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Die
Erfindung betrifft die Herstellung von abgeschwächten Influenza-Virus-Impfstoffen,
wobei die Viren Modifikationen an dem NS1-Gen besitzen, die die
Fähigkeit
des NS1-Genprodukts zum Bekämpfen
der zellulären
IFN-Reaktion verringert oder ausschaltet mit der Maßgabe, dass
die Viren keine Influenza-C-Viren sind. Die Mutantenviren replizieren
sich in vivo, weisen jedoch eine verringerte Pathogenzität auf und
sind deshalb zur Verwendung bei Lebendviren-Impfstoffen und pharmazeutischen
Formulierungen gut brauchbar.
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2. HINTERGRUND DER ERFINDUNG
-
2.1 DAS INFLUENZA-VIRUS
-
Virusfamilien,
die eine umhüllte
Einzelstrang-RNS des Genoms mit Negativ-Sense enthalten, werden in
Gruppen unterteilt, die nichtsegmentierte Genome enthalten (Paramyxoviridae,
Rhabdoviridae, Filoviridae und Borna-Krankheit-Virus), oder diejenigen,
die segmentierte Genome enthalten (Orthomyxoviridae, Bunyaviridae
und Arenaviridae). Die Orthomyxoviridae-Familie, die nachstehend
detailliert beschrieben ist und hier bei den Beispielen verwendet
wird, umfasst die Influenza-Viren, Viren des Typs A, B and C sowie
Thogoto- und Dhori-Viren und das infektiöse Salmonellenanämie-Virus.
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Die
Influenzavirionen bestehen aus einem inneren Ribonucleoproteinkern
(einem schraubenförmigen Nucleocapsid),
der das Einzelstrang-RNS-Genom enthält, und einer äußeren Lipopro teinhülle, die
innen von einem Matrixprotein (M1) verkleidet ist. Das segmentierte
Genom des Influenza-A-Virus besteht aus acht Molekülen (sieben
für die
Influenza C) von linearen Einzelstrang-RNS mit negativer Polarität, die für zehn Polypeptide
codieren, einschließlich:
der RNS-abhängigen
RNS-Polymeraseproteine (PB2, PB1 und PA) und des Nucleoproteins
(NP), die das Nucleocapsid bilden; der Matrixmembranproteine (M1,
M2); der zwei Oberflächen-Glycoproteine,
die aus der lipidenthaltenden Hülle
vorstehen: Hämagglutinin
(HA) und Neuraminidase (NA); des nichtstrukturellen Proteins (NS1)
und des nucleären
Exportproteins (NEP). Die Transcription und Replikation des Genoms
finden in dem Nucleus statt und das endgültige Formieren findet über das
Knospen auf der Plasmamembran statt. Die Viren können während Mischinfektionen Gene
neu zusammenstellen.
-
Das
Influenza-Virus adsorbiert sich über
HA an Sialyloligosaccharide in Zellmembranglycoproteinen und -glycolipiden.
Nach der Endozytose des Virions findet eine Konformationsänderung
im HA-Molekül
innerhalb des zellulären
Endosoms statt, die das Membranverschmelzen erleichtert, wodurch
das Enthüllen
ausgelöst
wird. Das Nucleocapsid wandert zum Nucleus, wo die virale mRNS transcribiert
wird. Die virale mRNS wird durch einen einzigartigen Mechanismus
transcribiert, bei dem die virale Endonuclease den mit Cap versehenen
5'-Terminus von
zellulären
heterologen mRNSs spaltet, die dann als Primer für die Transcription von viralen
RNS-Matrizen durch die virale Transcriptase dienen. Transcripts
enden an Stellen 15 bis 22 Basen von den Enden ihrer Matrizen, wo
die Oligo(U)-Sequenzen als Signale für die Addition von Poly(A)-Zügen wirken.
Von den so hergestellten acht viralen RNS-Molekülen sind sechs monocistronische
Botschaften, die direkt in die Proteine translatiert werden, die
HA, NA, NP und die viralen Polymeraseproteine, PB2, PB1 und PA,
darstellen. Die zwei anderen Transcripts werden einem Spleißen unterzogen,
wobei jedes zwei mRNS ergibt, die in unterschiedliche Leseraster
translatiert werden, um M1, M2, NS1 und NEP zu erzeugen. Mit anderen
Worten codieren die acht viralen RNS-Abschnitte für zehn Proteine:
neun strukturelle und ein nichtstrukturelles. Eine Zusammenfassung
der Gene des Influenza-Virus und ihrer Proteinprodukte ist in der
nachstehenden Tabelle I gezeigt. TABELLE
I INFLUENZA-VIRUSGENOM-RNS-ABSCHNITTE
UND CODIERUNGSAUFGABEN
a - a
In Überstimmung
mit R. A. Lamb und P. W. Choppin (1983), Annual Review of Biochemistry,
Band 52, 467-506, bearbeitet.
- b Für
den A/PR/8/34-Stamm
- c Mittels biochemischer und genetischer Ansätze bestimmt
- d Mittels Nucleotidsequenzanalyse und Proteinsequenzierung bestimmt
-
Das
Influenza-A-Virusgenom enthält
acht Abschnitte der Einzelstrang-RNS negativer Polarität, die für ein nichtstrukturelles
und neun strukturelle Proteine codieren. Das nichtstrukturelle Protein
NS1 ist in mit dem Influenza-Virus infizierten Zellen reichlich
vorhanden, wurde jedoch nicht in Virionen festgestellt. NS1 ist
ein Phosphoprotein, das während
der Infektion früh
im Nucleus und zu einem späteren
Zeitpunkt des viralen Zyklus auch im Zytoplasma gefunden wird (King
et al., 1975, Virology 64: 378). Untersuchungen mit temperaturempfindlichen
(ts) Influenza-Mutanten, die Läsionen
in dem NS-Gen aufweisen, legten nahe, dass das NS1-Protein ein Transcriptions-
und Posttranscriptions-Regulator von Mechanismen ist, mittels derer
das Virus die Wirtszellen-Genexpression inhibieren und die virale
Proteinsynthese stimulieren kann. Wie viele andere Proteine, die
Posttranscriptions-Prozesse
regulieren, steht das NS1-Protein mit spezifischen RNS-Sequenzen und -Strukturen
in Wechselwirkung. Es wurde berichtet, dass sich das NS1-Protein
an verschiedene RNS-Spezies bindet, einschließlich: vRNS, poly-A, U6 snRNS,
des 5'-nichttranslatierten
Bereichs ab den viralen mRNS und ds RNS (Qiu et al., 1995, RNA 1:
304; Qiu et al., 1994, J. Virol. 68: 2425; Hatada Fukuda, 1992,
J. Gen. Virol. 73: 3325-9). Die Expression des NS1-Proteins aus
cDNS in transfizierten Zellen wurde mit mehreren Wirkungen in Verbindung
gebracht: dem Inhibieren des nucleozytoplasmatischen Transports
von mRNS, dem Inhibieren von Prä-mRNS-Spleißen, dem
Inhibieren der Wirts-mRNS-Polyadenylierung und der Stimulation der Translation
von viraler mRNS (Fortes, et al., 1994, EMBO J. 13: 704; Enami,
et al, 1994, J. Virol. 68: 1432; de la Luna, et al., 1995, J. Virol.
69: 2427; Lu, et al., 1994, Genes Dev. 8: 1817; Park, et al., 1995,
J. Biol Chem. 270, 28433; Nemeroff et al., 1998, Mol. Cell. 1: 1991;
Chen, et al., 1994, EMBO J. 18: 2273-83).
-
2.2 ABGESCHWÄCHTE VIREN
-
Inaktivierte
Virusimpfstoffe werden durch "Abtöten" des viralen Pathogens,
z.B. durch Hitze- oder Formalinbehandlung hergestellt, so dass sie
nicht fähig
sind, sich zu replizieren. Inaktivierte Impfstoffe sind von begrenzter
Nützlichkeit,
da sie keine langandauernde Immunität verleihen und deshalb nur
einen begrenzten Schutz gewähren.
Ein alternativer Ansatz für
die Herstellung von Virus-Impfstoffen umfasst die Verwendung von
abgeschwächten
Lebendvirusimpfstoffen. Abgeschwächte
Viren können
sich replizieren, sind jedoch nicht pathogen und sorgen deshalb
für eine
länger
andauernde Immunität
und gewähren
einen besseren Schutz. Jedoch umfassen die herkömmlichen Verfahren zur Herstellung
von abgeschwächten
Viren die zufällige
Isolierung von Wirtsbereich-Mutanten, von denen viele temperaturempfindlich
sind; das Virus wird z.B. durch unnatürliche Wirte passagiert, und
Nachkommenviren, die immunogen, jedoch nicht pathogen sind, werden
ausgewählt.
-
Ein
herkömmliches
Substrat zum Isolieren und Kultivieren von Influenza-Viren für Impfstoffzwecke sind
embryonierte Hühnereier.
Influenza-Viren werden typischerweise 2 bis 4 Tage bei 37°C in 10 bis
11 Tage alten Eiern gezüchtet.
Obwohl die meisten humanen primären
Isolate der Influenza-A- und -B-Viren in der Amnionhöhle von
Embryos besser wachsen, werden die Viren nach zwei bis drei Passagen
angepasst, in den Zellen der Allantoishöhle zu wachsen, die von außerhalb
des Eis zugänglich
ist (Murphy, B. R., und R. G. Webster, 1996, Orthomyxoviruses, Seiten
1397-1445. In Fields Virology, Lippincott-Raven P. A.).
-
Rekombinante
DNS-Technik und gentechnische Techniken würden in der Theorie einen überlegenen Ansatz
für die
Herstellung eines abgeschwächten
Virus ergeben, da spezifische Mutationen gezielt gentechnisch in
das virale Genom verbracht werden können. Jedoch sind die genetischen Änderungen,
die für
die Abschwächung
der Viren erforderlich sind, nicht bekannt oder vorhersagbar. Im
Allgemeinen wurden die Versuche, die rekombinante DNS-Technik zu
verwenden, um virale Impfstoffe gentechnisch herzustellen, meistens auf
die Herstellung von Untereinheitsimpfstoffen gerichtet, die nur
die Proteinuntereinheiten des Pathogens enthalten, das an der Immunreaktion
beteiligt ist, exprimiert in rekombinanten viralen Vektoren wie
dem Windpockenvirus oder dem Baculovirus. In jüngerer Zeit wurden DNS-Techniken bei einem
Versuch verwendet, Herpesvirus-Deletionsmutanten oder Polioviren
herzustellen, die in der Natur gefundene, abgeschwächte Viren
oder bekannte Wirtsbereich-Mutanten nachahmen. Bis 1990 waren die
Negativstrang-RNS-Viren überhaupt
keiner sequenzspezifischen Manipulation zugänglich und konnten so nicht
gentechnisch hergestellt werden.
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Bisher
hergestellte, abgeschwächte
Lebendinfluenzaviren sind möglicherweise
nicht fähig,
die Interferonreaktion in dem Wirt, in dem sie sich replizieren,
zu unterdrücken.
Obwohl diese Viren nützlich
sind, da sie immunogen und nicht pathogen sind, ist es deshalb schwierig,
sie für
die Zwecke der Herstellung von Impfstoffen in herkömmlichen
Substraten zu vermehren.
-
Des
weiteren können
abgeschwächte
Viren Virulenzcharakteristiken besitzen, die so schwach sind, dass
sie es nicht gestatten, dass der Wirt eine Immunreaktion aufbaut,
die ausreicht, um mit späteren
Expositionen fertig zu werden.
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WO
97/08292 beschreibt ein Verfahren für die verbesserte Herstellung
eines abgeschwächten
Virus in Zellkultur, indem Tierzellkulturen zur Verfügung gestellt
werden, in denen die Expression von Interferongenen mit Bezug auf
das normale Expressionsniveau verringert ist. WO 97/08292 beschreibt
die Verwendung von Zellkulturen, bei denen das Niveau der mit Interferon
vermittelten, antiviralen Proteinaktivität, insbesondere für die Doppelstrang-RNS-abhängige Kinase
(PKR) und die 2'-5'-Oligoadenylatsynthetase
signifikant verringert ist.
