JP2009297040A - 低温適応性ウマインフルエンザウィルス - Google Patents

Abstract

【課題】ウマをウマインフルエンザウィルスから保護するための、安全で効果的な治療用組成を提供すること。
【解決手段】本発明は、実験的に作製された低温適応性ウマインフルエンザウィルス及び、そのようなウマインフルエンザウィルスの少なくとも１つのゲノム分節を有するリアソータントインフルエンザＡ型ウィルスを提供し、前記ウマインフルエンザウィルスのゲノム分節が、低温適応性、温度感受性、優性干渉性または弱毒性などの、低温適応性ウマインフルエンザウィルスの少なくとも１つの識別表現型を付与することを特徴とする。これらのウィルスを、インフルエンザＡ型ウィルスに起因する疾患から動物を保護するための、そして特に、ウマインフルエンザウィルスに起因する疾患からウマを保護するための治療用組成に製剤する。
【選択図】なし

Description

発明の属する技術分野
本発明は、実験的に作製された低温適応性ウマインフルエンザウィルスに関し、特に、弱毒化、優性干渉、または温度感受性などの付加的表現型を有する低温適応性ウマインフルエンザウィルスに関する。本発明は、そのようなウマインフルエンザウィルスからの、少なくとも１つのゲノム分節を有するリアソータントインフルエンザＡ型ウィルスも含み、このため、このリアソータントウィルスは、供与ウマインフルエンザウィルスの複数の表現型を含む。本発明は、リバース遺伝工学により作製された、本発明の低温適応性ウマインフルエンザウィルスの複数の識別表現型を持つ、遺伝子組換えされたウマインフルエンザウィルスをさらに含む。本発明は、インフルエンザウィルスに起因する疾患から動物を保護するため、これらのウィルスを治療用組成物中で使用する方法にも関する。

発明の背景
ウマインフルエンザウィルスは、１９５６年頃から、ウマ類の呼吸性疾患の主な病原として知られている。ウマインフルエンザウィルスにより引き起こされる疾患の症状は重症となるおそれがあり、また、多くの場合、続発性の細菌感染症を伴う。ウマインフルエンザウィルスの亜型としては、Ａ／ウマ／プラハ／１／５６（Ｈ７Ｎ７）を原型とする亜型−１と、Ａ／ウマ／マイアミ／１／６３ （Ｈ３Ｎ８）を原型とする亜型−２との２種類が知られている。現在、優勢なウィルス亜型は亜型−２であり、この亜型は、近年ではユーラシア及び北アメリカ分離菌にさらに分化している。
現在認可されているウマインフルエンザワクチンは、不活化（死菌）ウィルスワクチンである。このワクチンがウマ類に対して発揮する保護効果は、あるとしても非常に低く、また、例えば注射部位の炎症性反応などの望ましくない副作用を伴う可能性がある。例えば、非特許文献１及び非特許文献２を参照されたい。さらに、現在の療法を若齢の子馬に適用することはできない。なぜなら、現在の療法は母子免疫を克服できない可能性があり、また、若齢の動物の場合は耐薬性を誘発するおそれがあるからである。疾患の重症度から考えて、ウマをウマインフルエンザウィルスから保護するための、安全で効果的な治療用組成物が必要とされている。
低温適応性ヒトインフルエンザウィルスを含む治療用組成物の製造方法は、例えば、非特許文献３及び非特許文献４に述べられている。さらに、これらの研究者らは、低温適応性ヒトインフルエンザウィルス、すなわち、通常の温度よりも低い温度で生育するように適応されたウィルスが、温度感受性表現型を持つ傾向がある、つまり、そのようなウィルスは、野生型ウィルスが生育及び複製可能であるような、ある一定のより高い非許容温度では、十分に生育しないということを指摘した。既存の低温適応性ヒトインフルエンザＡ型ウィルスとのリアソートメントにより作製した様々な低温適応性ヒトインフルエンザＡ型ウィルスは、ワクチン接種された個体に良好な免疫反応を惹起することが示されており、また、複数の弱毒性の低温適応性リアソータントヒトインフルエンザＡ型ウィルスが、ヒトを野生型ウィルスの攻撃から保護することが証明されている。例えば、非特許文献５を参照のこと。 １９９２年９月２２日に発行された、Ｙｏｕｎｇｎｅｒ， ｅｔ ａｌによる特許文献１で、本発明の発明者らは、複数のリアソータント低温適応性ヒトインフルエンザＡ型ウィルスが優性干渉表現型を有する、すなわち、これらのウィルスが、対応する親野生型系統及び異種インフルエンザＡ型ウィルスの生育を阻害することをさらに示した。１９８７年７月２８日に発行された、Ｃｏｇｇｉｎｓ ｅｔ ａｌ．による特許文献２及び、１９８７年９月１５日に発行された、Ｃａｍｐｂｅｌｌ による特許文献３は、野生型ウマインフルエンザウィルスと弱毒性の低温適応性ヒトインフルエンザＡ型ウィルスとのリアソートメントにより作製された、弱毒性の治療用組成物を開示している。これらの治療用組成物は、ウマに対しては一般に安全で効果的であるものの、ヒトとウマ双方の遺伝子を含むウィルスの環境への導入は、重大な危険を伴う。

米国特許５，１４９，５３１号 米国特許４，６８３，１３７号 米国特許４，６９３，８９３号

Ｍｕｍｆｏｒｄ， １９８７， Ｅｑｕｉｎｅ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ＩＶ， ２０７−２１７， Ｍｕｍｆｏｒｄ， ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ｖａｃｃｉｎｅ １１， １１７２−１１７４ Ｍａａｓｓａｂ， ｅｔ ａｌ．， １９６０， Ｎａｔｕｒｅ ７，６１２−６１４ Ｍａａｓｓａｂ， ｅｔ ａｌ．， １９６９， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １０２， ７２８−７３２ Ｃｌｅｍｅｎｔｓ， ｅｔ ａｌ．， １９８６， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２３， ７３−７６

発明の概要
本発明は、実験的に作製した低温適応性ウマインフルエンザウィルスと、低温適応により作製したウマインフルエンザウィルスの少なくとも１つのゲノム分節を有し、そのウマインフルエンザウィルスのゲノム分節が、低温適応性ウマインフルエンザウィルスの少なくとも１つの識別表現型をリアソータントウィルスに与えるようなウマインフルエンザウィルスと、リバース遺伝工学により作製され、低温適応性ウマインフルエンザウィルスの少なくとも１つの識別表現型を有する、遺伝子組換えウマインフルエンザウィルスとを提供する。識別表現型は、低温適応性、温度感受性、優性干渉性及び弱毒性を含む。本発明は、インフルエンザＡ型ウィルスに起因する疾患から動物を保護するための治療用組成物をさらに提供する。この治療用組成物は、本発明の低温適応性ウマインフルエンザウィルス、リアソータントインフルエンザＡ型ウィルス、または遺伝子組換えウマインフルエンザウィルスを含む。また、そのような治療用組成物の投与を含む、インフルエンザＡ型ウィルスに起因する疾患から動物を保護するための方法も提供される。また、低温適応性ウマインフルエンザウィルスを作製する方法、及び、低温適応性ウマインフルエンザウィルスの少なくとも１つのゲノム分節を有するリアソータントインフルエンザＡ型ウィルスを作製する方法も含む。後記の方法では、このウマインフルエンザのゲノム分節が、低温適応性ウマインフルエンザウィルスの少なくとも１つの識別表現型を、リアソータントウィルスに与える。

低温適応性インフルエンザウィルスは、ふ化鶏卵内で、温度約２６℃から約３０℃までの範囲で複製を行うインフルエンザウィルスである。本発明の低温適応性ウマインフルエンザウィルス、リアソータントインフルエンザＡ型ウィルス、又は遺伝子組換えウマインフルエンザウィルスは、健康な動物を罹患させないように、弱毒化されていることが好ましい。

一実施例においては、本発明の低温適応性ウマインフルエンザウィルス、リアソータントインフルエンザＡ型ウィルス、又は遺伝子組換えウマインフルエンザウィルスは、このウィルスが、ふ化鶏卵内で、温度約２６℃から約３０℃の範囲で複製を行い、組織培養細胞内で、許容温度約３４℃でプラークを形成するが、組織培養細胞内で、非許容温度約３９℃ではプラークを形成しないような温度感受性でもある。

一実施例においては、このような温度感受性のウィルスは、２つの突然変異を有する。第１の突然変異は、温度約３９℃でプラーク形成を阻害し、ウィルスの核タンパク質遺伝子をコードするゲノム分節と共分離する。第２の突然変異は、温度約３９℃で全てのウィルスのタンパク質合成を阻害する。

別の一実施例においては、本発明の低温適応性及び温度感受性のウマインフルエンザウィルスは、ふ化鶏卵内で、温度約２６℃から約３０℃の範囲で複製を行い、組織培養細胞内で、許容温度約３４℃でプラークを形成するが、組織培養細胞内で、非許容温度３７℃では、プラークを形成せず、また、後期ウィルスタンパク質を発現しない。

典型的には、本発明の低温適応性ウマインフルエンザウィルスは、野生型ウマインフルエンザウィルスを１回またはそれ以上継代培養し、次に、低温で安定して生育及び複製を行うウィルスを選別することにより作製される。このようにして作製された低温適応性ウマインフルエンザウィルスは、複数の実施例においては、優性干渉性表現型を含む。すなわち、このようなウィルスは、親ウマインフルエンザウィルスまたは異種野生型インフルエンザＡ型ウィルスと共感染した場合に、これらのウィルスの生育を阻害するであろう。

本発明の低温適応性ウマインフルエンザウィルスの例は、受託番号ＡＴＣＣ ＶＲ＿＿＿＿で識別されるＥＩＶ−Ｐ８２１、受託番号ＡＴＣＣ ＶＲ＿＿＿で識別されるＥＩＶ−Ｐ８２４、受託番号ＡＴＣＣ ＶＲ＿＿＿で識別されるＥＩＶ−ＭＳＶ＋５、及びこれらのウィルスの後代を含む。

本発明の治療用組成物は、本発明の低温適応性ウマインフルエンザウィルス、リアソータントインフルエンザＡ型ウィルス、又は遺伝子組換えウマインフルエンザウィルスを、約１０^５ＴＣＩＤ_５０単位から約１０^８ＴＣＩＤ_５０単位、好適には約２×１０^６ＴＣＩＤ_５０単位含む。

本発明は、インフルエンザＡ型ウィルスに起因する疾患から動物を保護するための方法も含む。この方法は、本発明の低温適応性ウマインフルエンザウィルス、リアソータントインフルエンザＡ型ウィルス、又は遺伝子組換えウマインフルエンザウィルスを含む治療用組成物を動物に投与する工程を含む。保護する対象として好適な動物はウマ科の動物であり、特に好適な動物はウマ及び子馬である。

本発明のさらに別の一実施例は、低温適応性ウマインフルエンザウィルスを作製する方法である。この方法は、野生種ウマインフルエンザウィルスを継代培養する工程と、低温で生育するウィルスを選別する工程とを含む。一実施例においては、この方法は、温度を順次下げながら継代培養と選別とを繰り返すことを含む。ウマインフルエンザウィルスの継代培養は、ふ化鶏卵内で行うことが望ましい。

別の一実施例は、本発明の供与低温適応性ウマインフルエンザウィルスのゲノム分節と、受容インフルエンザＡ型ウィルスのゲノム分節との遺伝子リアソートメントにより、リアソータントインフルエンザＡ型ウィルスを作製する方法である。本発明のリアソータントインフルエンザＡ型ウィルスは、（ａ）供与低温適応性ウマインフルエンザウィルスのゲノム分節と、受容インフルエンザＡ型ウィルスのゲノム分節とを混合することと、（ｂ）この供与ウマインフルエンザウィルスの少なくとも１つの識別表現型を含むウィルスを選別することとを含む方法により作製される。識別表現型は、低温適応性、温度感受性、優性干渉性、及び弱毒性を含む。これらのようなリアソータントウィルスは、供与ウィルスの少なくとも１つの弱毒性表現型を含むことが望ましい。典型的なリアソータントウィルスは、受容ウィルスの抗原性を有するであろう。すなわち、受容ウィルスのヘマグルチニン（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）表現型を有するであろう。

本発明は、本発明の低温適応性ウマインフルエンザウィルスまたはリアソータントインフルエンザＡ型ウィルスを増殖させる方法もまた提供する。これらの方法は、ふ化鶏卵内または組織培養細胞内での増殖を含む。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１） 低温適応性ウマインフルエンザウィルス。
（項目２） 低温適応により作製されたウマインフルエンザウィルスの少なくとも１つのゲノム分節を有し、前記ウマインフルエンザウィルスが、低温適応性、温度感受性、優性干渉性、弱毒性から選択される１つの識別表現型を有するようなリアソータントインフルエンザＡ型ウィルスであって、前記ウマインフルエンザウィルスのゲノム分節が、前記識別表現型の少なくとも１つを前記リアソータントウィルスに与える、リアソータントインフルエンザＡ型ウィルス。
（項目３） （ａ）低温適応性ウマインフルエンザウィルスと、（ｂ）低温適応により作製されたウマインフルエンザウィルスの少なくとも１つのゲノム分節を有するリアソータントインフルエンザＡ型ウィルスと、から選択されるウィルスを有し、前記ウマインフルエンザウィルスが、低温適応性、温度感受性、優性干渉性、弱毒性から選択される１つの識別表現型を有する、動物をインフルエンザＡ型ウィルスから保護するための治療用組成物であって、前記ウマインフルエンザウィルスのゲノム分節が、前記識別表現型の少なくとも１つを前記リアソータントウィルスに与える、動物をインフルエンザＡ型ウィルスから保護するための治療用組成物。
（項目４） （ａ）低温適応性ウマインフルエンザウィルスと、（ｂ）低温適応により作製されたウマインフルエンザウィルスの少なくとも１つのゲノム分節を有するリアソータントインフルエンザＡ型ウィルスと、から選択されるウィルスを有し、前記ウマインフルエンザウィルスが、低温適応性、温度感受性、優性干渉性、弱毒性から選択される１つの識別表現型を有する治療用組成物を動物に投与することを含む、前記動物をインフルエンザＡ型ウィルスに起因する疾患から保護するための方法であって、前記ウマインフルエンザウィルスのゲノム分節が、前記識別表現型の少なくとの１つを前記リアソータントウィルスに与える、動物をインフルエンザＡ型ウィルスに起因する疾患から保護するための方法。
（項目５） ａ．野生型ウマインフルエンザウィルスを継代培養することと、 ｂ．低温で生育するウィルスを選別することと、 を含む、低温適応性ウマインフルエンザウィルスを作製する方法。
（項目６） ａ．供与低温適応性ウマインフルエンザウィルスのゲノム分節と受容インフルエンザＡ型ウィルスのゲノム分節を混合することと、 ｂ．前記供与ウマインフルエンザウィルスの少なくとも１つの表現型を有するリアソータントウィルスを選別することと、を含む、低温適応により作製されたウマインフルエンザウィルスの少なくとも１つのゲノム分節を有し、前記ウマインフルエンザウィルスが、低温適応性、温度感受性、優性干渉性、弱毒性から選択される１つの識別表現型を有する、リアソータントインフルエンザＡ型ウィルスを作製するための方法であって、前記表現型が、低温適応性、温度感受性、優性干渉性、弱毒性から選択される、リアソータントインフルエンザＡ型ウィルスを作製するための方法。
（項目７） 低温適応性ウマインフルエンザウィルスを卵内で増殖させることと、前記ウィルスを組織培養細胞内で増殖させることとから選択される方法を含む、低温適応性ウマインフルエンザウィルスを増殖させるための方法。
（項目８） 単離されたウマインフルエンザ核酸分子であって、前記ウマインフルエンザ核酸分子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５及び、前記核酸配列のいずれかと完全に相補的な核酸配列を有する核酸分子より選択される、単離されたウマインフルエンザ核酸分子。
（項目９） 単離されたウマインフルエンザ核酸分子であって、前記ウマインフルエンザ核酸分子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４より選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする、単離されたウマインフルエンザ核酸分子。
（項目１０） 単離されたウマインフルエンザタンパク質であって、前記ウマインフルエンザタンパク質が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４より選択されるアミノ酸配列を有する、単離されたウマインフルエンザタンパク質。
（項目１１） 項目１、３、４、５、７に記載の低温適応性ウマインフルエンザウィルスまたは項目２、３、４または６に記載のリアソータントインフルエンザＡ型ウィルスが、ふ化鶏卵内で、温度約２６℃から約３０℃で複製を行う、項目１、２、３、４、５、６または７に記載の発明。
（項目１２） 項目１、３、４、５、７に記載の低温適応性ウマインフルエンザウィルスまたは項目２、３、４または６に記載のリアソータントインフルエンザＡ型ウィルスが弱毒性である、項目１、２、３、４、５、６または７に記載の発明。
（項目１３） 項目１、３、４、５、７に記載の低温適応性ウマインフルエンザウィルスまたは項目２、３、４または６に記載のリアソータントインフルエンザＡ型ウィルスが温度感受性である、項目１、２、３、４、５、６または７に記載の発明。
（項目１４） 項目１、３、４、５、７に記載の低温適応性ウマインフルエンザウィルスまたは項目２、３、４または６に記載のリアソータントインフルエンザＡ型ウィルスが、ふ化鶏卵内で、温度約２６℃から約３０℃で複製を行うが、組織培養細胞内で、温度約３９℃ではプラークを形成しない、項目１、２、３、４、５、６または７に記載の発明。
（項目１５） 項目１、３、４、５、７に記載の低温適応性ウマインフルエンザウィルスまたは項目２、３、４または６に記載のリアソータントインフルエンザＡ型ウィルスが、ふ化鶏卵内で、温度約２６℃から約３０℃で複製を行うが、組織培養細胞内で、温度約３７℃ではプラークを形成しない、項目１、２、３、４、５、６または７に記載の発明。
（項目１６） 非許容温度約３９℃の表現型が、項目１、３、４、５、７に記載の低温適応性ウマインフルエンザウィルス、または項目２、３、４または６に記載のリアソータントインフルエンザＡ型ウィルスに、前記ウィルスのゲノム中の少なくとも２つの突然変異により与えられ、これらの突然変異が第１の突然変異及び第２の突然変異を有する、項目１、２、３、４、５、６または７に記載の発明。
（項目１７） 前記第１の突然変異が、温度約３９℃でプラーク形成を阻害する表現型を与え、また、前記第１の突然変異が、核タンパク質遺伝子を有する前記ゲノムの分節と共分離する、項目１６に記載の発明。
（項目１８） 前記第２の突然変異が、温度約３９℃でタンパク質合成を阻害する表現型を与える、項目１６に記載の発明。
（項目１９） 少なくとも１つのさらなる突然変異を有し、前記のさらなる突然変異が、非許容温度約３７℃の表現型を与え、前記表現型が、温度約３７℃でのプラーク形成の阻害及び温度約３７℃での後期遺伝子発現の阻害から選択される、項目１６に記載の発明。
（項目２０） 前記低温適応性ウマインフルエンザウィルスを、 ａ．野生型ウマインフルエンザウィルスを継代培養することと、 ｂ．低温で生育するウィルスを選別することと、を含む方法により作製可能な、項目１、３、４または７に記載の発明。
（項目２１） 前記低温適応性ウマインフルエンザウィルスを、前記継代培養及び選別工程を１回またはそれ以上繰り返すことをさらに含む方法により作製し、前記低温を順次低下させる、項目２０に記載の発明。
（項目２２） 前記継代培養工程をふ化鶏卵内で行う、項目２０に記載の発明。
（項目２３） 前記低温適応性ウマインフルエンザウィルスが、優性干渉性表現型を有する、項目２０に記載の発明。
（項目２４） 項目１、３、４、５または７に記載の低温適応性ウマインフルエンザウィルスまたは項目２、３、４または６に記載のゲノム分節が、Ａ／ウマ／ケンタッキー／１／９１（Ｈ３Ｎ８）株に由来する、項目１、２、３、４、５、６または７に記載の発明。
（項目２５） 項目１、３、４、５または７に記載の低温適応性ウマインフルエンザウィルスまたは項目２、３、４または６に記載のゲノム分節が、受託番号ＡＴＣＣ ＶＲ＿＿＿＿で識別されるＥＩＶ−Ｐ８２１；受託番号ＡＴＣＣ ＶＲ＿＿＿＿で識別されるＥＩＶ−Ｐ８２４；受託番号ＡＴＣＣ ＶＲ＿＿＿＿で識別されるＭＳＶ＋５より選択される、項目１、２、３、４、５、６または７に記載の発明。
（項目２６） 項目１、３、４、５または７に記載の前記低温適応性ウマインフルエンザウィルスまたは項目２、３、４または６に記載の前記ゲノム分節が、受託番号ＡＴＣＣ ＶＲ＿＿＿＿で識別されるＥＩＶ−Ｐ８２１；受託番号ＡＴＣＣ ＶＲ＿＿＿＿で識別されるＥＩＶ−Ｐ８２４；受託番号ＡＴＣＣ ＶＲ＿＿＿＿で識別されるＭＳＶ＋５；及び前記いずれかの受託番号の前記いずれかのウィルスの後代より選択される、項目１、２、３、４、５、６または７に記載の発明。
（項目２７） 前記リアソータントウィルスが、 ａ．供与低温適応性ウマインフルエンザウィルスのゲノム分節と受容インフルエンザＡ型ウィルスのゲノム分節とを混合することと、 ｂ．前記供与ウマインフルエンザウィルスの少なくとも１つの表現型を有するリアソータントウィルスを選別することと、を含む方法により作製され、前記表現型が、低温適応性、温度感受性、優性干渉性、弱毒性から選択される、項目２、３または４に記載の発明。
（項目２８） 前記受容インフルエンザＡ型ウィルスのヘマグルチニン及びノイラミニダーゼ表現型が、前記供与ウマインフルエンザウィルスのヘマグルチニン及びノイラミニダーゼ表現型とは異なり、また、前記リアソータントウィルスのヘマグルチニン及びノイラミニダーゼ表現型が、前記受容ウィルスのヘマグルチニン及びノイラミニダーゼ表現型である、項目２７または６に記載の発明。
（項目２９） 前記動物がウマ科動物である、項目３または項目４に記載の発明。
（項目３０） 前記治療用組成物を、ウィルスが上気道の粘膜細胞に侵入可能であるような経路で前記動物に投与する、項目３または項目４に記載の発明。
（項目３１） 前記治療用組成物が低温適応性ウマインフルエンザウィルスを含有し、前記疾患がウマインフルエンザウィルスに起因し、前記治療用組成物を予防的にウマ科動物に投与することにより、前記ウマ科動物体内のウマインフルエンザウィルスに対する免疫反応を惹起する、項目３または項目４に記載の発明。
（項目３２） 前記治療用組成物が、前記ウィルスを約１０ ^５ ＴＣＩＤ _５０ 単位から約１０ ^８ ＴＣＩＤ _５０ 単位含有する、項目３または項目４に記載の発明。
（項目３３） 前記治療用組成物が、賦形剤をさらに含有する、項目３または項目４に記載の発明。
（項目３４） 前記核酸分子が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５から選択される核酸配列を有する低温適応性ウマインフルエンザウィルスを含む、項目８に記載の発明。
（項目３５） 前記核酸分子が、Ｍタンパク質をコードする低温適応性ウマインフルエンザウィルスを含み、前記Ｍタンパク質のアミノ酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５を有する、項目８に記載の発明。
（項目３６） 前記核酸分子が、ＨＡタンパク質をコードする低温適応性ウマインフルエンザウィルスを含み、前記ＨＡタンパク質のアミノ酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１を有する、項目８に記載の発明。
（項目３７） 前記核酸分子が、ＰＢ２−Ｎタンパク質をコードする低温適応性ウマインフルエンザウィルスを含み、前記ＰＢ２−Ｎタンパク質のアミノ酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７を有する、項目８に記載の発明。
（項目３８） 前記核酸分子が、ＰＢ２−Ｃタンパク質をコードする低温適応性ウマインフルエンザウィルスを含み、前記ＰＢ２−Ｃタンパク質のアミノ酸配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４を有する、項目８に記載の発明。

