JPH05501053A - 鳥類予防接種用低毒性ラリンゴトラチェイチス（ｉｌｔ）ウイルス - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 鳥類予防接種用低毒性ラリンゴトラチェイチス（ＩＬＴ）ウィルス本発明の分野 本発明は、鳥類の予防接種に用いられる感染性ラリノゴトラチェイチス（Ｌａｒ ｙｎｇｏｔｒａｃｈｅｉｔｉｓ；　ＩＬＴ）ウィルスに関するものである。

このＩＬＴウィルスは、ヘルペス属のウィルスで家禽類からなる群れの数を周期 的に大幅に減少させるので、そのようなウィルスによる家禽類の減少を抑えるこ とは、商業的重要性を有するものとなる。そのようなＩｉＩ整、通常、生ワクチ ンを用いたり、衛生／検疫実務を充実させることによってなされて０る。したが って、この病気は家禽産業の発達した多くの国では、もはや主要疾宙力）らＩｉ ｆされ。

ており、さほど大きな問題ではない。しかし、庭先に（曳る鳥や、飼育室１こ飼 育れている鳥、異なる齢からなる集団において毒性ｒＬＴを保存する個体が存在 し続けていることから、予防接種されていない産卵鶏や焼き肉用ひなどり（ブロ イラー）の群れにおいてＩＬＴが広がる危険性がある。

本発明の背景 従来から、研究の方同は、はとんどが、毒性変化に対する体液性抗体の防御能力 に関する研究とともに、生ワクチンを用いる防御の実験的誘導に向Ｉｆられて０ た。また、不活性化ＩＬＴワクチンが使用されてきた。し力１し、毒性株の作用 を調整することが困難であること、また抵抗性が生ずること力）ら、予防接種の 新しい形態およびウィルスの特に新しい非毒性株の選択がつね１こなされてきた 。

ＩＬＴウィルスと宿主の免疫系との関係は、一般にウィルス血症また１ま白血球 の感染を含むものではない。細胞性免疫は、明ら力、ｌ：ｌＬＴワクチン防御の 主要メディエータ−（調停者）であり、気管洗浄にお０て検出されるウイＪレス 中和活性のような付加的活性を有する。ＩＬＴウィルス粒子の防Ｉｌ＋誘導成分 １１現在同定されている。また、抗体研究によって、野生株の主要エノベロープ 糖タンパク質と、ＩＬＴウィルスのワクチン株との間の実質的な抗原的類似性が 示されている。

歴史的には、米国およびオーストラリアにおいては、ＩＬＴウィルス感染の調整 に関心がよせられている。なぜなら、このような鳥類呼吸疾患ンンドロームは、 １９２０年代中頃において両国で発生しているからだ。［Ｂａｎ５ｏｎ、　Ｌ、 Ｅ、　（１，９８４）Ｌｎ：　Ｆ１１ｅａ８ｅｓＯｒ　Ｐｏｕｌｔｌｒｙ、　８ ｔｈ　ａｄ、　（Ｍ、Ｓ、　１ｌｏｆｓｔａｄ　ａｎｄ　ｏｔｈｅｒｓ、　ｅｄ ｓA）、　４４４−４５ １　Ｉｏｔａ　５ｔａｔｅ　［１ｎｉｖａｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ、＾ｗａｓ、 ｌｏｗａ］　”ノゝドソンおよびビュープツトは、孔（ｖｅｎｔ）を経てＩＬＴ を予防接種することが成功したことを１９３３年に報告している［Ｉ］ｕｄｓｏ ｎ、　Ｃ，Ｂ、　ａｎｄ　Ｂａａｕｄｅｔｔｅ、　Ｐ、Ｒ，（１９Ｈ）　Ｃｏｒ ｎｅｌｌ　Ｖｅｔａｒｉｎａｒ奄■ ｎ、　２３＋　６３−６５１゜この報告は、鶴類病原園の予防接種に関する最初 の例である。

しかし、彼の！１．Ｔウィルスと免疫応答とに関する総説からＡ０数年後、ヒツ チナー［旧ｔｃｈｎｅｒ、　Ｓ、Ｂ、（１９７５）Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｊｏｕｒ ｎａｌ　ｏｆ　Ｖｅｒｉｎａｒｙ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　３６F　５１ ａ−ｓｉ９１は、はとんどすべてのＩＬＴ研究は、病原性、ワクチンによる防御 の開始およびその継続の評価と、部分的に弱毒化されたワクチンの開発の実験的 側面に向けられていることを注目して見守った。

