JP2002522078A

JP2002522078A - 低温適応性ウマインフルエンザウィルス

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Publication number: JP2002522078A
Application number: JP2000565137A
Authority: JP
Inventors: パトリシアダブリュー．ドウリング; ジュリウスエス．ヤングナー
Original assignee: ザユニバーシティーオブピッツバーグオブザコモンウェルスシステムオブハイヤーエドゥケーション
Priority date: 1998-08-13
Filing date: 1999-08-12
Publication date: 2002-07-23
Anticipated expiration: 2019-08-12
Also published as: US20030180322A1; JP2009297040A; EP1854886A3; WO2000009702A1; AU5487799A; US6649169B2; JP5261338B2; AU760356B2; DE69935721T2; JP2012085657A; CA2339089C; EP1105497A1; ATE358722T1; ES2286892T3; DK1105497T3; EP1105497B1; US6436408B1; JP4583602B2; CA2339089A1; EP1854886A2

Abstract

(57)【要約】本発明は、実験的に作製された低温適応性ウマインフルエンザウィルス及び、そのようなウマインフルエンザウィルスの少なくとも１つのゲノム分節を有するリアソータントインフルエンザA型ウィルスを提供し、前記ウマインフルエンザウィルスのゲノム分節が、低温適応性、温度感受性、優性干渉性または弱毒性などの、低温適応性ウマインフルエンザウィルスの少なくとも１つの識別表現型を付与することを特徴とする。これらのウィルスを、インフルエンザA型ウィルスに起因する疾患から動物を保護するための、そして特に、ウマインフルエンザウィルスに起因する疾患からウマを保護するための治療用組成に製剤する。本発明は、クレームされた治療用組成を利用して動物をインフルエンザA型ウィルスに起因する疾患から保護するための方法もまた含む。そのような方法は、動物に、ビルレントウィルスへの曝露の前に、保護的な免疫反応を起こさせるワクチンとして治療用組成を使用することと、ビルレントウィルスに最近感染した、または今後数日以内にビルレントウィルスに曝露されるおそれのある動物の治療処置として治療用組成を使用することを含み、このため、前記治療用組成は、免疫のない場合でも、前記ビルレントウィルスの生育を阻害する。本発明は、低温適応性ウマインフルエンザウィルス及び低温適応により作製されたインフルエンザウィルスの少なくとも１つのゲノム分節を有するリアソータントインフルエンザA型ウィルスを作製する方法も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の属する技術分野本発明は、実験的に作製された低温適応性ウマインフルエンザウィルスに関し
、特に、弱毒化、優性干渉、または温度感受性などの付加的表現型を有する低温
適応性ウマインフルエンザウィルスに関する。本発明は、そのようなウマインフ
ルエンザウィルスからの、少なくとも１つのゲノム分節を有するリアソータント
インフルエンザＡ型ウィルスも含み、このため、このリアソータントウィルスは
、供与ウマインフルエンザウィルスの複数の表現型を含む。本発明は、リバース
遺伝工学により作製された、本発明の低温適応性ウマインフルエンザウィルスの
複数の識別表現型を持つ、遺伝子組換えされたウマインフルエンザウィルスをさ
らに含む。本発明は、インフルエンザウィルスに起因する疾患から動物を保護す
るため、これらのウィルスを治療用組成中で使用する方法にも関する。

【０００２】発明の背景ウマインフルエンザウィルスは、１９５６年頃から、ウマ類の呼吸制疾患の主
な病原として知られている。ウマインフルエンザウィルスにより引き起こされる
疾患の症状は重症となるおそれがあり、また、多くの場合、続発性の細菌感染症
を伴う。ウマインフルエンザウィルスの亜型としては、Ａ／ウマ／プラハ／１／
５６（Ｈ７Ｎ７）を原型とする亜型−１と、Ａ／ウマ／マイアミ／１／６３（
Ｈ３Ｎ８）を原型とする亜型−２との２種類が知られている。現在、優勢なウィ
ルス亜型は亜型−２であり、この亜型は、近年ではユーラシア及び北アメリカ分
離菌にさらに分化している。

【０００３】現在認可されているウマインフルエンザワクチンは、不活化（死菌）ウィルス
ワクチンである。このワクチンがウマ類に対して発揮する保護効果は、あるとし
ても非常に低く、また、例えば注射部位の炎症性反応などの望ましくない副作用
を伴う可能性がある。例えば、Ｍｕｍｆｏｒｄ，１９８７，ＥｑｕｉｎｅＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＤｉｓｅａｓｅＩＶ，２０７−２１７，及びＭ
ｕｍｆｏｒｄ，ｅｔａｌ．，１９９３，Ｖａｃｃｉｎｅ１１，１１
７２−１１７４を参照されたい。さらに、現在の療法を若齢の子馬に適用するこ
とはできない。なぜなら、現在の療法は母子免疫を克服できない可能性があり、
また、若齢の動物の場合は耐薬性を誘発するおそれがあるからである。疾患の重
症度から考えて、ウマをウマインフルエンザウィルスから保護するための、安全
で効果的な治療用組成が必要とされている。

【０００４】低温適応性ヒトインフルエンザウィルスを含む治療用組成の製造方法は、例え
ば、Ｍａａｓｓａｂ，ｅｔａｌ．，１９６０，Ｎａｔｕｒｅ７，６
１２−６１４，及びＭａａｓｓａｂ，ｅｔａｌ．，１９６９，Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０２，７２８−７３２に述べられている。さらに、こ
れらの研究者らは、低温適応性ヒトインフルエンザウィルス、すなわち、通常の
温度よりも低い温度で生育するように適応されたウィルスが、温度感受性表現型
を持つ傾向がある、つまり、そのようなウィルスは、野生型ウィルスが生育及び
複製可能であるような、ある一定のより高い非許容温度では、十分に生育しない
ということを指摘した。既存の低温適応性ヒトインフルエンザＡ型ウィルスとの
リアソートメントにより作製した様々な低温適応性ヒトインフルエンザＡ型ウィ
ルスは、ワクチン接種された個体に良好な免疫反応を惹起することが示されてお
り、また、複数の弱毒性の低温適応性リアソータントヒトインフルエンザＡ型ウ
ィルスが、ヒトを野生型ウィルスの攻撃から保護することが証明されている。例
えば、Ｃｌｅｍｅｎｔｓ，ｅｔａｌ．，１９８６，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２３，７３−７６を参照のこと。１９９２年９月２
２日に発行された、Ｙｏｕｎｇｎｅｒ，ｅｔａｌによる米国特許５，１４９
，５３１号で、本発明の発明者らは、複数のリアソータント低温適応性ヒトイン
フルエンザＡ型ウィルスが優性干渉表現型を有する、すなわち、これらのウィル
スが、対応する親野生型系統及び異種インフルエンザＡ型ウィルスの生育を阻害
することをさらに示した。１９８７年７月２８日に発行された、Ｃｏｇｇｉｎｓ
ｅｔａｌ．による米国特許４，６８３，１３７号及び、１９８７年９月１５
日に発行された、Ｃａｍｐｂｅｌｌによる米国特許４，６９３，８９３号は、
野生型ウマインフルエンザウィルスと弱毒性の低温適応性ヒトインフルエンザＡ
型ウィルスとのリアソートメントにより作製された、弱毒性の治療用組成を開示
している。これらの治療用組成は、ウマに対しては一般に安全で効果的であるも
のの、ヒトとウマ双方の遺伝子を含むウィルスの環境への導入は、重大な危険を
伴う。

【０００５】発明の概要本発明は、実験的に作製した低温適応性ウマインフルエンザウィルスと、低温
適応により作製したウマインフルエンザウィルスの少なくとも１つのゲノム分節
を有し、そのウマインフルエンザウィルスのゲノム分節が、低温適応性ウマイン
フルエンザウィルスの少なくとも１つの識別表現型をリアソータントウィルスに
与えるようなウマインフルエンザウィルスと、リバース遺伝工学により作製され
、低温適応性ウマインフルエンザウィルスの少なくとも１つの識別表現型を有す
る、遺伝子組換えウマインフルエンザウィルスとを提供する。識別表現型は、低
温適応性、温度感受性、優性干渉性及び弱毒性を含む。本発明は、インフルエン
ザＡ型ウィルスに起因する疾患から動物を保護するための治療用組成をさらに提
供する。この治療用組成は、本発明の低温適応性ウマインフルエンザウィルス、
リアソータントインフルエンザＡ型ウィルス、または遺伝子組換えウマインフル
エンザウィルスを含む。また、そのような治療用組成の投与を含む、インフルエ
ンザＡ型ウィルスに起因する疾患から動物を保護するための方法も提供される。
また、低温適応性ウマインフルエンザウィルスを作製する方法、及び、低温適応
性ウマインフルエンザウィルスの少なくとも１つのゲノム分節を有するリアソー
タントインフルエンザＡ型ウィルスを作製する方法も含む。後記の方法では、こ
のウマインフルエンザのゲノム分節が、低温適応性ウマインフルエンザウィルス
の少なくとも１つの識別表現型を、リアソータントウィルスに与える。

【０００６】低温適応性インフルエンザウィルスは、ふ化鶏卵内で、温度約２６℃から約３
０℃までの範囲で複製を行うインフルエンザウィルスである。本発明の低温適応
性ウマインフルエンザウィルス、リアソータントインフルエンザＡ型ウィルス、
又は遺伝子組換えウマインフルエンザウィルスは、健康な動物を罹患させないよ
うに、弱毒化されていることが好ましい。

【０００７】一実施例においては、本発明の低温適応性ウマインフルエンザウィルス、リア
ソータントインフルエンザＡ型ウィルス、又は遺伝子組換えウマインフルエンザ
ウィルスは、このウィルスが、ふ化鶏卵内で、温度約２６℃から約３０℃の範囲
で複製を行い、組織培養細胞内で、許容温度約３４℃でプラークを形成するが、
組織培養細胞内で、非許容温度約３９℃ではプラークを形成しないような温度感
受性でもある。

【０００８】一実施例においては、このような温度感受性のウィルスは、２つの突然変異を
有する。第１の突然変異は、温度約３９℃でプラーク形成を阻害し、ウィルスの
核タンパク質遺伝子をコードするゲノム分節と共分離する。第２の突然変異は、
温度約３９℃で全てのウィルスのタンパク質合成を阻害する。

【０００９】別の一実施例においては、本発明の低温適応性及び温度感受性のウマインフル
エンザウィルスは、ふ化鶏卵内で、温度約２６℃から約３０℃の範囲で複製を行
い、組織培養細胞内で、許容温度約３４℃でプラークを形成するが、組織培養細
胞内で、非許容温度３７℃では、プラークを形成せず、また、後発性ウィルスタ
ンパク質を発現しない。

【００１０】典型的には、本発明の低温適応性ウマインフルエンザウィルスは、野生型ウマ
インフルエンザウィルスを１回またはそれ以上継代培養し、次に、低温で安定し
て生育及び複製を行うウィルスを選別することにより作製される。このようにし
て作製された低温適応性ウマインフルエンザウィルスは、複数の実施例において
は、優性干渉性表現型を含む。すなわち、このようなウィルスは、親ウマインフ
ルエンザウィルスまたは異種野生型インフルエンザＡ型ウィルスと共感染した場
合に、これらのウィルスの生育を阻害するであろう。

【００１１】本発明の低温適応性ウマインフルエンザウィルスの例は、受託番号ＡＴＣＣＶＲ＿＿＿＿で識別されるＥＩＶ−Ｐ８２１、受託番号ＡＴＣＣＶＲ＿＿＿で
識別されるＥＩＶ−Ｐ８２４、受託番号ＡＴＣＣＶＲ＿＿＿で識別されるＥＩ
Ｖ−ＭＳＶ＋５、及びこれらのウィルスの後代を含む。

【００１２】本発明の治療用組成は、本発明の低温適応性ウマインフルエンザウィルス、リ
アソータントインフルエンザＡ型ウィルス、又は遺伝子組換えウマインフルエン
ザウィルスを、約１０^５ＴＣＩＤ_５０単位から約１０^８ＴＣＩＤ_５０単位、好適
には約２×１０^６ＴＣＩＤ_５０単位含む。

【００１３】本発明は、インフルエンザＡ型ウィルスに起因する疾患から動物を保護するた
めの方法も含む。この方法は、本発明の低温適応性ウマインフルエンザウィルス
、リアソータントインフルエンザＡ型ウィルス、又は遺伝子組換えウマインフル
エンザウィルスを含む治療用組成を動物に投与する工程を含む。保護する対象と
して好適な動物はウマ科の動物であり、特に好適な動物はウマ及び子馬である。

【００１４】本発明のさらに別の一実施例は、低温適応性ウマインフルエンザウィルスを作
製する方法である。この方法は、野生種ウマインフルエンザウィルスを継代培養
する工程と、低温で生育するウィルスを選別する工程とを含む。一実施例におい
ては、この方法は、温度を順次下げながら継代培養と選別とを繰り返すことを含
む。ウマインフルエンザウィルスの継代培養は、ふ化鶏卵内で行うことが望まし
い。

【００１５】別の一実施例は、本発明の供与低温適応性ウマインフルエンザウィルスのゲノ
ム分節と、受容インフルエンザＡ型ウィルスのゲノム分節との遺伝子リアソート
メントにより、リアソータントインフルエンザＡ型ウィルスを作製する方法であ
る。本発明のリアソータントインフルエンザＡ型ウィルスは、（ａ）供与低温適
応性ウマインフルエンザウィルスのゲノム分節と、受容インフルエンザＡ型ウィ
ルスのゲノム分節とを混合することと、（ｂ）この供与ウマインフルエンザウィ
ルスの少なくとも１つの識別表現型を含むウィルスを選別することとを含む方法
により作製される。識別表現型は、低温適応性、温度感受性、優性干渉性、及び
弱毒性を含む。これらのようなリアソータントウィルスは、供与ウィルスの少な
くとも１つの弱毒性表現型を含むことが望ましい。典型的なリアソータントウィ
ルスは、受容ウィルスの抗原性を有するであろう。すなわち、受容ウィルスのヘ
マグルチニン（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）表現型を有するであろう。

【００１６】本発明は、本発明の低温適応性ウマインフルエンザウィルスまたはリアソータ
ントインフルエンザＡ型ウィルスを増殖させる方法もまた提供する。これらの方
法は、ふ化鶏卵内または組織培養細胞内での増殖を含む。

【００１７】発明の詳細な説明本発明は、いくつかの規定された表現型を有する、実験的に作製された低温適
応性ウマインフルエンザウィルスを提供し、それらをここに開示する。ここで使
用する「１つの」物体は、１つ又はそれ以上の物体を指す。例えば、「１つの低
温適応性ウマインフルエンザウィルス」は、１つ又はそれ以上の低温適応性ウマ
インフルエンザウィルスを含みうる。従って、「１つの」、「１つまたはそれ以
上の」及び「少なくとも１つの」という語は、ここでは互換的に使用可能である
。また、「備える」、「含む」及び「有する」という語も互換的に使用可能であ
ることに留意されたい。さらに、「から選択される」物体は、そのグループの１
つまたはそれ以上の物体に関し、それらの組み合わせを含む。

【００１８】本発明の低温適応性ウマインフルエンザウィルスは、実験室内で作製されたウ
ィルスであり、従って、天然に発生するウィルスではない。本発明が、そのよう
な低温適応性ウマインフルエンザウィルスの識別発現型を有するウィルスも含む
ので、天然に発生したウィルスの混合物から分離された、すなわち、天然の環境
から隔離されたがクレームされた表現型を有するウマインフルエンザウィルスは
、本発明に含まれる。本発明の低温適応性ウマインフルエンザウィルスは、特定
のレベルの純度を必要としない。例えば、ふ化鶏卵内で生育した低温適応性ウマ
インフルエンザウィルスは、尿膜腔液（ＡＦ）と混合していてもよいし、また、
組織培養細胞内で生育した低温適応性ウマインフルエンザウィルスは、破砕細胞
及び組織培地と混合していてもよい。

【００１９】ここで使用される「ウマインフルエンザウィルス」という用語は、例えばウマ
及び子馬などのウマ科の動物に感染し、その体内で生育するインフルエンザウィ
ルスを指す。ここで使用される、ウィルスの「生育」という用語は、ウィルスが
、許容宿主細胞内で生殖または自身を「複製」する能力を意味する。従って、「
ウィルスの生育」及び「ウィルスの複製」という用語は、ここでは互換可能に用
いられる。特定の宿主細胞内でのウィルスの生育または複製を、ウィルス学の分
野の熟練技術者に公知の標準的方法で観察及び測定してもよい。例えば、感染し
たウマの鼻咽頭分泌物に含まれるような、感染性のウィルスを含有するサンプル
を、例えば組織培養細胞中のウィルスプラークなど、細胞変性作用（ＣＰＥ）を
起こさせる能力について検査する。サンプルをふ化鶏卵の尿膜腔内に接種し、次
いで、接種された鶏卵のＡＦを、赤血球細胞を凝集させる能力、すなわち、ＡＦ
内にインフルエンザウィルスヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質が存在すること
に起因する赤血球凝集反応を引き起こす能力について検査することにより、感染
性のウィルスを検出してもよい。

【００２０】天然に発生する、すなわち、野生型のウマインフルエンザウィルスは、温度約
３４℃から約３９℃で良好に複製を行う。例えば、野生型ウマインフルエンザウ
ィルスは、ふ化鶏卵内で、温度約３４℃で複製を行い、また、組織培養細胞中で
は、温度約３４℃から約３９℃で複製を行う。ここで用いられる「低温適応性の
」ウマインフルエンザウィルスという用語は、ウマインフルエンザウィルスの最
適生育温度よりも低い温度で生育するように適応されたウマインフルエンザウィ
ルスを指す。本発明の低温適応性のウマインフルエンザウィルスの一例に、ふ化
鶏卵内で、温度約３０℃で複製を行うウィルスがある。本発明の好適な低温適応
性のウマインフルエンザウィルスは、ふ化鶏卵内で、温度約２８℃で複製を行う
。本発明の別の好適な低温適応性のウマインフルエンザウィルスは、ふ化鶏卵内
で、温度約２６℃で複製を行う。一般に、本発明の好適な低温適応性のウマイン
フルエンザウィルスは、ふ化鶏卵内で、温度約２６℃から約３０℃の範囲内で、
すなわち、野生型ウィルスが殆どまたは全く生育しない温度で、複製を行う。こ
れらのウィルスがこの温度範囲内で複製を行う能力を有することは、これらのウ
ィルスが、より高いまたはより低い温度でも複製を行う能力を排除するものでは
ないことに留意されたい。例えば、一実施例は、ふ化鶏卵内で、温度約２６℃で
複製を行うが、組織培養細胞中で、温度約３４℃でも複製を行う低温適応性ウマ
インフルエンザウィルスである。野生型インフルエンザウィルスと同様に、本発
明の低温適応性ウマインフルエンザウィルスもまた、組織培養細胞中、例えばＭ
ａｄｉｎＤａｒｂｙイヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）中で、温度約３４℃で一般にプ
ラークを形成する。本発明の適当な及び好適な低温適応性のウマインフルエンザ
ウィルスの例を、ここに開示する。

【００２１】本発明の一実施例は、野生型ウマインフルエンザウィルスを継代培養すること
と、次いで、低温で生育するウィルスを選別することとを含む方法で作製された
、低温適応性のウマインフルエンザウィルスである。本発明の低温適応性ウマイ
ンフルエンザウィルスを、例えば、野生型インフルエンザウィルスを、ふ化鶏卵
内で、温度を順次低下させながら連続的に継代培養することにより、ウィルス混
合体の中から、低温で安定して複製を行う複数のウィルスを選択して作製しても
よい。継代培養の手順の一例を、例の項に詳しく開示する。継代培養工程の間に
、１つまたはそれ以上の突然変異が、このインフルエンザウィルスのゲノムを有
する一本鎖ＲＮＡ分節の複数に起こり、これらのＲＮＡ分節の遺伝子型、すなわ
ち、これらのＲＮＡ分節の初期ヌクレオチド配列を変化させる。ここで使用され
る「突然変異」という用語は、インフルエンザウィルスゲノムを構成している任
意のＲＮＡ分節の初期ヌクレオチド配列の変化を指す。突然変異の例には、１つ
またはそれ以上のヌクレオチドの置換、１つまたはそれ以上のヌクレオチドの欠
失、１つまたはそれ以上のヌクレオチドの挿入、または、２つまたはそれ以上の
ヌクレオチド切片の逆位がある。ウィルス混合体の中から、低温で安定して複製
を行う複数のウィルスを選択することにより、低温適応性表現型を有するウィル
スを選別する。ここで使用される「表現型」という用語は、細胞やウィルスのよ
うな生物学的実体の観察可能なまたは測定可能な特徴を指し、この観察される特
徴は、その生物学的実体の特定の遺伝子構成、すなわち、ある遺伝子型に帰する
ものである。従って、低温適応性表現型は、ウィルスゲノムの１つまたはそれ以
上の突然変異の結果である。ここで使用される「突然変異」、「ゲノム」、「遺
伝子型」または「表現型」という用語は、１つまたはそれ以上の、または少なく
とも１つの突然変異、ゲノム、遺伝子型、または表現型をそれぞれ指す。

【００２２】低温適応性ウマインフルエンザウィルスのさらに別の、観察可能な表現型が発
現してもよく、それらの表現型は、一般に、そのようなウィルスのゲノムにおけ
る１つまたはそれ以上の別の突然変異の結果として発現するであろう。例えば、
本発明の低温適応性ウマインフルエンザウィルスは、さらに、弱毒性であり、優
性干渉性を発揮し、及び／又は温度感受性であってもよい。

【００２３】一実施例においては、本発明の低温適応性ウマインフルエンザウィルスは、弱
毒性の特徴を持つ表現型を有する。低温適応性ウマインフルエンザウィルスが「
弱毒性」であるというのは、このウィルスを、ウマインフルエンザウィルス感受
性の動物に投与した結果、その動物に観察される臨床症状が、野生型ウマインフ
ルエンザウィルスに感染した動物に観察される臨床症状と比較して、軽症であ
るか、または全く観察されない場合を指す。例えば、野生型ウマインフルエンザ
ウィルスに感染した動物は、発熱、くしゃみ、咳、抑うつ、及び鼻汁などの症状
を呈するであろう。これに対し、本発明の弱毒化された低温適応性ウマインフル
エンザウィルスを投与された動物は、臨床症状を呈示するとしても最小であるか
、または全く呈示しない、すなわち、症状が検出不可能であろう。