発明の詳細な説明
本発明は、いくつかの規定された表現型を有する、実験的に作製された低温適応性ウマインフルエンザウィルスを提供し、それらをここに開示する。ここで使用する「１つの」物体は、１つ又はそれ以上の物体を指す。例えば、「１つの低温適応性ウマインフルエンザウィルス」は、１つ又はそれ以上の低温適応性ウマインフルエンザウィルスを含みうる。従って、「１つの」、「１つまたはそれ以上の」及び「少なくとも１つの」という語は、ここでは互換的に使用可能である。また、「備える」、「含む」及び「有する」という語も互換的に使用可能であることに留意されたい。さらに、「から選択される」物体は、そのグループの１つまたはそれ以上の物体に関し、それらの組み合わせを含む。

本発明の低温適応性ウマインフルエンザウィルスは、実験室内で作製されたウィルスであり、従って、天然に発生するウィルスではない。本発明が、そのような低温適応性ウマインフルエンザウィルスの識別発現型を有するウィルスも含むので、天然に発生したウィルスの混合物から分離された、すなわち、天然の環境から隔離されたがクレームされた表現型を有するウマインフルエンザウィルスは、本発明に含まれる。本発明の低温適応性ウマインフルエンザウィルスは、特定のレベルの純度を必要としない。例えば、ふ化鶏卵内で生育した低温適応性ウマインフルエンザウィルスは、尿膜腔液（ＡＦ）と混合していてもよいし、また、組織培養細胞内で生育した低温適応性ウマインフルエンザウィルスは、破砕細胞及び組織培地と混合していてもよい。

ここで使用される「ウマインフルエンザウィルス」という用語は、例えばウマ及び子馬などのウマ科の動物に感染し、その体内で生育するインフルエンザウィルスを指す。ここで使用される、ウィルスの「生育」という用語は、ウィルスが、許容宿主細胞内で生殖または自身を「複製」する能力を意味する。従って、「ウィルスの生育」及び「ウィルスの複製」という用語は、ここでは互換可能に用いられる。特定の宿主細胞内でのウィルスの生育または複製を、ウィルス学の分野の熟練技術者に公知の標準的方法で観察及び測定してもよい。例えば、感染したウマの鼻咽頭分泌物に含まれるような、感染性のウィルスを含有するサンプルを、例えば組織培養細胞中のウィルスプラークなど、細胞変性作用（ＣＰＥ）を起こさせる能力について検査する。サンプルをふ化鶏卵の尿膜腔内に接種し、次いで、接種された鶏卵のＡＦを、赤血球細胞を凝集させる能力、すなわち、ＡＦ内にインフルエンザウィルスヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質が存在することに起因する赤血球凝集反応を引き起こす能力について検査することにより、感染性のウィルスを検出してもよい。

天然に発生する、すなわち、野生型のウマインフルエンザウィルスは、温度約３４℃から約３９℃で良好に複製を行う。例えば、野生型ウマインフルエンザウィルスは、ふ化鶏卵内で、温度約３４℃で複製を行い、また、組織培養細胞中では、温度約３４℃から約３９℃で複製を行う。ここで用いられる「低温適応性の」ウマインフルエンザウィルスという用語は、ウマインフルエンザウィルスの最適生育温度よりも低い温度で生育するように適応されたウマインフルエンザウィルスを指す。本発明の低温適応性のウマインフルエンザウィルスの一例に、ふ化鶏卵内で、温度約３０℃で複製を行うウィルスがある。本発明の好適な低温適応性のウマインフルエンザウィルスは、ふ化鶏卵内で、温度約２８℃で複製を行う。本発明の別の好適な低温適応性のウマインフルエンザウィルスは、ふ化鶏卵内で、温度約２６℃で複製を行う。一般に、本発明の好適な低温適応性のウマインフルエンザウィルスは、ふ化鶏卵内で、温度約２６℃から約３０℃の範囲内で、すなわち、野生型ウィルスが殆どまたは全く生育しない温度で、複製を行う。これらのウィルスがこの温度範囲内で複製を行う能力を有することは、これらのウィルスが、より高いまたはより低い温度でも複製を行う能力を排除するものではないことに留意されたい。例えば、一実施例は、ふ化鶏卵内で、温度約２６℃で複製を行うが、組織培養細胞中で、温度約３４℃でも複製を行う低温適応性ウマインフルエンザウィルスである。野生型インフルエンザウィルスと同様に、本発明の低温適応性ウマインフルエンザウィルスもまた、組織培養細胞中、例えばＭａｄｉｎ Ｄａｒｂｙイヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）中で、温度約３４℃で一般にプラークを形成する。本発明の適当な及び好適な低温適応性のウマインフルエンザウィルスの例を、ここに開示する。

本発明の一実施例は、野生型ウマインフルエンザウィルスを継代培養することと、次いで、低温で生育するウィルスを選別することとを含む方法で作製された、低温適応性のウマインフルエンザウィルスである。本発明の低温適応性ウマインフルエンザウィルスを、例えば、野生型インフルエンザウィルスを、ふ化鶏卵内で、温度を順次低下させながら連続的に継代培養することにより、ウィルス混合体の中から、低温で安定して複製を行う複数のウィルスを選択して作製してもよい。継代培養の手順の一例を、例の項に詳しく開示する。継代培養工程の間に、１つまたはそれ以上の突然変異が、このインフルエンザウィルスのゲノムを有する一本鎖ＲＮＡ分節の複数に起こり、これらのＲＮＡ分節の遺伝子型、すなわち、これらのＲＮＡ分節の初期ヌクレオチド配列を変化させる。ここで使用される「突然変異」という用語は、インフルエンザウィルスゲノムを構成している任意のＲＮＡ分節の初期ヌクレオチド配列の変化を指す。突然変異の例には、１つまたはそれ以上のヌクレオチドの置換、１つまたはそれ以上のヌクレオチドの欠失、１つまたはそれ以上のヌクレオチドの挿入、または、２つまたはそれ以上のヌクレオチド切片の逆位がある。ウィルス混合体の中から、低温で安定して複製を行う複数のウィルスを選択することにより、低温適応性表現型を有するウィルスを選別する。ここで使用される「表現型」という用語は、細胞やウィルスのような生物学的実体の観察可能なまたは測定可能な特徴を指し、この観察される特徴は、その生物学的実体の特定の遺伝子構成、すなわち、ある遺伝子型に帰するものである。従って、低温適応性表現型は、ウィルスゲノムの１つまたはそれ以上の突然変異の結果である。ここで使用される「突然変異」、「ゲノム」、「遺伝子型」または「表現型」という用語は、１つまたはそれ以上の、または少なくとも１つの突然変異、ゲノム、遺伝子型、または表現型をそれぞれ指す。

低温適応性ウマインフルエンザウィルスのさらに別の、観察可能な表現型が発現してもよく、それらの表現型は、一般に、そのようなウィルスのゲノムにおける１つまたはそれ以上の別の突然変異の結果として発現するであろう。例えば、本発明の低温適応性ウマインフルエンザウィルスは、さらに、弱毒性であり、優性干渉性を発揮し、及び／又は温度感受性であってもよい。

一実施例においては、本発明の低温適応性ウマインフルエンザウィルスは、弱毒性の特徴を持つ表現型を有する。低温適応性ウマインフルエンザウィルスが「弱毒性」であるというのは、このウィルスを、ウマインフルエンザウィルス感受性の動物に投与した結果、その動物に観察される臨床症状が、野生型ウマインフルエンザウィルスに感染した動物に観察される 臨床症状と比較して、軽症であるか、または全く観察されない場合を指す。例えば、野生型ウマインフルエンザウィルスに感染した動物は、発熱、くしゃみ、咳、抑うつ、及び鼻汁などの症状を呈するであろう。これに対し、本発明の弱毒化された低温適応性ウマインフルエンザウィルスを投与された動物は、臨床症状を呈示するとしても最小であるか、または全く呈示しない、すなわち、症状が検出不可能であろう。

別の一実施例においては、本発明の低温適応性ウマインフルエンザウィルスは、温度感受性表現型を有する。ここで説明される温度感受性の低温適応性ウマインフルエンザウィルスは、低温では複製を行うが、野生型ウィルスが複製及びプラーク形成を行うようなより高い温度では、組織培養細胞中で複製またはプラーク形成を行わない。理論に拘束されるわけではないが、温度感受性表現型を有するウマインフルエンザウィルスが複製を行う場所は、主として上気道の低温の通路に限られ、ウィルスがより疾患の症状を引き起こしやすい下気道内では良好に複製を行わないと信じられている。温度感受性のウィルスが生育する温度は、ここでは、その温度感受性ウィルスにとっての「許容」温度として述べられる。そして、その温度感受性ウィルスが生育しないが、対応する野生型ウィルスが生育するような、より高い温度は、ここでは「非許容」温度として述べられている。例えば、本発明の複数の温度感受性の低温適応性ウマインフルエンザウィルスは、ふ化鶏卵内で、約３０℃またはそれ以下の温度で複製を行い、好適には約２８℃または約２６℃で複製を行い、許容温度約３４℃では組織培養細胞中でプラークを形成するが、非許容温度約３９℃では組織培養細胞中でプラークを形成しない。本発明の他の温度感受性の低温適応性ウマインフルエンザウィルスは、ふ化鶏卵内で、約３０℃またはそれ以下の温度で複製を行い、好適には約２８℃または約２６℃で複製を行い、許容温度約３４℃では組織培養細胞中でプラークを形成するが、非許容温度約３７℃では組織培養細胞中でプラークを形成しない。

本発明の複数の低温適応性ウマインフルエンザウィルスは、優性干渉性表現型を有する。すなわち、細胞内に別のインフルエンザＡ型ウィルスと共感染した時に、優先的に感染することにより、この別のウィルスの生育を抑制する。例えば、優性干渉性表現型を有する本発明の低温適応性ウマインフルエンザウィルスが、ＭＤＣＫ細胞に、野生型親ウマインフルエンザウィルス、Ａ／ウマ／ケンタッキー／１／９１（Ｈ３Ｎ８）と共感染した場合、この親ウィルスの生育が阻害される。従って、ビルレントインフルエンザウィルス、すなわち、疾患症状を引き起こすインフルエンザウィルスに最近曝された、またはまもなく曝されるかもしれない動物の上気道に、優性干渉性表現型を有する低温適応性ウマインフルエンザウィルスを含有する治療用組成物を投与すれば、そのビルレントウィルスの生育が阻害されるので、そのウィルスに対する免疫反応がない場合でも、その動物の疾患は改善または軽減されるであろう。

温度感受性を有する低温適応性ウマインフルエンザウィルスの優性干渉性を、標準的なウィルス学的手法により測定してもよい。例えば、ＭＤＣＫ細胞の分離単層を、（ａ）ビルレント野生型インフルエンザＡ型ウィルス、（ｂ）温度感受性、低温適応性ウマインフルエンザウィルス、及び（ｃ）これら両方のウィルスに感染させてもよい。これらの感染は全て、細胞当たり約２プラーク形成単位（ｐｆｕ）の感染多重度（ＭＯＩ）でなされる。感染後、様々な感染細胞からのウィルス産生量を、複製プラークアッセイにより、その低温適応性ウマインフルエンザウィルスの許容温度および非許容温度で測定する。温度感受性表現型を有する低温適応性ウマインフルエンザウィルスは、非許容温度ではプラークを形成できないが、野生型ウィルスは、許容温度でも非許容温度でもプラークを形成できる。従って、野生型ウィルスのみに感染した細胞の非許容温度でのウィルス産生量を、両方のウィルスに感染した細胞の非許容温度でのウィルス産生量と比較することにより、低温適応性ウィルスが存在する条件下での野生型ウィルスの生育を測定することが可能である。

本発明の低温適応性ウマインフルエンザウィルスは、主な特徴として、以下の識別表現型：低温適応性、温度感受性、優性干渉性、及び／又は弱毒性のうちの１つまたはそれ以上を有する。ここで用いられる「ウマインフルエンザウィルスが低温適応性、温度感受性、優性干渉性、及び／又は弱毒性の識別表現型を有する」という表現は、そのような表現型の１つまたはそれ以上を有するウィルスに関する。そのようなウィルスの例には、受託番号ＡＴＣＣ ＶＲ＿＿＿＿で識別されるＥＩＶ−Ｐ８２１、受託番号ＡＴＣＣ ＶＲ＿＿＿で識別されるＥＩＶ−Ｐ８２４、受託番号ＡＴＣＣ ＶＲ＿＿＿で識別されるＥＩＶ−ＭＳＶ＋５、及びＥＩＶ−ＭＳＶ０、ＥＩＶ、ＭＳＶ＋１、ＥＩＶ−ＭＳＶ＋２、ＥＩＶ−ＭＳＶ＋３、ＥＩＶ−ＭＳＶ＋４があるが、これらに限定されることはない。これらのウィルスの作製については、例で説明する。例えば、低温適応性ウマインフルエンザウィルスＥＩＶ−Ｐ８２１は、（ａ）例えば、ふ化鶏卵内で、温度約２６℃で複製を行う能力などの低温適応性と、（ｂ）例えば、非許容温度約３７℃では、組織培養細胞内でプラーク形成及び後期遺伝子産物の発現を行うことができず、また、非許容温度約３９℃では、組織培養細胞中でプラーク形成及びいかなるウィルスタンパク質の合成も行うことができないなどの温度感受性、（ｃ）ウマインフルエンザウィルス感受性の動物に投与した場合の弱毒性、及び、（ｄ）例えば、細胞内に野生型インフルエンザＡ型ウィルスと共感染した場合に、その野生型ウィルスの生育を阻害するなどの優性干渉性により特徴づけられる、すなわち、これらの識別表現型を有する。同様に、低温適応性ウマインフルエンザウィルスＥＩＶ−Ｐ８２４は、（ａ）例えば、ふ化鶏卵内で、温度約２８℃で複製を行う能力などの低温適応性と、（ｂ）例えば、非許容温度約３９℃では、組織培養細胞中でプラーク形成を行うことができないなどの温度感受性、及び、（ｃ）例えば、細胞内に野生型インフルエンザＡ型ウィルスと共感染した場合に、その野生型ウィルスの生育を阻害するなどの優性干渉性により特徴づけられる。別の一例では、低温適応性ウマインフルエンザウィルスＥＩＶ−ＭＳＶ＋５は、（ａ）例えば、温度約２６℃で、ふ化鶏卵内で複製を行うことができるなどの低温適応性、（ｂ）例えば、非許容温度約３９℃では、組織培養細胞中でプラーク形成を行うことができないなどの温度感受性、及び、（ｃ）ウマインフルエンザウィルス感受性の動物に投与した場合の弱毒性により特徴づけられる。

複数の例では、ある表現型に関与する１つ又はそれ以上の突然変異が発生するＲＮＡ分節を、ここに述べる標準的な方法を用いたリアソートメント分析により決定してもよい。一実施例においては、本発明の低温適応性ウマインフルエンザウィルスは、このウィルスのゲノム中の少なくとも２つの突然変異と相関する、温度感受性表現型を有する。この実施例では、ここに述べるリアソートメント分析により位置決定された、前記２つの突然変異のうちの１つが、ウィルスが組織培養細胞中で非許容温度３９℃でプラークを形成する能力を抑制、すなわち、阻害または防止する。この突然変異は、ウマインフルエンザウィルスゲノム中の、このウィルスの核タンパク質（ＮＰ）遺伝子をコードする分節と共分離する。すなわち、この突然変異は、このＮＰ遺伝子と同じＲＮＡ分節に位置する。この実施例の第２の突然変異は、非許容温度約３９℃で、全てのタンパク質の合成を阻害する。従って、この非許容温度では、このウィルスのゲノムは、いかなるウィルスタンパク質も発現できない。これらの特徴を持つ低温適応性ウマインフルエンザウィルスの例に、ＥＩＶ−Ｐ８２１及びＥＩＶ ＭＳＶ＋５がある。ＥＩＶ−Ｐ８２１を、例１Ａで説明する方法を用いて、ふ化鶏卵内で野生型インフルエンザウィルスを連続的に継代培養することにより作製した。 ＥＩＶ ＭＳＶ＋５を、例１Ｅで説明する方法を用いて、ＥＩＶ−Ｐ８２１をさらに連続的に継代培養することにより得た。