世界の主な家禽産業において弱毒化ワクチンの利用によって実質的に調整されて きてきたが［Ｂｌｇｇｇ、　Ｉ’、Ｍ、（１９８２）＾ｖｉａｎ　Ｐａｔｈｏｌ ｏｇｙ、　１１：　２８１−３００コ、［Ｂａｎ５ｏｎ。

Ｌ、Ｅ、　（１９８４＞　Ｉｎ：　Ｄｉｓｅａｓｅｓ　ｏｒ　Ｐｏｕｌｔｒｙ、 ８ｔｂ　ａｄ、　（Ｍ、Ｓ、Ｂｏｆｓｔａｎｄ　ａｎｄ　ｏ狽■■窒刀B ａｄｓ、）、　ｐｐ、　４＜４−４ｓ１．　Ｉｏｔａ　５ｔａｔｅ　ｕｎｉｖｅ ｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ、＾−ａｓ、　Ｉｏｔａ］、それに烽■ かわらずＩＬＴ＠染および疾患の散発的勃発が続いており、特にいろいろな齢か らなる商業的部分においてはそのような調整が困難である。

ＩＬＴウィルスに対する既知のワクチンの欠点は、病原性単離法を用Ｌｌること によって高い致死率が生ずることである。毒性の低い従来のＩＬＴワクチンは、 鳥を守る能力が低い。ＳＡ２株は、現在のところ、オーストラリアで最も使用さ れてるウィルス株のひとつである。この株はいくつかの副作用を誘発させるもの であり、鶴の齢や、投与および飼育方法にもよるが、予防接種されたブロイラー の２ないし３％を殺してしまう。・二の疾もそれ自体は群れの２０％を殺すもの だが、この疾去は、その毒性を少なからず有するＳＡ２ワクチンの連続的使用ζ こよって緩和化されて散発的様相を示すようになるので家禽中にその疾患が保存 さ１ｔてしまう可能性がある。

本発明の開示 本発明の好ましい実施態様においては、高い免疫原性を有し、かつ病原性の低い ウィルス株を提供することによって従来技術の問題点を克服または実質的に改善 し、公衆にＩＬＴワクチンの選択的形態を提供することを目的とするものである 。さらに、本発明は、飲料水、スプレィ、点眼または直腸投与（ｃｌｏａｅａｌ 　ａｄｓｉｎｊｓｔｒａｔｌｏｎ）によって簡単に投与することが可能な商業用 ＩＬＴワクチンを提供することを目的とするものである。

本発明の第一の発明は、商業卵の尿素絨毛膜上に、平均痘疹直径が１．０から３ ｍｍの間にある痘そうを生じさせ、かつＩＬＴＳＡＺ株と比較して実質的に毒性 が減少したことによって弱毒化され、Ｓ　Ａ　７．株に感染された家禽と比較し て家禽の体重減少が実質的に少なくなるような、さらにそれにも係わらず高い免 疫原性を示すようなＴＬＴウィルスを提供することである。

本発明の箪−の発明の変形例では、Ａ２０と指定された弱毒ＩＬＴウィルスを含 むものである。この試料は、動物培養細胞欧州フレクシ１ン（Ｅｕｒｏｐｅａｎ 　Ｃｏ１ｔｓｅｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ： 　ＥＣＡＣＣｋ　Ｐｏｒｔｏｎ　Ｄｏｗｎ、　Ｓａｌｉｇｂｕｒｙ、　ＵA区９ ）へ１ ９８９年４月２６ｉに寄託されたもので、登録番号Ｖ８９０４２６０２が与えら れている。この株は、２０代にシたって継代されたＳ　Ａ、　２株りローンＡで あって、以下、Ａ２０株とする。

このような特定株は、またそれと同等の機能を有するものは、ＳＡ２株細胞培養 系での一連の継代によってウィルスを弱毒化させることによって得られた。−次 細胞培養での一連のＳＡ２ウィルスの継代は、継代５ないし３０回の間で顕著な 病原性の減少を引き起こす。

免疫原性に関しては、より高い継代レベルは不適当であると証明された。もつと も改良されたウィルスは、継代５ないし２５回の間で達成された。−次細胞培養 における連続的な継代後に、単離法（アイル−ト）をさら１こト′ロンブトメツ ブレンルート（ｄｒｐｐｅｄ誦ｅｍｂｒａｎｅ　ｒｏｕｔｅ）を経て胚形成ｇＩ ］（ｅ＋＋ｂｒｙ’ｏｎａｔｅｄ　ａｓｓ）上で継代を約５回行なった。