【００２４】別の一実施例においては、本発明の低温適応性ウマインフルエンザウィルスは
、温度感受性表現型を有する。ここで説明される温度感受性の低温適応性ウマイ
ンフルエンザウィルスは、低温では複製を行うが、野生型ウィルスが複製及びプ
ラーク形成を行うようなより高い温度では、組織培養細胞中で複製またはプラー
ク形成を行わない。理論に拘束されるわけではないが、温度感受性表現型を有す
るウマインフルエンザウィルスが複製を行う場所は、主として上気道の低温の通
路に限られ、ウィルスがより疾患の症状を引き起こしやすい下気道内では良好に
複製を行わないと信じられている。温度感受性のウィルスが生育する温度は、こ
こでは、その温度感受性ウィルスにとっての「許容」温度として述べられる。そ
して、その温度感受性ウィルスが生育しないが、対応する野生型ウィルスが生育
するような、より高い温度は、ここでは「非許容」温度として述べられている。
例えば、本発明の複数の温度感受性の低温適応性ウマインフルエンザウィルスは
、ふ化鶏卵内で、約３０℃またはそれ以下の温度で複製を行い、好適には約２８
℃または約２６℃で複製を行い、許容温度約３４℃では組織培養細胞中でプラー
クを形成するが、非許容温度約３９℃では組織培養細胞中でプラークを形成しな
い。本発明の他の温度感受性の低温適応性ウマインフルエンザウィルスは、ふ化
鶏卵内で、約３０℃またはそれ以下の温度で複製を行い、好適には約２８℃また
は約２６℃で複製を行い、許容温度約３４℃では組織培養細胞中でプラークを形
成するが、非許容温度約３７℃では組織培養細胞中でプラークを形成しない。

【００２５】本発明の複数の低温適応性ウマインフルエンザウィルスは、優性干渉性表現型
を有する。すなわち、細胞内に別のインフルエンザＡ型ウィルスと共感染した時
に、優先的に感染することにより、この別のウィルスの生育を抑制する。例えば
、優性干渉性表現型を有する本発明の低温適応性ウマインフルエンザウィルスが
、ＭＤＣＫ細胞に、野生型親ウマインフルエンザウィルス、Ａ／ウマ／ケンタッ
キー／１／９１（Ｈ３Ｎ８）と共感染した場合、この親ウィルスの生育が阻害さ
れる。従って、ビルレントインフルエンザウィルス、すなわち、疾患症状を引き
起こすインフルエンザウィルスに最近曝された、またはまもなく曝されるかもし
れない動物の上気道に、優性干渉性表現型を有する低温適応性ウマインフルエン
ザウィルスを含有する治療用組成を投与すれば、そのビルレントウィルスの生育
が阻害されるので、そのウィルスに対する免疫反応がない場合でも、その動物の
疾患は改善または軽減されるであろう。

【００２６】温度感受性を有する低温適応性ウマインフルエンザウィルスの優性干渉性を、
標準的なウィルス学的手法により測定してもよい。例えば、ＭＤＣＫ細胞の分離
単層を、（ａ）ビルレント野生型インフルエンザＡ型ウィルス、（ｂ）温度感受
性、低温適応性ウマインフルエンザウィルス、及び（ｃ）これら両方のウィルス
に感染させてもよい。これらの感染は全て、細胞当たり約２プラーク形成単位（
ｐｆｕ）の感染多重度（ＭＯＩ）でなされる。感染後、様々な感染細胞からのウ
ィルス産生量を、複製プラークアッセイにより、その低温適応性ウマインフルエ
ンザウィルスの許容温度および非許容温度で測定する。温度感受性表現型を有す
る低温適応性ウマインフルエンザウィルスは、非許容温度ではプラークを形成で
きないが、野生型ウィルスは、許容温度でも非許容温度でもプラークを形成でき
る。従って、野生型ウィルスのみに感染した細胞の非許容温度でのウィルス産生
量を、両方のウィルスに感染した細胞の非許容温度でのウィルス産生量と比較す
ることにより、低温適応性ウィルスが存在する条件下での野生型ウィルスの生育
を測定することが可能である。

【００２７】本発明の低温適応性ウマインフルエンザウィルスは、主な特徴として、以下の
識別表現型：低温適応性、温度感受性、優性干渉性、及び／又は弱毒性のうちの
１つまたはそれ以上を有する。ここで用いられる「ウマインフルエンザウィルス
が低温適応性、温度感受性、優性干渉性、及び／又は弱毒性の識別表現型を有す
る」という表現は、そのような表現型の１つまたはそれ以上を有するウィルスに
関する。そのようなウィルスの例には、受託番号ＡＴＣＣＶＲ＿＿＿＿で識別
されるＥＩＶ−Ｐ８２１、受託番号ＡＴＣＣＶＲ＿＿＿で識別されるＥＩＶ−
Ｐ８２４、受託番号ＡＴＣＣＶＲ＿＿＿で識別されるＥＩＶ−ＭＳＶ＋５、及
びＥＩＶ−ＭＳＶ０、ＥＩＶ、ＭＳＶ＋１、ＥＩＶ−ＭＳＶ＋２、ＥＩＶ−ＭＳ
Ｖ＋３、ＥＩＶ−ＭＳＶ＋４があるが、これらに限定されることはない。これら
のウィルスの作製については、例で説明する。例えば、低温適応性ウマインフル
エンザウィルスＥＩＶ−Ｐ８２１は、（ａ）例えば、ふ化鶏卵内で、温度約２６
℃で複製を行う能力などの低温適応性と、（ｂ）例えば、非許容温度約３７℃で
は、組織培養細胞内でプラーク形成及び後期遺伝子産物の発現を行うことができ
ず、また、非許容温度約３９℃では、組織培養細胞中でプラーク形成及びいかな
るウィルスタンパク質の合成も行うことができないなどの温度感受性、（ｃ）ウ
マインフルエンザウィルス感受性の動物に投与した場合の弱毒性、及び、（ｄ）
例えば、細胞内に野生型インフルエンザＡ型ウィルスと共感染した場合に、その
野生型ウィルスの生育を阻害するなどの優性干渉性により特徴づけられる、すな
わち、これらの識別表現型を有する。同様に、低温適応性ウマインフルエンザウ
ィルスＥＩＶ−Ｐ８２４は、（ａ）例えば、ふ化鶏卵内で、温度約２８℃で複製
を行う能力などの低温適応性と、（ｂ）例えば、非許容温度約３９℃では、組織
培養細胞中でプラーク形成を行うことができないなどの温度感受性、及び、（ｃ
）例えば、細胞内に野生型インフルエンザＡ型ウィルスと共感染した場合に、そ
の野生型ウィルスの生育を阻害するなどの優性干渉性により特徴づけられる。別
の一例では、低温適応性ウマインフルエンザウィルスＥＩＶ−ＭＳＶ＋５は、（
ａ）例えば、温度約２６℃で、ふ化鶏卵内で複製を行うことができるなどの低温
適応性、（ｂ）例えば、非許容温度約３９℃では、組織培養細胞中でプラーク形
成を行うことができないなどの温度感受性、及び、（ｃ）ウマインフルエンザウ
ィルス感受性の動物に投与した場合の弱毒性により特徴づけられる。

【００２８】複数の例では、ある表現型に関与する１つ又はそれ以上の突然変異が発生する
ＲＮＡ分節を、ここに述べる標準的な方法を用いたリアソートメント分析により
決定してもよい。一実施例においては、本発明の低温適応性ウマインフルエンザ
ウィルスは、このウィルスのゲノム中の少なくとも２つの突然変異と相関する、
温度感受性表現型を有する。この実施例では、ここに述べるリアソートメント分
析により位置決定された、前記２つの突然変異のうちの１つが、ウィルスが組織
培養細胞中で非許容温度３９℃でプラークを形成する能力を抑制、すなわち、阻
害または防止する。この突然変異は、ウマインフルエンザウィルスゲノム中の、
このウィルスの核タンパク質（ＮＰ）遺伝子をコードする分節と共分離する。す
なわち、この突然変異は、このＮＰ遺伝子と同じＲＮＡ分節に位置する。この実
施例の第２の突然変異は、非許容温度約３９℃で、全てのタンパク質の合成を阻
害する。従って、この非許容温度では、このウィルスのゲノムは、いかなるウィ
ルスタンパク質も発現できない。これらの特徴を持つ低温適応性ウマインフルエ
ンザウィルスの例に、ＥＩＶ−Ｐ８２１及びＥＩＶＭＳＶ＋５がある。ＥＩＶ
−Ｐ８２１を、例１Ａで説明する方法を用いて、ふ化鶏卵内で野生型インフルエ
ンザウィルスを連続的に継代培養することにより作製した。ＥＩＶＭＳＶ＋
５を、例１Ｅで説明する方法を用いて、ＥＩＶ−Ｐ８２１をさらに連続的に継代
培養することにより得た。

【００２９】さらに、非許容温度約３９℃でプラーク形成及びウィルスタンパク質の合成を
阻害する２つの突然変異を有する、低温適応性かつ温度感受性のウマインフルエ
ンザウィルスは、そのウィルスが組織培養細胞中で非許容温度約３７℃で後期遺
伝子を発現し及びプラークを形成する能力を阻害する、１つまたはそれ以上の突
然変異を有してもよい。これらの特徴を有する低温適応性ウマインフルエンザウ
ィルスの一例に、ＥＩＶ−Ｐ８２１がある。このウィルス分離株は、温度約２６
℃では、ふ化鶏卵内で複製を行い、温度約３９℃では、プラーク形成もいかなる
ウィルスタンパク質の合成も行わない。さらに、ＥＩＶ−Ｐ８２１は、非許容温
度約３７℃では、ＭＤＣＫ細胞でプラークを形成せず、また、この温度では、後
期遺伝子の発現が阻害される。この阻害は、後期遺伝子が生成されない、すなわ
ち、通常レベルのＮＰタンパク質が合成され、低レベル又は検出不可能なレベル
のＭ１又はＨＡタンパク質が合成され、高レベルのポリメラーゼタンパク質が合
成されるような方法で行われる。この表現型は、特異なウィルスタンパク質合成
により特徴づけられるため、非許容温度約３９℃での全てのウィルスタンパク質
合成の阻害により特徴づけられるタンパク合成表現型との相違は明白である。

【００３０】米国連邦規制基準３７の１．８０２（ａ−ｃ）により、ここでＥＩＶ−Ｐ８２
１及びＥＩＶ−Ｐ８２４として表される低温適応性ウマインフルエンザウィルス
は、ブダペスト条約に基づき、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
（ＡＴＣＣ、２０１１０−２２０９バージニア州、マナッサス、ユニバーシテ
ィ・ブルヴァール１０８０１）に、それぞれＡＴＣＣ受託番号ＡＴＣＣＶＲ
−＿＿＿及びＡＴＣＣＶＲ−＿＿＿として、１９９８年７月１１日に寄託され
た。低温適応性ウマインフルエンザウィルスＥＩＶ−ＭＳＶ＋５は、ＡＴＣＣに
、ＡＴＣＣ受託番号ＡＴＣＣＶＲ−＿＿＿として、１９９８年８月３日に寄託
された。米国連邦規制基準３７の１．８０６により、寄託は少なくとも３０年間
維持され、かつ当該サンプルの最終の分譲請求を寄託期間が受領したのち少なく
とも５年間維持される。連邦規則コード３７の１．８０８（ａ）（２）により、
寄託者が分譲に関して設けた全ての制限は、特許の取得と同時に無効となり、こ
れを取り消すことはできない。

【００３１】本発明の好適な低温適応性ウマインフルエンザウィルスは、ＥＩＶ−Ｐ８２１
、ＥＩＶ−Ｐ８２４及びＥＩＶ−ＭＳＶ＋５の識別表現型を有する。特に好適
な低温適応性ウマインフルエンザウィルスは、ＥＩＶ−Ｐ８２１、ＥＩＶ−Ｐ８
２４及びＥＩＶ−ＭＳＶ＋５、及びこれらのウィルスの後代を包含する。ここ
で使用される「後代」とは、「子孫」であり、従って、親ウィルスと比較してわ
ずかに異なる表現型であってもよいが、その親ウィルスの、例えば低温適応性、
温度感受性、優性干渉性、または弱毒性などの識別表現型を保持する。例えば、
低温適応性ウマインフルエンザウィルスＥＩＶ−ＭＳＶ＋５は、低温適応性ウマ
インフルエンザウィルスＥＩＶ−Ｐ８２１の「後代」である。「後代」は、供与
親ウィルスの１つまたはそれ以上の識別表現型を有するリアソータントインフル
エンザＡ型ウィルスもまた包含する。

【００３２】本発明のリアソータントインフルエンザＡ型ウィルスは、本発明の供与低温適
応性ウマインフルエンザウィルスのゲノム分節と受容インフルエンザＡ型ウィル
スのゲノム分節との遺伝子リアソートメントを行った後に、８つのＲＮＡゲノム
分節のうちの少なくとも１つが供与ウィルスに由来するリアソータントウィルス
を選別るすことにより、このリアソータントウィルスが、供与低温適応性ウマイ
ンフルエンザウィルスの少なくとも１つの識別表現型を獲得するような方法で作
製される。識別表現型は、低温適応性、温度感受性、弱毒性及び優性干渉性を含
む。好適には、本発明のリアソータントインフルエンザＡ型ウィルスの少なくと
も弱毒性表現型は、供与ウィルスに由来する。リアソータントインフルエンザウ
ィルスを分離する方法は、ウィルス学の分野の熟練技術者に公知であり、例えば
、Ｆｉｅｌｄｓ，ｅｔａｌ．，１９９６，ＦｉｅｌｄｓＶｉｒｏｌ
ｏｇｙ，３ｄｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ、Ｐａｌｅｓ
ｅ，ｅｔａｌ．，１９７６，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１７，８７６−
８８４．Ｆｉｅｌｄｓ，ｅｔａｌ．，同上、及びＰａｌｅｓｅ，ｅｔａｌ．，同上、に開示されている。

【００３３】好適な供与ウマインフルエンザウィルスは、本発明の低温適応性ウマインフル
エンザウィルスであり、例えば、受託番号ＡＴＣＣＶＲ＿＿＿＿で識別される
ＥＩＶ−Ｐ８２１、受託番号ＡＴＣＣＶＲ＿＿＿＿で識別されるＥＩＶ−Ｐ８
２４、又は、受託番号ＡＴＣＣＶＲ＿＿＿＿＿で識別されるＥＩＶ−ＭＳＶ＋
５である。好適な受容インフルエンザＡ型ウィルスは、別のウマインフルエンザ
ウィルス、例えば、Ａ／ウマ／サフォーク／８９（Ｈ３Ｎ８）などのユーラシア
亜型２ウマインフルエンザウィルスまたはＡ／プラハ／１／５６（Ｈ７Ｎ７）な
どの亜型１インフルエンザウィルスであってもよい。受容インフルエンザＡ型ウ
ィルスもまた、供与低温適応性ウマインフルエンザウィルスを用いてリアソータ
ントウィルスを作製することの可能な任意のインフルエンザＡ型ウィルスであっ
てもよい。そのようなインフルエンザＡ型ウィルスの例には、Ａ／プエルトリコ
／８／３４（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／香港／１５６／９７（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／シンガポ
ール／１／５７（Ｈ２Ｎ２）及びＡ／香港／１／６８（Ｈ３Ｎ２）などのヒトイ
ンフルエンザウィルス、Ａ／ブタ／アイオワ／１５／３０（Ｈ１Ｎ１）などのブ
タウィルス、及びＡ／マガモ／ニューヨーク／６７５０／７８（Ｈ２Ｎ２）及び
Ａ／ニワトリ／香港／２５８／９７（Ｈ５Ｎ１）などの鳥ウィルスがあるが、こ
れらに限定されることはない。本発明のリアソータントウィルスは、その結果得
られるリアソータントインフルエンザウィルスが供与ウィルスの少なくとも１つ
の識別表現型を有する限り、供与及び受容遺伝子分節の任意の組み合わせを含ん
でもよい。

【００３４】本発明のリアソータントウィルスの一例は、”６＋２”リアソータントウ
ィルスである。このウィルスの６つの「内部遺伝子分節」、すなわち、ＮＰ、Ｐ
Ｂ２、ＰＢ１、ＰＡ、Ｍ及びＮＳ遺伝子を持つ分節は、供与低温適応性ウマイン
フルエンザウィルスに由来し、また、このウィルスの２つの「外部遺伝子分節」
、すなわち、ＨＡ及びＮＡ遺伝子を持つ分節は、受容インフルエンザＡ型ウィル
スに由来する。このようにして作製されたウィルスは、供与低温適応性ウマイン
フルエンザウィルスの弱毒性、低温適応性、温度感受性、及び／又は優性干渉性
表現型を有するが、受容株の抗原性は有しない。

【００３５】さらに別の一実施例においては、本発明の低温適応性ウマインフルエンザウィ
ルスを、組換え手段により作製してもよい。この方法では、識別された低温適応
性、弱毒性、温度感受性または優性干渉性表現型に関連する１つまたはそれ以上
の特異的突然変異を同定し、リバース遺伝工学的方法を用いて野生型ウマインフ
ルエンザウィルス株に再導入する。リバース遺伝工学的方法では、インフルエン
ザウィルスに感染した細胞から分離したＲＮＡポリメラーゼ複合体を使用して、
当該変異を有する人工インフルエンザウィルスゲノム分節を転写し、この合成さ
れたＲＮＡ分節を、ヘルパーウィルスを用いてウィルス粒子内に組み込み、所望
の変化を含むウィルスを選別する。インフルエンザウィルスへのリバース遺伝工
学的方法の使用は、例えば、Ｅｎａｍｉ，ｅｔａｌ．，１９９０，Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７，３８０２−３８０５及び
１９９６年１１月２６日に発行された、Ｐａｌｅｓｅ，ｅｔａｌ．による米
国特許５，５７８，４７３に述べられている。この方法を用いて、当業者は、冗
長な低温適応工程を経ることなく、また、所望のウィルス表現型を有する突然変
異体を、インヴィトロおよびインヴィヴォの両方で選別する工程を経ることなく
、本発明の別の低温適応性ウマインフルエンザウィルスを作製できる。

【００３６】本発明の低温適応性ウマインフルエンザウィルスを、当業者に公知の標準的な
ウィルス学的方法を用いて増殖させてもよい。そのような方法の例をここに開示
する。例えば、低温適応性ウマインフルエンザウィルスを、ふ化鶏卵中で生育さ
せてもよいし、真核性組織培養細胞中で生育させてもよい。本発明の低温適応性
ウマインフルエンザウィルスがその中で生育可能な、好適な無限継代真核細胞株
は、インフルエンザウィルスの生育を補助する、例えばＭＤＣＫ細胞などの細胞
株を含む。本発明の低温適応性ウマインフルエンザウィルスがその中で生育可能
な、他の好適な細胞には、サル、子ウシ、ハムスターまたはニワトリの初代腎臓
細胞があるが、これらに限定されることはない。

【００３７】一実施例においては、本発明は、インフルエンザＡ型ウィルスに起因する疾患
から動物を保護するための治療用組成を提供する。この治療用組成は、低温適応
性ウマインフルエンザウィルスまたは低温適応により作製されたウマインフルエ
ンザウィルスの少なくとも１つのゲノム分節を有するリアソータントインフルエ
ンザＡ型ウィルスのいずれかを含む。このウマインフルエンザウィルスのゲノム
分節は、低温適応性ウマインフルエンザウィルスの少なくとも１つの識別表現型
を付与する。さらに、本発明の治療用組成は、本発明の低温適応性ウマインフル
エンザウィルスのある識別表現型を付与することが識別されている１つまたはそ
れ以上の突然変異を有するように遺伝子操作されたウマインフルエンザウィルス
を含んでもよい。ここで使用される「インフルエンザＡ型ウィルスに起因する疾
患」という語句は、ビルレントインフルエンザＡ型ウィルスに感染している動物
に観察される臨床症状に関する。そのような臨床症状の例には、発熱、くしゃみ
、咳、鼻汁、水疱音、食欲減退および抑うつがあるが、これらに限定されること
はない。さらに、「インフルエンザＡ型ウィルスに起因する疾患」は、ここでは
、感染した動物によるビルレントウィルスの放散を包含するものとして定義され
る。ある動物に観察される臨床症状と、ビルレントウマインフルエンザウィルス
による感染との関連は、その動物中のウマインフルエンザウィルスに対する特定
の抗体及び／又はＴ細胞応答の検出を含めた複数の方法で確認してもよい。好適
には、ある動物に観察される臨床症状と、ビルレントウマインフルエンザウィル
スによる感染との関連を、例えば、感染した動物の鼻咽頭腔から、ウィルスを含
有する分泌物を綿棒で採取して、感染した動物からウィルスを分離することによ
り確認する。ウィルス分離は、分離された分泌物を接種した組織培養細胞中の細
胞変性効果を検出するか、分離された分泌物をふ化鶏卵内に接種し、そこで、接
種された卵から採取したＡＦの持つ、インフルエンザウィルスのヘマグルチニン
タンパク質の存在を示唆する赤血球凝集能力から、ウィルス複製を検出するか、
または、例えば、Ｄｉｒｅｃｔｉｇｅｎ（登録商標）ＦＬＵＡテストなどの
、一般に利用可能な診断テストを行うことにより、確認される。

【００３８】ここで使用される「保護する」という用語は、例えば、被験動物のインフルエ
ンザＡ型ウィルス感染の防止または治療を含む。従って、本発明の治療用組成を
、例えば予防接種ワクチンとして、被験動物が当該ビルレントウィルスに曝され
る以前のある時点で、その動物に投与し、その動物をインフルエンザ疾患から保
護するために使用してもよい。

【００３９】優性干渉性表現型を有する低温適応性ウマインフルエンザウィルスを含有する
本発明の治療用組成を、ビルレントインフルエンザＡ型ウィルスに最近感染した
、または今後数日以内にそのようなウィルスに曝される可能性のある動物を保護
するために使用してもよい。この場合、この治療用組成は、動物がそのビルレン
トウィルスに対する抗体を産生する以前に、そのビルレントウィルスの生育を迅
速に阻害する。優性干渉性表現型を有する低温適応性ウマインフルエンザウィル
スを含有する治療用組成を、今後予想される曝露の前に、本発明の低温適応性ウ
マインフルエンザウィルスが、治療される動物の上気道で複製を行うおおよその
期間、例えば約７日間まで、に相当する期間、効果的に投与してもよい。優性干
渉性表現型を有する低温適応性ウマインフルエンザウィルスを含有する治療用組
成を、ビルレントウマインフルエンザウィルスに曝された後に、感染した動物が
疾患症状を呈示するのに必要な期間、例えば約２日間まで、に相当する期間、効
果的に投与してもよい。