さらに、非許容温度約３９℃でプラーク形成及びウィルスタンパク質の合成を阻害する２つの突然変異を有する、低温適応性かつ温度感受性のウマインフルエンザウィルスは、そのウィルスが組織培養細胞中で非許容温度約３７℃で後期遺伝子を発現し及びプラークを形成する能力を阻害する、１つまたはそれ以上の突然変異を有してもよい。これらの特徴を有する低温適応性ウマインフルエンザウィルスの一例に、ＥＩＶ−Ｐ８２１がある。このウィルス分離株は、温度約２６℃では、ふ化鶏卵内で複製を行い、温度約３９℃では、プラーク形成もいかなるウィルスタンパク質の合成も行わない。さらに、ＥＩＶ−Ｐ８２１は、非許容温度約３７℃では、ＭＤＣＫ細胞でプラークを形成せず、また、この温度では、後期遺伝子の発現が阻害される。この阻害は、後期遺伝子が生成されない、すなわち、通常レベルのＮＰタンパク質が合成され、低レベル又は検出不可能なレベルのＭ１又はＨＡタンパク質が合成され、高レベルのポリメラーゼタンパク質が合成されるような方法で行われる。この表現型は、特異なウィルスタンパク質合成により特徴づけられるため、非許容温度約３９℃での全てのウィルスタンパク質合成の阻害により特徴づけられるタンパク合成表現型との相違は明白である。

米国連邦規制基準３７の１．８０２（ａ−ｃ）により、ここでＥＩＶ−Ｐ８２１及びＥＩＶ−Ｐ８２４として表される低温適応性ウマインフルエンザウィルスは、ブダペスト条約に基づき、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ、２０１１０−２２０９ バージニア州、マナッサス、ユニバーシティ・ブルヴァール１０８０１）に、それぞれＡＴＣＣ受託番号 ＡＴＣＣ ＶＲ−＿＿＿及びＡＴＣＣ ＶＲ−＿＿＿として、１９９８年７月１１日に寄託された。低温適応性ウマインフルエンザウィルスＥＩＶ−ＭＳＶ＋５は、ＡＴＣＣに、ＡＴＣＣ受託番号ＡＴＣＣ ＶＲ−＿＿＿として、１９９８年８月３日に寄託された。米国連邦規制基準３７の１．８０６により、寄託は少なくとも３０年間維持され、かつ当該サンプルの最終の分譲請求を寄託期間が受領したのち少なくとも５年間維持される。連邦規則コード３７の１．８０８（ａ）（２）により、寄託者が分譲に関して設けた全ての制限は、特許の取得と同時に無効となり、これを取り消すことはできない。

本発明の好適な低温適応性ウマインフルエンザウィルスは、ＥＩＶ−Ｐ８２１、ＥＩＶ−Ｐ８２４及び ＥＩＶ−ＭＳＶ＋５の識別表現型を有する。特に好適な低温適応性ウマインフルエンザウィルスは、ＥＩＶ−Ｐ８２１、ＥＩＶ−Ｐ８２４及び ＥＩＶ−ＭＳＶ＋５、及びこれらのウィルスの後代を包含する。ここで使用される「後代」とは、「子孫」であり、従って、親ウィルスと比較してわずかに異なる表現型であってもよいが、その親ウィルスの、例えば低温適応性、温度感受性、優性干渉性、または弱毒性などの識別表現型を保持する。例えば、低温適応性ウマインフルエンザウィルスＥＩＶ−ＭＳＶ＋５は、低温適応性ウマインフルエンザウィルスＥＩＶ−Ｐ８２１の「後代」である。「後代」は、供与親ウィルスの１つまたはそれ以上の識別表現型を有するリアソータントインフルエンザＡ型ウィルスもまた包含する。

本発明のリアソータントインフルエンザＡ型ウィルスは、本発明の供与低温適応性ウマインフルエンザウィルスのゲノム分節と受容インフルエンザＡ型ウィルスのゲノム分節との遺伝子リアソートメントを行った後に、８つのＲＮＡゲノム分節のうちの少なくとも１つが供与ウィルスに由来するリアソータントウィルスを選別るすことにより、このリアソータントウィルスが、供与低温適応性ウマインフルエンザウィルスの少なくとも１つの識別表現型を獲得するような方法で作製される。識別表現型は、低温適応性、温度感受性、弱毒性及び優性干渉性を含む。好適には、本発明のリアソータントインフルエンザＡ型ウィルスの少なくとも弱毒性表現型は、供与ウィルスに由来する。リアソータントインフルエンザウィルスを分離する方法は、ウィルス学の分野の熟練技術者に公知であり、例えば、Ｆｉｅｌｄｓ， ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，
３ｄ ｅｄ．， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ、 Ｐａｌｅｓｅ， ｅｔ ａｌ．， １９７６， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， １７， ８７６−８８４． Ｆｉｅｌｄｓ， ｅｔ ａｌ．， 同上、及び Ｐａｌｅｓｅ， ｅｔ ａｌ．， 同上、に開示されている。

好適な供与ウマインフルエンザウィルスは、本発明の低温適応性ウマインフルエンザウィルスであり、例えば、受託番号ＡＴＣＣ ＶＲ＿＿＿＿で識別されるＥＩＶ−Ｐ８２１、受託番号ＡＴＣＣ ＶＲ＿＿＿＿で識別されるＥＩＶ−Ｐ８２４、又は、受託番号ＡＴＣＣ ＶＲ＿＿＿＿＿で識別されるＥＩＶ−ＭＳＶ＋５である。好適な受容インフルエンザＡ型ウィルスは、別のウマインフルエンザウィルス、例えば、Ａ／ウマ／サフォーク／８９（Ｈ３Ｎ８）などのユーラシア亜型２ウマインフルエンザウィルスまたはＡ／プラハ／１／５６（Ｈ７Ｎ７）などの亜型１インフルエンザウィルスであってもよい。受容インフルエンザＡ型ウィルスもまた、供与低温適応性ウマインフルエンザウィルスを用いてリアソータントウィルスを作製することの可能な任意のインフルエンザＡ型ウィルスであってもよい。そのようなインフルエンザＡ型ウィルスの例には、Ａ／プエルトリコ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／香港／１５６／９７（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／シンガポール／１／５７（Ｈ２Ｎ２）及びＡ／香港／１／６８（Ｈ３Ｎ２）などのヒトインフルエンザウィルス、Ａ／ブタ／アイオワ／１５／３０（Ｈ１Ｎ１）などのブタウィルス、及びＡ／マガモ／ニューヨーク／６７５０／７８（Ｈ２Ｎ２）及びＡ／ニワトリ／香港／２５８／９７（Ｈ５Ｎ１）などの鳥ウィルスがあるが、これらに限定されることはない。本発明のリアソータントウィルスは、その結果得られるリアソータントインフルエンザウィルスが供与ウィルスの少なくとも１つの識別表現型を有する限り、供与及び受容遺伝子分節の任意の組み合わせを含んでもよい。

本発明のリアソータントウィルスの一例は、”６ ＋ ２”リアソータントウィルスである。このウィルスの６つの「内部遺伝子分節」、すなわち、ＮＰ、ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、Ｍ及びＮＳ遺伝子を持つ分節は、供与低温適応性ウマインフルエンザウィルスに由来し、また、このウィルスの２つの「外部遺伝子分節」、すなわち、ＨＡ及びＮＡ遺伝子を持つ分節は、受容インフルエンザＡ型ウィルスに由来する。このようにして作製されたウィルスは、供与低温適応性ウマインフルエンザウィルスの弱毒性、低温適応性、温度感受性、及び／又は優性干渉性表現型を有するが、受容株の抗原性は有しない。

さらに別の一実施例においては、本発明の低温適応性ウマインフルエンザウィルスを、組換え手段により作製してもよい。この方法では、識別された低温適応性、弱毒性、温度感受性または優性干渉性表現型に関連する１つまたはそれ以上の特異的突然変異を同定し、リバース遺伝工学的方法を用いて野生型ウマインフルエンザウィルス株に再導入する。リバース遺伝工学的方法では、インフルエンザウィルスに感染した細胞から分離したＲＮＡポリメラーゼ複合体を使用して、当該変異を有する人工インフルエンザウィルスゲノム分節を転写し、この合成されたＲＮＡ分節を、ヘルパーウィルスを用いてウィルス粒子内に組み込み、所望の変化を含むウィルスを選別する。インフルエンザウィルスへのリバース遺伝工学的方法の使用は、例えば、Ｅｎａｍｉ， ｅｔ ａｌ．， １９９０， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８７， ３８０２−３８０５及び１９９６年１１月２６日に発行された、Ｐａｌｅｓｅ， ｅｔ ａｌ．による米国特許５，５７８，４７３に述べられている。この方法を用いて、当業者は、冗長な低温適応工程を経ることなく、また、所望のウィルス表現型を有する突然変異体を、インヴィトロおよびインヴィヴォの両方で選別する工程を経ることなく、本発明の別の低温適応性ウマインフルエンザウィルスを作製できる。

本発明の低温適応性ウマインフルエンザウィルスを、当業者に公知の標準的なウィルス学的方法を用いて増殖させてもよい。そのような方法の例をここに開示する。例えば、低温適応性ウマインフルエンザウィルスを、ふ化鶏卵中で生育させてもよいし、真核性組織培養細胞中で生育させてもよい。本発明の低温適応性ウマインフルエンザウィルスがその中で生育可能な、好適な無限継代真核細胞株は、インフルエンザウィルスの生育を補助する、例えばＭＤＣＫ細胞などの細胞株を含む。本発明の低温適応性ウマインフルエンザウィルスがその中で生育可能な、他の好適な細胞には、サル、子ウシ、ハムスターまたはニワトリの初代腎臓細胞があるが、これらに限定されることはない。

一実施例においては、本発明は、インフルエンザＡ型ウィルスに起因する疾患から動物を保護するための治療用組成物を提供する。この治療用組成物は、低温適応性ウマインフルエンザウィルスまたは低温適応により作製されたウマインフルエンザウィルスの少なくとも１つのゲノム分節を有するリアソータントインフルエンザＡ型ウィルスのいずれかを含む。このウマインフルエンザウィルスのゲノム分節は、低温適応性ウマインフルエンザウィルスの少なくとも１つの識別表現型を付与する。さらに、本発明の治療用組成物は、本発明の低温適応性ウマインフルエンザウィルスのある識別表現型を付与することが識別されている１つまたはそれ以上の突然変異を有するように遺伝子操作されたウマインフルエンザウィルスを含んでもよい。ここで使用される「インフルエンザＡ型ウィルスに起因する疾患」という語句は、ビルレントインフルエンザＡ型ウィルスに感染している動物に観察される臨床症状に関する。そのような臨床症状の例には、発熱、くしゃみ、咳、鼻汁、水疱音、食欲減退および抑うつがあるが、これらに限定されることはない。さらに、「インフルエンザＡ型ウィルスに起因する疾患」は、ここでは、感染した動物によるビルレントウィルスの放散を包含するものとして定義される。ある動物に観察される臨床症状と、ビルレントウマインフルエンザウィルスによる感染との関連は、その動物中のウマインフルエンザウィルスに対する特定の抗体及び／又はＴ細胞応答の検出を含めた複数の方法で確認してもよい。好適には、ある動物に観察される臨床症状と、ビルレントウマインフルエンザウィルスによる感染との関連を、例えば、感染した動物の鼻咽頭腔から、ウィルスを含有する分泌物を綿棒で採取して、感染した動物からウィルスを分離することにより確認する。ウィルス分離は、分離された分泌物を接種した組織培養細胞中の細胞変性効果を検出するか、分離された分泌物をふ化鶏卵内に接種し、そこで、接種された卵から採取したＡＦの持つ、インフルエンザウィルスのヘマグルチニンタンパク質の存在を示唆する赤血球凝集能力から、ウィルス複製を検出するか、または、例えば、Ｄｉｒｅｃｔｉｇｅｎ（登録商標） ＦＬＵ Ａテストなどの、一般に利用可能な診断テストを行うことにより、確認される。

ここで使用される「保護する」という用語は、例えば、被験動物のインフルエンザＡ型ウィルス感染の防止または治療を含む。従って、本発明の治療用組成物を、例えば予防接種ワクチンとして、被験動物が当該ビルレントウィルスに曝される以前のある時点で、その動物に投与し、その動物をインフルエンザ疾患から保護するために使用してもよい。

優性干渉性表現型を有する低温適応性ウマインフルエンザウィルスを含有する本発明の治療用組成物を、ビルレントインフルエンザＡ型ウィルスに最近感染した、または今後数日以内にそのようなウィルスに曝される可能性のある動物を保護するために使用してもよい。この場合、この治療用組成物は、動物がそのビルレントウィルスに対する抗体を産生する以前に、そのビルレントウィルスの生育を迅速に阻害する。優性干渉性表現型を有する低温適応性ウマインフルエンザウィルスを含有する治療用組成物を、今後予想される曝露の前に、本発明の低温適応性ウマインフルエンザウィルスが、治療される動物の上気道で複製を行うおおよその期間、例えば約７日間まで、に相当する期間、効果的に投与してもよい。優性干渉性表現型を有する低温適応性ウマインフルエンザウィルスを含有する治療用組成物を、ビルレントウマインフルエンザウィルスに曝された後に、感染した動物が疾患症状を呈示するのに必要な期間、例えば約２日間まで、に相当する期間、効果的に投与してもよい。

本発明の治療用組成物は、例えば、ヒト、ブタ、ウマ及びその他のウマ科動物、水生鳥類、家禽、闘鶏、アザラシ、ミンク、クジラなどの、インフルエンザウィルス疾患感受性の任意の動物に投与可能である。より好適には、本発明の治療用組成物は、ウマインフルエンザウィルス疾患から保護するために、ウマに投与される。

ウマをウマインフルエンザウィルス疾患から保護するために利用できる現在のワクチンは、子馬の保護には有効ではないが、それはおそらく、これらのワクチンは、子馬の体内に存在する母親の抗体を克服することができないためであり、このため、多くの場合、例えば生後３ヶ月などの若齢でのワクチン投与は、免疫性よりもむしろ薬剤耐性に結びつくおそれがある。一実施例においては、既存のウマインフルエンザウィルスワクチンとは異なり、本発明の低温適応性ウマインフルエンザウィルスを含有する治療用組成物は、明らかに若齢の動物に免疫性を付与することが可能である。従って、本発明の治療用組成物を、生後約３ヶ月程度の子馬に、薬剤耐性を誘発することなくウマインフルエンザ疾患から保護するために、安全かつ効果的に投与することが可能である。

一実施例においては、本発明の治療用組成物は、多価性であってもよい。例えば、本発明の１つまたはそれ以上の低温適応性ウマインフルエンザウィルス、１つまたはそれ以上のリアソータントインフルエンザＡ型ウィルス、及び／又は、本発明の１つまたはそれ以上の遺伝子組換えされたウマインフルエンザウィルスの組み合わせを提供することにより、ある動物を１つまたはそれ以上のインフルエンザＡ型ウィルス株から保護してもよい。多価性治療用組成物は、例えば、Ａ／ウマ／ケンタッキー／１／９１（Ｈ１Ｎ８）のような北米亜型−２ウィルス分離株とＡ／ウマ／サフォーク／８９（Ｈ３Ｎ８）のようなユーラシア亜型−２ウィルス分離株、または、１つまたはそれ以上の亜型−２ウィルス分離株とＡ／ウマ／プラハ／１／５６（Ｈ７Ｎ７）のような１つの亜型−１ウィルス分離株に抗する、少なくとも２つの低温適応性ウマインフルエンザウィルスを含んでもよい。同様に、本発明の多価性治療用組成物は、本発明の低温適応性ウマインフルエンザウィルスとリアソータントインフルエンザＡ型ウィルス、または、本発明の２つのリアソータントインフルエンザＡ型ウィルスを含んでもよい。本発明の多価性治療用組成物は、インフルエンザＡ型ウィルスに加えて、１つまたはそれ以上の他の感染因子からも保護するための１つまたはそれ以上の製剤をさらに含んでもよい。そのような別の感染因子には、ウィルス類、細菌類、真菌類及び真菌類微生物類、及び寄生虫類があるが、これらに限定されることはない。好適な多価性治療用組成物には、本発明の低温適応性ウマインフルエンザウィルス、リアソータントインフルエンザＡ型ウィルス、または遺伝子組換えウマインフルエンザウィルスと、ウマを罹患させる１つまたはそれ以上の感染因子から防御するための１つまたはそれ以上の組成物との組み合わせがあるが、これらに限定されることはない。対抗すべき好適な感染因子には、ウマ感染性貧血症ウィルス、ウマヘルペスウィルス、東部、西部、またはベネズエラウマ脳炎ウィルス、破傷風、ストレプトコッカス−エクイ、及びＥｈｒｌｉｃｈｉａ ｒｅｓｔｉｃｉｉがあるが、これらに限定されることはない。

本発明の治療用組成物を、治療されるべき動物が許容可能な賦形剤中で調剤してもよい。そのような賦形剤の例として、水、生理食塩水、リンゲル液、ブドウ糖液、ハンクス液、及びその他の生理的平衡食塩水がある。賦形剤はまた、等張性及び、化学的または生物学的安定性を増強する物質のような微量の添加物も含有してもよい。バッファの例には、リン酸バッファ、重炭酸バッファおよびトリスバッファがあり、安定化剤の例には、アイオワ州デモイン、ダイアモンド・アニマル・ヘルス社より入手可能なＡ１／Ａ２安定化剤がある。標準的な製剤は、動物へ投与するための懸濁液または溶液に適した液体中に溶解可能な、液体または固体のいずれでもよい。一実施例においては、非液体製剤は、投与の前に滅菌水または生理食塩水を加えることの可能な食塩、バッファ、安定化剤などの添加剤を含有してもよい。

本発明の治療用組成物は、１つまたはそれ以上のアジュバントまたは担体を含有してもよい。典型的なアジュバントは、特定の抗原に対する動物の免疫反応を増強する物質であり、また、担体は、治療される動物の体内での治療用組成物の半減期を延ばす化合物を含む。本発明の低温適応性ウマインフルエンザウィルスまたはリアソータントインフルエンザＡ型ウィルスを含有する治療用組成物の利点の一つは、有効なワクチンの調製にアジュバント及び担体を必要としないことである。さらに、当業者に公知の多くの場合において、アジュバントまたは担体の使用が、本発明の治療用組成物の利点を妨げることがあるかもしれない。しかし、本発明はアジュバントまたは担体の使用を予め排除するものではないことに留意すべきである。

本発明の治療用組成物は、ビルレントウマインフルエンザウィルスの攻撃からある動物を保護するのに十分な量の低温適応性ウマインフルエンザウィルスを含む。一実施例においては、本発明の治療用組成物は、５０％組織培養感染価（ＴＣＩＤ_５０）約１０^５単位から約１０^８単位の低温適応性ウマインフルエンザウィルスを含んでもよい。ここで使用される「ＴＣＩＤ_５０単位」とは、感染した培養細胞の５０％に細胞変性効果を及ぼすウィルス量である。ＴＣＩＤ_５０を測定及び算出する方法は、当業者に周知であり、例えば、Ｒｅｅｄ ａｎｄ Ｍｕｅｎｃｈ， １９３８， Ａｍ． Ｊ． ｏｆ Ｈｙｇ． ２７， ４９３−４９７に記載されている。本発明の好適な治療用組成物は、本発明の低温適応性ウマインフルエンザウィルスまたはリアソータントインフルエンザＡ型ウィルスを、約１０^６ＴＣＩＤ_５０単位から約１０^７ＴＣＩＤ_５０単位含有し、より好適には、本発明の低温適応性ウマインフルエンザウィルスまたはリアソータントインフルエンザＡ型ウィルスを、約２×１０^６ＴＣＩＤ_５０単位含有している。

