DE69935721T2

DE69935721T2 - Kälteadaptierte Pferdeinfluenzaviren

Info

Publication number: DE69935721T2
Application number: DE69935721T
Authority: DE
Inventors: Patricia W. Pittsburgh DOWLING; Julius S. Pittsburgh YOUNGNER
Original assignee: University of Pittsburgh
Current assignee: University of Pittsburgh
Priority date: 1998-08-13
Filing date: 1999-08-12
Publication date: 2008-02-07
Anticipated expiration: 2019-08-13
Also published as: US20030180322A1; JP2009297040A; EP1854886A3; WO2000009702A1; AU5487799A; US6649169B2; JP5261338B2; AU760356B2; JP2012085657A; CA2339089C; EP1105497A1; ATE358722T1; ES2286892T3; DK1105497T3; EP1105497B1; US6436408B1; JP4583602B2; CA2339089A1; JP2002522078A; EP1854886A2

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf experimentell erzeugte kälteadaptierte Pferdeinfluenzaviren und insbesondere auf kälteadaptierte Pferdeinfluenzaviren mit zusätzlichen Phänotypen, wie beispielsweise Attenuation, dominanter Interferenz oder Temperaturempfindlichkeit. Die Erfindung umfasst auch reassortierte Influenza A-Viren, die mindestens ein Genomsegment von solch einem Pferdeinfluenzavirus enthalten, so dass das reassortierte Virus bestimmte Phänotypen des Spenderpferdeinfluenzavirus umfasst. Die Erfindung umfasst weiterhin gentechnisch erzeugte Pferdeinfluenzaviren, die durch Reverse Genetik erzeugt wurden und die bestimmte identifizierende Phänotypen eines kälteadaptierten Pferdeinfluenzavirus der vorliegenden Erfindung aufweisen. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf die Verwendung dieser Viren in therapeutischen Zusammensetzungen, um Tiere vor Krankheiten zu schützen, die durch Influenzaviren verursacht werden.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Pferdeinfluenzavirus ist seit ungefähr 1956 als ein Hauptatemwegskrankheitserreger bei Pferden erkannt. Krankheitssymptome, die durch Pferdeinfluenzavirus verursacht werden, können ernsthaft sein, und ihnen folgen oft sekundäre Bakterieninfektionen. Zwei Untertypen von Pferdeinfluenzavirus werden erkannt, nämlich Untertyp 1, wobei der Prototyp A/Equine/Prague/1/56 (H7N7) ist, und Untertyp 2, wobei der Prototyp A/Equine/Miami/1/63 (H3N8) ist. Derzeit ist der vorherrschende Virusuntertyp Untertyp 2, der sich in den letzten Jahren zwischen den eurasischen und nordamerikanischen Isolaten weiter verzweigt hat.
Der derzeit für Pferdeinfluenza lizenzierte Impfstoff ist ein inaktivierter (abgetöteter) Virusimpfstoff. Dieser Impfstoff ergibt für Pferde, falls überhaupt, minimalen Schutz und kann unerwünschte Nebenwirkungen hervorrufen, zum Beispiel entzündliche Reaktionen am Injektionsort. Siehe z. B. Mumford, 1987, Equine Infectious Disease IV, 207-217, und Mumford, et al., 1993, Vaccine 11, 1172-1174. Weiterhin können derzeitige Stoffe nicht bei jungen Fohlen angewendet werden, da sie die mütterliche Immunität nicht überwinden können und bei einem jüngeren Tier Toleranz induzieren können. Basierend auf der Ernsthaftigkeit der Erkrankung verbleibt ein Bedürfnis nach sicheren, wirksamen therapeutischen Zusammensetzungen, um Pferde gegenüber Pferdeinfluenzaerkrankung zu schützen.
Die Produktion von therapeutischen Zusammensetzungen, die kälteadaptierte humane Influenzaviren aufweisen, ist zum Beispiel in Maassab, et al., 1960, Nature 7, 612-614 und Maassab, et al., 1969, J. Immunol. 102, 728-732 beschrieben. Weiterhin haben diese Forscher bemerkt, dass kälteadaptierte humane Influenzaviren, d. h. Viren, die daran adaptiert sind, bei niedrigeren als normalen Temperaturen zu wachsen, dazu neigen, einen Phänotyp aufzuweisen, bei dem das Virus temperaturempfindlich ist; das heißt, das Virus wächst nicht gut bei bestimmten höheren, unerlaubten Temperaturen, bei denen das Virus vom Wildtyp wächst und sich repliziert. Von verschiedenen kälteadaptierten humanen Influenza A-Viren, die durch Reassortierung mit bestehenden kälteadaptierten humanen Influenza A-Viren produziert wurden, wurde gezeigt, dass sie gute Immunantworten bei geimpften Individuen hervorrufen, und von bestimmten lebenden attenuierten kälteadaptierten reassortierten humanen Influenza A-Viren wurde nachgewiesen, dass sie Menschen vor Exposition gegenüber Viren vom Wildtyp schützen. Siehe z. B. Clements, et al., 1986, J. Clin. Microbiol. 23, 3-76. In dem US-Patent Nr. 5,149,531 von Youngner, et al., herausgegeben am 22. September 1992, haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung weiterhin demonstriert, dass bestimmte reassortierte kälteadaptierte humane Influenza A-Viren auch einen dominanten Interferenz-Phänotyp besitzen, d. h. sie verhindern das Wachstum ihrer entsprechenden Ausgangsstämme vom Wildtyp sowie von heterologen Influenza A-Viren. Das US-Patent Nr. 4,683,137 von Coggins, et. al., herausgegeben am 28. Juli 1987, und das US-Patent Nr. 4,693,893 von Campbell, herausgegeben am 15. September 1987 offenbaren attenuierte therapeutische Zusammensetzungen, die durch Reassortierung von Pferdeinfluenzaviren vom Wildtyp mit attenuierten kälteadaptierten humanen Influenza A-Viren hergestellt wurden. Obwohl diese therapeutischen Zusammensetzungen im Allgemeinen sicher und wirksam bei Pferden zu sein scheinen, sind sie mit der signifikanten Gefahr des Einführens eines Virus, das sowohl menschliche als auch Pferdeinfluenzagene enthält, in die Umwelt verbunden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt experimentell erzeugte kälteadaptierte Pferdeinfluenzaviren, reassortierte Influenza A-Viren, die mindestens ein Genomsegment eines Pferdeinfluenzavirus, das durch Kälteadaptierung erzeugt wurde, so dass das Pferdeinfluenzavirusgenomsegment zumindest einen identifizierenden Phänotyp eines kälteadaptierten Pferdeinfluenzavirus zu dem reassortierten Virus beiträgt, und gentechnisch erzeugte Pferdeinfluenzaviren, die durch Reverse Genetik erzeugt wurden und die mindestens einen identifizierenden Phänotyp eines kälteadaptierten Pferdeinfluenzavirus aufweisen, bereit. Identifizierende Phänotypen umfassen Kälteadaptierung, Temperaturempfindlichkeit, dominante Interferenz und Attenuation. Die Erfindung stellt weiterhin eine therapeutische Zusammensetzung bereit, um ein Tier gegen Erkrankung zu schützen, die durch ein Influenza A-Virus verursacht wird, wobei die therapeutische Zusammensetzung ein kälteadaptiertes Pferdeinfluenzavirus, ein reassortiertes Influenza A-Virus oder ein gentechnisch erzeugtes Pferdeinfluenzavirus der vorliegenden Erfindung aufweist. Auch bereitgestellt wird ein Verfahren zum Schützen eines Tieres vor Erkrankungen, die durch ein Influenza A-Virus verursacht werden, das die Verabreichung solch einer therapeutischen Zusammensetzung umfasst. Auch bereitgestellt werden Verfahren zum Erzeugen eines kälteadaptierten Pferdeinfluenzavirus und Verfahren zum Erzeugen eines reassortierten Influenza A-Virus, das mindestens ein Genomsegment eines kälteadaptierten Pferdeinfluenzavirus aufweist, wobei das Pferdeinfluenzagenomsegment zu dem reassortierten Virus mindestens einen identifizierenden Phänotyp des kälteadaptierten Pferdeinfluenzavirus beiträgt.
Ein kälteadaptiertes Pferdeinfluenzavirus ist ein solches, das in embryonierten Hühnereiern bei einer Temperatur im Bereich von ungefähr 26°C bis ungefähr 30°C repliziert. Vorzugsweise ist ein kälteadaptiertes Pferdeinfluenzavirus, ein reassortiertes Influenza A-Virus oder ein gentechnisch erzeugtes Pferdeinfluenzavirus der vorliegenden Erfindung attenuiert (engl.: attenuated), so dass es bei einem gesunden Tier keine Erkrankung verursacht.
In einer Ausführungsform ist ein kälteadaptiertes Pferdeinfluenzavirus, ein reassortiertes Influenza A-Virus oder ein gentechnisch erzeugtes Pferdeinfluenzavirus der vorliegenden Erfindung auch temperaturempfindlich, so dass das Virus in embryonierten Hühnereiern bei einer Temperatur im Bereich von ungefähr 26°C bis ungefähr 30°C repliziert, Plaques in Gewebekulturzellen bei einer erlaubten Temperatur von ungefähr 34°C bildet, aber keine Plaques in Gewebekulturzellen bei einer unerlaubten Temperatur von ungefähr 39°C bildet.
In einer Ausführungsform weist ein solches temperaturempfindliches Virus zwei Mutationen auf: eine erste Mutation, die Plaquebildung bei einer Temperatur von ungefähr 39°C verhindert, wobei die Mutation gemeinsam mit dem Genomsegment, das das Virusnukleoproteingen kodiert, segregiert; und eine zweite Mutation, die bei einer Temperatur von ungefähr 39°C jegliche Virusproteinsynthese verhindert.
In einer anderen Ausführungsform repliziert ein kälteadaptiertes temperaturempfindliches Pferdeinfluenzavirus der vorliegenden Erfindung in embryonierten Hühnereiern bei einer Temperatur im Bereich von ungefähr 26°C bis ungefähr 30°C, bildet Plaques in Gewebekulturzellen bei einer erlaubten Temperatur von ungefähr 34°C, aber bildet keine Plaques in Gewebekulturzellen oder expressiviert späte Virusproteine bei einer unerlaubten Temperatur von ungefähr 37°C.
Typischerweise wird ein kälteadaptiertes Pferdeinfluenzavirus der vorliegenden Erfindung durch ein oder mehrmaliges Passaging eines Pferdeinfluenzavirus vom Wildtyp und anschließendes Selektieren von Viren, die bei reduzierter Temperatur stabil wachsen und replizieren, erzeugt. Ein kälteadaptiertes Pferdeinfluenzavirus, das dadurch erzeugt wurde, umfasst in bestimmten Ausführungsformen einen dominante Interferenz-Phänotyp, das heißt, das Virus verhindert, wenn es gemeinsam mit einem Pferdeinfluenzaausgangsvirus oder einem heterologen Influenza A-Virus vom Wildtyp infiziert wird, das Wachstum dieses Virus.
Beispiele für kälteadaptierte Pferdeinfluenzaviren der vorliegenden Erfindung umfassen EIV-P821, identifiziert durch Zugangsnummer ATCC VR-2625; EIV-P824, identifiziert durch Zugangsnummer ATCC VR-2624; EIV-MSV+5, identifiziert durch Zugangsnummer ATCC VR-2627; und Abkömmlinge solcher Viren.
Therapeutische Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung umfassen von ungefähr 105 TCID₅₀-Einheiten bis ungefähr 10⁸ TCID₅₀-Einheiten und vorzugsweise ungefähr 2 × 10⁶ TCID₅₀-Einheiten eines kälteadaptierten Pferdeinfluenzavirus, eines reassortierten Influenza A-Virus oder eines gentechnisch erzeugten Pferdeinfluenzavirus der vorliegenden Erfindung.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch ein Verfahren, um ein Tier vor Erkrankung zu schützen, die durch ein Influenza A-Virus verursacht wird, das den Schritt des Verabreichens einer therapeutischen Zusammensetzung, die ein kälteadaptiertes Pferdeinfluenzavirus, ein reassortiertes Influenza A-Virus oder ein gentechnisch erzeugtes Pferdeinfluenzavirus der vorliegenden Erfindung umfasst, an ein Tier umfasst. Bevorzugte zu schützende Tiere umfassen Pferdeartige, wobei Pferde und Ponys insbesondere bevorzugt sind.
Noch eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Erzeugen eines kälteadaptierten Pferdeinfluenzavirus. Das Verfahren umfasst die Schritte des Passaging eines Pferdeinfluenzavirus vom Wildtyp und des Selektierens von Viren, die bei reduzierter Temperatur wachsen. In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren das ein oder mehrmalige Wiederholen der Passaging- und Selektionsschritte, während die Temperatur zunehmend reduziert wird. Passaging von Pferdeinfluenzavirus erfolgt vorzugsweise in embryonierten Hühnereiern.
Eine andere Ausführungsform ist ein Verfahren, ein reassortiertes Influenza A-Virus durch genetisches Reassortieren der Genomsegmente eines kälteadaptierten Spenderpferdeinfluenzavirus der vorliegenden Erfindung mit den Genomsegmenten eines Empfängerinfluenza A-Virus zu erzeugen. Reassortierte Influenza A-Viren der vorliegenden Erfindung werden durch ein Verfahren erzeugt, das die Schritte umfasst: (a) Mischen der Genomsegmente eines kälteadaptierten Spenderpferdeinfluenzavirus mit den Genomsegmenten eines Empfängerinfluenza A-Virus, und (b) Selektieren von Viren, die mindestens einen identifizierenden Phänotyp des Spenderpferdeinfluenzavirus umfassen. Identifizierende Phänotypen umfassen Kälteadaptierung, Temperaturempfindlichkeit, dominante Interferenz und Attenuation. Vorzugsweise umfassen solche reassortierten Viren mindestens den Attenuationsphänotyp des Spendervirus. Ein typisches reassortiertes Virus wird die Antigenizität des Empfängervirus aufweisen, das heißt, es wird die Hämagglutinin-(HA-) und Neuraminidase-(NA-)Phänotypen des Empfängervirus beibehalten.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin Verfahren zum Vermehren von kälteadaptierten Pferdeinfluenzaviren oder reassortierten Influenza A-Viren der vorliegenden Erfindung bereit. Diese Verfahren umfassen Vermehrung in embryonierten Hühnereiern oder in Gewebekulturzellen.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt experimentell erzeugte kälteadaptierte Pferdeinfluenzaviren bereit, die bestimmte definierte Phänotypen aufweisen, welche hier offenbart sind. Es ist festzustellen, dass der Begriff "ein" oder "eine" Einheit sich auf eine einzige oder mehrere dieser Einheiten bezieht; zum Beispiel kann "ein kälteadaptiertes Pferdeinfluenzavirus" ein oder mehrere kälteadaptierte(s) Pferdeinfluenzavirus(/en) umfassen. Als solche können die Begriffe "ein" (oder "eine"), "ein(e) oder mehrere" und "mindestens ein(e)" hier untereinander austauschbar verwendet sein. Es ist auch festzustellen, dass die Begriffe "aufweisen", "umfassen" und "haben" austauschbar verwendet sein können. Weiterhin bezieht sich ein Gegenstand "ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus" auf einen oder mehrere der Gegenstände in der Gruppe, einschließlich Kombinationen davon.
Ein kälteadaptiertes Pferdeinfluenzavirus der vorliegenden Erfindung ist ein Virus, das im Labor erzeugt worden ist, und als solches kein Virus, wie es in der Natur auftritt. Da die vorliegende Erfindung auch solche Viren umfasst, die die identifizierenden Phänotypen von solch einem kälteadaptierten Pferdeinfluenzavirus aufweisen, ist ein Pferdeinfluenzavirus, das von einer Mischung aus natürlich auftretenden Viren isoliert ist, d. h. aus seinem natürlichen Milieu entfernt ist, aber den beanspruchten Phänotyp aufweist, in die vorliegende Erfindung eingeschlossen. Ein kälteadaptiertes Pferdeinfluenzavirus der vorliegenden Erfindung erfordert kein bestimmtes Niveau an Reinheit. Zum Beispiel kann ein kälteadaptiertes Pferdeinfluenzavirus, das in embryonierten Hühnereiern gezogen wurde, in einer Mischung mit dem allantoischen Fluid (AF) vorliegen, und ein kälteadaptiertes Pferdeinfluenzavirus, das in Gewebekulturzellen gezogen wurde, kann in einer Mischung mit aufgebrochenen Zellen und Gewebekulturmedium vorliegen.
So wie hier verwendet, ist ein "Pferdeinfluenzavirus" ein Influenzavirus, das Pferdeartige, z. B. Pferde und Ponys, infiziert und in diesen wächst. So wie hier verwendet, bezeichnet das "Wachsen" eines Virus die Fähigkeit des Virus, sich in einer erlaubten Wirtszelle zu reproduzieren oder "replizieren". Als solche werden die Begriffe "Wachstum eines Virus" und "Replikation eines Virus" hier austauschbar verwendet. Wachstum oder Replikation eines Virus in einer bestimmten Wirtszelle können durch Standardverfahren, die den Fachleuten auf dem Gebiet der Virologie gut bekannt sind, demonstriert und gemessen werden. Zum Beispiel können Proben, die infektiöse Viren enthalten, wie sie z. B. in nasopharyngealen Sekretionen eines infizierten Pferds enthalten sind, auf ihre Fähigkeit getestet werden, cytopathische Effekte (CPE), z. B. Virusplaques, in Gewebekulturzellen zu verursachen. Infektiöse Viren können auch durch Einimpfen einer Probe in die allantoische Kavität von embryonierten Hühnereiern und anschließendes Testen des AF der Eier, die so beimpft wurden, auf seine Fähigkeit, rote Blutzellen zu agglutimieren, d. h. Hämagglutination aufgrund der Anwesenheit des Influenzavirus Hämagglutinin-(HA-)Protein in dem AF zu verursachen, detektiert werden.
Natürlich auftretende, d. h. Pferdeinfluenzaviren vom Wildtyp, replizieren gut bei einer Temperatur von ungefähr 34°C bis ungefähr 39°C. Zum Beispiel repliziert Pferdeinfluenzavirus vom Wildtyp in embryonierten Hühnereiern bei einer Temperatur von ungefähr 34°C und in Gewebekulturzellen bei einer Temperatur von ungefähr 34°C bis 39°C. So wie hier verwendet, ist ein "kälteadaptiertes" Pferdeinfluenzavirus ein Pferdeinfluenzavirus, das adaptiert worden ist, um bei niedrigeren Temperaturen als der optimalen Wachstumstemperatur für Pferdeinfluenzavirus zu wachsen. Ein Beispiel eines kälteadaptierten Pferdeinfluenzavirus der vorliegenden Erfindung ist ein Virus, das in embryonierten Hühnereiern bei einer Temperatur von ungefähr 30°C repliziert. Ein bevorzugtes kälteadaptiertes Pferdeinfluenzavirus der vorliegenden Erfindung repliziert in embryonierten Hühnereiern bei einer Temperatur von ungefähr 28°C. Ein anderes bevorzugtes kälteadaptiertes Pferdeinfluenzavirus der vorliegenden Erfindung repliziert in embryonierten Hühnereiern bei einer Temperatur von ungefähr 26°C. Allgemein replizieren bevorzugte kälteadaptierte Pferdeinfluenzaviren der vorliegenden Erfindung in embryonierten Hühnereiern bei einer Temperatur im Bereich von ungefähr 26°C bis ungefähr 30°C, d. h. in einem Bereich von Temperaturen, in dem ein Wildtypvirus schlecht oder überhaupt nicht wächst. Es sollte angemerkt werden, dass die Fähigkeit solcher Viren, innerhalb des Temperaturbereichs zu replizieren, ihre Fähigkeit nicht ausschließt, bei höheren oder niedrigeren Temperaturen zu replizieren. Zum Beispiel ist eine Ausführungsform ein kälteadaptiertes Pferdeinfluenzavirus, das in embryonierten Hühnereiern bei einer Temperatur von ungefähr 26°C, aber auch in Gewebekulturzellen bei einer Temperatur von ungefähr 34°C repliziert. Wie Pferdeinfluenzaviren vom Wildtyp bilden kälteadaptierte Pferdeinfluenzaviren der vorliegenden Erfindung bei einer Temperatur von ungefähr 34°C allgemein Plaques in Gewebekulturzellen, zum Beispiel in Madin Darby Canine Kidney Cells (MDCK). Beispiele für geeignete und bevorzugte kälteadaptierte Pferdeinfluenzaviren der vorliegenden Erfindung sind hier offenbart.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein kälteadaptiertes Pferdeinfluenzavirus, das durch ein Verfahren erzeugt ist, das das Passaging eines Pferdeinfluenzavirus vom Wildtyp und das anschließende Selektieren von Viren, die bei reduzierter Temperatur wachsen, umfasst. Kälteadaptierte Pferdeinfluenzaviren der vorliegenden Erfindung können zum Beispiel durch sequenzielles Passaging eines Pferdeinfluenzavirus vom Wildtyp in embryonierten Hühnereiern bei abnehmenden Temperaturen erzeugt werden, wodurch nach bestimmten Mitgliedern der Virusmischung selektiert wird, die bei der reduzierten Temperatur stabil replizieren. Ein Beispiel einer Passaging-Prozedur ist detailliert in dem Beispiele-Abschnitt offenbart. Während der Passaging-Prozedur erscheinen eine oder mehrere Mutationen in bestimmten der Einzelstrang-RNS-Segmente, die das Influenza-Virus-Genom ausmachen, welche den Genotyp ändern, d. h. die primäre Nukleotidsequenz dieser RNS-Segmente. So wie hier verwendet, ist eine "Mutation" eine Änderung der primären Nukleotidsequenz irgendeines gegebenen RNS-Segments, das ein Influenzavirusgenom ausbildet. Beispiele für Mutationen umfassen Substitutionen eines oder mehrerer Nukleotide, Auslassungen eines oder mehrerer Nukleotide, Einsetzungen eines oder mehrerer Nukleotide oder eine Umkehrung eines Abschnitts von zwei oder mehreren Nukleotiden. Durch Auswählen jener Mitglieder der Virusmischung, die bei reduzierter Temperatur stabil replizieren, wird ein Virus mit einem Kälteadaptionsphänotyp selektiert. So wie hier verwendet, ist ein "Phänotyp" ein beobachtbares oder messbares Merkmal einer biologischen Einheit, beispielsweise einer Zelle oder eines Virus, wobei das beobachtete Merkmal einer bestimmten genetischen Konfiguration der biologischen Einheit zugeordnet werden kann, d. h. einem bestimmten Genotyp. Als solcher ist ein Kälteadaptierungsphänotyp das Resultat einer oder mehrerer Mutationen bei dem Virusgenom. So wie hier verwendet, beziehen sich die Begriffe "eine Mutation", "ein Genom", "ein Genotyp" oder "ein Phänotyp" auf eine/ein/einen oder mehrere oder mindestens eine/ein/einen Mutation, Genom, Genotyp bzw. Phänotyp.
Zusätzlich können beobachtbare Phänotypen bei einem kälteadaptierten Pferdeinfluenzavirus auftreten, und sie werden allgemein das Resultat einer oder mehrerer zusätzlicher Mutationen bei dem Genom solche eines Virus sein. Zum Beispiel kann ein kälteadaptiertes Pferdeinfluenzavirus der vorliegenden Erfindung zusätzlich attenuiert sein, dominante Interferenz entwickeln und/oder temperaturempfindlich sein.
In einer Ausführungsform weist ein kälteadaptiertes Pferdeinfluenzavirus der vorliegenden Erfindung einen Phänotyp auf, der durch Attenuation charakterisiert ist. Ein kälteadaptiertes Pferdeinfluenzavirus ist "attenuiert", wenn die Verabreichung des Virus an ein Pferdeinfluenzavirus-empfängliches Tier verglichen mit den klinischen Symptomen, die bei Tieren beobachtet werden, die mit Pferdeinfluenzavirus vom Wildtyp infiziert werden, in reduzierte oder abwesende klinische Symptome bei dem Tier resultiert. Zum Beispiel wird ein Tier, das mit Pferdeinfluenzavirus vom Wildtyp infiziert ist, Fieber, Schnupfen, Husten, Depression und Ausfluss zeigen. Im Gegensatz dazu wird ein Tier, dem ein attenuiertes kälteadaptiertes Pferdeinfluenzavirus der vorliegenden Erfindung verabreicht wird, minimale oder keine, d. h. undetektierbare, klinische Krankheitssymptome zeigen.
In einer anderen Ausführungsform weist ein kälteadaptiertes Pferdeinfluenzavirus der vorliegenden Erfindung einen temperaturempfindlichen Phänotyp auf. So wie hier verwendet, repliziert ein temperaturempfindliches kälteadaptiertes Pferdeinfluenzavirus bei reduzierten Temperaturen, repliziert aber nicht länger oder bildet keine Plaques in Gewebekulturzellen bei bestimmten höheren Wachstumstemperaturen, bei denen das Wildtypvirus repliziert und Plaques bildet. Obwohl nicht durch Theorie gebunden, wird angenommen, dass die Replikation von Pferdeinfluenzaviren mit einem temperaturempfindlichen Phänotyp weitestgehend auf die kühlen Passagen des oberen Atmungstrakts beschränkt ist und dass sie in dem unteren Atmungstrakt, wo das Virus stärker dazu neigt, Krankheitssymptome zu verursachen, nicht effektiv replizieren. Eine Temperatur, bei der ein temperaturempfindliches Virus wächst, wird hier als "erlaubte" Temperatur für das temperaturempfindliche Virus bezeichnet, und eine höhere Temperatur, bei der der das temperaturempfindliche Virus nicht wächst, bei der aber ein entsprechendes Wildtypvirus wächst, wird hier als "unerlaubte" Temperatur für das temperaturempfindliche Virus bezeichnet. Zum Beispiel replizieren bestimmte temperaturempfindliche kälteadaptierte Pferdeinfluenzaviren der vorliegenden Erfindung in embryonierten Hühnereiern bei einer Temperatur von ungefähr 30°C oder darunter, vorzugsweise von ungefähr 28°C oder ungefähr 26°C, und sie bilden Plaques in Gewebekulturzellen bei einer erlaubten Temperatur von ungefähr 34°C, aber sie bilden keine Plaques in Gewebekulturzellen bei einer unerlaubten Temperatur von ungefähr 39°C. Andere temperaturempfindliche kälteadaptierte Pferdeinfluenzaviren der vorliegenden Erfindung replizieren in embryonierten Hühnereiern bei einer Temperatur von ungefähr 30°C oder darunter, vorzugsweise von ungefähr 28°C oder ungefähr 26°C, und sie bilden Plaques in Gewebekulturzellen bei einer erlaubten Temperatur von ungefähr 34°C, aber sie bilden keine Plaques in Gewebekulturzellen bei einer unerlaubten Temperatur von ungefähr 37°C.
Bestimmte kälteadaptierte Pferdeinfluenzaviren der vorliegenden Erfindung weisen einen dominante Interferenz-Phänotyp auf, das heißt, sie dominieren eine Infektion, wenn sie gemeinsam mit einem anderen Influenza A-Virus in Zellen infiziert werden, wodurch sie das Wachstum des anderen Virus beeinträchtigen. Wenn zum Beispiel ein kälteadaptiertes Pferdeinfluenzavirus der vorliegenden Erfindung mit einem dominante Interferenz-Phänotyp gemeinsam mit dem Ausgangspferdeinfluenzavirus vom Wildtyp, A/Equine/Kentucky/1/91 (H3N8) in MDCK-Zellen infiziert wird, wird das Wachstum des Ausgangsvirus beeinträchtigt. So wird bei einem Tier, das kürzlich einem virulenten Influenzavirus, d. h. einem Influenzavirus, das Krankheitssymptome verursacht, ausgesetzt wurde, oder diesem bald ausgesetzt werden kann, die Verabreichung einer therapeutischen Zusammensetzung, die ein kälteadaptiertes Pferdeinfluenzavirus mit einem dominante Interferenz-Phänotyp aufweist, in dem oberen Atmungstrakt des Tieres das Wachstum des virulenten Virus beeinträchtigen, wodurch die Krankheit bei dem Tier abgemildert oder reduziert wird, selbst in der Abwesenheit einer Immunantwort auf den virulenten Virus.
Dominante Interferenz eines kälteadaptierten Pferdeinfluenzavirus mit einem temperaturempfindlichen Phänotyp kann durch virologische Standardverfahren gemessen werden. Zum Beispiel können separate Monolagen aus MDCK-Zellen (a) mit einem virulenten Influenza A- Virus vom Wildtyp, (b) mit einem temperaturempfindlichen kälteadaptierten Pferdeinfluenzavirus und (c) beiden Viren in einer gemeinsamen Infektion infiziert werden, wobei alle Infektionen in Multiplizitäten von Infektionen (multiplicities of infection = MOI) von ungefähr 2 Plaquebildenden Einheiten (plaque forming units = pfu) pro Zelle ausgeführt werden. Nach der Infektion werden die Virusausbeuten von den verschiedenen infizierten Zellen durch doppelte Plaquetests gemessen, die bei der erlaubten Temperatur für das kälteadaptierte Pferdeinfluenzavirus und bei der unerlaubten Temperatur des Virus durchgeführt werden. Ein kälteadaptierte Pferdeinfluenzavirus, das einen temperaturempfindlichen Phänotyp aufweist, ist nicht in der Lage, Plaques bei seiner unerlaubten Temperatur zu bilden, während das Wildtypvirus in der Lage ist, Plaque sowohl bei der erlaubten als auch der unerlaubten Temperatur zu bilden. So ist es möglich, das Wachstum des Wildtypvirus in der Anwesenheit des kälteadaptierten Virus durch Vergleichen der Virusausbeute bei der unerlaubten Temperatur der Zellen, die einzeln mit dem Wildtypvirus infiziert wurden, mit der Ausbeute bei der unerlaubten Temperatur des Wildtypvirus bei doppelt infizierten Zellen zu messen.
Kälteadaptierte Pferdeinfluenzaviren der vorliegenden Erfindung sind primär durch einen oder mehrere der folgenden identifizierenden Phänotypen charakterisiert: Kälteadaptation, Temperaturempfindlichkeit, dominante Interferenz und/oder Attenuation. So wie hier verwendet, bezieht sich die Phrase "ein Pferdeinfluenzavirus weist den/die identifizierenden Phänotyp(en) von Kälteadaptation, Temperaturempfindlichkeit, dominanter Interferenz und/oder Attenuation auf" auf ein Virus, das solch einen/solche Phänotyp(en) hat. Beispiele solcher Viren umfassen, aber sind nicht beschränkt auf, EIV-P821, identifiziert durch Zugangsnummer ATCC VR_, EIV-P824, identifiziert durch Zugangsnummer ATCC VR_, und EIV-MSV+5, identifiziert durch Zugangsnummer ATCC VR_, sowie EIV-MSV0, EIV, MSV+1, EIV-MSV+2, EIV-MSV+3 und EIV-MSV+4. Die Produktion solcher Viren wird in den Beispielen beschrieben. Zum Beispiel ist das kälteadaptierte Pferdeinfluenzavirus EIV-P821 dadurch charakterisiert, dass es die identifizierenden Phänotypen (a) von Kälteadaptation, d. h. seine Fähigkeit, in embryonierten Hühnereiern bei einer Temperatur von ungefähr 26°C zu replizieren; (b) von Temperaturempfindlichkeit, d. h. seine Unfähigkeit, Plaques in Gewebekulturzellen zu bilden und späte Genprodukte bei einer unerlaubten Temperatur von ungefähr 37°C zu expressivieren, und seine Unfähigkeit, Plaques in Gewebekulturzellen zu bilden und jegliche Virusproteine bei einer unerlaubten Temperatur von ungefähr 39°C zu synthetisieren; (c) seiner Attenuation bei Verabreichung an ein Pferdeinfluenzavirus-empfängliches Tier; und (d) von dominanter Interferenz, d. h. seiner Fähigkeit, wenn es gemeinsam mit einem Influenza A-Virus vom Wildtyp in eine Zelle infiziert wird, das Wachstum des Wildtypvirus zu stören, aufweist. In ähnlicher Weise ist das kälteadaptierte Pferdeinfluenzavirus EIV-P824 charakterisiert durch (a) Kälteadaptation, d. h. seine Fähigkeit, in embryonierten Hühnereiern bei einer Temperatur von ungefähr 28°C zu replizieren; (b) Temperaturempfindlichkeit, d. h. seine Unfähigkeit, Plaques in Gewebekulturzellen bei einer unerlaubten Temperatur von ungefähr 39°C zu bilden; und (c) dominante Interferenz, d. h. seine Fähigkeit, wenn es gemeinsam mit einem Influenza A-Virus vom Wildtyp in eine Zelle infiziert wird, das Wachstum des Wildtypvirus zu stören. In einem anderen Bespiel ist das kälteadaptierte Pferdeinfluenzavirus EIV-MSV+5 charakterisiert durch (a) Kälteadaptation, d. h. seine Fähigkeit, in embryonierten Hühnereiern bei einer Temperatur von ungefähr 26°C zu replizieren; (b) Temperaturempfindlichkeit, d. h. seine Unfähigkeit, Plaques in Gewebekulturzellen bei einer unerlaubten Temperatur von ungefähr 39°C zu bilden; und (c) seine Attenuation bei Verabreichung an ein Pferdeinfluenzavirus-empfängliches Tier.
In bestimmten Fällen kann das RNS-Segment, auf dem eine oder mehrere Mutationen, die mit einem bestimmten Phänotyp verbunden sind, auftreten, durch Reassortierungsanalyse mittels Standardverfahren bestimmt werden, wie hier offenbart wird. In einer Ausführungsform weist ein kälteadaptiertes Pferdeinfluenzavirus der vorliegenden Erfindung einen temperaturempfindlichen Phänotyp auf, der mit mindestens zwei Mutationen bei dem Genom des Virus korreliert ist. Bei dieser Ausführungsform inhibiert, d. h. blockiert oder verhindert, eine der zwei Mutationen, die durch Reassortierungsanalyse, wie sie hier offenbart wird, lokalisiert ist, die Fähigkeit des Virus, bei einer unerlaubten Temperatur von ungefähr 39°C Plaques bei den Gewebekulturzellen zu bilden. Diese Mutation cosegregiert mit dem Segment des Pferdeinfluenzavirusgenoms, das das Nukleoprotein-(NP-)Gen des Virus kodiert, d. h. die Mutation ist auf demselben RNS-Segment wie das NP-Gen angeordnet. Bei dieser Ausführungsform verhindert die zweite Mutation jegliche Proteinsynthese bei einer unerlaubten Temperatur von ungefähr 39°C. Als solches ist das Virusgenom bei der unerlaubten Temperatur unfähig, irgendwelche Virusproteine zu expressivieren. Beispiele für kälteadaptierte Pferdeinfluenzaviren, die diese Eigenschaften besitzen, sind EIV-P821 und EIV MSV+5. EIV-P821 wurde durch serielles Passaging eines Pferdeinfluenzavirus vom Wildtyp in embryonierten Hühnereiern durch in Beispiel 1A beschriebene Verfahren erzeugt. EIV-MSV+5 wurde durch weiteres serielles Passaging von EIV-P821 erhalten, wie in Beispiel 1E beschrieben ist.
Weiterhin kann ein kälteadaptiertes temperaturempfindliches Pferdeinfluenzavirus, das die beiden Mutationen aufweist, welche Plaquebildung und Virusproteinsynthese bei einer unerlaubten Temperatur von ungefähr 39°C verhindern, ein oder mehrere zusätzliche Mutationen aufweisen, die die Fähigkeit des Virus verhindern, bei einer unerlaubten Temperatur von ungefähr 37°C späte Genprodukte zu synthetisieren und Plaques in Gewebekulturzellen zu bilden. Ein Beispiel für ein kälteadaptiertes Pferdeinfluenzavirus, das diese Eigenschaften besitzt, ist EIV-P821. Dieses Virusisolat repliziert in embryonierten Hühnereiern bei einer Temperatur von ungefähr 26°C und bildet keine Plaques oder expressiviert irgendwelche Virusproteine bei einer Temperatur von ungefähr 39°C. Weiterhin bildet EIV-P821 keine Plaques in MDCK-Zellen bei einer unerlaubten Temperatur von ungefähr 37°C, und bei dieser Temperatur ist die späte Genexpression in einer solchen Weise verhindert, dass späte Proteine nicht produziert werden, d. h. normale Niveaus an NP-Protein werden synthetisiert, reduzierte oder nicht nachweisbare Niveaus an M1- oder HA-Proteinen werden synthetisiert, und erhöhte Niveaus des Polymeraseproteins werden synthetisiert. Da dieser Phänotyp durch differenzielle Virusproteinsynthese typisiert wird, unterscheidet er sich von dem Proteinsynthesephänotyp, der bei einer unerlaubten Temperatur von ungefähr 39°C gesehen wird, der durch die Verhinderung von Synthese jeglicher Virusproteine typisiert wird.
Gemäß 37 CFR § 1.802 (a-c) wurden kälteadaptierte Pferdeinfluenzaviren, die hier als EIV-P821 und EIV-P824 bezeichnet werden, bei der American Type Culture Collection (ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209) gemäß dem Budapester Vertrag als ATCC Zugangsnummern ATCC VR-_ beziehungsweise ATCC VR-_ am 11. Juli 1998 hinterlegt. Das kälteadaptierte Pferdeinfluenzavirus EIV-MSV+5 wurde bei der ATCC als ATCC Zugangsnummer ATCC VR-_ am 3. August 1998 hinterlegt. Gemäß 37 CFR § 1.806 wurden diese Hinterlegungen für einen Zeitraum von mindestens dreißig (30) Jahren gemacht, und für mindestens fünf (5) Jahre nachdem die letzte Anfrage wegen einer Lieferung einer Probe der Hinterlegung durch die Hinterlegungsstelle empfangen wurde. Gemäß 38 CFR § 1.808 (a)(2) werden alle Beschränkungen, die durch den Hinterleger bezüglich der Verfügbarkeit für die Öffentlichkeit gemacht wurden, bei der Erteilung des Patents unwiderruflich aufgehoben.
Bevorzugte kälteadaptierte Pferdeinfluenzaviren der vorliegenden Erfindung weisen die identifizierenden Phänotypen von EIV-P821, EIV-P824 und EIV-MSV+5 auf. Insbesondere bevorzugte kälteadaptierte Pferdeinfluenzaviren umfassen EIV-P821, EIV-P824, EIV-MSV+5 und Abkömmlinge dieser Viren. So wie hier verwendet, sind "Abkömmlinge" "Nachkommen", und als solche können sie verglichen mit dem Elternvirus leicht geänderte Phänotypen haben, behalten aber die identifizierenden Phänotypen des Elternvirus, zum Beispiel Kälteadaptierung, Temperaturempfindlichkeit, dominante Interferenz oder Attenuation, bei. Zum Beispiel ist das kälteadaptierte Pferdeinfluenzavirus EIV-MSV+5 ein "Abkömmling" des kälteadaptierten Pferde influenzavirus EIV-P821. "Abkömmlinge" umfassen auch reassortierte Influenza A-Viren, die einen oder mehrere identifizierende Phänotypen des Spenderelternvirus aufweisen.