寄託されたＩＬＴウィルスの株であるＡ２０株と、その機能的に等価なものとは 、商業外の尿素絨毛膜上に、平均ｔＬｇＥ直径が１．０から３ｍｍの間にある度 そうを生じさせ、 かつＩＬ丁ＳＡ２株と比較して実質的に毒性が減少して弱毒化され、ＳＡＺ株に 感染された家禽と比較して家禽の体重減少が実質的に少なくなった。しかもそれ にも係わらず１本発明は高い免疫原性を示した。

本発明の第二の発明は、商業外の尿嚢絨毛膜上に、平均庖疹直径が１．０から３ ｍｍの間にある痘そうを生じさせ、かつＩＬＴＳＡ２株と比較して実質的に毒性 が減少して弱毒化され、ＳＡ２株に感染された家禽と比較して家禽の体重減少が 実質的に少くなるような弱毒化ｆＬＴ株の有効量を含むワクチンからなるもので ある。特に、この発明の好適な実施ｃ様では、ＩＬＴ株は、動物培養細胞欧州フ レクシ璽ンに寄託され、登録番号Ｖ８９０４２６０２が与えられた株で、かつ２ ０代にわたって継代されたＳＡ２株クロりンＡである。

有効量は、免疫応答を引き出すのに十分な量である。本発明にもとづくワクチン は、経口（例えば、飲料水として）、吸入、点眼、または直腸経由で投与される が、もちろんこれらに限定されるものではない。

また、ワクチンは他の薬剤学的に許容される化合物または他の抗原またはそれら の部分を生ずるか、あるいは予防接種に用いられるような他のウィルスまたはａ ｍを含むものである。

本発明にもとづいて産生されるワクチンは、低毒性を示す。少なくとも六ケ月の 防御継続を提供し、ＳＡ２ワクチンと比較して体重減少および群れ致死率減少に 関してひな鳥（ｃｈｉｃｋｅｎ）に対する安全性が高い。

本発明の藁三の発明は、ワクチンに用いられる弱毒化ウィルス産生方法に関する もので、このワクチンは一次細胞培養において連続的に継代、好ましくは継代を ５ないし３０回され、その後に胚形成卵において継代を５回されたＳＡ２株を含 むものである。

本発明の第四の発明は、ｌ１ｌｌＢにおＩするＩＬＴウィルス感染を予防する方 法に関するもので、鴫に弱毒化ウィルスを含むワクチンの有効量を投与する。こ の弱毒化ウィルスは、ＩＬＴＳＡ２ウィルスを連続的に継代するこによって作ら れるもので、平均庖疹直径が１．０から３ｍｍの間にある痘そうを生じさせ、か つＩＬＴＳＡＲ株と比較して実質的に毒性が減少して弱毒化され、ＳＡＺ株に感 染された家禽と比較して家禽の体重減少が実質的に少ないことを特徴とするもの である。

この発明の特に好適な実施店様では、ワクチンは寄託されたＡ２０株またはその 機能的に等価なものとを含む。

図の簡単な説明 第１図は、制限酵素による切断がなされたＩＬＴウィルスの３種類の株のＤＮＡ プロファイルを示すもので、継代レベルが５および２０のＳＡ２クローン八を含 む。

本発明を実施するための最良の形態 本発明を、下記の実施例にもとづいてさらに記述する。

ＳＡ２ウィルスワクチンを鶏腎臓細胞の単層培養で５回または２０回連続継代し た。これらの継代によって単離されたウィルス株をクローンＡ株とし、さらに継 代５日目のクローンＡをＡ５、継代２００日目クローンＡをＡ２０とした。５ま たは２０継代の後に、単離ウィルス株をドロップドメンプレ／ルートを介して胚 形成卵に接種することによってさらに連続的に継代した。

胚形成卵での継代５＠後、ワクチ／として使用するために単離ウィルス株を適当 な安定剤と混合した。

１、商業外の尿曹絨毛腹上に形成される庖疹の大きさ第１表 ウィルス　平均庖疹直径（ｍｍ）　標ｔ１ｓ偏差サリスバリー（Ｓａｌｉｓｂｕ ｒｆｆ）（ｌｌ性：ＶＩｒｕｌｅｎｔ）　５．　Ｑ　Ｏ１、２１Ａ５およびＡ２ ０株による庖疹は、均一的に小さいが、ＳＡ２株による庖疹は、２つのグループ にわけられる。すなわち、ひとつは小さな庖疹（クローンＡに類似）からなるグ ループで、他は大きい庖疹（５−７ｍｍ）からなるグループである。クローンＡ （Ａ５およびＡ２０）による庖疹は、ＳＡＺ株による庖疹の平均的大きさよりも 著しく小さい（Ｐｒｏ、００１）。