本発明は、本発明の治療用組成物の動物への投与を含めた、動物をインフルエンザＡ型ウィルスに起因する疾患から保護するための方法も含む。好適な方法は、ウマ科動物をウマインフルエンザウィルスに起因する疾患から保護するための方法であり、これらの方法は、そのウマ科動物への低温適応性ウマインフルエンザウィルスの投与を含む。効果的な方法で治療用組成物を投与するための容認可能なプロトコルは、個別の投与量、投与回数、投与頻度及び投与方式を含む。これらのプロトコルの決定は当業者によってなされ、ここにその例を開示する。

インフルエンザＡ型ウィルスにより引き起こされる疾患から動物を保護するための好適な方法は、本発明の低温適応性ウマインフルエンザウィルス、リアソータントインフルエンザウィルスまたは遺伝子組換えウマインフルエンザウィルスを含有する治療用組成物を１回量投与することを含む。好適な１回量は、適切な間隔で１回またはそれ以上の回数投与した時に、動物を疾患から保護することの可能な投与量である。本発明の方法は、治療用組成物の後続的、またはブースター投与も含んでもよい。ブースター投与は、最初の投与後約２週間から約２年間行われてもよい。ブースター投与は、その動物の免疫反応が、その動物を疾患から保護するのに不十分となった時に行われることが望ましい。適切かつ好適な投与スケジュールを、例の項に記載する。

本発明の治療用組成物を、治療される動物の上気道の粘膜細胞内にウィルスが入って複製を行うような様々な手段を用いて、その動物に投与してもよい。そのような手段には、経鼻投与、経口投与及び眼内投与があるが、これらに限定されることはない。インフルエンザウィルスは、元来、上気道の粘膜に感染するので、本発明の治療用組成物を、経鼻投与により投与することが望ましい。そのような投与は、カニューレを装着した注射器を用いて、または、ワクチン投与される動物の鼻と口とに装着した噴霧器を用いて行ってもよい。

インフルエンザＡ型ウィルスに起因する疾患から動物を保護するための本発明の治療用組成物の有効性について、様々な方法で検査を行ってもよい。そのような方法には、例えば赤血球凝集抑制（ＨＡＩ）検査による抗体の検査、治療される動物の細胞免疫の検査、または、治療される動物について、ビルレントインフルエンザウィルスを用いて誘発試験を行い、その治療される動物が罹患に対する抵抗性を持つかどうかを調べること、があるが、これらに限定されることはない。さらに、ビルレントな野生型ウマインフルエンザウィルスを過去に接種された、または接種感受性の動物の疾患症状を緩和または減退させる優性干渉性表現型を有する低温適応性ウマインフルエンザウィルスを含有する本発明の治療用組成物の有効性を、治療される動物の疾患症状の減退または消失について判別することににより検査してもよい。

本発明は、本発明の治療用組成物を調製する方法も含む。本発明の治療用組成物を調製する好適な方法を以下に開示する。本発明の治療用組成物の１類型、すなわち低温適応性ウマインフルエンザウィルスの調製に関する適切な工程は、（ａ）野生型ウマインフルエンザウィルスを、例えばふ化鶏卵内などのインヴィトロで継代培養することと、（ｂ）低温で生育するウィルスを選別することと、（ｃ）継代培養および選別工程を、１回またはそれ以上の回数、温度を順次低下させながら繰り返し、ウィルスが所望の低温で安定して生育するようなウィルス個体数を選択することと、（ｄ）得られたウィルス製剤を適切な賦形剤と混合することと、を含む。

本発明の治療用組成物の別の１類型、すなわち、適応により作製されたウマインフルエンザウィルスの少なくとも１つのゲノム分節を有するリアソータントインフルエンザウィルスを調製する適切な工程は、次の工程を含む：（ａ）好適には弱毒性、温度感受性または優性干渉性の表現型も有する供与低温適応性ウマインフルエンザウィルスのゲノム分節を、受容インフルエンザＡ型ウィルスのゲノム分節と混合することと、（ｂ）供与ウマインフルエンザウィルスの少なくとも１つの認識表現型を有するリアソータントウィルスを選別すること。選別を行うための認識表現型は、弱毒性、低温適応性、温度感受性及び優性干渉性を含む。これらの表現型を判別する方法は、当業者に周知であり、それらをここに開示する。少なくとも弱毒性の表現型を持つウィルスについて判別検査を行うことが望ましい。

低温適応により作製されたウマインフルエンザウィルスの少なくとも１つのゲノム分節を有するリアソータントインフルエンザＡ型ウィルスを、この方法を用いて作製する時、選別されるリアソータントウィルスの１類型は、「６＋２」リアソータントである。このウィルスの６つの「内部遺伝子分節」、すなわち、ＮＰ、ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、Ｍ及びＮＳ遺伝子をコードする分節は、供与低温適応性ウマインフルエンザウィルスのゲノムに由来し、また、２つの「外部遺伝子分節」、すなわち、ＨＡ及びＮＡ遺伝子をコードする分節は、受容インフルエンザＡ型ウィルスに由来する。このようにして作製されたウィルスは、供与低温適応性ウマインフルエンザウィルスの低温適応性、弱毒性、温度感受性及び／又は干渉性表現型を有するが、受容株の抗原性は有しない。

本発明は、ウマインフルエンザウィルス野生型系統Ａ／ウマ／ケンタッキー／１／９１（Ｈ３Ｎ８）及び低温適応性ウマインフルエンザウィルスＥＩＶ−Ｐ８２１から分離された核酸分子を含む。

本発明によれば、分離された核酸分子とは、自然環境から隔離された（すなわち、人間により操作されてきた）核酸分子であり、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかの誘導体であってもよい。従って、「分離された」という用語は、核酸分子が精製されている程度を反映するものではない。

本発明は、野生型及び低温適応性ウマインフルエンザウィルスタンパク質をコードする核酸分子を含む。本発明の核酸分子を、当業者に周知の方法で作製してもよい。本発明のタンパク質を、当業者に周知の方法、すなわち、組換えＤＮＡ技術により作製してもよい。好適な核酸分子は、核酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５及び／又はそれらの相補体を含むコドン鎖を有する。相補体は、核酸の２本の一本鎖であり、そのヌクレオチド配列が全長にわたって塩基対合することによりハイブリッドを形成するようなものとして定義される。ヌクレオチド配列が分かれば、当業者はその相補体を導き出すことが可能である。

ウマインフルエンザＭタンパク質をコードする好適な核酸分子は、ｎｅｉ_ｗｔＭ_１０２３， ｎｅｉ_ｗｔ１Ｍ_１０２３， ｎｅｉ_ｗｔ２Ｍ_１０２３， ｎｅｉ_ｗｔＭ_７５６， ｎｅｉ_ｗｔ１Ｍ_７５６， ｎｅｉ_ｗｔ２Ｍ_７５６， ｎｅｉ_ｃａ１Ｍ_１０２３， ｎｅｉ_ｃａ２Ｍ_１０２３， ｎｅｉ_ｃａ１Ｍ_７５６ 及び／又はｎｅｉ_ｃａ２Ｍ_７５６であり、それらのコドン鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４及び／又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６で表される。

ウマインフルエンザＨＡタンパク質をコードする好適な核酸分子は、ｎｅｉ_ｗｔＨＡ_１７６２， ｎｅｉ_ｗｔＨＡ_１６９５， ｎｅｉ_ｃａ１ＨＡ_１７６２， ｎｅｉ_ｃａ２ＨＡ_１７６２， ｎｅｉ_ｃａ１ＨＡ_１６９５及び／又はｎｅｉ_ｃａ２ＨＡ_１６９５であり、それらのコドン鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０及び／又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２で表される。

ウマインフルエンザＰＢ２−Ｎタンパク質をコードする好適な核酸分子は、ｎｅｉ_ｗｔＰＢ２−Ｎ_１２４１， ｎｅｉ_ｗｔＰＢ２−Ｎ_１２１４， ｎｅｉ_ｃａ１ＰＢ２−Ｎ_１２４１ ｎｅｉ_ｃａ２ＰＢ２−Ｎ_１２４１， ｎｅｉ_ｃａ１ＰＢ２−Ｎ_１２１４ ｎｅｉ_ｃａ２及び／又はＰＢ２−Ｎ_１２１４であり、それらのコドン鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６及び／又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８で表される。

ウマインフルエンザＰＢ２−Ｃタンパク質をコードする好適な核酸分子は、ｎｅｉ_ｗｔ１ＰＢ２−Ｃ_１２３３， ｎｅｉ_ｗｔ２ＰＢ２−Ｃ_１２３２， ｎｅｉ_ｗｔＰＢ２−Ｃ_１１９４， ｎｅｉ_ｃａ１ＰＢ２−Ｃ_１２３２， ｎｅｉ_ｃａ２ＰＢ２−Ｃ_１２３１及び／又はｎｅｉ_ｃａ１ＰＢ２−Ｃ_１１９４であり、それらのコドン鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３及び／又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５で表される。

本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０及び／又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４を有するタンパク質と、これらのタンパク質をコードする核酸分子とを含む。

本発明の好適なウマインフルエンザＭタンパク質は、ｎｅｉ_ｗｔＭ_１０２３， ｎｅｉ_ｗｔ１Ｍ_１０２３， ｎｅｉ_ｗｔ２Ｍ_１０２３， ｎｅｉ_ｗｔＭ_７５６， ｎｅｉ_ｗｔ１Ｍ_７５６， ｎｅｉ_ｗｔ２Ｍ_７５６， ｎｅｉ_ｃａ１Ｍ_１０２３， ｎｅｉ_ｃａ２Ｍ_１０２３， ｎｅｉ_ｃａ１Ｍ_７５６及び／又はｎｅｉ_ｃａ２Ｍ_７５６を有する核酸分子によりコードされるタンパク質を含む。好適なウマインフルエンザＭタンパク質は、Ｐｅｉ_ｗｔＭ_２５２， Ｐｅｉ_ｃａ１Ｍ_２５２及び／又はＰｅｉ_ｃａ２Ｍ_２５２である。一実施例においては、本発明の好適なウマインフルエンザＭタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４及び／又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６によりコードされ、従って、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２及び／又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５を含むアミノ酸配列を有する。

本発明の好適なウマインフルエンザＨＡタンパク質は、ｎｅｉ_ｗｔＨＡ_１７６２， ｎｅｉ_ｗｔＨＡ_１６９５， ｎｅｉ_ｃａ１ＨＡ_１７６２， ｎｅｉ_ｃａ２ＨＡ_１７６２， ｎｅｉ_ｃａ１ＨＡ_１６９５及び／又はｎｅｉ_ｃａ２ＨＡ_１６９５を有する核酸分子によりコードされるタンパク質を含む。好適なウマインフルエンザＨＡタンパク質は、Ｐ Ｐｅｉ_ｗｔＨＡ_５６５， Ｐｅｉ_ｃａ１ＨＡ_５６５及び／又はＰｅｉ_ｃａ２ＨＡ_５６５である。一実施例においては、本発明の好適なウマインフルエンザＨＡタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０及び／又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２によりコードされ、従って、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８及び／又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１を含むアミノ酸配列を有する。

本発明の好適なウマインフルエンザＰＢ２−Ｎタンパク質は、ｎｅｉ_ｗｔＰＢ２−Ｎ_１２４１， ｎｅｉ_ｗｔＰＢ２−Ｎ_１２１４， ｎｅｉ_ｃａ１ＰＢ２−Ｎ_１２４１ ｎｅｉ_ｃａ２ＰＢ２−Ｎ_１２４１， ｎｅｉ_ｃａ１ＰＢ２−Ｎ_１２１４ ｎｅｉ_ｃａ２及び／又はＰＢ２−Ｎ_１２１４を有する核酸分子によりコードされるタンパク質を含む。好適なウマインフルエンザＰＢ２−Ｎタンパク質は、Ｐ_ｗｔＰＢ２−Ｎ_４０４， Ｐ_ｃａ１ＰＢ２−Ｎ_４０４及び／又はＰ_ｃａ２ＰＢ２−Ｎ_４０４である。一実施例においては、本発明の好適なウマインフルエンザＰＢ２−Ｎタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６及び／又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８によりコードされ、従って、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４及び／又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７を含むアミノ酸配列を有する。

本発明の好適なウマインフルエンザＰＢ２−Ｃタンパク質は、ｎｅｉ_ｗｔ１ＰＢ２−Ｃ_１２３３， ｎｅｉ_ｗｔ２ＰＢ２−Ｃ_１２３２， ｎｅｉ_ｗｔＰＢ２−Ｃ_１１９４， ｎｅｉ_ｃａ１ＰＢ２−Ｃ_１２３２， ｎｅｉ_ｃａ２ＰＢ２−Ｃ_１２３１及び／又はｎｅｉ_ｃａ１ＰＢ２−Ｃ_１１９４を有する核酸分子によりコードされるタンパク質を含む。好適なウマインフルエンザＰＢ２−Ｎタンパク質は、 Ｐ_ｗｔＰＢ２−Ｃ_３９８， Ｐ_ｃａ１ＰＢ２−Ｃ_３９８及び／又はＰ_ｃａ２ＰＢ２−Ｃ_３９８である。一実施例においては、本発明の好適なウマインフルエンザＰＢ２−Ｃタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３及び／又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５によりコードされ、従って、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０及び／又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４を含むアミノ酸配列を有する。

核酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１は、ここで ｎｅｉ_ｗｔ１Ｍ_１０２３及びｎｅｉ_ｗｔ２Ｍ_１０２３として表される、ＰＣＲ増幅された核酸分子のコドン鎖から導き出されたコンセンサス配列を表し、その製法については例の項で開示する。核酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４ は、ここでｎｅｉ_ｃａ１Ｍ_１０２３及びｎｅｉ_ｃａ２Ｍ_１０２３として表される、ＰＣＲ増幅された核酸分子のコドン鎖から導き出された配列を表し、その製法については例の項で開示する。核酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７は、ここでｎｅｉ_ｗｔＨＡ_１７６２として表される、ＰＣＲ増幅された核酸分子のコドン鎖から導き出された配列を表し、その製法については例の項で開示する。核酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０は、ここでｎｅｉ_ｃａ１ＨＡ_１７６２及びｎｅｉ_ｃａ２ＨＡ_１７６２として表される、ＰＣＲ増幅された核酸分子のコドン鎖から導き出された配列を表し、その製法については例の項で開示する。核酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３ は、ここでｎｅｉ_ｗｔＰＢ２−Ｎ_１２４１として表される、ＰＣＲ増幅された核酸分子のコドン鎖から導き出された配列を表し、その製法については例の項で開示する。核酸分子ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６ は、ここでｎｅｉ_ｃａ１ＰＢ２−Ｎ_１２４１及びｎｅｉ_ｃａ２ＰＢ２−Ｎ_１２４１として表される、ＰＣＲ増幅された核酸分子のコドン鎖から導き出された配列を表し、その製法については例の項で開示する。核酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９は、ここでｎｅｉ_ｗｔ１ＰＢ２−Ｃ_１２３３として表される。ＰＣＲ増幅された核酸分子のコドン鎖から導き出された配列を表し、その製法については例の項で開示する。核酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２は、ここでｎｅｉ_ｗｔ２ＰＢ２−Ｃ_１２３２として表される、ＰＣＲ増幅された核酸分子のコドン鎖から導き出された配列を表し、その製法については例の項で開示する。核酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３は、ここでｎｅｉ_ｃａ１ＰＢ２−Ｃ_１２３２として表される、ＰＣＲ増幅された核酸分子のコドン鎖から導き出された配列を表し、その製法については例の項で開示する。さらなる核酸分子、核酸配列、タンパク質及びアミノ酸配列については、例の項で説明する。

本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５を持つアミノ酸配列を有するＭタンパク質をコードする低温適応性ウマインフルエンザウィルスを含有する核酸分子を含む。本発明の別の一実施例は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１を持つアミノ酸配列を有するＨＡタンパク質をコードする低温適応性ウマインフルエンザウィルスを含有する核酸分子を含む。本発明の別の一実施例は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７を持つアミノ酸配列を有するＰＢ２−Ｎタンパク質をコードする低温適応性ウマインフルエンザウィルスを含有する核酸分子を含む。本発明の別の一実施例は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４を持つアミノ酸配列を有するＰＢ２−Ｃタンパク質をコードする低温適応性ウマインフルエンザウィルスを含有する核酸分子を含む。

核酸の配列決定技術は誤りが全くないわけではないため、ここで表される核酸配列及びアミノ酸配列は、それぞれ、本発明の核酸分子の見かけの核酸配列と、本発明の見かけのＭ， ＨＡ， 及びＰＢ２−Ｎ， 及びＰＢ２−Ｃタンパク質をそれぞれ表すことに留意されたい。

本発明の別の一実施例は、本発明の野生型ウィルスＭ， ＨＡ， ＰＢ２−Ｎ， ＰＢ２−Ｃ， ＰＢ２タンパク質と選択的に結合する抗体である。本発明の別の一実施例は、本発明の低温適応性ウィルスＭ， ＨＡ， ＰＢ２−Ｎ， ＰＢ２−Ｃ， ＰＢ２と選択的に結合する抗体である。好適な抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０ 及び／又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４と選択的に結合する。

以下の例は説明の目的で提供されるものであり、本発明の範囲を限定するものとしては意図されていない。

例１
本例は、本発明の複数の低温適応性ウマインフルエンザウィルスの製法及び表現型の特徴を説くものである。

Ａ．親ウマインフルエンザウィルスＡ／ウマ／ケンタッキー／１／９１（Ｈ３Ｎ８）
（ケンタッキー州レキシントン、ケンタッキー大学、トム・チャンバーズより入手）を、外来宿主種、すなわち、ふ化鶏卵中で、次の方法で低温適応させた。例えば、メリーランド州チェスタータウン、トラスロー・ファームまたアイオワ州アデル、ハイバック社より入手可能な、ふ化後１０日目または１１日目の鶏卵の殻に穿孔した小さな孔を介して、尿膜腔内に、約１０^６プラーク形成単位（ｐｆｕ）の親ウマインフルエンザウィルスを含有する約０．１ミリリットル（ｍｌ）の非希釈ＡＦを注射することにより、このウィルスを接種した。これらの孔を、マニキュア液で密封した後、これらの卵を、加湿したインキュベータ内で、適切な温度で３日間インキュベートした。インキュベート後、これらの卵を検卵し、無生育性の卵をすべて廃棄した。卵殻の一部を無菌的に除去し、滅菌ピンセットで漿尿膜（ＣＡＭ） を剥がし、ＡＦを滅菌ピペットで取り出して、生育可能な胚からＡＦを回収した。回収したＡＦを、次の継代培養まで冷凍した。次に、このＡＦを、未希釈の状態で、または表１に示したように、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１０００倍に希釈して使用し、２回目以降の継代培養に用いる新たな卵をインキュベートした。合計６９回の継代培養を行った。初期の継代培養は、約３４℃（継代１−２回目）または約３０℃で行い、それ以降の継代培養では、培養温度を約２８℃または約２６℃に低下させた。安定した弱毒性のウィルスの所望の表現型の選択の可能性を高めるため、表１に示すように、初回の連続継代を、連続継代培養ツリーの５つの異なる枝、ＡからＥまでに展開した。