Reassortierte Influenza A-Viren der vorliegenden Erfindung werden durch genetisches Reassortieren der Genomsegmente eines kälteadaptierten Spenderpferdeinfluenzavirus der vorliegenden Erfindung mit den Genomsegmenten eines Empfängerinfluenza A-Virus und anschließendes Selektieren eines reassortierten Virus, das mindestens eines seiner acht RNS-Genomsegmente von dem Spendervirus erhält, so dass das reassortierte Virus mindestens einen identifizierenden Phänotyp des kälteadaptierten Spenderpferdeinfluenzavirus erwirbt, erzeugt. identifizierende Phänotypen umfassen Kälteadaptierung, Temperaturempfindlichkeit, Attenuation und dominante Interferenz. Vorzugsweise erhalten die reassortierten Influenza A-Viren der vorliegenden Erfindung mindestens den Attenuations-Phänotyp des Spendervirus. Verfahren, um reassortierte Influenzaviren zu isolieren, sind den Fachleuten auf dem Gebiet der Virologie gut bekannt und sind zum Beispiel in Fields, et al., 1996, Fields Virology, 3. Aufl., Lippincott-Raven; und Palese, et al., 1976, J. Virol., 17, 876-884 offenbart. Fields, et al., ebd. und Palese, et al., ebd.
Ein geeignetes Spenderpferdeinfluenzavirus ist ein kälteadaptiertes Pferdeinfluenzavirus der vorliegenden Erfindung, zum Beispiel EIV-P821, identifiziert durch Zugangsnummer ATCC VR_, EIV-P824, identifiziert durch Zugangsnummer ATCC VR_ oder EIV-MSV+5, identifiziert durch Zugangsnummer ATCC VR_. Ein geeignetes Empfängerinfluenza A-Virus kann ein anderes Pferdeinfluenzavirus sein, zum Beispiel ein Pferdeinfluenzavirus vom eurasischen Untertyp 2, wie beispielsweise A/Equine/Suffolk/89 (H3N8) oder ein Pferdeinfluenzavirus vom Untertyp 1, wie beispielsweise A/Prague/1/56 (H7N7). Ein Empfängerinfluenza A-Virus kann auch irgendein Influenza A-Virus sein, das in der Lage ist, ein reassortiertes Virus mit einem kälteadaptierten Spenderpferdeinfluenzavirus zu bilden. Beispiele solcher Influenza A-Viren umfassen, aber sind nicht beschränkt auf, humane Influenzaviren, wie beispielsweise A/Puerto Rico/8/34 (H1N1), A/Hong Kong/156/97 (H5N1), A/Singapore/1/57 (H2N2) und A/Hong Kong/1/68 (H3N2); Schweineviren, wie beispielsweise A/Swine/Iowa/15/30 (H1N1) und Geflügelviren, wie beispielsweise A/Mallard/New York/6750/78 (H2N2) und A/Chicken/Hong Kong/258/97 (H5N1). Ein reassortiertes Virus der vorliegenden Erfindung kann jegliche Kombination von Spender- und Empfängergensegmenten aufweisen, so lange das resultierende reassortierte Virus mindestens einen identifizierenden Phänotyp des Spendervirus besitzt.
Ein Beispiel eines reassortierten Virus der vorliegenden Erfindung ist ein "6 + 2" reassortiertes Virus, bei dem die sechs "internen Gensegmente", d. h. jene, die die NP-, PB2-, PB1-, PA-, M- und NS-Gene aufweisen, von dem kälteadaptierten Spenderpferdeinfluenzavirusgenom abgeleitet sind, und die zwei "externen Gensegmente", d. h. jene, die die HA- und NA-Gene aufweisen, von dem Empfängerinfluenza A-Virus abgeleitet sind. Ein resultierendes Virus, das auf diese Weise erzeugt wurde, weist die attenuierten, kälteadaptierten, temperaturempfindlichen und/oder dominante Interferenz-Phänotypen des kälteadaptierten Spenderpferdeinfluenzavirus, aber die Antigenizität des Empfängerstamms auf.
In noch einer anderen Ausführungsform kann ein kälteadaptiertes Pferdeinfluenzavirus der vorliegenden Erfindung durch rekombinante Mittel erzeugt werden. Bei diesem Ansatz wird eine oder werden mehrere spezifische Mutationen, die mit den identifizierten Kälteadaptierungs-, Attenuations-, Temperaturempfindlichkeits- oder dominante Interferenz-Phänotypen assoziiert sind, identifiziert und unter Anwendung eines Reverse Genetik-Ansatzes zurück in einen Pferdeinfluenzavirusstamm vom Wildtyp eingeführt. Reverse Genetik bezieht die Verwendung von RNS-Polymerasekomplexen, die von Influenzavirus-infizierten Zellen isoliert wurden, ein, um künstliche Influenzavirusgenomsegmente zu transkribieren, die die Mutation(en) enthalten, wobei die synthetisierten RNS-Segmente unter Verwendung eines Hilfsvirus eingebaut werden, und wobei anschließend nach Viren selektiert wird, die die gewünschten Änderungen enthalten. Reverse Genetik-Verfahren für Influenzaviren werden zum Beispiel bei Enami, et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. 87, 3802-3805, und in dem US-Patent Nr. 5,578,473 von Palese, et al., herausgegeben am 26. November 1996, beschrieben. Dieser Ansatz erlaubt es dem Fachmann, zusätzliche kälteadaptierte Pferdeinfluenzaviren der vorliegenden Erfindung zu erzeugen, ohne die Notwendigkeit, mit dem gewünschten Virusphänotyp den langen Kälteadaptierungsprozess und den Prozess des Selektierens von Mutanten sowohl in vitro als auch in vivo zu durchlaufen.
Ein kälteadaptiertes Pferdeinfluenzavirus der vorliegenden Erfindung kann durch virologische Standardverfahren vermehrt werden, die den Fachleuten gut bekannt sind und von denen hier Beispiele offenbart werden. Zum Beispiel kann ein kälteadaptiertes Pferdeinfluenzavirus in embryonierten Hühnereiern oder in eukaryotischen Gewebekulturzellen gezogen werden. Geeignete kontinuierliche eukaryotische Zelllinien, auf denen ein kälteadaptiertes Pferdeinfluenzavirus der vorliegenden Erfindung zu ziehen ist, umfassen jene, die das Wachstum von Influenzaviren unterstützen, zum Beispiel MDCK-Zellen. Andere geeignete Zellen, auf denen kälteadaptierte Pferdeinfluenzavirus der vorliegenden Erfindung zu ziehen sind, umfassen, aber sind nicht beschränkt auf, primäre Nierenzellkulturen von Affen, Kälbern, Hamstern oder Hühnern.
In einer Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung eine therapeutische Zusammensetzung zum Schutz eines Tiers vor einer Erkrankung bereit, die durch einen Influenza A-Virus verursacht wird, wobei die therapeutische Zusammensetzung entweder ein kälteadaptiertes Pferdeinfluenzavirus oder ein reassortiertes Influenza A-Virus umfasst, das mindestens ein Genomsegment eines Pferdeinfluenzavirus aufweist, das durch Kälteadaptierung erzeugt wurde, wobei das Pferdeinfluenzavirusgenomsegment mindestens einen identifizierenden Phänotyp des kälteadaptiertes Pferdeinfluenzavirus beiträgt. Zusätzlich kann eine therapeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung ein Pferdeinfluenzavirus umfassen, das gentechnisch erzeugt wurde, um eine oder mehrere Mutationen aufzuweisen, wobei diese Mutationen dahingehend identifiziert worden sind, dass sie einen bestimmten identifizierenden Phänotyp zu einem kälteadaptierten Pferdeinfluenzavirus der vorliegenden Erfindung beitragen. So wie hier verwendet, bezieht sich die Phrase "durch ein Influenza A-Virus verursachte Erkrankung" auf die klinischen Manifestationen, die bei einem Tier beobachtet werden, das mit einem virulenten Influenza A-Virus infiziert wurde. Beispiele solcher klinischer Manifestationen umfassen, aber sind nicht beschränkt auf, Fieber, Schnupfen, Husten, Nasenausfluss, Rasselgeräusche, Anorexie und Depression. Zusätzlich ist die Phrase "durch ein Influenza A-Virus verursachte Erkrankung" hier so definiert, dass sie das Ausscheiden von virulentem Virus durch das infizierte Tier umfasst. Verifikation, dass bei einem Tier beobachtete klinische Manifestationen mit einer Infektion durch ein virulentes Pferdeinfluenzavirus korrelieren, kann durch verschiedene Verfahren herbeigeführt werden, einschließlich der Detektion eines spezifischen Antikörpers und/oder von T-Zellenantworten auf Pferdeinfluenzavirus bei dem Tier. Vorzugsweise erfolgt die Verifikation, dass bei einem Tier beobachtete klinische Manifestationen mit einer Infektion durch ein virulentes Influenza A-Virus korrelieren, durch die Isolation des Virus von dem betroffenen Tier, zum Beispiel durch Abtupfen der nasopharyngealen Kavität des Tiers nach Virus enthaltenden Sekretionen. Verifikation der Virusisolation kann durch die Detektion von CPE in Gewebekulturzellen herbeigeführt werden, die mit den isolierten Sekretionen beimpft wurden, durch Einimpfen der isolierten Sekretionen in embryonierte Hühnereier, wo die Virusreplikation durch die Fähigkeit von AF aus den beimpften Eiern detektiert wird, Erythrozyten zu agglutinieren, was auf die Anwesenheit des Influenzavirushämagglutininproteins hinweist, oder durch Verwendung eines kommerziell erhältlichen diagnostischen Tests, zum Beispiel des Directigen^® FLU A-Tests.
So wie hier verwendet, umfasst der Begriff "Schützen" zum Beispiel das Vorbeugen oder Behandeln von Influenza A-Virusinfektion bei dem gegenständlichen Tier. Als solche kann eine therapeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung zum Beispiel als prophylaktischer Impfstoff verwendet werden, um ein bestimmtes Tier durch Verabreichen der therapeutischen Zusammensetzung an das Tier zu einem Zeitpunkt vor der Aussetzung des Tier gegenüber dem virulenten Virus vor Influenzaerkrankung zu schützen.
Eine therapeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung, die ein kälteadaptiertes Pferdeinfluenzavirus mit einem dominanten Interferenz-Phänotyp aufweist, kann auch verwendet werden, um ein Tier zu behandeln, das kürzlich mit einem virulenten Influenza A-Virus infiziert wurde oder das wahrscheinlich nachfolgend binnen weniger Tage dem Virus ausgesetzt wird, so dass die therapeutische Zusammensetzung sofort das Wachstum des virulenten Virus stört, vor der Produktion des Tiers von Antikörpern gegen das virulente Virus. Eine therapeutische Zusammensetzung, die ein kälteadaptiertes Pferdeinfluenzavirus mit einem dominante Interferenz-Phänotyp aufweist, kann wirksam vor oder nach der Aussetzung für einen Zeitraum verabreicht werden, der der ungefähren Zeitdauer entspricht, binnen derer ein kälteadaptiertes Pferdeinfluenzavirus der vorliegenden Erfindung in dem oberen Atmungstrakt des behandelten Tiers repliziert, zum Beispiel für bis zu sieben Tage. Eine therapeutische Zusammensetzung, die ein kälteadaptiertes Pferdeinfluenzavirus mit einem dominante Interferenz-Phänotyp aufweist, kann wirksam nach der Aussetzung gegenüber dem virulenten Pferdeinfluenzavirus für eine Zeitdauer verabreicht werden, die der Zeit entspricht, die ein infiziertes Tier braucht, um Krankheitssymptome zu zeigen, zum Beispiel für bis zu ungefähr zwei Tage.
Therapeutische Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können an jegliche Tiere verabreicht werden, die für Influenzaviruserkrankung empfänglich sind, zum Beispiel Menschen, Schweine, Pferde und andere Pferdeartige, Wasservögel, Haus- und Wildvögel, Seehunde, Minke und Wale. Vorzugsweise wird eine therapeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung an Pferdeartige verabreicht. Noch mehr bevorzugt wird eine therapeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung an ein Pferd verabreicht, um es gegen Pferdeinfluenzaerkrankung zu schützen.
Derzeitige Impfstoffe, die erhältlich sind, um Pferde gegen Pferdeinfluenzaviruserkrankung zu schützen, sind beim Schützen von jungen Fohlen nicht wirksam, am wahrscheinlichsten weil sie nicht die Antikörper der Mutter überwinden können, die bei diesen jungen Tieren vorliegen, und oft führt eine Impfung in jungem Alter, zum Beispiel im Alter von 3 Monaten, zu Toleranz statt zu Immunität. In einer Ausführungsform und im Gegensatz zu bestehenden Pferdeinfluenzavirusimpfstoffen kann eine therapeutische Zusammensetzung, die ein kälteadaptiertes Pferdeinfluenzavirus der vorliegenden Erfindung aufweist, offensichtlich Immunität bei jungen Tieren erzeugen. Als solche kann eine therapeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung sicher und wirksam an junge Fohlen verabreicht werden, so jung wie ungefähr 3 Monate alt, um ohne die Induktion von Toleranz vor Pferdeinfluenzaerkrankung zu schützen.
In einer Ausführungsform kann eine therapeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung multivalent sein. Zum Beispiel kann sie ein Tier vor mehr als einem Influenza A-Virusstamm schützen, indem sie eine Kombination von einem oder mehreren kälteadaptierten Pferdeinfluenzaviren der vorliegenden Erfindung, einem oder mehreren assortierten Influenza A-Viren und/oder einem oder mehreren gentechnisch erzeugten Pferdeinfluenzaviren der vorliegenden Erfindung bereitstellt. Multivalente therapeutische Zusammensetzungen können mindestens zwei kälteadaptierte Pferdeinfluenzaviren umfassen, z. B. gegen nordamerikanische Virusisolate vom Untertyp 2, wie beispielsweise A/Equine/Kentucky/1/91 (H1N8) und eurasische Virusisolate vom Untertyp 2, wie beispielsweise A/Equine/Suffolk/89 (H3N8); oder ein oder mehrere Virusisolate vom Unteryp 2 und ein Virusisolat vom Untertyp 1, wie beispielsweise A/Equine/Prague/1/56 (H7N7). In gleicher Weise kann eine multivalente therapeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung ein kälteadaptiertes Pferdeinfluenzavirus und ein reassortiertes Influenza A-Virus der vorliegenden Erfindung oder zwei reassortierte Influenza A-Viren der vorliegenden Erfindung umfassen. Eine multivalente therapeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann auch eine oder mehrere Formulierungen enthalten, um zusätzlich zu Influenza A-Virus gegen ein oder mehrere andere infektiöse Mittel zu schützen. Solche anderen infektiösen Mittel umfassen, aber sind nicht beschränkt auf: Viren, Bakterien, Pilze und pilzverwandte Mikroorganismen sowie Parasiten. Vorzugsweise umfassen multivalente therapeutische Zusammensetzungen, sind aber nicht beschränkt auf, ein kälteadaptiertes Pferdeinfluenzavirus, ein reassortiertes Influenza A-Virus oder ein gentechnisch erzeugtes Pferdeinfluenzavirus der vorliegenden Erfindung plus eine oder mehrere Zusammensetzungen, die gegen ein oder mehrere andere infektiöse Mittel schützen, die Pferde befallen. Infektiöse Mittel, gegen die geeigneterweise geschützt wird, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, infektiöses Pferdeanämievirus, Pferdeherpesvirus, östliches, westliches oder venezuelisches Pferdeenzephalitisvirus, Tetanus, Streptococcus equi und Ehrlichia resticii.
Eine therapeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann in einem Streckungsmittel formuliert werden, das das zu behandelnde Tier tolerieren kann. Beispiele solcher Streckungsmittel umfassen Wasser, Salzlösung, Ringer-Lösung, Dextroselösung, Hank-Lösung und andere wässrige physiologisch ausbalancierte Salzlösungen. Streckungsmittel können auch geringe Mengen an Zusätzen enthalten, wie beispielsweise Substanzen, die die Isotonizität und die chemische oder biologische Stabilität verbessern. Beispiele für Puffer umfassen Phosphatpuffer, Bikarbonatpuffer und Tris-Puffer, während Beispiele für Stabilisatoren A1/A2-Stabilisator, erhältlich von Diamond Animal Health, Des Moines, IA, umfassen. Standardformulierungen können entweder Flüssigkeiten oder Feststoffe sein, die als Suspension oder Lösung zur Verabreichung an ein Tier in einer geeigneten Flüssigkeit aufgenommen werden können. In einer Ausführungsform kann eine nichtflüssige Formulierung das Streckungsmittel, Salze, Puffer, Stabilisatoren usw. enthalten, wozu steriles Wasser oder Salzlösung vor der Verabreichung zugegeben werden kann.
Eine therapeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann auch einen oder mehrere Zusätze oder Träger umfassen. Zusätze sind typischerweise Substanzen, die die Immunantwort eines Tiers auf ein spezifisches Antigen verbessern, und Träger umfassen solche Verbindungen, die die Halbwertzeit einer therapeutischen Zusammensetzung in dem behandelten Tier erhöhen. Ein Vorteil einer therapeutischen Zusammensetzung, die ein kälteadaptiertes Influenzavirus oder ein reassortiertes Influenza A-Virus der vorliegenden Erfindung aufweist, ist, dass Zusatzstoffe und Träger nicht erforderlich sind, um einen wirksamen Impfstoff herzustellen. Weiterhin würden in vielen Fällen, die den Fachleuten bekannt sind, die Vorteile einer therapeutischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung durch die Verwendung einiger Zusatzstoffe oder Träger behindert werden. Jedoch sollte angemerkt werden, dass die Verwendung von Zusatzstoffen oder Trägern durch die vorliegende Erfindung nicht ausgeschlossen ist.
Therapeutische Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung umfassen eine Menge eines kälteadaptierten Pferdeinfluenzavirus, die ausreichend ist, um ein Tier vor einem Angriff durch virulentes Pferdeinfluenzavirus zu schützen. In einer Ausführungsform kann eine therapeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung eine Menge an kälteadaptiertem Pferdeinfluenzavirus umfassen, die von ungefähr 10⁵ Gewebekulturinfektionsdosis-50 (engl.: tissue culture infectious dose-50 = TCID₅₀) Viruseinheiten bis ungefähr 10⁸ TCID₅₀-Viruseinheiten reicht. So wie hier verwendet, ist eine "TCID₅₀-Einheit" eine Menge an Virus, die in einen cytopathischen Effekt bei 50% aller infizierten Zellen resultiert. Verfahren, um TCID₅₀ zu messen und zu berechnen, sind dem Fachmann bekannt und zum Beispiel bei Reed und Muench, 1938, Am. J. of Hyg. 27, 493-497 verfügbar. Eine bevorzugte therapeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung weist von ungefähr 10⁶ TCID₅₀-Einheiten bis ungefähr 10⁷ TCID₅₀-Einheiten eines kälteadaptierten Pferdeinfluenzavirus oder eines reassortierten Influenza A-Virus der vorliegenden Erfindung auf. Noch mehr bevorzugt ist eine therapeutische Zusammensetzung, die ungefähr 2 × 10⁶ TCID₅₀-Einheiten eines kälteadaptierten Pferdeinfluenzavirus oder eines reassortierten Influenza A-Virus der vorliegenden Erfindung aufweist.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch Verfahren, um ein Tier gegen Erkrankung zu schützen, die durch ein Influenza A-Virus verursacht wird, wobei das Verfahren das Verabreichen einer therapeutischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung an das Tier aufweist. Bevorzugt sind jene Verfahren, die ein pferdeartiges Tier gegen Erkrankung schützen, die durch Pferdeinfluenzavirus verursacht wird, wobei jene Verfahren das Verabreichen eines kälteadaptierten Pferdeinfluenzavirus an das pferdeartige Tier umfassen. Akzeptable Protokolle zum Verabreichen therapeutischer Zusammensetzungen in einer wirksamen Weise umfassen individuelle Dosisgröße, Anzahl der Dosen, Frequenz der Dosisverabreichung und Art der Verabreichung. Festlegung solcher Protokolle kann durch Fachleute vorgenommen werden, und Beispiele werden hier offenbart.
Ein bevorzugtes Verfahren, ein Tier gegen Erkrankung zu schützen, die durch ein Influenza A-Virus verursacht wird, umfasst das Verabreichen einer Einzeldosis einer therapeutischen Zusammensetzung an das Tier, die ein kälteadaptiertes Pferdeinfluenzavirus, ein reassortiertes Influenza A-Virus oder ein gentechnisch erzeugtes Pferdeinfluenzavirus der vorliegenden Erfindung aufweist. Eine geeignete Einzeldosis ist eine Dosis, die in der Lage ist, ein Tier vor Erkrankung zu schützen, wenn sie einmal oder mehrmals über einen geeigneten Zeitraum verabreicht wird. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann auch das Verabreichen von nachfolgenden oder Auffrischdosen einer therapeutischen Zusammensetzung umfassen. Auffrischverabreichungen können von ungefähr 2 Wochen bis einige Jahre nach der ursprünglichen Verabreichung verabreicht werden. Auffrischverabreichungen werden vorzugsweise verabreicht, wenn die Immunantwort des Tiers unzureichend wird, um das Tier vor der Erkrankung zu schützen. Beispiele für geeignete und bevorzugte Dosierungspläne sind in dem Beispiele-Abschnitt offenbart.
Eine therapeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann an ein Tier auf eine Vielzahl von Weisen verabreicht werden, so dass das Virus in die Schleimhautzellen im oberen Atmungstrakt des behandelten Tiers eintritt und dort repliziert. Solche Weisen umfassen, aber sind nicht beschränkt auf, intranasale Verabreichung, orale Verabreichung und intraokulare Verabreichung. Da Influenzaviren natürlich die Schleimhaut des oberen Atmungstrakts infizieren, ist es ein bevorzugtes Verfahren, eine therapeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung durch intranasale Verabreichung zu verabreichen. Solche Verabreichung kann durch Verwendung einer Spritze bewirkt werden, die mit einer Kanüle ausgestattet ist, oder durch Verwendung eines Verneblers, der auf auf die Nase und die Schnauze des zu impfenden Tiers aufgesetzt wird.
Die Wirksamkeit einer therapeutischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung, um ein Tier gegen Erkrankung zu schützen, die durch Influenza A-Virus verursacht wird, kann auf einer Vielzahl von Wegen getestet werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Detektion von Antikörpern durch zum Beispiel Hämagglutinationsinhibierungs-(HAI-)Tests, Detektion von zellulärer Immunität innerhalb des behandelten Tiers oder Exposition des behandelten Tiers gegenüber virulentem Pferdeinfluenzavirus, um zu bestimmen, ob das behandelte Tier gegenüber der Entwicklung der Krankheit resistent ist. Zusätzlich kann die Wirksamkeit der therapeutischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung, die ein kälteadaptiertes Pferdeinfluenzavirus mit einem dominante Interferenz-Phänotyp, um die Krankheitssymptome bei einem Tier zu mildern oder zu reduzieren, das zuvor mit einem virulenten Pferdeinfluenzavirus vom Wildtyp angesteckt wurde oder dafür empfänglich ist, mit einem virulenten Pferdeinfluenzavirus vom Wildtyp angesteckt zu werden, durch Screenen nach der Reduktion oder Abwesenheit von Krankheitssymptomen bei dem behandelten Tier getestet werden.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch Verfahren, eine therapeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung herzustellen. Geeignete und bevorzugte Verfahren zum Herstellen einer therapeutischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung sind hier offenbart. Relevante Schritte, die in das Herstellen eines Typs von therapeutischer Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung einbezogen sind, d. h. eines kälteadaptierten Pferdeinfluenzavirus, umfassen (a) Passaging eines Influenzavirus vom Wildtyp in vitro, zum Beispiel in embryonierten Hühnereiern; (b) Selektieren von Viren, die bei reduzierter Temperatur wachsen; (c) ein- oder mehrmaliges Wiederholen der Passaging- und Selektionsschritte bei abnehmenden Temperaturen, bis Viruspopulationen selektiert sind, die stabil bei der gewünschten niedrigeren Temperatur wachsen; und (d) Mischen der resultierenden Viruspräparation mit geeigneten Streckungsmitteln.
Die relevanten Schritte, die in die Herstellung eines anderen Typs von therapeutischer Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung einbezogen sind, d. h. eines reassortierten Influenza A-Virus mit mindestens einem Genomsegment eines Pferdeinfluenzavirus, das durch Adaption erzeugt wurde, umfasst die Schritte (a) Mischen der Genomsegmente eines kälteadaptierten Spenderpferdeinfluenzavirus, das vorzugsweise auch die Phänotypen Attenuation, Temperaturempfindlichkeit oder dominante Interferenz aufweist, mit den Genomsegmenten eines Empfängerinfluenza A-Virus, und (b) Selektieren von reassortierten Viren, die mindestens einen identifizierenden Phänotyp des Spenderpferdeinfluenzavirus aufweisen. Identifizierende Phänotypen, nach denen zu selektieren ist, umfassen Attenuation, Kälteadaption, Temperaturempfindlichkeit und dominante Interferenz. Verfahren, um nach diesen Phänotypen zu screenen, sind den Fachleuten gut bekannt und hier offenbart. Es ist bevorzugt, nach Viren zu screenen, die mindestens den Phänotyp Attenuation aufweisen.
Bei Anwendung dieses Verfahrens, um ein reassortiertes Influenza A-Virus zu erzeugen, das mindestens ein Genomsegment eines Pferdeinfluenzavirus aufweist, das durch Kälteadaptierung erzeugt wurde, ist ein Typ von reassortiertem Virus, nach dem zu selektieren ist, ein "6 + 2" reassortiertes Virus, wobei die sechs "internen Gensegmente", d. h. jene, die die NP-. PB2-, PB1-, PA-, M- und NS-Gene kodieren, von dem kälteadaptierten Spenderpferdeinfluenzavirusgenom erhalten sind, und die zwei "externen Gensegmente", d. h. jene, die die HA- und NA-Gene kodieren, von dem Empfängerinfluenza A-Virus erhalten sind. Ein so erzeugtes resultierendes Virus kann die kälteadaptierten, attenuierten, temperaturempfindlichen und/oder Interferenz-Phänotypen des kälteadaptierten Spenderpferdeinfluenzavirus, aber die Antigenizität des Empfängerstamms aufweisen.
Die vorliegende Erfindung umfasst Nukleinsäuremoleküle, die von dem Pferdeinfluenzaviruswildtypstamm A/Equine/Kentucky/1/91 (H3N8) und kälteadaptierten Pferdeinfluenzavirus EIV-P821 isoliert wurden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein isoliertes Nukleinsäuremolekül ein Nukleinsäuremolekül, das aus seinem natürlichen Milieu entfernt wurde (d. h. das Gegenstand menschlicher Manipulation war), und kann DNS, RNS oder Derivate von DNS oder RNS umfassen. Als solches gibt "isoliert" nicht das Ausmaß an, zu dem das Nukleinsäuremolekül gereinigt wurde.
Die vorliegende Erfindung umfasst Nukleinsäuremoleküle, die kälteadaptierte Pferdeinfluenzavirusproteine und Pferdeinfluenzavirusproteine vom Wildtyp kodieren. Nukleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung können durch Verfahren präpariert werden, die dem Fachmann bekannt sind. Proteine der vorliegenden Erfindung können durch Verfahren präpariert werden, die dem Fachmann bekannt sind, d. h. rekombinante DNS-Technologie. Bevorzugte Nukleinsäuremoleküle weisen kodierende Stränge auf, die Nukleinsäuresequenzen SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25 und/oder ein Komplement davon aufweisen. Komplemente sind definiert als zwei Einzelstränge von Nukleinsäure, bei denen die Nukleotidsequenz derart ist, dass sie als Resultat von Basenpaarung über ihre gesamte Länge hybridisieren. Bei einer gegebener Nukleotidsequenz kann ein Fachmann das Komplement ableiten.
Bevorzugte Nukleinsäuremoleküle, die Pferdeinfluenza M-Proteine kodieren, sind nei_wtM₁₀₂₃, nei_wt1M₁₀₂₃, nei_wt2M₁₀₂₃, nei_wtM₇₅₆, nei_wt1M₇₅₆, nei_wt2M₇₅₆, nei_ca1M₁₀₂₃, nei_ca2M₁₀₂₃, nei_ca1M₇₅₆ und/oder nei_ca2M_756, wobei die kodierenden Stränge durch SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 und/oder SEQ ID NO:6 wiedergegeben werden.
Bevorzugte Nukleinsäuremoleküle, die Pferdeinfluenza HA-Proteine kodieren, sind nei_wtHA₁₇₆₂, nei_wtHA₁₆₉₅, nei_ca1HA₁₇₆₂, nei_ca2HA₁₇₆₂, nei_ca1HA₁₆₉₅ und/oder nei_ca2HA₁₆₉₅, wobei die kodierenden Stränge derselben durch SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 und/oder SEQ ID NO:12 wiedergegeben werden.
Bevorzugte Nukleinsäuremoleküle, die Pferdeinfluenza PB2-N-Proteine kodieren, sind nei_wtPB2-N₁₂₄₁, nei_wtPB2-N₁₂₁₄, nei_ca1PB2-N₁₂₄₁, nei_ca2PB2-N₁₂₄₁, nei_ca1PB2-N₁₂₁₄ nei_ca2 und/oder PB2-N₁₂₁₄, wobei die kodierenden Stränge derselben durch SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, und/oder SEQ ID NO:18 wiedergegeben werden.
Bevorzugten Nukleinsäuremoleküle, die Pferdeinfluenza PB2-C-Proteine kodieren, sind nei_wt1PB2-C₁₂₃₃, nei_wt2PB2-C₁₂₃₂, nei_wtPB2-C₁₁₉₄, nei_ca1PB2-C₁₂₃₂, nei_ca2PB2-C₁₂₃₁ und/oder nei_ca1PB2-C₁₁₉₄, wobei die kodierenden Stränge derselben durch SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23 und/oder SEQ ID NO:25 wiedergegeben werden.
Die vorliegende Erfindung umfasst Proteine, die SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:20 und/oder SEQ ID NO:24 aufweisen, sowie Nukleinsäuremoleküle, die solche Proteine kodieren.
Bevorzugte Pferdeinfluenza M-Proteine der vorliegenden Erfindung umfassen Proteine, die durch ein Nukleinsäuremolekül kodiert werden, das nei_wtM₁₀₂₃, nei_wt1M₁₀₂₃, nei_wt2M₁₀₂₃, nei_wtM₇₅₆, nei_wt1M₇₅₆, nei_wt2M₇₅₆, nei_ca1M₁₀₂₃, nei_ca2M₁₀₂₃, nei_ca1M₇₅₆ und/oder nei_ca2M₇₅₆ aufweist. Bevorzugte Pferdeinfluenza M-Proteine sind Pei_wtM₂₅₂, Pei_ca1M₂₅₂ und/oder Pei_ca2M₂₅₂. In einer Ausführungsform wird ein bevorzugtes Pferdeinfluenza M-Protein der vorliegenden Erfindung durch SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 und/oder SEQ ID NO:6 kodiert, und als solches weist es seine Aminosäuresequenz auf, die SEQ ID NO:2 und/oder SEQ ID NO:5 umfasst.
Bevorzugte Pferdeinfluenza HA-Proteine der vorliegenden Erfindung umfassen Proteine, die durch ein Nukleinsäuremolekül kodiert werden, das nei_wtHA₁₇₆₂, nei_wtHA₁₆₉₅, nei_ca1HA₁₇₆₂, nei_ca2HA₁₇₆₂, nei_ca1HA₁₆₉₅ und/oder nei_ca2HA₁₆₉₅ aufweist. Bevorzugte Pferdeinfluenza HA-Proteine sind P Pei_wtHA₅₆₅, Pei_ca1HA₅₆₅ und/oder Pei_ca2HA₅₆₅. In einer Ausführungsform wird ein bevorzugtes Pferdeinfluenza HA-Protein der vorliegenden Erfindung durch SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 und/oder SEQ ID NO:12 kodiert, und als solches weist es eine Aminosäuresequenz auf, die SEQ ID NO:8 und/oder SEQ ID NO:11 umfasst.
Bevorzugte Pferdeinfluenza PB2-N-Proteine der vorliegenden Erfindung umfassen Proteine, die durch ein Nukleinsäuremolekül kodiert werden, das nei_wtPB2-N₁₂₄₁, nei_wtPB2-N₁₂₁₄, nei_ca1PB2-N₁₂₄₁, nei_ca2PB2-N₁₂₄₁, nei_ca1PB2-N₁₂₁₄, nei_ca2 und/oder PB2-N₁₂₁₄ aufweist. Bevorzugte Pferdeinfluenza PB2-N-Proteine sind P_wtPB2-N₄₀₄, P_ca1PB2-N₄₀₄ und/oder P_ca2PB2-N₄₀₄. In einer Ausführungsform wird ein bevorzugtes Pferdeinfluenza PB2-N-Protein der vorliegenden Erfindung durch SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 und/oder SEQ ID NO:18 kodiert, und als solches weist es eine Aminosäuresequenz auf, die SEQ ID NO:14 und/oder SEQ ID NO:17 umfasst.
Bevorzugte Pferdeinfluenza PB2-C-Proteine der vorliegenden Erfindung umfassen Proteine, die durch ein Nukleinsäuremolekül kodiert werden, das nei_wt1PB2-C₁₂₃₃, nei_wt2PB2-C₁₂₃₂, nei_wtPB2-C₁₁₉₄, nei_ca1PB2-C₁₂₃₂, nei_ca2PB2-C₁₂₃₁ und/oder nei_ca1PB2-C₁₁₉₄ aufweist. Bevorzugte Pferdeinfluenza PB2-N-Proteine sind P_wtPB2-C₃₉₈, P_ca1PB2-C₃₉₈ und/oder P_ca2PB2-C₃₉₈. In einer Ausführungsform wird ein bevorzugtes Pferdeinfluenza PB2-C-Protein der vorliegenden Erfindung durch SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23 und/oder SEQ ID NO:25 kodiert, und als solches weist es eine Aminosäuresequenz auf, die SEQ ID NO:20 und/oder SEQ ID NO:24 umfasst.
Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO:1 gibt die Konsenssequenz wieder, die aus dem kodierenden Strang von PKR-verstärkten Nukleinsäuremolekülen gefolgert wurde, die hier als nei_wt1M₁₀₂₃ und nei_wt2M₁₀₂₃ bezeichnet werden und deren Produktion in den Beispielen offenbart ist. Die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO:4 gibt die abgeleitete Sequenz des kodierenden Strangs von PKR-verstärkten Nukleinsäuremolekülen wieder, die hier als nei_ca1M₁₀₂₃ und nei_ca2M₁₀₂₃ bezeichnet werden und deren Herstellung in den Beispielen offenbart ist. Die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO:7 gibt die abgeleitete Sequenz des kodierenden Strangs eines PKR-verstärkten Nukleinsäuremoleküls wieder, das hier als nei_wtHA₁₇₆₂ bezeichnet wird und dessen Produktion in den Beispielen offenbart ist. Die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO:10 gibt die abgeleitete Sequenz des kodierenden Strangs von PKR-verstärkten Nukleinsäuremolekülen wieder, die hier als nei_ca1HA₁₇₆₂ und nei_ca2HA₁₇₆₂ bezeichnet werden und deren Produktion in den Beispielen offenbart ist. Die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO:13 gibt die abgeleitete Sequenz des kodierenden Strangs eines PKR-verstärkten Nukleinsäuremoleküls wieder, das hier als nei_wtPB2-N₁₂₄₁ bezeichnet wird und dessen Produktion in den Beispielen offenbart ist. Die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO:16 gibt die abgeleitete Sequenz des kodierenden Strangs von PKR-verstärkten Nukleinsäuremolekülen wieder, die hier als nei_ca1PB2-N₁₂₄₁ und nei_ca2PB2-N₁₂₄₁ bezeichnet werden und deren Herstellung in den Beispielen offenbart ist. Die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO:19 gibt die abgeleitete Sequenz des kodierenden Strangs eines PKR-verstärkten Nukleinsäuremoleküls wieder, das hier als nei_wt1PB2-C₁₂₃₃ bezeichnet wird und dessen Herstellung in den Beispielen offenbart ist. Die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO:22 gibt die abgeleitete Sequenz des kodierenden Strangs eines PKR-verstärkten Nukleinsäuremoleküls wieder, das hier als nei_wt2PB2-C₁₂₃₂ bezeichnet wird und dessen Produktion in den Beispielen offenbart ist. Die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO:23 gibt die abgeleitete Sequenz des kodierenden Strangs eines PKR-verstärkten Nukleinsäuremoleküls wieder, das hier als nei_ca1PB2-C₁₂₃₂ bezeichnet wird und dessen Produktion in den Beispielen offenbart ist. Zusätzliche Nukleinsäuremoleküle, Nukleinsäuresequenzen, Proteine und Aminosäuresequenzen sind in den Beispielen beschrieben.
Die vorliegende Erfindung umfasst ein Nukleinsäuremolekül, das ein kälteadaptiertes Pferdeinfluenzavirus aufweist, welches ein M-Protein mit einer Aminosäuresequenz kodiert, die SEQ ID NO:5 aufweist. Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst ein Nukleinsäuremolekül, das ein kälteadaptiertes Pferdeinfluenzavirus aufweist, das ein HA- Protein mit einer Aminosäuresequenz kodiert, die SEQ ID NO:11 aufweist. Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst ein Nukleinsäuremolekül, das ein kälteadaptiertes Pferdeinfluenzavirus aufweist, das ein PB2-N-Protein mit einer Aminosäuresequenz kodiert, die SEQ ID NO:17 aufweist. Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst ein Nukleinsäuremolekül, das ein kälteadaptiertes Pferdeinfluenzavirus aufweist, das ein PB2-C-Protein mit einer Aminosäuresequenz kodiert, die SEQ ID NO:24 aufweist.
Es sollte angemerkt werden, dass, da Nukleinsäuresequenziertechnologie nicht vollkommen fehlerfrei ist, die hier angegebenen Nukleinsäuresequenzen und Aminosäuresequenzen jeweils scheinbare Nukleinsäuresequenzen von Nukleinsäuremolekülen der vorliegenden Erfindung und scheinbare Aminosäuresequenzen von M-, HA- und PB2-N- und PB2-C-Proteinen der vorliegenden Erfindung wiedergeben.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Antikörper, der selektiv an ein Wildtypvirus-M-, HA-, PB2-N-, PB2-C-, PB2-Protein der vorliegenden Erfindung anbindet. Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Antikörper, der selektiv an kälteadaptiertes Virus-M-, HA-, PB2-N-, PB2-C-, PB2-Protein der vorliegenden Erfindung anbindet. Bevorzugte Antikörper binden selektiv an SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:20 und/oder SEQ ID NO:24 an.
Die folgenden Beispiele werden zum Zwecke der Illustration gegeben und sind nicht vorgesehen, den Bereich der vorliegenden Erfindung zu beschränken:
Beispiel 1
Dieses Beispiel offenbart die Produktion und die phänotypische Charakterisierung von verschiedenen kälteadaptierten Pferdeinfluenzaviren der vorliegenden Erfindung.