毒性株による庖疹は、きわ立って大きいが、わずかながら小さな庖疹（３ｍｍ＞ も存在する。

（以下、余白） ２、生後７日目のブロイラーひな鳥（ｃｈｉｃｋｅｎ）に気管内接種を行なった 後の毒性を、接種後２１日間にわたって追跡調査した。

第２表 実験　ウィルス８　生存鳥数　致死鳥数　背致死率“４　Ａ２０　１４９　１９ 　１１．３ 本すべてを１０．０００ｐｆｕ／羽に調整　ｐｆｕ＝ｐｏｃｋ　ｆｏｒｍｉｎｇ 　ｕｎｉｔｓ　（１に疹形成単位）＋接種７臼目での全致死率 ３、生後　８目の商業鶏に３０．０００ｐｆｕ／羽となるように点眼接種した後 の毒性第３表 ウィルス　接種後２週間目の平均体重　接種後の致死数（ｌＬＴ＋ｖｅ）　／全 体 Ａ５　２２１．４　１／３９ Ａ２０　２２４．９　０／４１ ＳＡ２０　２０５．２　３／３５ 対照群（未接種）　２４２．８　０／４２＄３５−４０鳥／群 ＳＡ２接橿接種、対照群と比較してたいへん軽い（Ｐｒｏ、０１）。

Ａ５およびＡ２０接種群は、対照群上比較してあきらかに軽い（Ｐｒｏ、０５） 。

Ａ２０接種群では致死が認められなかったが、ＳＡ２接種では、点眼後に８．６ ％の致死率（Ｎ、［３いく羽かの鳥は、この実験中にマイコプラズマ感染症によ って死亡。同時発生的に生じたマイコプラズマ感染は、ｒＬＴ毒性効果によって 悪化されたものであろう）を示した。

（以下、余白） ４、毒性ＩＬＴに対する防御 第４表 実験　ウィルス　予防接種　予防接種　チャレンジ　＄ＩＬ丁臨床　％致死経路 　量子　経路　的徴候 Ａ　Ａ５　気管内　１０．０００　ＩＴ”　４　０Ａ２０　１０　０ ＳＡ２　２０　０ 対照群　−＋００　７０ Ｂ　Ａ５　眼　３０．０００　ＩＴ”　６．７　０対照群　−−８５３５ ＣＡ２０　排出孔　３．００１１　Ｃ／Ｉ　Ｏ−Ａ２０　（ｃｌｏａｃａｌ）　 ３００　０　−Ａ２０　３０　１０　− Ａ２０　３　１ｏｏ　一 対照群　−−８８，９− Ｄ　Ａ２０　排出孔　３０　Ｃ／１　２０．４　−Ａ２０　眼　６６．７　− Ａ２０　噴ｇ　２０　− Ａ２０　経口　６．７　一 対照群　−−７３，３− Ｅ　Ａ２０　眼　３，０００　ＩＴ”　Ｏ，’Ｏ３Ａ　２　１０．０００　０　 、　０ Ａ２０　噴霧　３，００Ｇ　３３．３　１６．７Ｓ　Ａ　２　１０．０００　０ 　０ Ａ２０　経口　３．０００　０　０ Ｓ　Ａ　２　１０．０００　０　０ 対照群　−−Ｉｏｎ　１１１．２５ 十痩疹形成単位／羽 ★ＩＴ−気管経由、Ｃ／ｆ−結膜に滴下−Ｃ／ｉを介して期待される致死はない 。

チャレンジ（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）は、いつも１０’ｐｆｕ／鳥のサリスバリー 株毒性ＩＬＴによるが、最後の実験（Ｅ）は１０’ｐｆｕ／鳥でなされた。

ＳＡ２ワクチン（実験Ａ、ＢおよびＥ）との直接的比較によれば、毒性ＩＬＴに 対する防御に関してＡ２０ワクチンはＳＡ２ワクチンと同等もしくはそれ以上の 効果を示した。