【００４０】本発明の治療用組成は、例えば、ヒト、ブタ、ウマ及びその他のウマ科動物、
水生鳥類、家禽、闘鶏、アザラシ、ミンク、クジラなどの、インフルエンザウィ
ルス疾患感受性の任意の動物に投与可能である。より好適には、本発明の治療用
組成は、ウマインフルエンザウィルス疾患から保護するために、ウマに投与され
る。

【００４１】ウマをウマインフルエンザウィルス疾患から保護するために利用できる現在の
ワクチンは、子馬の保護には有効ではないが、それはおそらく、これらのワクチ
ンは、子馬の体内に存在する母親の抗体を克服することができないためであり、
このため、多くの場合、例えば生後３ヶ月などの若齢でのワクチン投与は、免疫
性よりもむしろ薬剤耐性に結びつくおそれがある。一実施例においては、既存の
ウマインフルエンザウィルスワクチンとは異なり、本発明の低温適応性ウマイン
フルエンザウィルスを含有する治療用組成は、明らかに若齢の動物に免疫性を付
与することが可能である。従って、本発明の治療用組成を、生後約３ヶ月程度の
子馬に、薬剤耐性を誘発することなくウマインフルエンザ疾患から保護するため
に、安全かつ効果的に投与することが可能である。

【００４２】一実施例においては、本発明の治療用組成は、多価性であってもよい。例えば
、本発明の１つまたはそれ以上の低温適応性ウマインフルエンザウィルス、１つ
またはそれ以上のリアソータントインフルエンザＡ型ウィルス、及び／又は、本
発明の１つまたはそれ以上の遺伝子組換えされたウマインフルエンザウィルスの
組み合わせを提供することにより、ある動物を１つまたはそれ以上のインフルエ
ンザＡ型ウィルス株から保護してもよい。多価性治療用組成は、例えば、Ａ／ウ
マ／ケンタッキー／１／９１（Ｈ１Ｎ８）のような北米亜型−２ウィルス分離株
とＡ／ウマ／サフォーク／８９（Ｈ３Ｎ８）のようなユーラシア亜型−２ウィル
ス分離株、または、１つまたはそれ以上の亜型−２ウィルス分離株とＡ／ウマ／
プラハ／１／５６（Ｈ７Ｎ７）のような１つの亜型−１ウィルス分離株に抗する
、少なくとも２つの低温適応性ウマインフルエンザウィルスを含んでもよい。同
様に、本発明の多価性治療用組成は、本発明の低温適応性ウマインフルエンザウ
ィルスとリアソータントインフルエンザＡ型ウィルス、または、本発明の２つの
リアソータントインフルエンザＡ型ウィルスを含んでもよい。本発明の多価性治
療用組成は、インフルエンザＡ型ウィルスに加えて、１つまたはそれ以上の他の
感染因子からも保護するための１つまたはそれ以上の製剤をさらに含んでもよい
。そのような別の感染因子には、ウィルス類、細菌類、真菌類及び真菌類微生物
類、及び寄生虫類があるが、これらに限定されることはない。好適な多価性治療
用組成には、本発明の低温適応性ウマインフルエンザウィルス、リアソータント
インフルエンザＡ型ウィルス、または遺伝子組換えウマインフルエンザウィルス
と、ウマを罹患させる１つまたはそれ以上の感染因子から防御するための１つま
たはそれ以上の組成との組み合わせがあるが、これらに限定されることはない。
対抗すべき好適な感染因子には、ウマ感染性貧血症ウィルス、ウマヘルペスウィ
ルス、東部、西部、またはベネズエラウマ脳炎ウィルス、破傷風、ストレプトコ
ッカス−エクイ、及びＥｈｒｌｉｃｈｉａｒｅｓｔｉｃｉｉがあるが、これら
に限定されることはない。

【００４３】本発明の治療用組成を、治療されるべき動物が許容可能な賦形剤中で調剤して
もよい。そのような賦形剤の例として、水、生理食塩水、リンゲル液、ブドウ糖
液、ハンクス液、及びその他の生理的平衡食塩水がある。賦形剤はまた、等張性
及び、化学的または生物学的安定性を増強する物質のような微量の添加物も含有
してもよい。バッファの例には、リン酸バッファ、重炭酸バッファおよびトリス
バッファがあり、安定化剤の例には、アイオワ州デモイン、ダイアモンド・アニ
マル・ヘルス社より入手可能なＡ１／Ａ２安定化剤がある。標準的な製剤は、動
物へ投与するための懸濁液または溶液に適した液体中に溶解可能な、液体または
固体のいずれでもよい。一実施例においては、非液体製剤は、投与の前に滅菌水
または生理食塩水を加えることの可能な食塩、バッファ、安定化剤などの添加剤
を含有してもよい。

【００４４】本発明の治療用組成は、１つまたはそれ以上のアジュバントまたは担体を含有
してもよい。典型的なアジュバントは、特定の抗原に対する動物の免疫反応を増
強する物質であり、また、担体は、治療される動物の体内での治療用組成の半減
期を延ばす化合物を含む。本発明の低温適応性ウマインフルエンザウィルスまた
はリアソータントインフルエンザＡ型ウィルスを含有する治療用組成の利点の一
つは、有効なワクチンの調製にアジュバント及び担体を必要としないことである
。さらに、当業者に公知の多くの場合において、アジュバントまたは担体の使用
が、本発明の治療用組成の利点を妨げることがあるかもしれない。しかし、本発
明はアジュバントまたは担体の使用を予め排除するものではないことに留意すべ
きである。

【００４５】本発明の治療用組成は、ビルレントウマインフルエンザウィルスの攻撃からあ
る動物を保護するのに十分な量の低温適応性ウマインフルエンザウィルスを含む
。一実施例においては、本発明の治療用組成は、５０％組織培養感染価（ＴＣＩ
Ｄ_５０）約１０^５単位から約１０^８単位の低温適応性ウマインフルエンザウィル
スを含んでもよい。ここで使用される「ＴＣＩＤ_５０単位」とは、感染した培養
細胞の５０％に細胞変性効果を及ぼすウィルス量である。ＴＣＩＤ_５０を測定及
び算出する方法は、当業者に周知であり、例えば、ＲｅｅｄａｎｄＭｕｅｎ
ｃｈ，１９３８，Ａｍ．Ｊ．ｏｆＨｙｇ．２７，４９３−４９７
に記載されている。本発明の好適な治療用組成は、本発明の低温適応性ウマイン
フルエンザウィルスまたはリアソータントインフルエンザＡ型ウィルスを、約１
０^６ＴＣＩＤ_５０単位から約１０^７ＴＣＩＤ_５０単位含有し、より好適には、本
発明の低温適応性ウマインフルエンザウィルスまたはリアソータントインフルエ
ンザＡ型ウィルスを、約２×１０^６ＴＣＩＤ_５０単位含有している。

【００４６】本発明は、本発明の治療用組成の動物への投与を含めた、動物をインフルエン
ザＡ型ウィルスに起因する疾患から保護するための方法も含む。好適な方法は、
ウマ科動物をウマインフルエンザウィルスに起因する疾患から保護するための方
法であり、これらの方法は、そのウマ科動物への低温適応性ウマインフルエンザ
ウィルスの投与を含む。効果的な方法で治療用組成を投与するための容認可能な
プロトコルは、個別の投与量、投与回数、投与頻度及び投与方式を含む。これら
のプロトコルの決定は当業者によってなされ、ここにその例を開示する。

【００４７】インフルエンザＡ型ウィルスにより引き起こされる疾患から動物を保護するた
めの好適な方法は、本発明の低温適応性ウマインフルエンザウィルス、リアソー
タントインフルエンザウィルスまたは遺伝子組換えウマインフルエンザウィルス
を含有する治療用組成を１回量投与することを含む。好適な１回量は、適切な間
隔で１回またはそれ以上の回数投与した時に、動物を疾患から保護することの可
能な投与量である。本発明の方法は、治療用組成の後続的、またはブースター投
与も含んでもよい。ブースター投与は、最初の投与後約２週間から約２年間行わ
れてもよい。ブースター投与は、その動物の免疫反応が、その動物を疾患から保
護するのに不十分となった時に行われることが望ましい。適切かつ好適な投与ス
ケジュールを、例の項に記載する。

【００４８】本発明の治療用組成を、治療される動物の上気道の粘膜細胞内にウィルスが入
って複製を行うような様々な手段を用いて、その動物に投与してもよい。そのよ
うな手段には、経鼻投与、経口投与及び眼内投与があるが、これらに限定される
ことはない。インフルエンザウィルスは、元来、上気道の粘膜に感染するので、
本発明の治療用組成を、経鼻投与により投与することが望ましい。そのような投
与は、カニューレを装着した注射器を用いて、または、ワクチン投与される動物
の鼻と口とに装着した噴霧器を用いて行ってもよい。

【００４９】インフルエンザＡ型ウィルスに起因する疾患から動物を保護するための本発明
の治療用組成の有効性について、様々な方法で検査を行ってもよい。そのような
方法には、例えば赤血球凝集抑制（ＨＡＩ）検査による抗体の検査、治療される
動物の細胞免疫の検査、または、治療される動物について、ビルレントインフル
エンザウィルスを用いて誘発試験を行い、その治療される動物が罹患に対する抵
抗性を持つかどうかを調べること、があるが、これらに限定されることはない。
さらに、ビルレントな野生型ウマインフルエンザウィルスを過去に接種された、
または接種感受性の動物の疾患症状を緩和または減退させる優性干渉性表現型を
有する低温適応性ウマインフルエンザウィルスを含有する本発明の治療用組成の
有効性を、治療される動物の疾患症状の減退または消失について判別することに
により検査してもよい。

【００５０】本発明は、本発明の治療用組成を調製する方法も含む。本発明の治療用組成を
調製する好適な方法を以下に開示する。本発明の治療用組成の１類型、すなわち
低温適応性ウマインフルエンザウィルスの調製に関する適切な工程は、（ａ）野
生型ウマインフルエンザウィルスを、例えばふ化鶏卵内などのインヴィトロで継
代培養することと、（ｂ）低温で生育するウィルスを選別することと、（ｃ）継
代培養および選別工程を、１回またはそれ以上の回数、温度を順次低下させなが
ら繰り返し、ウィルスが所望の低温で安定して生育するようなウィルス個体数を
選択することと、（ｄ）得られたウィルス製剤を適切な賦形剤と混合することと
、を含む。

【００５１】本発明の治療用組成の別の１類型、すなわち、適応により作製されたウマイン
フルエンザウィルスの少なくとも１つのゲノム分節を有するリアソータントイン
フルエンザウィルスを調製する適切な工程は、次の工程を含む：（ａ）好適には
弱毒性、温度感受性または優性干渉性の表現型も有する供与低温適応性ウマイン
フルエンザウィルスのゲノム分節を、受容インフルエンザＡ型ウィルスのゲノム
分節と混合することと、（ｂ）供与ウマインフルエンザウィルスの少なくとも１
つの認識表現型を有するリアソータントウィルスを選別すること。選別を行うた
めの認識表現型は、弱毒性、低温適応性、温度感受性及び優性干渉性を含む。こ
れらの表現型を判別する方法は、当業者に周知であり、それらをここに開示する
。少なくとも弱毒性の表現型を持つウィルスについて判別検査を行うことが望ま
しい。

【００５２】低温適応により作製されたウマインフルエンザウィルスの少なくとも１つのゲ
ノム分節を有するリアソータントインフルエンザＡ型ウィルスを、この方法を用
いて作製する時、選別されるリアソータントウィルスの１類型は、「６＋２」リ
アソータントである。このウィルスの６つの「内部遺伝子分節」、すなわち、Ｎ
Ｐ、ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、Ｍ及びＮＳ遺伝子をコードする分節は、供与低温適
応性ウマインフルエンザウィルスのゲノムに由来し、また、２つの「外部遺伝子
分節」、すなわち、ＨＡ及びＮＡ遺伝子をコードする分節は、受容インフルエン
ザＡ型ウィルスに由来する。このようにして作製されたウィルスは、供与低温適
応性ウマインフルエンザウィルスの低温適応性、弱毒性、温度感受性及び／又は
干渉性表現型を有するが、受容株の抗原性は有しない。

【００５３】本発明は、ウマインフルエンザウィルス野生型系統Ａ／ウマ／ケンタッキー／
１／９１（Ｈ３Ｎ８）及び低温適応性ウマインフルエンザウィルスＥＩＶ−Ｐ８
２１から分離された核酸分子を含む。

【００５４】本発明によれば、分離された核酸分子とは、自然環境から隔離された（すなわ
ち、人間により操作されてきた）核酸分子であり、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または、Ｄ
ＮＡまたはＲＮＡのいずれかの誘導体であってもよい。従って、「分離された」
という用語は、核酸分子が精製されている程度を反映するものではない。

【００５５】本発明は、野生型及び低温適応性ウマインフルエンザウィルスタンパク質をコ
ードする核酸分子を含む。本発明の核酸分子を、当業者に周知の方法で作製して
もよい。本発明のタンパク質を、当業者に周知の方法、すなわち、組換えＤＮＡ
技術により作製してもよい。好適な核酸分子は、核酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ：
１，ＳＥＱＩＤＮＯ：３，ＳＥＱＩＤＮＯ：４，ＳＥＱＩＤＮＯ：６，ＳＥＱＩＤＮＯ：７，ＳＥＱＩＤＮＯ：９，ＳＥＱＩＤＮＯ：１０，ＳＥＱＩＤＮＯ：１２，ＳＥＱＩＤＮＯ：１３
，ＳＥＱＩＤＮＯ：１５，ＳＥＱＩＤＮＯ：１６，ＳＥＱＩＤＮＯ：１８，ＳＥＱＩＤＮＯ：１９，ＳＥＱＩＤＮＯ：２１，ＳＥＱＩＤＮＯ：２２，ＳＥＱＩＤＮＯ：２３，ＳＥＱＩＤＮ
Ｏ：２５及び／又はそれらの相補体を含むコドン鎖を有する。相補体は、核酸の
２本の一本鎖であり、そのヌクレオチド配列が全長にわたって塩基対合すること
によりハイブリッドを形成するようなものとして定義される。ヌクレオチド配列
が分かれば、当業者はその相補体を導き出すことが可能である。

【００５６】ウマインフルエンザＭタンパク質をコードする好適な核酸分子は、ｎｅｉ_ｗｔＭ_１０２３，ｎｅｉ_ｗｔ１Ｍ_１０２３，ｎｅｉ_ｗｔ２Ｍ_１０２３，ｎｅｉ _ｗｔＭ_７５６，ｎｅｉ_ｗｔ１Ｍ_７５６，ｎｅｉ_ｗｔ２Ｍ_７５６，ｎｅｉ_ｃ _ａ１Ｍ_１０２３，ｎｅｉ_ｃａ２Ｍ_１０２３，ｎｅｉ_ｃａ１Ｍ_７５６及び／
又はｎｅｉ_ｃａ２Ｍ_７５６であり、それらのコドン鎖は、ＳＥＱＩＤＮＯ：
１，ＳＥＱＩＤＮＯ：３，ＳＥＱＩＤＮＯ：４及び／又はＳＥＱＩＤＮＯ：６で表される。

【００５７】ウマインフルエンザＨＡタンパク質をコードする好適な核酸分子は、ｎｅｉ_ｗ _ｔＨＡ_１７６２，ｎｅｉ_ｗｔＨＡ_１６９５，ｎｅｉ_ｃａ１ＨＡ_１７６２，ｎｅｉ_ｃａ２ＨＡ_１７６２，ｎｅｉ_ｃａ１ＨＡ_１６９５及び／又はｎｅｉ_ｃａ _２ＨＡ_１６９５であり、それらのコドン鎖は、ＳＥＱＩＤＮＯ：７，ＳＥ
ＱＩＤＮＯ：９，ＳＥＱＩＤＮＯ：１０及び／又はＳＥＱＩＤＮ
Ｏ：１２で表される。

【００５８】ウマインフルエンザＰＢ２−Ｎタンパク質をコードする好適な核酸分子は、ｎ
ｅｉ_ｗｔＰＢ２−Ｎ_１２４１，ｎｅｉ_ｗｔＰＢ２−Ｎ_１２１４，ｎｅｉ_ｃａ _１ＰＢ２−Ｎ_１２４１ｎｅｉ_ｃａ２ＰＢ２−Ｎ_１２４１，ｎｅｉ_ｃａ１ＰＢ
２−Ｎ_１２１４ｎｅｉ_ｃａ２及び／又はＰＢ２−Ｎ_１２１４であり、それらの
コドン鎖は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３，ＳＥＱＩＤＮＯ：１５，ＳＥ
ＱＩＤＮＯ：１６及び／又はＳＥＱＩＤＮＯ：１８で表される。

【００５９】ウマインフルエンザＰＢ２−Ｃタンパク質をコードする好適な核酸分子は、ｎ
ｅｉ_ｗｔ１ＰＢ２−Ｃ_１２３３，ｎｅｉ_ｗｔ２ＰＢ２−Ｃ_１２３２，ｎｅｉ _ｗｔＰＢ２−Ｃ_１１９４，ｎｅｉ_ｃａ１ＰＢ２−Ｃ_１２３２，ｎｅｉ_ｃａ２ＰＢ２−Ｃ_１２３１及び／又はｎｅｉ_ｃａ１ＰＢ２−Ｃ_１１９４であり、それら
のコドン鎖は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１９，ＳＥＱＩＤＮＯ：２２，Ｓ
ＥＱＩＤＮＯ：２１，ＳＥＱＩＤＮＯ：２３及び／又はＳＥＱＩＤ
ＮＯ：２５で表される。

【００６０】本発明は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２，ＳＥＱＩＤＮＯ：５，ＳＥＱＩＤＮＯ：８，ＳＥＱＩＤＮＯ：１１，ＳＥＱＩＤＮＯ：１４，ＳＥＱＩＤＮＯ：１７，ＳＥＱＩＤＮＯ：２０及び／又はＳＥＱＩＤＮＯ：２４を有するタンパク質と、これらのタンパク質をコードする核酸
分子とを含む。

【００６１】本発明の好適なウマインフルエンザＭタンパク質は、ｎｅｉ_ｗｔＭ_１０２３，
ｎｅｉ_ｗｔ１Ｍ_１０２３，ｎｅｉ_ｗｔ２Ｍ_１０２３，ｎｅｉ_ｗｔＭ_７５６，ｎｅｉ_ｗｔ１Ｍ_７５６，ｎｅｉ_ｗｔ２Ｍ_７５６，ｎｅｉ_ｃａ１Ｍ_１０２ _３，ｎｅｉ_ｃａ２Ｍ_１０２３，ｎｅｉ_ｃａ１Ｍ_７５６及び／又はｎｅｉ_ｃａ _２Ｍ_７５６を有する核酸分子によりコードされるタンパク質を含む。好適なウマ
インフルエンザＭタンパク質は、Ｐｅｉ_ｗｔＭ_２５２，Ｐｅｉ_ｃａ１Ｍ_２５２及び／又はＰｅｉ_ｃａ２Ｍ_２５２である。一実施例においては、本発明の好適な
ウマインフルエンザＭタンパク質は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１，ＳＥＱＩＤ
ＮＯ：３，ＳＥＱＩＤＮＯ：４及び／又はＳＥＱＩＤＮＯ：６によ
りコードされ、従って、ＳＥＱＩＤＮＯ：２及び／又はＳＥＱＩＤＮＯ
：５を含むアミノ酸配列を有する。

【００６２】本発明の好適なウマインフルエンザＨＡタンパク質は、ｎｅｉ_ｗｔＨＡ_１７６ _２，ｎｅｉ_ｗｔＨＡ_１６９５，ｎｅｉ_ｃａ１ＨＡ_１７６２，ｎｅｉ_ｃａ２ＨＡ_１７６２，ｎｅｉ_ｃａ１ＨＡ_１６９５及び／又はｎｅｉ_ｃａ２ＨＡ_１６９ _５を有する核酸分子によりコードされるタンパク質を含む。好適なウマインフル
エンザＨＡタンパク質は、ＰＰｅｉ_ｗｔＨＡ_５６５，Ｐｅｉ_ｃａ１ＨＡ_５６ _５及び／又はＰｅｉ_ｃａ２ＨＡ_５６５である。一実施例においては、本発明の好
適なウマインフルエンザＨＡタンパク質は、ＳＥＱＩＤＮＯ：７，ＳＥＱ
ＩＤＮＯ：９，ＳＥＱＩＤＮＯ：１０及び／又はＳＥＱＩＤＮＯ
：１２によりコードされ、従って、ＳＥＱＩＤＮＯ：８及び／又はＳＥＱＩＤＮＯ：１１を含むアミノ酸配列を有する。

【００６３】本発明の好適なウマインフルエンザＰＢ２−Ｎタンパク質は、ｎｅｉ_ｗｔＰＢ
２−Ｎ_１２４１，ｎｅｉ_ｗｔＰＢ２−Ｎ_１２１４，ｎｅｉ_ｃａ１ＰＢ２−Ｎ _１２４１ｎｅｉ_ｃａ２ＰＢ２−Ｎ_１２４１，ｎｅｉ_ｃａ１ＰＢ２−Ｎ_１２１ _４ｎｅｉ_ｃａ２及び／又はＰＢ２−Ｎ_１２１４を有する核酸分子によりコード
されるタンパク質を含む。好適なウマインフルエンザＰＢ２−Ｎタンパク質は、
Ｐ_ｗｔＰＢ２−Ｎ_４０４，Ｐ_ｃａ１ＰＢ２−Ｎ_４０４及び／又はＰ_ｃａ２ＰＢ
２−Ｎ_４０４である。一実施例においては、本発明の好適なウマインフルエンザ
ＰＢ２−Ｎタンパク質は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３，ＳＥＱＩＤＮＯ：
１５，ＳＥＱＩＤＮＯ：１６及び／又はＳＥＱＩＤＮＯ：１８により
コードされ、従って、ＳＥＱＩＤＮＯ：１４及び／又はＳＥＱＩＤＮＯ
：１７を含むアミノ酸配列を有する。

