CZ306637B6 - Oslabený virus chřipky a vakcína - Google Patents

Oslabený virus chřipky a vakcína Download PDF

Info

Publication number
CZ306637B6
CZ306637B6 CZ2011-316A CZ2011316A CZ306637B6 CZ 306637 B6 CZ306637 B6 CZ 306637B6 CZ 2011316 A CZ2011316 A CZ 2011316A CZ 306637 B6 CZ306637 B6 CZ 306637B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
influenza virus
protein
amino acids
virus
ifn
Prior art date
Application number
CZ2011-316A
Other languages
English (en)
Inventor
Peter Palese
Adolfo Garcia-Sastre
Thomas Muster
Original Assignee
Mount Sinai School Of Medicine
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27376229&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CZ306637(B6) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Mount Sinai School Of Medicine filed Critical Mount Sinai School Of Medicine
Publication of CZ306637B6 publication Critical patent/CZ306637B6/cs

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/155—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/155—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
    • A61K39/17—Newcastle disease virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/205—Rhabdoviridae, e.g. rabies virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A61K2039/541—Mucosal route
    • A61K2039/543—Mucosal route intranasal
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/572—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 cytotoxic response
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/58—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation
    • A61K2039/585—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation wherein the target is cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16132—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2760/16143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16151—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16161—Methods of inactivation or attenuation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16161—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2760/16162—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16171—Demonstrated in vivo effect
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16221—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16232—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16241—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2760/16243—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16251—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16261—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2760/16262—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16271—Demonstrated in vivo effect
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18111—Avulavirus, e.g. Newcastle disease virus
    • C12N2760/18122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18111—Avulavirus, e.g. Newcastle disease virus
    • C12N2760/18134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
    • C12N2760/18522—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
    • C12N2760/18534—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/20011—Rhabdoviridae
    • C12N2760/20211—Vesiculovirus, e.g. vesicular stomatitis Indiana virus
    • C12N2760/20222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/20011—Rhabdoviridae
    • C12N2760/20211—Vesiculovirus, e.g. vesicular stomatitis Indiana virus
    • C12N2760/20234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

Oslabené RNA viry s negativním řetězcem se sníženou schopností antagonizovat buněčnou interferonovou (IFN) odpověď, a použití těchto oslabených virů ve vakcíně a farmaceutických prostředcích. Vynález se také týká vývoje a použití IFN-deficientních systémů pro selekci těchto oslabených virů. Vynález se zvláště týká oslabených virů chřipky s modifikacemi genu NS1, které zmenšují nebo odstraňují schopnost genového produktu NS1 antagonizovat buněčnou odpověď IFN. Mutantní viry se replikují in vivo, ale vykazují sníženou patogenicitu, a proto jsou vhodné pro živé virové vakcíny a farmaceutické prostředky.

Description

Oslabený virus chřipky a vakcína
Oblast techniky
Předkládaný vynález se obecně týká oslabených RNA virů s negativním řetězcem s oslabenou schopností antagonizovat odpověď buněčného interferonu (IFN) a použití těchto oslabených virů ve vakcíně a farmaceutických prostředcích. Vynález se také týká vývoje a použití IFN-defícientních systémů pro selekci, identifikaci a množení takových oslabených virů.
V jednom konkrétním provedení se vynález týká oslabených virů chřipky s modifikacemi genu NS1, které zmenšují nebo odstraňují schopnost genového produktu NS1 antagonizovat buněčnou odpověď IFN. Mutantní viry se replikují in vivo, ale vykazují sníženou patogenicitu, a proto jsou vhodné pro použití ve vakcínách a farmaceutických prostředcích na bázi živých virů.
Dosavadní stav techniky
1. Virus chřipky
Třídy virů obsahující jednořetězcovou RNA genomu s negativním řetězcem se klasifikují do skupin s nesegmentovanými genomy (Paramyxoviridae, Rhabdoviridae, Filoviridae a virus Bomské nemoci, Boma Disease Virus) nebo do skupin se segmentovanými genomy (Orthomyxoviridae, Bunyaviridae a Arenaviridae). Třída Orthomyxoviridae popisovaná podrobněji níže a používaná v přiložených příkladech zahrnuje viry chřipky typů A, B a C, stejně jako viry Thogoto a Dhori, a virus lososí anémie.
Viriony chřipky se skládají z vnitřního ribonukleoproteinového jádra (šroubovicová nukleokapsida) obsahujícího genom jednořetězcové RNA, a vnější lipoproteinové obálky, která je uvnitř opatřena proteinem matrice (Μ 1). Segmentovaný genom viru chřipky A se skládá z osmi molekul (v případě chřipky typu C ze sedmi) lineárních jednořetězcových RNA s negativní polaritou, které kódují deset polypeptidů včetně: proteinů RNA-dependentní RNA polymerázy (PB2, PB1 a PA) a nukleoproteinu (NP), který tvoří nukleokapsidu; membránových proteinů matrice (Ml, M2); dvou povrchových glykoproteinů, které vybíhají z obálky obsahující lipidy: hemaglutininu (HA) a neuraminidázy (NA); nestrukturního proteinu (NS1) a proteinu exportu jádra (NEP). Transkripce a replikace genomu probíhá v jádře a uspořádání probíhá pučením na plasmatické membráně. U virů může v průběhu smíšených infekcí docházet k přeuspořádání genů.
Virus chřipky se adsorbuje prostřednictvím HA na sialyloligosacharidy v glykoproteinech a glykolipidech buněčné membrány. Po endocytóze virionu dojde ke konformační změně v molekule HA uvnitř buněčného endosomu, což umožní membránovou fúzi a tím zahájení odstraňování obalu. Nukleokapsida migruje do jádra, kde se přepisuje virová mRNA. Virová mRNA se přepisuje jedinečným mechanismem, při kterém virová endonukleáza odštěpuje 5'-konec z buněčných heterologních mRNA, které potom slouží jako příměry pro transkripci templátů virové RNA virovou transkriptázou. Transkripty končí v místech vzdálených 15 až 22 bází od konců svých templátů, kde sekvence oligo (U) působí jako signály pro přidání úseků póly (A). Z osmi takto vytvořených molekul virové RNA je šest monocystronní „zprávy“ (messages), které jsou překládány přímo do proteinů HA, NA, NP, a proteinů virové polymerázy PB2, PB1 a PA. Dva další transkripty podléhají sestřihu (splicing), přičemž vznikají dvě mRNA, které jsou překládány v odlišných čtecích rámcích za vytvoření Ml, M2, NS1 a NEP. Jinými slovy, osm segmentů virové RNA kóduje deset proteinů. Devět strukturních a jeden nestruktumí. Souhrn genů chřipky a jejich proteinových produktů je ukázán v tabulce 1 níže.
- 1 CZ 306637 B6
Tabulka 1
Úseky genomické RNA viru chřipky a kódované polypeptidya
Úsek Délkab Kódovaný Délka Molekuly Poznámka
(nukleotidy) polypeptidc (aminokyseliny),. na virion
1 2341 PB2 759 30-60 složka RNA transkriptázy; vazba na čepičku RNA hostitelské buňky
2 2341 PB1 757 30-60 složka RNA transkriptázy; iniciace transkripce
3 2233 PA 716 30-60 složka RNA transkriptázy
4 1778 HA 566 500 hemaglutinin; trimer; glykoprotein obalu; zprostředkuje přichycení na buňky
5 1565 NP 498 1000 nukleoprotein; asociovaný s RNA; strukturní složka RNA transkriptázy
6 1413 NA 454 100 neuraminidáza; tetramer; glykoprotein obalu
7 1027 M, 252 3000 protein matrice; tvoří vnitřek obalu
m2 96 ? strukturní protein plasmatické membrány; rozštěpená mRNA
8 890 NS, 230 nestrukturní protein; funkce neznámá
5 NEP 121 ? protein exportu z jádra; rozštěpená mRNA
a upraveno z publikace R. A. Lamb a P. W. Choppin (1983), Annual Review of Biochemistry, díl 52, 467 - 506.