全ての実験Ａ−Ｄにおいて、チャレンツが接種後２週間で生じた。また、実験Ｅ では接種後６週間でチャレンジが生じた。このことは、免疫が少なくとも６週間 続いたことを示している。

ＩＬＴウィルス株は、ＤＮＡ制限酵素による切断地図によって分類される。

１５種類の制限酵素をＳＡ２クーローンＡ株、その親株ＳＡ２、そして同様に毒 性サリスバリー株との間の分類に用いた。

以下の表は、制限酵素とその切断部位とを表わしたものである。

（以下、余白） 第５表 制限酵素　ＤＮＡ切断配列 ＢａｍＨＩ　ＧＧＡＴＣＣ Ｂｇｌ工Ｉ　ＡＧＡＴＣＴ Ｄｒａ工　ＴＴＴＡＡＡ ＥｃｏＲＩ　ＧＡＡＴＴＣ ＥｃｏＲＶ　ＧλＴＡＴＣ Ｈｉｎｃエエ　ＧＴＰｙＰｕＡＣ ＨｉｎｄエエＩ　ＡＡＧＣＴＴ ｉ（ｐＡ　Ｉ　ＧＴＴＡＡＣ Ｋｐｎ工　ＧＧＴＧＣＣ ＮａｅＩ　ＧＣＣにＧＣ ＰｓｔＩ　ＣＴＧＣＡＧ Ｓａｃ工　にＡＧＣＴＣ ５ｍａＸ　ＣＣＣＧＧＧ Ｘｂａ工　ＴＣＴＡＧλ ＸｈｏＩ　ＣＴＣＧＡＧ （制限酵素による切断は、メルヂルノのバークヴイルにあるコモノウエルス　サ イエンティ、り　アット　インダストリアル　リサーチ　オーガニゼー／１〕の アニマルヘルス部のミフチェル／エバード博士によって実施された）１５種類の 制限酵素のすべてが、毒性サリスバリー株およびＳＡ２株と、ＳＡ２クローンＡ 株とを区別した。４つの制限酵素が３つの株（すなわち、ＳＡ２株、ＳＡ２クロ ーンＡ株、そしてサリスバリー株）のすべてを区別したが、ＳＡ２クローンＡ株 の継代５＠目および２０回目の単離株間を区別するような制限酵素はなかった。

第１図は、制限酵素ＢａｍＨ１，Ｂｇｌｌｌ、ＥｃｏＲＩ−モしてＮａｅｌを用 いてＩＬＴウィルスの３種類の株： （１）ＳＡ２株（継代Ｎｏ、２）； （１１）サリスバリー株、この株はＩＬＴウィルスの毒性株である；（Ｉ　Ｉ　 Ｉ）ＳＡ２クローンＡ株、この株では継代５回目のものと、継代２０回日のもの とを比較した。

得られた結果から、毒性サリスバリー株は、ＳＡ２株およびＳＡ２クローンＡ株 のどちらに対してもたいへん異なることが明らかである。しかし、のＤＮＡをそ れぞれ消化することによって得られたＤＮＡ電気泳動パターンである。前記の消 化パターンによれば、ＳＡ２クローンＡを作るためにＳＡ２株を弱毒化する過程 で、ＳＡ２からＳＡ２クロー／Ａへの分化が可能となるようなウィルスの遺伝的 物質の顕著な変化が起こると考えられる。

ＢａｍＨＩによる制限パターンによれば、ＳＡ２とＳＡ２クローンＡとの間では 、最初の３つのバノどの分子量がわずかながら変化しており、またＳＡ２の５番 目のバンドはＳＡ２のみに認められた。制限酵素Ｂｇｌｌ＋を用いた場合は、Ｓ Ａ２に独特の第２のバンドが生じており、またＥｃｏＲＩを用いた場合ではＳＡ ２クローノＡの２種類の単離株とＳＡ２株との間で第２および第３バツドの分子 量がわずかながら変化していた。制限酵素Ｎａｅｌを用いた場合は、分子量マー カー３７と４，２Ｋｂとの間にＳＡ２Ａ２時のバンドが認められた。

以下のようにして、［ＬＴクローンＡ２０株を含むワクチンの安全性と有効性と を調べた。

生後７回目の鳥、約１１，４５０個体に対して飲料水を介してＩＬＴ２０株によ る予防接種を施した。また、ワクチアを２．　５ｇ／＋のスキムミルク粉末を含 む飲料水４０リツトルによって再構成した。この再構成されたワクチンを２時間 にわたる飲料水飼料供給停止の後に、それらの鳥にトリツカ−を介して与えた。