【００６４】本発明の好適なウマインフルエンザＰＢ２−Ｃタンパク質は、ｎｅｉ_ｗｔ１Ｐ
Ｂ２−Ｃ_１２３３，ｎｅｉ_ｗｔ２ＰＢ２−Ｃ_１２３２，ｎｅｉ_ｗｔＰＢ２−
Ｃ_１１９４，ｎｅｉ_ｃａ１ＰＢ２−Ｃ_１２３２，ｎｅｉ_ｃａ２ＰＢ２−Ｃ_１ _２３１及び／又はｎｅｉ_ｃａ１ＰＢ２−Ｃ_１１９４を有する核酸分子によりコー
ドされるタンパク質を含む。好適なウマインフルエンザＰＢ２−Ｎタンパク質は
、Ｐ_ｗｔＰＢ２−Ｃ_３９８，Ｐ_ｃａ１ＰＢ２−Ｃ_３９８及び／又はＰ_ｃａ２ＰＢ２−Ｃ_３９８である。一実施例においては、本発明の好適なウマインフルエ
ンザＰＢ２−Ｃタンパク質は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１９，ＳＥＱＩＤＮ
Ｏ：２２，ＳＥＱＩＤＮＯ：２１，ＳＥＱＩＤＮＯ：２３及び／又
はＳＥＱＩＤＮＯ：２５によりコードされ、従って、ＳＥＱＩＤＮＯ：
２０及び／又はＳＥＱＩＤＮＯ：２４を含むアミノ酸配列を有する。

【００６５】核酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ：１は、ここでｎｅｉ_ｗｔ１Ｍ_１０２３及びｎ
ｅｉ_ｗｔ２Ｍ_１０２３として表される、ＰＣＲ増幅された核酸分子のコドン鎖か
ら導き出されたコンセンサス配列を表し、その製法については例の項で開示する
。核酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ：４は、ここでｎｅｉ_ｃａ１Ｍ_１０２３及びｎ
ｅｉ_ｃａ２Ｍ_１０２３として表される、ＰＣＲ増幅された核酸分子のコドン鎖か
ら導き出された配列を表し、その製法については例の項で開示する。核酸配列Ｓ
ＥＱＩＤＮＯ：７は、ここでｎｅｉ_ｗｔＨＡ_１７６２として表される、ＰＣ
Ｒ増幅された核酸分子のコドン鎖から導き出された配列を表し、その製法につい
ては例の項で開示する。核酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ：１０は、ここでｎｅｉ_ｃ _ａ１ＨＡ_１７６２及びｎｅｉ_ｃａ２ＨＡ_１７６２として表される、ＰＣＲ増幅さ
れた核酸分子のコドン鎖から導き出された配列を表し、その製法については例の
項で開示する。核酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ：１３は、ここでｎｅｉ_ｗｔＰＢ
２−Ｎ_１２４１として表される、ＰＣＲ増幅された核酸分子のコドン鎖から導き
出された配列を表し、その製法については例の項で開示する。核酸分子ＳＥＱＩＤＮＯ：１６は、ここでｎｅｉ_ｃａ１ＰＢ２−Ｎ_１２４１及びｎｅｉ_ｃａ _２ＰＢ２−Ｎ_１２４１として表される、ＰＣＲ増幅された核酸分子のコドン鎖か
ら導き出された配列を表し、その製法については例の項で開示する。核酸配列Ｓ
ＥＱＩＤＮＯ：１９は、ここでｎｅｉ_ｗｔ１ＰＢ２−Ｃ_１２３３として表さ
れる。ＰＣＲ増幅された核酸分子のコドン鎖から導き出された配列を表し、その
製法については例の項で開示する。核酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ：２２は、ここ
でｎｅｉ_ｗｔ２ＰＢ２−Ｃ_１２３２として表される、ＰＣＲ増幅された核酸分子
のコドン鎖から導き出された配列を表し、その製法については例の項で開示する
。核酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ：２３は、ここでｎｅｉ_ｃａ１ＰＢ２−Ｃ_１２３ _２として表される、ＰＣＲ増幅された核酸分子のコドン鎖から導き出された配列
を表し、その製法については例の項で開示する。さらなる核酸分子、核酸配列、
タンパク質及びアミノ酸配列については、例の項で説明する。

【００６６】本発明は、ＳＥＱＩＤＮＯ：５を持つアミノ酸配列を有するＭタンパク質
をコードする低温適応性ウマインフルエンザウィルスを含有する核酸分子を含む
。本発明の別の一実施例は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１１を持つアミノ酸配列を有
するＨＡタンパク質をコードする低温適応性ウマインフルエンザウィルスを含有
する核酸分子を含む。本発明の別の一実施例は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１７を持
つアミノ酸配列を有するＰＢ２−Ｎタンパク質をコードする低温適応性ウマイン
フルエンザウィルスを含有する核酸分子を含む。本発明の別の一実施例は、ＳＥ
ＱＩＤＮＯ：２４を持つアミノ酸配列を有するＰＢ２−Ｃタンパク質をコー
ドする低温適応性ウマインフルエンザウィルスを含有する核酸分子を含む。

【００６７】核酸の配列決定技術は誤りが全くないわけではないため、ここで表される核酸
配列及びアミノ酸配列は、それぞれ、本発明の核酸分子の見かけの核酸配列と、
本発明の見かけのＭ，ＨＡ，及びＰＢ２−Ｎ，及びＰＢ２−Ｃタンパク質
をそれぞれ表すことに留意されたい。

【００６８】本発明の別の一実施例は、本発明の野生型ウィルスＭ，ＨＡ，ＰＢ２−Ｎ
，ＰＢ２−Ｃ，ＰＢ２タンパク質と選択的に結合する抗体である。本発明の
別の一実施例は、本発明の低温適応性ウィルスＭ，ＨＡ，ＰＢ２−Ｎ，Ｐ
Ｂ２−Ｃ，ＰＢ２と選択的に結合する抗体である。好適な抗体は、ＳＥＱＩ
ＤＮＯ：２，ＳＥＱＩＤＮＯ：５，ＳＥＱＩＤＮＯ：８，ＳＥ
ＱＩＤＮＯ：１１，ＳＥＱＩＤＮＯ：１４，ＳＥＱＩＤＮＯ：
１７，ＳＥＱＩＤＮＯ：２０及び／又はＳＥＱＩＤＮＯ：２４と選
択的に結合する。

【００６９】以下の例は説明の目的で提供されるものであり、本発明の範囲を限定するもの
としては意図されていない。

【００７０】例１本例は、本発明の複数の低温適応性ウマインフルエンザウィルスの製法及び表
現型の特徴を説くものである。

【００７１】Ａ．親ウマインフルエンザウィルスＡ／ウマ／ケンタッキー／１／９１（Ｈ３
Ｎ８）（ケンタッキー州レキシントン、ケンタッキー大学、トム・チャンバ
ーズより入手）を、外来宿主種、すなわち、ふ化鶏卵中で、次の方法で低温適応
させた。例えば、メリーランド州チェスタータウン、トラスロー・ファームまた
アイオワ州アデル、ハイバック社より入手可能な、ふ化後１０日目または１１日
目の鶏卵の殻に穿孔した小さな孔を介して、尿膜腔内に、約１０^６プラーク形成
単位（ｐｆｕ）の親ウマインフルエンザウィルスを含有する約０．１ミリリット
ル（ｍｌ）の非希釈ＡＦを注射することにより、このウィルスを接種した。これ
らの孔を、マニキュア液で密封した後、これらの卵を、加湿したインキュベータ
内で、適切な温度で３日間インキュベートした。インキュベート後、これらの卵
を検卵し、無生育性の卵をすべて廃棄した。卵殻の一部を無菌的に除去し、滅菌
ピンセットで尿漿膜（ＣＡＭ）を剥がし、ＡＦを滅菌ピペットで取り出して、
生育可能な胚からＡＦを回収した。回収したＡＦを、次の継代培養まで冷凍した
。次に、このＡＦを、未希釈の状態で、または表１に示したように、リン酸緩衝
生理食塩水（ＰＢＳ）で１０００倍に希釈して使用し、２回目以降の継代培養に
用いる新たな卵をインキュベートした。合計６９回の継代培養を行った。初期の
継代培養は、約３４℃（継代１−２回目）または約３０℃で行い、それ以降の継
代培養では、培養温度を約２８℃または約２６℃に低下させた。安定した弱毒性
のウィルスの所望の表現型の選択の可能性を高めるため、表１に示すように、初
回の連続継代を、連続継代培養ツリーの５つの異なる枝、ＡからＥまでに展開し
た。

【００７２】

【表１】

【００７３】Ｂ．セクションＡに記載の低温適応法で得られたウィルス分離株の温度感受性
、すなわち、当該低温適応ウィルスが比較的低温または許容温度（例えば約３４
℃）では生育するが、比較的高温または非許容温度（例えば約３７℃）ではプラ
ークを形成しないような表現型について、下記のように検査を行った。低温適応
継代培養の各回に、ＡＦをプラークアッセイで約３４℃で力価測定した。アッセ
イを行った個々のプラークのプラーク領域を周期的に切り出し、切り出した寒天
培地を、ＭＤＣＫ細胞の単層を含有する９６ウェルのトレイに置いて、当該プラ
ークをクローン分離した。この９６ウェル・トレイを一晩インキュベートし、そ
の産物の温度感受性を、約３４℃及び約３９℃でインキュベートした複製９６ウ
ェル・トレイで、ＣＰＥアッセイによりアッセイした。このアッセイにより温度
感受性変異体であるとして判別されたクローンのパーセント、すなわち、３４℃
では生育するが３９℃では生育しないウィルス性のプラークの数を、プラークの
総数で割ったものを算出し、図２に示す。次に、温度感受性分離株の非許容温度
でのタンパク合成について、放射線標識されたウィルス合成タンパク質をＳＤＳ
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で視覚化することによ
り、測定した。

【００７４】

【表２】

【００７５】温度感受性について検査を行ったクローン分離株から、２つを選択してさらな
る検査に使用した。表１に示すように、クローンＥＩＶ−Ｐ８２１を枝Ｂの継代
４９回目から選択し、また、クローンＥＩＶ−Ｐ８２４を枝Ｃの継代４８回目か
ら選択した。これらのウィルス分離株は、両方とも温度感受性であり、どちらの
分離株のプラーク形成も、温度約３９℃で阻害された。この温度では、タンパク
質合成はＥＩＶ−Ｐ８２１では完全に阻害されたが、ＥＩＶ−Ｐ８２４は通常の
レベルのタンパク質合成を示した。加えて、ＥＩＶ−Ｐ８２１のプラーク形成は
、温度約３７℃で阻害され、また、この温度では、後期遺伝子発現が阻害された
。すなわち、ＮＰタンパク質合成は通常レベルであり、Ｍ１またはＨＡタンパク
質の合成は少ないか全く行われず、ポリメラーゼタンパク質の合成レベルは高か
った。ウィルス特異的なタンパク質合成を特徴とする、３７℃で観察された表現
型は、すべてのウィルスタンパク質合成の阻害を特徴とする、３９℃で観察され
た表現型とは異なる。ウィルスＥＩＶ−Ｐ８２１は、アメリカン・タイプ・カル
チャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に、受託番号ＡＴＣＣＶＲ−＿＿＿＿＿で
寄託され、また、ウィルスＥＩＶ−Ｐ８２４は、ＡＴＣＣに受託番号ＡＴＣＣ
ＶＲ−＿＿＿＿＿で寄託されている。

【００７６】Ｃ．分離株ＥＩＶ−Ｐ８２１の突然変異のさらなる特徴を、リアソートメント
分析により、次のように明らかにした。インフルエンザウィルスのリアソートメ
ント分析により、当業者は、いくつかの条件下で、任意のウィルスの表現型と、
あるインフルエンザＡ型ウィルスゲノムを有する８つのＲＮＡ分節の複数に発生
していると推定される突然変異とを関連づけることができる。この技術は、例え
ばＰａｌｅｓｅ，ｅｔａｌ．，同上、に説明されている。ＥＩＶ−Ｐ８２
１と、鳥類インフルエンザウィルス、Ａ／マガモ／ニューヨーク／６７５０／７
８との混合感染を、次のように行った。ＭＤＣＫ細胞とＥＩＶ−Ｐ８２１との共
感染を、感染多重度（ＭＯＩ）２ｐｆｕ／細胞で、また、ＭＤＣＫ細胞とＡ／マ
ガモ／ニューヨーク／６７５０／７８との共感染を、ＭＯＩ２、５、または１０
ｐｆｕ／細胞で行った。感染した細胞を、温度約３４℃でインキュベートした。
これら様々な共感染の産物を力価測定し、個々のプラークを約３４℃で分離した
。そして、その結果得られたクローン分離株について、約３９℃及び約３７℃で
生育できるか否か、また、約３９℃、約３７℃及び約３４℃で遺伝子発現、すな
わち、ウィルスタンパク質の合成ができるか否かを調べた。タンパク質の合成を
、放射線標識された感染細胞の溶解産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により評価した
。これら２つの親ウィルスのＨＡ、ＮＰ及びＮＳ−１タンパク質は、それぞれ分
離ゲノム分節でコードされ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で区別可能である。なぜなら
、これらの各ウィルスタンパク質は、ウマまたは鳥類インフルエンザウィルスの
いずれかに由来し、異なる見掛け分子量で移動するからである。このような方法
で、少なくともＨＡ、ＮＰ及びＮＳ−１遺伝子については、親ウィルスの温度感
受性表現型やタンパク質合成表現型などのいくつかの表現型が、これらの遺伝子
を有するゲノム分節と共分離するか否かを調べることができる。ＥＩＶ−Ｐ８２
１のＨＡ、ＮＰ及びＮＳ−１タンパク質のそれぞれについて、ａ）非許容温度
約３９℃でのプラーク形成を阻害する、すなわち、ＣＰＥを誘発する突然変異、
またはｂ）非許容温度約３９℃でのタンパク質合成を阻害する突然変異の共分離
を、リアソートメント分析により調べ、その結果を表３及び表４にそれぞれ示す
。

【００７７】

【表３】

【００７８】

【表４】

【００７９】検査の結果、ウマＮＰ遺伝子と、非許容温度約３９℃でＥＩＶ−Ｐ８２１のプ
ラーク形成を阻害する突然変異との関連性が示された。しかし、ＨＡ、ＮＰまた
はＮＳ−１遺伝子のいずれについても、非許容温度約３９℃でＥＩＶ−Ｐ８２１
のウィルスタンパク質発現を阻害する突然変異との関連性は示されなかった。従
って、これらのデータは、ウィルスＥＩＶ−Ｐ８２１のプラーク形成表現型とタ
ンパク質合成表現型とが、異なる突然変異の結果であることも示した。

【００８０】Ｄ．本発明の低温適応性ウマインフルエンザウィルスが優性干渉性表現型を持
つか否か、すなわち、野生型親ウィルスＡ／ケンタッキー／１／９１（Ｈ３Ｎ８
）との混合感染の場合にこれらのウィルスを抑制するか否か．についても研究を
行った。ウィルスＥＩＶ−Ｐ８２１及びＥＩＶ−Ｐ８２４の優性干渉性表現型を
、次の方法で測定した。ＭＤＣＫ細胞の分離単層を、親ウィルスＡ／ケンタッキ
ー／１／９１（Ｈ３Ｎ８）にＭＯＩ２で単感染させるか、低温適応性ウィルスＥ
ＩＶ−Ｐ８２１またはＥＩＶ−Ｐ８２４のいずれかにＭＯＩ２で単感染させるか
、又は、これら親ウィルスと、低温適応性ウィルスの１つとにＭＯＩ２＋２で同
時に二重感染させた。このときの温度はいずれの場合も約３４℃であった。感染
後２４時間で、培養株から培地を採取し、これらの様々な感染細胞からのウィル
ス産生を測定した。測定は、温度約３４℃及び約３９℃の複製プラークアッセイ
で行った。このアッセイでは、低温適応性ウマインフルエンザウィルスＥＩＶ−
Ｐ８２１またはＥＩＶ−Ｐ８２４が温度感受性であり、従って、非許容温度約３
９℃ではプラークを形成できないが、親ウィルスはいずれの温度でもプラークを
形成できるため、これら低温適応性ウィルスの存在下でも親ウィルスの生育を測
定できるという事実を利用した。具体的には、これらの低温適応性ウィルスがこ
の親ウィルスの生育に及ぼす優性干渉作用を、約３９℃で親ウィルスに単感染さ
せた細胞のウィルス産出量と、二重感染させた細胞の親ウィルス産出量とを比較
することにより、定量した。ＥＩＶ−Ｐ８２１は、混合感染で、親ウィルスの産
出量をおよそ２００分の１まで減少させることができ、また、ＥＩＶ−Ｐ８２４
は、混合感染で、親ウィルスの産出量をおよそ３２００分の１まで減少させるこ
とができた。従って、このアッセイは、低温適応性ウマインフルエンザウィルス
ＥＩＶ−Ｐ８２１及びＥＩＶ−Ｐ８２４が、両方とも優性干渉性表現型を発揮す
ることを示した。

【００８１】Ｅ．ウィルス分離株ＥＩＶ−ＭＳＶ＋５を、次の方法でＥＩＶ−Ｐ８２１から
誘導した。ＥＩＶ−Ｐ８２１を、上述の方法で卵内で１回継代培養し、ここでＥ
ＩＶ−ＭＳＶ０として表されるマスター・シード・ウィルス分離株を作製した。
次に、ＥＩＶ−ＭＳＶ０を、卵内でさらに３回継代培養し、各回の終了毎に得ら
れたウィルス分離株を、それぞれＥＩＶ−ＭＳＶ＋１、ＥＩＶ−ＭＳＶ＋２、Ｅ
ＩＶ−ＭＳＶ＋３とした。ＥＩＶ−ＭＳＶ＋３を、次の方法で、ＭＤＣＫ細胞内
でさらに２回継代培養した。ＭＤＣＫ細胞を、１５０ｃｍ^２の組織培養フラスコ
中で、子ウシ血清を１０％含むハンクス液のＭＥＭ組織培養培地で生育させた。
次に、細胞を滅菌ＰＢＳで洗浄し、生育培地を、フラスコ当たり約８ｍｌの感染
培地（ハンクス液、１μｇ／ｍｌのＴＰＣＫトリプシン溶液、０．１２５％のウ
シ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び１０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファからなるＭＥＭ
組織培養培地）と取り替えた。ＭＤＣＫ細胞に、ウィルスＥＩＶ−ＭＳＶ＋３（
ＭＤＣＫ細胞の継代培養１回目）またはＥＩＶ−ＭＳＶ＋３（ＭＤＣＫ細胞の継
代培養２回目）から採取したウィルスストックを含有するＡＦを接種し、これら
のウィルスを約３４℃で１時間吸収させた。接種物を細胞単層から取り除いた後
、細胞を再度ＰＢＳで洗浄し、フラスコ当たり約１００ｍｌの感染培地を加えた
。感染した細胞を、約３４℃で２４時間インキュベートした。フラスコを強く揺
すって細胞単層を破砕することにより、ウィルス感染したＭＤＣＫ細胞を採集し
、ウィルス分離株ＥＩＶ−ＭＳＶ＋４（ＭＤＣＫ細胞の継代培養１回目）及びＥ
ＩＶ−ＭＳＶ＋５（ＭＤＣＫ）細胞の継代培養２回目）を得た。

【００８２】ウィルスＥＩＶ−ＭＳＶ０及びＥＩＶ−ＭＳＶ＋５の表現型を、上記セクショ
ンＢで述べた方法で分析し、これらのウィルスが温度約３４℃、約３７℃及び約
３９℃でプラーク形成及びタンパク質合成を行う能力を測定した。ＥＩＶ−ＭＳ
Ｖ０及びＥＩＶ−ＭＳＶ＋５は、いずれも温度約３４℃では組織培養細胞内でプ
ラークを形成したが、温度約３９℃では、いずれのウィルス分離株も、プラーク
形成または検出可能なウィルスタンパク質合成を行わなかった。ウィルスＥＩＶ
−ＭＳＶ０は、温度約３７℃でＥＩＶ−Ｐ８２１と類似した温度感受性表現型を
示した。すなわち、プラーク形成の阻害及び後期遺伝子発現の阻害が見られた。
しかし、ＥＩＶ−ＭＳＶ＋５の場合は、その親ウィルスＥＩＶ−Ｐ８２１とは異
なり、温度約３７℃で、組織培地内でプラークを形成し、また、この温度で、全
てのタンパク質を通常量合成した。ウィルスＥＩＶ−ＭＳＶ＋５は、受託番号Ａ
ＴＣＣＶＲ−＿＿＿＿＿でＡＴＣＣに寄託されている。

【００８３】例２本発明の治療用組成を、次の方法で作製した。

【００８４】Ａ．ＥＩＶ−Ｐ８２１の大量のストックを、次の方法で卵内で増殖させた。約
６０個のＳＰＦふ化鶏卵を検卵し、無生育卵を廃棄した。ストックウィルスを、
滅菌ＰＢＳで、約１．０×１０^５ｐｆｕ／ｍｌに希釈した。ウィルスを、例１Ａ
で説明した方法で、卵の尿膜腔に接種した。加湿したインキュベータで、温度約
３４℃で３日間インキュベートした後に、例１Ａで説明した方法で、ＡＦを卵か
ら採取した。採取したＡＦを、例えばアイオワ州デモイン、ダイアモンド・アニ
マル・ヘルス社より入手可能なＡ１／Ａ２安定化剤などの安定化剤液と、２５％
Ｖ／Ｖ（安定化剤／ＡＦ）で混合した。採取したＡＦを遠心分離管内でバッチに
して、旋回バケットロータを取り付けたＩＥＣＣｅｎｔｒａ−７Ｒ冷却卓上遠
心機中で、１０分間、１０００ｒｐｍで遠心分離して清澄化させた。清澄化した
液体を、１−ｍｌ冷凍バイアルに入れ、約−７０℃で冷凍した。ウィルスストッ
クを、ＭＤＣＫ細胞中で、約３４℃で、ＣＰＥ及びプラークアッセイにより力価
測定した。

