次的培养物，该不同代次的培养物为5-35代以内的培养物，收获病毒后用TAKARA公司MiniBEST Viral RNA/DNAExtraction Kit Ver.3.0试剂盒提取PRV基因组DNA。取1μl基因组DNA作为模板，分别利用gB、gD特异性引物：

gBSF:5′CTAGGGGGCGTCGGGGTCCTCGT 3′和

gBSR:5′ATGCCCGCTGGTGGCGGTCTTTGG3′

gDSF:5′ATGCTGCTCGCAGCGCTATTGGC 3′和

gDSR:5′CTACGGACCGGGCTGCGCTTTTAG3′

进行PCR扩增，利用TAKARA的高保真酶HS DNA Polymerase withGC Buffer，gB扩增条件为：94℃3min；98℃10s，68℃3min，30 cycles；68℃5min，PCR产物命名为gB。gD扩增条件为：94℃3min；98℃10s，68℃1min，30 cycles；68℃5min。PCR产物命名为gD。

2.重组Bacmid的获取及鉴定

将高保真酶扩增获得的PCR产物gB和gD分别克隆至pFastBac/HBM-TOPO载体(购自Invitrogen公司，货号A11339)，克隆体系如下：PCR产物gB 4μl，Salt solution(盐溶液)1μl，TOPO vector 1μl，共6μl。混合均匀，室温孵育5min，转化One ShotR Mach1^TMT1R感受态细胞，涂布氨苄青霉素抗性平板，分别挑取单克隆鉴定gB、gD基因的插入方向，插入方向正确的质粒送Invitrogen公司测序，鉴定gB、gD序列的正确性。测序正确的质粒分别命名为pFastBac/HBM-TOPO-gB，pFastBac/HBM-TOPO-gD。

分别将pFastBac/HBM-TOPO-gB、pFastBac/HBM-TOPO-gD质粒转化DH10Bac感受态细胞，pFastBac/HBM-TOPO-gB、pFastBac/HBM-TOPO-gD分别和感受态细胞中的穿梭质粒Bacmid进行转座，用Invitrogen的PureLink HiPure Plasmid DNA Miniprep Kit提取获得的重组质粒，并用pUCM13 Forward/pUCM13 Reverse引物分别鉴定gB、gD的插入，阳性Bacmid分别命名为Bacmid-gB、Bacmid-gD。

3.转染获得重组杆状病毒

按照Invitrogen公司Bac-to-Bac HBM TOPO Secreted Expression System的说明书提供的方法进行。6孔板每孔铺8×10⁵个sf9细胞，待细胞贴壁后按照Cellfectin Ⅱ转染试剂的说明书进行转染：分别稀释8μl Cellfectin Ⅱ和1μg Bacmid-gB DNA到100μlSF-900Ⅱ培养基中，Vortex混匀，混合稀释后的DNA与稀释后的Cellfectin Ⅱ(总体积～210μl),混合均匀室温孵育15～30min，一滴滴加到细胞中。转染后72h待出现细胞病变后，收集细胞培养上清，记为P0代重组病毒vBac-gB。P0代重组病毒vBac-gB感染sf9细胞，经3代扩大培养后，获得的P3代vBac-gB用于重组蛋白表达。

同样按上述转染方法，将Bacmid-gD DNA进行转染，收获的重组病毒记为P0代vBac-gD。P0代重组病毒vBac-gD感染sf9细胞，经3代扩大培养后，获得的P3代vBac-gD用于重组蛋白表达。

4.重组杆状病毒感染High-five细胞获得重组蛋白

分别将P3代重组杆状病毒vBac-gB、vBac-gD接种High-five细胞(购自Invitrogen，货号B85502)。在500ml三角瓶中悬浮培养High-five细胞，至细胞密度达到7.0×10⁵cell/ml后，按照1MOI的量接种病毒，感染后72h收取细胞培养上清。利用Millipore的切向流过滤系统将体积浓缩为原来体积的1/10。用1％(体积比)的Triton X-100(购自sigma,货号T8787)灭活杆状病毒，SDS-PAGE光密度法测定蛋白含量为200μg/ml。

实施2 猪伪狂犬病毒疫苗组合物的制备

取实施例1制备的gB和gD蛋白，缓缓加入到佐剂中，加的过程中不断用转速为800rpm乳化机搅拌12min，混匀，4℃保存，即为猪伪狂犬病毒的疫苗组合物。具体配比见表1。