b pro kmen A/PR/8/34 c stanoveno biochemickými a genetickými metodami io d určeno analýzou nukleotidové sekvence a sekvenací proteinů
Genom viru chřipky typu A obsahuje osm segmentů jednořetězcové RNA s negativní polaritou kódujících jeden nestruktumí a devět strukturních proteinů. Nestrukturní protein NS1 je přítomen v nadbytku v buňkách infikovaných virem chřipky, ale nebyl detekován ve virionech. NS1 je 15 fosfoprotein, který se nachází v jádře v časné fázi infekce a v pozdějších fázích virového cyklu také v cytoplasmě (King a další, 1975, Virology 64: 378). Studie mutantu viru chřipky citlivých na teplotu (ts) nesoucích poškození genu NS ukazují na to, že protein NS1 je transkripční a posttranskripční regulátor mechanismů, kterými je virus schopen inhibovat expresi genů hostitelské buňky a stimulovat syntézu virových proteinů. Podobně jako mnoho dalších proteinů, které řídí
-2CZ 306637 B6 posttranskripční procesy, interaguje protein NS1 se specifickými sekvencemi a strukturami RNA. Uvádí se, že protein NS1 se váže na různé druhy RNA, včetně: vRNA, poly-A, U6 snRNA, 5' nepřekládané oblasti virových mRNA a dsRNA (Qiu a další, 1995, RNA 1: 304; Qiu a další, 1994, J. Virol. 68: 2425; Hatada Fukuda 1992, J. Gen. Virol. 73: 3325 - 9). Exprese proteinu NS1 z cDNA ve transfekovaných buňkách byla spojována s několika efekty: inhibicí nukleocytoplasmatického transportu mRNA, inhibicí štěpení pre-mRNA, inhibicí polyadenylace hostitelské mRNA a stimulací translace virové mRNA (Fortes, a další, 1994, EMBO J. 13: 704; Enami, a další, 1994, J. Virol. 68: 1432; de la Luna, a další, 1995, J. Virol. 69: 2427; Lu, a další, 1994, Genes Dev. 8: 1817; Park, a další, 1995, J. Biol. Chem. 270, 28433; Nemeroff, a další, 1998, Mol. Cell. 1: 1991; Chen, a další, 1994, EMBO J. 18:2273 -83).
2. Oslabené viry
Inaktivované virové vakcíny se vyrábějí „usmrcením“ virového patogenu, například teplem nebo působením formaldehydu, takže již není schopen replikace. Inaktivované vakcíny mají omezenou použitelnost, protože neposkytují dlouhodobou imunitu, a proto poskytují pouze omezenou ochranu. Alternativní přístup k výrobě virových vakcín zahrnuje použití oslabených živých virových vakcín. Oslabené viry jsou schopné replikace, ale nejsou patogenní, a proto poskytují dlouhotrvající imunitu s dosažením vyšší ochrany. Běžné metody pro výrobu oslabených virů však zahrnují náhodnou izolaci mutantu hostitelského kmene, z nichž mnohé jsou citlivé na teplotu; například virus se pasážuje na nepřirozených hostitelích, a provede se selekce potomstva virů, přičemž se vybírají kmeny, které jsou imunogenní, ale ne patogenní.
Běžným substrátem pro izolaci a množení virů chřipky pro účely vakcín jsou vejce s kuřecími embryi. Viry chřipky se typicky pěstují 2 až 4 dny při 37 °C ve vejcích stáří 10 až 11 dnů. Ačkoli většina lidských primárních izolátů virů chřipky typu A a B roste lépe v amniotickém vaku embrya, po dvou až třech pasážích se viry přizpůsobí růstu v buňkách alantoické dutiny, která je dostupná zvnějšku vejce (Murphy, B. R„ a R. G. Webster, 1996, Orthomyxoviruses, str. 1397 1445, ve Fields Virology, Lippincott-Raven P. A.)
Technologie rekombinantní DNA a genetického inženýrství by teoreticky mohly poskytnout lepší způsob výroby oslabených virů, protože specifické mutace by mohly být libovolně vpravovány do virového genomu. Genetické změny požadované pro oslabení virů však dosud nejsou známé nebo předpověditelné. Obecně byly pokusy o použití technologie rekombinantní DNA pro vytvoření virových vakcín ponejvíce zaměřeny na produkci podjednotkových vakcín, které obsahují pouze proteinové podjednotky patogenu, které se účastní imunitní odpovědi, exprimované v rekombinantních virových vektorech, jako je virus vakcinie nebo bakulovirus. V poslední době byly techniky rekombinantní DNA použity při pokusu o výrobu delečních mutant herpetického viru nebo poliovirů, které napodobují oslabené viry nalézané v přírodě, nebo známé mutanty z oblasti hostitele. Do roku 1990 nebylo možno provádět u RNA virů s negativními řetězci místně specifické manipulace vůbec, a tyto typy virů tedy nemohly být upravovány metodami genetického inženýrství.
Dosud vyrobené oslabené živé viry chřipky nemusí být schopné potlačit odpověď interferonu u hostitele, ve kterém se replikují. Přestože mají tedy tyto viry prospěšné vlastnosti z hlediska imunogenicity a nepatogenicity, je obtížné jejich pomnožení v běžných substrátech pro účely výroby vakcín.
Navíc mohou mít oslabené viry vlastnosti z hlediska virulence, která je tak mírná, že neumožňuje vytvořit hostiteli dostatečnou imunitní odpověď, která by vyhověla následujícím podáním.
-3 CZ 306637 B6
Podstata vynálezu
Předkládaný vynález se týká oslabených virů s negativními řetězci, které mají sníženou schopnost antagonizovat buněčnou odpověď IFN, a použití těchto virů ve vakcíně a ve farmaceutických prostředcích. Mutantní viry se sníženou antagonistickou aktivitou IFN jsou oslabené, tj. jsou infekční, mohou se replikovat in vivo za poskytnutí subklinických hladin infekce, a nejsou patogenní. Proto jsou ideálními kandidáty na vakcíny založené na živých virech. Navíc mohou oslabené viry indukovat silnou odpověď IFN, která má in vivo další biologické důsledky, poskytnout ochranu proti následným infekčním onemocněním a/nebo indukovat antitumorové odpovědi. Proto mohou být oslabené viry využity farmaceuticky pro prevenci nebo léčení jiných infekčních onemocnění, rakoviny u jedinců s vysokým rizikem a/nebo onemocnění léčitelných IFN.
RNA viry s negativním řetězcem používané podle předkládaného vynálezu zahrnují jak segmentované, tak i nesegmentované viry; výhodná provedení zahrnují bez omezení virus chřipky, respirační syncytiální virus (RSV), virus Newcastleského onemocnění (NDV), virus vesikulární stomatitidy (VSV), a virus parainfluenzy (PIV). Viry používané v rámci vynálezu mohou být zvoleny z kmenů vyskytujících se v přírodě, jejich variant nebo mutantu; mutagenizovaných virů (například vytvořených vystavením mutagennímu působení, opakovaným pasážováním a/nebo pasážováním v nepermisivních hostitelích); přeuspořádaných virů (reassortants) (v případě segmentovaných virových genomů); a/nebo virů upravených genetickým inženýrstvím (například použitím reverzně genetických technik) s požadovaným fenotypem, tj. sníženou schopností antagonizovat buněčnou odpověď IFN. Mutant nebo virus připravený metodami genetického inženýrství může být selektován na základě odlišného růstu v IFN-deficientních systémech proti IFN-kompetentním systémům. Například je možno vybrat viry, které rostou v IFN-deficientním systému, ale nerostou v IFN-kompetentním systému (nebo které rostou v IFN-kompetentním systému méně).
Takto vybrané oslabené viry mohou být samy o sobě použity jako účinná složka vakcíny nebo farmaceutických prostředků. Alternativně mohou být oslabené viry použity jako vektor nebo „kostra“ rekombinantně vyráběných vakcín. Z tohoto hlediska mohou být použity technologie „reverzní genetiky“ pro získání mutací nebo zavedení cizích epitopů do oslabeného viru, který by sloužil jako „rodičovský“ kmen. Tímto způsobem je možno navrhnout vakcíny pro imunizaci proti variantám kmenů nebo alternativně proti zcela odlišným infekčním činitelům, nebo antigenům onemocnění. Například oslabený virus může být upraven metodami genetického inženýrství tak, aby exprimoval neutralizační epitopy jiných vybraných kmenů. Alternativně mohou být do oslabeného mutantního viru vestavěny epitopy nebo viry jiné než RNA viry s negativním řetězcem (například gp!60, gp!20 nebo gp41 HIV). Alternativně je možno také do virů zabudovat metodami genetického inženýrství epitopy nevirových infekčních patogenů (například parazitů, bakterií nebo hub). V ještě další alternativě mohou být vyrobeny vakcíny proti rakovině, například vložením tumorových antigenu do kostry oslabeného viru metodami genetického inženýrství.
V konkrétním provedení týkajícím se viru RNA se segmentovanými genomy mohou být použity pro přenos oslabeného fenotypu z rodičovského viru se segmentovanou RNA (přirozený mutant, mutagenizovaný virus nebo virus získaný metodou genetického inženýrství) na odlišný kmen viru (standardní typ viru, přírodní mutant, mutagenizovaný virus nebo virus získaný metodou genetického inženýrství) techniky přeuspořádání (reassortment).
Oslabené viry, které indukují silné odpovědi IFN u hostitelů, mohou být také použity ve farmaceutických prostředcích pro prevenci nebo léčení jiných virových infekcí nebo onemocnění léčitelných IFN, jako je rakovina. V tomto smyslu může být tropismus oslabeného viru změněn tak, aby zacílil virus na požadovaný cílový orgán, tkáň nebo buňky in vivo nebo ex vivo. S použitím tohoto přístupu může být odpověď IFN indukována lokálně, v cílovém místě, a tím je možno zabránit nebo minimalizovat vedlejší účinky systémových léčení IFN. Z tohoto hlediska může
-4CZ 306637 B6 být oslabený virus upraven metodami genetického inženýrství tak, aby exprimoval ligand specifický pro receptor cílového orgánu, tkáně nebo buněk.