A. Ein Pferdeinfluenzaausgangsvirus, A/Equine/Kentucky/1/91 (H3N8) (erhalten von Tom Chambers, University of Kentucky, Lexington, KY), wurde Kälteadaptierung in einer Fremdwirtspezies, d. h. embryonierten Hühnereiern, in der folgenden Weise unterworfen. Embryonierte, 10 oder 11 Tage alte Hühnereier, erhältlich zum Beispiel von Truslow Farms, Chestertown, MD oder von HyVac, Adel, IA, wurden mit dem Pferdeinfluenzaausgangsvirus durch Injizieren von ungefähr 0,1 Milliliter (ml) unverdünntes AF, das ungefähr 10⁶ Plaqueformen bildende Einheiten (plaque forming units = pfu) Virus enthielt, durch ein kleines in die Eierschale geschlagenes Loch in die allantoische Kavität beimpft. Die Löcher in den Eiern wurden mit Nagellack abgedichtet, und die Eier wurden in einem befeuchteten Inkubator für drei Tage inkubiert, der auf die geeignete Temperatur eingestellt war. Nach der Inkubation wurden die Eier durchleuchtet, und jegliche nicht lebensfähige Eier wurden verworfen. durch aseptisches Entfernen eines Teils der Eierschale, Beiseiteziehen der chorioallantoischen Membran (CAM) mit einer sterilen Zange und Entfernen des AF mit einer sterilen Pipette wurde AF von den lebensfähigen Embryos geerntet. Das geerntete AF wurde zwischen den Passagen gefroren.