Ｂ．セクションＡに記載の低温適応法で得られたウィルス分離株の温度感受性、すなわち、当該低温適応ウィルスが比較的低温または許容温度（例えば約３４℃）では生育するが、比較的高温または非許容温度（例えば約３７℃）ではプラークを形成しないような表現型について、下記のように検査を行った。低温適応継代培養の各回に、ＡＦをプラークアッセイで約３４℃で力価測定した。アッセイを行った個々のプラークのプラーク領域を周期的に切り出し、切り出した寒天培地を、ＭＤＣＫ細胞の単層を含有する９６ウェルのトレイに置いて、当該プラークをクローン分離した。この９６ウェル・トレイを一晩インキュベートし、その産物の温度感受性を、約３４℃及び約３９℃でインキュベートした複製９６ウェル・トレイで、ＣＰＥアッセイによりアッセイした。このアッセイにより温度感受性変異体であるとして判別されたクローンのパーセント、すなわち、３４℃では生育するが３９℃では生育しないウィルス性のプラークの数を、プラークの総数で割ったものを算出し、図２に示す。次に、温度感受性分離株の非許容温度でのタンパク合成について、放射線標識されたウィルス合成タンパク質をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で視覚化することにより、測定した。

温度感受性について検査を行ったクローン分離株から、２つを選択してさらなる検査に使用した。表１に示すように、クローンＥＩＶ−Ｐ８２１を枝Ｂの継代４９回目から選択し、また、クローンＥＩＶ−Ｐ８２４を枝Ｃの継代４８回目から選択した。これらのウィルス分離株は、両方とも温度感受性であり、どちらの分離株のプラーク形成も、温度約３９℃で阻害された。この温度では、タンパク質合成はＥＩＶ−Ｐ８２１では完全に阻害されたが、ＥＩＶ−Ｐ８２４は通常のレベルのタンパク質合成を示した。加えて、ＥＩＶ−Ｐ８２１のプラーク形成は、温度約３７℃で阻害され、また、この温度では、後期遺伝子発現が阻害された。すなわち、ＮＰタンパク質合成は通常レベルであり、Ｍ１またはＨＡタンパク質の合成は少ないか全く行われず、ポリメラーゼタンパク質の合成レベルは高かった。ウィルス特異的なタンパク質合成を特徴とする、３７℃で観察された表現型は、すべてのウィルスタンパク質合成の阻害を特徴とする、３９℃で観察された表現型とは異なる。ウィルスＥＩＶ−Ｐ８２１は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に、受託番号ＡＴＣＣ ＶＲ−＿＿＿＿＿で寄託され、また、ウィルスＥＩＶ−Ｐ８２４は、ＡＴＣＣに受託番号ＡＴＣＣ ＶＲ−＿＿＿＿＿で寄託されている。

Ｃ．分離株ＥＩＶ−Ｐ８２１の突然変異のさらなる特徴を、リアソートメント分析により、次のように明らかにした。インフルエンザウィルスのリアソートメント分析により、当業者は、いくつかの条件下で、任意のウィルスの表現型と、あるインフルエンザＡ型ウィルスゲノムを有する８つのＲＮＡ分節の複数に発生していると推定される突然変異とを関連づけることができる。この技術は、例えばＰａｌｅｓｅ， ｅｔ ａｌ．， 同上、に説明されている。ＥＩＶ−Ｐ８２１と、鳥類インフルエンザウィルス、Ａ／マガモ／ニューヨーク／６７５０／７８との混合感染を、次のように行った。ＭＤＣＫ細胞とＥＩＶ−Ｐ８２１との共感染を、感染多重度（ＭＯＩ）２ｐｆｕ／細胞で、また、ＭＤＣＫ細胞とＡ／マガモ／ニューヨーク／６７５０／７８との共感染を、ＭＯＩ２、５、または１０ｐｆｕ／細胞で行った。感染した細胞を、温度約３４℃でインキュベートした。これら様々な共感染の産物を力価測定し、個々のプラークを約３４℃で分離した。そして、その結果得られたクローン分離株について、約３９℃及び約３７℃で生育できるか否か、また、約３９℃、約３７℃及び約３４℃で遺伝子発現、すなわち、ウィルスタンパク質の合成ができるか否かを調べた。タンパク質の合成を、放射線標識された感染細胞の溶解産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により評価した。これら２つの親ウィルスのＨＡ、ＮＰ及びＮＳ−１タンパク質は、それぞれ分離ゲノム分節でコードされ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で区別可能である。なぜなら、これらの各ウィルスタンパク質は、ウマまたは鳥類インフルエンザウィルスのいずれかに由来し、異なる見掛け分子量で移動するからである。このような方法で、少なくともＨＡ、ＮＰ及びＮＳ−１遺伝子については、親ウィルスの温度感受性表現型やタンパク質合成表現型などのいくつかの表現型が、これらの遺伝子を有するゲノム分節と共分離するか否かを調べることができる。ＥＩＶ−Ｐ８２１の ＨＡ、ＮＰ及びＮＳ−１タンパク質のそれぞれについて、ａ）非許容温度約３９℃でのプラーク形成を阻害する、すなわち、ＣＰＥを誘発する突然変異、またはｂ）非許容温度約３９℃でのタンパク質合成を阻害する突然変異の共分離を、リアソートメント分析により調べ、その結果を表３及び表４にそれぞれ示す。

検査の結果、ウマＮＰ遺伝子と、非許容温度約３９℃でＥＩＶ−Ｐ８２１のプラーク形成を阻害する突然変異との関連性が示された。しかし、ＨＡ、ＮＰまたはＮＳ−１遺伝子のいずれについても、非許容温度約３９℃でＥＩＶ−Ｐ８２１のウィルスタンパク質発現を阻害する突然変異との関連性は示されなかった。従って、これらのデータは、ウィルスＥＩＶ−Ｐ８２１のプラーク形成表現型とタンパク質合成表現型とが、異なる突然変異の結果であることも示した。

Ｄ．本発明の低温適応性ウマインフルエンザウィルスが優性干渉性表現型を持つか否か、すなわち、野生型親ウィルスＡ／ケンタッキー／１／９１（Ｈ３Ｎ８）との混合感染の場合にこれらのウィルスを抑制するか否か．についても研究を行った。ウィルスＥＩＶ−Ｐ８２１及びＥＩＶ−Ｐ８２４の優性干渉性表現型を、次の方法で測定した。ＭＤＣＫ細胞の分離単層を、親ウィルスＡ／ケンタッキー／１／９１（Ｈ３Ｎ８）にＭＯＩ２で単感染させるか、低温適応性ウィルスＥＩＶ−Ｐ８２１またはＥＩＶ−Ｐ８２４のいずれかにＭＯＩ２で単感染させるか、又は、これら親ウィルスと、低温適応性ウィルスの１つとにＭＯＩ２＋２で同時に二重感染させた。このときの温度はいずれの場合も約３４℃であった。感染後２４時間で、培養株から培地を採取し、これらの様々な感染細胞からのウィルス産生を測定した。測定は、温度約３４℃及び約３９℃の複製プラークアッセイで行った。このアッセイでは、低温適応性ウマインフルエンザウィルスＥＩＶ−Ｐ８２１またはＥＩＶ−Ｐ８２４が温度感受性であり、従って、非許容温度約３９℃ではプラークを形成できないが、親ウィルスはいずれの温度でもプラークを形成できるため、これら低温適応性ウィルスの存在下でも親ウィルスの生育を測定できるという事実を利用した。具体的には、これらの低温適応性ウィルスがこの親ウィルスの生育に及ぼす優性干渉作用を、約３９℃で親ウィルスに単感染させた細胞のウィルス産出量と、二重感染させた細胞の親ウィルス産出量とを比較することにより、定量した。ＥＩＶ−Ｐ８２１は、混合感染で、親ウィルスの産出量をおよそ２００分の１まで減少させることができ、また、ＥＩＶ−Ｐ８２４は、混合感染で、親ウィルスの産出量をおよそ３２００分の１まで減少させることができた。従って、このアッセイは、低温適応性ウマインフルエンザウィルスＥＩＶ−Ｐ８２１及びＥＩＶ−Ｐ８２４が、両方とも優性干渉性表現型を発揮することを示した。

Ｅ．ウィルス分離株ＥＩＶ−ＭＳＶ＋５を、次の方法でＥＩＶ−Ｐ８２１から誘導した。ＥＩＶ−Ｐ８２１を、上述の方法で卵内で１回継代培養し、ここでＥＩＶ−ＭＳＶ０として表されるマスター・シード・ウィルス分離株を作製した。次に、ＥＩＶ−ＭＳＶ０を、卵内でさらに３回継代培養し、各回の終了毎に得られたウィルス分離株を、それぞれＥＩＶ−ＭＳＶ＋１、ＥＩＶ−ＭＳＶ＋２、ＥＩＶ−ＭＳＶ＋３とした。ＥＩＶ−ＭＳＶ＋３を、次の方法で、ＭＤＣＫ細胞内でさらに２回継代培養した。ＭＤＣＫ細胞を、１５０ｃｍ^２の組織培養フラスコ中で、子ウシ血清を１０％含むハンクス液のＭＥＭ組織培養培地で生育させた。次に、細胞を滅菌ＰＢＳで洗浄し、生育培地を、フラスコ当たり約８ｍｌの感染培地（ハンクス液、１μｇ／ｍｌのＴＰＣＫトリプシン溶液、０．１２５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び１０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファからなるＭＥＭ組織培養培地）と取り替えた。ＭＤＣＫ細胞に、ウィルスＥＩＶ−ＭＳＶ＋３（ＭＤＣＫ細胞の継代培養１回目）またはＥＩＶ−ＭＳＶ＋３（ＭＤＣＫ細胞の継代培養２回目）から採取したウィルスストックを含有するＡＦを接種し、これらのウィルスを約３４℃で１時間吸収させた。接種物を細胞単層から取り除いた後、細胞を再度ＰＢＳで洗浄し、フラスコ当たり約１００ｍｌの感染培地を加えた。感染した細胞を、約３４℃で２４時間インキュベートした。フラスコを強く揺すって細胞単層を破砕することにより、ウィルス感染したＭＤＣＫ細胞を採集し、ウィルス分離株ＥＩＶ−ＭＳＶ＋４（ＭＤＣＫ細胞の継代培養１回目）及びＥＩＶ−ＭＳＶ＋５（ＭＤＣＫ）細胞の継代培養２回目）を得た。

ウィルスＥＩＶ−ＭＳＶ０及びＥＩＶ−ＭＳＶ＋５の表現型を、上記セクションＢで述べた方法で分析し、これらのウィルスが温度約３４℃、約３７℃及び約３９℃でプラーク形成及びタンパク質合成を行う能力を測定した。ＥＩＶ−ＭＳＶ０及びＥＩＶ−ＭＳＶ＋５は、いずれも温度約３４℃では組織培養細胞内でプラークを形成したが、温度約３９℃では、いずれのウィルス分離株も、プラーク形成または検出可能なウィルスタンパク質合成を行わなかった。ウィルスＥＩＶ−ＭＳＶ０は、温度約３７℃でＥＩＶ−Ｐ８２１と類似した温度感受性表現型を示した。すなわち、プラーク形成の阻害及び後期遺伝子発現の阻害が見られた。しかし、ＥＩＶ−ＭＳＶ＋５の場合は、その親ウィルスＥＩＶ−Ｐ８２１とは異なり、温度約３７℃で、組織培地内でプラークを形成し、また、この温度で、全てのタンパク質を通常量合成した。ウィルスＥＩＶ−ＭＳＶ＋５は、受託番号ＡＴＣＣ ＶＲ−＿＿＿＿＿でＡＴＣＣに寄託されている。

例２
本発明の治療用組成物を、次の方法で作製した。

Ａ．ＥＩＶ−Ｐ８２１の大量のストックを、次の方法で卵内で増殖させた。約６０個のＳＰＦふ化鶏卵を検卵し、無生育卵を廃棄した。ストックウィルスを、滅菌ＰＢＳで、約１．０×１０^５ｐｆｕ／ｍｌに希釈した。ウィルスを、例１Ａで説明した方法で、卵の尿膜腔に接種した。加湿したインキュベータで、温度約３４℃で３日間インキュベートした後に、例１Ａで説明した方法で、ＡＦを卵から採取した。採取したＡＦを、例えばアイオワ州デモイン、ダイアモンド・アニマル・ヘルス社より入手可能なＡ１／Ａ２安定化剤などの安定化剤液と、２５％Ｖ／Ｖ（安定化剤／ＡＦ）で混合した。採取したＡＦを遠心分離管内でバッチにして、旋回バケットロータを取り付けたＩＥＣ Ｃｅｎｔｒａ−７Ｒ冷却卓上遠心機中で、１０分間、１０００ｒｐｍで遠心分離して清澄化させた。清澄化した液体を、１−ｍｌ冷凍バイアルに入れ、約−７０℃で冷凍した。ウィルスストックを、ＭＤＣＫ細胞中で、約３４℃で、ＣＰＥ及びプラークアッセイにより力価測定した。

Ｂ．ＥＩＶ−Ｐ８２１の大量のストックを、次の方法でＭＤＣＫ細胞内で増殖させた。ＭＤＣＫ細胞を、１５０ｃｍ^２の組織培養フラスコ中で、子ウシ血清を１０％含むハンクス液のＭＥＭ組織培養培地で生育させた。次に、細胞を滅菌ＰＢＳで洗浄し、生育培地を、フラスコ当たり約８ｍｌの感染培地と取り替えた。ＭＤＣＫ細胞を、ウィルスストックに、細胞当たり約０．５ｐｆｕから細胞当たり約０．００５ｐｆｕの範囲のＭＯＩで接種し、ウィルスを約３４℃で１時間吸収させた。接種物を細胞単層から取り除いた後、細胞を再度ＰＢＳで洗浄し、フラスコ当たり約１００ｍｌの感染培地を加えた。感染した細胞を、約３４℃で２４時間インキュベートした。フラスコを強く揺すって細胞単層を破砕することにより、ウィルス感染したＭＤＣＫ細胞を採集し、安定化剤をフラスコに２５％Ｖ／Ｖ（安定化剤／ウィルス溶液）で加えた。上清を無菌的に冷凍バイアルに入れて、−７０℃で冷凍した。

Ｃ．本発明のいくつかの低温適応性温度感受性ウマインフルエンザウィルスを含む治療用組成物を、以下の方法で製剤した。ワクチン接種工程の直前に、以下の例３−７に記載されているように、ＥＩＶ−Ｐ８２１又はＥＩＶ−ＭＳＶ＋５の保存バイアルを解凍し、水またはＰＢＳを含む賦形剤、または、０．１２５％のウシ血清アルブミンを含有するハンクス液を加えたＭＥＭ組織培養培地（ＢＳＡ−ＭＥＭ溶液）に希釈し、動物への接種のための所望の濃度とした。このワクチン組成物を、投与前に氷冷した。全ての治療用組成物を、ワクチン接種の直前に、ＭＤＣＫ細胞で、標準的な方法で力価測定し、また、動物に投与された組成物と同一に処理された一定量の組成物を、可能な方法で、ワクチン接種後力価測定し、ウィルスが工程の間生育可能であり続けるようにした。

例３
低温適応性ウマインフルエンザウィルスＥＩＶ−Ｐ８２１を含有する治療用組成物の安全性と複製能力とを、ウマインフルエンザウィルスに対する検出可能な免疫をすでに持っている３頭のウマで次のように検査した。例１で説明した方法で作製したＥＩＶ−Ｐ８２１を、例２Ａで説明した方法により卵内で生育させ、これを用いて例２Ｃに述べた１０^７ｐｆｕ ＥＩＶ−Ｐ８２１／２ｍｌ ＢＳＡ−ＭＥＭ溶液を含有する治療用組成物を調剤した。

ウマインフルエンザウィルスに対する検出可能なヘマグルチニン阻害（ＨＡＩ）価をすでに持っている３頭の子馬に、ＥＩＶ−Ｐ８２１を含有する治療用組成物を、次の方法で接種した。各子馬に２−ｍｌ量のＥＩＶ−Ｐ８２１を、偽鼻孔に十分に届く長さのブラント・カニューレを嵌めた注射器を用いて、各鼻孔に１ｍｌずつ経鼻投与した。

これらの子馬の、くしゃみ、唾液分泌過多、呼吸困難または呼吸異常、ふるえ、過敏症、または発熱などの即時型アレルギー反応を、ワクチン投与直後約３０分間及び約４時間後に観察した。これらの動物の、惰眠や食欲低下などの遅延型アレルギー反応を、ワクチン接種後１日目から１１日目にわたってさらに観察した。この研究では、３頭の子馬のいずれも、ワクチン接種によるアレルギー反応を示さなかった。

これらの子馬の、ウマインフルエンザに一致する臨床症状を、ワクチン接種の２日前からワクチン接種後１１日目まで、毎日ほぼ同じ時刻に観察した。これらの子馬の鼻汁、眼球分泌物、食欲低下、気質、心拍数、毛細血管レフィル時間、呼吸数、呼吸困難、肺音、上歯肉上の中毒線の出現及び体温を観察した。加えて、顎下及び腹壁のリンパ節を触診し、異常を記述した。この研究に使用した３頭の子馬のいずれも、観察期間中、いかなる異常反応または顕性の臨床症状も示さなかった。

これらの動物のウィルス放散を検査するために、Ｃｈａｍｂｅｒｓ， ｅｔ ａｌ．，
１９９５， Ｅｑｕｉｎｅ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， １７， １９−２３． Ｃｈａｍｂｅｒｓ， ｅｔ ａｌ．， 同上 に記載されている方法で、ワクチン接種後０日目から１１日目にわたって、子馬の鼻咽頭スワブを採取した。簡単に言うと、これらの子馬のそれぞれの鼻孔に、２本の滅菌ダクロンポリエステルチップアプリケータ（例えばメイン州ギルフォード、ハードウッド・プロダクツ社より入手可能）を同時に挿入した。スワブ（合計４本、各鼻孔毎に２本）を、５％のグリセロール、ペニシリン、ストレプトマイシン、ネオマイシン及びゲンタマイシンを含有する生理的ｐＨのＰＢＳからなる冷却輸送培地２．５ｍｌを入れた１５−ｍｌコニカル遠心分離管内に折り入れた。サンプルを湿らせた氷上に保持しながら、スワブを無菌的に培地中に絞り出し、鼻咽頭サンプルを２つのアリコートに分けた。アリコートの１つを使用して、例１に記載の方法で、ふ化鶏卵接種によるＥＩＶの分離を行った。次に、接種された鶏卵のＡＦの赤血球凝集能力を、標準的な方法で検査したところ、当該ＡＦ中にウマインフルエンザウィルスの存在が確認された。ワクチン接種後２日目及び３日目に、もう１つのアリコートを使用して、ベクトン−ディッキンソン社（メリーランド州コッキーズヴィル）より入手可能なＤｉｒｅｃｔｉｇｅｎ（登録商標）Ｆｌｕ Ａテストによるウィルス検査を行った。

これら３頭の動物の鼻咽頭分泌物から、卵接種によりＥＩＶを分離しようとした試みは、失敗に終わった。しかし、２日目及び３日目に、検査した全ての動物がＤｉｒｅｃｔｉｇｅｎ Ｆｌｕ Ａテストによるウィルス放散検査で陽性を示した。このことは、ＥＩＶ−Ｐ８２１が血清陽性の子馬の体内で複製を行うという仮説を裏付けるものである。

本例に述べた被接種動物および例４−７に述べた動物のＥＩＶに対する抗体価を検査するために、ワクチン接種前及び、ワクチン接種後の指定日に当該動物から血液を採取した。血清を分離し、トリプシン／過ヨウ素酸塩またはカオリンのいずれかで処理し、通常の血清に見られる赤血球凝集反応の非特異インヒビターを阻害した。新鮮なＥＩＶ分離株に抗する血清サンプルの赤血球凝集反応阻害（ＨＡＩ）価を、例えば連邦規則コード９の１１３．２に基づき、Ｕ．Ｓ．Ｄ．Ａ．国立獣医学実用試験所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）提供の「ウマインフルエンザウィルス抗体の赤血球凝集反応阻害アッセイを行うための補助的アッセイ」（ＳＡＭ １２４）に記載の標準的な方法で検査した。