Vynález je z části založen na objevu přihlašovatelů, že NS1 standardního typu viru chřipky funguje jako antagonista IFN tím, že NS1 inhibuje odpověď hostitelských buněk infikovaných virem zprostředkovanou IFN. Bylo zjištěno, že mutanty virů s chybějící aktivitou NS1 jsou silnými induktory buněčné odpovědi IFN, a bylo ukázáno, že mají in vivo oslabený fenotyp; tj. mutantní viry se replikují in vivo, ale mají snížené patogenní účinky. I když si autoři nepřejí být vázáni jakoukoli teorií nebo vysvětlením způsobu, jakým vynález pracuje, oslabené vlastnosti virů podle vynálezu jsou pravděpodobně způsobeny jejich schopností indukovat silnou buněčnou odpověď IFN a jejích zmenšenou schopností antagonizovat odpověď IFN hostitele. Prospěšné vlastnosti oslabených virů podle předkládaného vynálezu však nemohou být připisovány výlučně účinkům na buněčnou interferonovou odpověď. K požadovanému oslabenému fenotypu mohou ovšem přispívat změny v dalších aktivitách spojených s NS1.
Mutantní viry chřipky s oslabenou antagonistickou aktivitou IFN se podle zjištění replikují in vivo za vytvoření titrů, které jsou dostatečné pro indukci imunologických a cytokinových odpovědí. Například vakcinace oslabeným virem chřipky snížila titr viru u zvířat, kteiým byl následně zkušebně podán virus chřipky standardního typu. Ukázalo se, že oslabené viry chřipky mají také antivirové a antitumorové účinky. Předchozí infekce oslabeným virem chřipky inhibovala replikaci jiných kmenů viru chřipky standardního typu a jiných virů (jako virus Sendai), kterými byla embrya ve vejcích infikována. Inokulace oslabeného viru chřipky u zvířat, jimž byly vstříknuty tumorové buňky, snížila počet vytvořených ohnisek. Protože je známo, že virus chřipky indukuje odpověď CTL (cytotoxických T-lymfocytů), oslabený virus je velmi přitažlivým kandidátem na vakcíny proti rakovině.
Mutace, které zmenší, ale neodstraní antagonistickou aktivitu IFN viru, jsou výhodné pro tvoření vakcín - takové viry mohou být selektovány na růst jak v konvenčních, tak i nekonvenčních substrátech, a na virulenci střední síly. Přihlašovatelé zvláště ukázali, že mutant NS1 se zkráceným C-koncem se replikuje na vysoké titry v substrátech deficientních na IFN, jako jsou 6- a 7-denní kuřecí embrya, stejně jako v alantoické membráně desetidenních kuřecích embryí, což je běžný substrát pro virus chřipky, který nedovolí růst mutantu viru chřipky, ve kterých došlo k deleci celého genu NS1 (dále označované jako ztrátové (knockout) mutanty). Replikace mutantu s NSl-C-koncovým zkrácením je však zmenšena u dvanáctidenních kuřecích embryí. Tento přístup umožňuje poprvé vytvořit a identifikovat živé oslabené RNA viry s negativním řetězcem, které mají změněnou, ale nikoli odstraněnou antagonistickou aktivitu IFN, a které jsou schopné růst v substrátech vhodných pro přípravu vakcín. Tento přístup také poprvé umožňuje získat účinný selekční identifikační systém pro chřipku nebo jiné viry, které obsahují mutace poskytující změněnou, ale nikoli odstraněnou, antagonistickou aktivitu interferonu.
Vynález se také týká použití IFN-deficientních systémů pro propagaci oslabených virů, které nemohou růst v běžných systémech, které se v současnosti používají pro výrobu vakcín. Termín „IFN-deficientní systémy“, jak se zde používá, označuje systémy, například buňky, buněčné linie a živočichy, jako jsou myši, kuřata, krocani, králíci, krysy apod., které neprodukují IFN nebo produkují nízké hladiny IFN, neodpovídají na IFN nebo na něj odpovídají méně efektivně, a/nebo jsou deficientní na aktivitu antivirových genů indukovaných IFN. Z tohoto hlediska přihlašovatelé identifikovali nebo navrhli celou řadu IFN-deficientních systémů, které mohou být použity, včetně bez omezení mladých kuřecích embryí, IFN-deficientních buněčných linií (jako jsou buňky VĚRO nebo buněčné linie získané metodami genetického inženýrství, jako jsou ztrátové mutanty STATI). Alternativně mohou být kuřecí embrya nebo buněčné linie předem zpracovány sloučeninami, které inhibují systém IFN (včetně léčiv, protilátek, antisense řetězců, ribozymů atd.).
-5CZ 306637 B6
V dalším provedení se zahrnuje použití vajec deficientních na systém IFN, například vajec produkovaných STATI-negativními ptáky, zvláště drůbeží, včetně bez omezení transgenních kuřat, kachen nebo krocanů.
Objasnění výkresů
Obr. 1. Virus delNSl inhibuje replikaci viru chřipky typu A ve vejcích. Desetidenní kuřecí embrya byla očkována uvedenými pfu viru delNSl. O osm hodin později byla vejce infikována 103 pfu viru WSN. Po dvou dnech inkubace při 37 °C byla oddělena alantoická kapalina a testem tvorby plaků na buňkách MDBK byly zjištěny titry viru WSN. Výsledky jsou průměrné hodnoty ze dvou vajec.
Obr. 2. Indukce antivirové odpovědi u kuřecích embryí virem delNSl. Desetidenní kuřecí embrya byla očkována PBS (neošetřená kontrola) nebo 2 x 104 pfu viru delNSl (ošetřeno delNSl). O osm hodin později byla vejce infikována 103 pfu viru chřipky A/WSN/33 (HIN 1), viru chřipky A/PR8/34 (H+Nl), viru chřipky A/X-31 (H3N2), viru chřipky B/Lee/40 nebo viru Sendai. Po dvou dnech inkubace byla alantoická kapalina sklizena a testem hemaglutinace byly zjištěny titry virů. Výsledky jsou průměrné hodnoty ze dvou vajec.
Obr. 3. Buňky CV1 byly transfekovány plasmidem exprimujícím IRF-3 fúzovaný se zeleně fluoreskujícím proteinem (green fluorescent protein, GFP). To umožnilo zjištění lokalizace IRF-3 uvnitř buněk fluorescenční mikroskopií. V některých případech byl expresní plasmid NS1 kotransfekován v uvedených poměrech expresním plasmidem IRF-3. Buňky 24 h po transfekci byly infikovány při vysokém moi PR8 (WT) nebo virem delNSl, jak je označeno. Deset hodin po infekci byly buňky analyzovány ve fluorescenčním mikroskopu na lokalizaci IRF-3 GFP. Je ukázáno procento buněk vykazujících výlučně cytoplasmatickou lokalizací (CYT) a jak cytoplasmatickou, tak i jadernou lokalizaci IRF-3 (Nuc+Cyt).
Podrobný popis vynálezu
Předkládaný vynález se týká vytváření, selekce a identifikace oslabených RNA virů s negativním řetězcem, které mají sníženou schopnost antagonizovat buněčnou odpověď IFN, a použití těchto virů ve vakcíně a farmaceutických prostředcích.
Tyto viry mohou mít segmentované nebo nesegmentované genomy a mohou být zvoleny z kmenů vyskytujících se v přírodě, variant nebo mutantu; mutagenizovaných virů (získaných například expozicí UV záření, mutagenům a/nebo pasážováním); přeuspořádaných virů (v případě virů se segmentovanými genomy); a/nebo virů získaných metodami genetického inženýrství. Mutantní viry mohou být například vytvářeny přírodní variací, vystavením UV záření, expozicí chemickým mutagenům, pasážováním v nepermisivních hostitelích, přeuspořádáním (tj. souběžnou infekcí oslabeného segmentovaného viru dalším kmenem s požadovanými antigeny) a/nebo metodami genetického inženýrství (například použitím „reverzně genetických“ způsobů). Viry vybrané pro použití v rámci předkládaného vynálezu mají defektní IFN-antagonistickou aktivitu a jsou oslabené; jsou tedy infekční a mohou se replikovat in vivo, ale tvoří pouze nízké titry, což vede k subklinickým hladinám infekce, které jsou nepatogenní. Tyto oslabené viry jsou ideálními kandidáty na živé vakcíny. Ve výhodném provedení by měly být oslabené viry vybrané pro použití v rámci předkládaného vynálezu schopné indukovat silnou odpověď IFN hostiteli, což je vlastnost, která přispívá k vytvoření silné imunitní odpovědi při použití vakcíny, a což má další biologické důsledky, které způsobují užitečnost viru jako farmaceutického prostředku pro prevenci a/nebo léčení jiných virových infekcí nebo tvorby tumorů u jedinců s vysokým rizikem, nebo dalších onemocnění, která se léčí IFN.