Das AF wurde dann verwendet, entweder unverdünnt oder 1:1000 in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) wie in Tabelle 1 angegeben, um einen neuen Satz von Eiern für eine zweite Passage zu beimpfen, und so weiter. Eine Gesamtzahl von 69 Passagen wurde abgeschlossen. Frühere Passagen wurden entweder bei ungefähr 34°C (Passagen 1-2) oder etwa 30°C durchgeführt, und bei folgenden Passagen wurde die Inkubationstemperatur entweder auf ungefähr 28°C oder auf ungefähr 26°C nach unten verschoben. Um die Wahrscheinlichkeit der Selektion des gewünschten Phänotyps eines stabilen attenuierten Virus zu erhöhen, wurde die anfängliche serielle Passage ausgeweitet, um fünf unterschiedliche Äste des seriellen Passagenbaums, A bis E, zu umfassen, wie in Tabelle 1 gezeigt ist. TABELLE 1: Passagenhistorie der Äste A bis E.

Passage #

Temperatur Ast A Ast B Ast C Ast D Ast E

34°C 1-2 1-2 1-2 1-2 1-2

30°C 3-8 3-29 3-29 3-29 3-29

28°C 30-33* 30-68* 30-33 30-69

26°C 9-65 34-69* 34-65

* = das infektiöse allantoische Fluid wurde bei diesen Passagen 1:1000 verdünnt

B. Virusisolate, die durch die Kälteadaptierungsprozedur, die in Abschnitt A beschrieben wurde, erhalten wurden, wurden wie folgt auf Temperaturempfindlichkeit getestet, d. h. einen Phänotyp, bei dem das kälteadaptierte Virus bei der niedrigeren oder erlaubten Temperatur (z. B. ungefähr 34°C) wächst, aber nicht länger Plaques bei einer höheren oder unerlaubten Temperatur (z. B. ungefähr 37°C oder ungefähr 39°C) bildet. Bei jeder Kälteadaptierungspassage wurde der Titer des AF durch Plaquetest bei ungefähr 34°C bestimmt. Periodisch wurden individuelle Plaques aus dem Test durch Ausschneiden des Plaquebereichs und Anordnen des ausgeschnittenen Agarstücks in ein 96-Loch-Tablett, das eine Monolage von MDCK-Zellen enthielt, klonal isoliert. Die 96-Loch-Platten wurden über Nacht inkubiert, und die Ausbeute wurde durch CPE-Test in doppelten 96-Loch-Platten inkubiert bei ungefähr 34°C und ungefähr 39°C auf Temperaturempfindlichkeit getestet. Der Prozentsatz der Klone, die bei diesem Test als temperaturempfindliche Mutanten bewertet wurden, d. h. die Anzahl von Virusplaques, die bei 34°C wuchsen, aber nicht bei 39°C, geteilt durch die gesamte Anzahl an Plaques, wurde berechnet und ist in Tabelle 2 gezeigt.

Temperaturempfindliche Isolate wurden dann bezüglich Proteinsynthese bei der unerlaubten Temperatur durch Visualisierung von radiomarkierten Virus-synthetisierten Proteinen durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) ausgewertet. TABELLE 2: Prozentsatz an isolierten Klonen, die temperaturempfindlich waren.

	Prozentsatz temperatur empfindlich
Passage#	Ast A	Ast B	Ast C	Ast D	Ast E
p36	56%	66%	0%	66%	54%
p46		80%	60%		75%
p47			80%
p48			100%
p49		100%		100%	50%
p50			90%
p51		100%
p52					57%
p62	100%			100%
p65			100%
p66		100%			88%

Von den klonalen Isolaten, die auf Temperaturempfindlichkeit getestet wurden, wurden zwei für weitere Studien ausgewählt. Der Klon EIV-P821 wurde von der 49. Passage des Asts B ausgewählt, und der Klon EIV-P824 wurde von der 48. Passage des Asts C ausgewählt, wie in Tabelle 1 definiert ist. Diese beiden Virusisolate waren temperaturempfindlich, wobei die Plaquebildung beider Isolaten bei einer Temperatur von ungefähr 39°C inhibiert war. Bei dieser Temperatur war die Proteinsynthese bei EIV-P821 vollständig inhibiert, aber EIV-P824 entwickelte normale Niveaus an Proteinsynthese. Zusätzlich war die Plaquebildung durch EIV-P821 bei einer Temperatur von ungefähr 37°C inhibiert, und bei dieser Temperatur war die späte Genexpression inhibiert, d. h. normale Niveaus an NP-Protein wurden synthetisiert, reduzierte oder keine M1- oder HA-Proteine wurden synthetisiert, und erhöhte Niveaus an Polymeraseproteinen wurden synthetisiert. Der Phänotyp, der bei 37°C beobachtet wurde und der durch differentielle Virusproteinsynthese typisiert wurde, unterschied sich von dem Proteinsynthesephänotyp, der bei ungefähr 39°C gesehen wurde und der durch die Inhibierung der Synthese aller Virusproteine typisiert wurde. Das Virus EIV-P821 wurde bei der American Type Culture Collection (ATCC) unter der Zugangsnummer ATCC VR-_ hinterlegt, und das Virus EIV-P824 wurde bei der ATCC unter der Zugangsnummer ATCC VR-_ hinterlegt.

C. Weitere Charakterisierung der Mutationen bei dem Isolat EIV-P821 wurde wie folgt durch Reassortierungsanalyse durchgeführt. Reassortierungsanalyse bei Influenzaviren erlauben es dem Fachmann unter bestimmten Umständen, Phänotypen eines gegebenen Virus mit putativen Mutationen zu korrelieren, die auf bestimmten der acht RNS-Segmente auftreten, die ein Influenza A-Virusgenom ausbilden. Diese Technik wird zum Beispiel bei Palese, et al., ebd. beschrieben. Eine gemischte Infektion von EIV-P821 und einem Geflügelinfluenzavirus, A/Mallard/New York/6750/78 wurde wie folgt durchgeführt. MDCK-Zellen wurden gemeinsam mit EIV-P821 in einer Multiplizität von Infektionen (englisch: multiplicity of infection = MOI) von 2 pfu/Zelle und A/Mallard/New York/6750/78 in einer MOI von entweder 2, 5 oder 10 pfu/Zelle infiziert. Die infizierten Zellen wurden bei einer Temperatur von ungefähr 34°C inkubiert. Der Titer der Ausbeuten der verschiedenen Koinfektionen wurde bestimmt, und bei ungefähr 34°C wurden einzelne Plaques isoliert, und die resultierenden klonalen Isolate wurden dahingehend charakterisiert, ob sie in der Lage waren, bei ungefähr 39°C und ungefähr 37°C zu wachsen und ihre Gene zu expressivieren, d. h. Virusproteine bei ungefähr 39°C, ungefähr 37°C und ungefähr 34°C zu synthetisieren. Proteinsynthese wurde durch SDS-PAGE-Analyse von radiomarkierten Lysaten infizierter Zellen ausgewertet. Die HA-, NP- und NS-1-Proteine der zwei Ausgangsviren, von denen jedes durch ein separates Genomsegment kodiert ist, waren durch SDS-PAGE-Analyse unterscheidbar, da diese speziellen Virusproteine, wie sie entweder von dem Pferde- oder dem Geflügelinfluenzavirus abgeleitet werden, mit unterschiedlichen scheinbaren Molekülgewichten laufen. Auf diese Weise war es zumindest für die HA-, NP- und NS-1-Gene möglich, auszuwerten, ob bestimmte Phänotypen des Ausgangsvirus, d. h. des temperaturempfindlichen und des Proteinsynthesephänotyps mit den Genomsegmenten, die diese Gene tragen, gemeinsam segregieren. Die Resultate der Reassortierungsanalysen, die die gemeinsame Segregation a) der Mutation, die bei einer unerlaubten Temperatur von ungefähr 39°C Plaquebildung inhibiert, d. h. die Induktion von CPE, oder b) der Mutation, die Proteinsynthese bei einer unerlaubten Temperatur von ungefähr 39°C inhibiert, mit jedem der EIV-P821-, HA-, NP- und NS-1-Proteine untersuchen, sind in Tabelle 3 bzw. 4 gezeigt.

Gen	Virus	ts+¹	ts-²
HA	Geflügel	26	13
HA	Pferd	11	44
NP	Geflügel	37	8
NP	Pferd	0	49
NS-1	Geflügel	9	8
NS-1	Pferd	12	20

¹Anzahl von klonalen Isolaten, die in der Lage sind, CPE in Gewebekulturzellen bei einer Temperatur von ungefähr 39°C zu induzieren.
²Anzahl von klonalen Isloaten, die in der Fähigkeit behindert waren, CPE in Gewebekulturzellen bei einer Temperatur von ungefähr 39°C zu induzieren.

Gen	Virus	ts+¹	ts-²
HA	Geflügel	18	1
HA	Pferd	11	7
NP	Geflügel	34	5
NP	Pferd	7	8
NS-1	Geflügel	10	4
NS-1	Pferd	14	5

¹Anzahl von klonalen Isolaten, die alle Virusproteine bei einer Temperatur von ungefähr 39°C synthetisieren.
²Anzahl von klonalen Isloaten, die in der Fähigkeit inhibiert sind, alle Virusproteine bei einer Temperatur von ungefähr 39°C zu synthetisieren

Die Resultate demonstrieren einen Zusammenhang des Pferde-NP-Gens mit einer Mutation, die die Unfähigkeit von EIV-P821 verursacht, Plaques bei einer unerlaubten Temperatur von ungefähr 39°C zu bilden, aber die Resultate weisen nicht auf eine Verbindung irgendeines der HA-, NP- oder NS-1-Gene mit einer Mutation hin, die die Unfähigkeit von EIV-P821 verursacht, Virusproteine bei einer unerlaubten Temperatur von ungefähr 39°C zu expressivieren. Somit zeigten diese Daten auch an, dass der Plaquebildungsphänotyp und der Proteinsynthesephänotyp, die bei dem Virus EIV-P821 beobachtet werden, das Resultat getrennter Mutationen waren.

D. Studien wurden auch durchgeführt, um zu bestimmen, ob kälteadaptierte Pferdeinfluenzaviren der vorliegenden Erfindung einen dominante Interferenz-Phänotyp aufweisen, das heißt, ob sie bei einer gemischten Infektion mit dem Wildtypausgangsvirus A/Kentucky/1/91 (H3N8) dominieren. Der dominante Interferenz-Phänotyp der Viren EIV-P821 und EIV-P824 wurde auf die folgende Weise ausgewertet. Separate Monolagen aus MDCK-Zellen wurden einzeln mit dem Ausgangsvirus A/Kentucky/1/91 (H3N8) mit einer MOI von 2 infiziert, einfach infiziert mit entweder kälteadaptiertem Virus EIV-P821 oder EIV-P824 bei einer MOI von 2 oder gleichzeitig doppelt infiziert sowohl mit dem Ausgangsvirus als auch einem der kälteadaptierten Viren bei einer MOI von 2 + 2, alles bei einer Temperatur von ungefähr 34°C. 24 Stunden nach der Infektion wurden die Medien von den Kulturen geerntet, und die Virusausbeuten von den verschiedenen infizierten Zellen wurden durch doppelte Plaquetests gemessen, die bei Temperaturen von ungefähr 34°C und ungefähr 39°C durchgeführt wurden. Dieser Test nutzte den Vorteil der Tatsache, dass kälteadaptierte Pferdeinfluenzaviren EIV-P821 oder EIV-P824 temperaturempfindlich sind und so nicht in der Lage sind, Plaques bei einer unerlaubten Temperatur von ungefähr 39°C zu bilden, während das Ausgangsvirus in der Lage ist, Plaques bei beiden Temperaturen zu bilden, wodurch es möglich gemacht ist, das Wachstum des Ausgangsvirus in der Anwesenheit des kälteadaptierten Virus zu messen. Speziell wurde der dominante Interferenzeffekt des kälteadaptierten Virus auf das Wachstum des Ausgangsvirus durch Vergleichen der Virusausbeute bei ungefähr 39°C von Zellen, die einfach mit dem Ausgangsvirus infiziert waren, mit der Ausbeute an Ausgangsvirus bei doppelt infizierten Zellen quantifiziert. EIV-P821 war bei gemischten Infektionen in der Lage, die Ausbeute des Ausgangsvirus ungefähr 200-fach zu reduzieren, während EIV-P824 bei gemischter Infektion die Ausbeute des Ausgangsvirus um ungefähr einen Faktor 3200 reduzierte. Der Test zeigte deshalb, dass kälteadaptierte Pferdeinfluenzaviren EIV-P821 und EIV-P824 beide den dominante Interferenz-Phänotyp zeigen.
E. Virusisolat EIV-MSV+5 wurde von EIV-P821 wie folgt erhalten. EIV-P821 wurde einer Passage in Eiern unterworfen, wie oben beschrieben ist, um ein Masterimpfvirusisolat (engl.: Master Seed Virus isolate) zu erzeugen, das hier als EIV-MSV0 bezeichnet wird. EIV-MSV0 wurde dann drei weitere Male der Passage in Eiern unterworfen, wobei das Virusisolat am Ende jeder Passage EIV-MSV+1, EIV-MSV+2 bzw. EIV-MSV+3 bezeichnet wurde. EIV-MSV+3 wurde dann wie folgt zwei zusätzlichen Passagen in MDCK-Zellen unterworfen. MDCK-Zellen wurden in 150 cm² Gewebekulturkolben in MEM-Gewebekulturmedium mit Hanks-Salzen, das 10% Kalbserum enthielt, gezogen. Die Zellen wurden dann mit sterilem PBS gewaschen, und das Wachstumsmedium wurde durch ungefähr 8 ml des Infektionsmediums pro Kolben ersetzt (Gewebekulturmedium, das MEM mit Hanks-Salzen, 1 μg/ml TPCK-Trypsinlösung, 0,125% bovines Serum Albumin (BSA) und 10 mM HEPES-Puffer enthielt). MDCK-Zellen wurden mit AF beimpft, die Virus EIV-MSV+3 (für die erste Passage in MDCK-Zellen) oder Virusstammlösung, die von EIV-MSV+4 geerntet wurde, (für die zweite Passage in MDCK-Zellen) enthielt, und den Viren wurde es erlaubt, für eine Stunde bei ungefähr 34°C zu adsorbieren. Das Inoculum wurde dann von den Zellmonolagen entfernt, die Zellen wurden erneut mit PBS gewaschen und ungefähr 100 ml des Infektionsmediums wurden pro Kolben zugegeben. Die infizierten Zellen wurden bei ungefähr 34°C für 24 Stunden inkubiert. Die Virusinfizierten MDCK-Zellen wurden durch heftiges Schütteln der Kolben geerntet, um die Zellmonolagen aufzubrechen, was in Virusisolate EIV-MSV+4 (die erste Passage in MDCK-Zellen) und EIV-MSV+5 (die zweite Passage in MDCK-Zellen) resultierte.

Die Viren EIV-MSV0 und EIV-MSV+5 wurden Phänotypenanalyse unterworden, wie oben in Abschnitt B beschrieben ist, um ihre Fähigkeit zu bestimmen, Plaques zu bilden und Virusproteine bei Temperaturen von ungefähr 34°C, ungefähr 37°C und ungefähr 39°C zu bilden. Sowohl EIV-MSV0 als auch EIV-MSV+5 bildeten Plaques in Gewebekulturzellen bei einer Temperatur von ungefähr 34°C, und kein Virusisolat bildete Plaques oder zeigte detektierbare Virusproteinsynthese bei einer Temperatur von ungefähr 39°C. Das Virus EIV-MSV0 hatte bei einer Temperatur von ungefähr 37°C einen ähnlichen temperaturempfindlichen Phänotyp wie EIV-P821, d. h. es war bei der Plaquebildung inhibiert, und die späte Genexpression war inhibiert. Jedoch bildete EIV-MSV+5 anders als sein Ausgangsvirus EIV-P821 bei einer Temperatur von ungefähr 37°C Plaques in Gewebekultur, und bei dieser Temperatur synthetisierte das Virus normale Mengen aller Proteine. Das Virus EIV-MSV+5 wurde bei der ATCC unter der Zugangsnummer ATCC VR-_ hinterlegt.
Beispiel 2
Therapeutische Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung wurden wie folgt hergestellt.

A. Ein großer Bestand an EIV-P821 wurde wie folgt in Eiern vermehrt. Ungefähr 60 spezielle Krankheitserreger-freie embryonierte Hühnereier wurden durchleuchtet, und nicht lebensfähige Eier wurden verworfen. Virusstammlösung wurde auf 1,0 × 10⁵ pfu/ml in sterilem PBS verdünnt. Das Virus wurde in die allantoische Kavität der Eier eingeimpft, wie in Beispiel 1A beschrieben ist. Nach 3 Tagen Inkubation in einer befeuchteten Kammer bei einer Temperatur von ungefähr 34°C wurde gemäß dem in Beispiel 1A beschriebenen Verfahren AF von den Eiern geerntet. Das geerntete AF wurde mit einer Stabilisatorlösung gemischt, zum Beispiel A1/A2-Stabilisator, erhältlich von Diamond Animal Health, Des Moines, IA, bei 25% V/V (Stabilisator/AF). Das geerntete AF wurde schlagweise in ein Zentrifugenrohr gegeben und durch Zentrifugieren für 10 Minuten bei 1000 Umdrehungen pro Minute in einer gekühlten IEC Centra-7R Auftischzentrifuge, die mit einem Rotor mit ausschwenkbaren Aufnahmen ausgestattet war, geklärt. Das geklärte Fluid wurde in 1 ml-Kryophiolen verteilt und bei ungefähr –70°C eingefroren. Die Virusbestände wurden auf MDCK-Zellen mit CPE und Plaquetest bei ungefähr 34°C titriert.
B. Ein großer Bestand an EIV-P821 wurde wie folgt in MDCK-Zellen vermehrt. MDCK-Zellen wurden in 150 cm² Gewebekulturkolben in MEM-Gewebekulturmedium mit Hanks-Salzen gezogen, das 10% Kalbserum enthielt. Die Zellen wurden dann mit sterilem PBS gewaschen, und das Wachstumsmedium wurde durch ungefähr 8 ml Infektionsmedium pro Kolben ersetzt. Die MDCK-Zellen wurden mit Virusstammlösung bei einer MOI im Bereich von ungefähr 0,5 pfu pro Zelle bis ungefähr 0,005 pfu pro Zelle beimpft, und den Viren wurde es erlaubt, für 1 Stunde bei etwa 34°C zu adsorbieren. Das Inoculum wurde von den Zellmonolagen entfernt, die Zellen wurden erneut mit PBS gewaschen, und ungefähr 100 ml des Infektionsmediums wurden pro Kolben zugegeben. Die infizierten Zellen wurden bei ungefähr 34°C für 24 Stunden inkubiert. Die Virus-infizierten MDCK-Zellen wurden durch heftiges Schütteln der Kolben geerntet, um die Zellmonolagen aufzubrechen, und Stabilisatorlösung wurde mit 25% V/V (Stabilisator/Viruslösung) zu den Kolben zugegeben. Die Überstände wurden aseptisch in Kryophiolen verteilt und bei –70°C eingefroren.
C. Therapeutische Zusammensetzungen, die bestimmte kälteadaptierte temperaturempfindliche Pferdeinfluenzaviren der vorliegenden Erfindung enthielten, wurden wie folgt formuliert. Direkt vor den Impfprozeduren, wie beispielsweise jenen die unten in den Beispielen 3-7 beschrieben sind, wurden Stammlösungsphiolen von EIV-P821 oder EIV-MSV+5 aufgetaut, und ihr Inhalt wurde in einem Streckungsmittel, das entweder oder Wasser oder PBS enthielt, oder in MEM-Gewebekulturmedium mit Hanks-Salzen, das 0,125% bovines Serum Albumin enthielt (BSA-MEM-Lösung), auf die gewünschte Verdünnung für die Verabreichung an Tiere verdünnt. Die Impfstoffzusammensetzungen wurden vor den Impfungen auf Eis gelagert. Der Titer aller therapeutischen Zusammensetzungen wurde durch Standardverfahren auf MDCK-Zellen direkt vor den Impfungen bestimmt, und, wann immer es möglich war, wurde der Titer einer Menge der Zusammensetzung, die identisch mit derjenigen war, die an die Tiere verabreicht wurde, nach den Impfungen bestimmt, um sicherzustellen, dass das Virus während der Prozeduren lebensfähig blieb.

Beispiel 3
Eine therapeutische Zusammensetzung, die ein kälteadaptiertes Pferdeinfluenzavirus EIV-P821 aufwies, wurde wie folgt auf Sicherheit und ihre Fähigkeit, in drei Pferden, die detektierbare frühere Immunität gegenüber Pferdeinfluenzavirus zeigten, zu replizieren, getestet. EIV-P821, das wie in Beispiel 1A beschrieben hergestellt wurde, wurde in Eiern gezogen, wie in Beispiel 2A beschrieben ist, und wurde in eine therapeutische Zusammensetzung formuliert, die 10⁷ pfu EIV-P821/2ml BSA-MEM-Lösung aufwies, wie in Beispiel 2C beschrieben ist.
Drei Ponys mit früheren detektierbaren Hämagglutinationsinhibierungs-(HAI-)Titern gegenüber Pferdeinfluenzavirus wurden mit einer therapeutischen Zusammensetzung, die EIV-P821 aufwies, durch das folgende Verfahren geimpft. Jedem Pony wurde eine 2 ml Dosis EIV-P821 gegeben, die intranasal unter Verwendung einer Spritze mit einer stumpfen Nadel verabreicht wurde, die lang genug war, um hinter die falschen Nüstern zu reichen, 1 ml pro Nüster.
Die Ponys wurden für ungefähr 30 Minuten direkt nach und ungefähr vier Stunden nach der Impfung auf unmittelbare Reaktionen vom allergischen Typ beobachtet, wie beispielsweise Schnupfen, Speichelausfluss, angestrengtes oder ungleichmäßiges Atmen, Schütteln, Anaphylaxie oder Fieber. Die Tiere wurden weiter an den Tagen 1-11 nach der Impfung bezüglich verzögerter Reaktionen vom allergischen Typ beobachtet, wie beispielsweise Lethargie oder Anorexie. Keines der drei Ponys in dieser Studie zeigte irgendwelche allergischern Reaktionen auf die Impfung.
Die Ponys wurden täglich ungefähr zu selben Zeit an jedem Tag, beginnend zwei Tage vor der Impfung und fortgesetzt bis zum 11. Tag nach der Impfung auf klinische Anzeichen, die mit Pferdeinfluenza konsistent sind, beobachtet. Die Ponys wurden bezüglich Nasenausfluss, Augenfluss, Anorexie, Disposition, Pulsrate, Kapillarwiederauffüllzeit, Atmungsfrequenz, Atemnot, Husten, Lungengeräusch, Anwesenheit von toxischen Linien am oberen Zahnfleisch und Körpertemperatur beobachtet. Zusätzlich wurden die submandibulären und parietalen Lymphknoten abgetastet, und jegliche Abnormalitäten wurden beschrieben. Keines der drei Ponys in dieser Studie zeigte während der Beobachtungsperiode irgendwelche abnormalen Reaktionen oder offensichtliche klinische Anzeichen.
Um auf Virusausscheidung bei den Tieren zu testen, wurden an den Tagen 0 bis 11 nach der Impfung nasopharyngeale Abstriche von den Ponys genommen, wie in Chambers, et al., 1995, Equine Practice, 17, 19-23, Chambers et al., ebd., beschrieben ist. Kurz gesagt, wurden zwei sterile Dacron-Applikatoren mit Polyesterspitzen (z. B. erhältlich von Hardwood Products Co., Guilford, ME) zusammen in jede Nüster der Ponys eingesetzt. Die Abstriche (insgesamt vier, zwei für jede Nüster) wurden in ein konisches 15 ml Zentrifugenröhrchen aufgelöst, das 2,5 ml gekühltes Transportmedium, welches 5% Glyzerin, Penicillin, Streptomycin, Neomycin und Gentamycin in PBS bei einem physiologischen pH-Wert aufwies. Während die Proben auf nassem Eis gehalten wurden, wurden die Abstriche aseptisch in das Medium ausgewrungen, und die nasopharyngealen Proben wurden in zwei gleiche Mengen aufgeteilt. Eine Menge wurde verwendet, um durch Beimpfung von embryonierten Eiern die Isolation von EIV, unter Anwendung des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens, zu versuchen. Das AF der beimpften Eier wurde dann durch Standardverfahren auf seine Fähigkeit getestet, Hämagglutination zu verursachen, was auf die Anwesenheit von Pferdeinfluenzavirus in dem AF hinweist. An den Tagen 2 und 3 nach der Impfung wurden die anderen Mengen mit dem Directigen^® Flu A-Test, erhältlich von Becton-Dickinson (Cockeysville, MD), auf Virus getestet,
Versuche, EIV von den nasopharyngealen Sekretionen der drei Tiere durch Eierbeimpfung zu isolieren, waren nicht erfolgreich. Jedoch wurden an den Tagen 2 und 3 alle Tiere unter Verwendung des Directigen Flu A-Tests positiv auf die Anwesenheit von Virusausscheidung getestet, was konsistent mit der Hypothese ist, dass EIV-P821 in den serumpositiven Ponys replizierte.
Um die Antikörpertiter gegen EIV bei den geimpften Tieren, die in diesem Beispiel beschrieben sind, sowie bei den Tieren, die in den Beispielen 4-7 beschrieben sind, zu testen, wurde von den Tieren vor der Impfung und an bestimmten Tagen nach der Impfung Blut genommen. Serum wurde isoliert und entweder mit Trypsin/Periodat oder Kaolin behandelt, um nichtspezifische Inhibitoren von Hämagglutination zu blockieren, die in normalen Seren vorliegen. Serumproben wurden gegen ein kürzliches EIV-Isolat durch Standardverfahren auf Hämagglutinationsinhibierungs-(HAI-)Titer getestet, die zum Beispiel in "Supplemental assay method for conducting the hemagglutination inhibition assay for equine influenza virus antibody" (SAM 124), bereitgestellt durch das U.S.D.A. National Veterinary Services Laborstory gemäß 9 CFR 113.2, beschrieben sind.
Die HAI-Titer der drei Ponys sind in Tabelle 5 gezeigt. Wie gesehen werden kann, stiegen die Serum-HAI-Titer unabhängig von dem Anfangstiter bei allen drei Tieren nach der Impfung mit EIV-P821 mindestens auf das Vierfache an.
Diese Daten zeigen, dass kälteadaptiertes Pferdeinfluenzavirus EIV-P821 sicher ist und bei serumpositiven Ponys nicht reaktogen, und dass diese Tiere einen Anstieg bei den Antikörpertitern gegen Pferdeinfluenzavirus zeigten, obwohl sie frühere nachweisbare Titer hatten. TABELLE 5: HAI-Titer von geimpften Tieren*.