-
Egorov
et al (1998, J. Virol. 72 (8): 6437-41) beschreiben das wirksame
Züchten
von Influenza-A-Viren mit langen Deletionen in dem NS1-Protein in
Vero-Zellen im Vergleich zu MDCK-Zellen. Sie vermuten, dass dieses
differentielle Züchtungsverhalten
auf die Tatsache zurückzuführen sein
könnte,
dass Vero-Zellen in der Expression von funktionellem Interferon
defizient sind.
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3. ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung von abgeschwächten Influenza-Virusimpfstoffen,
wobei die Viren eine Mutation im NS1-Gen aufweisen, die die Fähigkeit
des NS1-Genprodukts zum Bekämpfen der
zellulären
Interferonreaktion verringert oder ausschaltet, mit der Maßgabe, dass
die Viren keine Influenza-C-Viren sind. Die Mutantenviren mit einer
beeinträchtigten
IFN-Antagonisten-Aktivität
sind abgeschwächt – sie sind
infektiös,
sie können
sich in vivo replizieren, um für
ein subklinisches Niveau der Infektion zu sorgen, und sie sind nicht
pathogen. Deshalb sind sie ideale Kandidaten für Lebendvirus-Impfstoffe. Des
weiteren können
die abgeschwächten
Viren eine starke IFN-Reaktion induzieren, die in vivo andere biologische
Konsequenzen hat, wodurch ein Schutz gegen spätere infektiöse Krankheiten
gewährt
wird und/oder Antitumorreaktionen induziert werden. Deshalb können die
abgeschwächten
Viren für
die Prävention
oder Behandlung anderer Infektionskrankheiten, von Krebs bei Risikopersonen
und/oder mit IFN behandelbaren Krankheiten pharmazeutisch verwendet
werden.
-
Die
bei der Erfindung verwendeten Viren können ausgewählt werden aus natürlich vorkommenden Stämmen, Varianten
oder Mutanten, mutagenisierten Viren (z.B. durch Aussetzen an Mutagene,
wiederholte Passagen und/oder eine Passage in nichtpermissiven Wirten
erzeugt), Neuzusammenstellern (im Fall von segmentierten viralen
Genomen) und/oder gentechnisch hergestellten Viren (z.B. unter Verwendung
der "reversen Gentechniken"), die den gewünschen Phänotyp aufweisen – d.h. eine
beeinträchtigte
Fähigkeit,
die zelluläre
IFN-Reaktion zu bekämpfen.
Das Mutanten- oder gentechnisch veränderte Virus kann auf der Grundlage von
differentiellem Wachstum in IFN-defizienten Systemen im Vergleich
zu IFN-kompetenten Systemen ausgewählt werden. Beispielsweise
können
Viren, die in einem IFN-defizienten
System, jedoch nicht in einem IFN-kompetenten System wachsen (oder
weniger gut in einem IFN-kompetenten System wachsen), ausgewählt werden.
-
Das
so ausgewählte,
abgeschwächte
Virus kann selbst als Wirkbestandteil in Impfstoff- oder pharmazeutischen
Formulierungen verwendet werden. Alternativ kann das abgeschwächte Virus
als Vektor oder "Grundgerüst" von rekombinant
hergestellten Impfstoffen verwendet werden. Für diesen Zweck kann die "reverse Gentechnik" verwendet werden,
um Mutationen gentechnisch herzustellen oder fremde Epitope in das abgeschwächte Virus
einzuführen,
die als "Parental"-Stamm dienen könnten. Auf
diese Weise können
Impfstoffe für
die Immunisierung gegen Stammvarianten oder bei der Alternative
gegen vollkommen unterschiedliche Erreger oder Krankheitsantigene
konstruiert werden. Beispielsweise kann das abgeschwächte Virus
gentechnisch hergestellt werden, um neutralisierende Epitope anderer
vorher ausgewählter
Stämme
zu exprimieren. Alternativ können
Epitope von anderen Viren als den Negativstrang-RNS-Viren in das
abgeschwächte
Mutantenvirus eingebaut werden (z.B. gp160, gp120 oder gp41 von
HIV). Alternativ können
Epitope von nichtviralen infektiösen
Pathogenen (z.B. Parasiten, Bakterien, Pilze) gentechnisch in das
Virus eingeführt
werden. Bei einer weiteren Alternative können Krebsimpfstoffe z.B. durch
das gentechnische Einführen
von Tumorantigenen in das abgeschwächte virale Gerüst hergestellt
werden.
-
Bei
einer bestimmten Ausführungsform,
die Influenza-Viren umfasst mit der Maßgabe, dass die Viren nicht
Influenza-C-Viren sind, können
Neuzusammenstelltechniken verwendet werden, um den abgeschwächten Phänotyp von
einem Parental-Virusstamm (einem natürlichen Mutanten, einem mutagenisierten
Virus oder einem gentechnisch hergestellten Virus) zu einem unterschiedlichen
Virusstamm (einem Wildtyp-Virus, einem natürlichen Mutanten, einem mutagenisierten
Virus oder einem gentechnisch veränderten Virus) zu transferieren.
-
Die
abgeschwächten
Viren, die starke IFN-Reaktionen in Wirten induzieren, können auch
in pharmazeutischen Formulierungen für die Prophylaxe oder Behandlung
anderer viraler Infektionen oder mit IFN behandelbarer Krankheiten
wie Krebs verwendet werden. In dieser Hinsicht kann der Tropismus
des abgeschwächten
Virus geändert
werden, um das Virus zu einem gewünschten Zielorgan, Zielgewebe
oder zu gewünschten
Zielzellen in vivo oder ex vivo zielgerichtet zu richten. Unter
Verwendung dieses Ansatzes kann die IFN-Reaktion lokal an der Zielstelle
induziert werden, wodurch die Nebenwirkungen von systemischen Behandlungen
mit IFN vermieden oder auf ein Minimum herabgesetzt werden. Für diesen
Zweck kann das abgeschwächte
Virus gentechnisch verändert
werden, um einen Liganden zu exprimieren, der für einen Rezeptor des Zielorgans,
des Zielgewebes oder der Zielzellen spezifisch ist.
-
Die
Erfindung basiert teilweise auf der Entdeckung der Anmelder, dass
NS1 des Wildtyp-Influenza-Virus als IFN-Antagonist wirkt, da NS1
die von IFN vermittelte Reaktion der mit dem Virus infizierten Wirtszellen inhibiert.
Es wurde gefunden, dass virale Mutanten, die mit Bezug auf die NS1-Aktivität defizient
sind, potente Induktoren der zellulären IFN-Reaktion sind, und
sie wiesen in vivo einen abgeschwächten Phänotyp auf; d.h. die Mutantenviren
replizieren sich in vivo, haben jedoch verringerte pathogene Wirkungen.
Es ist zwar nicht beabsichtigt, sich durch irgendeine Theorie oder
Erklärung,
wie die Erfindung funktioniert, zu binden, doch die abgeschwächten Merkmale
der Viren der Erfindung sind wahrscheinlich auf ihre Fähigkeit
zurückzuführen, eine
starke zelluläre
IFN-Reaktion zu induzieren, und ihre beeinträchtige Fähigkeit, die IFN-Reaktion des
Wirts zu bekämpfen.
Die nützlichen
Merkmale der abgeschwächten
Viren der Erfindung sind jedoch möglicherweise nicht nur auf
die Wirkungen auf die zelluläre
Interferon-Reaktion zurückzuführen. Tatsächlich können die Änderungen
der anderen mit NS1 verbundenen Aktivitäten zu dem gewünschten
abgeschwächten
Phänotyp
beitragen.
-
Es
wurde gezeigt, dass sich die Mutanten-Influenza-Viren mit einer
beeinträchtigten
IFN-Antagonistenaktivität
in vivo replizieren, wobei Titer erzeugt werden, die ausreichend
sind, immunologische und zytokine Reaktionen zu induzieren. Beispielsweise
verringerte die Impfung mit dem abgeschwächten Influenza-Virus den viralen
Titer bei Tieren, die anschließend
dem Wildtyp-Influenza-Virus
ausgesetzt wurden. Die abgeschwächten
Influenza-Viren wiesen auch eine antivirale und Antitumor-Aktivität auf. Die
Präinfektion
mit dem abgeschwächten
Influenza-Virus inhibierte die Replikation anderer Stämme des
Wildtyp-Influenza-Virus
und anderer Viren (wie dem Sendai-Virus), die in embryonierten Eiern
superinfiziert waren. Die Inokulation des abgeschwächten Influenza-Virus
bei Tieren, denen man Tumorzellen injiziert hatte, verringerte die
Anzahl der gebildeten Herde. Da es bekannt ist, dass das Influenza-Virus
eine CTL-(zytotoxische T- Lymphozyten-)Reaktion induziert,
ist das abgeschwächte
Virus ein sehr attraktiver Kandidat für Krebsimpfstoffe.
-
Mutationen,
die die IFN-Antagonistenaktivität
des Virus verringern, jedoch nicht ausschalten, werden für Impfstoffformulierungen
bevorzugt – solche
Viren können
für das
Züchten
sowohl in herkömmlichen
als auch nichtherkömmlichen
Substraten und für
eine Zwischenvirulenz ausgewählt
werden. Die Anmelder haben insbesondere gezeigt, dass sich ein NS1
C-ständig
verkürzter
Mutant in IFN-defizienten Substraten, wie 6 und 7 Tage alten embryonierten
Hühnereiern,
sowie in der Allantoismembran von 10 Tage alten embryonierten Hühnereiern,
dem herkömmlichen
Substrat für
das Influenza-Virus, das das Züchten
der Influenza-Virus-Mutanten
nicht gestattet, in denen das gesamte NS1-Gen deletiert ist (hier
auch als "Knockout"-Mutanten bezeichnet),
auf hohe Titer repliziert. Die Replikation des NS1-C-ständig verkürzten Mutanten
ist in 12 Tage alten embryonierten Eiern verringert. Dieser Ansatz
gestattet zum ersten Mal die Erzeugung und Identifizierung von lebendigen,
abgeschwächten
Negativstrang-RNS-Viren,
die die IFN-Antagonistenaktivität
geändert,
jedoch nicht ausgeschaltet haben und die in Substraten, die für die Impfstoffherstellung
geeignet sind, wachsen können.
Dieser Ansatz gestattet zum ersten Mal ein wirksames Selektionsidentifikationssystem
für Influenza-
oder andere Viren, welche Mutationen enthalten, die eine geänderte,
jedoch nicht ausgeschaltete Interferon-Antagonisten-Aktivität verleihen.
-
Die
Erfindung betrifft auch die Verwendung von IFN-defizienten Systemen,
um die abgeschwächten Viren
zu vermehren, die nicht in herkömmlichen
Systemen, die gegenwärtig
für die
Impfstoffherstellung verwendet werden, gezüchtet werden können. Der Begriff "IFN-defiziente Systeme", wie hier verwendet,
bezeichnet unreife embryonierte Eier, die sechs bis neun Tage alt
sind, oder eine interferon-defiziente Zelllinie mit der Maßgabe, dass
die Zelllinie keine Vero-Zellen und keine STAT(-)-Zelllinie ist,
die kein IFN erzeugen oder ein geringes Niveau an IFN erzeugen,
die nicht oder weniger wirksam auf IFN reagieren und/oder bezüglich der Aktivität der durch
IFN induzierten antiviralen Gene defizient sind. Diese embryonierten
Eier oder Zelllinien können
mit Verbindungen vorbehandelt werden, die das IFN-System inhibieren
(einschließlich
Medikamenten, Antikörpern,
Antisense, Ribozymen usw.).
-
Die
Erfindung betrifft auch Verfahren zum Vermehren von Viren in den
IFN-defizienten Systemen der Erfindung. Bei einer Ausführungsform
umfasst ein Verfahren zum Vermehren der Viren (a) das Züchten des Virus
in unreifen embryonierten Eiern, die sechs bis neun Tage alt sind,
und (b) das Sammeln von Nachkommen-Virus mit der Maßgabe, dass das Virus kein
Influenza-C-Virus ist. Bei einer weiteren Ausführungsform umfasst ein Verfahren
zum Vermehren von Viren (a) das Züchten des Virus in einer interferon-defizienten
Zelllinie, und (b) das Sammeln des Nachkommenvirus, mit der Maßgabe, dass
das Virus kein Influenza-C-Virus ist
und die interferon-defiziente Zelllinie keine Vero-Zellen und keine
STAT(-)-Zelllinien ist.
-
4. BESCHREIBUNG
DER FIGUREN
-
1.