【００８５】Ｂ．ＥＩＶ−Ｐ８２１の大量のストックを、次の方法でＭＤＣＫ細胞内で増殖
させた。ＭＤＣＫ細胞を、１５０ｃｍ^２の組織培養フラスコ中で、子ウシ血清を
１０％含むハンクス液のＭＥＭ組織培養培地で生育させた。次に、細胞を滅菌Ｐ
ＢＳで洗浄し、生育培地を、フラスコ当たり約８ｍｌの感染培地と取り替えた。
ＭＤＣＫ細胞を、ウィルスストックに、細胞当たり約０．５ｐｆｕから細胞当た
り約０．００５ｐｆｕの範囲のＭＯＩで接種し、ウィルスを約３４℃で１時間吸
収させた。接種物を細胞単層から取り除いた後、細胞を再度ＰＢＳで洗浄し、フ
ラスコ当たり約１００ｍｌの感染培地を加えた。感染した細胞を、約３４℃で２
４時間インキュベートした。フラスコを強く揺すって細胞単層を破砕することに
より、ウィルス感染したＭＤＣＫ細胞を採集し、安定化剤をフラスコに２５％Ｖ
／Ｖ（安定化剤／ウィルス溶液）で加えた。上清を無菌的に冷凍バイアルに入れ
て、−７０℃で冷凍した。

【００８６】Ｃ．本発明のいくつかの低温適応性温度感受性ウマインフルエンザウィルスを
含む治療用組成を、以下の方法で製剤した。ワクチン接種工程の直前に、以下の
例３−７に記載されているように、ＥＩＶ−Ｐ８２１又はＥＩＶ−ＭＳＶ＋５の
保存バイアルを解凍し、水またはＰＢＳを含む賦形剤、または、０．１２５％の
ウシ血清アルブミンを含有するハンクス液を加えたＭＥＭ組織培養培地（ＢＳＡ
−ＭＥＭ溶液）に希釈し、動物への接種のための所望の濃度とした。このワクチ
ン組成を、投与前に氷冷した。全ての治療用組成を、ワクチン接種の直前に、Ｍ
ＤＣＫ細胞で、標準的な方法で力価測定し、また、動物に投与された組成と同一
に処理された一定量の組成を、可能な方法で、ワクチン接種後力価測定し、ウィ
ルスが工程の間生育可能であり続けるようにした。

【００８７】例３低温適応性ウマインフルエンザウィルスＥＩＶ−Ｐ８２１を含有する治療用組
成の安全性と複製能力とを、ウマインフルエンザウィルスに対する検出可能な免
疫をすでに持っている３頭のウマで次のように検査した。例１で説明した方法で
作製したＥＩＶ−Ｐ８２１を、例２Ａで説明した方法により卵内で生育させ、こ
れを用いて例２Ｃに述べた１０^７ｐｆｕＥＩＶ−Ｐ８２１／２ｍｌＢＳＡ−
ＭＥＭ溶液を含有する治療用組成を調剤した。

【００８８】ウマインフルエンザウィルスに対する検出可能なヘマグルチニン阻害（ＨＡＩ
）価をすでに持っている３頭の子馬に、ＥＩＶ−Ｐ８２１を含有する治療用組成
を、次の方法で接種した。各子馬に２−ｍｌ量のＥＩＶ−Ｐ８２１を、偽鼻孔に
十分に届く長さのブラント・カニューレを嵌めた注射器を用いて、各鼻孔に１ｍ
ｌずつ経鼻投与した。

【００８９】これらの子馬の、くしゃみ、唾液分泌過多、呼吸困難または呼吸異常、ふるえ
、過敏症、または発熱などの即時型アレルギー反応を、ワクチン投与直後約３０
分間及び約４時間後に観察した。これらの動物の、惰眠や食欲低下などの遅延型
アレルギー反応を、ワクチン接種後１日目から１１日目にわたってさらに観察し
た。この研究では、３頭の子馬のいずれも、ワクチン接種によるアレルギー反応
を示さなかった。

【００９０】これらの子馬の、ウマインフルエンザに一致する臨床症状を、ワクチン接種の
２日前からワクチン接種後１１日目まで、毎日ほぼ同じ時刻に観察した。これら
の子馬の鼻汁、眼球分泌物、食欲低下、気質、心拍数、毛細血管レフィル時間、
呼吸数、呼吸困難、肺音、上歯肉上の中毒線の出現及び体温を観察した。加えて
、顎下及び腹壁のリンパ節を触診し、異常を記述した。この研究に使用した３頭
の子馬のいずれも、観察期間中、いかなる異常反応または顕性の臨床症状も示さ
なかった。

【００９１】これらの動物のウィルス放散を検査するために、Ｃｈａｍｂｅｒｓ，ｅｔａｌ．，１９９５，ＥｑｕｉｎｅＰｒａｃｔｉｃｅ，１７，１９−２
３．Ｃｈａｍｂｅｒｓ，ｅｔａｌ．，同上に記載されている方法で
、ワクチン接種後０日目から１１日目にわたって、子馬の鼻咽頭スワブを採取し
た。簡単に言うと、これらの子馬のそれぞれの鼻孔に、２本の滅菌ダクロンポリ
エステルチップアプリケータ（例えばメイン州ギルフォード、ハードウッド・プ
ロダクツ社より入手可能）を同時に挿入した。スワブ（合計４本、各鼻孔毎に２
本）を、５％のグリセロール、ペニシリン、ストレプトマイシン、ネオマイシン
及びゲンタマイシンを含有する生理的ｐＨのＰＢＳからなる冷却輸送培地２．５
ｍｌを入れた１５−ｍｌコニカル遠心分離管内に折り入れた。サンプルを湿らせ
た氷上に保持しながら、スワブを無菌的に培地中に絞り出し、鼻咽頭サンプルを
２つのアリコートに分けた。アリコートの１つを使用して、例１に記載の方法で
、ふ化鶏卵接種によるＥＩＶの分離を行った。次に、接種された鶏卵のＡＦの赤
血球凝集能力を、標準的な方法で検査したところ、当該ＡＦ中にウマインフルエ
ンザウィルスの存在が確認された。ワクチン接種後２日目及び３日目に、もう１
つのアリコートを使用して、ベクトン−ディッキンソン社（メリーランド州コッ
キーズヴィル）より入手可能なＤｉｒｅｃｔｉｇｅｎ（登録商標）ＦｌｕＡテ
ストによるウィルス検査を行った。

【００９２】これら３頭の動物の鼻咽頭分泌物から、卵接種によりＥＩＶを分離しようとし
た試みは、失敗に終わった。しかし、２日目及び３日目に、検査した全ての動物
がＤｉｒｅｃｔｉｇｅｎＦｌｕＡテストによるウィルス放散検査で陽性を示
した。このことは、ＥＩＶ−Ｐ８２１が血清陽性の子馬の体内で複製を行うとい
う仮説を裏付けるものである。

【００９３】本例に述べた被接種動物および例４−７に述べた動物のＥＩＶに対する抗体価
を検査するために、ワクチン接種前及び、ワクチン接種後の指定日に当該動物か
ら血液を採取した。血清を分離し、トリプシン／過ヨウ素酸塩またはカオリンの
いずれかで処理し、通常の血清に見られる赤血球凝集反応の非特異インヒビター
を阻害した。新鮮なＥＩＶ分離株に抗する血清サンプルの赤血球凝集反応阻害（
ＨＡＩ）価を、例えば連邦規則コード９の１１３．２に基づき、Ｕ．Ｓ．Ｄ．Ａ
．国立獣医学実用試験所（ＮａｔｉｏｎａｌＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＳｅｒｖ
ｉｃｅｓＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）提供の「ウマインフルエンザウィルス抗体の
赤血球凝集反応阻害アッセイを行うための補助的アッセイ」（ＳＡＭ１２４）
に記載の標準的な方法で検査した。

【００９４】当該３頭の子馬のＨＡＩ価を、表５に示す。図示されるように、ＥＩＶ−Ｐ８
２１接種後の３頭の動物すべてにおいて、血清ＨＡＩ価は、初期価に関係なく、
少なくとも４倍に増加した。

【００９５】これらのデータは、低温適応性ウマインフルエンザウィルスＥＩＶ−Ｐ８２１
が、安全かつ非反応発生性であることを示し、また、これらの動物が、すでに証
明可能な価を持っている場合でも、ウマインフルエンザウィルス抗体価を増加さ
せたことを示している。

【００９６】

【表５】

【００９７】例４この例では、低温適応性ウマインフルエンザウィルスＥＩＶ−Ｐ８２１を含有
する治療用組成の安全性と有効性を評価するための動物研究を開示する。

【００９８】低温適応性ウマインフルエンザウィルスＥＩＶ−Ｐ８２１を含有する治療用組
成を、弱毒性及び、ビルレントウマインフルエンザウィルスの攻撃からウマを保
護する能力について、以下のように検査した。例１に記載の方法で作製されたＥ
ＩＶ−Ｐ８２１を、例２Ａに記載の方法で卵内で生育させ、例２Ｃに記載の方法
で、ウィルス１０^７ｐｆｕ／水２ｍｌを含有する治療用組成を調製した。８頭の
ＥＩＶ−血清陰性の子馬を本研究に使用した。これら８頭の子馬のうち３頭に、
例３で記載した方法と同様の方法で、ＥＩＶ−Ｐ８２１治療用組成を１０^７ｐｆ
ｕ含有するワクチンを２−ｍｌ経鼻接種した。１頭の子馬にＥＩＶ−Ｐ８２１治
療用組成を１０^７ｐｆｕ経口投与した。投与は、６ｍｌのウィルスを、以下の方
法で細かい霧を発生するようにした１０−ｍｌ注射器を用いて、咽頭に注入する
ことによりなされた。針を取り付けるための突出した「台（ｓｅａｔ）」を、モ
デリング・クレイを用いて密封し、キャップを正しく閉めた。２５ゲージの針を
用いて、注射器の底部、すなわち、「台（ｓｅａｔ）」の周囲に約１０個の孔を
開けた。注射器を歯間隙内に入れ、ウィルスを口の裏側に強制的に注入した。残
り４頭の子馬を、非ワクチン接種対照動物とした。

【００９９】ワクチン接種された子馬の即時型アレルギー反応を、ワクチン接種直後約３０
分間及び約４時間後に観察し、さらに、これらの子馬の遅延型アレルギー反応を
ワクチン接種後１日目から１１日目にわたって観察した。ともに例３に記載の方
法で行った。この研究に用いたこれら４頭のワクチン接種された子馬のいずれも
、ワクチン接種による異常な反応を示さなかった。

【０１００】例３に記載の方法で、ウィルスワクチン接種の２日前から接種後１１日目まで
毎日ほぼ同じ時刻に、これらの子馬の臨床症状を観察した。この研究でワクチン
接種された４頭の子馬のいずれも、観察期間中にいかなる臨床症状も示さなかっ
た。この結果、低温適応性ウマインフルエンザウィルスＥＩＶ−Ｐ８２１が弱毒
性表現型を発揮することが立証された。

【０１０１】これらのワクチン接種動物のウィルス放散を検査するために、ワクチン接種後
０日目から１１日目にわたって、例３に記載の方法で、鼻咽頭スワブをこれらの
子馬から採取した。例３に記載の方法で、この鼻咽頭サンプルのウィルスを、ふ
化鶏卵中で検査した。

【０１０２】表６に示すように、この鶏卵法では、ウィルスは１頭のワクチン接種動物のみ
から分離された。しかし、例３で述べたように、この方法でウィルスが分離され
なかったことにより、ウィルスの複製の事実が否定されるわけではない。なぜな
ら、より感度の高い、例えばＤｉｒｅｃｔｉｇｅｎＦｌｕＡテストのような
方法では、複製が検出されるかもしれないからである。

【０１０３】

【表６】

【０１０４】これらのワクチン接種された動物中のウマインフルエンザウィルスに対する抗
体価を測定するために、ワクチン接種前及びワクチン接種後７日目、１４日目、
２１日目及び２８日目に、これらの動物から血液を採取した。例３に記載の方法
に基づき、血清サンプルを分離し、新鮮なＥＩＶ分離株に対する赤血球凝集阻害
（ＨＡＩ）価を測定した。

【０１０５】これら４頭のワクチン接種された子馬のＨＡＩ価を表７に示す。

【０１０６】

【表７】

【０１０７】例３に述べた研究で用いられた３頭の動物では、ＨＡＩ価の増加が観察された
が、それとは異なり、この例の研究で用いられた動物では、ＥＩＶ−Ｐ８２１ワ
クチン接種後、ＨＡＩ価の著しい増加、すなわち、４倍を超える増加は観察され
なかった。

【０１０８】ワクチンウィルスの投与後およそ４ヶ月半目に、８頭全ての子馬、すなわち、
ワクチン接種された４頭と非ワクチン接種対照動物である４頭とに、以下の処置
を施した。１頭毎に、ビルレントウマインフルエンザウィルス株Ａ／ウマ／ケン
タッキー／１／９１（Ｈ３Ｎ８）１０^７ｐｆｕを水５ｍｌに懸濁した。マスク
をネブライザに接続し、このマスクを、これらの動物の鼻孔を含めた鼻鏡部に被
せた。５ｍｌを１頭毎に噴霧した。このとき、５ｍｌ全部を噴霧するのに５−１
０分かかるように調節した。処置の３日前及び処置後１１日間の毎日、例３に記
載した方法で臨床観察を行った。

【０１０９】ワクチン接種されたこれらの動物のウマインフルエンザウィルスに対するＨＡ
Ｉ価に著しい増加が見られなかったという事実にもかかわらず、ワクチン接種さ
れた４頭の動物はすべて、ウマインフルエンザウィルスの攻撃から保護された。
ワクチン接種された動物はいずれも顕性の臨床症状を示さなかった。ただし、そ
のうち１頭に微弱な喘鳴が２日間見られた。一方、ワクチン接種されたかった４
頭はいずれもウィルスを放散し、ウマインフルエンザウィルス感染に特有の臨床
症状及び発熱を示した。従って、この例は、本発明の治療用組成が、ウマをウマ
インフルエンザ疾患から保護可能であることを実証している。

【０１１０】例５この例では、低温適応性ウマインフルエンザウィルスＥＩＶ−Ｐ８２１を含有
する治療用組成の弱毒性と、ワクチン接種されたウマを、その後のビルレントウ
マインフルエンザウィルスの攻撃から保護する能力とを評価するためのさらなる
動物研究を開示する。さらに、この研究では、運動ストレスがこの治療用組成の
安全性と有効性に及ぼす効果についても評価した。

【０１１１】低温適応性ウマインフルエンザウィルスＥＩＶ−Ｐ８２１を含有する治療用組
成の安全性と有効性とを、ウマを用いて次のように検査した。例１に記載の方法
で作製したＥＩＶ−Ｐ８２１を、例２Ａに記載の方法で卵内で生育させ、例２Ｃ
に記載した方法で、ウィルス１０^７ｐｆｕ／水５ｍｌを含有する治療用組成を調
製した。この研究では、１５頭の子馬を使用した。これらの子馬を、表８に示す
ように、それぞれ５頭からなる３つのグループに無作為に分けた。そのうち２つ
のグループにはワクチンを接種し、１つのグループは非接種対照グループとした
。グループ２の子馬には、ワクチン接種前に運動ストレスを与えたが、接種グル
ープ１の子馬は厩舎に留置した。

【１１２】

【表８】

【０１１３】グループ２の子馬について、次の方法でトレッドミル運動ストレス試験を行っ
た。これらの子馬に、トレッドミルを歩行のみで６時間使用させ、慣れさせた。
実際の運動負荷ストレス試験では、ワクチン接種の４日前からワクチン接種当日
（ワクチン接種直前）まで、毎日運動させた。トレッドミル運動の内容を表９に
示す。

【１１４】

【表９】

【０１１５】グループ１及びグループ２に、例４に述べた処置で用いた噴霧方法により、Ｅ
ＩＶ−Ｐ８２１を１０^７ｐｆｕ含有する治療用組成を投与した。この研究でワク
チン接種した子馬のいずれも、このワクチン接種による即時型または遅延型アレ
ルギー反応を示さなかった。

【０１１６】これらの子馬の、例３で述べた臨床症状を、ワクチン接種の２日前からワクチ
ン接種後１１日目までの毎日、ほぼ同じ時刻に観察した。この研究でワクチン接
種した子馬のいずれも、観察期間中に顕性の臨床症状を示さなかった。

【０１１７】ワクチン接種した動物のウィルス放散を検査するために、ワクチン接種前及び
ワクチン接種後１日目から１１日目にかけて、例３に記載した方法で、これらの
子馬から鼻咽頭スワブを採取した。これらの鼻咽頭サンプルのウィルスを、ふ化
鶏卵内で、例３に記載の方法に従って検査した。表１０に示すように、ウィルス
を、ワクチン接種した動物、すなわち、グループ１及び２から分離した。

【１１８】

【表１０】

【０１１９】ワクチン接種されたこれらの動物のウマインフルエンザウィルスに対する抗体
価を検査するために、ワクチン接種前及びワクチン接種後７日目、１４日目、２
１日目及び２８日目に血液を採取した。例３に記載の方法に従って、血清サンプ
ルを分離し、最近のＥＩＶ分離株に対するＨＡＩ価を検査した。これらの価を表
１１に示す。

【１２０】

【表１１】

【０１２１】接種後９０日目に、１５頭すべての子馬を、ネブライザを用いて、例４に記載
の方法により１０^７ｐｆｕのウマインフルエンザウィルス株Ａ／ウマ／ケンタッ
キー／１／９１（Ｈ３Ｎ８）で攻撃した。例３に記載した臨床症状の観察を、
すべての動物について、攻撃の３日前及び、攻撃後１１日間の毎日行った。ワク
チン接種した動物のいずれも、顕性の臨床症状を示さなかった。ワクチンを接種
しなかった５頭のうち４頭は、ウマインフルエンザウィルス感染に特有の発熱及
び臨床症状を示した。

【０１２２】従って、この例は、本発明の治療用組成は、ウマにワクチン投与前にストレス
を与えた場合でも、これらのウマをウマインフルエンザウィルスから保護するこ
とを実証するものである。

【０１２３】例６この例では、本発明の治療用組成の感染力を、卵内で生育させた場合と組織培
養細胞中で生育させた場合とで比較した。製剤的見地からすると、本発明の治療
用組成を、ふ化鶏卵内で生育させるよりも、組織培養細胞中で生育させる方が有
利である。ウマインフルエンザウィルスは、しかし、細胞内では、卵内ほど高力
価にまで生育しない。加えて、このウィルスが感染力を得るためには、ウィルス
のヘマグルチニンに、トリプシンのようなタンパク分解酵素による細胞外タンパ
ク分解開裂が必要である。血清にはトリプシン抑制物質が含まれるので、細胞培
養で生育したウィルスに感染力を付与するためには、トリプシンを含む無血清培
地中で増殖させなければならない。このような条件が、組織培養細胞の生存力の
点では決して最適ではないことは、当業者に周知である。さらに、これらの生育
条件のために、ウマ細胞との結合性が変化したウィルスが選別されるかもしれな
いが、そのためにウィルスの感染力が影響を受けるかもしれない。なぜなら、ウ
ィルスは、複製及び免疫刺激を行うためには、動物の鼻粘膜に効率的に結合する
必要があるからである。従って、この例で開示した研究は、本発明の治療用組成
の感染力が、インヴィトロ組織培養における多数の継代にわたる生育により、逆
に影響を受けるかどうかを評価することを目的とする。

【０１２４】例１に記載の方法で作製したＥＩＶ−Ｐ８２１を、例２Ａに記載の方法で卵内
で生育させるか、または、例２Ｂに記載の方法でＭＤＣＫ細胞内で生育させる。
どちらの場合も、ウィルスを５回継代培養した。各継代毎に、ＥＩＶ−Ｐ８２１
の低温適応性表現型及び温度感受性表現型を検査した。これらの卵及び細胞継代
ウィルス調製物を、例２Ｃで述べたように、ウィルス１０^７ｐｆｕ／ＢＳＡ−Ｍ
ＥＭ溶液２ｍｌを含む治療用組成に製剤し、卵培養ＥＩＶ−Ｐ８２１治療用組成
と、ＭＤＣＫ細胞培養ＥＩＶ−Ｐ８２１治療用組成とをそれぞれ得た。

【０１２５】８頭の子馬をこの研究に使用した。それぞれの動物から採取した血清の、ウマ
インフルエンザウィルスに対するＨＡＩ価を、この研究に先立って検査した。こ
れらの動物を、それぞれ４頭からなる２つのグループに無作為に分けた。グルー
プＡには、卵培養ＥＩＶ−Ｐ８２１治療用組成を投与し、グループＢには、例２
Ｂの方法で調製したＭＤＣＫ培養ＥＩＶ−Ｐ８２１治療用組成を投与した。これ
らの治療用組成を、例３Ｃに記載の方法で経鼻投与した。

【０１２６】これらの子馬の、例３に記載したアレルギー反応または臨床症状を、ワクチン
接種の２日前からワクチン接種後１１日目まで、毎日ほぼ同じ時刻に観察した。
これらの動物のいずれも、アレルギー反応または顕性の臨床症状を示さなかった
。

【０１２７】ワクチン接種前及びワクチン接種後１１日間の毎日、鼻咽頭スワブを採取した
。鼻スワブ中のウィルス物質の存在を、例１に記載したように、ＭＤＣＫ細胞の
ＣＰＥを検出することにより、または、例３に記載したように、卵へ接種し、感
染したＡＦが赤血球凝集を起こす能力を調べることにより、測定した。検査した
のは、ウィルスの存在についてのみであり、サンプル中のウィルスの力価につい
ては検査しなかった。ウィルス分離の結果を表１２に示す。血液を採取し、ワク
チン接種後０日目、７日目、１４日目、２１日目及び２８日目の血清サンプルの
、新鮮分離株に対する赤血球凝集阻害抗体価を検査した。ＨＡＩ価も表１２に示
す。

【０１２８】

【表１２】

【０１２９】表１２の結果は、卵培養ＥＩＶ−Ｐ８２１治療用組成とＭＤＣＫ培養ＥＩＶ−
Ｐ８２１治療用組成との間で、感染性も免疫抗原性も著しい差がなかったことを
示している。例７

【０１３０】この例では、ウマをウマインフルエンザウィルス感染から保護するために必要
な、低温適応性ウマインフルエンザウィルスを含有する治療用組成の最小量を評
価した。