-6CZ 306637 B6
Vynález je z části založen na celé řadě objevů a pozorování učiněných přihlašovateli při práci s mutanty viru chřipky. Tyto principy však mohou být analogicky aplikovány a extrapolovány na jiné segmentované a nesegmentované RNA viry s negativními řetězci, včetně bez omezení paramyxovirů (virus Sendai, virus parainfluenzy, virus příušnic, virus Newcastleské nemoci), morbilivirů (virus spalniček, virus psinky a virus dobytčího moru); pneumovirů (respirační syncytiální virus a bovinní respirační virus); a rhabdovirů (virus vezikulámí stomatitidy a virus vztekliny).
IFN odpověď je za prvé důležitá pro potlačení virové infekce in vivo. Přihlašovatelé zjistili, že růst viru chřipky standardního typu A/WSN/33 v IFN-deficientních myších (myši STATI-/-) vedl k infekci všech orgánů; tj. virová infekce nebyla omezena na plíce, jak je tomu u standardních myší, které vytvářejí odpověď IFN (Garcia-Sastre, a další, 1998, J. Virol. 72: 8550, zařazeno odkazem jako celek). Za druhé, přihlašovatelé zjistili, že NS1 viru chřipky funguje jako antagonista IFN. Přihlašovatelé objevili, že mutant viru chřipky s deletovaným celým genem NS1 (tj. „NS1 ztrátový“) nebyl schopen růst do vysokých titrů v IFN-kompetentních hostitelských buňkách, a mohl být propagován pouze v IFN-deficientních hostitelských buňkách. NSl-ztrátový virus vykazoval oslabený fenotyp (tj. byl letální u IFN-deficientní myši STATI-/-, ale nikoli u myši standardního typu) a bylo zjištěno, že je silným induktorem odpovědi IFN v hostitelských buňkách (Garcia-Sastre, a další, 1998, Virology 252: 324 - 330, který se zařazuje ve svém celku odkazem). Předinfekce s NSl-ztrátovým mutantním virem snížila titry chřipky standardního typu a jiných virů (např. Sendai), kterými byla embrya navíc infikována. V dalším experimentu snížila infekce NSl-ztrátovým mutantem viru chřipky tvorbu ohnisek u zvířat, kterým byly naočkovány tumorové buňky. NSl-ztrátový virus chřipky tedy ukázal zajímavé biologické vlastnosti. NS1ztrátové mutantní viry však nemohly být pomnožovány v běžných systémech pro výrobu vakcín. Aby bylo možno předejít tomuto problému, přihlašovatelé použili a vyvinuli IFN-deficientní systémy, které umožňují produkci oslabeného viru s rozumnými výtěžky.
Navíc přihlašovatelé navrhli deleční mutanty NS1, u kterých nechybí celý gen. Překvapivě bylo zjištěno, že tyto mutanty NS1 mají fenotyp „meziproduktu“ - virus je možno pěstovat v běžných hostitelích používaných pro pomnožování viru chřipky (i když růst je lepší v IFN-deficientních systémech, kde se dosahuje vyšších titrů). Co je nejdůležitější, deleční mutanty jsou oslabené in vivo a indukují silnou odpověď IFN. Vakcinace NSl-zkrácenými mutanty viru chřipky vedla k nízkým titrům viru u zvířat, kterým byl potom zkušebně podán virus standardního typu, a poskytovala ochranu proti onemocnění.
Předkládaný vynález se také týká substrátů navržených pro izolaci, identifikaci a růst virů pro účely vakcín. Popisují se zvláště substráty deficientní na interferon pro účinné pěstování mutantu viru chřipky. Podle předkládaného vynálezu je substrát deficientní na interferon takový substrát, který má nedostatečnou schopnost produkovat interferon, nebo na něj odpovídat. Substrát podle předkládaného vynálezu může být použit pro růst jakýchkoli virů, které mohou vyžadovat růstové prostředí deficientní na interferon. Tyto viry mohou bez omezení zahrnovat paramyxoviry (virus Sendai, virus parainfluenzy, virus příušnic, virus Newcastleské nemoci), morbiliviry (virus spalniček, virus psinky a virus dobytčího moru); pneumoviry (respirační syncytiální virus a bovinní respirační virus); a rhabdoviry (virus vezikulární stomatitidy a virus vztekliny).
Vynález se také týká použití oslabeného viru podle vynálezu ve vakcínách a farmaceutických prostředcích pro viry nebo zvířata. Oslabené viry mohou být zvláště použity jako vakcíny proti širokému spektru virů a/nebo antigenu, včetně bez omezení antigenu variant kmenů, odlišných virů nebo jiných infekčních patogenů (například bakterií, parazitů a hub) nebo antigenu specifických proti tumorům. V dalším provedení mohou být oslabené viry, které inhibují virovou replikaci a tvorbu tumorů použity pro prevenci nebo léčení infekce (virovými nebo nevirovými patogeny) nebo tvorby tumorů nebo léčení onemocnění, pro které interferon přináší terapeutický prospěch. Pro zavádění prostředků s obsahem živého oslabeného viru do člověka nebo zvířete, u kterých má dojít k indukci imunitní nebo příslušné cytokinové odpovědi, může být použito různých metod. Sem patří bez omezení intranazální, intratracheální, orální, intradermální, intra
-7 CZ 306637 B6 muskulární, intraperitoneální, intravenózní a subkutánní cesty podávání. Ve výhodném provedení se oslabené viry podle předkládaného vynálezu formulují pro intranazální podávání.
Tvorba mutantů se změněnou antagonistickou aktivitou vůči IFN
Podle předkládaného vynálezu může být selektován a použit jakýkoli mutantní virus nebo kmen, který má sníženou antagonistickou aktivitu vůči IFN. V jednom provedení je možno provést selekci v přírodě se vyskytujících mutantu nebo variant nebo spontánních mutantu, které mají sníženou schopnost antagonizovat buněčnou odpověď IFN. V dalším provedení je možno vytvářet mutantní viry vystavením viru působení mutagenů, jako je ultrafialové záření nebo chemické mutageny, nebo vícenásobným pasážováním a/nebo pasážováním v nepermisivních hostitelích. Pro selekci na mutanty s omezenou IFN-antagonistickou funkcí může být použit screening v diferenciálním růstovém systému. V případě virů se segmentovanými genomy může být oslabený fenotyp převeden do jiného kmene s požadovaným antigenem přeuspořádání, tj. společnou infekcí oslabeného viru a požadovaného kmene, a selekcí na přeuspořádané varianty vykazující oba fenotypy.
V dalším provedení mohou být mutace zavedeny do RNA viru s negativním řetězcem jako je chřipka, RSV, NDV, VSV a PIV, metodami genetického inženýrství s použitím přístupu „reverzní genetiky“. Tímto způsobem je možné zavést do vakcinačních kmenů přírodní nebo jiné mutace, které kmenu propůjčují oslabený fenotyp. Metodami genetického inženýrství je například možné získat delece, inzerce nebo substituce kódující oblasti genu odpovědného za IFNantagonistické aktivity (jako je NS1 chřipky). Jsou možné také delece, substituce nebo inzerce v nekódující oblasti genu, odpovědného za IFN-antagonistickou aktivitu. Metodami genetického inženýrství mohou také být získány mutace signálů odpovědných za transkripci, replikaci, polyadenylaci a/nebo sbalování genu odpovědného za IFN-antagonistickou aktivitu. Například v případě chřipky mohou takové modifikace bez omezení zahrnovat: substituci nekódujících oblastí genu viru chřipky typu A nekódujícími oblastmi genu viru chřipky typu B (Muster, a další, 1991, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 88: 5177), záměny párů bází v nekódujících oblastech genu viru chřipky (Fodor, a další, 1998, J. Virol. 72: 6283), mutace v promotorové oblasti genu viru chřipky (Piccone, a další, 1993, Virus Res. 28: 99; Li, a další, 1992, J. Virol. 66: 4331), substituce a delece v řadě uridinových zbytků na 5'-konci genu viru chřipky ovlivňují polyadenylaci (Luo, a další, 1991, J. Virol. 65: 2861; Li, a další, J. Virol. 1994, 68(2): 1245 - 9). Takové mutace, například promotoru, by mohly snížit expresi genu odpovědného za IFN-antagonistickou aktivitu. Mutace ve virových genech, které mohou regulovat expresi genu odpovědného za IFNantagonistickou aktivitu, spadají také do rozsahu virů, které mohou být použity podle předkládaného vynálezu.