Das delNS1-Virus inhibiert die Replikation des Wildtyp-Influenza-A-Virus
in Eiern. Zehn Tage alte, embryonierte Hühnereier wurden mit den angegebenen
pfu des delNS1-Virus inokuliert. Acht Stunden später wurden die Eier mit 103 pfu des WSN-Virus infiziert. Nach zwei
Tagen Inkubation bei 37°C
wurde das Allantois-Fluid geerntet und die WSN-Virustiter wurden
mittels des Plaque-Tests in MDBK-Zellen bestimmt. Die Ergebnisse
sind der Durchschnitt von zwei Eiern.
-
2.
Induzierung einer antiviralen Reaktion in embryonierten Eiern durch
das delNS1-Virus. Zehn Tage alte, embryonierte Hühnereier wurden mit PBS (unbehandelt)
oder mit 2 × 104 pfu des delNS1-Virus (mit delNS1 behandelt)
inokuliert. Acht Stunden später
wurden die Eier nun mit 103 pfu des Influenza-A/WSN/33-(H1N1-)Virus,
des Influenza-A/PR8/34-(H+N1-)Virus, des Influenza-A/X-31-(H3N2-)Virus,
des Influenza-B/Lee/40-Virus
oder des Sendai-Virus infiziert. Nach zwei Tagen Inkubation wurde
das Allantois-Fluid geerntet und die Virustiter wurden mittels eines
Hämagglutinations-Assays
bestimmt. Die Ergebnisse sind der Durchschnitt von zwei Eiern.
-
3.
CV1-Zellen wurden mit einem IRF-3-exprimierenden Plasmid transfiziert,
das mit dem grün
fluoreszierende Protein (GFP) verschmolzen ist. Dies ermöglichte
die Bestimmung der Lokalisierung des IRF-3 innerhalb der Zellen
mittels Fluoreszenzmikroskopie. In einigen Fällen wurde ein NS1-Expressionsplasmid
mit dem IRF-3-Expressionsplasmid in den angezeigten Verhältnissen
kotransfiziert. Zellen 24 Stunden nach der Transfektion wurden mit
hohem Moi mit PR8 (WT) oder mit dem delNS1-Virus wie angegeben infiziert.
Zellen 10 Stunden nach der Infektion wurden in einem Fluoreszenzmikroskop
mit Bezug auf die IRF-3-GFP-Lokalisierung analysiert. Der Prozentsatz
der Zellen, die eine ausschließliche
zytoplasmatische Lokalisierung (CYT) und sowohl zytoplasmatische
als auch nukleäre
Lokalisierungen von IRF-3 (Nuc+Cyt) aufwiesen, ist angegeben.
-
5. DETALLIERTE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
-
Die
Erfindung betrifft die Herstellung von abgeschwächten Influenza-Virus-Impfstoffen,
wobei die Viren eine Mutation im NS1-Gen aufweisen, die die Fähigkeit
des NS1-Genprodukts zum Bekämpfen
der zellulären IFN-Reaktion
verringert oder ausschaltet, mit der Maßgabe, dass die Viren keine
Influenza-C-Viren sind.
-
Die
Viren können
aus natürlich
vorkommenden Stämmen,
Varianten oder Mutanten, mutagenisierten Viren (z.B. durch die Aussetzung
an UV-Strahlung, Mutagene und/oder Passagieren), Neuzusammenstellern und/oder
gentechnisch veränderten
Viren ausgewählt
sein. Beispielsweise können
die Mutantenviren durch natürliche
Variation, Aussetzen an UV-Strahlung, Aussetzen an chemische Mutagene,
durch Passagieren in nichtpermissiven Wirten, durch Neuzusammenstellen
(z.B. durch Koinfektion eines abgeschwächten Virus mit einem anderen
Stamm, der die gewünschten
Antigene aufweist) und/oder durch Gentechnik (z.B. unter Verwendung
von "reverser Genetik") erzeugt werden.
Die zur Verwendung bei der Erfindung ausgewählten Viren besitzen eine fehlerhafte
IFN-Antagonistenaktivität
und sind abgeschwächt,
d.h. sie sind infektiös
und können sich
in vivo replizieren, erzeugen jedoch nur niedrige Titer, was zu
einem subklinischen Infektionsniveau führt, das nicht pathogen ist.
Solche abgeschwächten
Viren sind ideale Kandidaten für
Lebendimpfstoffe.
-
Die
zur Verwendung bei der Erfindung ausgewählten, abgeschwächten Viren
sollten eine starke IFN-Reaktion in dem Wirt induzieren können – ein Merkmal,
das zu der Erzeugung einer starken Immunreaktion bei Verwendung
als Impfstoff beiträgt und
das andere biologische Konsequenzen hat, die die Viren als pharmazeutische
Mittel für
die Prävention
und/oder Behandlung anderer viraler Infektionen oder der Tumorbildung
bei Risikopersonen oder anderer Krankheiten, die mit IFN behandelt
werden, brauchbar machen.
-
Die
Erfindung basiert teilweise auf einer Reihe von Entdeckungen und
Beobachtungen, die von den Anmeldern gemacht wurden, als sie mit
Influenza-Virus-Mutanten gearbeitet haben.
-
Zunächst ist
die IFN-Reaktion wichtig, um eine virale Infektion in vivo einzudämmen. Die
Anmelder haben gefunden, dass das Wachstum des Wildtyp-Influenza-Virus
A/WSN/33 bei IFN-defizienten
Mäusen (STAT1-/-Mäusen) zu
einer Panorganinfektion führte,
d.h. die virale Infektion war nicht auf die Lungen wie bei Wildtyp-Mäusen beschränkt, die
eine IFN-Reaktion erzeugen (Garcia-Sastre, et al., 1998, J. Virol.
72: 8550). Zweitens stellten die Anmelder fest, dass das NS1 des
Influenza-Virus als IFN-Antagonist
wirkt. Die Anmelder fanden heraus, dass ein Influenza-Virus-Mutant,
der von dem gesamten NS1-Gen nicht deletiert ist (d.h. ein NS1-"Knockout") nicht zu hohen
Titern in IFN-kompetenten Wirtszellen wachsen konnte und nur in
IFN-defizienten Wirtszellen vermehrt werden konnte. Das NS1-Knockout-Virus
wies einen abgeschwächten
Phänotyp auf
(d.h. es war tödlich
bei IFN-defizienten STAT1-/-Mäusen,
jedoch nicht bei Wildtyp-Mäusen) und
es wurde gefunden, dass es ein starker Induktor von IFN-Reaktionen
in Wirtszellen war (Garcia-Sastre, et al., 1998, Virology 252: 324-330).
Eine Präinfektion
mit dem NS1-Knockout-Mutantenvirus
verringerte die Titer von Wildtyp-Influenza- und anderen Viren (z.B. Sendai),
die in embryonierten Eiern superinfiziert waren. Bei einem anderen
Experiment verrin gerte die Infektion mit dem NS1-Knockout-Mutanten-Influenza-Virus die Herdbildung bei
Tieren, die mit Tumorzellen inokuliert wurden. So wies das NS1-Knockout-Influenza-Virus
interessante biologische Eigenschaften auf. Die NS1-Knockout-Mutantenviren
konnten jedoch nicht in herkömmlichen
Systemen für
die Impfstoffherstellung vermehrt werden. Um dieses Problem zu lösen, verwendeten
und entwickelten die Anmelder IFN-defiziente Systeme, die die Herstellung
von annehmbaren Ausbeuten des abgeschwächten Virus gestatten.
-
Des
weiteren konstruierten die Anmelder Deletionsmutanten von NS1, die
nicht das gesamte Gen deletieren. Überraschenderweise wurde gefunden,
dass diese NS1-Mutanten einen Zwischen-"Phänotyp" aufweisen – das Virus
kann in herkömmlichen
Wirten gezüchtet
werden, die für
das Vermehren des Influenza-Virus verwendet werden (obwohl das Wachstum
in IFN-defizienten Systemen besser ist, die höhere Titer ergeben). Am wichtigsten
ist, dass die Deletionsmutanten in vivo abgeschwächt werden und eine starke
IFN-Reaktion induzieren. Die Impfung mit den verkürzten Influenza-Virus-NS1-Mutanten
führte
zu einem niedrigen Titer des Virus bei Tieren, die anschließend dem
Wildtyp-Virus ausgesetzt
wurden, und gewährten
Schutz gegen Krankheit.
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft auch Substrate, die für das Isolieren,
das Identifizieren und das Züchten
von Viren für
Impfstoffzwecke bestimmt sind. Insbesondere werden interferon-defiziente Substrate
für das
wirksame Züchten
von Influenza-Virusmutanten
beschrieben. Erfindungsgemäß ist ein
interferon-defizientes
Substrat eines, dessen Fähigkeit,
Interferon zu erzeugen oder auf es zu reagieren, fehlerhaft ist.
-
Die
abgeschwächten
Viren können
als Impfstoffe gegen zahlreiche Viren und/oder Antigene verwendet
werden, einschließlich,
jedoch nicht beschränkt
auf, Antigene von Stammvarianten, verschiedene Viren oder andere
infektiöse
Pathogene (z.B. Bakterien, Parasiten, Pilze) oder tumorspezifische
Antigene. Die abgeschwächten
Viren, die die virale Replikation und die Tumorbildung inhibieren,
können
für die
Prophylaxe oder Behandlung von Infektionen (viralen oder nichtviralen
Pathogenen) oder die Tumorbildung oder die Behandlung von Krankheiten,
bei denen IFN von therapeutischem Nutzen ist, verwendet werden.
Viele Verfahren können
verwendet werden, um die abgeschwächten Lebendvirenformulierungen
einem menschlichen oder tierischen Patienten zu verabreichen, um
eine Immun- oder eine geeignete Zytokinantwort zu induzieren. Diese umfassen,
sind jedoch nicht beschränkt
auf, intranasale, intratrachiale, orale, intradermale, intramuskuläre, intraperitoneale,
intravenöse
und subkutane Wege. Die abgeschwächten
Viren der vorliegenden Erfindung könnten für eine intranasale Verabreichung
formuliert werden
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5.1 ERZEUGUNG VON MUTANTEN
MIT GEÄNDERTER
IFN-ANTAGONISTENAKTIVITÄT
-
Natürlich vorkommende
Influenza-Mutanten oder -Varianten oder spontane Mutanten können ausgewählt werden,
die eine beeinträchtigte
Fähigkeit
haben, die zelluläre
IFN-Reaktion zu bekämpfen.
Influenza-Mutantenviren können
durch Aussetzen des Virus an Mutagene, wie ultraviolette Strahlung
oder chemische Mutagene oder durch mehrere Passagen und/oder eine
Passage in nichtpermissiven Wirten erzeugt werden. Ein Screening
in einem differentiellen Züchtungssystem
kann verwendet werden, um mit Bezug auf diejenigen Mutanten eine
Auswahl zu treffen, die eine beeinträchtigte IFN-Antagonistenfunktion
aufweisen. Der abgeschwächte
Phänotyp
kann durch Neuzusammenstellen auf einen anderen Stamm mit einem
gewünschten
Antigen transferiert werden (d.h. durch Koinfektion des abgeschwächten Virus
und des gewünschten
Stamms und Auswahl mit Bezug auf Neuzusammensteller, die beide Phänotypen
aufweisen).
-
Mutationen
können
unter Verwendung von Ansätzen
der "reversen Genetik" gentechnisch in
das Influenza-Virus eingeführt
werden. Auf diese Weise können
natürliche
oder andere Mutationen, die den abgeschwächten Phänotyp verleihen, gentechnisch
in Impfstoffstämme
eingeführt
werden. Beispielsweise können Deletionen,
Insertionen oder Substitutionen des codierenden Bereichs des Gens,
das für
die IFN-Antagonistenaktivität
verantwortlich ist (des NS1 des Influenza-Virus) gentechnisch hergestellt
werden. Auch Deletionen, Substitutionen oder Insertionen in dem
nichtcodierenden Bereich des Gens, das für die IFN-Antagonistenaktivität verantwortlich ist, werden
ins Auge gefasst. Zu diesem Zweck können Mutationen in den Signalen,
die für die
Transcription, Replikation, Polyadenylierung und/oder das Verpacken
des Gens, das für
die IFN-Antagonistenaktivität
verantwortlich ist, genetisch hergestellt werden. Beispielsweise
können
bei dem Influenza-Virus solche Modifikationen umfassen, jedoch nicht
beschränkt
sein auf: die Substitution der nichtcodierenden Bereiche eines Influenza-A-Virusgens
durch die nichtcodierenden Bereiche eines Influenza-B-Virusgens
(Muster, et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:5177), den
Austausch von Basenpaaren in den nichtcodierenden Bereichen eines
Influenza-Virusgens
(Fodor, et al., 1998, J. Virol. 72:6283), die Mutationen in dem
Promotorbereich eines Influenza-Virusgens (Piccone, et al., 1993,
Virus Res. 28:99; Li, et al., 1992, J. Virol. 66:4331), Substitutionen
und Deletionen in dem Abschnitt der Uridinreste an dem 5'-Ende eines Influenza-Virusgens,
die die Polyadenylierung beeinflussen (Luo, et al., 1991, J. Virol.