【０１３１】例３から例６で開示した動物研究により、本発明の治療用組成が有効かつ安全
であることが示された。これらの研究で用いられた投与量は１０^７ｐｆｕであり
、これは約１０^８ＴＣＩＤ_５０単位に相当する。しかし、費用及び安全面から考
えると、ウマインフルエンザウィルスに起因する疾患からウマを保護するであろ
う最小ウィルス力価を用いると有利である。この研究では、低温ウマインフルエ
ンザウィルスを含有する治療用組成の４種類の異なる量を子馬にワクチン接種し
、ビルレントウマインフルエンザウィルスの攻撃からウマを保護する最小量を決
定した。

【０１３２】例１Ａに記載の方法で作製したＥＩＶ−Ｐ８２１を、例２Ｂに記載の方法でＭ
ＤＣＫ細胞内で継代培養して生育させ、例２Ｃに記載したように、２×１０^４、
２×１０^５、２×１０^６または２×１０^７ＴＣＩＤ_５０単位／ＢＳＡ−ＭＥＭ溶
液１ｍｌの治療用組成を製剤した。様々に異なる年齢及び血統の１９頭のウマ
を使用した。これらのウマを、３頭のグループ１つと４頭のグループ３つからな
る４つのワクチングループと、４頭からなる対照グループ１つとに分けた（表１
３参照）。ワクチングループの各子馬に、例３に記載したのと同様の方法で、指
示された治療用組成を１−ｍｌ量投与した。

【０１３３】

【表１３】

【０１３４】これらの子馬の即時型反応を、ワクチン接種直後約３０分間及びワクチン接種
後約４時間後に観察し、また、これらの動物の遅延型反応を、ワクチン接種後１
日目から１１日目にかけて観察した。ともに例３に記載の方法を用いた。この研
究では、これらのワクチン接種した動物のいずれも、ワクチン接種による異常な
反応や顕性の臨床症状を示さなかった。

【０１３５】ワクチン接種の３日前、ワクチン接種後７日目、１４日目、２１日目、２８日
目、及びワクチン接種後３５日目及び４２日目の攻撃後に、血清分析用の血液を
採集した。例３に記載の方法に従い、新鮮なＥＩＶ分離株に抗するＨＡＩ価につ
いて、血清サンプルを検査した。これらの価を表１４に示す。２９日目の攻撃の
前に、グループ１の３頭のうち２頭、グループ２の４頭のうち４頭、グループ３
の４頭のうち３頭及びグループ４の４頭のうち４頭のＨＡＩ価が、ワクチン接種
後少なくとも４倍に増加した。加えて、４頭の対照ウマのうち２頭も、ＨＡＩ価
が増加した。この結果に対する説明の一つとして、対照ウマが、ワクチン接種さ
れたウマのワクチンウィルスに感染したのかもしれない。なぜなら、この研究で
用いたウマはすべて同じ厩舎で飼育されていたからである。

【０１３６】

【表１４】

【０１３７】ワクチン接種後２９日目に、１９頭の子馬すべてを、例４に記載のネブライザ
法を用いて、ウマインフルエンザウィルス株Ａ／ウマ／ケンタッキー／１／９１
（Ｈ３Ｎ８）で攻撃した。攻撃の投与量を見込み計算し、１頭当たり、容量５ｍ
ｌに約１０^８ＴＣＩＤ_５０単位の攻撃ウィルスが含まれるようにした。攻撃の２
日前、攻撃当日及び攻撃後１１日間、例３に記載された臨床観察を行った。表１
４に示されるように、グループ１及び２のいずれの動物も、ウマインフルエンザ
疾患の臨床症状を示さず、また、グループ３の４頭のうち１頭だけが罹患した。
グループ４の４頭のうち２頭が罹患し、また、４頭の対照動物のうち２頭だけが
罹患した。表１４の結果は、血清変換と疾患からの保護との関連性を示唆してい
る。なぜなら、例えば、ワクチン接種期間中にＨＡＩ価が増加した２頭の対照動
物は、攻撃後はウマインフルエンザ疾患の臨床症状を示さなかったからである。
しかし、別の解釈として、攻撃ウィルスの実際の力価が、計算した量１０^８ＴＣ
ＩＤ_５０単位よりも少なかったのかもしれない。なぜなら、前出の結果に基づけ
ば、このレベルの攻撃は、全ての対照動物を罹患させたはずだからである。

【０１３８】それでもなお、低温適応性ウマインフルエンザウィルスを少なくとも２×１０ ^６ＴＣＩＤ_５０単位含む治療用組成を投与されたグループにおける血清変換
のレベル及び臨床症状の欠如は、この量が、ウマインフルエンザ疾患からウマを
保護するのに十分な量であったことを示唆している。さらに、２×１０^５ＴＣ
ＩＤ_５０単位の投与で血清変換が誘発され、４頭のうち３頭が攻撃から臨床的
に保護されたことから、この量でも、ウマをウマインフルエンザウィルスから効
果的に保護するのには十分であるのかもしれない。

【０１３９】例８この例では、低温適応性ウマインフルエンザウィルスＥＩＶ−Ｐ８２１を含有
する治療用組成の免疫性の持続時間を評価するための動物研究について開示する
。

【０１４０】例１に記載の方法で作製した低温適応性ウマインフルエンザウィルスＥＩＶ−
Ｐ８２１を含有する治療用組成を、例２Ａに記載した方法と同様に卵内で生育さ
せ、例２Ｂに記載した方法と同様にＭＤＣＫ細胞内で継代培養により展開し、例
２Ｃに記載した方法と同様に治療用組成に製剤した。生後およそ１１ヶ月から１
２ヶ月の３０頭のウマをこの研究に使用した。これらのうち１９頭のそれぞれに
、ＥＩＶ−Ｐ８２１治療用組成ＴＣＩＤ_５０単位を６ｌｏｇ含む投与量１．０ｍ
ｌをのワクチンを、端部に送出装置の先端を取り付けた注射器を使用して、片方
の鼻孔に経鼻接種した。ワクチン接種を０日目に行った。

【０１４１】これらのウマを、０日目（ワクチン接種前及びワクチン接種後４時間以内）及
び、ワクチン接種後の研究日１日目、２日目、３日目、７日目、１５日目及び１
６９日目に観察した。これらの日に、少なくとも１５分間の遠隔検査を行った。
この遠隔検査には、様子、行動、咳、くしゃみ及び鼻汁の観察が含まれた。１６
９日目の検査でも、これらのウマは、ワクチン接種場所から約３６０マイル離れ
た攻撃場所までの輸送に適する健康状態であったことが確認された。

【０１４２】これらの動物は攻撃場所に慣らされ、ほぼ毎日、獣医師または動物専門技術者
により疾患の徴候を観察された。ワクチン接種後１７１日目に、次の項目につい
て、一般的な身体検査を行った：様子、行動、咳、くしゃみ及び鼻汁。１７２日
目から１７７日目までは、これらのウマそれぞれの異常な臨床症状を観察する担
当獣医の判断に基づき、同様の検査に加えて、直腸温を記録した。

【０１４３】ワクチン接種したウマのいずれも、ワクチン接種後に有害反応を示さなかった
。そのうち１頭は、ワクチン接種の約２ヶ月後に死亡した。このウマは、ワクチ
ン接種後少なくとも１ヶ月間の観察時には、有害反応の徴候を全く示さなかった
。死因を確定することはできないとしても、死亡は突発的なものではなく、疝痛
、骨折または重症の寄生虫性の負担などの要因と関連があるのではないかと考え
られた。他のワクチン接種したウマには、ワクチン接種後に有害反応は見られな
かったので、この場合、ワクチンが何らかの有害反応の原因となったとは考えに
くい。

【０１４４】ワクチン接種後１８１日目に攻撃を行った。ウマの疾患を引き起こすことが予
め確認されている、次のウマインフルエンザウィルスの野生型分離株：Ａ／ウマ
／２／ケンタッキー／９１を、攻撃ウィルスとして使用した。各攻撃グループの
感染の前に、攻撃材料を約３７度で急速解凍した。ウィルスをリン酸緩衝生理食
塩水で希釈し、総量約２１ｍｌとした。この希釈した材料を、接種の直前まで氷
冷保存した。各攻撃グループの接種前及び噴霧終了時に、希釈した攻撃ウィルス
のサンプルを採集して、接種前及び接種後のウィルス力価を確認した。ワクチン
接種ウマと対照ウマとを、それぞれ６頭からなる４つの攻撃グループと、５頭か
らなる１つの攻撃グループとに無作為に分け、各攻撃グループが、４頭のワクチ
ン接種ウマと２頭の対照ウマ、または３頭のワクチン接種ウマと２頭の対照ウマ
の組み合わせから構成されるようにした。

【０１４５】エアロゾル状態の攻撃ウィルスを、超音波ネブライザ（例えばデビルビス・モ
デル０９９ＨＤ，ペンシルベニア州サマセット、デビルビス・ヘルスケア社）
を用いて、プラスチックのシーリングの中央に開けた小さな孔から挿入した管を
介して、約１０分間投与した。噴霧終了後さらに約３０分間、これらのウマをチ
ャンバ内に留置した（曝露時間合計約４０分間）。この時点でプラスチックを取
り除いてチャンバを換気し、これらのウマを解放してそれぞれの厩舎に戻した。
この攻撃工程を各グループについて繰り返した。

【０１４６】この研究における統計手法には、すべてＳＡＳ（ノースカロライナ州ケアリー
、ＳＡＳインスティテュート社）を使用し、Ｐ＜０．０５を統計上有意であると
した。ワクチン接種後１７８日目（攻撃３日前）から１９１日目（攻撃後１０日
目）まで、これらのウマを遠隔検査及び個体検査の双方により、毎日観察した。
この時、直腸温を測定した。０日目（攻撃当日）から攻撃後１０日目までのデー
タを分析に使用し、表１５に示す。

【０１４７】

【表１５】

【０１４８】表１５は、攻撃後２日目から８日目まで、ワクチン接種ウマの温度が、ワクチ
ン非接種対照ウマの温度よりも低い（Ｐ＜０．０５）ことを示している。

【０１４９】遠隔検査の時間は２０分間であり、その中で次の観察を行った：咳、鼻汁、呼
吸及び抑うつ。採点基準を表１６に示す。

【０１５０】

【表１６】

【０１５１】それぞれのウマを、これらの各カテゴリについて採点した。加えて、顎下リン
パ節を触診し、細菌感染の有無を調べた。同じ日に行われた観察で、遠隔検査の
主観臨床症状スコアと個別検査の主観臨床症状スコアとが異なる場合は、結果の
整理分析の際に、大きい方のスコアを用いた。最終処理の前にこれらのウマの健
康状態を評価する目的で、攻撃後１４日目、１８日目及び２１日目に遠隔検査を
行った。この分析には、攻撃後１日目から１０日目までのデータも使用した。こ
れらのスコアを１頭毎に日別に合計し、ウィルコクソン順位合計検定により、ワ
クチン接種ウマと対照ウマとを比較した。さらに、１頭毎に全ての日のスコアを
合計し、同じ方法で比較した。平均順位及び平均臨床スコアを、表１７及び表１
８にそれぞれ示す。接種後５日目では、ワクチン接種ウマのスコアの平均順位は
、ワクチン非接種対照ウマのスコアの平均順位よりも低かった（Ｐ＜０．０５）
。そして、この結果は、６日目、７日目、８日目、９日目及び１０日目でも同様
であった（Ｐ＜０．０５）。検査期間全体の累積順位についても、ワクチン接種
ウマの方がワクチン非接種対照ウマよりも低かった（Ｐ＜０．０５）。

【０１５２】

【表１７】

【０１５３】

【表１８】

【０１５４】鼻咽頭スワブを、例３で述べたように、攻撃前日及び攻撃後１日目から８日目
にかけて採取し、放散されたウィルスを細胞培養アッセイにより検査した。攻撃
ウィルスを放散していたウマの各グループのパーセンテージを、表１９に示す。
攻撃ウィルスを放散していたウマのワクチン接種グループでのパーセントは、攻
撃後５日目及び６日目では、非ワクチン接種対照グループでのパーセントよりも
低かった（Ｐ＜０．０５）。攻撃ウィルスが放散された平均日数も、ワクチン接
種グループは、非ワクチン接種対照グループよりも低かった（Ｐ＜０．０５）。

【０１５５】

【表１９】

【０１５６】ワクチン接種グループのインフルエンザに関係する臨床徴候スコア及び客観的
温度測定のスコアは共に、対照グループと比較して低く、その差は統計的に有意
であった；このことは、このワクチンが疾患からの著しい保護効果を有すること
を説明するものである。

【０１５７】攻撃後にウマがインフルエンザウィルスを放散する能力についても、攻撃後の
複数の日の放散陽性のウマの出現率と、１頭当たりの放散日数とが、共に、ワク
チン接種グループの方が対照グループよりも著しく少なかった。ワクチン接種グ
ループによる放散が少ないというこの事実は、重要な意味を持つ。なぜなら、こ
のことが、インフルエンザ流行時に、感受性の動物が野生型ウィルスに曝露され
る潜在的な可能性を減少させるのに役立つと予想されるからである。

【０１５８】この研究の結果は、このワクチンが、ウマインフルエンザに起因する臨床疾患
を６ヶ月間安全に防止し、天然に発生するビルレントウマインフルエンザウィル
スの放散の可能性を減少させたということを説明するものである。疾患からの保
護の程度は完全ではないが（ワクチン接種された１９頭のうち１３頭が保護され
たのに対し、１０頭の対照ウマのうち１０頭が罹患した）、臨床疾患の重度及び
期間は明らかに軽減され、また、ウマインフルエンザのビルレント株への曝露後
にウィルスが放散する潜在的な可能性に大きな影響を与えた。ワクチン接種ウマ
と対照ウマとが、免疫接種後６ヶ月目の攻撃の直前に、双方とも血清陰性であっ
たという結果は、血清抗体以外の何かにより伝達される免疫力が、このワクチン
の測定可能なかつ恒久性の保護能力を最も大きく左右するのかもしれないという
ことを示唆している。

【０１５９】例９この例では、低温適応性ウマインフルエンザウィルスＥＩＶ−Ｐ８２１を含有
する治療用組成の、ウマインフルエンザウィルスの異種株への曝露後の疾患を予
防する能力を評価するための動物研究を開示する。

【０１６０】検査に使用した異種株は、遺伝学的にはユーラシア系統株（サスカチェワン大
学、ヒューゴ・タウンセンドより入手）として述べられるＡ／ウマ／２／サスカ
トゥーン／９０であった。２０頭の約１５月齢（ワクチン接種時）のペルシュロ
ン種の雌ウマを、有効性研究に使用した。これらのウマを、１０頭からなるワク
チン接種グループと、１０頭からなるワクチン非接種対照グループとの２グルー
プに分けた。０日目に、例８に述べた方法でワクチン接種グループにワクチンを
接種した。

【０１６１】攻撃材料、すなわちウマインフルエンザ株Ａ／ウマ／２／サスカトゥーン／９
０［Ｈ３Ｎ８］を、例８で述べた製法と同様の方法で調製した。ワクチン接種ウ
マと対照ウマとを、それぞれ５頭からなる４つの攻撃グループに無作為に分け、
各攻撃グループが２頭のワクチン接種ウマと３頭の対照ウマ、または３頭のワク
チン接種ウマと２頭の対照ウマから構成されるようにした。攻撃の工程は、例８
で述べた工程と同様であった。ワクチン接種後２８日目に攻撃を行った。

【０１６２】ワクチン接種ウマと対照ウマとの臨床観察を、ワクチン接種４日前と、研究日
０日目（ワクチン接種前からワクチン接種後４時間まで）、１日目から７日目、
１２日目、１５日目から１７日目まで、１９日目から２３日目、２５日目から３
８日目、及び４２日目に行った。ワクチン接種４日前からワクチン接種後４２日
目までの間の臨床観察日に、１頭毎に、異常な臨床症状を観察する担当獣医の判
断に基づき、直腸温を含めた臨床観察を記録した。例８（表１５）で使用したの
と同じ基準を用いて、ウマのスコアをつけた。これらの日に、例８で述べた遠隔
検査を行った。２０日目及び２５日目から３８日目にかけては、これらのウマを
遠隔検査と個別検査の両方により（例８で述べたのと同じ方法で）観察した。

【０１６３】直腸温を、攻撃の３日前から攻撃後１０日目まで毎日測定した。攻撃０日目は
攻撃の当日である。攻撃後０日目から１０日目までのデータを分析に使用した。
例８で使用したのと同じ統計的手法と基準とを用いた。攻撃後２日目、５日目及
び７日目には、ワクチン接種されたウマは、非ワクチン接種対照ウマよりも統計
上有意的に低い体温を示した（表２０）。

【０１６４】

【表２０】

【０１６５】攻撃後１日目から１０日目までのデータを、分析に使用した。これらのスコア
を１頭毎に日別に合計し、ウィルコクソン順位合計検定により、ワクチン接種ウ
マと対照ウマとを比較した。統計的手法はすべて例９で述べたのと同じ手法を用
いた。さらに、１頭毎に全ての日のスコアを合計し、同じ方法で比較した。平均
順位を表２１に示す。

【０１６６】

【表２１】

【０１６７】接種後４日目では、ワクチン接種ウマのスコアの平均順位は、ワクチン非接種
対照ウマのスコアの平均順位よりも低かった（Ｐ＜０．０５）。そして、この結
果は、この研究の期間全体を通して同じであった（Ｐ＜０．０５）。検査期間全
体の累積順位についても、ワクチン接種ウマの方がワクチン非接種対照ウマより
も低かった（Ｐ＜０．０５）。

【０１６８】鼻咽頭スワブを、例３で述べた方法で、攻撃後１日目から８日目にかけて採集
した。鼻サンプルを、ウィルスの存在について分析した。分析は、細胞に接種し
て、細胞変性効果（ＣＰＥ）によりウィルスを検出するか、または、卵に接種し
て、赤血球凝集（ＨＡ）によりウィルスを検出して行った。細胞培養アッセイを
、Ｙｏｕｎｇｎｅｒｅｔａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ．３２，７５０−７５４に概説されている方法で行った。連続
的に希釈した鼻サンプルを、マディン・ダービー・イヌ腎臓（ＭＤＣＫ）単層を
含むウェルに加えた。インキュベート後、細胞変性効果の存在及び程度について
、ウェルを検査した。ウィルスのＴＣＩＤ^５０単位量を、リード−ミュエンチ法
により算出した。例１に述べた方法で、卵感染性アッセイを行った。各グループ
で攻撃ウィルスを放散していたウマのパーセンテージを、アッセイ別に表２２及
び表２３に示す。ワクチン接種グループでは、攻撃後２日目から７日目までの間
に攻撃ウィルスを放散していたウマのパーセントは、どちらの方法でも比較的低
かった（Ｐ＜０．０５）。攻撃後１日目または８日目は、差異が見られなかった
。また、攻撃ウィルス放散日数も、ワクチン接種グループの方が、非ワクチン接
種対照グループよりも低かった（Ｐ＜０．０５）；表２２及び表２３を参照のこ
と。

【０１６９】

【表２２】

【０１７０】

【表２３】

【０１７１】ワクチン接種グループのインフルエンザ臨床徴候の程度（重度及び期間）は、
対照グループと比較して概ね軽かった。インフルエンザに関係する臨床徴候のス
コア及び客観的温度測定結果は、共に、ワクチン接種グループの方が対照グルー
プよりも統計的有意に低かった。このことは、このワクチンに、異種株による疾
患からの著しい保護効果があることを示す。

【０１７２】攻撃後にウマがインフルエンザウィルスを放散する能力についても、攻撃後の
複数の日の放散陽性のウマの出現率と、１頭当たりの放散日数とが、共に、ワク
チン接種グループの方が対照グループよりも著しく低かった。ワクチン接種グル
ープによる放散が少ないというこの事実は重要な意味をもつ。なぜなら、このこ
とが、インフルエンザ流行時に、感受性の動物が野生型ウィルスに曝露される可
能性を減少させるのに役立つであろうからである。

【０１７３】総合すると、この研究の結果は、このワクチンが、ユーラシア系ウマインフル
エンザウィルス株の一種による異種攻撃に対する保護効果を発揮したことを示し
た。

【０１７４】例１０この例では、低温適応性ウマインフルエンザウィルスＥＩＶ−Ｐ８２１を含有
する治療用組成の、ウマインフルエンザウィルスの異種株への曝露後の疾患を予
防する能力を評価するための動物研究について開示する。

【０１７５】検査した異種株は、Ａ／ウマ／ケンタッキー／１／９１（Ｈ３Ｎ８）（ケ
ンタッキー大学、トム・チャンバーズより入手）であった。生後５ヶ月から７ヶ
月の８頭の子馬を、この有効性研究に使用した。これらのウマを、ワクチン接種
する４頭と、非ワクチン接種対照の４頭の２グループに分けた。例８に述べた方
法で、０日目に子馬にワクチンを接種した。

【０１７６】研究日０日目（ワクチン接種前及びワクチン接種の４時間後）及び接種後１日
目から８日目まで、２３日目、３０日目から５０日目まで、及び５７日目に、ワ
クチン接種グループの臨床観察を行った。対照グループの臨床観察を、接種後２
９日目から５０日目まで、及び５７日目に行った。例８に述べた方法で、観察及
び採点を行った。

【０１７７】攻撃材料、すなわち、ケンタッキー／９８からのウマインフルエンザ株を、こ
の分離ウィルスを卵内で２回継代培養して作製した。このウィルス０．５ｍｌを
解凍し、次に滅菌リン酸緩衝生理食塩水４．５ｍｌに希釈して、それぞれのウマ
への接種材料を調製した。この接種材料を、ワクチン接種後３６日目に、マスク
を使用した噴霧により、それぞれのウマに投与した。

【０１７８】臨床観察スコアを、日別に１頭毎に合計し、攻撃後１日目から９日目の累積合
計スコアに基づき、ウマを順位付けした。これらの結果を表２４に示す。

【０１７９】

【表２４】

【０１８０】表２４の結果は、ワクチン接種グループのスコアが０から２の間であり、対照
グループのスコア２１から２６までと比較して著しく低かったことを示している
。

【０１８１】攻撃の６日前から攻撃後９日目まで、直腸温を毎日測定した。０日目は攻撃の
当日である。攻撃後０日目から９日目までのデータを分析に使用した。これらの
結果を表２５に示す。

【０１８２】

【表２５】

【０１８３】全ての日で、対照ウマの温度は、ワクチン接種ウマの温度よりも高かった。対
照ウマの温度は、２日目に顕著に高かった。

【０１８４】例３に述べた方法で、攻撃後１日目及び８日目に鼻咽頭スワブを採集した。例
１に述べた卵感染性アッセイにより、これらのサンプルの放散ウィルスを検査し
た。このアッセイの結果を表２６に示す。