Předkládaný vynález se také týká mutací segmentu genu NS1, které nemusí vést ke změněné IFN—antagonistické aktivitě nebo změněnému IFN—indukujícímu fenotypu, ale mohou vést spíše ke změněným virovým funkcím a oslabenému fenotypu, například změněná inhibice exportu mRNA obsahující poly(A) z jádra, změněná inhibice aktivace PKR sekvestrací dsRNA, změněný vliv na translaci virové RNA a změněná inhibice polyadenylace u hostitelské mRNA (viz Krug, Textbook of Influenza, Nicholson, a další, ed. 1998, 82-92, a tam uvedené odkazy).
Techniky reverzní genetiky zahrnují přípravu syntetických rekombinantních virových RNA, které obsahují nekódující oblasti viru RNA s negativním řetězcem, které jsou nezbytné pro rozpoznávání virovými polymerázami a pro signály sbalování nezbytné k vytvoření zralého virionu. Rekombinantní RNA jsou syntetizovány z rekombinantního templátů DNA a rekonstituovány in vitro_purifikovaným komplexem virové polymerázy za vytvoření rekombinantních ribonukleoproteinů (RNP), které mohou být použity pro transfekci buněk. Účinnější transfekce se dosahuje, jestliže jsou proteiny virové polymerázy přítomny v průběhu transkripce syntetických RNA buď in vitro, nebo in vivo. Syntetické rekombinantní RNP mohou být vneseny zpět do infekčních virových částic. Následující techniky se popisují v patentu US 5 166 057 uděleném 24. listopadu 1992; v patentu US 5 854 037 uděleném 29. prosince 1998; v evropské zveřejněné patentové
-8CZ 306637 B6 přihlášce EP 0 702 085 Al, zveřejněné 20. února 1996; v patentové přihlášce US 09/152 845; v mezinárodních zveřejněných patentových přihláškách PCT WO 97/12 032 zveřejněné 3. dubna 1997; WO 96/34 625 zveřejněné 7. listopadu 1996; v evropské patentové zveřejněné přihlášce EP A 780 475; WO 99/02 657 zveřejněné 21. ledna 1999; WO 98/53 078 zveřejněné 26. listopadu 1998; WO 98/02 530 zveřejněné 22. ledna 1998; WO 99/15 672 zveřejněné 1. dubna 1999; WO 98/13 501 zveřejněné 2. dubna 1998; WO 97/06 270 zveřejněné 20. února 1997; a EP 0 780 475 AI zveřejněné 25. června 1997, přičemž všechny tyto dokumenty se zařazují jako celek odkazem.
Oslabené viry vytvořené metodami reverzní genetiky mohou být použity v popisovaných vakcínách a farmaceutických prostředcích. Techniky reverzní genetiky mohou být také použity pro zavedení dalších mutací metodami genetického inženýrství do jiných virových genů důležitých pro výrobu vakcíny - tj. do oslabeného viru mohou být metodami genetického inženýrství zavedeny epitopy užitečných variant vakcinačního kmene. Do oslabeného řetězce mohou být metodami genetického inženýrství také alternativně zavedeny úplně cizí epitopy včetně antigenu odvozených z jiných virových nebo nevirových patogenů. Do oslabeného kmene mohou být metodami genetického inženýrství zavedeny například antigeny nepříbuzných virů jako je HIV (gp!60, gp!20, gp41), antigeny parazitů (například malárie), antigeny bakterií nebo hub nebo tumorové antigeny. Alternativně mohou být do chimérických oslabených virů podle předkládaného vynálezu zavedeny epitopy, které mění tropismus viru in vivo.
V odlišném provedení mohou být pro získání oslabených virů s požadovanými epitopy v segmentovaných RNA virech použity kombinace technologií reverzní genetiky a technologií přeuspořádání. Například oslabený virus (vytvořený přirozenou selekcí, mutagenezí nebo metodami reverzní genetiky) a kmen nesoucí požadovaný epitop vakcíny (vytvořený přirozenou selekcí, mutagenezí nebo metodami reverzní genetiky) mohou být zavedeny společnou infekcí do hostitele, který umožňuje přeuspořádání segmentovaných genomů. Potom je možné provést selekci přeuspořádaných genotypů, které mají jak oslabený fenotyp, tak i obsahují požadovaný epitop.
V dalším provedení je mutovaným virem virus DNA (např. virus vakcinie, adenovirus, bakulovirus) nebo virus s pozitivním řetězcem RNA (např. poliovirus). V takových případech mohou být také použity techniky rekombinantní DNA, které jsou dobře známé v oboru (viz například patent US 4 769 330 Paoletti, patent US 4 215 051 Smith, z nichž oba jsou zařazeny ve svém celku odkazem.
Metodami genetického inženýrství podle předkládaného vynálezu může být získán jakýkoli virus, včetně bez omezení skupin uvedených v tabulce 2 níže.
Tabulka 2
Skupiny lidských a živočišných virů
Vlastnosti viru dsDNA s obalem
Bez obalu
Skupina viru
Poxviridae Irididoviridae Herpesviridae
Adenoviridae Papovaviridae Hepadnaviridae
-9CZ 306637 B6
ssDNA bez obalu Parvoviridae
dsRNA Reoviridae
bez obalu Birnaviridae
ssRNA s obalem Togaviridae
Genom s pozitivním řetězcem Bez kroku DNA při replikaci Flaviviridae Coronaviridae Hepatitis C Virus
S krokem DNA při replikaci Retroviridae
Genom s negativním řetězcem Nesegmentovaný genom Paramyxoviridae Rhabdoviridae Filoviridae
Segmentovaný genom Orthomyxoviridae Bunyaviridae Arenaviridae
Bez obalu Picornaviridae Caliciviridae
Použité zkratky: ds = dvojřetězcový; ss = jednořetězcový; s obalem = obsahují vnější lipidovou dvojvrstvu odvozenou z membrány hostitelské buňky; genom s pozitivním řetězcem = pro RNA viry, genomy, které jsou složené z nukleotidových sekvencí, které se přímo překládají na ribozomech, = pro viry DNA, genomy, které jsou složené z nukleotidových sekvencí stejných jako mRNA; genom s negativním řetězcem = genomy, které jsou složené z nukleotidových sekvencí komplementárních k řetězci s pozitivním (kódujícím) řetězcem.
Ve výhodném provedení se předkládaný vynález týká virů chřipky získaných metodami genetického inženýrství, které obsahují delece a/nebo zkrácení genového produktu NS1. NSl-mutanty chřipky typu A a B jsou zvláště výhodné. V jednom přístupu se zachovají části aminokoncové oblasti genového produktu NS1, zatímco dojde k deleci C-koncové oblasti genového produktu NS1. Konkrétní požadované mutace mohou být získány vložením nukleové kyseliny, deleci nebo mutací na příslušném kodonu. Zkrácené proteiny NS1 mají zvláště 1 až 60 aminokyselin, 1 až 70 aminokyselin, 1 až 80 aminokyselin, 1 až 90 aminokyselin (N-koncová aminokyselina je označena jako 1), a s výhodou 90 aminokyselin; od 1 do 100 aminokyselin, a s výhodou 99 aminokyselin; od 1 do 110 aminokyselin; od 1 do 120 aminokyselin; nebo od 1 do 130 aminokyselin, a s výhodou 124 aminokyselin genového produktu NS1 standardního typu.
Předkládaný vynález se také týká jakéhokoli viru chřipky získaného metodami genetického inženýrství, ve kterém byl genový produkt NS1 modifikován zkrácením nebo úpravou proteinu NS1, který propůjčuje mutantním virům následující fenotypy: schopnost virů růst do vysokých titrů v neobvyklých substrátech, jako jsou šesti až sedmidenní kuřecí embrya, nebo schopnost virů indukovat interferonovou odpověď hostitele. V případě virů chřipky typu A sem bez omezení patří viry se zkráceným NS 1.
Předkládaný vynález zahrnuje jakékoli použití v přírodě se vyskytujících mutantních virů chřipky typu a nebo B s oslabeným fenotypem, stejně jako kmeny viru chřipky získané metodami genetického inženýrství tak, aby obsahovaly mutace odpovědné za oslabený fenotyp. Pro viry chřipky typu A sem bez omezení patří viry s NS1 o délce 124 aminokyselin (Norton, a další, 1987, Viro
- 10CZ 306637 B6 logy 156: 204 - 213, zařazeno jako celek odkazem). Pro viry chřipky typu B sem bez omezení patří viry se zkrácenou mutací NSI obsahující 110 aminokyselin odvozených zN-konce (B/201) (Norton, a další, 1987, Virology 156: 204 - 213, zařazeno jako celek odkazem), a viry se zkrácenou mutací NSI obsahující 89 aminokyselin odvozených z N-konce (B/AWBY-234) (Tobita, a další, 1990, Virology 174: 314 - 19, zařazeno jako celek odkazem). Předkládaný vynález zahrnuje použití v přírodě se vyskytujících mutantních analogů pro NS1/38, NS1/80, NS1/124, (Egorov, a další, 1998, J. Virol. 72 (8): 6437 - 41), stejně jako v přírodě se vyskytující mutanty A/Turkey/ORE/71, B/201 nebo B/AWBY-234.