65:2861; Li, et al., J. Virol. 1994, 68:1245). Solche Mutationen,
beispielsweise am Promotor, können
die Expression des Gens herunterregulieren, das für die IFN-Antagonistenaktivität verantwortlich
ist. Mutationen in viralen Genen, die die Expression des Gens regulieren
können,
das für
die IFN-Antagonistenaktivität
verantwortlich ist, liegen auch innerhalb des Umfangs von Viren,
die erfindungsgemäß verwendet
werden können.
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Die
Technik reverser Genetik umfasst die Herstellung von synthetischen
rekombinanten viralen RNS, die nichtcodierende Bereiche der Virus-RNS
enthalten, die für
die Erkennung mittels viraler Polymerasen und für die Verpackung von Signalen
wesentlich sind, die zur Erzeugung eines reifen Virions benötigt werden.
Die rekombinanten RNS werden aus einer rekombinanten DNS-Matrize synthetisiert
und in vitro mit einem gereinigten viralen Polymerasekomplex neu
gebildet, um rekombinante Ribonucleoproteine (RNPs) zu bilden, die verwendet
werden können,
Zellen zu transfizieren. Eine wirksamere Transfektion wird erzielt,
wenn die viralen Polymeraseproteine während der Transcription der
synthetischen RNSs entweder in vitro oder in vivo vorhanden sind.
Die synthetischen rekombinanten RNPs können in infektiöse Virusteilchen
hinüber
gerettet werden. Die vorstehend angegebenen Techniken sind beschrieben
im US-Patent Nr. 5,166,057, erteilt am 24. November 1992; im US-Patent
Nr. 5,854,037, erteilt am 29 Dezember 1998; in der europäischen Patentveröffentlichung
EP 0 702 085 A1 ,
veröffentlicht
am 20. Februar 1996; in der US-Patentanmeldung Serial No. 09/152,845;
in den internationalen Patentveröffentlichungen
PCT WO 97/12032, veröffentlicht
am 3. April 1997; WO 96/34625, veröffentlicht am 7. November 1996;
in der europäischen
Patentveröffentlichung EP-A-780 475; in der
WO 99/02657, veröffentlicht
am 21. Januar 1999; in der WO 98/53078, veröffentlicht am 26. November
1998; in der WO 98/02530, veröffentlicht
am 22. Januar 1998; in der WO 99/15672, veröffentlicht am 1. April 1999;
in der WO 98/13501, veröffentlicht
am 2. April 1998; in der WO 97/06270, veröffentlicht am 20. Februar 1997;
und in EPO 780 475 A1, veröffentlicht
am 25. Juni 1997.
-
Abgeschwächte Viren,
die mittels des Ansatzes reverser Genetik erzeugt werden, können bei
den hier beschriebenen Impfstoff- und
pharmazeutischen Formulierungen verwendet werden. Die Techniken
reverser Genetik können
auch verwendet werden, um zusätzliche
Mutationen bei anderen viralen Genen, die für die Impfstoffherstellung
wichtig sind, gentechnisch einzuführen, d.h. die Epitope von
brauchbaren Impfstoffstammvarianten können in das abgeschwächte Virus
gentechnisch eingebracht werden. Alternativ können vollständig fremde Epitope, einschließlich Antigenen,
die von anderen viralen oder nichtviralen Pathogenen abgeleitet sind,
gentechnisch in den abgeschwächten
Stamm eingebracht werden. Beispielsweise können Antigene von nichtverwandten
Viren wie HIV (gp160, gp120, gp41), Parasitenantigene (z.B. Malaria),
bakterielle oder Pilzantigene oder Tumorantigene gentechnisch zu
dem abgeschwächten
Stamm verändert
werden. Alternativ können
Epitope, die den Tropismus des Virus in vivo verändern, in die abgeschwächten chimären Viren
der Erfindung gentechnisch eingebracht werden.
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Eine
Kombination von Techniken der reversen Genetik und der Neuzusammenstelltechniken
kann verwendet werden, um abgeschwächte Viren mit den gewünschten
Epitopen in segmentierten RNS-Viren gentechnisch herzustellen. Beispielsweise
können
ein abgeschwächter
Virus (durch natürliche
Selektion, Mutagenese oder durch Techniken reverser Genetik erzeugt)
und ein Stamm, der das gewünschte
Impfstoffepitop trägt
(durch natürliche
Selektion, Mutagenese oder durch Techniken reverser Genetik erzeugt)
in Wirten koinfiziert werden, die das Neuzusammenstellen der segmentierten
Genome gestattet. Neuzusammensteller, die sowohl den abgeschwächten Phänotyp als
auch das gewünschte
Epitop aufweisen, können
dann ausgewählt werden.
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Bei
einer bevorzugten Ausführungsform
umfasst die vorliegende Erfindung die Verwendung von gentechnisch
hergestellten Influenza-Viren, die Deletionen und/oder Verkürzungen
des NS1-Genprodukts
enthalten, mit der Maßgabe,
dass die Viren nicht Influenza-C-Viren sind. NS1-Mutanten des Influenza-Virus
A und B werden besonders bevorzugt. Bei einem Ansatz werden Abschnitte
des amino-ständigen
Bereichs des NS1-Genprodukts zurückbehalten,
während
Abschnitte des C-ständigen
Bereichs des NS1-Genprodukts deletiert werden. Spezifische gewünschte Mutationen
können über die
Nucleinsäureinsertion,
-deletion oder -mutation an dem geeigneten Codon gentechnisch verändert werden.
Insbesondere weisen die verkürzten NS1-Proteine
1-60 Aminosäuren,
1-70 Aminosäuren,
1-80 Aminosäuren,
1-90 Aminosäuren
(die N-ständige Aminosäure ist
1) und vorzugsweise 90 Aminosäuren;
1 bis 100 Aminosäuren
vorzugsweise 99 Aminosäuren; 1-110
Aminosäuren,
1-120 Aminosäuren
oder 1-130 Aminosäuren
und vorzugsweise 124 Aminosäuren
des Wildtyp-NS1-Genprodukts
auf.
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Die
vorliegende Erfindung umfasst auch die Verwendung von allen gentechnisch
veränderten
Influenza-Viren, die kein Influenza-C-Virus sind, bei denen das NS1-Genprodukt
durch die Verkürzung
oder Modifikation des NS1-Proteins modifiziert wurde, das den Mutantenviren
die folgenden Phänotypen
verleiht: die Fähigkeit
der Viren, in nichtherkömmlichen
Substraten wie 6 bis 7 Tage alten Hühnereiern auf hohe Titer zu
wachsen, oder die Fähigkeit
der Viren, eine Wirt-Interferonreaktion zu induzieren. Bei Influenza-A-Viren
umfassen diese, sind jedoch nicht beschränkt auf: Viren mit NS1-Verkürzungen.
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Die
vorliegende Erfindung umfasst die Verwendung von natürlich vorkommenden
Mutanten-Influenza-Viren A oder B mit dem abgeschwächten Phänotyp sowie
Influenza-Virusstämme,
die genetisch verändert wurden,
um solche Mutationen zu enthalten, die für den abgeschwächten Phänotyp verantwortlich
sind. Bei den Influenza-A-Viren umfassen diese, sind jedoch nicht
beschränkt
auf: Viren mit einem NS1 von 124 Aminosäuren (Norton et al., 1987,
Virology 156: 204-213). Bei den Influenza-B-Viren umfassen diese,
sind jedoch nicht beschränkt
auf: Viren mit einem NS1-Verkürzungsmutanten
mit 127 Aminosäuren,
die von dem N-Terminus abgeleitet sind (B/201) (Norton et al., 1987,
Virology 156: 204-213), und Viren mit einem NS1-Verkürzungsmutanten
mit 90 Aminosäuren,
die von dem N-Terminus abgeleitet sind (B/AWBY-234) (Tobita et al., 1990,
Virology 174: 314-19). Die vorliegende Erfindung umfasst die Verwendung
von natürlich
vorkommenden Mutanten analog zu NS1/38, NS1/80, NS1/124 (Egorov,
et al., 1998, J. Virol. 72 (8): 6437-41) sowie die natürlich vorkommenden
Mutanten A/Turkey/ORE/71, B/201 oder B/AWBY-234.
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Das
abgeschwächte
Influenza-Virus kann des weiteren gentechnisch hergestellt werden,
um Antigene von anderen Impfstoffstämmen zu exprimieren (z.B. unter
Verwendung von reverser Genetik oder Neuzusammenstellen). Alternativ
können
die abgeschwächten
Influenza-Viren unter Verwendung von reverser Genetik oder Neuzusammenstellen
mit gentechnisch hergestellten Viren gentechnisch hergestellt werden,
um vollständig
fremde Epitope, z.B. Antigene von anderen infektiösen Pathogenen,
Tumorantigene oder Targeting-Antigene zu exprimieren. Da das NS
RNS-Segment das kürzeste
unter den acht viralen RNS ist, ist es möglich, dass die NS RNS längere Insertionen
von heterologen Sequenzen als andere virale Gene zulässt. Des
weiteren lenkt das NS RNS-Segment die Synthese eines hohen Gehalts
an Protein in infizierten Zellen, was nahelegt, dass es ein ideales
Segment für
Insertionen von fremden Antigenen wäre. Erfindungsgemäß kann jedoch ein
beliebiges der acht Segmente der Influenza-Viren für die Insertion
der heterologen Sequenzen verwendet werden. Beispielsweise können dort,
wo eine Oberflächenantigenpräsentation
gewünscht
wird, Segmente, die für
strukturelle Proteine, z.B. HA oder NA, codieren, verwendet werden.
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5.2 SELEKTIONSSYSTEM AUF
DER GRUNDLAGE DER WIRTSRESTRIKTION
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Die
Verfahren des Auswählens
von Influenza-Viren, die den gewünschten
Phänotyp
haben, d.h. Viren, die eine geringe oder keine IFN-Antagonistenaktivität aufweisen,
gleichgültig
ob sie aus natürlichen
Varianten, spontanen Varianten (d.h. Varianten, die während der
Virusvermehrung entstehen), mutagenisierten natürlichen Varianten, Neuzusammenstellern
und/oder gentech nisch hergestellten Viren erhalten werden, können verwendet
werden. Solche Viren werden am besten in differentiellen Wachstums-Assays,
die das Wachstum in IFN-defizienten im Vergleich zu IFN-kompetenten
Wirtssystemen vergleichen, gescreent. Viren, die ein besseres Wachstum
in den IFN-defizienten Systemen im Vergleich zu IFN-kompetenten
Systemen aufweisen, werden ausgewählt. Vorzugsweise werden Viren,
die in IFN-defizienten Systemen zu Titern wachsen, die mindestens
um ein Log höher
sind, im Vergleich zu einem IFN-kompetenten System ausgewählt.
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Alternativ
können
die Viren unter Verwendung von IFN-Assay-Systemen, z.B. auf Transcription basierenden
Assay-Systemen, bei denen die Reportergenexpression durch einen
auf IFN ansprechenden Promotor gesteuert wird, gescreent werden.
Die Reportergenexpression in infizierten im Vergleich zu nichtinfizierten
Zellen kann gemessen werden, um Viren zu identifizieren, die wirksam
eine IFN-Reaktion induzieren, die jedoch die IFN-Reaktion nicht bekämpfen können. Differentielle Wachstums-Assays können verwendet
werden, um Viren mit dem gewünschten
Phänotyp
auszuwählen,
da das verwendete Wirtssystem (IFN-kompetent im Vergleich zu IFN-defizient)
den geeigneten Selektionsdruck zur Anwendung bringt.