当該３頭の子馬のＨＡＩ価を、表５に示す。図示されるように、ＥＩＶ−Ｐ８２１接種後の３頭の動物すべてにおいて、血清ＨＡＩ価は、初期価に関係なく、少なくとも４倍に増加した。

これらのデータは、低温適応性ウマインフルエンザウィルスＥＩＶ−Ｐ８２１が、安全かつ非反応発生性であることを示し、また、これらの動物が、すでに証明可能な価を持っている場合でも、ウマインフルエンザウィルス抗体価を増加させたことを示している。

例４
この例では、低温適応性ウマインフルエンザウィルスＥＩＶ−Ｐ８２１を含有する治療用組成物の安全性と有効性を評価するための動物研究を開示する。

低温適応性ウマインフルエンザウィルスＥＩＶ−Ｐ８２１を含有する治療用組成物を、弱毒性及び、ビルレントウマインフルエンザウィルスの攻撃からウマを保護する能力について、以下のように検査した。例１に記載の方法で作製されたＥＩＶ−Ｐ８２１を、例２Ａに記載の方法で卵内で生育させ、例２Ｃに記載の方法で、ウィルス１０^７ｐｆｕ／水２ｍｌを含有する治療用組成物を調製した。８頭のＥＩＶ−血清陰性の子馬を本研究に使用した。これら８頭の子馬のうち３頭に、例３で記載した方法と同様の方法で、ＥＩＶ−Ｐ８２１治療用組成物を１０^７ｐｆｕ含有するワクチンを２−ｍｌ経鼻接種した。１頭の子馬にＥＩＶ−Ｐ８２１治療用組成物を１０^７ｐｆｕ経口投与した。投与は、６ｍｌのウィルスを、以下の方法で細かい霧を発生するようにした１０−ｍｌ注射器を用いて、咽頭に注入することによりなされた。針を取り付けるための突出した「台（ｓｅａｔ）」を、モデリング・クレイを用いて密封し、キャップを正しく閉めた。２５ゲージの針を用いて、注射器の底部、すなわち、「台（ｓｅａｔ）」の周囲に約１０個の孔を開けた。注射器を歯間隙内に入れ、ウィルスを口の裏側に強制的に注入した。残り４頭の子馬を、非ワクチン接種対照動物とした。

ワクチン接種された子馬の即時型アレルギー反応を、ワクチン接種直後約３０分間及び約４時間後に観察し、さらに、これらの子馬の遅延型アレルギー反応をワクチン接種後１日目から１１日目にわたって観察した。ともに例３に記載の方法で行った。この研究に用いたこれら４頭のワクチン接種された子馬のいずれも、ワクチン接種による異常な反応を示さなかった。

例３に記載の方法で、ウィルスワクチン接種の２日前から接種後１１日目まで毎日ほぼ同じ時刻に、これらの子馬の臨床症状を観察した。この研究でワクチン接種された４頭の子馬のいずれも、観察期間中にいかなる臨床症状も示さなかった。この結果、低温適応性ウマインフルエンザウィルスＥＩＶ−Ｐ８２１が弱毒性表現型を発揮することが立証された。

これらのワクチン接種動物のウィルス放散を検査するために、ワクチン接種後０日目から１１日目にわたって、例３に記載の方法で、鼻咽頭スワブをこれらの子馬から採取した。例３に記載の方法で、この鼻咽頭サンプルのウィルスを、ふ化鶏卵中で検査した。

表６に示すように、この鶏卵法では、ウィルスは１頭のワクチン接種動物のみから分離された。しかし、例３で述べたように、この方法でウィルスが分離されなかったことにより、ウィルスの複製の事実が否定されるわけではない。なぜなら、より感度の高い、例えばＤｉｒｅｃｔｉｇｅｎ Ｆｌｕ Ａテストのような方法では、複製が検出されるかもしれないからである。

これらのワクチン接種された動物中のウマインフルエンザウィルスに対する抗体価を測定するために、ワクチン接種前及びワクチン接種後７日目、１４日目、２１日目及び２８日目に、これらの動物から血液を採取した。例３に記載の方法に基づき、血清サンプルを分離し、新鮮なＥＩＶ分離株に対する赤血球凝集阻害（ＨＡＩ）価を測定した。

これら４頭のワクチン接種された子馬のＨＡＩ価を表７に示す。

例３に述べた研究で用いられた３頭の動物では、ＨＡＩ価の増加が観察されたが、それとは異なり、この例の研究で用いられた動物では、ＥＩＶ−Ｐ８２１ワクチン接種後、ＨＡＩ価の著しい増加、すなわち、４倍を超える増加は観察されなかった。

ワクチンウィルスの投与後およそ４ヶ月半目に、８頭全ての子馬、すなわち、ワクチン接種された４頭と非ワクチン接種対照動物である４頭とに、以下の処置を施した。１頭毎に、ビルレントウマインフルエンザウィルス株Ａ／ウマ／ケンタッキー／１／９１ （Ｈ３Ｎ８）１０^７ｐｆｕを水５ｍｌに懸濁した。マスクをネブライザに接続し、このマスクを、これらの動物の鼻孔を含めた鼻鏡部に被せた。５ｍｌを１頭毎に噴霧した。このとき、５ｍｌ全部を噴霧するのに５−１０分かかるように調節した。処置の３日前及び処置後１１日間の毎日、例３に記載した方法で臨床観察を行った。

ワクチン接種されたこれらの動物のウマインフルエンザウィルスに対するＨＡＩ価に著しい増加が見られなかったという事実にもかかわらず、ワクチン接種された４頭の動物はすべて、ウマインフルエンザウィルスの攻撃から保護された。ワクチン接種された動物はいずれも顕性の臨床症状を示さなかった。ただし、そのうち１頭に微弱な喘鳴が２日間見られた。一方、ワクチン接種されたかった４頭はいずれもウィルスを放散し、ウマインフルエンザウィルス感染に特有の臨床症状及び発熱を示した。従って、この例は、本発明の治療用組成物が、ウマをウマインフルエンザ疾患から保護可能であることを実証している。

例５
この例では、低温適応性ウマインフルエンザウィルスＥＩＶ−Ｐ８２１を含有する治療用組成物の弱毒性と、ワクチン接種されたウマを、その後のビルレントウマインフルエンザウィルスの攻撃から保護する能力とを評価するためのさらなる動物研究を開示する。さらに、この研究では、運動ストレスがこの治療用組成物の安全性と有効性に及ぼす効果についても評価した。

低温適応性ウマインフルエンザウィルスＥＩＶ−Ｐ８２１を含有する治療用組成物の安全性と有効性とを、ウマを用いて次のように検査した。例１に記載の方法で作製したＥＩＶ−Ｐ８２１を、例２Ａに記載の方法で卵内で生育させ、例２Ｃに記載した方法で、ウィルス１０^７ｐｆｕ／水５ｍｌを含有する治療用組成物を調製した。この研究では、１５頭の子馬を使用した。これらの子馬を、表８に示すように、それぞれ５頭からなる３つのグループに無作為に分けた。そのうち２つのグループにはワクチンを接種し、１つのグループは非接種対照グループとした。グループ２の子馬には、ワクチン接種前に運動ストレスを与えたが、接種グループ１の子馬は厩舎に留置した。

グループ２の子馬について、次の方法でトレッドミル運動ストレス試験を行った。これらの子馬に、トレッドミルを歩行のみで６時間使用させ、慣れさせた。実際の運動負荷ストレス試験では、ワクチン接種の４日前からワクチン接種当日（ワクチン接種直前）まで、毎日運動させた。トレッドミル運動の内容を表９に示す。

グループ１及びグループ２に、例４に述べた処置で用いた噴霧方法により、ＥＩＶ−Ｐ８２１を１０^７ｐｆｕ含有する治療用組成物を投与した。この研究でワクチン接種した子馬のいずれも、このワクチン接種による即時型または遅延型アレルギー反応を示さなかった。

これらの子馬の、例３で述べた臨床症状を、ワクチン接種の２日前からワクチン接種後１１日目までの毎日、ほぼ同じ時刻に観察した。この研究でワクチン接種した子馬のいずれも、観察期間中に顕性の臨床症状を示さなかった。

ワクチン接種した動物のウィルス放散を検査するために、ワクチン接種前及びワクチン接種後１日目から１１日目にかけて、例３に記載した方法で、これらの子馬から鼻咽頭スワブを採取した。これらの鼻咽頭サンプルのウィルスを、ふ化鶏卵内で、例３に記載の方法に従って検査した。表１０に示すように、ウィルスを、ワクチン接種した動物、すなわち、グループ１及び２から分離した。

ワクチン接種されたこれらの動物のウマインフルエンザウィルスに対する抗体価を検査するために、ワクチン接種前及びワクチン接種後７日目、１４日目、２１日目及び２８日目に血液を採取した。例３に記載の方法に従って、血清サンプルを分離し、最近のＥＩＶ分離株に対するＨＡＩ価を検査した。これらの価を表１１に示す。

接種後９０日目に、１５頭すべての子馬を、ネブライザを用いて、例４に記載の方法により１０^７ｐｆｕのウマインフルエンザウィルス株Ａ／ウマ／ケンタッキー／１／９１ （Ｈ３Ｎ８）で攻撃した。例３に記載した臨床症状の観察を、すべての動物について、攻撃の３日前及び、攻撃後１１日間の毎日行った。ワクチン接種した動物のいずれも、顕性の臨床症状を示さなかった。ワクチンを接種しなかった５頭のうち４頭は、ウマインフルエンザウィルス感染に特有の発熱及び臨床症状を示した。

従って、この例は、本発明の治療用組成物は、ウマにワクチン投与前にストレスを与えた場合でも、これらのウマをウマインフルエンザウィルスから保護することを実証するものである。

例６
この例では、本発明の治療用組成物の感染力を、卵内で生育させた場合と組織培養細胞中で生育させた場合とで比較した。製剤的見地からすると、本発明の治療用組成物を、ふ化鶏卵内で生育させるよりも、組織培養細胞中で生育させる方が有利である。ウマインフルエンザウィルスは、しかし、細胞内では、卵内ほど高力価にまで生育しない。加えて、このウィルスが感染力を得るためには、ウィルスのヘマグルチニンに、トリプシンのようなタンパク分解酵素による細胞外タンパク分解開裂が必要である。血清にはトリプシン抑制物質が含まれるので、細胞培養で生育したウィルスに感染力を付与するためには、トリプシンを含む無血清培地中で増殖させなければならない。このような条件が、組織培養細胞の生存力の点では決して最適ではないことは、当業者に周知である。さらに、これらの生育条件のために、ウマ細胞との結合性が変化したウィルスが選別されるかもしれないが、そのためにウィルスの感染力が影響を受けるかもしれない。なぜなら、ウィルスは、複製及び免疫刺激を行うためには、動物の鼻粘膜に効率的に結合する必要があるからである。従って、この例で開示した研究は、本発明の治療用組成物の感染力が、インヴィトロ組織培養における多数の継代にわたる生育により、逆に影響を受けるかどうかを評価することを目的とする。

例１に記載の方法で作製したＥＩＶ−Ｐ８２１を、例２Ａに記載の方法で卵内で生育させるか、または、例２Ｂに記載の方法でＭＤＣＫ細胞内で生育させる。どちらの場合も、ウィルスを５回継代培養した。各継代毎に、ＥＩＶ−Ｐ８２１の低温適応性表現型及び温度感受性表現型を検査した。これらの卵及び細胞継代ウィルス調製物を、例２Ｃで述べたように、ウィルス１０^７ｐｆｕ／ＢＳＡ−ＭＥＭ溶液２ｍｌを含む治療用組成物に製剤し、卵培養ＥＩＶ−Ｐ８２１治療用組成物と、ＭＤＣＫ細胞培養ＥＩＶ−Ｐ８２１治療用組成物とをそれぞれ得た。

８頭の子馬をこの研究に使用した。それぞれの動物から採取した血清の、ウマインフルエンザウィルスに対するＨＡＩ価を、この研究に先立って検査した。これらの動物を、それぞれ４頭からなる２つのグループに無作為に分けた。グループＡには、卵培養ＥＩＶ−Ｐ８２１治療用組成物を投与し、グループＢには、例２Ｂの方法で調製したＭＤＣＫ培養ＥＩＶ−Ｐ８２１治療用組成物を投与した。これらの治療用組成物を、例３Ｃに記載の方法で経鼻投与した。

これらの子馬の、例３に記載したアレルギー反応または臨床症状を、ワクチン接種の２日前からワクチン接種後１１日目まで、毎日ほぼ同じ時刻に観察した。これらの動物のいずれも、アレルギー反応または顕性の臨床症状を示さなかった。

ワクチン接種前及びワクチン接種後１１日間の毎日、鼻咽頭スワブを採取した。鼻スワブ中のウィルス物質の存在を、例１に記載したように、ＭＤＣＫ細胞のＣＰＥを検出することにより、または、例３に記載したように、卵へ接種し、感染したＡＦが赤血球凝集を起こす能力を調べることにより、測定した。検査したのは、ウィルスの存在についてのみであり、サンプル中のウィルスの力価については検査しなかった。ウィルス分離の結果を表１２に示す。血液を採取し、ワクチン接種後０日目、７日目、１４日目、２１日目及び２８日目の血清サンプルの、新鮮分離株に対する赤血球凝集阻害抗体価を検査した。ＨＡＩ価も表１２に示す。

表１２の結果は、卵培養ＥＩＶ−Ｐ８２１治療用組成物とＭＤＣＫ培養ＥＩＶ−Ｐ８２１治療用組成物との間で、感染性も免疫抗原性も著しい差がなかったことを示している。

例７
この例では、ウマをウマインフルエンザウィルス感染から保護するために必要な、低温適応性ウマインフルエンザウィルスを含有する治療用組成物の最小量を評価した。

例３から例６で開示した動物研究により、本発明の治療用組成物が有効かつ安全であることが示された。これらの研究で用いられた投与量は１０^７ｐｆｕであり、これは約１０^８ＴＣＩＤ_５０単位に相当する。しかし、費用及び安全面から考えると、ウマインフルエンザウィルスに起因する疾患からウマを保護するであろう最小ウィルス力価を用いると有利である。この研究では、低温ウマインフルエンザウィルスを含有する治療用組成物の４種類の異なる量を子馬にワクチン接種し、ビルレントウマインフルエンザウィルスの攻撃からウマを保護する最小量を決定した。

例１Ａに記載の方法で作製したＥＩＶ−Ｐ８２１を、例２Ｂに記載の方法でＭＤＣＫ細胞内で継代培養して生育させ、例２Ｃに記載したように、２×１０^４、２×１０^５、２×１０^６または２×１０^７ＴＣＩＤ_５０単位／ＢＳＡ−ＭＥＭ溶液１ｍｌ の治療用組成物を製剤した。様々に異なる年齢及び血統の１９頭のウマを使用した。これらのウマを、３頭のグループ１つと４頭のグループ３つからなる４つのワクチングループと、４頭からなる対照グループ１つとに分けた（表１３参照）。ワクチングループの各子馬に、例３に記載したのと同様の方法で、指示された治療用組成物を１−ｍｌ量投与した。

これらの子馬の即時型反応を、ワクチン接種直後約３０分間及びワクチン接種後約４時間後に観察し、また、これらの動物の遅延型反応を、ワクチン接種後１日目から１１日目にかけて観察した。ともに例３に記載の方法を用いた。この研究では、これらのワクチン接種した動物のいずれも、ワクチン接種による異常な反応や顕性の臨床症状を示さなかった。

ワクチン接種の３日前、ワクチン接種後７日目、１４日目、２１日目、２８日目、及びワクチン接種後３５日目及び４２日目の攻撃後に、血清分析用の血液を採集した。例３に記載の方法に従い、新鮮なＥＩＶ分離株に抗するＨＡＩ価について、血清サンプルを検査した。これらの価を表１４に示す。２９日目の攻撃の前に、グループ１の３頭のうち２頭、グループ２の４頭のうち４頭、グループ３の４頭のうち３頭及びグループ４の４頭のうち４頭のＨＡＩ価が、ワクチン接種後少なくとも４倍に増加した。加えて、４頭の対照ウマのうち２頭も、ＨＡＩ価が増加した。この結果に対する説明の一つとして、対照ウマが、ワクチン接種されたウマのワクチンウィルスに感染したのかもしれない。なぜなら、この研究で用いたウマはすべて同じ厩舎で飼育されていたからである。

ワクチン接種後２９日目に、１９頭の子馬すべてを、例４に記載のネブライザ法を用いて、ウマインフルエンザウィルス株Ａ／ウマ／ケンタッキー／１／９１（Ｈ３Ｎ８）で攻撃した。攻撃の投与量を見込み計算し、１頭当たり、容量５ｍｌに約１０^８ＴＣＩＤ_５０単位の攻撃ウィルスが含まれるようにした。攻撃の２日前、攻撃当日及び攻撃後１１日間、例３に記載された臨床観察を行った。表１４に示されるように、グループ１及び２のいずれの動物も、ウマインフルエンザ疾患の臨床症状を示さず、また、グループ３の４頭のうち１頭だけが罹患した。グループ４の４頭のうち２頭が罹患し、また、４頭の対照動物のうち２頭だけが罹患した。表１４の結果は、血清変換と疾患からの保護との関連性を示唆している。なぜなら、例えば、ワクチン接種期間中にＨＡＩ価が増加した２頭の対照動物は、攻撃後はウマインフルエンザ疾患の臨床症状を示さなかったからである。しかし、別の解釈として、攻撃ウィルスの実際の力価が、計算した量１０^８ＴＣＩＤ_５０単位よりも少なかったのかもしれない。なぜなら、前出の結果に基づけば、このレベルの攻撃は、全ての対照動物を罹患させたはずだからである。

それでもなお、低温適応性ウマインフルエンザウィルスを少なくとも２×１０^６ ＴＣＩＤ_５０ 単位含む治療用組成物を投与されたグループにおける血清変換のレベル及び臨床症状の欠如は、この量が、ウマインフルエンザ疾患からウマを保護するのに十分な量であったことを示唆している。さらに、２×１０^５ ＴＣＩＤ_５０ 単位の投与で血清変換が誘発され、４頭のうち３頭が攻撃から臨床的に保護されたことから、この量でも、ウマをウマインフルエンザウィルスから効果的に保護するのには十分であるのかもしれない。

例８
この例では、低温適応性ウマインフルエンザウィルスＥＩＶ−Ｐ８２１を含有する治療用組成物の免疫性の持続時間を評価するための動物研究について開示する。

例１に記載の方法で作製した低温適応性ウマインフルエンザウィルスＥＩＶ−Ｐ８２１を含有する治療用組成物を、例２Ａに記載した方法と同様に卵内で生育させ、例２Ｂに記載した方法と同様にＭＤＣＫ細胞内で継代培養により展開し、例２Ｃに記載した方法と同様に治療用組成物に製剤した。生後およそ１１ヶ月から１２ヶ月の３０頭のウマをこの研究に使用した。これらのうち１９頭のそれぞれに、ＥＩＶ−Ｐ８２１治療用組成物ＴＣＩＤ_５０単位を６ｌｏｇ含む投与量１．０ｍｌをのワクチンを、端部に送出装置の先端を取り付けた注射器を使用して、片方の鼻孔に経鼻接種した。ワクチン接種を０日目に行った。

これらのウマを、０日目（ワクチン接種前及びワクチン接種後４時間以内）及び、ワクチン接種後の研究日１日目、２日目、３日目、７日目、１５日目及び１６９日目に観察した。これらの日に、少なくとも１５分間の遠隔検査を行った。この遠隔検査には、様子、行動、咳、くしゃみ及び鼻汁の観察が含まれた。１６９日目の検査でも、これらのウマは、ワクチン接種場所から約３６０マイル離れた攻撃場所までの輸送に適する健康状態であったことが確認された。