表1 猪伪狂犬病毒疫苗组合物成分配比

实施例3猪伪狂犬病毒疫苗组合物的免疫原性试验

将21日龄PRV抗体阴性仔猪36头随机分成9组，4头/组，即1-7组分别为本发明实施例1制备的疫苗1、疫苗2、疫苗3、疫苗4、疫苗5、疫苗6、疫苗7免疫组，第8组和第9组注射等量的PBS，单次免疫。免疫后28日后攻毒，攻毒剂量为猪伪狂犬病病毒HN1201株2×10^8.0TCID₅₀/头，攻击后7天内每天固定时间观察临床状况并测量体温。

结果在该攻毒剂量下第1-7免疫组4只仔猪均获得保护，出现短暂临床体征在5天后逐步恢复正常，最终存活；第8组在攻毒后2天死2头，3天全部死亡，有明显的临床体征；第9组存活，无异常现象发生。攻毒保护结果见表2。

表2 猪伪狂犬病病毒疫苗组合物免疫仔猪后的攻毒保护结果

对于动物进行判断，评估疾病的临床体征是在不清楚所有个体免疫情况下进行的，体温升高情况见表3。临床猪只体温升高天数统计，使用ANOVA分析来比较疫苗对仔猪体温变化的作用。结果显示疫苗1、疫苗2、疫苗3和疫苗4免疫组之间体温升高差异不显著(P＞0.05)，疫苗5、疫苗6和疫苗7免疫组之间差异不显著(P＞0.05)，而疫苗1、疫苗2、疫苗3、疫苗4同疫苗5、疫苗6、疫苗7之间差异极显著(P＜0.01)。通过比较免疫仔猪体温升高天数平均值，结果显示疫苗5、疫苗6和疫苗7免疫仔猪的体温升高天数平均值与疫苗1、疫苗2、疫苗3和疫苗4免疫仔猪的体温升高天数平均值相比由2.75-3天下降到1-1.25天，平均下降了54.5％-66.7％。通过比较各疫苗的免疫效力临床评判结果相关性，可以看出疫苗5、疫苗6和疫苗7的免疫效果要显著高于疫苗1、疫苗2、疫苗3和疫苗4。证明了本发明包含两种抗原疫苗组合物免疫效果要优于单一抗原疫苗，而且还发现，本发明包含两种抗原疫苗组合物具有更低的抗原含量，却能达到更好的免疫效果，在通过比较疫苗对临床疾病的影响，本发明疫苗组合物临床疾病显著少于单一抗原疫苗。

表3 猪伪狂犬病病毒疫苗组合物免疫仔猪后的体温升高情况

组别	A(天)	B(天)	C(天)	D(天)	平均值(天)
						1	3	3	3	3	3
2	3	3	3	2	2.75
						3	3	2	3	3	2.75
4	2	3	3	3	2.75
						5	1	1	1	2	1.25
6	1	1	1	1	1
						7	1	1	1	1	1
9	0	0	0	0	0

进一步对各试验组仔猪采食情况进行统计，结果见表4。临床猪只7天采食量统计，使用ANOVA分析来比较疫苗对仔猪采食量变化的作用。结果显示疫苗1、疫苗2、疫苗3和疫苗4免疫组之间采食量差异不显著(P＞0.05)，疫苗5、疫苗6和疫苗7免疫组之间差异不显著(P＞0.05)，而疫苗1、疫苗2、疫苗3、疫苗4同疫苗5、疫苗6、疫苗7之间差异极显著(P＜0.01)。通过比较免疫仔猪采食量平均值，结果显示疫苗5、疫苗6和疫苗7免疫仔猪的采食量平均值与疫苗1、疫苗2、疫苗3和疫苗4免疫仔猪的采食量平均值相比由210.89g-215.21g上升到285.56g-290.57g，平均上升了37.78％-32.69％。通过比较各疫苗的免疫效力临床评判结果相关性，可以看出疫苗5、疫苗6和疫苗7的免疫效果要显著高于疫苗1、疫苗2、疫苗3和疫苗4。进一步证明了本发明包含两种抗原疫苗组合物免疫效果要优于单一抗原疫苗。