鳥−羽あたりの量を計算すると、７，０ＯＯｐｆｕ／羽となる。飲料水を介した ワクチンの安定性を追跡し、その結果再構成後１時間は変化しないことがわかっ た。

予防接種後８日間、すべての死亡個体数は、獣医学スタッフによる剖検によって 決定された。すべての鶏は、ワクチアに起因すると思われる結膜炎などの臨床的 徴候について調べられた。通常の商業眉農場での調査では、死亡率、餌消費量、 体重について調べた。

東６図は、予防接種７日前と予防接種８日後での全集団における死亡個体数と、 劣等なものとして取り除かれた個体数（ｃｕｌｌｇ）とを示すものである。剖検 によれば、ＩＬＴ＠染の結果と思われるような予防接種後の死亡は認められなか った。

（以下、余白） 箪６表 ＩＬＴ　Ａ２０を含む飲料水を介した予防接種の前後における死亡個体数針　死 亡個体数　劣等個体　全群の　コメント（日）　（Ｃｕｌｌｓ）数　累積％ ２　１３　０．２２ ３　１０　０．３１ ４　５　３　０．３８ ５　１４　２　０．５２ ６　６　４　０．６０ ７　５　０．６５　予防接種日　ＩＬＴＡ２０８　５　２　０．７＋ ９　１　０．７２ ｔｏ　’２　０．７３ １１　４　０．７７ １２　６５　１、　３３　０．５５％　窒息死１３　１　１．３４ １４　１５　１．４７　ビークトリム（Ｂｅａｋ　Ｔｒｉｍ）１５　１４　１． ６０ 予防接種後７日目始めにおいて、くちばしのトリミングを実施したが、ＩＬＴＡ ２０ワチクンを受けた鳥に観察されるような問題は無かった。

予防接種を受けた鶏のうち３０羽は、同一の群れの予防接種を受けてｔｌな０対 照群の鶏２５羽と同様に、予防接種後４週間（鳥の齢−５週１日）において点眼 により１０，０ＯＯｒｆｕ／羽のＮＳＷ毒性ＩＬＴの投与を受けることによって チャレンジされた。第ニゲループの予防接種を受けた鶏の３０羽と予防接種を受 けていない対照群の８２５羽とは、それらの齢が７週４日のときの予防接種後４ ６日で同様のチャレンジ方法にもとづいてチャレンジされた。予防接種後の鶏へ のチャレンジの結果を第７表に表わした。

第７表 ＩＬＴＡ２０によるチャレンジに対する齢７日で予防接種された鳥の応答群　齢 （週）　チャレンジ日　防御された　全鳥数　％防御鳥数 予防接種　５　１　２４　３０　８０ 対照　５　１　０　２５　０ 予防接種　７　４　３０　３０　１００対照　７　４　０　３０　０ 本チャレンジに対する防御は、チャレンジされた眼に結膜炎が認められなｔｌこ とによって評価した。

このフールトドイアルの結果が示すことは、以下のことである。すなわち、】、 飲料水によってワクチンを鶏の大群に容易に投与することができる：２、予防接 種後の副作用が認められない：そして、３、このワクチンの有効性は高く、試験 された鳥の８０％が５週間目でのチャレンジにおいて防御され、また試験された 鳥の１００％が７週間目でのチャレンジにおいて防御されたことから、８０ない し１００％の間が実蕨の群れ防１ＩＩ１１範囲だと思われることである。

フィールドトライアル２ ７種類の翼なる商業的目的上の２５群の３００，０００羽の鶏に、前記フィール ドトライアルｌと同様の方法によってＩＬＴＡ２０の予防接種を行なった。予防 接種時における鳥の齢は、７から１２日の間である。

いくつかの群れには、標準的方法として、ＩＬＴＡ２０投与前または後のどちら か一方において結節性発疹ワクチンを投与した。また、くちばしトリミング（ｂ ｅａｋ　ｔｒｉｍｍｉｎｇ）が種々の群れで必要とされるように種々の時間にお いて実施後予防接種反応（ｐｏｓｔ−ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ）は検出されず、 ワクチンが原因となるような問題は起こらなかった。したがって、このようなフ ィールド条件下でのＩＬＴＡ２０ワクチン投与は安全と判断された。通常の方法 （くちばしトリミング結節性発疹予防接種など）では、ＩＬＴＡ２０によって予 防接種された鳥においてＩＬＴ反応は誘導されない。