Oslabený virus chřipky může být metodami genetického inženýrství dále upraven tak, aby exprimoval antigeny jiných vakcinaěních kmenů (například použitím metod reverzní genetiky nebo přeuspořádání). Alternativně může být získán metodou genetického inženýrství oslabený virus chřipky použitím reverzní genetiky nebo přeuspořádání s viry získanými metodami genetického inženýrství, pro expresi zcela cizích epitopů, například antigenu jiných infekčních patogenů, tumorových antigenu nebo cílených antigenu. Protože segment NS RNA je mezi osmi virovými RNA nejkratší, je možné, že bude NS RNA tolerovat delší inzerce heterologních sekvencí než jiné virové geny. Navíc segment NS RNA řídí syntézu vysokých koncentrací proteinu v infikovaných buňkách, což může ukazovat na to, že by byl ideálním segmentem pro inzerce cizích antigenu. Podle předkládaného vynálezu však může být pro inzerci heterologních sekvencí použit jakýkoli z osmi segmentů virů chřipky. Jestliže se například požaduje prezentace povrchového antigenu, mohou být použity segmenty kódující strukturní proteiny, například HA nebo NA.
Selekční systém založený na omezení hostitele
Vynález zahrnuje způsoby selekce virů, které mají požadovaný fenotyp, tj. virů, které mají nízkou nebo žádnou IFN-antagonistickou aktivitu, ať už jsou získány z přírodních variant, spontánních variant (tj. variant, které se vyvinou při pomnožování viru), mutagenizovaných přírodních variant, přeuspořádaných virů a/nebo virů získaných metodami genetického inženýrství. U těchto virů je nej lepší provést screening testy rozdílného růstu, které porovnávají růst v IFN-deficientních a v IFN-kompetentních hostitelských systémech. Viry, které prokážou lepší růst v IFNdeficientních systémech ve srovnání s IFN-kompetentními systémy, se vyberou. S výhodou se zvolí viry, které rostou v IFN-deficientních systémech do titrů alespoň o řád vyšších než v IFNkompetentním systému.
Alternativně je možno provést screening virů použitím systémů s testováním IFN, například testovacích systémů založených na transkripci, při kterých se exprese reporterového genu řídí promotorem reagujícím na IFN. Exprese reporterového genu v infikovaných buňkách ve srovnání s neinfikovanými buňkami může být měřena pro identifikaci virů, které účinně indukují odpověď IFN, ale které jsou neschopné antagonizovat odpověď IFN. Ve výhodném provedení se však používají pro selekci virů s požadovaným fenotypem testy rozdílného růstu, protože použitý hostitelský systém (IFN-kompetentní proti IFN-deficientnímu) vykonává příslušný selekční tlak.
Například růst viru (měřený titrem) může být porovnán v celé řadě buněk, buněčných linií nebo modelových zvířecích systémech, které exprimují IFN a složky odpovědi IFN proti buňkám, buněčným liniím nebo modelovým zvířecím systémům, které jsou deficientní na IFN nebo složky odpovědi IFN. Z tohoto hlediska je možno porovnat růst viru v buněčných liniích jako jsou buňky VĚRO (které jsou IFN-deficientní) proti buňkám MDCK. (které jsou IFN-kompetentní). Alternativně mohou být IFN-deficientní buněčné linie odvozeny a vytvořeny ze zkřížených zvířat, nebo mohou být získány metodami genetického inženýrství tak, aby byly deficientní na systém INF (např. mutantní myš STATI-/-). Je možno měřit růst viru v těchto buněčných liniích ve srovnání s IFN-kompetentními buňkami, odvozenými například ze zvířat standardního typu (například myš standardního typu). V dalším provedení je možno upravit buněčné linie, které jsou IFN—kompetentní a o nichž je známo, že podporují růst viru standardního typu, metodami genetického inženýrství tak, aby byly IFN-deficientní (například ztrátové mutanty STATI, IRF3, PKR, atd.). Je možno použít způsobů propagace virů v buněčných liniích dobře známých v oboru
- 11 CZ 306637 B6 (viz například pracovní příklady dále). Je možno porovnávat růst viru ve standardní 1FNkompetentní buněčné linii proti buněčné linii IFN-deficientní, získané metodami genetického inženýrství.
Mohou být také použity zvířecí systémy. Například v případě chřipky je možno porovnávat růst v mladých, IFN-deficientních kuřecích embryích, například přibližně šest až přibližně osm dnů starých, s růstem ve starších, IFN-kompetentních vejcích, o stáří například deset až dvanáct dnů. Pro tento účel mohou být použity techniky infekce a propagace ve vejcích známé v oboru (například viz pracovní příklady níže). Alternativně může být porovnáván růst v IFN-deficientní myší STATI-/- s IFN-kompetentní myší standardního typu. V ještě další alternativě může být porovnáván růst v IFN-deficientních vejcích, poskytovaných například STATI-/- transgenní drůbeží, s růstem v IFN-kompetentních vejcích vytvořených drůbeží standardního typu.
Pro účely screeningu však mohou být namísto geneticky manipulovaných systémů použity přechodné (tranzientní) IFN-deficientní systémy. Například hostitelský systém může být ošetřen sloučeninami, které inhibují produkci IFN a/nebo složky odpovědi IFN (například léčiva, protilátky proti IFN, protilátky proti receptoru IFN, inhibitory PKR, molekuly a antisense ribozymy atd.). Růst viru může být porovnáván v IFN-kompetentních neošetřených kontrolách, a IFNdeficientních ošetřených systémech. Například starší vejce, která jsou IFN-kompetentní, mohou být ošetřena těmito léčivy před infekcí viru, u kterého se provádí screening. Růst se porovnává s růstem dosahovaným v neošetřených kontrolních vejcích stejného stáří. Metody screeningu podle předkládaného vynálezu poskytují jednoduchou a snadnou metodu systematického prozkoumávání pro identifikaci mutantních virů se sníženou IFN-antagonistickou aktivitou tím, že mutantní virus není schopen růst v prostředích reagujících na IFN ve srovnání se schopností mutantního viru růst v IFN-deficientních prostředích. Metody screeningu podle předkládaného vynálezu mohou být také použity pro identifikaci mutantních virů se změněnou, ale nikoli oslabenou antagonistickou aktivitou, měřením schopnosti mutantního viru růst jak v IFN-responsivních, například desetidenních embryích nebo buňkách MDCK, a v prostředích IFN-deficientních, například šesti až sedmidenních embryích nebo buňkách Věro. Například viry chřipky vykazující alespoň o jeden řád nižší titry v desetidenních vejcích, ve srovnání s šesti až sedmidenními vejci, jsou považovány za částečně neschopné antagonizovat odpověď IFN, a proto jsou přijatelnými kandidáty na vakcínu.
Metody selekce podle vynálezu také zahrnují identifikaci těch mutantních virů, které indukují odpovědi IFN. V souladu s metodami selekce podle vynálezu je možno měřit indukci odpovědí IFN testováním úrovní exprese IFN nebo exprese cílových genů nebo reportérových genů indukovaných IFN po infekci mutantním virem nebo aktivaci transaktivátoru, který se účastní exprese IFN a/nebo odpovědi IFN.
V ještě dalším provedení selekčních systémů podle vynálezu je možno určit indukci odpovědí IFN měřením fosforylovaného stavu složek biochemické cesty IFN po infekci testovaným mutantním virem, například IRF-3, který je fosforylován jako odpověď na dvoj řetězcovou RNA. Jako odpověď na IFN typu I jsou rychle na tyrosinech fosforylovány Jakl kináza a TyK.2 kináza, podjednotky receptoru IFN, STATI a STAT2. Pro určení, zda mutantní virus indukuje odpovědi IFN, se tedy infikují buňky, jako buňky 293, testovaným mutantním virem a po infekci se buňky lyžují. Složky biosyntézy IFN, jako je kináza Jakl nebo kináza TyK2, se imunoprecipitují z lyzátů infikované buňky s použitím specifických polyklonálních sér nebo protilátek, a stav s fosforylovaným tyrosinem kinázy se určí metodami imunologického přenosu s antifosfotyrosinovou protilátkou (viz např. Krishnan, a další, 1997, Eur. J. Biochem. 247: 298 - 305). Zvýšený fosforylovány stav jakékoli ze složek biosyntézy IFN po infekci mutantním virem by ukazoval na indukci odpovědí IFN mutantním virem.
V ještě dalším provedení zahrnují selekční systémy podle vynálezu měření schopnosti vázat specifické sekvence DNA nebo translokace transkripčních faktorů indukované jako odpověď na virovou infekci, například IRF3, STATI, STAT2 atd. Zvláště STATI a STAT2 jsou fosforylová
- 12 CZ 306637 B6 ny a přemisťovány z cytoplasmy do jádra jako odpověď na IFN typu I. Schopnost vázat specifické sekvence DNA nebo přemisťování transkripčních faktorů je možno měřit technikami známými odborníkům v oboru, například testem posunu elektromobility v gelu, barvením buněk apod.