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Beispielsweise
kann das Wachstum des Virus (wie mittels des Titers gemessen) in
einer Vielzahl von Zell-, Zelllinien- oder Tiermodellsystemen, die
IFN und die Komponenten der IFN-Reaktion
im Vergleich zu Zell-, Zelllinien oder Tiermodellsystemen exprimieren,
die mit Bezug auf IFN oder Komponenten der IFN-Reaktion defizient
sind, verglichen werden. Für
diesen Zweck kann das Wachstum des Virus in Zelllinien wie VERO-Zellen
(die IFN-defizient sind) im Vergleich zu MDCK-Zellen (die IFN-kompetent sind) verglichen
werden. Alternativ können
IFN-defiziente Zelllinien
aus Tieren gewonnen und festgelegt werden, die gezüchtet oder
gentechnisch verändert
wurden, um in dem IFN-System defizient zu sein (z.B. STAT1-/-Mutantenmäuse). Das
Wachstum des Virus in solchen Zelllinien im Vergleich zu IFN-kompetenten
Zellen, die beispielsweise von Wildtyp-Tieren (z.B. Wildtyp-Mäusen) abgeleitet
sind, kann gemessen werden. Zelllinien, die IFN-kompetent sind und
von denen bekannt ist, dass sie das Wachstum des Wildtyp-Virus unterstützen, können gentechnisch verändert werden,
damit sie IFN-defizient sind) (z.B. durch Ausschalten von STAT1,
IRF3, PKR usw.). Techniken, die im Stand der Technik für die Vermehrung
von Viren in Zelllinien bekannt sind, können verwendet werden (siehe
beispielsweise die nachstehenden Arbeitsbeispiele). Das Wachstum
des Virus in der IFN-kompetenten Standard-Zelllinie im Vergleich
zu der IFN-defizienten, gentechnisch hergestellten Zelllinie kann
verglichen werden.
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Auch
Tiersysteme können
verwendet werden. Beispielsweise kann für das Influenza-Virus das Wachstum
in jungen, IFN-defizienten
embryonierten Eiern, z.B. etwa 6 bis etwa 8 Tage alt, mit dem Wachstum
in älteren,
IFN-kompetenten Eiern, z.B. etwa 10 bis 12 Tage alt, verglichen
werden. Für
diesen Zweck können Techniken,
die im Stand der Technik für
die Infektion und Vermehrung in Eiern bekannt sind, verwendet werden (z.B.
siehe nachstehende Arbeitsbeispiele). Alternativ kann das Wachstum
in IFN-defizienten STAT1-/-Mäusen mit
IFN-kompetenten Wildtyp-Mäusen verglichen
werden. Bei einer weiteren Alternative kann das Wachstum in IFN-defizienten
embryonierten Eiern, hergestellt durch beispielsweise STAT1-/-transgenes
Geflügel
mit dem Wachstum in IFN-kompetenten Eiern, die von Wildtyp-Geflügel erzeugt
werden, verglichen werden.
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Für die Zwecke
des Screenings können
jedoch transiente IFN-defiziente
Systeme statt gentechnisch manipulierter Systeme verwendet werden.
Das Wirtssystem kann beispielsweise mit Verbindungen behandelt werden,
die die IFN-Produktion und/oder Komponenten der IFN-Reaktion inhibieren
(z.B. Medikamente, Antikörper
gegen IFN, Antikörper
gegen den IFN-Rezeptor, Inhibitoren von PKR, Antisense-Moleküle und Ribozyme
usw.). Das Wachstum des Virus kann in IFN-kompetenten, unbehandelten
Kontrollen im Vergleich zu IFN-defizienten, behandelten Systemen
verglichen werden. Beispielsweise können ältere Eier, die IFN-kompetent
sind, mit solchen Medikamenten vor der Infektion mit dem zu screenenden
Virus vorbehandelt werden. Das Wachstum wird mit demjenigen verglichen,
das bei unbehandelten Kontrolleiern des gleichen Alters erreicht
wird.
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Die
Screening-Verfahren stellen ein einfaches und leichtes Screening
zur Verfügung,
um Mutantenviren mit ausgeschalteter IFN-Antagonistenaktivität durch
die Unfähigkeit
des Mutantenvirus, in auf IFN ansprechenden Umgebungen zu wachsen,
im Vergleich zu der Fähigkeit
des Mutantenvirus, in IFN-defizienten Umgebungen zu wachsen, zu
identifizieren. Die Screening-Verfahren
können
auch verwendet werden, um Mutantenviren mit geänderter, jedoch nicht ausgeschalteter
IFN-Antagonistenaktivität
durch Messen der Fähigkeit des
Mutantenvirus, sowohl in auf IFN ansprechenden, z.B. 10 Tage alten,
embryonierten Eiern oder MDCK-Zellen als auch in IFN-defizienten
Umgebungen, z.B. 6 bis 7 Tage alten, embryonierten Eiern oder Vero-Zellen,
zu wachsen, zu identifizieren. Beispielsweise nimmt man an, dass Influenza-Viren,
die um mindestens einen Log niedrigere Titer in 10 Tage alten Eiern
im Vergleich zu 6 bis 7 Tage alten Eiern aufweisen, in ihrer Fähigkeit,
die IFN-Reaktion zu inhibieren, beeinträchtigt sind. Bei einem weiteren
Beispiel geht man davon aus, dass Influenza-Viren, die einen um
mindestens ein Log niedrigeren Titer in 12 Tage alten Eiern (die eine
hohe IFN-Reaktion verursachen) im Vergleich zu 10 Tage alten Eiern
(die eine mäßige IFN-Reaktion
verursachen) aufweisen in ihrer Fähigkeit, die IFN-Reaktion zu bekämpfen, teilweise
beeinträchtigt
sind, und sie werden als attraktive Impfstoffkandidaten erachtet.
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Die
Auswahlverfahren umfassen auch das Identifizieren von denjenigen
Mutantenviren, die IFN-Reaktionen induzieren. Gemäß den Auswahlverfahren
kann das Induzieren von IFN-Reaktionen durch Untersuchen des Niveaus
der IFN-Expression oder der Expression von Zielgenen oder Reportergenen
gemessen werden, die durch die auf IFN folgende Infektion mit dem
Mutantenvirus oder die Aktivierung von Transaktivatoren induziert
wird, die an der IFN-Expression und/oder der IFN-Reaktion beteiligt
sind.
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Das
Induzieren von IFN-Reaktionen kann durch Messen des phosphorylierten
Zustands von Komponenten in dem IFN-Pfad nach der Infektion mit
dem Test-Mutantenvirus, z.B. IRF-3, der in Reaktion auf die Doppelstrang-RNS
phosphoryliert ist, bestimmt werden. In Reaktion auf den Typ I IFN,
Jak1 Kinase und TyK2 Kinase werden Untereinheiten des IFN-Rezeptors,
STAT1 und STAT2, schnell tyrosinphosphoryliert. So werden, um zu
bestimmen, um das Mutantenvirus IFN-Reaktionen induziert, Zellen
wie 293 Zellen mit dem Test-Mutantenvirus infiziert, und nach der
Infektion werden die Zellen lysiert. IFN-Pfadkomponenten wie Jak1 Kinase
oder Tyk2 Kinase werden aus den infizierten Zelllysaten unter Verwendung
von spezifischen polyclonalen Seren oder Antikörpern immunpräzipitiert,
und der tyrosinphosphorylierte Zustand der Kinase wird mittels Immun-Blotting-Assay
mit einem Antiphosphotyrosin-Antikörper bestimmt (z.B. siehe Krishnan
et al. 1997, Eur. J. Biochem. 247: 298-305). Ein verbesserter phosphorylierter
Zustand einer der Komponenten des IFN-Pfads nach der Infektion mit
dem Mutantenvirus würde
ein Induzieren der IFN-Reaktionen durch das Mutantenvirus angeben.
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Die
Auswahlsysteme können
das Messen der Fähigkeit,
spezifische DNS-Sequenzen zu binden, oder der Translokation von
Transcriptionsfaktoren, die in Reaktion auf eine virale Infektion
induziert werden, z.B. IRF3, STAT1, STAT2 usw., umfassen. Insbesondere
werden STAT1 und STAT2 phosphoryliert und von dem Zytoplasma zu
dem Nucleus in Reaktion auf IFN vom Typ I und transloziert. Die
Fähigkeit,
spezifische DNS-Sequenzen zu binden, oder der Translokation der
Transcriptionsfaktoren kann mittels Techniken, die Fachleuten bekannt
sind, gemessen werden, z.B. Elektromobilitäts-Gel-Shift-Assays, Zellfärben usw.
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Das
Induzieren von IFN-Reaktionen kann durch Messen der IFN-abhängigen Transcriptionsaktivierung
nach der Infektion mit dem Test-Mutantenvirus bestimmt werden. Bei
dieser Ausführungsform
kann die Expression von Genen, von der bekannt ist, dass sie durch
IFN, z.B. Mx, PKR, 2-5-Oligoadenylatsynthetase, Haupthistokompatibilitätskomplex
(MHC) Klasse I usw. induziert wird, mittels Techniken analysiert
werden, die Fachleuten bekannt sind (z.B. Northern Blotting, Western
Blotting, PCR usw.). Alternativ werden Testzellen wie humane embryonische
Nierenzellen oder humane osteogene Sarkoma-Zellen gentechnisch verändert, um
Reportergene wie das Luciferase-Reportergen oder das Chloramphenicoltransferase-(CAT-)Reportergen
unter der Kontrolle eines interferonstimulierten Reaktionselements
wie dem IFN-stimulierten Promotor des ISG-54K-Gens (Bluyssen et
al., 1994, Eur. J. Biochem. 220: 395-402) vorübergehend oder konstitutiv
zu exprimieren. Zellen werden mit dem Test-Mutantenvirus infiziert,
und das Niveau der Expression des Reportergens wird mit demjenigen
bei nichtinfizierten Zellen oder mit dem Wildtyp-Virus infizierten
Zellen verglichen. Eine Erhöhung
des Niveaus der Expression des Reportergens nach der Infektion mit
dem Testvirus würde
angeben, dass das Test-Mutantenvirus eine IFN-Reaktion induziert.
-
Die
Selektionssysteme können
das Messen des IFN-Induzierens durch Bestimmen, ob ein Extrakt aus der
Zelle oder dem Ei, die bzw. das mit dem Test-Mutantenvirus infiziert
ist, eine Schutzaktivität
gegen eine virale Infektion verleihen kann, umfassen. Insbesondere
werden Gruppen von 10 Tage alten embryonierten Hühnereiern mit dem Test-Mutantenvirus
oder dem Wildtyp-Virus infiziert. Etwa 15 bis 20 Stunden nach der Infektion
wird das Allantoisfluid geerntet und mit Bezug auf die IFN-Aktivität getestet,
indem die höchste
Verdünnung
mit Schutzaktivität
gegen eine VSV-Infektion in Gewebekulturzellen wie CEF-Zellen bestimmt
wird.
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5.3 VERMEHRUNG DES VIRUS
IN INTERFERON-DEFIZIENTEN WACHSTUMSSUBSTRATEN
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft neue Verfahren und Substrate für die Vermehrung
von Influenza-Viren. Die Erfindung betrifft IFN-defiziente Substrate
und Verfahren für
das Vermehren von Viren in diesen Substraten. Insbesondere betrifft
die Erfindung Verfahren des Vermehrens von Viren in unreifen embryonierten, sechs
bis neun Tage alten Eiern, die aufgrund ihres zerbrechlichen Zustands
und der kleineren Allantoishöhle normalerweise
nicht zum Züchten
von Viren verwendet werden. Erfindungsgemäß umfassen unreife embryonierte
Eier sechs bis neun Tage alte Eier.
-
Gemäß den Verfahren
der vorliegenden Erfindung werden die Viren, die in unreifen embryonierten
Eiern gezüchtet
werden können,
aus natürlich
vorkommenden Stämmen,
Varianten oder Mutanten, mutagenisierten Viren, Neuzusammenstellern
und/oder gentechnisch hergestellten Viren ausgewählt. Die Verfahren der vorliegenden
Erfindung umfassen das Züchten
der Viren in sechs bis neun Tage alten Eiern, vorzugsweise unter
Verwendung von geeigneten Züchtungsbedingungen
(siehe z.B. die Züchtungsbedingungen,
die in dem nachstehend angegebenen Abschnitt 6 angegeben sind) und
das Sammeln des Nachkommenvirus. Die erfindungsgemäßen Verfahren,
die das Züchten
der Viren in unreifen embryonierten, sechs bis neun Tage alten Eiern
umfassen, sind für
das Züchten
von Viren, die besonders zur Verwendung bei Impfstoffformulierungen geeignet
sind, besonders geeignet.