Tier HAI-Titer (Tage nach der Impfung)

ID 0 7 14 21

18 40 80 160 160

18 10 20 40 80

25 20 40 320 80

*HAI-Titer werden als Kehrwert der höchsten Verdünnung an Serum ausgedrückt, die Hämagglutination von Erythrozyten durch ein aktuelles Isolat von Pferdeinfluenzavirus inhibierte.

Beispiel 4
Dieses Beispiel offenbart eine Tierstudie, um die Sicherheit und Wirksamkeit einer therapeutischen Zusammensetzung auszuwerten, die ein kälteadaptiertes Pferdeinfluenzavirus EIV-P821 aufweist.
Eine therapeutische Zusammensetzung, die kälteadaptiertes Pferdeinfluenzavirus EIV-P821 aufweist, wurde wie folgt auf Attenuation sowie ihre Fähigkeit getestet, Pferde vor Exposition gegenüber virulentem Pferdeinfluenzavirus zu schützen. EIV-P821, das wie in Beispiel 1 beschrieben erzeugt wurde, wurde in Eiern gezogen, wie in Beispiel 2A beschrieben ist, und wurde in eine therapeutische Zusammensetzung formuliert, die 10⁷ pfu Virus/2ml Wasser aufwies, wie in Beispiel 2C beschrieben ist. Acht EIV-serumnegative Ponys wurden bei dieser Studie verwendet. Drei der acht Ponys wurden mit einer 2 ml Dosis geimpft, die 10⁷ pfu der therapeutischen EIV-P821-Zusammensetzung aufwies und die intranasal unter Anwendung von Verfahren verabreicht wurde, die denjenigen ähnlich waren, welche in Beispiel 3 beschrieben sind. Einem Pony wurde 10⁷ pfu der therapeutischen EIV-P821-Zusammensetzung verabreicht, die oral durch Injizieren von 6 ml des Virus unter Verwendung einer 10 ml Spritze, welche durch das folgende Verfahren angepasst war, um einen Sprühnebel zu erzeugen, in den Pharynx verabreicht wurde. Der vorstehende "Sitz" für das Befestigen von Nadeln wurde unter Verwendung von Modelliergips abgedichtet, und ihre Kappe wurde am Platz belassen.
Ungefähr 10 Löcher wurden durch den Boden der Spritze, d. h. um den "Sitz" herum, unter Verwendung einer 25 Gauge-Nadel gestochen. Die Spritze wurde in den Zahnzwischenraum angeordnet, und das Virus wurde mit Druck in den hinteren Teil der Schnauze injiziert. Die verbliebenen vier Ponys wurden als nichtgeimpfte Kontrollen belassen.
Die geimpften Ponys wurden für ungefähr 30 Minuten direkt nach und ungefähr vier Stunden nach der Impfung hinsichtlich sofortiger Reaktionen vom allergischen Typ beobachtet, und die Tiere wurden an den Tagen 1-11 nach der Impfung weiter auf verzögerte Reaktionen vom allergischen Typ überwacht, beides wie in Beispiel 3 beschrieben. Keines der vier geimpften Ponys zeigte bei dieser Studie abnormale Reaktionen auf die Impfung.
Die Ponys wurden täglich, etwas zur selben Zeit an jedem Tag, beginnend zwei Tage vor der Virusimpfung und fortgesetzt bis zum 11. Tag nach der Virusimpfung auf klinische Anzeichen, so wie jene, die in Beispiel 3 beschrieben sind, beobachtet. Keines der vier geimpften Ponys zeigte bei dieser Studie irgendwelche klinischen Anzeichen während der Beobachtungsperiode. Dieses Resultat demonstriert, dass das kälteadaptierte Pferdeinfluenzavirus EIV-P821 den Phänotyp Attenuation zeigt.
Um die geimpften Tiere auf Virusausscheidung zu testen, wurden an den Tagen 0 bis 11 nach der Impfung nasopharyngeale Abstriche von den Ponys genommen, wie in Beispiel 3 beschrieben ist. Die nasopharyngealen Proben wurden in embryonierten Hühnereiern gemäß dem in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren auf Virus getestet.

Wie in Tabelle 6 gezeigt ist, wurde Virus unter Anwendung des Eierverfahrens nur von einem geimpften Tier isoliert. Wie jedoch bei Beispiel 3 bemerkt wurde, schließt das Fehlen von Isolation durch dieses Verfahren nicht die Tatsache aus, dass Virusreplikation erfolgt, da Replikation durch empfindlichere Verfahren, z. B. den Directigen Flu A-Test detektiert werden kann. TABELLE 6: Virusisolation in Eiern nach Impfung.

Tier	Virusisolation (Tage nach der Impfung)
ID	Route	0	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11
91	IN	-	-	+	+	+	+	+	+	+	+	+	-
666	IN	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
673	IN	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
674	Oral	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-

Um bei den geimpften Tieren die Antikörpertiter gegen Pferdeinfluenzavirus zu testen, wurde vor der Impfung und an den Tagen 7, 14, 21 und 28 nach der Impfung Blut von den Tieren genommen. Serumproben wurden isoliert und gemäß den in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren auf Hämagglutinationsinhibierungs-(HAI-)Titer gegen ein aktuelles EIV-Isolat getestet.
Die HAI-Titer der vier geimpften Ponys sind in Tabelle 7 gezeigt. TABELLE 7: HAI-Titel nach Impfung.

Tier HAI-Titer (Tage nach der Impfung)

ID Route 0 7 14 21 28

91 IN <10 <10 <10 <10 <10

666 IN 10 10 10 20 20

673 IN 10 10 10 20 20

674 Oral 20 40 40 40 40
Anders als den Anstieg beim HAI-Titer, der bei den drei Tieren, die in der Studie in Beispiel 3 beschrieben sind, beobachtet wurde, entwickelten die Tiere in dieser Studie bei dem HAI-Titer nach Impfung mit EIV-P821 keinen signifikanten Anstieg, d. h. größer als vierfach.
Ungefähr viereinhalb Monate nach der Virusimpfstoffverabreichung wurden alle 8 Ponys, d. h. die vier geimpften und die vier nicht geimpften Kontrollen, gemäß dem folgenden Verfahren einer Exposition ausgesetzt. Für jedes Tier wurden 10 pfu des virulenten Pferdeinfluenzavirusstamms A/Equine/Kentucky/1/91 (H3N8) in 5 ml Wasser suspendiert. Eine Maske wurde an einen Vernebler angeschlossen, und die Maske wurde auf der Schnauze des Tiers einschließlich der Nüstern angeordnet. Fünf (5) ml wurden für jedes Tier unter Anwendung von Vorgabewerten vernebelt, dass es 5-10 Minuten dauerte, um die gesamten 5 ml zu verabreichen. Klinische Beobachtungen wurden, wie in Beispiel 3 beschrieben ist, bei allen Tieren drei Tage vor der Exposition und täglich für 11 Tage nach der Exposition durchgeführt.
Unabhängig von der Tatsache, dass die geimpften Tiere keine deutlichen Anstiege bei ihren HAI-Titern gegen Pferdeinfluenzavirus zeigten, waren alle vier geimpften Tiere gegen den Pferdeinfluenzavirusangriff geschützt. Keines der geimpften Tiere zeigte offensichtliche klinische Anzeichen oder Fieber, obwohl eines der Tiere für zwei Tage etwas keuchte. Auf der anderen Seite schieden alle vier nicht geimpften Ponys Virus aus und entwickelten klinische Anzeichen und Fieber, wie es für eine Pferdeinfluenzavirusinfektion typisch ist. Somit demonstriert dieses Beispiel, dass eine therapeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung Pferde vor Pferdeinfluenzaerkrankung schützen kann.
Beispiel 5
Dieses Beispiel offenbart eine zusätzliche Tierstudie, um die Attenuation einer therapeutischen Zusammensetzung auszuwerten, die kälteadaptiertes Pferdeinfluenzavirus EIV-P821 aufweist, und ihre Fähigkeit, geimpfte Pferde vor nachfolgenden Expositionen gegenüber virulentem Pferdeinfluenzavirus zu schützen. Weiterhin wertet diese Studie den Effekt von Übungsstress auf die Sicherheit und Wirksamkeit der therapeutischen Zusammensetzung aus.
Eine therapeutische Zusammensetzung, die kälteadaptiertes Pferdeinfluenzavirus EIV-P821 aufwies, wurde wie folgt bei Pferden auf Sicherheit und Wirksamkeit getestet. EIV-P821, das wie in Beispiel 1 beschrieben erzeugt war, wurde in Eiern gezogen, wie in Beispiel 2A beschrieben ist, und wurde in eine therapeutische Zusammensetzung formuliert, die 10⁷ pfu Virus/5ml Wasser aufwies, wie in Beispiel 2C beschrieben ist. Fünfzehn Ponys wurden in dieser Studie verwendet. Die Ponys wurden zufällig drei Gruppen von fünf Tieren zugeordnet, wie in Tabelle 8 gezeigt ist, wobei es zwei geimpfte Gruppen und eine ungeimpfte Kontrollgruppe gab. Die Ponys in Gruppe 2 wurden vor der Impfung Übungsstress ausgesetzt, während die Ponys in der geimpften Gruppe 1 in einem Stall gehalten wurden. TABELLE 8: Impfungs-/Expositionsprotokoll.

Gruppe Anzahl der Ponys Übung Impfung Exposition

1 5 - Tag 0 Tag 90

2 5 Tage -4 bis 0 Tag 0 Tag 90

3 5 - - Tag 90
Die Ponys in Gruppe 2 wurden wie folgt vor der Impfung Übungsstress auf einem Laufband ausgesetzt. Die Ponys wurden durch 6 Stunden Laufbandverwendung nur im Schritt an die Verwendung des Laufbands gewöhnt. Der aktuelle Übungsstress schloss ein tägliches Übungsregime beginnend 4 Tage vor und endend am Tag der Impfung (direkt vor der Impfung) ein. Das Laufbandübungsregime ist in Tabelle 9 gezeigt. TABELLE 9: Übungsregime für die Ponys in Gruppe 2.

Geschwindigkeit (m/s) Zeit (min) Steigerung (°)

1,5 2 0

3,5 2 0

3,5 2 7

4,5⁺ 2 7

5,5⁺ 2 7

6,5⁺ 2 7

7,5⁺ 2 7

8,5⁺ 2 7

3,5 2 7

1,5 10 0⁺

⁺Geschwindigkeit in Metern pro Sekunde (m/s) wurde für jedes Tier alle 2 Minuten erhöht, bis die Herzrate ≥ 200 Schläge pro Minute erreichte und beibehielt.

Den Gruppen 1 und 2 wurde eine therapeutische Zusammensetzung, die 10⁷ pfu EIV-P821 aufwies, durch das Vernebelungsverfahren, das für den Angriff in Beispiel 4 beschrieben ist, verabreicht. Keines der geimpften Ponys zeigte in dieser Studie irgendwelche sofortigen oder verzögerten allergischen Reaktionen auf die Impfung.
Die Ponys wurden täglich, ungefähr zu selben Zeit an jedem Tag, beginnend zwei Tage vor der Impfung und fortgesetzt bis zum 11. Tag nach der Impfung auf klinische Anzeichen, so wie jene, die in Beispiel 3 beschrieben sind, beobachtet. Keines der geimpften Ponys zeigte bei dieser Studie während der Beobachtungsperiode irgendwelche offensichtlichen klinischen Anzeichen.

Um bei den geimpften Tieren auf Virusausscheidung zu testen, wurden vor der Impfung und an den Tagen 1 bis 11 nach der Impfung bei den Ponys Nasopharyngealabstriche gemacht, wie in Beispiel 3 beschrieben ist. Die Nasopharyngealproben wurden gemäß dem in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren in embryonierten Hühnereiern auf Virus getestet. Virus wurde von den geimpften Tieren, d. h. den Gruppen 1 und 2, isoliert, wie in Tabelle 10 gezeigt ist. TABELLE 10: Virusisolation nach Impfung.

	Tier		Virusisolation (Tage nach der Impfung)
Gruppe	ID	Übung	0	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11
1	12	Nein	-	-	+	+	+	+	+	-	+	+	-	-
	16		-	-	+	+	+	+	+	-	-	-	-	-
	17		-	-	+	+	+	+	+	+	+	-	+	-
	165		-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
	688		-	-	-	-	-	+	-	+	-	-	-	-
2	7	Ja	-	-	-	+	+	+	+	-	-	-	-	-
	44		-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
	435		-	-	+	+	+	+	-	-	-	-	-	-
	907		-	-	-	+	-	+	+	-	-	-	-	-
	968		-	-	-	-	-	+	-	+	-	-	-	-

Um bei den geimpften Tieren auf die Antikörpertiter gegen Pferdeinfluenzavirus zu testen, wurde vor der Impfung und an den Tagen 7, 14, 21 und 28 nach der Impfung Blut genommen.

Serumproben wurden isoliert und auf HAI-Titer gegen ein aktuelles EIV-Isolat gemäß dem in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren getestet. Diese Titer sind in Tabelle 11 gezeigt. TABELLE 11: HAI-Titer nach der Impfung und nach Exposition am Tag 90.

	Tier	Tage nach der Impfung
Gruppe	ID	-1	7	14	21	28	91	105	112	119	126
1	12	<10	<10	<10	<10	<10	<10	80	320	320	640
1	16	<10	<10	20	20	<10	<10	20	160	320	320
1	17	<10	<10	10	10	10	10	80	160	160	160
1	165	<10	<10	10	10	10	10	80	80	80	80
1	688	<10	<10	20	20	20	20	20	20	20	40
2	7	<10	<10	10	10	<10	<10	20	80	80	40
2	44	<10	<10	20	20	20	10	80	320	320	320
2	435	<10	<10	20	20	10	<10	20	80	80	80
2	907	<10	<10	10	10	20	10	10	40	80	80
2	968	<10	<10	<10	<10	<10	<10	40	160	160	160
3	2						<10	80	640	640	320
3	56						<10	80	320	320	320
3	196						<10	20	160	80	80
3	198						10	40	160	320	320
3	200						<10	20	80	80	40
Gruppe	Beschreibung
1	nur Impfung
2	Impfung und Übung
3	Kontrolle

Am Tag 90 nach der Impfung wurden alle 15 Ponys mit 10⁷ pfu vom Pferdeinfluenzavirusstamm A/Equine/Kentucky/1/91 (H3N8) durch das Verneblerverfahren expomiert, wie in Beispiel 4 beschrieben ist. Klinische Beobachtungen, wie sie in Beispiel 3 beschrieben sind, wurden an allen Tieren drei Tage vor dem Angriff und täglich für 11 Tage nach dem Angriff durchgeführt. Es gab keine offensichtlichen klinischen Anzeichen, die bei irgendeinem der geimpften Ponys beobachtet wurden. Vier der fünf nicht geimpften Ponys entwickelten Fieber und klinische Anzeichen, die für Pferdeinfluenzavirusinfektion typisch sind.
So zeigt dieses Beispiel, dass eine therapeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung Pferde gegen Pferdeinfluenzaerkrankung schützt, selbst wenn die Tiere vor der Impfung Stress ausgesetzt werden.
Beispiel 6
Dieses Beispiel vergleicht die Infektiositäten von therapeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung, die in Eiern und in Gewebekulturzellen gezogen wurden. Vom Produktionsstandpunkt gibt es einen Vorteil, therapeutische Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung anstelle von embryonierten Hühnereiern in Gewebekulturzellen zu ziehen. Pferdeinfluenzavirus wächst jedoch in Zellen nicht auf so hohe Titer wie in Eiern. Zusätzlich erfordert das Hämagglutinin des Virus für die Infektiosität eine extrazelluläre proteolytische Spaltung durch Trypsin-artige Proteasen. Da Serum Trypsininhibitoren enthält, muss in Zellkultur gezogenes Virus in serumfreiem Medium vermehrt werden, das Trypsin enthält, um infektiös zu sein. Es ist den Fachleuten gut bekannt, dass solche Bedingungen für die Lebensfähigkeit von Gewebekulturzellen weniger als optimal sind. Zusätzlich können diese Wachstumsbedingungen ein Virus mit geänderter Bindungsaffinität für Pferdezellen selektieren, was die Virusinfektiosität beeinträchtigen kann, da das Virus wirksam an die Nasenschleimhaut des Tiers anbinden muss, um zu replizieren und Immunität zu stimulieren. Somit war es das Ziel der in diesem Beispiel offenbarten Studie, auszuwerten, ob die Infektiosität von therapeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung durch das Wachstum für mehrere Passagen in in vitro-Gewebekulturen negativ beeinflusst war.
EIV-P821, das erzeugt wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben ist, wurde in Eiern gezogen, wie in Beispiel 2A beschrieben wurde, oder in MDCK-Zellen, wie in Beispiel 2B beschrieben wurde. In jedem Fall wurde das Virus fünf Passagen unterworfen. EIV-P821 wurde nach jeder Passage auf seine Phänotypen Kälteadaptierung und Temperaturempfindlichkeit getestet. Die Präparationen des Virus mit Ei- und Zellpassagen wurden in therapeutische Zusammensetzungen formuliert, die 10⁷ pfu Virus/2ml BSA-MEM-Lösung enthielten, wie in Beispiel 2C beschrieben ist, was in eine Ei-gezogene therapeutische EIV-P821-Zusammensetzung beziehungsweise eine MDCK-Zellen-gezogene therapeutische EIV-P821-Zusammensetzung resultierte.
Acht Ponys wurden in dieser Studie verwendet. Serum von jedem der Tiere wurde vor der Studie auf HAI-Titer gegen Pferdeinfluenzavirus getestet. Die Tiere wurden zufällig einer von zwei Gruppen von jeweils vier Ponys zugeordnet. Die Gruppe A erhielt die Ei-gezogene therapeutische EIV-P821-Zusammensetzung, und die Gruppe B erhielt die MDCK-gezogene therapeutische EIV-P821-Zusammensetzung, die wie in Beispiel 2B beschrieben präpariert war.
Die therapeutischen Zusammensetzungen wurden intranasal durch das Verfahren verabreicht, das in Beispiel 3 beschrieben ist.
Die Ponys wurden täglich, ungefähr zur selben Zeit an jedem Tag, beginnend zwei Tage vor der Impfung und fortgesetzt bis zum 11. Tag nach der Impfung, auf allergische Reaktionen oder klinische Anzeichen beobachtet, wie in Beispiel 3 beschrieben ist. Bei keinem der Tiere wurden allergischen Reaktionen oder offensichtliche klinische Anzeichen beobachtet.

Nasopharyngealabstriche wurden vor der Impfung und täglich für 11 Tage nach der Impfung gemacht. Die Anwesenheit von Virusmaterial in den Nasenabstrichen wurde durch Detektion von CPE auf MDCK-Zellen bestimmt, die wie in Beispiel 1 beschrieben ist, infiziert wurden, oder durch Einimpfung in Eier und Untersuchung der Fähigkeit des infizierten AF, Hämagglutination zu verursachen, wie in Beispiel 3 beschrieben ist. Das Material wurde auf die Anwesenheit nur von Virus getestet und nicht auf den Titer von Virus in der Probe. Virusisolierungsresultate sind in Tabelle 12 aufgelistet. Blut wurde genommen, und Serumproben von den Tagen 0, 7, 14, 21 und 28 nach der Impfung wurden auf Hämagglutinationsinhibierungsantikörpertiter gegen ein aktuelles Isolat getestet. HAI-Titer sind in Tabelle 12 ebenfalls gelistet. TABELLE 12: HAI-Titer und Virusisolierung nach Impfung.

Gruppe²	ID	HAI-Titer (DPV³)								Virusisolierung¹ (DPV³)
Gruppe²	ID	0	7	14	21	28	0	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11
1	31	<10	20	160	160	160	-	EC	-	C	EC	EC	C	C	EC	-	-	-
	37	<10	40	160	160	160	-	EC	C	C	EC	C	C	C	-	-	-	-
	40	<10	20	80	160	80	-	EC	EC	C	-	C	EC	C	-	EC	EC	-
	41	<10	40	160	160	80	-	EC	EC	C	EC	C	EC	EC	-	-	-	-
2	32	<10	<10	80	80	40	-	EC	-	C	-	C	-	C	-	EC	-	-
	34	<10	20	160	160	160	-	EC	-	C	EC	C	EC	C	-	-	-	-
	35	<10	<10	80	80	40	-	EC	-	C	-	C	-	C	-	EC	-	-
	42	<10	<10	80	80	40	-	-	-	C	-	C	EC	EC	-	-	-	-

¹E = Eierisolierung positiv; C = CPE-Issolierung positiv; - = Virus durch keines der Verfahren detektiert
²Gruppe 1: Virus mit 5 Passagen in MDCK-Zellen; Gruppe 2: Virus mit 5 Passagen in Eiern
³Tage nach der Impfung

Die Resultate in Tabelle 12 zeigen, dass es keine signifikanten Unterschiede bei der Infektiosität oder Immunogenizität zwischen den Ei-gezogenen und MDCK-gezogenen therapeutischen EIV-P821-Zusammensetzungen gab.
Beispiel 7
Dieses Beispiel wertet die minimale Dosis einer ein kälteadaptiertes Pferdeinfluenzavirus aufweisenden therapeutischen Zusammensetzung aus, die erforderlich ist, um ein Pferd vor Pferdeinfluenzavirusinfektion zu schützen.
Die in den Beispielen 3-6 offenbarten Tierstudien weisen darauf hin, dass eine therapeutische Zusammensetzung der Erfindung wirksam und sicher war. In diesen Studien wurde eine Dosis von 10 pfu verwendet, was mit ungefähr 10⁸ TCID₅₀-Einheiten korreliert. Von den Gesichtspunkten Kosten und Sicherheit ist es jedoch vorteilhaft, den minimalen Virustiter zu verwenden, der ein Pferd vor durch Pferdeinfluenzavirus verursachter Erkrankung schützen wird. In dieser Studie wurden Ponys mit vier unterschiedlichen Dosen einer ein kälteadaptiertes Pferdeinfluenzavirus aufweisenden therapeutischen Zusammensetzung geimpft, um die Minimaldosis zu bestimmen, die ein Pferd gegen einen Angriff mit virulentem Pferdeinfluenzavirus schützt.
EIV-P821, das wie in Beispiel 1A beschrieben erzeugt war, wurde in MDCK-Zellen gezogen und Passagen unterworden, wie in Beispiel 2B beschrieben ist, und wurde in eine therapeutische Zusammensetzung formuliert, die entweder 2 × 10⁴, 2 × 10⁵, 2 × 10⁶ oder 2 × 10⁷ TCID₅₀-Einheiten/1ml BSA-MEM-Lösung enthielt, wie in Beispiel 2C beschrieben ist. Neunzehn Pferde von unterschiedlichem Alter und unterschiedlicher Zucht wurden für diese Studie verwendet. Die Pferde wurden vier Impfgruppen zugeordnet, einer Gruppe von drei Pferden und drei Gruppen von vier Pferden, und einer Kontrollgruppe von vier Pferden (siehe Tabelle 13). Jedem der Ponys in den Impfgruppen wurde eine 1 ml Dosis der angegebenen therapeutischen Zusammensetzung gegeben, die intranasal durch Verfahren ähnlich denjenigen verabreicht wurden, die in Beispiel 3 beschrieben sind. TABELLE 13: Impfprotokoll.

Gruppe Nr. Anzahl der Tiere Impfdosis, TCID₅₀-Einheiten

1 3 2 × 10⁷

2 4 2 × 10⁶

3 4 2 × 10⁵

4 4 2 × 10⁴

5 4 Kontrolle
Die Ponys wurden für ungefähr 30 Minuten direkt nach und zum Zeitpunkt ungefähr vier Stunden nach der Impfung auf Reaktionen vom unmittelbaren Typ beobachtet, und die Tiere wurden weiter an den Tagen 1-11 nach der Impfung hinsichtlich Reaktionen vom verzögerten Typ überwacht, beides wie in Beispiel 3 beschrieben ist. Keines der geimpften Ponys entwickelte bei dieser Studie abnormale Reaktionen oder offensichtliche klinische Anzeichen aufgrund der Impfung.