V ještě dalším provedení selekčních systémů podle vynálezu je možno zjišťovat indukci odpovědí IFN měřením IFN-dependentní transkripční aktivace po infekci testovaným mutantním virem. V tomto provedení je možno analyzovat expresi genů, o kterých je známo, že jsou indukovány IFN, například Mx, PKR, 2-5-oligoadenylátsyntetáza, hlavní histokompatibilitní komplex (MHC) třídy I apod., přičemž se používají způsoby známé odborníkům v oboru, jako jsou northemový přenos, westernový přenos, PCR atd.
Alternativně se metodami genetického inženýrství upraví testovací buňky, jako jsou lidské embryonální ledvinové buňky, nebo buňky lidského osteogenního sarkomu, tak, aby přechodně nebo konstitučně exprimovaly reportérové geny, jako je luciferázový reportérovy gen nebo reportérovy gen chloramfenikoltransferázy (CAT), pod řízením prvku odpovědi stimulovaného interferonem, jako je promotor genu ISG-54K stimulovaného IFN (Bluyssen, a další, 1994, Eur. J. Biochem. 220: 395 - 402). Buňky se infikují testovaným mutantním virem a míra exprese reporterového genu se porovnává s expresí v neinfikovaných buňkách nebo buňkách infikovaných virem standardního typu. Zvýšení míry exprese rekordérového genu po infekci testovaným virem by naznačovalo, že testovaný mutantní virus indukuje odpověď IFN.
V ještě dalším provedení zahrnují selekční systémy podle vynálezu měření indukce IFN zjištěním, zda extrakt z buňky nebo vejce infikovaných testovaným mutantním virem je schopen propůjčovat ochrannou aktivitu proti virové infekci. Konkrétněji se skupiny desetidenních kuřecích embryí infikují testovaným mutantním virem nebo virem standardního typu. Přibližně 15 až 20 hodin po infekci se sklidí alantoická kapalina a testuje se na aktivitu IFN určením nejvyššího ředění, které se ještě vyznačuje ochranným účinkem proti infekci VSV v buňkách tkáňové kultury, jako jsou buňky CEF.
Pomnožování viru v růstových substrátech deficientních na interferon
Vynález také zahrnuje způsoby a IFN-deficientní substráty pro růst a izolaci v přírodě se vyskytujících nebo metodami genetického inženýrství získaných mutantních virů, které mají změněnou antagonistickou aktivitu vůči IFN. IFN-deficientní substráty, které mohou být použity pro podporu růstu oslabených mutantních virů zahrnují bez omezení v přírodě se vyskytující buňky, buněčné linie, zvířata nebo embrya ve vejcích, která jsou IFN-deficientní, například buňky Věro, mladá embrya ve vejcích; rekombinantní buňky nebo buněčné linie, které jsou upraveny metodami genetického inženýrství tak, aby byly IFN-deficientní, tedy například IFN-deficientní buněčné linie odvozené ze STATI-ztrátové myši nebo jiných transgenních zvířat upravených podobnými zásahy genetického inženýrství; embrya ve vejcích získaná od IFN-deficientních ptáků, zvláště drůbeže (například kuřat, kachen, krocanů) včetně hejn, která jsou křížena tak, aby poskytovala IFN-deficientní nebo transgenní ptáky (například STATI-ztrátové). Alternativně je možno metodami genetického inženýrství upravit hostitelský systém, buňky, buněčné linie, vejce nebo zvířata tak, aby exprimovaly transgeny kódující inhibitory systému IFN, například dominantně-negativní mutanty, jako je STATI s chybějící vazebnou doménou DNA, antisense RNA, ribozymy, inhibitory produkce IFN, inhibitory signálů IFN a/nebo inhibitory antivirových genů indukovaných IFN. Mělo by být zřejmé, že zvířata, která jsou křížena nebo metodami genetického inženýrství upravena tak, aby byla IFN-deficientní, budou mít do určité míry oslabenou imunitu, a měla by být udržována v kontrolovaném prostředí bez přístupu onemocnění. Měla by být tedy prováděna vhodná opatření (včetně použití antibiotik ve výživě) pro omezení rizika expozice infekčním činitelům transgenních IFN-deficientních zvířat, jako jsou hejna vyšlechtěných slepic, kachen, krocanů atd. Alternativně je možno působit na hostitelský systém, například buňky, buněčné linie, vejce nebo zvířata sloučeninou, která inhibuje produkci IFN a/nebo biochemickou cestu syntézy IFN, například léky, protilátkami, antisense molekulami, ribozymovými molekulami cílenými na gen STATI a/nebo antivirovými geny indukovanými IFN.
- 13 CZ 306637 B6
Podle předkládaného vynálezu zahrnují nezralá kuřecí embrya vejce, která jsou stará do deseti dnů, ale již ne deset dnů, s výhodou šesti až devítidenní vejce; a vejce, která uměle napodobují nezralá vejce stáří méně než 10 dnů získaná změnami podmínek růstu, například změnami inkubačních teplot; působením chemických látek; nebo jakoukoli jinou změnou, která poskytuje vejce se zpomaleným vývojem, takže systém IFN vejce není zcela vyvinutý ve srovnání s vejci stáří 10 až 12 dnů.
Přírodní IFN-deficientní substráty
V jednom provedení se předkládaný vynález týká pěstování v přírodě se vyskytujících a metodami genetického inženýrství získaných mutantních virů v neobvyklých substrátech, jako jsou nezralá embrya ve vejcích, u kterých ještě nedošlo k vyvinutí systému IFN. Nezralá embrya ve vejcích se normálně používají pro pěstování viru pro svůj křehký stav a malý alantoický objem. Předkládaný vynález zahrnuje pěstování mutantních virů v embryích ve vejcích starých méně než 10 dnů; s výhodou pěstování mutantních virů v embryích ve vejcích starých 8 dnů a nejvýhodněji ve vejcích starých 6 až 8 dnů.
Předkládaný vynález také zahrnuje způsoby pěstování a izolace mutantních virů se změněnou IFN-antagonistickou aktivitou v buňkách a buněčných liniích, které v přirozeném stavu nemají biosyntézu IFN nebo mají deficientní biosyntézu IFN nebo mají deficientní systém IFN, například nízké hladiny exprese IFN ve srovnání s buňkami standardního typu. Ve zvláště výhodném provedení se předkládaný vynález týká způsobů pěstování mutovaných virů se změněnou antagonistickou aktivitou IFN v buňkách Věro.
IFN-deficientní substráty získané metodami genetického inženýrství
Předkládaný vynález se týká metod pěstování a izolace mutovaných virů se změněnou IFNantagonistickou aktivitou v IFN-deficientním substrátu získaném metodami genetického inženýrství. Předkládaný vynález zahrnuje transgenní ptáky, u kterých je mutován gen nezbytný pro funkci systému IFN, například STATI, kteří mohou klást vejce, která jsou IFN-deficientní. Předkládaný vynález dále zahrnuje transgenní ptáky, kteří exprimují dominantně-negativní transkripční faktory, například STATI s chybějící vazebnou doménou DNA, ribozymy, antisense RNA, inhibitory produkce IFN, inhibitory signálů IFN a inhibitory antivirových genů indukovaných jako odpověď na IFN. Při použití vajec z IFN-deficientních transgenních ptáků je prospěšné to, že při pěstování viru mohou být použita běžná desetidenní vejce, která jsou stabilnější a mají větší objem v důsledku jejich větší velikosti. V ještě dalším provedení mohou být upravovány metodami genetického inženýrství buněčné linie tak, aby byly IFN-deficientní. Předkládaný vynález zahrnuje buněčné linie, ve kterých jsou mutovány geny nezbytné pro syntézu IFN, geny účastnící se biosyntézy IFN a/nebo antivirový gen nebo geny indukované IFN, například STATI.
Předkládaný vynález poskytuje rekombinantní buněční linie nebo zvířata, zvláště ptáky, u kterých byl přerušen jeden nebo více genů nezbytných pro biosyntézu IFN, například interferonový receptor, STATI atd., tj. jsou tímto způsobem „ztrátové“; rekombinantním zvířetem může být jakékoli zvíře, ale ve výhodném provedení jde o ptáka, například kuře, krocana, slepici, kachnu atd. (viz např. Sang, 1994, Trends Biotechnol. 12: 415; Perry, a další, 1993, Transgenic Res. 2: 125; Stem, C. D„ 1996, Curr. Top Microbiol. Immunol. 212: 195 - 206; a Shuman, 1991, Experientia 47: 897, kteří poskytují přehled týkající se produkce transgenních ptáků, přičemž každý z těchto odkazů je zařazen ve svém celku). Taková buněčná linie nebo zvíře mohou být vytvořeny jakýmkoli způsobem známým v oboru pro přerušování genu nebo chromozomu buňky nebo zvířete. Tyto techniky zahrnují bez omezení pronukleámí mikroinjekci (Hoppe & Wagner, 1989, patent US 4 873 191); přenos genu do zárodečných linií zprostředkovaný retrovirem (Van der Putten, a další, 1985, Proč. Nati. Acad. Sci, USA 82: 6148 - 6152); cílené působení na geny v embryonálních kmenových buňkách (Thompson, a další, 1989, Cell 56: 313); elektroporaci embryí (Lo, 1983, Mol. Cell. Biol. 3: 1803); a přenos genů zprostředkovaný spermatem (Lavitrano,
- 14 CZ 306637 B6 a další, 1989, Cell 57: 717); atd. Přehled těchto technik je uveden v ělánku Gordon, 1989, Transgenic Animals, Inti. Rev. Cytol. 115: 171, který je ve svém celku zařazen odkazem.