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Die
Erfindung umfasst auch Verfahren und IFN-defiziente Substrate für das Züchten und
Isolieren von natürlich
vorkommenden oder gentechnisch hergestellten Mutantenviren mit einer
geänderten
IFN-Antagonistenaktivität.
Die IFN-defizienten Substrate, die verwendet werden können, um
das Züchten
der abgeschwächten
Mutantenviren zu unterstützen,
sind Zelllinien oder unreife embryonierte, sechs bis neun Tage alte
Eier, die IFN-defizient
sind, mit der Maßgabe,
dass die Zelllinien keine Vero- Zellen
sind und keine STAT(-)-Zelllinien sind, z.B. rekombinante Zellen
oder Zelllinien, die gentechnisch verändert wurden, um IFN-defizient
zu sein, oder embryonierte Eier, die von IFN-defizienten Vögeln, insbesondere Geflügel (z.B.
Hühnern,
Enten, Truthähnen)
erhalten werden, einschließlich
Beständen,
die zu IFN-defizienten oder transgenen Vögeln gezüchtet werden (z.B. STAT1 Knockouts).
Diese Zelllinien oder Eier können
gentechnisch verändert
werden, um Transgene zu exprimieren, die für Inhibitoren des IFN-Systems,
z.B. dominant-negative Mutanten, Antisense-RNS, Ribozyme, Inhibitoren
der IFN-Produktion, Inhibitoren der IFN-Signalgebung und/oder Inhibitoren
von antiviralen Genen, die durch IFN induziert werden, codieren.
Alternativ können
diese Zelllinien oder Eier mit einer Verbindung behandelt werden,
die die IFN-Produktion und/oder den IFN-Pfad inhibiert, z.B. Medikamente,
Antikörper,
Antisense-Moleküle,
Ribozymmoleküle,
die auf das STAT1-Gen zielgerichtet sind und/oder durch IFN induzierte,
antivirale Gene inhibieren.
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Erfindungsgemäß umfassen
unreife embryonierte Hühnereier
Eier, die auf natürliche
Weise sechs bis neun Tage alt sind.
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5.3.1 NATÜRLICHE IFN-DEFIZIENTE
SUBSTRATE
-
In
einer Ausführungsform
betrifft die vorliegende Erfindung das Züchten von natürlich vorkommenden und
gentechnisch veränderten
Influenza-Mutantenviren in nichtherkömmlichen Substraten wie unreifen
embryonierten Eiern, die noch kein IFN-System entwickelt haben.
Unreife embryonierte Eier werden normalerweise aufgrund ihres zerbrechlichen
Zustands und des kleineren Allantoisvolumens nicht zum Züchten von
Viren verwendet. Die vorliegende Erfindung umfasst das Züchten von
Mutantenviren in embryonierten, sechs bis neun Tage alten Eiern,
vorzugsweise das Züchten
des mutierten Virus in 8 Tage alten, embryonierten Eiern und am
meisten bevorzugt in 6 bis 8 Tage alten Eiern.
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Die
vorliegende Erfindung umfasst auch Verfahren des Züchtens und
Isolierens von mutierten Influenza-Viren mit einer geänderten
IFN-Antagonistenaktivität
in Zellen und Zelllinien, die von Natur aus keinen IFN-Pfad oder
einen defizienten IFN-Pfad oder eine Defizienz des IFN-Systems,
z.B. ein niedriges Niveau der IFN-Expression im Vergleich zu Wildtyp-Zellen
aufweisen.
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5.3.2 GENTECHNISCH HERGESTELLTE
IFN-DEFIZIENTE SUBSTRATE
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Züchten und Isolieren von mutierten
Influenza-Viren mit geänderter
IFN-Antagonistenaktivität in einem
gentechnisch hergestellten, IFN-defizienten
Substrat. Bei einer weiteren Ausführungsform können die
Zelllinien gentechnisch verändert
werden, um IFN-defizient zu sein. Die vorliegende Erfindung umfasst
Zelllinien, bei denen ein Gen, das für die IFN-Synthese oder den
IFN-Pfad wesentlich ist, und/oder ein antivirales Gen oder antivirale
Gene, die durch IFN induziert werden, mutiert ist.
-
Die
Erfindung stellt rekombinante Zelllinien zur Verfügung, bei
denen ein oder mehr Gene, die für
den IFN-Pfad wesentlich ist bzw. sind, z.B. Interferon-Rezeptor
usw., gespalten wurde(n), d.h. ein "Knockout" ist. Eine solche Zelllinie kann durch
ein beliebiges im Stand der Technik bekanntes Verfahren für das Spalten
eines Gens auf dem Chromosom der Zelle oder des Tiers erzeugt werden.
Solche Techniken umfassen, sind jedoch nicht be schränkt auf,
pronucleäre
Mikroinjektion (Hoppe & Wagner,
1989, US-Patent Nr. 4,873,191); einen retrovirusvermittelten Gentransfer
in Keimzellen (Van der Putten et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci.,
USA 82: 6148-6152); Gen-Targeting in embryonischen Stammzellen (Thompson
et al., 1989, Cell 56: 313); Elektroporation von Embryos (Lo, 1983,
Mol. Cell. Biol. 3: 1803); und einen spermavermittelten Gentransfer
(Lavitrano et al., 1989, Cell 57: 717) usw. Bezüglich eines Überblicks über solche
Techniken siehe Gordon, 1989, Transgenic Animals, Intl. Rev. Cytol.
115: 171.
-
Homologe
Rekombinationsverfahren für
das Spalten von Genen in dem Mausgenom werden beispielsweise in
Capecchi (1989, Science 244: 1288) und Mansour et al. (1988, Nature
336: 348-352) beschrieben.
-
5.3.3 TRANSIENTE IFN-DEFIZIENTE
SUBSTRATE
-
Die
Zelllinien oder Eier können
mit Verbindungen vorbehandelt werden, die das IFN-System inhibieren.
Erfindungsgemäß können Verbindungen,
die die Synthese von IFN oder die Aktivität oder die Expression der Komponenten
des IFN-Systems hemmen, verwendet werden, um Wirte vorzubehandeln,
z.B. Verbindungen, die die Synthese von IFN, die Aktivität von IFN,
den IFN-Rezeptor,
andere Ziele in dem IFN-Signaltransduktionspfad inhibieren oder
die die Aktivität
von antiviralen Genen inhibieren, die von IFN induziert werden. Beispiele
von Verbindungen, die gemäß der vorliegenden
Erfindung verwendet werden können,
umfassen, sind jedoch nicht beschränkt, auf Nucleinsäuremoleküle, Antikörper, Peptide,
Antagonisten des IFN-Rezeptors, Inhibitoren des STAT1-Pfads, Inhibitoren
von PKR usw. Erfindungsgemäß umfassen
Nucleinsäuremoleküle Antisense-Moleküle, Ribozyme
und Dreifachhelixmoleküle,
die Gene zielgerichtet anvisieren, die für wesentliche Komponenten des
IFN-Systems, z.B. STAT1, codieren. Nucleinsäuremoleküle umfassen auch Nucleotide,
die für
dominante negative Mutanten der Komponenten des IFN-Systems codieren,
z.B. vor der Infektion mit dem viralen Mutanten können die
Zellen mit einer DNS transfiziert werden, die für einen verkürzten, signalgebenden
inkompetenten Mutanten des IFN-Rezeptors codiert.
-
Dominant-negative
Mutanten, die erfindungsgemäß verwendet
werden können,
um den IFN-Pfad zu inhibieren, umfassen kinase-defiziente Versionen
von Jak1, TyK2 oder Transcriptionsfaktoren, denen die DNS-Bindungsdomänen STAT1
und STAT2 fehlen (siehe z.B. Krishnan et al., 1997, Eur. J. Biochem.
247: 298-305).
-
6. BEISPIEL: ERZEUGUNG
UND CHARAKTERISIERUNG VON NS1-VERKÜRZUNGSMUTANTEN DES INFLUENZA-A-VIRUS
-
6.1 MATERIALIEN UND VERFAHREN
-
Das
Influenza-A/PR/8/34-(PR8-)Virus wurde in 10 Tage alten embryonierten
Hühnereiern
bei 37°C vermehrt.
Das Influenza-A-Virus
25 A-1, ein Neuzusammenstellvirus, das das NS-Segment von dem kälteangepassten
Stamm A/Leningrad/134/47/57 und den verbleibenden Genen vom PR8-Virus
enthielt (Egorov et al., 1994, Vopr. Virusol. 39: 201-205; Shaw
et al., 1996, in Options of the control of influenza III, Herausgeber Brown,
Hampson Webster (Elsevier Science) Seiten 433-436), wurde in Vero-Zellen bei 34°C gezüchtet. Das 25A-1-Virus
ist in Säugerzellen temperaturempfindlich
und wurde als Helfervirus für
die Rettung des NS1/99 Transfektionsvirus verwendet. Vero-Zellen
und MDCK-Zellen, die in einem minimalen essentiellen Medium (MEM)
gehalten wurden, das 1 μg/ml
Trypsin (Difco Laboratories, Detroit, Michigan) enthielt, wurden
für das Züchten des
Influenza-Virus
verwendet. Die Vero-Zellen wurden auch für die Selektion, die Plaque-Reinigung und
Titrierung des NS1/99-Virus verwendet. MDCK-Zellen wurden in DMEM
(Dubeccos minimalem essentiellem Medium) gehalten, das 10% mittels
Hitze inaktiviertes, fötales
Kalbserum enthielt. Vero-Zellen wurden in AIM-V Medium (Life Technologies,
Grand Island, NY) gezüchtet.
-
Das
Plasmid pT3NS1/99, das eine C-ständig
verkürzte
Form des NS1 mit 99 Aminosäuren
enthielt, wurde wie folgt hergestellt. Zunächst wurde pPUC19-T3/NS PR8,
das das vollständige
NS-Gen des PR8-Virus,
der von dem T3-RNS-Polymerasepromotor und der BpuAI-Restriktionsschnittstelle
flankiert war, enthielt, mittels reverser PCR (Ochman et al., 1988,
Genetics 120: 621-623)
unter Verwendung der geeigneten Primer amplifiziert. Die erhaltene
cDNS, die so das verkürzte
NS1-Gen enthielt, wurde phosphoryliert, nach Klenow behandelt, selbstligasiert
und im E. coli Stamm TG1 vermehrt. Das nach der Reinigung erhaltene
Konstrukt wurde pT3NS1/99 genannt und mittels Sequenzierung verifiziert.
Plasmide für
die Expression von NP-, PB1-, PB2- und PA-Proteinen des PR8-Virus
(pHMG-NP, pHMG-PB1, pHMG-PB2 und pHMG-PA) wurden früher beschrieben
(Pleschka et al., 1996, J. Virol. 70: 4188-4192). pPOLI-NS-RB wurde
durch Substituieren des offenen CAT-Leserasters von pPOLI-CAT-RT
(Pleschka et al., 1996, J. Virol. 70: 4188-4192) innerhalb des RT-PCR-Produkts, das von
dem codierten Bereich des NS-Gens des Influenza A/WSN/33-(WSN-)Virus
abgeleitet war, hergestellt.
-
Dieses
Plasmid exprimiert das NS-spezifische virale RNS-Segment des WSN-Virus unter der Kontrolle
eines verkürzten,
humanen Polymerase-I-Promotors.
-
Die
Erzeugung des NS1/99-Virus wurde mittels Ribonucleoprotein-(RNP-)Transfektion
(Luytjes et al., 1989, Cell 59: 1107-1113) durchgeführt. Die RNPs wurden mittels
der T3 RNS-Polymerasetranscription
aus T3NS1/99 gebildet, das mit BpuAI in Gegenwart des gereinigten
Nucleoproteins und Polymerase des Influenza-25A-1-Virus linearisiert
war (Enami, et al., 1991, J. Virol. 65: 2711-2713). RNP-Komplexe
wurden in Vero-Zellen transfiziert, die zuvor mit dem 25A-1-Virus
infiziert worden waren. Transfizierte Zellen wurden 18 Stunden bei
37°C inkubiert,
und der Überstand
wurde zweimal in Vero-Zellen bei 40°C passagiert und Plaque, die
dreimal in Vero-Zellen, die mit mit Agar überzogenem Medium bei 37°C bedeckt
waren, gereinigt wurde, passagiert. Der isolierte NS1/99-Virus wurde
mittels RT-PCR unter Verwendung von spezifischen Primern analysiert.