Blut für Serumanalysen wurde 3 Tage vor der Impfung, an den Tagen 7, 14, 21 und 28 nach der Impfung und nach der Exposition an den Tagen 35 und 42 genommen. Serumproben wurden auf HAI-Titer gegen ein aktuelles EIV-Isolat gemäß dem im Beispiel 3 beschriebenen Verfahren getestet. Diese Titer sind in Tabelle 14 gezeigt. Vor der Exposition am Tag 29 zeigten 2 der 3 Tiere in der Gruppe 1, 4 der 4 Tiere in Gruppe 2, 3 der 4 Tiere in Gruppe 3 und 2 der 4 Tiere in Gruppe 4 mindestens 4-fache Anstiege bei den HAI-Titern nach der Impfung. Zusätzlich zeigten 2 der 4 Kontrollpferde ebenfalls Anstiege bei den HAT-Titern. Eine Interpretation für dieses Resultat ist, dass die Kontrollpferde dem Impfvirus ausgesetzt waren, das von den geimpften Pferden übertragen wurde, da alle Pferde bei dieser Studie in demselben Stall untergebracht waren. TABELLE 14: HAI-Titer nach der Impfung und nach der Exposition und Expositionsresultate.

Nr.	Dosis in TCID₅₀-Einheiten	Tier-ID	Impfung am Tag 0, Exposition am Tag 29							krank nach Exposition
Nr.	Dosis in TCID₅₀-Einheiten	Tier-ID	-1	7	14	21	28	35	42	+/-
1	2 × 10⁷	41	<10	<10	10	40	10	20	80	-
		42	40	40	40	40	40	<10	80	-
		200	<10	<10	80	40	160	40	40	-
2	2 × 10⁶	679	<10	10	40	40	40	20	20	-
		682	<10	<10	40	40	40	40	40	-
		795	20	80	160	160	320	320	640	-
		R	<10	10	40	20	160	40	40	-
3	2 × 10⁵	73	<10	<10	160	40	80	160	160	-
		712	<10	<10	20	20	40	40	20	-
		720	<10	20	80	40	80	80	160	-
		796	<10	<10	<10	<10	<10	10	80	+
4	2 × 10⁴	75	<10	<10	<10	<10	<10	<10	160	+
		724	<10	>10	<10	<10	<10	20	320	+
		789	<10	10	320	160	320	320	320	-
		790	<10	<10	80	40	160	80	40
5	Kontrolle	12	<10	<10	<10	20	20	40	40	-
		22	10	20	40	10	160	40	640	-
		71	<10	<10	<10	<10	10	20	160	+
		74	<10	<10	<10	<10	<10	<10	20	+

Am Tag 29 nach der Impfung wurden alle 19 Ponys gegenüber dem Pferdeinfluenzastamm A/Equine/Kentucky/1/91 (H3N8) durch das Verneblerverfahren, wie es in Beispiel 4 beschrieben ist, exponiert. Die Expositionsdosis wurde so voraussichtlich berechnet, dass sie für jedes Tier ungefähr 10⁸ TCID₅₀-Einheiten Expositionsvirus in einem Volumen von 5 ml enthielt. Klinische Beobachtungen wurden, wie in Beispiel 3 beschrieben ist, beginnend zwei Tage vor der Exposition, am Tag der Exposition und 11 Tage nach der Exposition überwacht. Wie in Tabelle 14 gezeigt ist, zeigten keine Tiere in den Gruppen 1 oder 2 klinische Anzeichen, die auf Pferdeinfluenzaerkrankung hinweisen, und nur eines von vier Tieren in der Gruppe 3 wurde krank. Zwei von vier Tieren in der Gruppe 4 wurden krank, und nur zwei der vier Kontrolltiere wurden krank. Die Resultate in Tabelle 14 weisen auf eine Korrelation zwischen Serumkonversion und Schutz vor Krankheit hin, da zum Beispiel die zwei Kontrolltiere, die erhöhte HAI-Titer während der Impfperiode aufwiesen, keine klinischen Anzeichen von Pferdeinfluenzaerkrankung nach der Exposition zeigten. Eine andere Interpretation jedoch war, dass der tatsächliche Titer des Expositionsvirus kleiner als die berechnete Menge von 10⁸ TCID₅₀-Einheiten war, da basierend auf den früheren Resultaten dieses Expositiosniveau bei allen Kontrolltieren Erkrankung hätte verursacht haben sollen.
Nichtsdestotrotz weisen die Niveaus an Serumkonversion und das Fehlen von klinischen Anzeichen bei den Gruppen, die eine therapeutische Zusammensetzung erhielten, die mindestens 2 × 10⁶ TCID₅₀-Einheiten eines kälteadaptierten Pferdeinfluenzavirus aufwies, darauf hin, dass diese Menge ausreichend war, um ein Pferd gegen Pferdeinfluenzaviruserkrankung zu schützen. Weiterhin induzierte eine Dosis von 2 × 10⁵ TCID₅₀-Einheiten Serumkonversion und ergab klinischen Schutz gegenüber dem Angriff bei 3 von 4 Pferden, und so mag selbst diese Menge ausreichend sein, um signifikanten Schutz bei Pferden gegen Pferdeinfluenzaerkrankung beizutragen.
Beispiel 8
Dieses Beispiel offenbart eine Tierstudie, um die Dauer der Immunität einer therapeutischen Zusammensetzung auszuwerten, die ein kälteadaptiertes Pferdeinfluenzavirus EIV-P821 aufweist.
Eine therapeutische Zusammensetzung, die kälteadaptiertes Pferdeinfluenzavirus EIV-P821, das wie in Beispiel 1 beschrieben erzeugt war, aufwies, wurde in Eiern ähnlich der Prozedur, die in Beispiel 2A beschrieben ist, gezogen, wurde durch Passage in MDCK-Zellen ähnlich der in Beispiel 2B beschriebenen Prozedur vermehrt und wurde, wie in Beispiel 2C beschrieben ist, in eine therapeutische Zusammensetzung formuliert. Dreißig Pferde von ungefähr 11 bis 12 Monaten Alter wurden für diese Studie verwendet. Neunzehn der Pferde wurden jeweils unter Verwendung einer Spritze, wobei eine Austragsvorrichtungsspitze an dem Ende befestigt war, mit einer 1,0 ml Dosis, die 6 log TCID₅₀-Einheiten der therapeutischen EIV-P821-Zusammensetzung aufwies, intranasal in eine Nüster geimpft. Die Impfungen wurden am Tag 0 durchgeführt.
Die Pferde wurden am Tag 0 (vor der Impfung und bis zu 4 Stunden nach der Impfung) und an den Tagen 1, 2, 3, 7, 15 und 169 der Studie nach der Impfung beobachtet. An diesen Tagen wurde eine Untersuchung aus der Entfernung für einen Zeitraum von mindestens 15 Minuten durchgeführt. Diese Untersuchung aus der Entfernung umfasst Beobachtung bezüglich Gebaren, Verhalten, Husten, Schupfen und Nasenausfluss. Die Untersuchung am Tag 169 diente auch dazu, zu bestätigen, dass die Pferde in einem für den Transport zu einem Expositionsort geeigneten Gesundheitszustand waren, der ungefähr 360 Meilen von dem Impfort entfernt war.
Die Tiere wurden an den Expositionsort akklimatisiert und wurden ungefähr täglich durch einen Tierarzt oder einen Tierpfleger auf das Auftreten von Krankheit untersucht. Eine allgemeine physische Untersuchung wurde am Tag 171 nach der Impfung durchgeführt, um die folgenden Punkte zu überwachen: Gebaren, Verhalten, Husten, Schnupfen und Nasenausfluss. Von den Tagen 172 bis 177 wurden ähnliche Beobachtungen sowie Rektaltemperaturen aufgezeichnet, gemäß der Beurteilung des beigezogenen Tierarztes für jedes einzelne Pferd mit abnormaler klinischer Erscheinung.
Kein geimpftes Pferd zeigte nach der Impfung irgendwelche Nebenwirkungen. Ein geimpftes Pferd wurde ungefähr zwei Monate nach der Impfung tot gefunden. Dieses Pferd zeigte keinen Hinweis auf Nebenwirkung, als es für mindestens einen Monat nach der Impfung beobachtet wurde. Obwohl keine Todesursache sicher festgestellt werden konnte, war der Tod nicht plötzlich und wurde als konsistent mit möglichen beitragenden Faktoren, wie beispielsweise Kolik, Knochenbruch oder ernste Wurmlast, betrachtet. Da es keinen anderen Hinweis auf irgendwelche Nebenwirkungen nach der Impfung bei irgendeinem anderen geimpften Pferd gab, ist es hoch unwahrscheinlich, dass die Impfung in diesem Fall zu irgendeiner Nebenwirkung beitrug.
Die Expositionen wurden am Tag 181 nach der Impfung durchgeführt. Das folgende Wildtypisolat von Pferdeinfluenzavirus, von dem kürzlich gezeigt wurde, dass es Krankheit bei Pferden verursacht, wurde als Expositionsvirus verwendet: A/Equine/2/Kentucky/91. Vor der Infektion jeder Expositionsgruppe wurde das Expositionsmaterial schnell auf ungefähr 37°C aufgetaut. Das Virus wurde mit Phophat-gepufferter Salzlösung auf ein Gesamtvolumen von ungefähr 21 ml verdünnt. Das verdünnte Material wurde bis unmittelbar vor der Beimpfung auf Eis gekühlt gelagert. Vor der Beimpfung und zum Ende der Verneblung wurde für jede Expositionsgruppe eine Probe des verdünnten Expositionsvirus für eine Prä- und Postimpfvirustiterbestätigung genommen. Die Geimpften und Kontrollen wurden zufällig 4 Expositionsgruppen von jeweils 6 Pferden und einer Expositionsgruppe von 5 Pferden zugeordnet, so dass jede Expositionsgruppe eine Mischung von 4 Geimpften und 2 Kontrollen oder 3 Geimpften und 2 Kontrollen enthielt.
Das Expositionsvirus wurde in Aerosolform mit einem Ultraschallvernebler (z. B. DeVilbiss Modell 099HD, DeVilbiss Healthcare Inc., Somerset, Pennsylvania) für einen Zeitraum von ungefähr 10 Minuten durch ein Rohr ausgetragen, das durch eine kleine Öffnung mitten in einer Kunststoffdecke eingesetzt war. Die Pferde blieben für einen weiteren Zeitraum von ungefähr 30 Minuten in der Kammer, nachdem die Vernebelung abgeschlossen war (Gesamtaussetzungszeit ungefähr 40 Minuten). Zu diesem Zeitpunkt wurde der Kunststoff entfernt, um die Kammer zu belüften, und die Pferde wurden freigelassen und kehrten in ihren Pferch zurück. Die Expositionsprozedur wurde für jede Gruppe wiederholt.
Alle statistischen Verfahren in dieser Studie wurden unter Verwendung von SAS (SAS Institute, Cary, NC) durchgeführt, und P < 0,05 wurde als statistisch signifikant betrachtet. Beginnend am Tag 178 nach der Impfung (drei Tage vor der Exposition) bis zum Tag 191 (Tag 10 nach der Impfung) wurden die Pferde täglich sowohl aus der Entfernung als auch durch individuelle Untersuchungen beobachtet. Rektaltemperaturen wurden zu diesen Zeitpunkten genommen.

Daten vom Tag 0 (Expositionstag) bis zum Tag 10 wurden in die Analyse einbezogen, siehe Tabelle 15. TABELLE 15: Effekt der Exposition auf die täglichen Temperaturen (°C) bei geimpften und Kontrollpferden (Mittelwerte mit kleinstem quadratischen Fehler).

Tage nach der Exposition	geimpft (n = 19)	nicht geimpft (n = 10)	P-Wert
0	100,7	100,8	0,8434
1	100,5	100,4	0,7934
2	103,4	104,9	0,0024
3	101,8	103,9	0,0001
4	101,5	103,2	0,0002
5	101,7	103,8	0,0001
6	101,3	103,6	0,0001
7	100,7	102,3	0,0007
8	100,5	101,4	0,0379
9	100,1	100,3	0,7416
10	100,3	100,5	0,7416
zusammengefasste Standardabweichung des Mittelwerts	0,27	0,38

Tabelle 15 zeigt, dass geimpfte Pferde an den Tagen 2 bis 8 niedrigere Temperaturen (P < 0,05) als die nicht geimpften Kontrollpferde hatten.
Die Untersuchung aus der Ferne bestand aus einem Zeitraum von 20 Minuten, in dem die folgenden Beobachtungen gemacht wurden: Husten, Nasenausfluss, Atmung und Depression.

Bewertungen der Kriterien sind in Tabelle 16 gezeigt. TABELLE 16: Klinische Anzeichen und Bewertungsindex.

Klinisches Anzeichen	Beschreibung	Bewertung
Husten	normal während des Beobachtungszeit-	0
	raums von 15 Minuten
	einmaliges Husten während der	1
	Beobachtung	2
	zweimaliges oder häufigeres Husten
	während der Beobachtung
Nasenausfluss	normal	0
	abnormal, serös	1
	abnormal, mukopurulent	2
	abnormal, profus	3
Atmung	normal	0
Atmung	abnormal (Dyspnoe, Tachypnoe)	1
Depression	normal	0
Depression	Depression liegt vor⁺	1

⁺Depression wurde subjektiv durch Auswertung des individuellen Tierverhaltens erfasst, das die folgenden Aspekte beinhaltete: kein schnelles Aufsuchen des Futters, allgemeine Lethargie, fehlender Appetit und Anorexie.

Jedes Pferd wurde in jeder dieser Kategorien bewertet. Zusätzlich wurden submandibuläre Lymphknoten abgetastet, um auf mögliche Bakterieninfektionen zu überwachen. In jedem Fall, in dem es einen unterschiedlichen Wert gab, der für ein subjektives klinisches Anzeichen von einer Bobachtung am selben Tag aus der Ferne gegenüber der individuellen Untersuchung gab, wurde bei der Zusammenfassung und der Analyse der Resultate der größere Wert verwendet. Zum Zwecke des Erfassens der Gesundheit der Pferde vor der letztendlichen Disposition wurden Untersuchungen aus der Entfernung 14, 18 und 21 Tage nach der Exposition durchgeführt. Daten von den Tagen 1 bis 10 nach der Exposition wurden in die Analyse einbezogen. Die Bewertungen wurden für jedes Pferd an jedem Tag aufsummiert, und die Geimpften und Kontrollen wurden unter Verwendung des Wilcoxon-Rangsummentests verglichen. Zusätzlich wurden die Bewertungen über alle Tage für jedes Pferd aufsummiert und in derselben Weise verglichen. Die mittleren Ränge und mittleren klinischen Bewertungen sind in Tabelle 17 beziehungsweise 18 gezeigt. Fünf Tage nach der Exposition war der mittlere Rang von Bewertungen bei den geimpften Pferden niedriger (P < 0,05) als bei den nicht geimpften Kontrollpferden; und dieser Effekt setzte sich an den Tagen 6, 7, 8, 9 und 10 (P < 0,05) fort. Der kumulative Rang über die gesamte Testperiode war bei den geimpften Pferden ebenfalls kleiner (P < 0,05) als bei den nicht geimpften Kontrollen. TABELLE 17: Auswirkung der Exposition auf die Bewertung klinischer Anzeichen bei geimpften und Kontrollpferden (mittlerer Rang).

Tage nach der Exposition	geimpft (n = 19), mittlerer Rang*	nicht geimpft (n = 10), mittlerer Rang	P-Wert
0	13,6	17,6	0,1853
1	16,4	12,4	0,2015
2	15,1	14,9	0,9812
3	13,3	18,3	0,1331
4	13,5	17,9	0,1721
5	12,4	19,9	0,0237
6	12,7	19,4	0,0425
7	12,1	20,6	0,0074
8	12,6	19,6	0,0312
9	13,1	18,7	0,0729
10	12,3	20,1	0,0135
insgesamt über 11 Tage	11,8	21,2	0,0051

*Durch Wilcoxon-Rangsummentest.

Tage nach der Exposition	geimpft (n = 19)	nicht geimpft (n = 10)
0	1,2	1,6
1	1,5	0,9
2	2,4	2,5
3	3,2	4,1
4	3,4	4,3
5	3,2	4,7
6	3,4	4,8
7	3,3	4,7
8	3,2	4,5
9	3,2	3,9
10	2,4	3,4

Nasopharyngealabstriche wurden an dem Tag vor der Exposition und an den Tagen 1 bis 8 nach der Exposition gemacht, wie in Beispiel 3 beschrieben ist, und durch Zellkulturtest auf ausgeschiedenes Virus getestet. Der Prozentsatz der Pferde, die Expositionsvirus in jeder Gruppe ausscheiden, ist in Tabelle 19 gezeigt. Der Prozentsatz der Pferde, die das Expositionsvirus in der geimpften Gruppe ausschieden, war an den Tagen 5 und 6 nach der Exposition niedriger (P < 0,05) als bei den nicht geimpften Kontrollen. Die mittlere Anzahl an Tagen, über die das Expositionsvirus ausgeschieden wurde, war bei der geimpften Gruppe verglichen mit den nicht geimpften Kontrollen ebenfalls niedriger (P < 0,05). TABELLE 19: Prozentsatz an Pferden pro Tag, die Virus nach der Exposition ausscheiden, und mittlere Anzahl an Tagen des Ausscheidens pro Gruppe.

Tage nach der Exposition	geimpft (n = 19)	nicht geimpft (n = 10)
-1	0	0
1	63,2	90
2	100	100
3	84,2	100
4	100	100
5	47,4	88,9*
6	10,5	77,8*
7	5,3	20
8	0	0
mittlere Anzahl der Ausscheidungstage	4,1	5,6*

*Innerhalb eines Zeitpunkts unterschieden sich Geimpfte von Nichtgeimpften (P < 0,05) entweder durch Fisher's Exakttest (Prozentdaten) oder den Wilcoxon-Rangsummentest (Tage der Ausscheidung).

Die Bewertungen der klinischen Anzeichen, die für Influenza relevant sind, und die objektiven Temperaturmessungen zeigen beide eine statistisch signifikante Reduktion bei der geimpften Gruppe, wenn sie mit jenen der Kontrollgruppe verglichen werden; dies ist konsistent mit einer Interpretation, dass der Impfstoff signifikanten Schutz vor Krankheit verleiht.
Die Fähigkeit von Pferden, Influenzavirus nach der Exposition auszuscheiden, war bei den Geimpften verglichen mit den Kontrollen ebenfalls sowohl hinsichtlich der Fälle von Pferden, die nach der Exposition an bestimmten Tagen positiv für das Ausscheiden waren, als auch hinsichtlich des Mittelwerts der Anzahl an Tagen der Ausscheidung pro Pferd signifikant reduziert. Dieses reduzierte Ausscheiden durch Geimpfte ist insofern wichtig, als dass es dazu dienen sollte, bei einem Ausbrechen von Influenza das Potential der Aussetzung von empfänglichen Tieren gegenüber dem Wildtypvirus zu reduzieren.
Die Resultate dieser Studie sind konsistent mit der Interpretation, dass der Impfstoff für 6 Monate sicher zum Schutz vor klinischer Erkrankung führt, die durch Pferdeinfluenza verursacht wird, und das Potential der Verbreitung von natürlich auftretendem virulenten Pferdeinfluenzavirus reduziert. Während das Maß des Schutzes vor der Erkrankung nicht vollständig war (13 von 19 Geimpften waren geschützt, während 10/10 Kontrollen krank waren), gab es eine klare Reduktion bei der Ernsthaftigkeit und der Dauer der klinischen Erkrankung und einen beachtlichen Effekt auf das Potential von Virusausscheidung nach der Aussetzung gegenüber einem virulenten Pferdeinfluenzastamm. Die Erkenntnis, dass sowohl Geimpfte als auch Kontrollen direkt vor der Exposition bei 6 Monaten nach der Immunisierung serumnegativ waren, weist darauf hin, dass Immunität, die durch etwas anderes als Serumantikörper vermittelt wird, von primärer Wichtigkeit bei der Fähigkeit dieses Impfstoffs sein mag, messbaren und dauerhaften Schutz beizutragen.
Beispiel 9
Dieses Beispiel offenbart eine Tierstudie, um die Fähigkeit einer therapeutischen Zusammensetzung, die kälteadaptiertes Pferdeinfluenzavirus EIV-P821 aufweist, bei der Verhinderung von Krankheit nach der Aussetzung gegenüber einem heterologen Stamm von Pferdeinfluenzavirus zu helfen, auszuwerten.
Der getestete heterologe Stamm war A/Equine/2/Saskatoon/90, genetisch beschrieben als ein eurasischer Stamm (erhalten von Hugh Townsend, University of Saskatchewan). Zwanzig (zum Zeitpunkt der Impfung) ungefähr 15 Monate alte weibliche Percheron-Pferde wurden für die Wirksamkeitsstudie verwendet. Die Pferde wurden zwei Gruppen zugeordnet, einer Gruppe von 10, die zu impfen waren, und einer andere Gruppe von 10, die als nicht geimpfte Kontrolle dienten. Am Tag 0 wurde die Impfgruppe in der in Beispiel 8 beschriebenen Weise geimpft.
Das Expositionsmaterial, d. h. Pferdeinfluenzastamm A/Equine/2/Saskatoon/90 [H3N8] wurde ähnlich der Präparation in Beispiel 8 präpariert. Die Geimpften und Kontrollen wurden zufällig 4 Expositionsgruppen von jeweils 5 Pferden zugeordnet, so dass jede Expositionsgruppe eine Mischung von 2 Geimpften und drei Kontrollen oder umgekehrt enthielt. Die Expositionsprozedur war ähnlich derjenigen, die in Beispiel 8 beschrieben ist. Die Expositionen wurden am Tag 28 nach der Impfung durchgeführt.
Klinische Beobachtungen wurden für die Geimpften und Kontrollen am Tag –4 und an den Tagen 0 (vor der Impfung und bis zu 4 Stunden nach der Impfung), 1 bis 7, 12, 15 bis 17, 19 bis 23, 25 bis 38 und 42 der Studie durchgeführt. Für Tage, an denen klinische Beobachtungen während der Tage –4 bis 42 durchgeführt wurden, wurden klinische Beobachtungen einschließlich Rektaltemperatur gemäß der Beurteilung des beigezogenen Tierarztes für jedes einzelne Pferd mit abnormaler klinischer Erscheinung aufgezeichnet. Die Pferde wurden unter Verwendung derselben Kriterien wie in Beispiel 8 (Tabelle 15) bewertet. Untersuchungen aus der Entfernung wurden an diesen Tagen durchgeführt, wie in Beispiel 8 beschrieben ist. Am Tag 20 und von den Tagen 25 bis 38 wurden die Pferde auch sowohl durch entfernte als auch individuelle Untersuchungen (ebenfalls durchgeführt wie in Beispiel 8 beschrieben) beobachtet.

Die Rektaltemperaturen wurden täglich beginnend 3 Tage vor der Exposition gemessen, und fortgesetzt bis 10 Tage nach der Exposition. Tag 0 ist der Tag relativ zu der Exposition. Daten von Tagen 0 bis 10 wurden in die Analyse einbezogen. Statistische Verfahren und Kriterien waren identisch mit denjenigen, die in Beispiel 8 angewendet wurden. An den Tagen 2, 5 und 7 wiesen geimpfte Pferde statistisch signifikant niedrigere Körpertemperaturen als die nicht geimpften Kontrollpferde auf (Tabelle 20). TABELLE 20: Auswirkung der Exposition auf die täglichen Temperaturen (°C) bei geimpften und Kontrollpferden (Mittelwerte mit kleinstem quadratischen Fehler).

Tage nach der Exposition	geimpft (n = 10)	nicht geimpft (n = 10)	P-Wert
0	99,9	99,8	0,9098
1	100,5	100,3	0,4282
2	101,0	102,8	0,0001
3	100,7	100,6	0,7554
4	101,0	101,3	0,4119
5	100,8	102,1	0,0004
6	100,4	100,4	0,9774
7	100,3	101,1	0,0325
8	100,6	100,7	0,8651
9	100,5	100,6	0,8874
10	100,5	100,1	0,2465

Standardabweichung des Mittelwerts = 0,249.

Daten von den Tagen 1 bis 10 nach der Exposition wurden in die Analyse einbezogen. Diese Bewertungen wurden an jedem Tag für jedes Pferd aufsummiert, und die Geimpften und Kontrollen wurden unter Verwendung des Wilcoxon-Rangsummentests verglichen. Alle statistischen Verfahren wurden durch geführt, wie in Beispiel 9 beschrieben ist. Zusätzlich wurden die Bewertungen über alle Tage für jedes Pferd aufsummiert und in derselben Weise verglichen. Die mittleren Ränge sind in Tabelle 21 gezeigt. TABELLE 21: Auswirkung der Exposition auf Bewertungen klinischer Anzeichen bei geimpften und Kontrollpferden (mittlerer Rang).

Tage nach der Exposition	geimpft (n = 10)	nicht geimpft (n = 10)	P-Wert*
1	8,85	12,15	0,1741
2	8,80	12,20	0,1932
3	8,90	12,10	0,2027
4	7,60	13,40	0,0225
5	6,90	14,10	0,0053
6	7,00	14,00	0,0059
7	6,90	14,10	0,0053
8	7,60	13,40	0,0251
9	6,90	14,10	0,0048
10	6,10	14,90	0,0006
Gesamt über 10 Tage	5,70	15,30	0,0003

*Durch Wilcoxon 2-Stichprobentest.