表4 猪伪狂犬病病毒疫苗组合物免疫仔猪后采食情况

组别	A(g)	B(g)	C(g)	D(g)	平均值(g)
						1	215.90	210.14	208.00	209.54	210.89
2	214.50	210.24	210.08	211.42	211.56
						3	210.08	211.80	219.60	209.12	212.64
4	220.74	214.63	216.14	209.35	215.21
						5	280.42	275.26	298.34	288.24	285.56
6	295.21	289.28	287.35	290.45	290.57
						7	291.14	288.84	292.08	287.42	289.87
9	288.45	290.54	287.96	296.35	290.83

实施例4 以新城疫病毒为载体的猪伪狂犬病病毒疫苗的制备

1.新城疫病毒La Sota株全长载体的构建

(1)NDV的增殖及RNA提取，RT-PCR

以新城疫病毒疫苗用弱毒株La Sota株为基础，参考华中农业大学2012年硕士学位论文NDV La Sota株基因组全长cDNA载体和NP、P辅助质粒的构建及鉴定，取NDV La Sota株病毒在SPF鸡胚的培养物，收获病毒后用Invitrogen公司的Trizol Reagent(货号：12183-555)抽提NDV RNA，用TAKARA公司的Reverse Transcriptase M-MLV(货号：2641A)试剂盒制备cDNA。

(2)新城疫病毒La Sota株各片段的构建

参照Gene Bank公布的NDV LaSota株基因组序列(基因序列号为AF077761)，用NEBcutter软件对NDV La Sota株基因组的限制性内切酶分析，结合pBR322载体的多克隆位点，分成8个片段扩增病毒基因组全长，在M基因的下游和F基因的上游分别引入FseI和PacI酶切位点，并在5‘端加上T7聚合酶启动子，在其3‘末端后引入可自我修饰的丁型肝炎病毒核酶核心序列(HdvRz)，设计8对引物进行扩增(引物见下表)。用TAKARA公司的高保真酶HS DNA Polymerase，PCR扩增NDV的各片段基因，PRC条件为：94℃2min；98℃10s，55℃15s，72℃1min/kb(根据各片段长度调整延伸时间)，30 cycles；72℃10min。

NDV1-UP:5′CGGCgaattcTAATACGACTCACTATAGGACCAAACAGAGAATCCGTGAG3′

NDV1-DOWN:5′CATgggcccTTTTTAGCATTGGAC3′

NDV2-UP:5′TGCTAAAAAgggcccATGGTCGAG3′

NDV2-DOWN:5′ATTCcacgtgCTTGACTGCATTCACTG3′

NDV3-UP:5′ATTCcacgtgCGTGAAAGCGCCAGAGAAGA 3′

NDV3-DOWN:5′CAAAttaattaaGAACTAggccggccCTAACTTGATAGACAGGTAA3′

NDV4-UP:5′ATTCttaattaaAAAAAACACGGGTAGAAGAT3′

NDV4-DOWN:5′AGCTGcggccgcTGTTATTTGTGC 3′

NDV5-UP:5′AACAgcggccgcAGCTCTGATACAAGC3′

NDV5-DOWN:5′GATCcgtacgAATGCTGCTGAACTCCTC 3′

NDV6-UP:5′CATTcgtacgGATCCGGCATTCTGGTT 3′

NDV6-DOWN:5′GTTTcttaagAACAATATTTGGGCTTG 3′

NDV7-UP:5′TGTTcttaagAAACATACGCAAAGAGT 3′

NDV7-DOWN:5′CGAGatttaaatACATGTAGTACAGATTAGCTGGGAATG 3′

NDV8-UP:5′ATGTatttaaatCTCGGAAGAGCCTCAATTTGATCA 3′

NDV8-DOWN:5′CCGGacgcgtACCAAACAAAGATTTGGTGAATG 3′

(3)新城疫病毒La Sota株全长载体的构建

根据NDV La Sota株基因组限制性内切酶分析和pBR322载体的多克隆位点，合成一段265bp序列(包括EcoRⅠ、ApaⅠ、PmlⅠ、FseⅠ、PacⅠ、NotⅠ、BsiwⅠ、AflⅡ、SwaⅠ、MluⅠ和HindⅢ酶切位点的多克隆位点序列，以及HdvRz和T7终止子序列：GAATTCGGGCCCCACGTGGGCCGGCCTTAATTAAGCGGCCGCCGTACGCTTAAGATTTAAATACGCGTACGCGTGGGTCGGCATGGCATCTCCACCTCCTCGACCTGGGCATCCGAAGGAGGACGCACGTCCACTCGGATGGCTAAGGGAGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAGCTT，质粒命名为pMD18T-HT。