Das Wildtyp-Transfektionsvirus wurde wie folgt erzeugt. Vero-Zellen
in 35 mm Schalen wurden mit Plasmiden pHMG-NP, pHMG-PB1, pHMG-PB2, pHMG-PA und
pPOLI-NS-RB, wie vorstehend beschrieben (Pleschka et al., 1996,
J. Virol.70: 4188-4192), transfiziert. Zwei Tage nach der Transfektion
wurden Zellen mit 5 × 104 pfu des delNS1-Virus infiziert und zwei
weitere Tage bei 37°C
inkubiert. Der Zellüberstand
wurde einmal in MDCK-Zellen und zweimal in embryonierten Hühnereiern
passagiert. Transfektionsviren wurde durch Begrenzung der Verdünnung in
Eiern geclont. Genomische RNS aus dem gereinigten NS1/99-Transfektionsvirus
wurde mittels Polyacrylamidgelelektrophorese wie vorstehend beschrieben
(Zheng et al., 1996, Virology 217: 242-251) analysiert. Die Expression
eines verkürzten
NS1-Proteins mittels des NS1/99-Virus wurde mittels Immunpräzipitieren
von markierten infizierten Zellextrakten unter Verwendung eines
polyclonalen Kaninchenantiserums gegen NS1 verifiziert.
-
Die
Allantoishöhle
der embryonierten Hühnereier,
die 6, 10 und 14 Tage alt waren, wurde mit etwa 103 pfu
PR8-, NS1/99- oder delNS1-(bei denen das gesamte NS1-Gen deletiert
ist)Viren, die zwei Tage bei 37°C inkubiert
wurden, inokuliert, und die in dem Allantoisfluid vorhandenen Viren
wurden mittels Hämagglugination-(HA-)Assay
titriert.
-
Gruppen
von 5 BALB/c-Mäusen
(Taconic Farms) wurden intranasal mit 5 × 106 pfu,
1,5 × 105 pfu oder 5 × 103 pfu
des Wildtyp-A/PR/8/34-(PR8-)
oder NS1/99-Virus inokuliert. Die Inokulationen wurden unter Anästhesie
unter Verwendung von 50 μl
MEM durchgeführt,
das die geeignete Anzahl von plaquebildenden Einheiten des geeigneten
Virus enthielt. Die Tiere wurden täglich überwacht und getötet, wenn
beobachtet wurde, dass sie in extremis waren. Bei einem späteren Experiment
wurden alle überlebenden
Mäuse vier
Wochen später
einer Dosis von 100 LD50 des Wildtyp-PR8-Virus
ausgesetzt. Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den NIH-Richtlinien über die
Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt.
-
6.2 ERGEBNISSE: ABSCHWÄCHUNG VON
INFLUENZA-A-VIREN DURCH NS1-DELETIONEN
-
Die
Anmelder haben vorstehend gezeigt, dass ein Influenza-A-Virus, bei dem das
NS1-Gen deletiert war (delNS1-Virus) in Zellen, die bezüglich der
Erzeugung des Typ I Interferons (IFN) defizient sind, wie Vero-Zellen
zu Titern von etwa 107 pfu/ml wach sen kann.
Dieses Virus war jedoch in seiner Fähigkeit, sich zu replizieren
und eine Krankheit bei Mäusen
hervorzurufen, beeinträchtigt
(Garcia-Sastre et al., 1998, Virology 252: 324). Im Gegensatz hierzu
konnte das delNS1-Virus in STAT1-/-Mäusen wachsen und diese töten. Diese Ergebnisse
zeigten, dass das NS1-Protein des Influenza-A-Virus ein Virulenzfaktor
ist, der an der Inhibition der antiviralen Wirtsreaktionen beteiligt
ist, die durch das Typ I IFN vermittelt werden. Die folgenden Experimente wurden
durchgeführt,
um zu bestimmen, ob Influenza-Viren mit Virulenzcharakteristiken
erzeugt werden können,
die zwischen dem Wildtyp- und dem delNS1-Virus liegen, indem Abschnitte
des NS1-Gens deletiert werden, und ob einige dieser Viren optimale
Charakteristiken haben könnten,
damit sie als abgeschwächte
Lebendimpfstoffe gegen Influenza-Viren verwendet werden können, d.h.
Stabilität
und ein geeignetes Gleichgewicht zwischen Abschwächung, Immunogenizität und Wachstum
in Substraten, die für
die Impfstoffherstellung geeignet sind, wie embryonierten Hühnereiern.
-
Um
diese Hypothese zu testen, wurde ein Influenza-A/PR/8/34-(PR8-)Virus erzeugt,
bei dem das NS1-Gen modifiziert worden war, um die Expression eines
verkürzten
NS1-Proteins zu lenken, das nur 99 Aminosäuren an dem Amino-Terminal
gemeinsam mit den 230 Aminosäuren
des Wildtyp-NS1-Proteins hat. Dieses Virus (NS1-99) wurde mittels
RNP-Transfektion eines künstlich
gentechnisch hergestellten NS-Gens unter Verwendung eines 25A1-Helfervirus
wie vorstehend beschrieben erhalten (Garcia-Sastre et al., 1998, Virology 252: 324).
Die Analyse der NS1-Expression
in mit Virus infizierten Zellen lässt die abgekürzte Natur
des NS1-Proteins des NS1-99-Virus erkennen.
-
Die
Fähigkeit
der delNS1-, NS1-99- und Wildtyp-PR8-Viren, in embryonierten Hühnereiern
unterschiedlichen Alters zu wachsen, wurde analysiert. Die logische
Grundlage für
dieses Experiment basiert auf der Tatsache, dass die Fähigkeit
von embryonierten Eiern, das Typ I IFN unter einem geeigneten Stimulus
zu synthetisieren und auf es zu reagieren, altersabhängig ist.
Tatsächlich
beginnen sowohl die IFN-Induzierbarkeit als auch die Reaktionsfähigkeit
im Alter von etwa 10 Tagen und sie nehmen dann exponentiell mit
dem Alter zu (Sekellick et al., 1990, In Vitro Cell. Dev. Biol.
26: 997; Sekellick & Marcus,
1985, J. Interferon Res. 5: 657). So stellt die Verwendung von Eiern
unterschiedlichen Alters ein einzigartiges System dar, um die Fähigkeit
der verschiedenen Viren, IFN-Reaktionen zu inhibieren, zu testen.
Eier im Alter von 6, 10 und 14 Tagen wurden mit etwa 10
3 pfu
von PR8-, NS1-99 oder delNS1-Viren inokuliert, die 2 Tage bei 37°C inkubiert
worden waren, und die in dem Allantoisfluid vorhandenen Viren wurden
mittels des Hämagglutinations-(HA-)Assays
titriert. Wie in Tabelle 3 gezeigt, replizierte sich das delNS1,
obgleich das Wildtyp-Virus zu ähnlichen
HA-Titern in 6, 10 und 14 Tage alten embryonierten Eiern wuchs,
nur zu einem feststellbaren HA-Titer in 6 Tage alten Eiern. Im Gegensatz
hierzu zeigte das NS1-99-Virus ein Zwischenverhalten zwischen dem
delNS1- und dem
Wildtyp-Virus und konnte in 10 Tage alten Eiern, jedoch nicht in
14 Tage alten Eiern, zu HA-Titern wachsen, die ähnlich denjenigen des Wildtyp-Virus
waren Tabelle
3: Virusreplikation in embryonierten Hühnereiern
- 1 Titer stellen
die höchste
Verdünnung
mit Hämagglutinaationsaktivität dar.
- 2 Wildtyp-Influenza-A/PR/8/34-Virus.
- 3 Nicht bestimmt.
-
Die
Abschwächungscharakteristiken
des NS1-99-Virus wurden als nächstes
in Mäusen
bestimmt. Für diesen
Zweck wurden Gruppen von 5 BALB/c-Mäusen intranasal mit 5 × 10
6 pfu, 1,5 × 10
5 oder
1,5 × 10
3 pfu des Wildtyp-PR8- oder NS1-99-Virus
infiziert. Die Mäuse
wurden dann 3 Wochen mit Bezug auf das Überleben beobachtet. Die Ergebnisse
sind in Tabelle 4 angegeben. Das NS1-99-Virus hatte ein LD
50, das mindestens 3 Log höher war,
als dasjenige des Wildtyp-Virus. Tabelle
4: Abschwächung
des NS1-99-Virus bei Mäusen
- 1 Wildtyp-Influenza-Virus-A/PR/8/34
-
7. BEISPIEL: DIE ERZEUGUNG
UND CHARAKTERISIERUNG VON NS1-VERKÜRZTEN MUTANTEN IM INFLUENZA-B-VIRUS
-
7.1 MATERIALIEN UND VERFAHREN
-
Die
experimentellen Details sind ähnlich
denjenigen in Abschnitt 6.1. Zwei Mutanten-Influenza-B-Viren, B/610B5B/201
(B/201) und B/AWBY-234, die 127 Aminosäuren bzw. 90 Aminosäuren lang
waren (C-ständig
verkürzte
NS1-Proteine) (Norton et al., 1987 Virology 156: 204; Tobita et
al., 1990 Virology 174: 314) wurden aus Koinfektions-Experimenten
in Gewebekulturen, an denen B/Yamagata/1/73-(B/Yam-) und A/Aichi/2/68-Viren
beteiligt waren, in Gegenwart eines anti-A-(H3N2-)Virus-Antikörpers gewonnen.
Das Wachstum der Mutanten-Influenza-Viren in embryonierten Eiern
verschiedenen Alters wurde mit demjenigen des Parentalvirus B/YAM
verglichen, das ein Wildtyp-NS1-Protein
mit 281 Aminosäuren
besitzt. 6, 10 und 14 Tage alte Eier wurden mit etwa 103 pfu
B/Yam-, B/201- oder B/AW/BY-234-Viren
inokuliert, die 2 Tage bei 35°C
inkubiert worden waren, und die in dem Allantoisfluid vorhandenen
Viren wurden mittels eines HA-Assays titriert.
-
Des
weiteren wurden die Abschwächungscharakteristiken
der B/201- und B/AWBY-234-Viren in Mäusen bestimmt. Gruppen von
drei BALB/c-Mäusen
wurden intranasal mit 3 × 10
5 pfu der Wildtyp-B/YAM-, B/201- oder B/AWBY/234-Mutantenviren
infiziert, und die Fähigkeit
dieser Viren, sich zu replizieren, wurde durch Messen der viralen
Titer in den Lungen am Tag 3 nach der Infektion bestimmt, da das
Wildtyp-B/YAM bei Mäusen keine
offensichtlichen Krankheitssymptome induziert. 7.2
ERGEBNISSE Tabelle
5: Influenza-B-Virus-Replikation in embryonierten Hühnereiern
-
Die
Ergebnisse aus dem Wachstum der Mutanten- und Wildtyp-Influenza-B-Viren
in embryonierten Hühnereiern,
die in Tabelle 5 aufgeführt
sind, zeigen, dass wie im Fall der Influenza-A-Viren, eine carboxyständige Verkürzung des
NS1 des Influenza-B-Virus für
eine geringere Replikationsausbeute in älteren, embryonierten Hühnereiern
verantwortlich ist, die eine wirksame IFN-Reaktion induzieren. Diese Erkenntnis
gibt an, dass das NS1 des Influenza-B-Virus auch an dem Inhibieren
der IFN-Reaktionen des Wirts beteiligt ist und dass Deletionen an
dem NS1-Gen des Influenza-B-Virus zu einem abgeschwächten Phänotyp führen.