【０１８５】

【表２６】

【０１８６】表２６の結果は、１日当たりの陽性ウマの数が、対照グループの方がワクチン
接種グループよりも高かったことを示している。さらに、対照ウマはワクチン接
種ウマよりも陽性を示した日数が多かった。

【０１８７】インフルエンザに関連する臨床徴候のスコア及び客観的温度測定結果は、共に
、ワクチン接種グループと対照グループとの間に著しい相違を示した；このこと
は、このワクチンが、異種株ケンタッキー／９８に起因する疾患からの高い保護
効果を有することを示している。

【０１８８】ウマが攻撃後にインフルエンザウィルスを放散する能力についても、ワクチン
接種グループの１頭当たりの平均放散日数は、対照グループと比較して著しく低
かった。ワクチン接種グループによる放散が少ないというこの事実は重要な意味
をもつ。なぜなら、このことが、インフルエンザ流行時に、感受性の動物が野生
型ウィルスに曝露される可能性を減少させるのに役立つと予想されるからである
。

【０１８９】総合すると、この研究の結果は、このワクチンが、新鮮な及び臨床的に近似し
た分離株による異種攻撃に対する安全な保護効果を有することを示している。こ
の研究結果を、ユーラシア系統株による異種攻撃に対して発揮した保護効果（例
９）に照らして見ると、この調製生ワクチンが、同種ウマインフルエンザ感染だ
けではなく異種ウマインフルエンザ感染に対しても保護効果を有することは明ら
かである。

【０１９０】例１１この例では、野生型及び低温適応性ウマインフルエンザウィルスの、ウマイン
フルエンザＭ（基質）タンパク質核酸分子のクローニング及び配列決定について
説明する。

【０１９１】Ａ．野生型または低温適応性ウマインフルエンザウィルスＭタンパク質をコー
ドする核酸分子を、次の方法で作製した。ウマインフルエンザウィルスＤＮＡ及
び、それぞれＳＥＱＩＤＮＯ：２６及びＳＥＱＩＤＮＯ：２７のプライ
マｗ５８４及びｗ５８５から、ＰＣＲ増幅により、ウマインフルエンザＭ遺伝子
を含有するＰＣＲ産物を作製した。ｎｅｉ_ｗｔＭ_１０２３として表され、核酸配
列ＳＥＱＩＤＮＯ：１のコドン鎖を有する、ヌクレオチド１０２３個からな
る核酸分子を、さらなるＰＣＲ増幅により、上述のＰＣＲ産物を鋳型として作製
し、カリフォルニア州カールズバッド、インヴィトロゲン社より入手可能なｐＣ
Ｒ２．１（登録商標）ＴＡクローニングベクターに、製造者が保証する標準的
な方法でクローニングした。使用したプライマは、ＳＥＱＩＤＮＯ：２９の
Ｔ７プライマ及びＳＥＱＩＤＮＯ：２８のＲＥＶプライマであった。プラス
ミドＤＮＡを、カリフォルニア州バレンシア、キアゲン社より入手可能なミニプ
レップ法で精製した。シークエンシング用のＰＣＲ産物を、それぞれカリフォル
ニア州フォスターシティ、ピーイー・アプライド・バイオシステムズ社より入手
可能な、ＰＲＩＳＭ^ＴＭダイ・ターミネータ・サイクル・シークエンシング・
レディ・リアクション・キット、ＰＲＩＳＭ^ＴＭｄＲｈｏダミン・ターミネー
タ・サイクル・シークエンシング・レディ・リアクション・キット、またはＰＲ
ＩＳＭ^ＴＭＢｉｇＤｙｅ^ＴＭターミネータ・サイクル・シークエンシング・
レディ・リアクション・キットを用いて、製造者のプロトコルに従って作製した
。キットで使用したＰＣＲ条件は、９５℃で１０秒間加熱、５０℃で５秒間加熱
、６０℃で４分間加熱、このサイクルを２５回繰り返した。異なる反応では、異
なるプライマの組み合わせを用いた：第１の反応ではＴ７とＲＥＶ、第２の反応
ではｗ５８４とｗ５８５、第３の反応ではＳＥＱＩＤＮＯ：３１のｅｆＭ−
ａ１及びＳＥＱＩＤＮＯ：３０のｅｆＭ−ｓ１を使用した。ＰＣＲ産物を、
エタノール／塩化マグネシウム沈降法により精製した。ピーイー・アプライド・
バイオシステムズ社より入手可能なＡＢＩＰｒｉｓｍ^ＴＭモデル３７７、Ｘ
ＬアップグレードＤＮＡシークエンサを使用して、ＤＮＡサンプルの自動配列決
定を行った。

【０１９２】ＳＥＱＩＤＮＯ：１を翻訳すると、核酸分子ｎｅｉ_ｗｔＭ_１０２３が、こ
こではＰｅｉ_ｗｔＭ_２５２と言及されるアミノ酸約２５２個からなる全長ウマイ
ンフルエンザＭタンパク質をコードすることが判明し、このタンパク質のアミノ
酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：２で表されるが、ただしこのとき、開いた読み枠
の開始コドンがＳＥＱＩＤＮＯ：１のヌクレオチド２５からヌクレオチド２
８にあり、終了コドンがＳＥＱＩＤＮＯ：１のヌクレオチド７８１からヌク
レオチド７８３にあることを想定している。Ｐｅｉ_ｗｔＭ_２５２をコードする領
域は、ｎｅｉ_ｗｔＭ_７５６で表されるが、この領域は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１
のヌクレオチド２５から７８０までにあるコドン鎖を有し、ＳＥＱＩＤＮＯ
：３で表される。

【０１９３】ＳＥＱＩＤＮＯ：１及びＳＥＱＩＤＮＯ：３は、２つの野生型核酸分
子から得たコンセンサス配列を表し、これらの野生型核酸分子とはヌクレオチド
が１つ異なる。ｎｅｉ_ｗｔ１Ｍ_１０２３のヌクレオチド６６３、すなわち、ｎ
ｅｉ_ｗｔ１Ｍ_７５６のヌクレオチド６４９は、アデニンであるが、ｎｅｉ_ｗｔ２Ｍ_１０２３のヌクレオチド６６３、すなわち、ｎｅｉ_ｗｔ２Ｍ_７５６のヌクレオ
チド６４９は、グアニンであった。これらの配列を翻訳しても、対応するアミノ
酸は変化せず、双方ともＰｅｉ_ｗｔＭ_２５２の残基２２１のバリンに翻訳する
。

【０１９４】Ｂ．低温適応性ウマインフルエンザウィルスＭをコードする１０２３個のヌク
レオチドからなる核酸分子は、ｎｅｉ_ｃａ１Ｍ_１０２３で表され、ＳＥＱＩＤ
ＮＯ：４で表されるコドン鎖を有するが、この核酸分子をさらなるＰＣＲ増幅
により作製し、インヴィトロゲン社より入手可能なｐＣＲ（登録商標）−Ｂｌｕ
ｎｔクローニングベクターに、製造者が保証する標準的な方法でクローニングし
た。このとき使用したプライマはＴ７及びＲＥＶであった。例１１Ａに記載した
方法で、プラスミドＤＮＡ精製及びサイクルシークエンスを行った。ＳＥＱＩ
ＤＮＯ：４を翻訳すると、核酸分子ｎｅｉ_ｃａ１Ｍ_１０２３が、ここではＰｅ
ｉ_ｃａ１Ｍ_２５２と言及されるアミノ酸約２５２個からなる全長ウマインフルエ
ンザＭタンパク質をコードすることが判明し、このタンパク質のアミノ酸配列は
ＳＥＱＩＤＮＯ：５で表されるが、ただしこのとき、開放読み取り枠の開始
コドンがＳＥＱＩＤＮＯ：４のヌクレオチド２５からヌクレオチド２８にあ
り、終了コドンがＳＥＱＩＤＮＯ：４のヌクレオチド７８１からヌクレオチ
ド７８３にあることを想定している。Ｐｅｉ_ｃａ１Ｍ_２５２をコードする領域は
、ｎｅｉ_ｃａ１Ｍ_７５６を指定するが、この領域は、ＳＥＱＩＤＮＯ：４の
ヌクレオチド２５から７８０までにあるコドン鎖を有し、ＳＥＱＩＤＮＯ：
６で表される。低温適応性ウマインフルエンザＭタンパク質をコードする第２の
核酸分子を同じ方法でＰＣＲ増幅し、ｎｅｉ_ｃａ１Ｍ_１０２３と同一の分子ｎ
ｅｉ_ｃａ２Ｍ_１０２３、及びｎｅｉ_ｃａ１Ｍ_７５６と同一の分子ｎｅｉ_ｃａ２Ｍ _７５６を作製した。

【０１９５】Ｃ．ｎｅｉ_ｗｔＭ_１０２３（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）とｎｅｉ_ｃａ１Ｍ_１０ _２３（ＳＥＱＩＤＮＯ：４）のコドン鎖の核酸配列をＤＮＡアライメント
で比較すると、次の相違が判明する：塩基６７のＧがＴに変化、塩基５２７のＣ
がＴに変化、塩基８８６のＧがＣに変化。タンパク質Ｐｅｉ_ｗｔＭ_２５２（ＳＥ
ＱＩＤＮＯ：２）とＰｅｉ_ｃａ１Ｍ_２５２（ＳＥＱＩＤＮＯ：５）と
のアミノ酸配列を比較すると、次の相違が判明する：ＤＮＡ配列の塩基６７のＧ
からＴへの変化に対応する、アミノ酸２３のＶからＬへの変化、及びＤＮＡ配列
の塩基５２７のＣからＴへの変化に対応する、アミノ酸１８７のＴからＩへの変
化。

【０１９６】例１２この例では、野生型または低温適応性ウマインフルエンザウィルスのウマイン
フルエンザＨＡ（ヘマグルチニン）タンパク質核酸分子のクローニング及び配列
決定について説明する。

【０１９７】Ａ．野生型または低温適応性ウマインフルエンザウィルスＨＡタンパク質をコ
ードする核酸分子を、次の方法で作製した。ウマインフルエンザウィルスＤＮＡ
及び、それぞれＳＥＱＩＤＮＯ：３２及びＳＥＱＩＤＮＯ：３３のプラ
イマｗ５７８及びｗ５７９から、ＰＣＲ増幅により、ウマＨＡ遺伝子を含有する
ＰＣＲ産物を作製した。ｎｅｉ_ｗｔＨＡ_１７６２として表され、核酸配列ＳＥＱ
ＩＤＮＯ：７を含むコドン鎖を有する、野生型ＨＡタンパク質をコードする
ヌクレオチド１７６２個からなる核酸分子を、さらなるＰＣＲ増幅により、上述
のＰＣＲ産物を鋳型として作製し、例１１Ａに記載した方法でｐＣＲ２．１（
登録商標）ＴＡクローニングベクターにクローニングした。プラスミドＤＮＡを
、例１１Ａに記載した方法で精製及び配列決定した。ただし、シークエンシング
キットで使用したプライマは、例１１ＡではＴ７及びＲＥＶであったが、この例
では、ＳＥＱＩＤＮＯ：３４で表されるＨＡ−１及びＳＥＱＩＤＮＯ：
３５で表されるＨＡ−２を使用した。

【０１９８】ＳＥＱＩＤＮＯ：７を翻訳すると、核酸分子ｎｅｉ_ｗｔＨＡ_１７６２が、
ここではＰｅｉ_ｗｔＨＡ_５６５と言及されるアミノ酸約５６５個からなる全長ウ
マインフルエンザＨＡタンパク質をコードすることが判明し、このタンパク質の
アミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：８で表されるが、ただしこのとき、開いた
読み枠の開始コドンがＳＥＱＩＤＮＯ：７のヌクレオチド３０からヌクレオ
チド３３にあり、終了コドンがＳＥＱＩＤＮＯ：７のヌクレオチド１７２５
からヌクレオチド１７２７にあることを想定している。Ｐｅｉ_ｗｔＨＡ_５６５を
コードする領域は、ｎｅｉ_ｗｔＨＡ_１６９５で表されるが、この領域は、ＳＥＱ
ＩＤＮＯ：７のヌクレオチド３０から１７２４までにあるコドン鎖を有し、
ＳＥＱＩＤＮＯ：９で表される。

【０１９９】Ｂ．低温適応性ウマインフルエンザウィルスＨＡタンパク質をコードする１７
６２個のヌクレオチドからなる核酸分子は、ｎｅｉ_ｃａ１ＨＡ_１７６２で表され
、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０で表されるコドン鎖を有するが、この核酸分子を、
例１１Ｂに記載した方法で作製した。プラスミドＤＮＡ精製及びサイクルシーク
エンスを、例１２Ａに記載した方法で行った。

【０２００】ＳＥＱＩＤＮＯ：１０を翻訳すると、核酸分子がｎｅｉ_ｃａ１ＨＡ_１７６ _２が、ここではＰｅｉ_ｃａ１ＨＡ_５６５と言及されるアミノ酸約５６５個からな
る全長ウマインフルエンザＨＡタンパク質をコードすることが判明し、このタン
パク質のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：１１で表されるが、ただしこのと
き、開いた読み枠の開始コドンがＳＥＱＩＤＮＯ：１０のヌクレオチド３０
からヌクレオチド３３にあり、終了コドンがＳＥＱＩＤＮＯ：１０のヌクレ
オチド１７２５からヌクレオチド１７２７にあることを想定している。Ｐｅｉ_ｃ _ａ１ＨＡ_５６５をコードする領域は、ｎｅｉ_ｃａ１ＨＡ_１６９５で表されるが、
この領域は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１０のヌクレオチド３０から１７２４までに
あるコドン鎖を有し、ＳＥＱＩＤＮＯ：１２で表される。

【０２０１】低温適応性ウマインフルエンザＨＡタンパク質をコードする第２の核酸分子を
同じ方法でＰＣＲ増幅し、ｎｅｉ_ｃａ１ＨＡ_１７６２と同一の分子ｎｅｉ_ｃａ _２ＨＡ_１７６２、及びｎｅｉ_ｃａ１ＨＡ_１６９５と同一の分子ｎｅｉ_ｃａ２ＨＡ _１６９５を作製した。

【０２０２】Ｃ．ｎｅｉ_ｗｔＨＡ_１７６２（ＳＥＱＩＤＮＯ：７）とｎｅｉ_ｃａ１Ｈ
Ａ_１７６２（ＳＥＱＩＤＮＯ：１０）とのコドン鎖の核酸配列をＤＮＡア
ライメントで比較すると、次の相違が判明する：塩基５５のＣがＴに変化、塩基
４９９のＧがＡに変化、塩基６７１のＧがＡに変化、塩基７３８のＣがＴに変化
、塩基８０５のＴがＣに変化、塩基１２８９のＧがＡに変化、塩基１３６８のＡ
がＧに変化。。タンパク質Ｐｅｉ_ｗｔＨＡ_５６５（ＳＥＱＩＤＮＯ：８）
とＰｅｉ_ｃａ１ＨＡ_５６５（ＳＥＱＩＤＮＯ：１１）とのアミノ酸配列を
比較すると、次の相違が判明する：ＤＮＡ配列の塩基５５のＣからＴへの変化に
対応する、アミノ酸１８のＰからＬへの変化、ＤＮＡ配列の塩基４９９のＧから
Ａへの変化に対応する、アミノ酸１６６のＧからＥへの変化、ＤＮＡ配列の塩基
７３８のＣからＴへ温変化に対応する、アミノ酸２４６のＲからＷへの変化、Ｄ
ＮＡ配列の塩基８０５のＴからＣへの変化に対応する、アミノ酸２６８のＭから
Ｔへの変化、ＤＮＡ配列の塩基１３６８のＡからＧへの変化に対応する、アミノ
酸４５６のＫからＥへの変化。ＤＮＡ配列の塩基６７１のＧからＡへの変化に対
応する、残基２２３のセリン（Ｓ）は変化せず、また、ＤＮＡ配列の塩基１２８
９のＧからＡへの変化に対応する、残基４２９のアルギニン（Ｒ）も変化しなか
った。

【０２０３】例１３この例では、野生型又は低温適応性ウマインフルエンザウィルスの、ウマイン
フルエンザＰＢ２タンパク質（ＲＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ）のＮ−末端部分
に対応する核酸分子のクローニング及び配列決定について説明する。

【０２０４】Ａ．野生型または低温適応性ウマインフルエンザウィルスＰＢ２−Ｎタンパ
ク質をコードする核酸分子を、次の方法で作製した。ウマインフルエンザウィル
スＤＮＡ及び、それぞれＳＥＱＩＤＮＯ：３６及びＳＥＱＩＤＮＯ：３
７で表されるプライマｗ５７０及びｗ５７１から、ＰＣＲ増幅により、ウマＰＢ
２遺伝子のＮ−末端部分を含有するＰＣＲ産物を作製した。ｎｅｉ_ｗｔＰＢ２−
Ｎ_１２４１として表され、核酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ：１３で表されるアミノ
酸配列を有するコドン鎖を有する、野生型ＰＢ２−Ｎタンパク質をコードするヌ
クレオチド１２４１個からなる核酸分子を、さらなるＰＣＲ増幅により、上述の
ＰＣＲ産物を鋳型として作製し、例１１Ｂに記載した方法でクローニングした。
プラスミドＤＮＡを、例１１Ｂに記載した方法で精製及び配列決定した。ただし
、シークエンシングキットで使用したプライマは、Ｔ７及びＲＥＶのみであった
。

【０２０５】ＳＥＱＩＤＮＯ：１３を翻訳すると、核酸分子ｎｅｉ_ｗｔＰＢ２−Ｎ_１２ _４１が、ここではＰ_ｗｔＰＢ２−Ｎ_４０４と言及されるアミノ酸約４０４個から
なるウマインフルエンザＰＢ２タンパク質をコードすることが判明し、このタン
パク質のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：１４で表されるが、ただしこのと
き、開いた読み枠の開始コドンがＳＥＱＩＤＮＯ：１３のヌクレオチド２８
からヌクレオチド３０にあり、終了コドンがヌクレオチド１２３７からヌクレオ
チド１２３９にあることを想定している。Ｐ_ｗｔＰＢ２−Ｎ_４０４をコードする
領域は、ｎｅｉ_ｗｔＰＢ２−Ｎ_１２１４で表されるが、この領域は、ＳＥＱＩ
ＤＮＯ：１３のヌクレオチド２８から１２３９までにあるコドン鎖を有し、Ｓ
ＥＱＩＤＮＯ：１５で表される。

【０２０６】Ｂ．インフルエンザＰＢ２低温適応性ウマインフルエンザウィルスＰＢ２−Ｎ
タンパク質のＮ−末端をコードする１２３９個のヌクレオチドからなる核酸分子
は、ｎｅｉ_ｃａ１ＰＢ２−Ｎ_１２４１で表され、ＳＥＱＩＤＮＯ：１６で表
されるコドン鎖を有するが、この核酸分子を、例１２Ａに記載した方法で作製し
た。

【０２０７】ＳＥＱＩＤＮＯ：１６を翻訳すると、核酸分子ｎｅｉ_ｃａ１ＰＢ２−Ｎ_１ _２４１が、ここではＰｅｉ_ｃａ１ＰＢ２−Ｎ_４０４と言及されるアミノ酸約４０
４個からなるウマインフルエンザＰＢ−２タンパク質のＮ−末端をコードするこ
とが判明し、このタンパク質のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：１７で表さ
れるが、ただしこのとき、開いた読み枠の開始コドンがＳＥＱＩＤＮＯ：１
６のヌクレオチド２８からヌクレオチド３０にあり、終了コドンがヌクレオチド
１２３７からヌクレオチド１２３９にあることを想定している。Ｐｅｉ_ｃａ１Ｐ
Ｂ２−Ｎ_４０４をコードする領域は、ｎｅｉ_ｃａ１ＰＢ２−Ｎ_１２１４で表され
るが、この領域は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１６のヌクレオチド２８から１２３９
にあるコドン鎖を有し、ＳＥＱＩＤＮＯ：１８で表される。

【０２０８】低温適応性ウマインフルエンザＰＢ２−Ｎタンパク質をコードする第２の核酸
分子を同じ方法でＰＣＲ増幅し、ｎｅｉ_ｃａ１ＰＢ２−Ｎ_１２４１と同一の分子
ｎｅｉ_ｃａ２ＰＢ２−Ｎ_１２４１、及びｎｅｉ_ｃａ１ＰＢ２−Ｎ_１２１４と
同一の分子ｎｅｉ_ｃａ２ＰＢ２−Ｎ_１２１４を作製した。

【０２０９】Ｃ．ｎｅｉ_ｗｔＰＢ２−Ｎ_１２４１（ＳＥＱＩＤＮＯ：１３）とｎｅｉ _ｃａ１ＰＢ２−Ｎ_１２１４（ＳＥＱＩＤＮＯ：１６）とのコドン鎖の核酸配
列をＤＮＡアライメントで比較すると、次の相違が判明する：塩基３７０のＴが
Ｃ。タンパク質Ｐ_ｗｔＰＢ２−Ｎ_４０４（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４）とＰ_ｃａ _１ＰＢ２−Ｎ_４０４（ＳＥＱＩＤＮＯ：１７）とのアミノ酸配列を比較す
ると、次の相違が判明する：ＤＮＡ配列の塩基３７０のＴからＣへの変化に対応
する、アミノ酸１２４のＹからＨへの変化。

【０２１０】例１４この例では、野生型又は低温適応性ウマインフルエンザウィルスの、ウマイン
フルエンザＰＢ２タンパク質（ＲＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ）のＣ−末端部分
に対応する核酸分子のクローニング及び配列決定について説明する。