フィールドトライアル３−ブロイラー（ｂｒｏｉｌｅｒ　５ｔｒａｉｎ　ｂｉｒ ｄ）に対する安全性および有効性 この商業的フィールドトライアルでは、飲料水のかたちでＩＬＴＡ２０を１９゜ ０００羽のＱ（齢７日）に予防接種した。予防接種の実際の方法は、フールトド ライアルＮｏ、ｌと同様である。−羽あたりの投与量は、５０００ｐｌｕであつ た。比較可能な数からなる鳥を予防接種されていないオン・サイト（ｏｎ　５ｉ ｔｅ）対照群とした。いく羽かの鳥を予防接種前に群れから除去して後述するチ ャレンジ調べのオフ・サイト対照群とした。

各鳥は、予防接種後１０日間にわたって観察され、すべての死亡原因が調べられ た。その結果を第８表に示す。

第８表 ＩＬＴ　Ａ２０による予防接種後のブロイラー（齢７日）の死亡数につｔ＼て予 防接種後の経過日数　オン・サイト対照群　ワクチン接種’ＩＬＴによる病変数 ／あらゆる原因による死亡数予防接種後１０日間の間は、臨床的なＩＬＴ徴候、 結膜炎やワクチンによると思われるような問題が認められなかった。剖検によれ ば、１９，０００羽以上の予防接種された鶴のうち、ＩＬＴによる病変により死 亡したのはたったの４羽であった。また、体重にもとづく鳥の成長率に対しては 、第９表（体重は１００羽の平均重量で表わした）に示すように、ワクチンは何 ら影響を与えなかった。

第９表 ＩＬＴＡ２０のワクチン接種のブロイラーの体重（ダラム）１こ対する影響齢　 オン・サイト　ワクチン接種　標的体重１　相違率１対照群 ３実行目標としての理想体重 ”実際の体重と標的体重との相違率 第１０表 予防接種後２週問および５週間目でのチャレンジに対する鳥の反応群　チャレン ジ時　防御された　全鳥　防御率％の齢（日）　鳥数９　数 オフ・サイト対照群 オン・サイト対照群　２８　７　６０　１１．７ワクチン接種　２１　６０　６ ０　１００オフ・サイト対照群 オン・サイト対照群　４２　４　６０　６．７ワクチン接種　４２　６０　６０ 　ｔｏ。

０チヤレンジに対する防御は、チャレンジされた眼に結膜炎が認められなｔｌこ とによって評価した。

第１０表は、ＩＬＴＡ２０が予防接種された鳥に１００％防御を与えることを示 すものである。この防御は、鳥の一生続く。

オン・サイト対照群は、いくつかの防御は、予防接種された鳥からの膠場におけ るウィルス水平感染の結果としての可能性があることを示している。第一次のチ ャレンジにおいてはオフ・サイト対照群の防御率は低く（１］、、７％）、第二 次チャンレンジでは６，７％に落ちる（最小水平感染をなす）。オフ・サイト対 照群は、何ら防御を示さなかった。一方、予防接種された群では、防御率が１０ ０％であった。

以上のことから、フィールドトライアルＮＯ３３によれば、１、何ら困難をとも なわずに、多くのブロイラーに飲料水によって［ＬＴＡ２０ワクチンを投与する ことができる； ２、ＴＬＴＡ２０ワクチンは、フィールド条件でブロイラーの群れにおいて安全 である。ワクチン投与は、最小の損害効果しか与えない。Ｉ　ＬＴＡ２０ワクチ ン投与による体重減少、死亡率上昇および品質の低下は認められない：そ１．て ３．１＋、Ｔワクチンは、高い有効性を示す。予防接種された鳥の１００％が、 齢３および６週（処理前の鳥の齢は６週）でのチャレッジに対して防御された。

ｏＮｐ分子ｍ−ｙ−ｈ−（＋　３ｉｔｂ−＋４ｋｂ）は、左側（こ示しｔこ。

国際調査報告 １１１１１！ｒｌｌｌｌＮｌｌｌｌｌｌｌ　Ａ１１９１−（１＋１６１１　＃Ｏ Ｆ＜ゴ／Ａｌｌ　９０１０Ｏ’Ｘ２２Ａ＋ｌ１ｆｌＴｏＴｔｌＥＩ１７ｒ’Ｄｔ ｍ、ＴＩα（へＪシ５ＥＡＪｔＯＩＲＥ丁’ｃｒ（ｒαコ■ｎり廿ＩＡＴＩαＩ ＡＬ　Ａ、ＰＰＬＩＣＡＴＩαＪ　ｌＯ，ｒ’ｆ？ｒ　ＡＵ　９０００３２２Ｅ Ｐ　２５３３Ｐ、９　ＪＰ　６３０２１４Ｅ１