将pMD18T-HT质粒用EcoRⅠ和HindⅢ酶切，将含有多克隆位点序列、HdvRz序列及T7终止子序列的片段克隆至pBR322载体的EcoRⅠ和HindⅢ位点，获得的阳性质粒命名为pBRT7H。随后将NDV La Sota全基因组PCR扩增获得的NDV1～8DNA片段按照图所示的克隆次序，利用基因组相邻片段重叠的限制性内切酶位点进行连接组装到pBRT7H载体，最终构建的质粒命名为pBRT7H-La。同时对构建的载体进行测序，保证碱基序列的正确。

2.辅助质粒的构建及鉴定

以pCI-neo载体为基础，分别将编码NDV核蛋白NP、磷蛋白P和聚合酶蛋白L基因ORF的cDNA克隆在pCI-neo载体的T7启动子下的多克隆位点，构建的质粒分别命名为pCI-NP、pCI-P和pCI-L。

将构建的质粒大量抽提后，分别转染BHK细胞，转染72h后收获细胞样品，用抗新城疫标准血清为一抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡IgG为二抗进行WesternBlot鉴定；用抗新城疫标准阳性血清为一抗，FITC标记的羊抗鸡IgG为二抗进行间接免疫荧光检测表明构建的辅助质粒均有表达。

3.NDV的拯救及鉴定

分别将构建的全长质粒pT7H-La与辅助质粒pCI-NP、pCI-P和pCI-L用Lipofectamine 2000按照4:2:2:1的比例共转染BHK细胞，转染后培养3～4d收获培养液及细胞。将收获的培养物接种9日龄SPF鸡胚传代，进行NDV的HA检测，收获HA阳性的鸡胚尿囊液，即为拯救的病毒。

将拯救的病毒感染BHK细胞，用间接免疫荧光检测显示荧光观察可见明显的绿色荧光，证明构建的NDV pT7H-La质粒在T7启动子下能够包装成有功能活性的病毒，也说明构建的辅助质粒pCI-NP、pCI-P和pCI-L具有功能活性。

4.构建含有PRV gB基因以及gD基因的NDV转录质粒

PRV gB、gD基因的扩增

在生长良好的PK15细胞上接种PRV HN1201病毒或其不同代次的培养物(猪伪狂犬病病毒株为HN1201株(Pseudorabies virus，strain HN1201)，保藏号为CCTCC NO.V201311；保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏日期为2013年5月20日)，该不同代次的培养物为5-35代以内的培养物，收获病毒后用TAKARA公司MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.3.0试剂盒提取PRV基因组DNA。取1μl基因组DNA作为模板，分别利用gB、gD特异性引物：

gBSF:5′GGGCTAGCCTAGGGGGCGTCGGGGTCCTCGT 3′和

gBSR:5′TTGAATTCATGCCCGCTGGTGGCGGTCTTTGG3′

gDSF:5′GGGCGGCCGCATGCTGCTCGCAGCGCTATTGGC 3′和

gDSR:5′TTTCTAGACTACGGACCGGGCTGCGCTTTTAG3′

进行PCR扩增，利用TAKARA的高保真酶HS DNA Polymerase withGC Buffer，gB扩增条件为：94℃3min；98℃10s，68℃3min，30cycles；68℃5min，PCR产物命名为gB。gD扩增条件为：94℃3min；98℃10s，68℃1min，30cycles；68℃5min。PCR产物命名为gD。

5构建含有PRV gB基因和gD基因的NDV转录质粒

将扩增的PRV gB基因(SEQ ID NO:1)和pVAX1载体经NheⅠ和EcoRⅠ酶切后，连接构建pVAX1-gB质粒，将pVAX1-gB质粒和gD基因(SEQ ID NO:2)经NotⅠ和XbaⅠ酶切后，连接构建pVaX1-gB-gD质粒，以构建的pVAX1-gB-gD质粒为模板，通过PCR扩增的方法获得两端为PacⅠ和FseⅠ酶切位点，并且含有T7启动子、终止子的的插入盒。引物如下：

gBDF:5′CATGGCCGGCCTAATACGACTCACTATAGGGAGAC3′和gBDR：5′GCTCTTAATTAAAGCCATAGAGCCCACCGCATCCC3′

用PacⅠ和FseⅠ消化PCR产物，片段大小约为4343bp。用PacⅠ和FseⅠ消化质粒pBRT7H-La，生成大小为19812bp的片段。将这两个片段连接生成质粒pBRT7H-LP。