これらの動物は攻撃場所に慣らされ、ほぼ毎日、獣医師または動物専門技術者により疾患の徴候を観察された。ワクチン接種後１７１日目に、次の項目について、一般的な身体検査を行った：様子、行動、咳、くしゃみ及び鼻汁。１７２日目から１７７日目までは、これらのウマそれぞれの異常な臨床症状を観察する担当獣医の判断に基づき、同様の検査に加えて、直腸温を記録した。

ワクチン接種したウマのいずれも、ワクチン接種後に有害反応を示さなかった。そのうち１頭は、ワクチン接種の約２ヶ月後に死亡した。このウマは、ワクチン接種後少なくとも１ヶ月間の観察時には、有害反応の徴候を全く示さなかった。死因を確定することはできないとしても、死亡は突発的なものではなく、疝痛、骨折または重症の寄生虫性の負担などの要因と関連があるのではないかと考えられた。他のワクチン接種したウマには、ワクチン接種後に有害反応は見られなかったので、この場合、ワクチンが何らかの有害反応の原因となったとは考えにくい。

ワクチン接種後１８１日目に攻撃を行った。ウマの疾患を引き起こすことが予め確認されている、次のウマインフルエンザウィルスの野生型分離株：Ａ／ウマ／２／ケンタッキー／９１を、攻撃ウィルスとして使用した。各攻撃グループの感染の前に、攻撃材料を約３７度で急速解凍した。ウィルスをリン酸緩衝生理食塩水で希釈し、総量約２１ｍｌとした。この希釈した材料を、接種の直前まで氷冷保存した。各攻撃グループの接種前及び噴霧終了時に、希釈した攻撃ウィルスのサンプルを採集して、接種前及び接種後のウィルス力価を確認した。ワクチン接種ウマと対照ウマとを、それぞれ６頭からなる４つの攻撃グループと、５頭からなる１つの攻撃グループとに無作為に分け、各攻撃グループが、４頭のワクチン接種ウマと２頭の対照ウマ、または３頭のワクチン接種ウマと２頭の対照ウマの組み合わせから構成されるようにした。

エアロゾル状態の攻撃ウィルスを、超音波ネブライザ（例えばデビルビス・モデル０９９ＨＤ， ペンシルベニア州サマセット、デビルビス・ヘルスケア社）を用いて、プラスチックのシーリングの中央に開けた小さな孔から挿入した管を介して、約１０分間投与した。噴霧終了後さらに約３０分間、これらのウマをチャンバ内に留置した（曝露時間合計約４０分間）。この時点でプラスチックを取り除いてチャンバを換気し、これらのウマを解放してそれぞれの厩舎に戻した。この攻撃工程を各グループについて繰り返した。

この研究における統計手法には、すべてＳＡＳ（ノースカロライナ州ケアリー、ＳＡＳインスティテュート社）を使用し、Ｐ＜０．０５を統計上有意であるとした。ワクチン接種後１７８日目（攻撃３日前）から１９１日目（攻撃後１０日目）まで、これらのウマを遠隔検査及び個体検査の双方により、毎日観察した。この時、直腸温を測定した。０日目（攻撃当日）から攻撃後１０日目までのデータを分析に使用し、表１５に示す。

表１５は、攻撃後２日目から８日目まで、ワクチン接種ウマの温度が、ワクチン非接種対照ウマの温度よりも低い（Ｐ＜０．０５）ことを示している。

遠隔検査の時間は２０分間であり、その中で次の観察を行った：咳、鼻汁、呼吸及び抑うつ。採点基準を表１６に示す。

それぞれのウマを、これらの各カテゴリについて採点した。加えて、顎下リンパ節を触診し、細菌感染の有無を調べた。同じ日に行われた観察で、遠隔検査の主観臨床症状スコアと個別検査の主観臨床症状スコアとが異なる場合は、結果の整理分析の際に、大きい方のスコアを用いた。最終処理の前にこれらのウマの健康状態を評価する目的で、攻撃後１４日目、１８日目及び２１日目に遠隔検査を行った。この分析には、攻撃後１日目から１０日目までのデータも使用した。これらのスコアを１頭毎に日別に合計し、ウィルコクソン順位合計検定により、ワクチン接種ウマと対照ウマとを比較した。さらに、１頭毎に全ての日のスコアを合計し、同じ方法で比較した。平均順位及び平均臨床スコアを、表１７及び表１８にそれぞれ示す。接種後５日目では、ワクチン接種ウマのスコアの平均順位は、ワクチン非接種対照ウマのスコアの平均順位よりも低かった（Ｐ＜０．０５）。そして、この結果は、６日目、７日目、８日目、９日目及び１０日目でも同様であった（Ｐ＜０．０５）。検査期間全体の累積順位についても、ワクチン接種ウマの方がワクチン非接種対照ウマよりも低かった（Ｐ＜０．０５）。

鼻咽頭スワブを、例３で述べたように、攻撃前日及び攻撃後１日目から８日目にかけて採取し、放散されたウィルスを細胞培養アッセイにより検査した。攻撃ウィルスを放散していたウマの各グループのパーセンテージを、表１９に示す。攻撃ウィルスを放散していたウマのワクチン接種グループでのパーセントは、攻撃後５日目及び６日目では、非ワクチン接種対照グループでのパーセントよりも低かった（Ｐ＜０．０５）。攻撃ウィルスが放散された平均日数も、ワクチン接種グループは、非ワクチン接種対照グループよりも低かった（Ｐ＜０．０５）。

ワクチン接種グループのインフルエンザに関係する臨床徴候スコア及び客観的温度測定のスコアは共に、対照グループと比較して低く、その差は統計的に有意であった；このことは、このワクチンが疾患からの著しい保護効果を有することを説明するものである。

攻撃後にウマがインフルエンザウィルスを放散する能力についても、攻撃後の複数の日の放散陽性のウマの出現率と、１頭当たりの放散日数とが、共に、ワクチン接種グループの方が対照グループよりも著しく少なかった。ワクチン接種グループによる放散が少ないというこの事実は、重要な意味を持つ。なぜなら、このことが、インフルエンザ流行時に、感受性の動物が野生型ウィルスに曝露される潜在的な可能性を減少させるのに役立つと予想されるからである。

この研究の結果は、このワクチンが、ウマインフルエンザに起因する臨床疾患を６ヶ月間安全に防止し、天然に発生するビルレントウマインフルエンザウィルスの放散の可能性を減少させたということを説明するものである。疾患からの保護の程度は完全ではないが（ワクチン接種された１９頭のうち１３頭が保護されたのに対し、１０頭の対照ウマのうち１０頭が罹患した）、臨床疾患の重度及び期間は明らかに軽減され、また、ウマインフルエンザのビルレント株への曝露後にウィルスが放散する潜在的な可能性に大きな影響を与えた。ワクチン接種ウマと対照ウマとが、免疫接種後６ヶ月目の攻撃の直前に、双方とも血清陰性であったという結果は、血清抗体以外の何かにより伝達される免疫力が、このワクチンの測定可能なかつ恒久性の保護能力を最も大きく左右するのかもしれないということを示唆している。

例９
この例では、低温適応性ウマインフルエンザウィルスＥＩＶ−Ｐ８２１を含有する治療用組成物の、ウマインフルエンザウィルスの異種株への曝露後の疾患を予防する能力を評価するための動物研究を開示する。

検査に使用した異種株は、遺伝学的にはユーラシア系統株（サスカチェワン大学、ヒューゴ・タウンセンドより入手）として述べられるＡ／ウマ／２／サスカトゥーン／９０であった。２０頭の約１５月齢（ワクチン接種時）のペルシュロン種の雌ウマを、有効性研究に使用した。これらのウマを、１０頭からなるワクチン接種グループと、１０頭からなるワクチン非接種対照グループとの２グループに分けた。０日目に、例８に述べた方法でワクチン接種グループにワクチンを接種した。

攻撃材料、すなわちウマインフルエンザ株Ａ／ウマ／２／サスカトゥーン／９０［Ｈ３Ｎ８］を、例８で述べた製法と同様の方法で調製した。ワクチン接種ウマと対照ウマとを、それぞれ５頭からなる４つの攻撃グループに無作為に分け、各攻撃グループが２頭のワクチン接種ウマと３頭の対照ウマ、または３頭のワクチン接種ウマと２頭の対照ウマから構成されるようにした。攻撃の工程は、例８で述べた工程と同様であった。ワクチン接種後２８日目に攻撃を行った。

ワクチン接種ウマと対照ウマとの臨床観察を、ワクチン接種４日前と、研究日０日目（ワクチン接種前からワクチン接種後４時間まで）、１日目から７日目、１２日目、１５日目から１７日目まで、１９日目から２３日目、２５日目から３８日目、及び４２日目に行った。ワクチン接種４日前からワクチン接種後４２日目までの間の臨床観察日に、１頭毎に、異常な臨床症状を観察する担当獣医の判断に基づき、直腸温を含めた臨床観察を記録した。例８（表１５）で使用したのと同じ基準を用いて、ウマのスコアをつけた。これらの日に、例８で述べた遠隔検査を行った。２０日目及び２５日目から３８日目にかけては、これらのウマを遠隔検査と個別検査の両方により（例８で述べたのと同じ方法で）観察した。

直腸温を、攻撃の３日前から攻撃後１０日目まで毎日測定した。攻撃０日目は攻撃の当日である。攻撃後０日目から１０日目までのデータを分析に使用した。例８で使用したのと同じ統計的手法と基準とを用いた。攻撃後２日目、５日目及び７日目には、ワクチン接種されたウマは、非ワクチン接種対照ウマよりも統計上有意的に低い体温を示した（表２０）。

攻撃後１日目から１０日目までのデータを、分析に使用した。これらのスコアを１頭毎に日別に合計し、ウィルコクソン順位合計検定により、ワクチン接種ウマと対照ウマとを比較した。統計的手法はすべて例９で述べたのと同じ手法を用いた。さらに、１頭毎に全ての日のスコアを合計し、同じ方法で比較した。平均順位を表２１に示す。

接種後４日目では、ワクチン接種ウマのスコアの平均順位は、ワクチン非接種対照ウマのスコアの平均順位よりも低かった（Ｐ＜０．０５）。そして、この結果は、この研究の期間全体を通して同じであった（Ｐ＜０．０５）。検査期間全体の累積順位についても、ワクチン接種ウマの方がワクチン非接種対照ウマよりも低かった（Ｐ＜０．０５）。

鼻咽頭スワブを、例３で述べた方法で、攻撃後１日目から８日目にかけて採集した。鼻サンプルを、ウィルスの存在について分析した。分析は、細胞に接種して、細胞変性効果（ＣＰＥ）によりウィルスを検出するか、または、卵に接種して、赤血球凝集（ＨＡ）によりウィルスを検出して行った。細胞培養アッセイを、Ｙｏｕｎｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３２， ７５０−７５４に概説されている方法で行った。連続的に希釈した鼻サンプルを、マディン・ダービー・イヌ腎臓（ＭＤＣＫ）単層を含むウェルに加えた。インキュベート後、細胞変性効果の存在及び程度について、ウェルを検査した。ウィルスのＴＣＩＤ^５０単位量を、リード−ミュエンチ法により算出した。例１に述べた方法で、卵感染性アッセイを行った。各グループで攻撃ウィルスを放散していたウマのパーセンテージを、アッセイ別に表２２及び表２３に示す。ワクチン接種グループでは、攻撃後２日目から７日目までの間に攻撃ウィルスを放散していたウマのパーセントは、どちらの方法でも比較的低かった（Ｐ＜０．０５）。攻撃後１日目または８日目は、差異が見られなかった。また、攻撃ウィルス放散日数も、ワクチン接種グループの方が、非ワクチン接種対照グループよりも低かった（Ｐ＜０．０５）；表２２及び表２３を参照のこと。

ワクチン接種グループのインフルエンザ臨床徴候の程度（重度及び期間）は、対照グループと比較して概ね軽かった。インフルエンザに関係する臨床徴候のスコア及び客観的温度測定結果は、共に、ワクチン接種グループの方が対照グループよりも統計的有意に低かった。このことは、このワクチンに、異種株による疾患からの著しい保護効果があることを示す。

攻撃後にウマがインフルエンザウィルスを放散する能力についても、攻撃後の複数の日の放散陽性のウマの出現率と、１頭当たりの放散日数とが、共に、ワクチン接種グループの方が対照グループよりも著しく低かった。ワクチン接種グループによる放散が少ないというこの事実は重要な意味をもつ。なぜなら、このことが、インフルエンザ流行時に、感受性の動物が野生型ウィルスに曝露される可能性を減少させるのに役立つであろうからである。

総合すると、この研究の結果は、このワクチンが、ユーラシア系ウマインフルエンザウィルス株の一種による異種攻撃に対する保護効果を発揮したことを示した。

例１０
この例では、低温適応性ウマインフルエンザウィルスＥＩＶ−Ｐ８２１を含有する治療用組成物の、ウマインフルエンザウィルスの異種株への曝露後の疾患を予防する能力を評価するための動物研究について開示する。

検査した異種株は、Ａ／ウマ／ケンタッキー／１／９１（Ｈ３Ｎ８） （ケンタッキー大学、トム・チャンバーズより入手）であった。生後５ヶ月から７ヶ月の８頭の子馬を、この有効性研究に使用した。これらのウマを、ワクチン接種する４頭と、非ワクチン接種対照の４頭の２グループに分けた。例８に述べた方法で、０日目に子馬にワクチンを接種した。

研究日０日目（ワクチン接種前及びワクチン接種の４時間後）及び接種後１日目から８日目まで、２３日目、３０日目から５０日目まで、及び５７日目に、ワクチン接種グループの臨床観察を行った。対照グループの臨床観察を、接種後２９日目から５０日目まで、及び５７日目に行った。例８に述べた方法で、観察及び採点を行った。

攻撃材料、すなわち、ケンタッキー／９８からのウマインフルエンザ株を、この分離ウィルスを卵内で２回継代培養して作製した。このウィルス０．５ｍｌを解凍し、次に滅菌リン酸緩衝生理食塩水４．５ｍｌに希釈して、それぞれのウマへの接種材料を調製した。この接種材料を、ワクチン接種後３６日目に、マスクを使用した噴霧により、それぞれのウマに投与した。

臨床観察スコアを、日別に１頭毎に合計し、攻撃後１日目から９日目の累積合計スコアに基づき、ウマを順位付けした。これらの結果を表２４に示す。

表２４の結果は、ワクチン接種グループのスコアが０から２の間であり、対照グループのスコア２１から２６までと比較して著しく低かったことを示している。

攻撃の６日前から攻撃後９日目まで、直腸温を毎日測定した。０日目は攻撃の当日である。攻撃後０日目から９日目までのデータを分析に使用した。これらの結果を表２５に示す。

全ての日で、対照ウマの温度は、ワクチン接種ウマの温度よりも高かった。対照ウマの温度は、２日目に顕著に高かった。

例３に述べた方法で、攻撃後１日目及び８日目に鼻咽頭スワブを採集した。例１に述べた卵感染性アッセイにより、これらのサンプルの放散ウィルスを検査した。このアッセイの結果を表２６に示す。

表２６の結果は、１日当たりの陽性ウマの数が、対照グループの方がワクチン接種グループよりも高かったことを示している。さらに、対照ウマはワクチン接種ウマよりも陽性を示した日数が多かった。

インフルエンザに関連する臨床徴候のスコア及び客観的温度測定結果は、共に、ワクチン接種グループと対照グループとの間に著しい相違を示した；このことは、このワクチンが、異種株ケンタッキー／９８に起因する疾患からの高い保護効果を有することを示している。

ウマが攻撃後にインフルエンザウィルスを放散する能力についても、ワクチン接種グループの１頭当たりの平均放散日数は、対照グループと比較して著しく低かった。ワクチン接種グループによる放散が少ないというこの事実は重要な意味をもつ。なぜなら、このことが、インフルエンザ流行時に、感受性の動物が野生型ウィルスに曝露される可能性を減少させるのに役立つと予想されるからである。

総合すると、この研究の結果は、このワクチンが、新鮮な及び臨床的に近似した分離株による異種攻撃に対する安全な保護効果を有することを示している。この研究結果を、ユーラシア系統株による異種攻撃に対して発揮した保護効果（例９）に照らして見ると、この調製生ワクチンが、同種ウマインフルエンザ感染だけではなく異種ウマインフルエンザ感染に対しても保護効果を有することは明らかである。

例１１
この例では、野生型及び低温適応性ウマインフルエンザウィルスの、ウマインフルエンザＭ（基質）タンパク質核酸分子のクローニング及び配列決定について説明する。

Ａ．野生型または低温適応性ウマインフルエンザウィルスＭタンパク質をコードする核酸分子を、次の方法で作製した。ウマインフルエンザウィルスＤＮＡ及び、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７のプライマｗ５８４及びｗ５８５から、ＰＣＲ増幅により、ウマインフルエンザＭ遺伝子を含有するＰＣＲ産物を作製した。ｎｅｉ_ｗｔＭ_１０２３として表され、核酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のコドン鎖を有する、ヌクレオチド１０２３個からなる核酸分子を、さらなるＰＣＲ増幅により、上述のＰＣＲ産物を鋳型として作製し、カリフォルニア州カールズバッド、インヴィトロゲン社より入手可能なｐＣＲ ２．１（登録商標）ＴＡクローニングベクターに、製造者が保証する標準的な方法でクローニングした。使用したプライマは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９のＴ７プライマ及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８のＲＥＶプライマであった。プラスミドＤＮＡを、カリフォルニア州バレンシア、キアゲン社より入手可能なミニプレップ法で精製した。シークエンシング用のＰＣＲ産物を、それぞれカリフォルニア州フォスターシティ、ピーイー・アプライド・バイオシステムズ社より入手可能な、ＰＲＩＳＭ^ＴＭ ダイ・ターミネータ・サイクル・シークエンシング・レディ・リアクション・キット、ＰＲＩＳＭ^ＴＭ ｄＲｈｏダミン・ターミネータ・サイクル・シークエンシング・レディ・リアクション・キット、またはＰＲＩＳＭ^ＴＭ ＢｉｇＤｙｅ^ＴＭ ターミネータ・サイクル・シークエンシング・レディ・リアクション・キットを用いて、製造者のプロトコルに従って作製した。キットで使用したＰＣＲ条件は、９５℃で１０秒間加熱、５０℃で５秒間加熱、６０℃で４分間加熱、このサイクルを２５回繰り返した。異なる反応では、異なるプライマの組み合わせを用いた：第１の反応ではＴ７とＲＥＶ、第２の反応ではｗ５８４とｗ５８５、第３の反応ではＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１のｅｆＭ−ａ１及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０のｅｆＭ−ｓ１を使用した。ＰＣＲ産物を、エタノール／塩化マグネシウム沈降法により精製した。ピーイー・アプライド・バイオシステムズ社より入手可能なＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ^ＴＭ モデル３７７、ＸＬアップグレードＤＮＡシークエンサを使用して、ＤＮＡサンプルの自動配列決定を行った。

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１を翻訳すると、核酸分子ｎｅｉ_ｗｔＭ_１０２３が、ここではＰｅｉ_ｗｔＭ_２５２と言及されるアミノ酸約２５２個からなる全長ウマインフルエンザＭタンパク質をコードすることが判明し、このタンパク質のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で表されるが、ただしこのとき、開いた読み枠の開始コドンがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のヌクレオチド２５からヌクレオチド２８にあり、終了コドンがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のヌクレオチド７８１からヌクレオチド７８３にあることを想定している。Ｐｅｉ_ｗｔＭ_２５２をコードする領域は、ｎｅｉ_ｗｔＭ_７５６で表されるが、この領域は、ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：１のヌクレオチド２５から７８０までにあるコドン鎖を有し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３で表される。