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. １．弱められたＩＬＴウイルスであって、該ウイルスは、商業卵の尿嚢絨毛膜上 に形成される平均痘疹直径が１．０から３ｍｍの間にある痘そうを生じさせ、か つＩＬＴウイルスＳＡ２株と比較して実質的に毒性が減少され、また前記ＳＡ２ 株に感染された家禽と比較して前記弱められたＩＬＴウイルスによって感染され た家禽の体重減少が実質的に少なく、さらに高い免疫原性を示すことができるこ とを特徴とする弱毒化ＩＬＴウイルス。
2. ２．請求の範囲第１項記載の弱毒化ＩＬＴウイルスであって、該ウイルスは、Ｅ ＣＡＣＣ登録番号Ｖ８９０４２６０２の抗原性および毒性を有することを特徴と する弱毒化ＩＬＴウイルス。
3. ３．請求の範囲第１項または第２項記載の弱毒化ＩＬＴウイルスであって、該ウ イルスは、ＥＣＡＣＣ登録番号Ｖ８９０４２６０２のウイルスであることを特徴 とする弱毒化ＩＬＴウイルス。
4. ４．弱められたウイルスを含むワクチンであって、該ワクチンに含まれる前記ウ イルスは、請求の範囲第１項ないし第３項のいずれか一項に記載された弱毒ウイ ルスを含むことを特徴とするワクチン。
5. ５．請求の範囲第４項記載のワクチンであって、該ワクチンは、さらに付形剤、 希釈安定剤および担体から選択される一成分を含むことを特徴とするワクチン。
6. ６．請求の範囲第４項ないし第５項のいずれか一項記載のワクチンであって、該 ワクチンはさらに他の薬剤学的に許容される化合物また抗原またはそれらの断片 、またウイルスまたはウイルス粒子を含むことを特徴とするワクチン。
7. ７．請求の範囲第４項ないし第６項のいずれか一項記載のワクチンであって、該 ワクチンは、経口、噴霧、点眼、そして直腸投与からなる群から選択あれる方法 による投与に適したものであることを特徴とするワクチン。
8. ８．ワクチンに使用されるために、弱められたウイルスの生産方法であって、該 方法は、一次細胞培養においてＩＬＴウイルスＳＡ２株の一連の継代を実施し、 その後に胚形成卵で一連の継代を行なうことが含まれること特徴とする弱毒化ウ イルス生産方法。
9. ９．請求の範囲第８項記載の方法であって、前記ウイルスの株は、前記細胞培養 において５から３０回連続して継代されることを特徴とする弱毒化ウイルス生産 方法。
10. １０．請求の範囲第８項または第９項記載の方法であって、前記胚形成卵での一 連の継代は、５回の継代であることを特徴とする弱毒化ウイルス生産方法。
11. １１．鳥におけるＩＬＴウイルスの感染を予防するための方法であって、該方法 は、請求の範囲第１項、第２項または第３項のいずれか一項記載の弱毒化された ウイルスの株を有効量含むワクチンを鳥に投与することが含まれることを特徴と するＩＬＴウイルス感染予防方法。
12. １２．鳥におけるＩＬＴウイルスの感染を予防するための方法であって、該方法 は、 商業卵の尿嚢絨毛膜上に形成される平均痘疹直径が１．０から３ｍｍの間にある 痘そうを生じさせ、かつＩＬＴウイルスＳＡ２株と比較して実質的に毒性が減少 きれ、また前記ＳＡ２株に感染された家禽と比較して前記弱められたＩＬＴウイ ルスによって感染された家禽の体重減少が実質的に少なく、さらに高い免疫原性 を示すことができる弱毒化ＩＬＴウイルスを含むワクチンの有効量を鳥に投与す ることが含まれることを特徴とするＩＬＴウイルス感染予防方法。
13. １３．ＩＬＴウイルスによる感染を予防するための方法であって、弱毒化ウイル スは前記請求の範囲第２項または第３項にクレームされた弱毒化ウイルスである ことを特徴とするＩＬＴウイルス感染予防方法。