Am Tag 4 nach der Exposition war der mittlere Rang der Bewertungen bei den geimpften Pferden niedriger (P < 0,05) als bei den nicht geimpften Kontrollpferden, und dieser Effekt setzte ich für den Rest der Studie fort (P < 0,05). Der kumulative Rang über den gesamten Testzeitraum war bei den geimpften Pferden ebenfalls niedriger als bei den nicht geimpften Kontrollen (P < 0 05).
Nasopharyngealabstriche wurden an den Tagen 1 und 8 nach der Exposition gemacht, wie in Beispiel 3 beschrieben ist. Die Nasalproben wurden auf die Anwesenheit von Virus durch Zellbeimpfung mit Virusdetektion durch cytopathogenen Effekt (CPE) oder durch Eibeimpfung mit Virusdetektion durch Hämagglutination (HA) analysiert. Der Zellkulturtest wurde durchgeführt, wie allgemein durch Youngner et al., 1994, J. Clin. Microbiol., 32, 750-754, beschrieben ist. Seriell verdünnte Nasalproben wurden in die Löcher gegeben, die Monolagen von Madin Darby Canine Kidney-(MDCK-)Zellen enthielten. Nach Inkubation wurden die Löcher auf die Anwesenheit und das Ausmaß des cytopathogenen Effekts untersucht. Die Menge an Virus in TCID₅₀-Einheiten wurde durch die Reed-Muench-Technik berechnet. Der Eiinfektiositätstest wurde durchgeführt, wie in Beispiel 1 beschrieben ist. Der Prozentsatz an Pferden, die Expositionsvirus ausscheiden, ist für jeden Test in jeder Gruppe in den Tabellen 22 und 23 gezeigt. Der Prozentsatz an Pferden, die Expositionsvirus ausscheiden, war an den Tagen 2 bis 7 nach der Aussetzung bei beiden Verfahren bei der geimpften Gruppe niedriger (P < 0,05). Keine Unterschiede wurden an den Tagen 1 oder 8 nach der Exposition gesehen.
Die Anzahl an Tagen, an denen das Expositionsvirus ausgeschieden wurde, war in der geimpften Gruppe verglichen mit den nicht geimpften Kontrollen ebenfalls niedriger (P < 0,05); siehe Tabellen 22 und 23. TABELLE 22: Prozentsatz der Pferde, die nach der Exposition Virus ausscheiden – Zellkulturtest.

Tage nach der Exposition geimpft (n = 10) nicht geimpft (n = 10)

1 0 0

2 0 70*

3 0 70*

4 20 100*

5 10 100*

6 20 100*

7 0 80*

8 0 30

mittlere Anzahl der Ausscheidungstage 0,5 5,5

*Bei einem Zeitpunkt unterschieden sich dei geimpften von den nicht geimpften P < 0, entweder durch Fisher's Exakttest (Prozentdaten) oder den Wilcoxon 2-Stichprobentest (Tage der Ausscheidung).

Tage nach der Exposition	geimpft (n = 10)	nicht geimpft (n = 10)
1	0	0
2	0	70*
3	10	70*
4	0	90*
5	10	70*
6	20	90*
7	0	50*
8	0	0
mittlere Anzahl der Ausscheidungstage	0,4	4,4

Das Ausmaß (Ernsthaftigkeit und Dauer) der klinischen Anzeichen von Influenza unter den Geimpften war relativ zu den Kontrollen wesentlich reduziert. Die Bewertungen der für Influenza relevanten klinischen Anzeichen und die objektiven Temperaturmesswerte zeigten eine statistisch signifikante Reduktion bei der Gruppe der Geimpften, wenn sie mit jenen der Kontrollgruppe verglichen wurden; was darauf hinweist, dass der Impfstoff signifikanten Schutz vor Krankheit durch heterologe Stämme verleiht.
Die Fähigkeit von Pferden, Influenzavirus nach der Exposition auszuscheiden, war ebenfalls sowohl im Fall von Pferden positiv für das Ausscheiden an bestimmten Tagen nach der Exposition als auch bezüglich der mittleren Anzahl von Tagen des Ausscheidens pro Pferd bei Geimpften verglichen mit Kontrollen signifikant reduziert. Das reduzierte Ausscheiden von Geimpften ist insoweit wichtig, als dass es bei einem Ausbrechen von Influenza dazu dienen sollte, das Potential der Aussetzung von empfänglichen Tieren gegenüber Wildtypvirus zu reduzieren.
Ingesamt zeigen die Resultate dieser Studie, dass der Impfstoff Schutz gegen eine heterologe Exposition durch ein Mitglied der eurasischen Linie der Pferdeinfluenzavirusstämme verleiht.
Beispiel 10
Dieses Beispiel offenbart eine Tierstudie, um die Fähigkeit einer therapeutischen Zusammensetzung, die kälteadaptiertes Pferdeinfluenzavirus EIV-P821 aufweist, bei der Prävention von Krankheit nach Aussetzung gegenüber einem heterologen Stamm von Pferdeinfluenzavirus zu helfen, auszwerten.
Der getestete heterologe Stamm war A/Equine/2/Kentucky/98 [H3N8] (erhalten von Tom Chambers, University of Kentucky). Acht Ponys im Alter von 5 bis 7 Monaten wurden für diese Wirksamkeitsstudie verwendet. Die Pferde wurden zwei Gruppen zugeordnet, einer Gruppe von 4, die zu impfen waren, und einer anderen Gruppe von 4, die als nicht geimpfte Kontrollen dienten. Die Ponys wurden am Tag 0 geimpft, wie in Beispiel 8 beschrieben ist.
Klinische Beobachtungen wurden für die Geimpften am Tag 0 der Studie (vor der Impfung und 4 Stunden nach der Impfung) sowie an den Tagen 1 bis 8, 23, 30 bis 50 und 57 nach der Impfung durchgeführt. Die Kontrollen wurden klinisch an den Tagen 29 bis 50 und 57 beobachtet. Die Beobachtungen wurden so wie in Beispiel 8 beschrieben durchgeführt und bewertet.
Das Expositionsmaterial, d. h. Pferdeinfluenzastamm aus Kentucky/98, wurde durch zwei Passagen des isolierten Virus in Eiern präpariert. Das Inoculum für jedes Pferd wurde durch Auftauen von 0,5 ml des Virus, dann Verdünnen in 4,5 ml steriler Phosphat-gepufferter Salzlösung präpariert. Das Inoculum wurde durch Vernebelung unter Verwendung einer Maske für jedes individuelle Pferd am Tag 36 nach der Impfung verabreicht.

Die Bewertungen der klinischen Beobachtung wurden an jedem Tag für jedes Pferd aufsummiert, und die Pferde wurden gemäß der kumulativen Gesamtbewertung von den Tagen 1 bis 9 nach der Exposition dem Rang nach geordnet. Diese Resultate sind in Tabelle 24 gezeigt. TABELLE 24: Beobachtungen klinischer Anzeichen: Gesamtbewertungen, sortiert nach der Gesamtbewertung.

Gruppe	Halfteridentität	Gesamtbewertung⁺⁺ Tage 1 bis 9 nach Exposition
1-geimpft	50	0
1-geimpft	52	0
1-geimpft	55	1
1-geimpft	15	2
2-Kontrolle	61	21
2-Kontrolle	20	25
2-Kontrolle	7	26
2-Kontrolle	13	26

⁺⁺Gesamtbewertungen geben die Summe der täglichen Bewertungen (wobei die täglichen Bewertungen gleich der Summe der Bewertungen für Husten, Nasenausfluss, Atmung und Depression sind) wieder und sind von den niedrigsten (am wenigsten ernsten) bis zu den höchsten (ernsthaftigsten) Bewertungen sortiert.

Die Resultate aus Tabelle 24 zeigen, dass die Bewertungen der Geimpften zwischen 0 und 2 lagen, was signifikant niedriger als die Bewertungen der Kontrollen war, die zwischen 21 und 26 lagen.

Rektaltemperaturen wurden täglich beginnend 6 Tage vor der Exposition gemessen und fortlaufend bis 9 Tage nach der Exposition. Tag 0 ist der Tag relativ zu der Exposition. Daten von den Tagen 0 bis 9 wurden in die Analyse einbezogen. Diese Resultate sind in Tabelle 25 gezeigt. TABELLE 25: Effekt der Exposition auf die tägliche mittlere Temperatur (°C) bei geimpften und Kontrollpferden.

Tage nach der Exposition	Kontrolle	Geimpft	Unterschied
0	99,7	99,5	0,2
1	100,0	99,6	0,4
2	103,9	100,2	3,7
3	99,8	99,2	0,6
4	99,6	99,1	0,5
5	99,8	99,3	0,5
6	99,6	99,3	0,3
7	99,3	99,0	0,3
8	99,7	99,6	0,1
9	99,5	99,1	0,4

Die Temperaturen der Kontrollpferde waren an allen Tagen höher als die Temperaturen der geimpften Pferde. Die Temperatur bei den Kontrollpferden war am Tag 2 signifikant höher.

Nasopharyngeale Abstriche wurden an den Tagen 1 und 8 nach der Exposition wie in Beispiel 3 beschrieben gemacht. Diese Proben wurden durch einen Eierinfektiositätstest auf ausgeschiedenes Virus getestet, wie in Beispiel 1 beschrieben ist. Die Resultate des Tests sind in Tabelle 26 gezeigt. TABELLE 26: Virusausscheidung nach Exposition detektiert durch Eierinfektiosität.

Tag der Studie		35	37	38	39	40	41	42	43	44
Tage nach der Exposition		-1	1	2	3	4	5	6	7	8
Gruppe	Identität Nr.	Detektion des Virus*									Anzahl der Tage positiv pro Pferd
Geimpfte	15	0	2	0	3	3	0	2	1	0	5
	50	0	0	0	0	0	1	0	0	0	1
	52	0	0	3	3	2	2	0	0	0	4
	55	0	2	3	1	3	0	0	0	0	4
Anzahl der positiven Pferde pro Tag		0	2	2	3	3	2	1	1	0
Kontrollen	07	0	3	3	3	3	3	3	1	0	7
	13	0	3	3	3	3	3	3	1	0	7
	20	0	2	3	3	3	3	3	1	0	7
	61	0	3	3	3	3	3	3	2	0	7
Anzahl der positiven Pferde pro Tag		0	4	4	4	4	4	4	4	0

*Die Werte beziehen sich die Anzahl an Eiern, die von 3 pro Probe getesteten positiv geteste wurden. Für die statistische Analyse wurde eine Probe als positiv für Virus betrachtet, wenn mindestens 1 Ei pro Probe positiv war.

Die Resultate aus Tabelle 26 zeigen, dass die Anzahl der Pferde, die pro Tag positiv waren, für die Kontrollen höher war als für die Geimpften. Zusätzlich waren die Kontrollpferde für mehr Tage positiv als die geimpften.
Die Bewertungen von klinischen Anzeichen, die für Influenza relevant sind, und die objektiven Temperaturmessungen zeigten beide signifikante Unterschiede bei der Gruppe der Geimpften, wenn sie mit der Kontrollgruppe verglichen wurden; dies zeigt, dass der Impfstoff signifikanten Schutz vor Krankheit verursacht durch den heterologen Stamm Kentucky/98 verleiht.
Die Fähigkeit der Pferde, Influenzavirus nach der Exposition auszuscheiden, wurde auch bei den Geimpften gegenüber den Kontrollen bei dem Mittelwert der Tage des Ausscheidens pro Pferd reduziert. Dieses reduzierte Ausscheiden durch Geimpfte ist dahingehend wichtig, dass es bei einem Ausbrechen von Influenza dazu dienen sollte, das Potential der Aussetzung von empfänglichen Tieren gegenüber dem Wildtypvirus zu reduzieren.
Insgesamt zeigen die Resultate dieser Studie, dass der Impfstoff sicher Schutz vor einer heterologen Exposition gegenüber einem aktuellen und klinisch relevanten Isolat verleiht. Wenn die Resultate dieser Studie im Licht des zuvor demonstrierten Schutzes vor heterologer Exposition gegenüber einem eurasischen Stamm (Beispiel 9) betrachtet werden, gibt es einen klaren Hinweis auf die Stützung der Behauptung, dass dieser modifizierte lebende Impfstoff Schutz vor heterologer sowie homologer Pferdeinfluenzainfektion verleihen kann.
Beispiel 11
Dieses Beispiel beschreibt das Klonieren und Sequenzieren von Pferdeinfluenza M-(Matrix-)Proteinsäuremolekülen für Pferdeinfluenzaviren vom Wildtyp und kälteadaptierte Pferdeinfluenzaviren.

A. Nukleinsäuremoleküle, die Pferdeinfluenzavirus M-Protein vom Wildtyp oder kälteadaptiertes Pferdeinfluenzavirus M-Protein kodieren, wurden wie folgt erzeugt. Ein PKR-Produkt, das ein Pferde M-Gen enthielt, wurde durch PKR-Verstärkung von Pferdeinfluenzavirus-DNS und Primern w584 und w585, die durch SEQ ID NO:26 beziehungsweise SEQ ID NO:27 bezeichnet werden, erzeugt. Ein als nei_wtM₁₀₂₃ bezeichnetes Nukleinsäuremolekül von 1023 Nukleotiden, wobei ein kodierender Strang eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die durch SEQ ID NO:1 bezeichnet wird, wurde durch weitere PKR-Verstärkung unter Verwendung des oben beschriebenen PKR-Produkts als Matrize und Klonieren in pCR2.1^®TA-Kloniervektor, erhältlich von Invitrogen, Carlsbad, CA, unter Anwendung von durch den Hersteller empfohlenen Standardprozeduren erzeugt. Die verwendeten Primer waren der T7-Primer, bezeichnet durch SEQ ID NO:29, und der REV-Primer, bezeichnet durch SEQ ID NO:28. Plasmid-DNS wurde unter Verwendung eines Mini-Prep-Verfahrens, erhältlich von Qiagen, Valencia, CA, gereinigt. PKR-Produkte wurden für das Sequenzieren unter Verwendung eines PRISM^TM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit, eines PRISM^TM dRhodamine Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit oder eines PRISM^TM Big Dye^TM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit, alle erhältlich von PE Applied Biosystems, Forster City, CA, präpariert, wobei dem Protokoll des Herstellers gefolgt wurde. Die speziellen PKR-Bedingungen, die bei diesem Kit verwendet wurden, waren eine steile Rampe auf 95°C, Halten für 10 Sekunden, gefolgt von einer steilen Rampe auf 50°C mit einem 5 Sekunden Halt, dann eine steile Rampe auf 60°C mit einem Halt für 4 Minuten, Wiederholung für 25 Zyklen. Unterschiedliche Sätze von Primern wurden in verschiedenen Reaktionen verwendet: T7 und REV wurden in einer Reaktion verwendet; w584 und w585 wurden in einer zweiten Reaktion verwendet, und efM-a1, bezeichnet durch SEQ ID NO:31, und efM-s1, bezeichnet durch SEQ ID NO:30, wurden in einer dritten Reaktion verwendet. PKR-Produkte wurden durch Ethanol-/Magnesiumchloridpräzipitation gereinigt. Automatisiertes Sequenzieren von DNS-Proben wurde unter Verwendung eines ABI PRISM^TM Modell 377 mit XL Upgrade DNS Sequenzierer, erhältlich von PE Applied Biosystems, durchgeführt.

Die Translation von SEQ ID NO:1 weist darauf hin, dass das Nukleinsäuremolekül nei_wtM₁₀₂₃ ein Pferdeinfluenza M-Protein voller Länge von ungefähr 252 Aminosäuren kodiert, das hier als Pei_wtM₂₅₂ bezeichnet wird und die Aminosäuresequenz SEQ ID NO:2 aufweist, unter Annahme eines offenen Leserahmens, bei dem sich das Initiierungskodon von Nukleotid 25 bis zu Nukleotid 28 von SEQ ID NO:1 erstreckt und sich das Terminierungskodon von Nukleotid 781 bis zu Nukleotid 783 in SEQ ID NO:1 erstreckt. Die Region, die Pei_wtM₂₅₂ kodiert, die nei_wtM₇₅₆ bezeichnet wird und die einen kodierenden Strang aufweist, der die Nukleotide 25 bis 780 von SEQ ID NO:1 aufweist, wird durch SEQ ID NO:3 wiedergegeben.
SEQ ID NO:1 und SEQ ID NO:3 geben die Konsenssequenz wieder, die von zwei Wildtypnukleinsäuremolekülen erhalten wurde, welche sich in einem Nukleotid unterscheiden. Das Nukleotid 663 von nei_wt1M₁₀₂₃, d. h. das Nukleotid 649 von nei_wt1M₇₅₆, war Adenin, während das Nukleotid 663 von nei_wt2M₁₀₂₃, d. h. das Nukleotid 649 von nei_wt2M₇₅₆, Guanin war. Translation dieser Sequenzen resultiert nicht in eine Aminosäureänderung bei der entsprechenden Aminosäure; beide werden bei dem Rest 221 bei Pei_wtM₂₅₂ in Valin übersetzt.

B. Ein Nukleinsäuremolekül von 1023 Nukleotiden, das ein nei_ca1M₁₀₂₃ bezeichnetes kälteadaptiertes Pferdeinfluenzavirus-M kodiert, wobei ein kodierender Strang eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die durch SEQ ID NO:4 bezeichnet wird, wurde durch weitere PKR-Verstärkung erzeugt und in den pCR^®-Blunt-Kloniervektor, erhältlich von Invitrogen, unter Anwendung von vom Hersteller empfohlenen Bedingungen und Primern T7 und REV kloniert. Plasmid-DNS-Reinigung und zyklisches Sequenzieren wurden durchgeführt, wie in Beispiel 11, Teil A beschrieben ist. Translation von SEQ ID NO:4 weist darauf hin, dass das Nukleinsäuremolekül nei_ca1M₁₀₂₃ ein Pferdeinfluenza M-Protein von ungefähr 252 Aminosäuren kodiert, das hier als Pei_ca1M₂₅₂ bezeichnet wird und eine Aminosäuresequenz SEQ ID NO:5 aufweist, unter der Annahme eines offenen Leserahmens, bei dem sich das Initiierungskodon von Nukleotid 25 bis zu Nukleotid 28 von SEQ ID NO:4 erstreckt und bei dem sich das Terminierungskodons von Nukleotid 781 bis zu Nukleotid 783 von SEQ ID NO:4 erstreckt. Die Region, die Pei_ca1M₂₅₂ kodiert, als nei_ca1M₇₅₆ bezeichnet wird und einen kodierenden Strang aufweist, der die Nukleotide 25 bis 780 von SEQ ID NO:4 aufweist, wird durch SEQ ID NO:6 wiedergegeben. PKR-Verstärkung eines zweiten Nukleinsäuremoleküls, das ein kälteadaptiertes Pferdeinfluenza M-Protein in derselben Weise kodiert, resultierte in Moleküle nei_ca2M₁₀₂₃ identisch mit nei_ca1M₁₀₂₃ und nei_ca2M₇₅₆ identisch mit nei_ca1M₇₅₆.
C. Vergleich der Nukleinsäuresequenzen der kodierenden Stränge von nei_wtM₁₀₂₃ (SEQ ID NO:1) und nei_ca1M₁₀₂₃ (SEQ ID NO:4) durch DNS-Ausrichtung ergibt die folgenden Unterschiede: eine G zu T Verschiebung bei Base 67, eine C zu T Verschiebung bei Base 527 und eine G zu C Verschiebung bei Base 868. Vergleich der Aminosäuresequenzen der Proteine Pei_wtM₂₅₂ (SEQ ID NO:2) und Pei_ca1M₂₅₂ (SEQ ID NO:5) ergibt die folgenden Unterschiede: eine V zu L Verschiebung bei Aminosäure 23 bezüglich der G zu T Verschiebung bei Base 67 bei den DNS-Sequenzen; und eine T zu I Verschiebung bei Aminosäure 187 bezüglich der C zu T Verschiebung bei Base 527 bei den DNS-Sequenzen.

Beispiel 12
Dieses Beispiel beschreibt das Klonieren und Sequenzieren von Pferdeinfluenza HA-(Hämagglutinin-)Proteinnukleinsäuremolekülen für Pferdeinfluenzaviren vom Wildtyp oder kälteadaptierte Pferdeinfluenzaviren.

A. Nukleinsäuremoleküle, die Pferdeinfluenzavirus HA-Proteine vom Wildtyp oder kälteadaptierte Pferdeinfluenzavirus HA-Proteine kodieren, wurden wie folgt erzeugt. Ein PKR-Produkt, das ein Pferde HA-Gen enthielt, wurde durch PKR-Verstärkung von Pferdeinfluenzavirus-DNS und Primern w578 und w578, bezeichnet durch SEQ ID NO:32 beziehungsweise SEQ ID NO:33, erzeugt. Ein Nukleinsäuremolekül von 1762 Nukleotiden, das ein als nei_wtHA₁₇₆₂ bezeichnetes HA-Protein vom Wildtyp kodierte, wobei ein kodierender Strang eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die durch SEQ ID NO:7 bezeichnet wird, wurde durch weitere PKR-Verstärkung unter Verwendung des oben beschriebenen PKR-Produkts als Matrize erzeugt und in pCR2.1^®TA-Kloniervektor kloniert, wie in Beispiel 11A beschrieben ist. Plasmid-DNS wurde wie in Beispiel 11A gereinigt und sequenziert, außer dass die in den Sequenzierkits verwendeten Primer entweder T7 und REV in einem Fall oder HA-I, bezeichnet durch SEQ ID NO:34, und HA-2, bezeichnet durch SEQ ID NO:35, in einem zweiten Fall waren.

Translation von SEQ ID NO:7 weist darauf hin, dass das Nukleinsäuremolekül nei_wtHA₁₇₆₂ ein Pferdeinfluenza HA-Protein voller Länge von ungefähr 565 Aminosäuren kodiert, das hier als Pei_wtHA₅₆₅ bezeichnet wird und eine Aminosäuresequenz SEQ ID NO:8 aufweist, unter Annahme eines offenen Leserahmens, bei dem sich das Initiierungskodon von Nukleotid 30 bis zu Nukleotid 33 von SEQ ID NO:7 erstreckt und sich das Teminierungskodon von Nukleotid 1725 bis zu Nukleotid 1727 von SEQ ID NO:7 erstreckt. Die Region, die Pei_wtHA₅₆₅ kodiert, die als nei_wtHA₁₆₉₅ bezeichnet wird und einen kodierenden Strang mit den Nukleotiden 30 bis 1724 von SEQ ID NO:7 aufweist, wird durch SEQ ID NO:9 wiedergegeben.

B. Ein Nukleinsäuremolekül von 1762 Nukleotiden, das ein als nei_ca1HA₁₇₆₂ bezeichnetes kälteadaptiertes Pferdeinfluenzavirus HA-Protein kodiert, wobei ein kodierender Strang eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die durch SEQ ID NO:10 bezeichnet wird, wurde wie in Beispiel 11B beschrieben erzeugt. Plasmid-DNS-Reinigung und zyklisches Sequenzieren wurden durchgeführt, wie in Beispiel 12, Teil A beschrieben ist.

Translation von SEQ ID NO:10 weist darauf hin, dass das Nukleinsäuremolekül nei_ca1HA₁₇₆₂ ein Pferdeinfluenza HA-Protein voller Länge von ungefähr 565 Aminosäuren kodiert, das hier als Pei_ca1HA₅₆₅ bezeichnet wird und eine Aminosäuresequenz SEQ ID NO:1 aufweist, unter der Annahme eines offenen Leserahmens, bei dem sich das Initiierungskodon von Nukleotid 30 bis zu Nukleotid 33 von SEQ ID NO:10 erstreckt und sich das Terminierungskodon von Nukleotid 1725 bis zu Nukleotid 1727 von SEQ ID NO:10 erstreckt. Die Region, die Pei_ca1HA₅₆₅ kodiert, als nei_ca1HA₁₆₉₅ bezeichnet wird und einen kodierenden Strang mit den Nukleotiden 30 bis 1724 von SEQ ID NO:10 aufweist, wird durch SEQ ID NO:12 wiedergegeben.
PKR-Verstärkung eines zweiten Nukleinsäuremoleküls, das ein kälteadaptiertes Pferdeinfluenza HA-Protein kodiert, in derselben Weise resultierte in Moleküle nei_ca2HA₁₇₆₂m identisch mit nei_ca1HA₁₇₆₂ und nei_ca2HA₁₆₉₅ identisch mit nei_ca1HA₁₆₉₅.

C. Vergleich der Nukleinsäuresequenzen des kodierenden Strangs von nei_wtHA₁₇₆₂ (SEQ ID NO:7) und nei_ca1HA₁₇₆₂ (SEQ ID NO:10) durch DNS-Ausrichtung ergibt die folgenden Unterschiede: eine C zu T Verschiebung bei Base 55, eine G zu A Verschiebung bei Base 499, eine G zu A Verschiebung bei Base 671, eine C zu T Verschiebung bei Base 738, eine T zu C Verschiebung bei Base 805, eine G zu A Verschiebung bei Base 1289 und eine A zu G Verschiebung bei Base 1368. Vergleich der Aminosäuresequenzen der Proteine Pei_wtHA₅₆₆ (SEQ ID NO:8) und Pei_ca1HA₆₆₅ (SEQ ID NO:11) ergibt die folgenden Unterschiede: eine P zu L Verschiebung bei Aminosäuresäure 18 bezüglich der C zu T Verschiebung bei Base 55 bei der DNS-Sequenz; eine G zu E Verschiebung bei Aminosäure 166 bezüglich der G zu A Verschiebung bei Base 499 bei der DNS-Sequenz; eine R zu W Verschiebung bei Aminosäure 246 bezüglich der C zu T Verschiebung bei Base 738 bei der DNS-Sequenz; eine M zu T Verschiebung bei Aminosäure 268 bezüglich der T zu T Verschiebung bei Base 805 bei der DNS-Sequenz; eine K zu E Verschiebung bei Aminosäure 456 bezüglich der A zu G Verschiebung bei Base 1368 bei der DNS-Sequenz. Es gibt weder eine Änderung des Serins (S) bei Rest 223 bezüglich der G zu A Verschiebung bei Base 671 bei der DNS-Sequenz, noch gibt es eine Änderung des Arginins^® bei Rest 429 bezüglich der G zu A Verschiebung bei Base 1289 bei der DNS-Sequenz.

Beispiel 13
Dieses Beispiel beschreibt das Klonieren und Sequenzieren von Pferdeinfluenza PB2-Protein-(RNS-gerichteten RNS-Polymerase-)Nukleinsäuremolekülen entsprechend dem N-terminalen Bereich des Proteins für Pferdeinfluenzaviren vom Wildtyp oder kälteadaptierte Pferdeinfluenzaviren.