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３は、２つの野生型核酸分子から得たコンセンサス配列を表し、これらの野生型核酸分子とはヌクレオチドが１つ異なる。 ｎｅｉ_ｗｔ１Ｍ_１０２３のヌクレオチド６６３、すなわち、ｎｅｉ_ｗｔ１Ｍ_７５６のヌクレオチド６４９は、アデニンであるが、ｎｅｉ_ｗｔ２Ｍ_１０２３のヌクレオチド６６３、すなわち、ｎｅｉ_ｗｔ２Ｍ_７５６のヌクレオチド６４９は、グアニンであった。これらの配列を翻訳しても、対応するアミノ酸は変化せず、双方とも Ｐｅｉ_ｗｔＭ_２５２の残基２２１のバリンに翻訳する。

Ｂ．低温適応性ウマインフルエンザウィルスＭをコードする１０２３個のヌクレオチドからなる核酸分子は、ｎｅｉ_ｃａ１Ｍ_１０２３で表され、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４で表されるコドン鎖を有するが、この核酸分子をさらなるＰＣＲ増幅により作製し、インヴィトロゲン社より入手可能なｐＣＲ（登録商標）−Ｂｌｕｎｔクローニングベクターに、製造者が保証する標準的な方法でクローニングした。このとき使用したプライマはＴ７及びＲＥＶであった。例１１Ａに記載した方法で、プラスミドＤＮＡ精製及びサイクルシークエンスを行った。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４を翻訳すると、核酸分子ｎｅｉ_ｃａ１Ｍ_１０２３が、ここではＰｅｉ_ｃａ１Ｍ_２５２と言及されるアミノ酸約２５２個からなる全長ウマインフルエンザＭタンパク質をコードすることが判明し、このタンパク質のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５で表されるが、ただしこのとき、開放読み取り枠の開始コドンがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のヌクレオチド２５からヌクレオチド２８にあり、終了コドンがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のヌクレオチド７８１からヌクレオチド７８３にあることを想定している。Ｐｅｉ_ｃａ１Ｍ_２５２をコードする領域は、ｎｅｉ_ｃａ１Ｍ_７５６を指定するが、この領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のヌクレオチド２５から７８０までにあるコドン鎖を有し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６で表される。低温適応性ウマインフルエンザＭタンパク質をコードする第２の核酸分子を同じ方法でＰＣＲ増幅し、ｎｅｉ_ｃａ１Ｍ_１０２３と同一の分子 ｎｅｉ_ｃａ２Ｍ_１０２３、及びｎｅｉ_ｃａ１Ｍ_７５６と同一の分子ｎｅｉ_ｃａ２Ｍ_７５６を作製した。

Ｃ．ｎｅｉ_ｗｔＭ_１０２３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）とｎｅｉ_ｃａ１Ｍ_１０２３ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）のコドン鎖の核酸配列をＤＮＡアライメントで比較すると、次の相違が判明する：塩基６７のＧがＴに変化、塩基５２７のＣがＴに変化、塩基８８６のＧがＣに変化。タンパク質Ｐｅｉ_ｗｔＭ_２５２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）とＰｅｉ_ｃａ１Ｍ_２５２ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）とのアミノ酸配列を比較すると、次の相違が判明する：ＤＮＡ配列の塩基６７のＧからＴへの変化に対応する、アミノ酸２３のＶからＬへの変化、及びＤＮＡ配列の塩基５２７のＣからＴへの変化に対応する、アミノ酸１８７のＴからＩへの変化。

例１２
この例では、野生型または低温適応性ウマインフルエンザウィルスのウマインフルエンザＨＡ（ヘマグルチニン）タンパク質核酸分子のクローニング及び配列決定について説明する。

Ａ．野生型または低温適応性ウマインフルエンザウィルスＨＡタンパク質をコードする核酸分子を、次の方法で作製した。ウマインフルエンザウィルスＤＮＡ及び、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３のプライマｗ５７８及びｗ５７９から、ＰＣＲ増幅により、ウマＨＡ遺伝子を含有するＰＣＲ産物を作製した。ｎｅｉ_ｗｔＨＡ_１７６２として表され、核酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７を含むコドン鎖を有する、野生型ＨＡタンパク質をコードするヌクレオチド１７６２個からなる核酸分子を、さらなるＰＣＲ増幅により、上述のＰＣＲ産物を鋳型として作製し、例１１Ａに記載した方法でｐＣＲ ２．１（登録商標）ＴＡクローニングベクターにクローニングした。プラスミドＤＮＡを、例１１Ａに記載した方法で精製及び配列決定した。ただし、シークエンシングキットで使用したプライマは、例１１ＡではＴ７及びＲＥＶであったが、この例では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４で表されるＨＡ−１及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５で表されるＨＡ−２を使用した。

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７を翻訳すると、核酸分子ｎｅｉ_ｗｔＨＡ_１７６２が、ここではＰｅｉ_ｗｔＨＡ_５６５と言及されるアミノ酸約５６５個からなる全長ウマインフルエンザＨＡタンパク質をコードすることが判明し、このタンパク質のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８で表されるが、ただしこのとき、開いた読み枠の開始コドンがＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：７のヌクレオチド３０からヌクレオチド３３にあり、終了コドンがＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：７のヌクレオチド１７２５からヌクレオチド１７２７にあることを想定している。Ｐｅｉ_ｗｔＨＡ_５６５をコードする領域は、ｎｅｉ_ｗｔＨＡ_１６９５で表されるが、この領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７のヌクレオチド３０から１７２４までにあるコドン鎖を有し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９で表される。

Ｂ．低温適応性ウマインフルエンザウィルスＨＡタンパク質をコードする１７６２個のヌクレオチドからなる核酸分子は、ｎｅｉ_ｃａ１ＨＡ_１７６２で表され、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０で表されるコドン鎖を有するが、この核酸分子を、例１１Ｂに記載した方法で作製した。プラスミドＤＮＡ精製及びサイクルシークエンスを、例１２Ａに記載した方法で行った。

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０を翻訳すると、核酸分子がｎｅｉ_ｃａ１ＨＡ_１７６２が、ここではＰｅｉ_ｃａ１ＨＡ_５６５と言及されるアミノ酸約５６５個からなる全長ウマインフルエンザＨＡタンパク質をコードすることが判明し、このタンパク質のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１で表されるが、ただしこのとき、開いた読み枠の開始コドンがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０のヌクレオチド３０からヌクレオチド３３にあり、終了コドンがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０のヌクレオチド１７２５からヌクレオチド１７２７にあることを想定している。Ｐｅｉ_ｃａ１ＨＡ_５６５をコードする領域は、ｎｅｉ_ｃａ１ＨＡ_１６９５で表されるが、この領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０のヌクレオチド３０から１７２４までにあるコドン鎖を有し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２で表される。

低温適応性ウマインフルエンザＨＡタンパク質をコードする第２の核酸分子を同じ方法でＰＣＲ増幅し、ｎｅｉ_ｃａ１ＨＡ_１７６２と同一の分子 ｎｅｉ_ｃａ２ＨＡ_１７６２、及びｎｅｉ_ｃａ１ＨＡ_１６９５と同一の分子ｎｅｉ_ｃａ２ＨＡ_１６９５を作製した。

Ｃ．ｎｅｉ_ｗｔＨＡ_１７６２ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）とｎｅｉ_ｃａ１ＨＡ_１７６２ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）とのコドン鎖の核酸配列をＤＮＡアライメントで比較すると、次の相違が判明する：塩基５５のＣがＴに変化、塩基４９９のＧがＡに変化、塩基６７１のＧがＡに変化、塩基７３８のＣがＴに変化、塩基８０５のＴがＣに変化、塩基１２８９のＧがＡに変化、塩基１３６８のＡがＧに変化。。タンパク質Ｐｅｉ_ｗｔＨＡ_５６５ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）とＰｅｉ_ｃａ１ＨＡ_５６５ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）とのアミノ酸配列を比較すると、次の相違が判明する：ＤＮＡ配列の塩基５５のＣからＴへの変化に対応する、アミノ酸１８のＰからＬへの変化、ＤＮＡ配列の塩基４９９のＧからＡへの変化に対応する、アミノ酸１６６のＧからＥへの変化、ＤＮＡ配列の塩基７３８のＣからＴへ温変化に対応する、アミノ酸２４６のＲからＷへの変化、ＤＮＡ配列の塩基８０５のＴからＣへの変化に対応する、アミノ酸２６８のＭからＴへの変化、ＤＮＡ配列の塩基１３６８のＡからＧへの変化に対応する、アミノ酸４５６のＫからＥへの変化。ＤＮＡ配列の塩基６７１のＧからＡへの変化に対応する、残基２２３のセリン（Ｓ）は変化せず、また、ＤＮＡ配列の塩基１２８９のＧからＡへの変化に対応する、残基４２９のアルギニン（Ｒ）も変化しなかった。

例１３
この例では、野生型又は低温適応性ウマインフルエンザウィルスの、ウマインフルエンザＰＢ２タンパク質（ＲＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ）のＮ−末端部分に対応する核酸分子のクローニング及び配列決定について説明する。

Ａ． 野生型または低温適応性ウマインフルエンザウィルスＰＢ２−Ｎタンパク質をコードする核酸分子を、次の方法で作製した。ウマインフルエンザウィルスＤＮＡ及び、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７で表されるプライマｗ５７０及びｗ５７１から、ＰＣＲ増幅により、ウマＰＢ２遺伝子のＮ−末端部分を含有するＰＣＲ産物を作製した。ｎｅｉ_ｗｔＰＢ２−Ｎ_１２４１として表され、核酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３で表されるアミノ酸配列を有するコドン鎖を有する、野生型ＰＢ２−Ｎタンパク質をコードするヌクレオチド１２４１個からなる核酸分子を、さらなるＰＣＲ増幅により、上述のＰＣＲ産物を鋳型として作製し、例１１Ｂに記載した方法でクローニングした。プラスミドＤＮＡを、例１１Ｂに記載した方法で精製及び配列決定した。ただし、シークエンシングキットで使用したプライマは、Ｔ７及びＲＥＶのみであった。

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３を翻訳すると、核酸分子ｎｅｉ_ｗｔＰＢ２−Ｎ_１２４１が、ここではＰ_ｗｔＰＢ２−Ｎ_４０４と言及されるアミノ酸約４０４個からなるウマインフルエンザＰＢ２タンパク質をコードすることが判明し、このタンパク質のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４で表されるが、ただしこのとき、開いた読み枠の開始コドンがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３のヌクレオチド２８からヌクレオチド３０にあり、終了コドンがヌクレオチド１２３７からヌクレオチド１２３９にあることを想定している。Ｐ_ｗｔＰＢ２−Ｎ_４０４をコードする領域は、ｎｅｉ_ｗｔＰＢ２−Ｎ_１２１４で表されるが、この領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３のヌクレオチド２８から１２３９までにあるコドン鎖を有し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５で表される。

Ｂ．インフルエンザＰＢ２低温適応性ウマインフルエンザウィルスＰＢ２−Ｎタンパク質のＮ−末端をコードする１２３９個のヌクレオチドからなる核酸分子は、ｎｅｉ_ｃａ１ＰＢ２−Ｎ_１２４１で表され、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６で表されるコドン鎖を有するが、この核酸分子を、例１２Ａに記載した方法で作製した。

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６を翻訳すると、核酸分子ｎｅｉ_ｃａ１ＰＢ２−Ｎ_１２４１が、ここではＰｅｉ_ｃａ１ＰＢ２−Ｎ_４０４と言及されるアミノ酸約４０４個からなるウマインフルエンザＰＢ−２タンパク質のＮ−末端をコードすることが判明し、このタンパク質のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７で表されるが、ただしこのとき、開いた読み枠の開始コドンがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６のヌクレオチド２８からヌクレオチド３０にあり、終了コドンがヌクレオチド１２３７からヌクレオチド１２３９にあることを想定している。Ｐｅｉ_ｃａ１ＰＢ２−Ｎ_４０４をコードする領域は、ｎｅｉ_ｃａ１ＰＢ２−Ｎ_１２１４で表されるが、この領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６のヌクレオチド２８から１２３９にあるコドン鎖を有し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８で表される。

低温適応性ウマインフルエンザＰＢ２−Ｎタンパク質をコードする第２の核酸分子を同じ方法でＰＣＲ増幅し、ｎｅｉ_ｃａ１ＰＢ２−Ｎ_１２４１と同一の分子 ｎｅｉ_ｃａ２ＰＢ２−Ｎ_１２４１、及びｎｅｉ_ｃａ１ＰＢ２−Ｎ_１２１４ と同一の分子ｎｅｉ_ｃａ２ＰＢ２−Ｎ_１２１４を作製した。

Ｃ．ｎｅｉ_ｗｔＰＢ２−Ｎ_１２４１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）とｎｅｉ_ｃａ１ＰＢ２−Ｎ_１２１４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）とのコドン鎖の核酸配列をＤＮＡアライメントで比較すると、次の相違が判明する：塩基３７０のＴがＣ。タンパク質Ｐ_ｗｔＰＢ２−Ｎ_４０４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）とＰ_ｃａ１ＰＢ２−Ｎ_４０４ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）とのアミノ酸配列を比較すると、次の相違が判明する：ＤＮＡ配列の塩基３７０のＴからＣへの変化に対応する、アミノ酸１２４のＹからＨへの変化。

例１４
この例では、野生型又は低温適応性ウマインフルエンザウィルスの、ウマインフルエンザＰＢ２タンパク質（ＲＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ）のＣ−末端部分に対応する核酸分子のクローニング及び配列決定について説明する。

Ａ． 野生型または低温適応性ウマインフルエンザウィルスＰＢ２−Ｃタンパク質をコードする核酸分子を、次の方法で作製した。ウマインフルエンザウィルスＤＮＡ及び、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９で表されるプライマｗ５７２及びｗ５７３から、ＰＣＲ増幅により、ウマＰＢ２遺伝子のＣ−末端部分を含有するＰＣＲ産物を作製した。ｎｅｉ_ｗｔＰＢ２−Ｃ_１２３３として表され、核酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９を含むコドン鎖を有する、野生型ＰＢ２−Ｃタンパク質をコードするヌクレオチド１２３３個からなる核酸分子を、さらなるＰＣＲ増幅により、上述のＰＣＲ産物を鋳型として作製し、例１１Ｂに記載した方法でクローニングした。プラスミドＤＮＡを、例１１Ａに記載した方法で精製及び配列決定した。ただし、シークエンシングキットでは異なるプライマを使用した。例１１ＡではＴ７及びＲＥＶを使用したが、この例では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４０で表されるｅｆＰＢ２−ａ１とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４１で表されるｅｆＰＢ２−ｓ１、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４２で表されるｅｆＰＢ２−ａ２とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４３で表されるｅｆＰＢ２−ｓ２を使用した。

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９を翻訳すると、核酸分子ｎｅｉ_ｗｔ１ＰＢ２−Ｃ_１２３３が、ここではＰ_ｗｔＰＢ２−Ｃ_３９８と言及されるアミノ酸約３９８個からなるウマインフルエンザＰＢ２タンパク質のＣ−末端をコードすることが判明し、このタンパク質のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０で表されるが、ただしこのとき、開いた読み枠の開始コドンがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９のヌクレオチド３からヌクレオチド５にあり、終了コドンがヌクレオチド１１９７からヌクレオチド１１９９にあることを想定している。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９は単なる部分的な遺伝子配列であるので、開始コドンを含まない。Ｐ_ｗｔＰＢ２−Ｃ_３９８をコードする領域は、ｎｅｉ_ｗｔＰＢ２−Ｃ_１１９４で表されるが、この領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９のヌクレオチド３から１１９６までにあるコドン鎖を有し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１で表される。

野生型インフルエンザＰＢ２−Ｎタンパク質をコードする第２の核酸分子を同様の方法でＰＣＲ増幅し、ｎｅｉ_ｗｔ２ＰＢ２−Ｎ_１２３２として表され、核酸配列ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：２２を含むコドン鎖を有する、ヌクレオチド１２３２個からなる核酸分子を作製した。ｎｅｉ_ｗｔ２ＰＢ２−Ｎ_１２３２は、５’−末端のヌクレオチド１個の欠失を除いては、ｎｅｉ_ｗｔ１ＰＢ２−Ｃ_１２３３と同一である。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２を翻訳すると、核酸分子ｎｅｉ_ｗｔ１ＰＢ２−Ｃ_１２３３が、Ｐ_ｗｔＰＢ２−Ｃ_３９８（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ．２０）もコードすることが判明するが、ただしこのとき、開いた読み枠の開始コドンがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２のヌクレオチド２からヌクレオチド４にあり、終了コドンがヌクレオチド１１９６からヌクレオチド１１９８にあることを想定している。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２は単なる部分的な遺伝子配列であるので、開始コドンを含まないＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２のヌクレオチド２から１１９５までにあるヌクレオチドを含むコドン鎖を有する核酸分子は、ｎｅｉ_ｗｔ２ＰＢ２−Ｃ_１１９４で表され、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１と同一である。

Ｂ．インフルエンザＰＢ２低温適応性ウマインフルエンザウィルスＰＢ−２タンパク質のＣ−末端部分をコードする１２３２個のヌクレオチドからなる核酸分子は、ｎｅｉ_ｃａ１ＰＢ２−Ｃ_１２３２で表され、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３で表されるコドン鎖を有するが、この核酸分子を、ｐＣＲ（登録商標）−Ｂｌｕｎｔクローニングベクターを使用した点以外では例１４Ａに記載した方法と同じ方法で作製した。

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３を翻訳すると、核酸分子ｎｅｉ_ｃａ１ＰＢ２−Ｃ_１２３２が、ここではＰ_ｃａ１ＰＢ２−Ｃ_３９８と言及されるアミノ酸約３９８個からなるウマインフルエンザＰＢ−２タンパク質のＣ−末端をコードすることが判明し、このタンパク質のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４で表されるが、ただしこのとき、開いた読み枠の開始コドンがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３のヌクレオチド２からヌクレオチド４にあり、終了コドンがヌクレオチド１１９６からヌクレオチド１１９８にあることを想定している。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３は単なる部分的な遺伝子配列であるので、開始コドンを含まない。Ｐ_ｃａ１ＰＢ２−Ｃ_３９８をコードする領域は、ｎｅｉ_ｃａ１ＰＢ２−Ｃ_１１９４で表されるが、この領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３のヌクレオチド２から１１９５までにあるヌクレオチドを含むコドン鎖を有し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５で表される。

低温適応性ウマインフルエンザＰＢ２−Ｃタンパク質をコードする第２の核酸分子を同じ方法でＰＣＲ増幅し、ｎｅｉ_ｃａ１ＰＢ２−Ｎ_１２４１と比較して３’末端のヌクレオチド１個が欠失しているｎｅｉ_ｃａ２ＰＢ２−Ｃ_１２３１、及びｎｅｉ_ｃａ１ＰＢ２−Ｎ_１２１４ と同一の分子ｎｅｉ_ｃａ２ＰＢ２−Ｎ_１２１４を作製した。

Ｃ．ｎｅｉ_ｗｔ１ＰＢ２−Ｃ_１２３３ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）とｎｅｉ_ｃａ１ＰＢ２−Ｃ_１２３２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）のコドン鎖の核酸配列をＤＮＡアライメントで比較すると、次の相違が判明する：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９の塩基１５３のＡがＣに変化、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９の塩基９２９のＧがＡに変化。タンパク質Ｐ_ｗｔＰＢ２−Ｃ_３９８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）とＰ_ｃａ１ＰＢ２−_３９８ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）とのアミノ酸配列を比較すると、次の相違が判明する：ＤＮＡ配列の塩基１５３のＡからＣへの変化に対応する、アミノ酸５１のＫからＱへの変化。塩基９２９のＧからＡへの変化によるアミノ酸の変化はない。

本発明の様々な実施例を詳細に説明したが、これらの実施例に修正及び変更が加えられるであろうことは当業者に明白である。しかしながら、そのような修正及び変更は、以下の請求の範囲で述べるような、本発明の範囲内で行われるものであることを、理解されたい。

Claims (1)

1. ふ化鶏卵内で、温度約２６℃から約３０℃で複製を行う、低温適応性ウマインフルエンザウィルス。