-
Die
Ergebnisse aus den Replikationsexperimenten bei Mäusen sind
in Tabelle 6 angegeben. B/201- und B/AWBY-234-Virustiter waren um
etwa drei Log der Größenordnung
niedriger als B/YAM-Titer,
was angibt, dass Verkürzungen
der carboxyständigen
Domäne
des NS-1 des Influenza-B-Virus für
einen abgeschwächten Phänotyp bei
Mäusen
verantwortlich sind. Tabelle
6: Influenza-B-Virus-Replikation in Mäuselungen
-
8. SCHUTZ GEGEN WILDTYP-INFLUENZA-VIRUS-INFEKTION
BEI MÄUSEN,
DIE MIT INFLUENZA-A- UND -B-VIREN IMMUNISIERT SIND, DIE DELETIONEN
IN IHREN NS1-PROTEINEN ENTHALTEN
-
Um
zu bestimmen, ob Mäuse,
die mit den abgeschwächten
Influenza-A- und -B-Viren immunisiert sind, die verkürzte NS-1-Proteine enthalten,
gegen eine Aussetzung mit ihren jeweiligen Wildtyp-Viren geschützt wurden,
wurde das folgende Experiment durchgeführt. BALB/C-Mäuse wurden
intranasal mit dem A/NS1-99-Virus
immunisiert und drei Wochen später
mit 100 LD50 des Wildtyp-Influenza-A/PR/8/34-Virus
infiziert. Immunisierte Tiere waren gegen den Tod geschützt, während alle
kontrollnaiven Mäuse
nach der Aussetzung starben (siehe Tabelle 7). Bei einem zweiten
Experiment wurden BALB/c-Mäuse
intranasal mit den Influenza-B-Viren B/201 oder B/AWBY-234 immunisiert,
die verkürzte
NS1-Proteine exprimierten. Drei Wochen später wurden die Mäuse 3 × 105 pfu des Wildtyp-Influenza-B/Yam/1/73-Virus
ausgesetzt. Da dieser Stamm des Influenza-B-Virus bei Mäusen keine
Krankheitssymptome induziert, wurde der Grad des Schutzes durch
Messen der Virustiter in der Lunge am Tag 3 nach der Aussetzung
bestimmt.
-
Während kontrollnaive
Tiere Titer von etwa 10
4 pfu/Lunge aufwiesen,
wurden keine Viren in den Lungen von immunisierten Tieren festgestellt
(siehe Tabelle 8). Diese Erkenntnisse legen nahe, dass das Influenza-A-
sowie das Influenza-B-Virus, die modifizierte NS1-Gene enthalten,
eine Immunantwort bei Mäusen
induzieren können,
die gegen eine spätere
Aussetzung an den Wildtyp-Virus vollständig schützt. Tabelle
7. Überleben
von Mäusen,
die mit dem Influenza-A/NS1-99-Virus
immunisiert wurden, nach Aussetzen an 100 LD
50 des
Wildtyp-Influenza-A-/PR/8/34-Virus
Tabelle
B. Lungentiter bei Mäusen,
die mit dem Influenza-B/201- und
B/AWBY-234-Virus immunisiert wurden, nach Aussetzung an 3 × 10
5 pfu des Wildtyp-Influenza-B/Yamagata/73-Virus
-
9. BEISPIEL: INDUKTION
DES TYP I INTERFERONS IN EMBRYONIERTEN EIERN, DIE MIT DEM DELNS1-VIRUS
INFIZIERT WURDEN
-
Die
Fähigkeit
des delNS1-Virus, einem Influenza-A-Virus, dem das NS1-Gen fehlt,
die Typ I IFN-Sekretion in embryonierten Hühnereiern zu induzieren, wurde
als nächstes
bestimmt. Für
diesen Zweck wurden Gruppen von zwei 10 Tage alten, embryonierten
Hühnereiern
mit 5 × 10
3 pfu des delNS1- oder Wildtyp-PR8-Virus infiziert.
Achtzehn Stunden nach der Inkubation bei 37°C wurde das Allantoisfluid geerntet
und gegen Säure-pH über Nacht
dialysiert, um infektiöse
Viren zu inaktivieren. Nach der Säure-pH-Behandlung wurden Proben
gegen PBS dialysiert und mit Bezug auf die IFN-Aktivität durch
Bestimmen der höchsten
Verdünnung
mit Schutzaktivität
gegen eine VSV-Infektion (etwa 200 pfu) in CEF-Zellen getestet.
Die in Tabelle 9 gezeigten Ergebnisse geben an, dass wenn NS1 fehlt,
die Influenza-A-Viren höhere
Induktoren von IFN sind. Tabelle
9. Induktion von IFN in Eiern.
-
10. BEISPIEL: ANTIVIRALE
AKTIVITÄT
DES delNS1-VIRUS
-
Das
Eliminieren des IFN-Antagonisten-(NS1-)Gens aus dem Influenza-A-Virus
kann zu einem Virus führen,
der die Fähigkeit
hat, ein hohes Niveau an IFN zu induzieren. Falls dies der Fall
ist, "stört" das delNS1-Virus
die Replikation der IFN-empfindlichen Viren. Um diese Möglichkeit
zu testen, untersuchten die Anmelder die Fähigkeit des delNS1-Virus, die
Replikation des Influenza-A-/WSN/33-(WSN-)Virus,
einem üblicherweise
verwendeten Laborstamm des Influenza-Virus, in Eiern zu inhibieren.
Wie aus 1 ersichtlich ist, konnte die
Behandlung mit nur 2 pfu des delNS1-Virus die endgültigen Titer
des WSN-Virus in dem Allantois-Fluid um einen Log verringern. Des
weiteren führte
die Behandlung mit 2 × 104 pfu des delNSI-Virus zu einer praktisch
vollständigen
Aufhebung der WSN-Replikation in Eiern. Das delNS1-Virus konnte
auch die Replikation von anderen Influenza-A-Virus-Stämmen (H1N1 und H3N2), dem Influenza-B-Virus
und einem anderen Virus wie dem Sendai-Virus stören (2).
-
Durch
diese Ergebnisse ermutigt bestimmten die Anmelder als nächstes die
Fähigkeit
des delNS1-Virus, die Wildtyp-Influenza-Virus-Replikation bei Mäusen zu
stören.
Obgleich die Typ I IFN-Behandlung
in Gewebekulturen die Replikation des Influenza-A-Virus in vitro verhindert,
kann die Behandlung von Mäusen
mit IFN die Replikation von Influenza-Viren nicht inhibieren (Haller,
1981, Current Top Microbiol. Immunol. 92: 25-52). Dies gilt für die meisten
durch Inzucht erzeugten Stämme
von Mäusen
mit Ausnahme der A2G-Mäuse. A2G-Mäuse sowie
ein signifikanter Anteil von wilden Mäusen (etwa 75 %) enthalten
mindestens eine intakte Mx1-Allele, während die meisten Laborstämme Mx1
-/- sind (Haller, 1986, Current Top Microbiol. Immunol. 127: 331- 337). Das Mx1-Protein,
das ein Homolog des humanen MxA-Proteins
ist (Aebi, 1989, Mol. Cell. Biol. 11: 5062), ist ein starker Inhibitor
der Influenza-Virus-Replikation (Haller, 1980, Nature 283: 660).
Dieses Protein wird nicht konstitutiv exprimiert, sondern seine
Expression wird transcriptionell durch das Typ I IFN induziert.
So können
A2G-Mäuse
verwendet werden, um die Fähigkeit
von IFN-Induktoren, eine antivirale Reaktion gegen Influenza-A-Viren
zu stimulieren, zu testen (Haller, 1981, Current Top Microbiol.
Immunol. 92:25-32).
-
Die
Anmelder infizierten 8 vier Wochen alte A2G-Mäuse intranasal mit 5 × 10 pfu6 eines hoch pathogenen Influenza-A/PR/8/34-Virusisolats (Haller,
1981, Current Top Microbiol. Immunol. 92: 25-52). Die Hälfte der
Mäuse erhielt
eine intranasale Behandlung mit 5 × 106 pfu
des delNS1 nach -24 Stunden mit Bezug auf die PR8-Infektion. Die
anderen vier Mäuse
wurden mit PBS behandelt. Die Änderungen
des Körpergewichts
und das Überleben
wurden überwacht.
Diese Ergebnisse zeigen, dass die delNS1-Behandlung A2G-Mäuse gegen den durch das Influenza-Virus
induzierten Tod und Verlust des Körpergewichts schützen kann.
Die gleiche Behandlung war bei Mx1-/-Mäusen nicht wirksam, was angibt,
das der Mechanismus des viralen Schutzes Mx1-, d.h. IFN-, vermittelt
war.
-
11. BEISPIEL: ANTITUMOREIGENSCHAFTEN
DES DELNS1-VIRUS BEI MÄUSEN
-
Da
gezeigt wurde, dass das Typ I IFN und/oder Induktoren des Typ I
IFNs Antitumoraktivitäten
aufweisen (Belardelli und Gresser, 1996, Immunology Today, 17: 369-372;
Qin et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci., 95: 14411-14416), ist
es möglich,
dass die Behandlung von Tumoren mit dem delNS1-Virus die Tumorregression vermitteln
kann. Alternativ könnte
das delNS1-Virus onkolytische Eigenschaften haben, d.h. es kann
spezifisch in Tumorzellen wachsen und diese töten, von denen bekannt ist,
dass viele von ihnen Defekte des IFN-Systems aufweisen. Um die Antitumor-Aktivität des delNS1-Virus
zu testen, wurde das folgende Experiment unter Verwendung der Mäuse-Karzinomazelllinie
CT26.WT in einem Mäuse-Tumormodell
für pulmonale
Metastasen durchgeführt
(Restifo et al., 1998, Virology 249: 89-97). 5 × 10
5 CT26.WT-Zellen
wurden 12 sechs Wochen alten BALB/c-Mäusen
intravenös
injiziert. Die Hälfte
der Mäuse
wurde intranasal mit 10
6 pfu des delNS1-Virus alle
24 Stunden am Tag 1, 2 und 3 nach der Inokulation behandelt. Zwölf Tage
nach der Tumorinjektion wurden die Mäuse getötet und die Lungenmetastasen
gezählt.
Wie in Tabelle 10 gezeigt, vermittelte die delNS1-Behandlung eine signifikante
Regression der pulmonalen Metastasen der Mäuse. Tabelle
10. Antitumor-Aktivität
des delNS1-Virus in BALB/c-Mäusen, denen
CT26.WT-Tumorzellen injiziert wurden
-
12. BEISPIEL: DAS NS1-PROTEIN
INHIBIERT DIE TRANSLOCATION VON IRF-3 WÄHREND DER INFLUENZA-VIRUS-INFEKTION
-
Die
hier beschriebenen Ergebnisse legen nahe, dass das NS1-Protein des Influenza-Virus
für die
Inhibierung der Typ I IFN-Reaktion
gegen das Virus verantwortlich ist und dass Mutationen/Deletionen
in diesem Protein zu abgeschwächten
Viren aufgrund einer verbesserten IFN-Reaktion während der Infektion führten. Es ist
bekannt, dass die Synthese des Typ I IFN während einer viralen Infektion
durch die Doppelstrang-RNS (dsRNS) ausgelöst werden kann. IRF-3 ist ein
Transcriptionsfaktor, der üblicherweise
in einer inaktiven Form in dem Zytoplasma von Säugerzellen gefunden wird. Die
Doppelstrang-RNS induziert die Phosphorylierung (Aktivierung) des
Transcriptionsfaktors IRF-3, was zu seiner Translocation zum Nucleus
führt,
wo er die Transcription der spezifischen Gene, einschließlich der
Gene, die für
das Typ I IFN codieren, induziert (Weaver et al., 1998, Mol. Cell.
Biol. 18: 1359). Um zu bestimmen, ob das NS1 des Influenza-Virus auf IRF-3 wirkt,
wurde die IRF-3-Lokalisierung in CV1-Zellen, die mit dem Wildtyp-PR8- oder
mit dem delNS1-Influenza-A-Virus
infiziert worden waren, überwacht. 3 zeigt,
dass die IRF-3-Translocation in PR-8-infizierten Zellen minimal
ist (in weniger als 10% der Zellen). Im Gegensatz hierzu zeigten
etwa 90% der mit delNS1-infizierten Zellen eine nucleäre Lokalisierung
von IRF-3. Überraschenderweise
war es möglich,
die IRF-3-Translokation in mit delNS1 infizierten Zellen durch Exprimieren
von NS1 aus einem Plasmid in trans teilweise zu inhibieren. Die
Ergebnisse zeigen, dass das NS1 des Influenza-A-Virus die IRF-3-Translocation
in virusinfizierten Zellen inhibieren kann. Es ist wahrscheinlich,
dass das NS1 des Influenza-Virus die dsRNS-vermittelte Aktivierung
von IRF-3 durch Maskieren der dsRNS, die während der viralen Infektion
erzeugt wurde, verhindert, was so zu einer Inhibierung der IFN-Synthese
führt.