A. Nukleinsäuremoleküle, die Pferdeinfluenzavirus PB2-N-Proteine vom Wildtyp oder kälteadaptierte Pferdeinfluenzavirus PB2-N-Proteine kodieren, wurden wie folgt erzeugt. Ein PKR-Produkt, das einen N-terminalen Bereich des Pferde-PB2-Gens enthielt, wurde durch PKR-Verstärkung von Pferdeinfluenzavirus-DNS und Primern w570 und w571, bezeichnet durch SEQ ID NO:36 beziehungsweise SEQ ID NO:37, erzeugt. Ein Nukleinsäuremolekül von 1241 Nukleotiden, das ein als nei_wtPB2-N₁₂₄₁ bezeichnetes PB2-N-Protein vom Wildtyp kodiert, wobei ein kodierender Strang eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die durch SEQ ID NO:13 bezeichnet wird, wurde durch weitere PKR-Verstärkung unter Verwendung des oben beschriebenen PKR-Produkts als Matrize erzeugt und kloniert, wie in Beispiel 11B beschrieben ist. Plasmid-DNS wurde gereinigt und sequenziert, wie in Beispiel 11B beschrieben ist, außer dass in den Sequenzierkits nur T7- und REV-Primer verwendet wurden.

Translation von SEQ ID NO:13 weist darauf hin, dass das Nukleinsäuremolekül nei_wtPB2-N₁₂₄₁ einen N-terminalen Bereich von Influenza PB2-Protein von ungefähr 404 Aminosäuren kodiert, der hier als P_wtPB2-N₄₀₄ bezeichnet wird und die Aminosäursequenz SEQ ID NO:14 aufweist, unter der Annahme eines offenen Leserahmens, bei dem sich das Initiierungskodon von Nukleotid 28 zu Nukleotid 30 von SEQ ID NO:13 erstreckt und sich das letzte Kodon von Nukleotid 1237 zu Nukleotid 1239 erstreckt. Die Region, die P_wtPB2-N₄₀₄ kodiert, als nei_wtPB2-^N1214 bezeichnet wird und einen kodierenden Strang mit den Nukleotiden 28 bis 1239 von SEQ ID NO:13 aufweist, wird durch SEQ ID NO:15 wiedergegeben.

B. Ein Nukleinsäuremolekül von 1239 Nukleotiden, die einen als nei_ca1PB2-N₁₂₄₁ bezeichneten N-terminalen Bereich von kälteadaptiertem Pferdeinfluenzavirus PB2-N-Protein kodieren, wobei ein kodierender Strang eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die durch SEQ ID NO:16 bezeichnet wird, wurde erzeugt und sequenziert, wie in Beispiel 12, Teil A beschrieben ist.
Translation von SEQ ID NO:16 weist darauf hin, dass das Nukleinsäuremolekül nei_ca1PB2-N₁₂₄₁ einen N-terminalen Bereich von Pferdeinfluenza PB2-Protein von ungefähr 404 Aminosäuren kodiert, der hier als P_ca1PB2-N₄₀₄ bezeichnet wird und eine Aminosäuresequenz SEQ ID NO:17 aufweist, unter der Annahme eines offenen Leserahmens, bei dem sich das Initiierungskodon von Nukleotid 28 zu Nukeotid 30 von SEQ ID NO:16 erstreckt und sich das letzte Kodon von Nukleotid 1237 zu Nukleotid 1239 erstreckt. Die Region, die P_ca1PB2-N₄₀₄ kodiert, als nei_ca1PB2-^N1214 bezeichnet wird und einen kodierenden Strang mit den Nukleotiden 28 bis 1239 von SEQ ID NO:16 aufweist, wird durch SEQ ID NO:18 wiedergegeben.

PKR-Verstärkung eines zweiten Nukleinsäuremoleküls, das ein kälteadaptiertes Pferdeinfluenza PB2-N-Protein kodiert, in derselben Weise resultierte in Moleküle nei_ca2PB2-N₁₂₄₁ identisch mit nei_ca1PB2-N₁₂₄₁ und nei_ca2PB2-N₁₂₁₄ identisch mit nei_ca1PB2-N₁₂₁₄. C. Vergleich der Nukleinsäuresequenzen der kodierenden Stränge von nei_wtPB2-N₁₂₄₁ (SEQ ID NO:13) und nei_ca1PB2-N₁₂₄₁ (SEQ ID NO:16) durch DNS-Ausrichtung ergibt die folgenden Unterschiede: eine T zu C Basenverschiebung bei Base 370. Vergleich der Aminosäuresequenzen von Protein P_wtPB2-N₄₀₄ (SEQ ID NO:14) und P_ca1PB2-N₄₀₄ (SEQ ID NO:17) ergibt den folgenden Unterschied: eine Y zu H Verschiebung bei Aminosäure 124 bezüglich der T zu C Verschiebung bei Base 370 bei der DNS-Sequenz.
Beispiel 14
Dieses Beispiel beschreibt das Klonieren und Sequenzieren von Pferdeinfluenza PB2-Protein-(RNS-gerichteten RNS-Polymerase-)Nukleinsäuremolekülen entsprechend dem C-terminalen Bereich des Proteins für Pferdeinfluenzaviren des Wildtyps oder kälteadaptierte Pferdeinfluenzaviren.

A. Nukleinsäuremoleküle, die Pferdeinfluenzavirus PB2-C-Proteine vom Wildtyp oder kälteadaptierte Pferdeinfluenzavirus PB2-C-Proteine kodieren, wurden wie folgt erzeugt. Ein PKR-Produkt, das den C-terminalen Bereich des Pferde-PB2-Gens enthielt, wurde durch PKR-Verstärkung unter Verwendung von Pferdeinfluenzavirus-DNS und Primern w572 und w573, bezeichnet durch SEQ ID NO:38 beziehungsweise SEQ ID NO:39, erzeugt. Ein Nukleinsäuremolekül von 1233 Nukleotiden, das ein als nei_wtPB2-C₁₂₃₃ bezeichnetes PB2-C-Protein vom Wildtyp kodiert, wobei ein kodierender Strang eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die durch SEQ ID NO:19 bezeichnet wird, wurde durch weitere PKR-Verstärkung unter Verwendung des oben beschriebenen PKR-Produkts als Matrize erzeugt und kloniert, wie in Beispiel 11B beschrieben ist. Plasmid-DNS wurde wie in Beispiel 11A gereinigt und sequenziert, außer dass unterschiedliche Primer bei den Sequenzierkits verwendet wurden. T7 und REV wurden in einem Fall verwendet; efPB2-a1, bezeichnet durch SEQ ID NO:40, und efPB2-s1, bezeichnet durch SEQ ID NO:41, wurden in einem anderen Fall verwendet, und efPB2-a2, bezeichnet durch SEQ ID NO:42, und efPB2-s2, bezeichnet durch SEQ ID NO:43, wurden in anderen Fällen verwendet.

Translation von SEQ ID NO:19 weist darauf hin, dass das Nukleinsäuremolekül nei_wt1PB2-C₁₂₃₃ einen C-terminalen Bereich von Influenza PB2-Protein von ungefähr 398 Aminosäuren kodiert, der hier als P_wtPB2-C₃₉₈ bezeichnet wird und die Aminosäuresequenz SEQ ID NO:20 aufweist, unter der Annahme eines offenen Leserahmens mit einem ersten Kodon, das sich von Nukleotid 3 zu Nukleotid 5 erstreckt, und eines Terminierungskodons, das sich von Nukleotid 1197 zu Nukleotid 1199 von SEQ ID NO:19 erstreckt. Weil SEQ ID NO:19 nur eine Genteilsequenz ist, enthält sie kein Initierungskodon. Die Region, die P_wtPB2-C₃₉₈ kodiert, als nei_wtPB2-C₁₉₄ bezeichnet wird und einen kodierenden Strang mit den Nukleotiden 3 bis 1196 von SEQ ID NO:19 aufweist, wird durch SEQ ID NO:21 wiedergegeben.
PKR-Verstärkung eines zweiten Nukleinsäuremoleküls, das ein Pferdeinfluenza PB2-N-Protein vom Wildtyp kodiert, in derselben Weise resultierte in ein als nei_wt2PB2-N₁₂₃₂ bezeichnetes Nukleinsäuremolekül von 1232 Nukleotiden, das als nei_wt2PB2-N₁₂₃₂ bezeichnet wird, mit einem kodierenden Strang mit einer durch SEQ ID NO:22 bezeichneten Sequenz. nei_wt2PB2-N₁₂₃₂ ist identisch mit nei_wt1PB2-C₁₂₃₂, außer dass nei_wt2PB2-N₁₂₃₂ ein Nukleotid an dem 5'-Ende fehlt. Translation von SEQ ID NO:22 weist darauf hin, dass das Nukleinsäuremolekül nei_wt1PB2-C₁₂₃₂ auch P_wtPB2-C₃₉₈ (SEQ ID NO:20) kodiert, unter Annahme eines offenen Leserahmens mit einem ersten Kodon, das sich von Nukleotid 2 zu Nukleotid 4 erstreckt, und eines Terminierungskodons, das sich von Nukleotid 1196 zu Nukleotid 1198 von SEQ ID NO:22 erstreckt. Weil SEQ ID NO:22 nur eine Genteilsequenz ist, enthält sie kein Initiierungskodon. Das Nukleinsäuremolekül, das einen kodierenden Strang mit den Nukleotiden 2 bis 1195 von SEQ ID NO:22 aufweist und als nei_wt2PB2-C₁₁₉₄ bezeichnet wird, ist identisch mit SEQ ID NO:21.

B. Ein Nukleinsäuremolekül von 1232 Nukleotiden, das einen C-terminalen Bereich des Influenza PB2 kälteadaptierten Pferdeinfluenzavirusproteins kodiert, der als nei_ca1PB2-C₁₂₃₂ bezeichnet wird und einen kodierenden Strang mit einer durch SEQ ID NO:23 bezeichneten Sequenz aufweist, wurde erzeugt, wie in Beispiel 14, Teil A beschrieben ist, außer dass der pCR^®-Blunt-Kloniervektor verwendet wurde.

Translation von SEQ ID NO:23 weist darauf hin, dass das Nukleinsäuremolekül nei_ca1PB2-C₁₂₃₂ einen C-terminalen Bereich von Pferdeinfluenza PB2-Protein von ungefähr 398 Aminosäuren kodiert, der hier als P_ca1PB2-C₃₉₈ bezeichnet wird und eine Aminosäuresequenz SEQ ID NO:24 aufweist, unter der Annahme eines offenen Leserahmens mit einem ersten Kodon, das sich von Nukeotid 2 zu Nukleotid 4 erstreckt, und eines Terminierungskodons, das sich von dem Nukleotid 1196 zu dem Nukleotid 1198 von SEQ ID NO:23 erstreckt. Weil SEQ ID NO:23 nur eine Genteilsequenz ist, enthält sie kein Initiierungskodon. Die Region, die P_ca1PB2-C₃₉₈ kodiert, nei_ca1PB2-C₁₁₉₄ bezeichnet wird und einen kodierenden Strang mit Nukleotiden 2 bis 1195 von SEQ ID NO:23 aufweist, wird durch SEQ ID NO:25 wiedergegeben.
PKR-Verstärkung eines zweiten Nukleinsäuremoleküls, das ein kälteadaptiertes Pferdeinfluenza PB2-C-Protein kodiert, in derselben Weise resultierte in Moleküle nei_ca2PB2-C₁₂₃₁, das ein Molekül weniger an dem 3'-Ende als nei_ca1PB2N₁₂₄₁ aufweist, und nei_ca2PB2-N₁₂₁₄ identisch mit nei_ca1PB2-N₁₂₁₄.

C. Vergleich der Nukleinsäuresequenzen der kodierenden Stränge von nei_wt1PB2-C₁₂₃₃ (SEQ ID NO:19) und nei_ca1PB2-C₁₂₃₂ (SEQ ID NO:23) durch DNS-Ausrichtung ergibt die folgenden Unterschiede: eine A zu C Basenverschiebung bei Base 153 von SEQ ID NO:19 und eine G zu A Basenverschiebung bei Base 929 von SEQ ID NO:19. Vergleich der Aminosäuresequenzen der Proteine P_wtPB2-C₃₉₈ (SEQ ID NO:20) und P_ca1PB2-C₃₉₈ (SEQ ID NO:24) ergibt die folgenden Unterschiede: eine K zu Q Verschiebung bei Aminosäure 51 bezüglich der A zu C Basenverschiebung bei der Base 153 bei der DNS-Sequenz. Es gibt keine Aminosäureverschiebung, die aus der G zu A Basenverschiebung bei Base 929 resultiert.

Während verschiedene Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung detailliert beschrieben worden sind, ist deutlich, dass dem Fachmann Modifikationen und Anpassungen dieser Ausführungsformen aufscheinen werden. Es ist jedoch ausdrücklich zu verstehen, dass solche Modifikationen und Adaptionen innerhalb des Bereichs der vorliegenden Erfindung liegen, wie er durch die folgenden Patentansprüche festgelegt ist.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Ein kälteadaptiertes Pferdeinfluenzavirus, das in embryonierten Hühnereiern bei einer Temperatur im Bereich von 26°C bis 30°C repliziert.
Reassortiertes Influenza A-Virus, das in embryonierten Hühnereiern bei einer Temperatur im Bereich von 26°C bis 30°C repliziert, wobei das reassortierte Virus (a) mindestens ein Genomsegment eines Spenderpferdeinfluenzavirus, das durch Kälteadaptierung erzeugt wurde, wobei das Pferdeinfluenzavirus einen identifizierenden Phänotyp aufweist, der aus der Gruppe ausgewählt ist, welche aus Kälteadaptierung, Temperaturempfindlichkeit, dominanter Interferenz und Attenuation besteht, wobei das Pferdeinfluenzavirusgenomsegment mindestens einen der identifizierenden Phänotypen zu dem reassortierten Virus beiträgt, und (b) mindestens ein Genomsegment eines Empfängerinfluenza A-Virus aufweist, das identifizierende Hämagglutinin- und Neuraminidasephänotypen aufweist.
Therapeutische Zusammensetzung, um ein Tier gegen eine Krankheit zu schützen, die durch ein Influenza A-Virus verursacht wird, die ein Virus aufweist, das aus der Gruppe ausgewählt ist, welche besteht aus: (a) einem kälteadaptierten Pferdeinfluenzavirus, das in embryonierten Hühnereiern bei einer Temperatur im Bereich von 26°C bis 30°C repliziert; und (b) einem reassortierten Influenza A-Virus, das in embryonierten Hühnereierzellen bei einer Temperatur im Bereich von ungefähr 26°C bis ungefähr 30°C repliziert, wobei das reassortierte Virus (1) mindestens ein Genomsegment eines Pferdeinfluenzavirus, das durch Kälteadaptierung erzeugt wurde, wobei das Pferdeinfluenzavirus einen identifizierenden Phänotyp aufweist, der aus der Gruppe ausgewählt ist, welche aus Kälteadaptierung, Temperaturempfindlichkeit, dominanter Inferferenz und Attenuation besteht, wobei das Pferdeinfluenzagenomsegment mindestens einen der identifizierenden Phänotypen zu dem reassortierten Virus beiträgt, und (2) mindestens ein Genomsegment eines Empfängerinfluenza A-Virus aufweist, das identifizierende Hämagglutinin- und Neuraminidasephänotypen aufweist.
Verwendung einer therapeutischen Zusammensetzung, die ein Virus aufweist, das aus der Gruppe ausgewählt ist, welche besteht aus: (a) einem kälteadaptierten Pferdeinfluenzavirus, das in embryonierten Hühnereiern bei einer Temperatur im Bereich von 26°C bis 30°C repliziert; und (b) einem reassortierten Influenza A-Virus, das in embryonierten Hühnereierzellen bei einer Temperatur im Bereich von 26°C bis 30°C repliziert, wobei das reassortierte Virus (1) mindestens ein Genomsegment eines Pferdeinfluenzavirus, das durch Kälteadaptierung erzeugt wurde, wobei das Pferdeinfluenzavirus einen identifizierenden Phänotyp aufweist, der aus der Gruppe ausgewählt ist, welche aus Kälteadaptierung, Temperaturempfindlichkeit, dominanter Inferferenz und Attenuation besteht, wobei das Pferdeinfluenzagenomsegment mindestens einen der identifizierenden Phänotypen zu dem reassortierten Virus beiträgt, und (2) mindestens ein Genomsegment eines Empfängerinfluenza A-Virus aufweist, das identifizierende Hämagglutinin- und Neuraminidasephänotypen aufweist, bei der Herstellung eines Medikaments zum Schützen eines Tiers gegen Krankheit, die durch Influenza A-Virus verursacht wird.
Verfahren zum Herstellen eines kälteadaptierten Pferdeinfluenzavirus, das in embryonierten Hühnereiern bei einer Temperatur von ungefähr 26°C bis ungefähr 30°C repliziert, das die Schritte aufweist: a) Kultivieren (Passaging) eines Pferdeinfluenzavirus vom Wildtyp; und b) Selektieren von Viren, die bei reduzierter Temperatur wachsen.
Verfahren, um ein reassortiertes Influenza A-Virus herzustellen, das in embryonierten Hühnereiern bei einer Temperatur im Bereich von 26°C bis 30°C repliziert, wobei das reassortierte Virus mindestens ein Genomsegment eines Pferdeinfluenzavirus aufweist, das durch Kälteadaptierung erzeugt wurde, wobei das Pferdeinfluenzavirus einen identifizierenden Phänotyp aufweist, der aus der Gruppe ausgewählt ist, welche aus Kälteadaptierung, Temperaturempfindlichkeit, dominanter Interferenz und Attenuation besteht, mit den Schritten: a. Mischen der Genomsegmente eines kälteadaptieren Spenderpferdeinfluenzavirus mit den Genomsegmenten eines Empfängerinfluenza A-Virus und b) Selektieren eines reassortierten Virus, das (a) mindestens einen Phänotyp des Spenderpferdeinfluenzavirus, wobei der Phänotyp aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Kälteadaptierung, Temperaturempfindlichkeit, dominanter Interferenz und Attenuation besteht; und (b) die Hämagglutinin- und Neuraminidasephänotypen des Empfängerinfluenza A-Virus aufweist.
Verfahren zum Vermehren eines kälteadaptierten Pferdeinfluenzavirus, das in embryonierten Hühnereiern bei einer Temperatur im Bereich von 26°C bis 30°C repliziert, wobei es ein Verfahren aufweist, das aus der Gruppe ausgewählt ist, welche besteht aus Vermehren des Virus in Eiern und Vermehren des Virus in Gewebekulturzellen.
Isoliertes Pferedeinfluenzanukleinsäuremolekül, wobei des Pferdeinfluenzanukleinsäuremolekül aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:23 und SEQ ID NO:25 und einem Nukleinsäuremolekül besteht, das eine Nukleinsäuresequenz aufweist, welche vollständig komplementär zu einer der genannten Nukleinsäuresequenzen ist.
Isoliertes Pferdeinfluenzanukleinsäuremolekül, wobei das Pferdeinfluenzanukleinsäuremolekül ein Protein codiert, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:17 und SEQ ID NO:24 besteht.
Isoliertes Pferdeinfluenzaprotein, wobei das Pferdeinfluenzaprotein eine Aminosäuresequenz aufweist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:17 und SEQ ID NO:24 besteht.
Kälteadaptiertes Pferdeinfluenzavirus nach Anspruch 1, reassortiertes Influenza A-Virus nach Anspruch 2, therapeutische Zusammensetzung nach Anspruch 3, Verwendung nach Anspruch 4 oder Verfahren nach Anspruch 5, 6 oder 7, wobei das kälteadaptierte Pferdeinfluenzavirus, auf das in den Ansprüchen 1, 3, 4, 5, 7 Bezug genommen ist, oder das reassortierte Influenza A-Virus, auf das in Anspruch 2, 3, 4 oder 6 Bezug genommen ist, attenuiert ist.
Kälteadaptiertes Pferdeinfluenzavirus nach Anspruch 1, reassortiertes Influenza A-Virus nach Anspruch 2, therapeutische Zusammensetzung nach Anspruch 3, Verwendung nach Anspruch 4 oder Verfahren nach Anspruch 5, 6 oder 7, wobei das kälteadaptierte Pferdeinfluenzavirus, auf das in den Ansprüchen 1, 3, 4, 5, 7 Bezug genommen ist, oder das reassortierte Influenza A-Virus, auf das in Anspruch 2, 3, 4 oder 6 Bezug genommen ist, temperaturempfindlich ist..
Kälteadaptiertes Pferdeinfluenzavirus nach Anspruch 1, reassortiertes Influenza A-Virus nach Anspruch 2, therapeutische Zusammensetzung nach Anspruch 3, Verwendung nach Anspruch 4 oder Verfahren nach Anspruch 5, 6 oder 7, wobei das kälteadaptierte Pferdeinfluenzavirus, auf das in Anspruch 1, 3, 4, 5, 7 Bezug genommen ist, oder das reassortierte Influenza A-Virus, auf das in Anspruch 2, 3, 4 oder 6 Bezug genommen ist, in embryonierten Hühnereiern bei einer Temperatur im Bereich von 26°C bis 30°C repliziert, aber bei einer Temperatur von 39°C keine Plaques in Gewebekulturzellen ausbildet.
Kälteadaptiertes Pferdeinfluenzavirus nach Anspruch 1, reassortiertes Influenza A-Virus nach Anspruch 2, therapeutische Zusammensetzung nach Anspruch 3, Verwendung nach Anspruch 4 oder Verfahren nach Anspruch 5, 6 oder 7, wobei ein Phänotyp, der eine nicht zulässige Temperatur von 39°C aufweist, durch mindestens zwei Mutationen in dem Genom des Virus, die eine erste Mutation und eine zweite Mutation umfassen, zu dem kälteadaptierten Pferdeinfluenzavirus, auf das in Anspruch 1, 3, 4, 5, 7 Bezug genommen ist, oder dem reassortierten Influenza A-Virus, auf das in Anspruch 2, 3, 4 oder 6 Bezug genommen ist, beigetragen wird.
Kälteadaptiertes Pferdeinfluenzavirus nach Anspruch 1, therapeutische Zusammensetzung nach Anspruch 3, Verwendung nach Anspruch 4 oder Verfahren nach Anspruch 7, wobei das kälteadaptierte Pferdeinfluenzavirus einen Phänotyp mit dominanter Interferenz aufweist.
Kälteadaptiertes Pferdeinfluenzavirus nach Anspruch 1, reassortiertes Influenza A-Virus nach Anspruch 2, therapeutische Zusammensetzung nach Anspruch 3, Verwendung nach Anspruch 4 oder Verfahren nach Anspruch 5, 6 oder 7, wobei das kälteadaptierte Pferdeinfluenzavirus, auf das in den Ansprüchen 1, 3, 4, 5 oder 7 Bezug genommen ist, oder das Genomsegment, auf das in den Ansprüchen 2, 3, 4 oder 6 Bezug genommen ist, von dem Stamm A/equine/Kentucky/1/91 (H3N8) erhalten ist.
Kälteadaptiertes Pferdeinfluenzavirus nach Anspruch 1, reassortiertes Influenza A-Virus nach Anspruch 2, therapeutische Zusammensetzung nach Anspruch 3, Verwendung nach Anspruch 4 oder Verfahren nach Anspruch 5, 6 oder 7, wobei das kälteadaptierte Pferdeinfluenzavirus, auf das in den Ansprüchen 1, 3, 4, 5 oder 7 Bezug genommen ist, oder das reassortierte Influenza A-Virus, auf das in den Ansprüchen 2, 3, 4 oder 6 Bezug genommen ist, den identifizierenden Phänotyp Kälteadaptierung, Temperaturempfindlichkeit, dominante Interferenz oder Attenuation eines Virus aufweist, das aus der Gruppe ausgewählt ist, welche besteht aus: EIV-P821, identifiziert durch Zugangsnummer ATCC VR-2625; EIV-P824, identifiziert durch Zugangsnummer ATCC VR-2624; und MSV+5, identifiziert durch Zugangsnummer ATCC VR-2627.
Kälteadaptiertes Pferdeinfluenzavirus nach Anspruch 1, reassortiertes Influenza A-Virus nach Anspruch 2, therapeutische Zusammensetzung nach Anspruch 3, Verwendung nach Anspruch 4 oder Verfahren nach Anspruch 5, 6 oder 7, wobei das kälteadaptierte Pferdeinfluenzavirus, auf das in den Ansprüchen 1, 3, 4, 5 oder 7 Bezug genommen ist oder das Genomsegment, auf das in den Ansprüchen 2, 3, 4 oder 6 Bezug genommen ist, aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus: EIV-P821, identifiziert durch Zugangsnummer ATCC VR-2625; EIV-P824, identifiziert durch Zugangsnummer ATCC VR-2624; MSV+5, identifiziert durch Zugangsnummer ATCC VR-2627; und Abkömmlingen, die den identifizierenden Phänotyp Kälteadaptierung, Temperaturempfindlichkeit, dominante Interferenz oder Attenuation von jedwedem der genannten Viren, das eine der genannten Zugangsnummern aufweist, beibehalten.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei das genannte Empfängerinfluenza A-Virus unterschiedliche Hämagglutinin- und Neuraminidasephänotypen als jene des Spenderpferdeinfluenzavirus aufweist und wobei das reassortierte Virus die Hämagglutinin- und Neuramidasephänotypen des Empfängervirus aufweist.
Therapeutische Zusammensetzung nach Anspruch 3 oder Verwendung nach Anspruch 4, wobei die therapeutische Zusammensetzung oder das Medikament für die Verabreichung an das Tier über eine Route vorgesehen ist, die es dem Virus erlaubt, in die Schleimhautzellen des oberen Atmungstrakts einzutreten.
Therapeutische Zusammensetzung nach Anspruch 3 oder Verwendung nach Anspruch 4, wobei die therapeutische Zusammensetzung ein kälteadaptiertes Pferdeinfluenzavirus aufweist, wobei die Krankheit durch das Pferdeinfluenzavirus verursacht wird und wobei die therapeutische Zusammensetzung für die prophylaktische Verabreichung an ein Pferd vorgesehen ist, um eine Immunantwort gegen Pferdeinfluenzavirus bei dem Pferd hervorzurufen.
Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 8, wobei das Nukleinsäuremolekühl ein Protein codiert, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus: einem M-Protein, wobei das M-Protein eine Aminosäuresequenz aufweist, die SEQ ID NO:5 umfasst; einem HA-Protein, wobei das HA-Protein eine Aminosäuresequenz aufweist, die SEQ ID No:11 umfasst; einem PB2-N-Protein, wobei das PB2-N-Protein eine Aminosäuresequenz aufweist, die SEQ ID NO:17 umfasst; und einem PB2-C-Protein, wobei das PB2-C-Protein eine Aminosäuresequenz aufweist, die SEQ ID NO:24 umfasst.