【０２１１】Ａ．野生型または低温適応性ウマインフルエンザウィルスＰＢ２−Ｃタンパ
ク質をコードする核酸分子を、次の方法で作製した。ウマインフルエンザウィル
スＤＮＡ及び、それぞれＳＥＱＩＤＮＯ：３８及びＳＥＱＩＤＮＯ：３
９で表されるプライマｗ５７２及びｗ５７３から、ＰＣＲ増幅により、ウマＰＢ
２遺伝子のＣ−末端部分を含有するＰＣＲ産物を作製した。ｎｅｉ_ｗｔＰＢ２−
Ｃ_１２３３として表され、核酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ：１９を含むコドン鎖を
有する、野生型ＰＢ２−Ｃタンパク質をコードするヌクレオチド１２３３個から
なる核酸分子を、さらなるＰＣＲ増幅により、上述のＰＣＲ産物を鋳型として作
製し、例１１Ｂに記載した方法でクローニングした。プラスミドＤＮＡを、例１
１Ａに記載した方法で精製及び配列決定した。ただし、シークエンシングキット
では異なるプライマを使用した。例１１ＡではＴ７及びＲＥＶを使用したが、こ
の例では、ＳＥＱＩＤＮＯ．４０で表されるｅｆＰＢ２−ａ１とＳＥＱＩ
ＤＮＯ．４１で表されるｅｆＰＢ２−ｓ１、及びＳＥＱＩＤＮＯ．４２で
表されるｅｆＰＢ２−ａ２とＳＥＱＩＤＮＯ．４３で表されるｅｆＰＢ２−
ｓ２を使用した。

【０２１２】ＳＥＱＩＤＮＯ：１９を翻訳すると、核酸分子ｎｅｉ_ｗｔ１ＰＢ２−Ｃ_１ _２３３が、ここではＰ_ｗｔＰＢ２−Ｃ_３９８と言及されるアミノ酸約３９８個か
らなるウマインフルエンザＰＢ２タンパク質のＣ−末端をコードすることが判明
し、このタンパク質のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：２０で表されるが、
ただしこのとき、開いた読み枠の開始コドンがＳＥＱＩＤＮＯ：１９のヌク
レオチド３からヌクレオチド５にあり、終了コドンがヌクレオチド１１９７から
ヌクレオチド１１９９にあることを想定している。ＳＥＱＩＤＮＯ：１９は
単なる部分的な遺伝子配列であるので、開始コドンを含まない。Ｐ_ｗｔＰＢ２−
Ｃ_３９８をコードする領域は、ｎｅｉ_ｗｔＰＢ２−Ｃ_１１９４で表されるが、こ
の領域は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１９のヌクレオチド３から１１９６までにある
コドン鎖を有し、ＳＥＱＩＤＮＯ：２１で表される。

【０２１３】野生型インフルエンザＰＢ２−Ｎタンパク質をコードする第２の核酸分子を同
様の方法でＰＣＲ増幅し、ｎｅｉ_ｗｔ２ＰＢ２−Ｎ_１２３２として表され、核酸
配列ＳＥＱＩＤＮＯ：２２を含むコドン鎖を有する、ヌクレオチド１２３２
個からなる核酸分子を作製した。ｎｅｉ_ｗｔ２ＰＢ２−Ｎ_１２３２は、５’−末
端のヌクレオチド１個の欠失を除いては、ｎｅｉ_ｗｔ１ＰＢ２−Ｃ_１２３３と同
一である。ＳＥＱＩＤＮＯ：２２を翻訳すると、核酸分子ｎｅｉ_ｗｔ１ＰＢ
２−Ｃ_１２３３が、Ｐ_ｗｔＰＢ２−Ｃ_３９８（ＳＥＱＩＤＮＯ．２０）もコ
ードすることが判明するが、ただしこのとき、開いた読み枠の開始コドンがＳＥ
ＱＩＤＮＯ：２２のヌクレオチド２からヌクレオチド４にあり、終了コドン
がヌクレオチド１１９６からヌクレオチド１１９８にあることを想定している。
ＳＥＱＩＤＮＯ：２２は単なる部分的な遺伝子配列であるので、開始コドン
を含まないＳＥＱＩＤＮＯ：２２のヌクレオチド２から１１９５までにある
ヌクレオチドを含むコドン鎖を有する核酸分子は、ｎｅｉ_ｗｔ２ＰＢ２−Ｃ_１１ _９４で表され、ＳＥＱＩＤＮＯ：２１と同一である。

【０２１４】Ｂ．インフルエンザＰＢ２低温適応性ウマインフルエンザウィルスＰＢ−２タ
ンパク質のＣ−末端部分をコードする１２３２個のヌクレオチドからなる核酸分
子は、ｎｅｉ_ｃａ１ＰＢ２−Ｃ_１２３２で表され、ＳＥＱＩＤＮＯ：２３で
表されるコドン鎖を有するが、この核酸分子を、ｐＣＲ（登録商標）−Ｂｌｕｎ
ｔクローニングベクターを使用した点以外では例１４Ａに記載した方法と同じ方
法で作製した。

【０２１５】ＳＥＱＩＤＮＯ：２３を翻訳すると、核酸分子ｎｅｉ_ｃａ１ＰＢ２−Ｃ_１ _２３２が、ここではＰ_ｃａ１ＰＢ２−Ｃ_３９８と言及されるアミノ酸約３９８個
からなるウマインフルエンザＰＢ−２タンパク質のＣ−末端をコードすることが
判明し、このタンパク質のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：２４で表される
が、ただしこのとき、開いた読み枠の開始コドンがＳＥＱＩＤＮＯ：２３の
ヌクレオチド２からヌクレオチド４にあり、終了コドンがヌクレオチド１１９６
からヌクレオチド１１９８にあることを想定している。ＳＥＱＩＤＮＯ：２
３は単なる部分的な遺伝子配列であるので、開始コドンを含まない。Ｐ_ｃａ１Ｐ
Ｂ２−Ｃ_３９８をコードする領域は、ｎｅｉ_ｃａ１ＰＢ２−Ｃ_１１９４で表され
るが、この領域は、ＳＥＱＩＤＮＯ：２３のヌクレオチド２から１１９５ま
でにあるヌクレオチドを含むコドン鎖を有し、ＳＥＱＩＤＮＯ：２５で表さ
れる。

【０２１６】低温適応性ウマインフルエンザＰＢ２−Ｃタンパク質をコードする第２の核酸
分子を同じ方法でＰＣＲ増幅し、ｎｅｉ_ｃａ１ＰＢ２−Ｎ_１２４１と比較して３
’末端のヌクレオチド１個が欠失しているｎｅｉ_ｃａ２ＰＢ２−Ｃ_１２３１、及
びｎｅｉ_ｃａ１ＰＢ２−Ｎ_１２１４と同一の分子ｎｅｉ_ｃａ２ＰＢ２−Ｎ_１２ _１４を作製した。

【０２１７】Ｃ．ｎｅｉ_ｗｔ１ＰＢ２−Ｃ_１２３３（ＳＥＱＩＤＮＯ：１９）とｎｅ
ｉ_ｃａ１ＰＢ２−Ｃ_１２３２（ＳＥＱＩＤＮＯ：２３）のコドン鎖の核酸配
列をＤＮＡアライメントで比較すると、次の相違が判明する：ＳＥＱＩＤＮ
Ｏ：１９の塩基１５３のＡがＣに変化、及びＳＥＱＩＤＮＯ：１９の塩基９
２９のＧがＡに変化。タンパク質Ｐ_ｗｔＰＢ２−Ｃ_３９８（ＳＥＱＩＤＮＯ
：２０）とＰ_ｃａ１ＰＢ２−_３９８（ＳＥＱＩＤＮＯ：２４）とのアミノ
酸配列を比較すると、次の相違が判明する：ＤＮＡ配列の塩基１５３のＡからＣ
への変化に対応する、アミノ酸５１のＫからＱへの変化。塩基９２９のＧからＡ
への変化によるアミノ酸の変化はない。

【０２１８】本発明の様々な実施例を詳細に説明したが、これらの実施例に修正及び変更が
加えられるであろうことは当業者に明白である。しかしながら、そのような修正
及び変更は、以下の請求の範囲で述べるような、本発明の範囲内で行われるもの
であることを、理解されたい。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｎ 7/04 Ｃ１２Ｒ 1:92）Ｃ１２Ｒ 1:92）Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ヤングナージュリウスエス．アメリカ合衆国 15217 ペンシルベニア州ピッツバーグマルボロアベニュー 5831 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 CA01 DA02 GA25 4B065 AA95Y AC01 BA14 CA43 4C085 AA03 BA55 CC08 DD06 4H045 AA10 BA10 CA01 EA20 EA50

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】低温適応性ウマインフルエンザウィルス。
【請求項２】低温適応により作製されたウマインフルエンザウィルスの少な
くとも１つのゲノム分節を有し、前記ウマインフルエンザウィルスが、低温適応
性、温度感受性、優性干渉性、弱毒性から選択される１つの識別表現型を有する
ようなリアソータントインフルエンザＡ型ウィルスであって、前記ウマインフル
エンザウィルスのゲノム分節が、前記識別表現型の少なくとも１つを前記リアソ
ータントウィルスに与える、リアソータントインフルエンザＡ型ウィルス。
【請求項３】（ａ）低温適応性ウマインフルエンザウィルスと、（ｂ）低温
適応により作製されたウマインフルエンザウィルスの少なくとも１つのゲノム分
節を有するリアソータントインフルエンザＡ型ウィルスと、から選択されるウィ
ルスを有し、前記ウマインフルエンザウィルスが、低温適応性、温度感受性、優
性干渉性、弱毒性から選択される１つの識別表現型を有する、動物をインフルエ
ンザＡ型ウィルスから保護するための治療用組成であって、前記ウマインフルエ
ンザウィルスのゲノム分節が、前記識別表現型の少なくとも１つを前記リアソー
タントウィルスに与える、動物をインフルエンザＡ型ウィルスから保護するため
の治療用組成。
【請求項４】（ａ）低温適応性ウマインフルエンザウィルスと、（ｂ）低温
適応により作製されたウマインフルエンザウィルスの少なくとも１つのゲノム分
節を有するリアソータントインフルエンザＡ型ウィルスと、から選択されるウィ
ルスを有し、前記ウマインフルエンザウィルスが、低温適応性、温度感受性、優
性干渉性、弱毒性から選択される１つの識別表現型を有する治療用組成を動物に
投与することを含む、前記動物をインフルエンザＡ型ウィルスに起因する疾患か
ら保護するための方法であって、前記ウマインフルエンザウィルスのゲノム分節
が、前記識別表現型の少なくとの１つを前記リアソータントウィルスに与える、
動物をインフルエンザＡ型ウィルスに起因する疾患から保護するための方法。
【請求項５】ａ．野生型ウマインフルエンザウィルスを継代培養することと
、ｂ．低温で生育するウィルスを選別することと、を含む、低温適応性ウマインフルエンザウィルスを作製する方法。
【請求項６】ａ．供与低温適応性ウマインフルエンザウィルスのゲノム分節
と受容インフルエンザＡ型ウィルスのゲノム分節を混合することと、ｂ．前記供与ウマインフルエンザウィルスの少なくとも１つの表現型を有する
リアソータントウィルスを選別することと、を含む、低温適応により作製されたウマインフルエンザウィルスの少なくとも１
つのゲノム分節を有し、前記ウマインフルエンザウィルスが、低温適応性、温度
感受性、優性干渉性、弱毒性から選択される１つの識別表現型を有する、リアソ
ータントインフルエンザＡ型ウィルスを作製するための方法であって、前記表現
型が、低温適応性、温度感受性、優性干渉性、弱毒性から選択される、リアソー
タントインフルエンザＡ型ウィルスを作製するための方法。
【請求項７】低温適応性ウマインフルエンザウィルスを卵内で増殖させるこ
とと、前記ウィルスを組織培養細胞内で増殖させることとから選択される方法を
含む、低温適応性ウマインフルエンザウィルスを増殖させるための方法。
【請求項８】単離されたウマインフルエンザ核酸分子であって、前記ウマイ
ンフルエンザ核酸分子が、ＳＥＱＩＤＮＯ：１，ＳＥＱＩＤＮＯ：３
，ＳＥＱＩＤＮＯ：４，ＳＥＱＩＤＮＯ：６，ＳＥＱＩＤＮ
Ｏ：７，ＳＥＱＩＤＮＯ：９，ＳＥＱＩＤＮＯ：１０，ＳＥＱＩＤＮＯ：１２，ＳＥＱＩＤＮＯ：１３，ＳＥＱＩＤＮＯ：１５
，ＳＥＱＩＤＮＯ：１６，ＳＥＱＩＤＮＯ：１８，ＳＥＱＩＤ
ＮＯ：１９，ＳＥＱＩＤＮＯ：２１，ＳＥＱＩＤＮＯ：２２，ＳＥＱＩＤＮＯ：２３，ＳＥＱＩＤＮＯ：２５及び、前記核酸配列の
いずれかと完全に相補的な核酸配列を有する核酸分子より選択される、単離され
たウマインフルエンザ核酸分子。
【請求項９】単離されたウマインフルエンザ核酸分子であって、前記ウマイ
ンフルエンザ核酸分子が、ＳＥＱＩＤＮＯ：２，ＳＥＱＩＤＮＯ：５
，ＳＥＱＩＤＮＯ：８，ＳＥＱＩＤＮＯ：１１，ＳＥＱＩＤＮＯ：１４，ＳＥＱＩＤＮＯ：１７，ＳＥＱＩＤＮＯ：２０、ＳＥ
ＱＩＤＮＯ：２４より選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコード
する、単離されたウマインフルエンザ核酸分子。
【請求項１０】単離されたウマインフルエンザタンパク質であって、前記ウ
マインフルエンザタンパク質が、ＳＥＱＩＤＮＯ：２，ＳＥＱＩＤＮ
Ｏ：５，ＳＥＱＩＤＮＯ：８，ＳＥＱＩＤＮＯ：１１，ＳＥＱＩＤＮＯ：１４，ＳＥＱＩＤＮＯ：１７，ＳＥＱＩＤＮＯ：２０
、ＳＥＱＩＤＮＯ：２４より選択されるアミノ酸配列を有する、単離された
ウマインフルエンザタンパク質。
【請求項１１】請求項１、３、４、５、７に記載の低温適応性ウマインフル
エンザウィルスまたは請求項２、３、４または６に記載のリアソータントインフ
ルエンザＡ型ウィルスが、ふ化鶏卵内で、温度約２６℃から約３０℃で複製を行
う、請求項１、２、３、４、５、６または７に記載の発明。
【請求項１２】請求項１、３、４、５、７に記載の低温適応性ウマインフル
エンザウィルスまたは請求項２、３、４または６に記載のリアソータントインフ
ルエンザＡ型ウィルスが弱毒性である、請求項１、２、３、４、５、６または７
に記載の発明。
【請求項１３】請求項１、３、４、５、７に記載の低温適応性ウマインフル
エンザウィルスまたは請求項２、３、４または６に記載のリアソータントインフ
ルエンザＡ型ウィルスが温度感受性である、請求項１、２、３、４、５、６また
は７に記載の発明。
【請求項１４】請求項１、３、４、５、７に記載の低温適応性ウマインフル
エンザウィルスまたは請求項２、３、４または６に記載のリアソータントインフ
ルエンザＡ型ウィルスが、ふ化鶏卵内で、温度約２６℃から約３０℃で複製を行
うが、組織培養細胞内で、温度約３９℃ではプラークを形成しない、請求項１、
２、３、４、５、６または７に記載の発明。
【請求項１５】請求項１、３、４、５、７に記載の低温適応性ウマインフル
エンザウィルスまたは請求項２、３、４または６に記載のリアソータントインフ
ルエンザＡ型ウィルスが、ふ化鶏卵内で、温度約２６℃から約３０℃で複製を行
うが、組織培養細胞内で、温度約３７℃ではプラークを形成しない、請求項１、
２、３、４、５、６または７に記載の発明。
【請求項１６】非許容温度約３９℃の表現型が、請求項１、３、４、５、７
に記載の低温適応性ウマインフルエンザウィルス、または請求項２、３、４また
は６に記載のリアソータントインフルエンザＡ型ウィルスに、前記ウィルスのゲ
ノム中の少なくとも２つの突然変異により与えられ、これらの突然変異が第１の
突然変異及び第２の突然変異を有する、請求項１、２、３、４、５、６または７
に記載の発明。
【請求項１７】前記第１の突然変異が、温度約３９℃でプラーク形成を阻害
する表現型を与え、また、前記第１の突然変異が、核タンパク質遺伝子を有する
前記ゲノムの分節と共分離する、請求項１６に記載の発明。
【請求項１８】前記第２の突然変異が、温度約３９℃でタンパク質合成を阻
害する表現型を与える、請求項１６に記載の発明。
【請求項１９】少なくとも１つのさらなる突然変異を有し、前記のさらなる
突然変異が、非許容温度約３７℃の表現型を与え、前記表現型が、温度約３７℃
でのプラーク形成の阻害及び温度約３７℃での後期遺伝子発現の阻害から選択さ
れる、請求項１６に記載の発明。
【請求項２０】前記低温適応性ウマインフルエンザウィルスを、ａ．野生型ウマインフルエンザウィルスを継代培養することと、ｂ．低温で生育するウィルスを選別することと、を含む方法により作製可能な、請求項１、３、４または７に記載の発明。
【請求項２１】前記低温適応性ウマインフルエンザウィルスを、前記継代培
養及び選別工程を１回またはそれ以上繰り返すことをさらに含む方法により作製
し、前記低温を順次低下させる、請求項２０に記載の発明。
【請求項２２】前記継代培養工程をふ化鶏卵内で行う、請求項２０に記載の
発明。
【請求項２３】前記低温適応性ウマインフルエンザウィルスが、優性干渉性
表現型を有する、請求項２０に記載の発明。
【請求項２４】請求項１、３、４、５または７に記載の低温適応性ウマイン
フルエンザウィルスまたは請求項２、３、４または６に記載のゲノム分節が、Ａ
／ウマ／ケンタッキー／１／９１（Ｈ３Ｎ８）株に由来する、請求項１、２、３
、４、５、６または７に記載の発明。
【請求項２５】請求項１、３、４、５または７に記載の低温適応性ウマイン
フルエンザウィルスまたは請求項２、３、４または６に記載のゲノム分節が、受
託番号ＡＴＣＣＶＲ＿＿＿＿で識別されるＥＩＶ−Ｐ８２１；受託番号ＡＴＣ
ＣＶＲ＿＿＿＿で識別されるＥＩＶ−Ｐ８２４；受託番号ＡＴＣＣＶＲ＿＿
＿＿で識別されるＭＳＶ＋５より選択される、請求項１、２、３、４、５、６ま
たは７に記載の発明。
【請求項２６】請求項１、３、４、５または７に記載の前記低温適応性ウマ
インフルエンザウィルスまたは請求項２、３、４または６に記載の前記ゲノム分
節が、受託番号ＡＴＣＣＶＲ＿＿＿＿で識別されるＥＩＶ−Ｐ８２１；受託番
号ＡＴＣＣＶＲ＿＿＿＿で識別されるＥＩＶ−Ｐ８２４；受託番号ＡＴＣＣＶＲ＿＿＿＿で識別されるＭＳＶ＋５；及び前記いずれかの受託番号の前記いず
れかのウィルスの後代より選択される、請求項１、２、３、４、５、６または７
に記載の発明。
【請求項２７】前記リアソータントウィルスが、ａ．供与低温適応性ウマインフルエンザウィルスのゲノム分節と受容インフル
エンザＡ型ウィルスのゲノム分節とを混合することと、ｂ．前記供与ウマインフルエンザウィルスの少なくとも１つの表現型を有する
リアソータントウィルスを選別することと、を含む方法により作製され、前記表
現型が、低温適応性、温度感受性、優性干渉性、弱毒性から選択される、請求項
２、３または４に記載の発明。
【請求項２８】前記受容インフルエンザＡ型ウィルスのヘマグルチニン及び
ノイラミニダーゼ表現型が、前記供与ウマインフルエンザウィルスのヘマグルチ
ニン及びノイラミニダーゼ表現型とは異なり、また、前記リアソータントウィル
スのヘマグルチニン及びノイラミニダーゼ表現型が、前記受容ウィルスのヘマグ
ルチニン及びノイラミニダーゼ表現型である、請求項２７または６に記載の発明
。
【請求項２９】前記動物がウマ科動物である、請求項３または請求項４に記
載の発明。
【請求項３０】前記治療用組成を、ウィルスが上気道の粘膜細胞に侵入可能
であるような経路で前記動物に投与する、請求項３または請求項４に記載の発明
。
【請求項３１】前記治療用組成が低温適応性ウマインフルエンザウィルスを
含有し、前記疾患がウマインフルエンザウィルスに起因し、前記治療用組成を予
防的にウマ科動物に投与することにより、前記ウマ科動物体内のウマインフルエ
ンザウィルスに対する免疫反応を惹起する、請求項３または請求項４に記載の発
明。
【請求項３２】前記治療用組成が、前記ウィルスを約１０^５ＴＣＩＤ_５０単
位から約１０^８ＴＣＩＤ_５０単位含有する、請求項３または請求項４に記載の
発明。
【請求項３３】前記治療用組成が、賦形剤をさらに含有する、請求項３また
は請求項４に記載の発明。
【請求項３４】前記核酸分子が、ＳＥＱＩＤＮＯ：４，ＳＥＱＩＤ
ＮＯ：６，ＳＥＱＩＤＮＯ：１０，ＳＥＱＩＤＮＯ：１２，Ｓ
ＥＱＩＤＮＯ：１６，ＳＥＱＩＤＮＯ：１８，ＳＥＱＩＤＮＯ
：２３，ＳＥＱＩＤＮＯ：２５から選択される核酸配列を有する低温適応
性ウマインフルエンザウィルスを含む、請求項８に記載の発明。
【請求項３５】前記核酸分子が、Ｍタンパク質をコードする低温適応性ウマ
インフルエンザウィルスを含み、前記Ｍタンパク質のアミノ酸配列が、ＳＥＱＩＤＮＯ：５を有する、請求項８に記載の発明。
【請求項３６】前記核酸分子が、ＨＡタンパク質をコードする低温適応性ウ
マインフルエンザウィルスを含み、前記ＨＡタンパク質のアミノ酸配列が、ＳＥ
ＱＩＤＮＯ：１１を有する、請求項８に記載の発明。
【請求項３７】前記核酸分子が、ＰＢ２−Ｎタンパク質をコードする低温適
応性ウマインフルエンザウィルスを含み、前記ＰＢ２−Ｎタンパク質のアミノ酸
配列が、ＳＥＱＩＤＮＯ：１７を有する、請求項８に記載の発明。
【請求項３８】前記核酸分子が、ＰＢ２−Ｃタンパク質をコードする低温適
応性ウマインフルエンザウィルスを含み、前記ＰＢ２−Ｃタンパク質のアミノ酸
配列が、ＳＥＱＩＤＮＯ：２４を有する、請求項８に記載の発明。