6表达PRV gB和gD基因的NDV载体的生成及鉴定

为生成表达PRV gB基因和gD基因的工程改造的NDV载体，使用了以下反应剂和条件。将步骤3的质粒pBRT7H-LP用作转录质粒。将质粒pCI-NP、pCI-P和pCI-L分别用作NP、P和L蛋白质的表达质粒。将这四种质粒一同共转染进入BHK细胞。72小时后，将BHK细胞上清接种9日龄SPF鸡胚以扩增病毒。3天后，收获尿囊液并使用鸡血红细胞检查红血球凝聚活性(HA)。成功获得了NDV-PRV-gB-gD的感染性颗粒。使用QuiaAMP病毒RNA提取试剂盒(Qiagen)提取RNA。使用一步RT-PCR试剂盒(Qiagen)进行RT-PCR。测序结果显示gB基因和gD基因与克隆入转录质粒的gB基因和gD基因原始序列均为100％相同。将该重组病毒载体记为vNDV-PRV-gB-gD。

7对NDV-PRV疫苗在猪中的临床评估

表5 vNDV-PRV-gB-gD疫苗免疫仔猪情况

组别	免疫方式	免疫剂量	仔猪数	攻毒剂量
					vNDV-PRV-gB-gD	皮下免疫	2mL	4	2×108.0TCID50
PBS	皮下免疫	2mLPBS	4	2×108.0TCID50
					空白对照	—	—	4	—

将21日龄PRV抗体阴性仔猪20头随机分成3组，4头/组，将vNDV-PRV-gB-gD稀释至10^7.0EID₅₀/mL，按照表5免疫vNDV-PRV-gB-gD疫苗2ml/头，对照组接种PBS液2ml/头。免疫后28日后攻毒，攻毒剂量为HN1201株猪伪狂犬病病毒2×10^8.0TCID₅₀/头，观察临床症状和死亡情况(结果见表6)。

表6 vNDV-PRV-gB-gD疫苗免疫仔猪后的攻毒情况

表6显示，vNDV-PRV-gB-gD疫苗免疫仔猪后，虽然不能阻断病毒感染(出现临床症状)，但能为仔猪提供100％(4/4)保护，而对照仔猪攻毒后4日后全部死亡，因此，vNDV-PRV-gB-gD疫苗具有很好的保护力。

以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (5)

1.一种猪伪狂犬病病毒疫苗组合物，其特征在于，所述的疫苗组合物包括重组新城疫病毒-猪伪狂犬病病毒载体以及佐剂；其中，所述的重组新城疫病毒-猪伪狂犬病病毒载体是表达猪伪狂犬病病毒gB蛋白、gD蛋白的新城疫病毒载体；其包含新城疫病毒NP、P和L基因以及猪伪狂犬病病毒gB、gD基因，所述的猪伪狂犬病病毒gB、gD基因分别编码SEQ ID NO.3所示的gB蛋白和SEQ ID NO.4所示的gD蛋白。

2.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其特征在于，所述的新城疫病毒为弱毒株。

3.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其特征在于，所述的新城疫病毒为新城疫病毒LaSota株。

4.一种制备权利要求1-3任一项所述疫苗组合物的方法，其特征在于，所述的方法包括：

1)构建包含所述新城疫病毒基因组全长cDNA的重组载体的步骤；

2)构建分别包含所述新城疫病毒NP、P、L基因ORF的辅助质粒的步骤；

3)将所述猪伪狂犬病病毒抗原基因gB、gD构建到所述步骤1)的所述重组载体中，获得转录质粒的步骤；以及

4)将所述步骤3)获得的转录质粒和步骤2)获得的所述辅助质粒共同转染细胞，进行病毒拯救的步骤。

5.根据权利要求1-3任一项所述的疫苗组合物在制备预防和/或治疗猪伪狂犬病病毒相关疾病或由猪伪狂犬病病毒导致的感染的药物中的应用。