Konkrétně STATI-ztrátová zvířata mohou být produkována podporou homologní rekombinace mezi genem STATI ve svém chromozomu a exogenním genem STATI, u kterého bylo dosaženo biologické neaktivity (s výhodou vložením heterologní sekvence, například genu pro rezistenci na antibiotika). Homologní rekombinaění metody pro přerušování genů v myším genomu se poskytují například v Capecchi (1989, Science 244: 1288) a Mansour, a další (1988, Nature 336: 348).
Ve stručnosti, celý nebo část STATl-genomického klonu se izoluje z genomické DNA ze stejného druhu, jakého je ztrátová buňka nebo zvíře. STATl-genomický klon může být izolován jakýmkoli v oboru známým způsobem pro izolaci agenomických klonů (například testováním genomické knihovny sondou odvozenou ze sekvence STATI, jako jsou sekvence poskytované v Meraz, a další, 1996, Cell 84: 431; Durbin, a další, 1996, Cell 84: 443, a tam uvedených odkazech). Jakmile je již genomický klon izolován, celek nebo část tohoto klonu se zavede do rekombinantního vektoru. S výhodou část klonu zavedená do vektoru obsahuje alespoň část exonu genu STATI, tj. obsahuje kódující sekvenci proteinu STATI. Potom se sekvence, která není homologní se sekvencí STATI, s výhodou pozitivně selekcí zjistitelný marker, jako je gen kódující rezistenci na antibiotika, zavede do exonu genu STATI. Tento marker vhodný pro selekci se s výhodou operativně připojí k promotoru, výhodněji ke konstitutivnímu promotoru. Nehomologní sekvence se zavede kdekoli v kódující sekvenci STATI, což přeruší aktivitu STATI, například v poloze, kde bylo ukázáno, že bodové mutace nebo i jiné mutace inaktivují funkci proteinu STATI. Pro příklad, ale bez omezení, je možno nehomologní sekvenci vložit do kódující sekvence pro část proteinu STATI obsahující veškerou nebo část kinázové domény (například nukleotidová sekvence kódující alespoň 50, 100, 150, 200 nebo 250 aminokyselin kinázové domény). Marker umožňující pozitivní selekci je s výhodou gen rezistence na neomycin (neo gen) nebo hygromycin (hygro gen). Promotorem může být jakýkoli promotor známý v oboru, například promotor fosfoglycerátkinázy (PGK) (Adra, a další, 1987, Gene 60: 65 - 74), promotor Polil (Soriano, a další, 1991, Cell 64: 693 - 701), nebo promotor MCI, který je syntetickým promotorem navrženým pro expresi kmenových buněk odvozených z embryí (Thomas & Capecchi, 1987, Cell 51: 503 - 512). Použití markéru umožňujícího selekci, jako je gen rezistence na antibiotika, umožní selekci buněk, které mají v sobě obsažen cílový vektor (například exprese produktu neo genu propůjčuje rezistenci na G418 a exprese hygro genu propůjčuje rezistenci na hygromycin).
Ve výhodném provedení se mimo inzert genomického klonu STATI množí marker umožňující negativní selekcí pro dosažení negativní selekce na homologní, na rozdíl od nehomologní rekombinace vektoru. Takovým markérem umožňujícím negativní selekci je gen HSV thymidinkinázy (HSV-í/c), jehož exprese způsobí citlivost buněk na gancyklovir. Marker umožňující negativní selekci je s výhodou pod řízením promotoru, jako je například bez omezení promotor PGK, promotor Polil nebo promotor MCI.
Jestliže dojde k homologní rekombinaci, části vektoru homologní s genem STATI stejně jako nehomologní inzert uvnitř sekvencí genu STATI, jsou vloženy do genu STATI v chromozomu, a zbytek vektoru se ztratí. Protože je tedy marker umožňující negativní selekci mimo oblast homologie s genem STATI, buňky u nichž došlo k homologní rekombinaci (nebo jejich potomstvo), nebudou obsahovat marker umožňující negativní selekci. Jestliže je například markérem umožňujícím negativní selekci gen HSV-tk, buňky, ve kterých došlo k homologní rekombinaci, nebudou exprimovat thymidinkinázu a přežijí expozici gancykloviru. Tento postup umožňuje selekci buněk, ve kterých došlo k homologní rekombinaci, na rozdíl od nehomologní rekombinace, při které je pravděpodobné, že marker umožňující negativní selekci je rovněž zahrnut do genomu spolu se sekvencemi STATI a markérem umožňujícím pozitivní selekci. Buňky, ve kterých došlo k nehomologní rekombinaci, by nej pravděpodobněji exprimovaly thymidinkinázu a byly by citlivé na gancyklovir.
- 15 CZ 306637 B6
Jakmile se připraví cílový vektor, je linearizován restrikčním enzymem, pro který existuje jedinečné místo v cílovém vektoru, a linearizovaný vektor se zavede do kmenových buněk odvozených z embrya (ES) (Gossler, a další, 1986, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 83: 9065 - 9069) jakýmkoli způsobem známým odborníkům v oboru, například elektroporací. Jestliže cílový vektor obsahuje marker umožňující pozitivní selekci a marker umožňující negativní protiselekci, mohou být buňky ES, ve kterých došlo k homologní rekombinaci, selektovány inkubací v selektivních médiích. Například jestliže jsou markéry umožňujícími selekci gen rezistence na neo a gen HSVtk, buňky se vystaví působení G418 (například přibližně 300 pg/ml) a gancykloviru (například přibližně 2 M). Pro potvrzení skutečnosti, že přerušené sekvence STATI se homologně rekombinovaly do genu STATI v genomu buněk ES, je možno použít jakýkoli způsob zjištění genotypu známý v oboru, například bez omezení analýzy Southernovým přenosem. Protože restrikční mapa genomického klonu STATI je známa a známa je i kódující sekvence STATI (viz Meraz, a další, 1996, Cell 84: 431; Durbin, a další, 1996, Cell 84: 443 - 450, a všechny tam uvedené reference), je možno určit velikost konkrétního restrikčního fragmentu nebo produktu amplifikace PCR vytvořených z DNA jak přerušených, tak i nepřerušených alel. Testováním restrikčního fragmentu nebo produktu PCR, jejichž velikost je odlišná mezi přerušeným a nepřerušeným genem STATI, je tedy možno určit, zda došlo pro přerušení genu STATI k homologní rekombinaci.
Buňky ES s přerušeným lokusem STATI mohou být tedy zavedeny do blastocyst mikroinjekcí a potom mohou být blastocysty implantovány do děloh pseudopregnantní myši použitím rutinních technik. Zvířata, která se vyvinou z implantovaných blastocyst, jsou chimérická na přerušené alely. Chiméričtí samci mohou být zkříženi se samicemi a křížení může být navrženo tak, že přenos alely je svázán s přenosem určité barvy srsti. Přenos v zárodečné linii alely může být potvrzen Southernovým přenosem nebo analýzou PCR, jak bylo popsáno výše, provedenými s genomickou DNA izolovanou ze vzorků tkáně.
Substráty s přechodnou deficiencí na IFN
Na buňky, buněčné linie, zvířata nebo vejce je možno předem působit sloučeninami, které inhibují systém IFN. Podle předkládaného vynálezu mohou být sloučeniny inhibující syntézu IFN nebo aktivitu exprese složek systému IFN použity pro působení na hostitele, tedy například sloučeniny inhibující syntézu IFN, aktivitu IFN, receptor IFN, jiné cíle v cestě přenosu signálu IFN, nebo které inhibují aktivitu antivirových genů indukovaných IFN. Příklady sloučenin, které mohou být použity podle předkládaného vynálezu, zahrnují bez omezení molekuly nukleových kyselin, protilátky, peptidy, látky s antagonistickými účinky na receptor IFN, inhibitory biosyntézy STATI, inhibitory PKR apod. Podle předkládaného vynálezu patří mezi molekuly nukleových kyselin antisense molekuly, ribozomy a trojšroubovicové molekuly, jejichž cílem jsou geny kódující nezbytné složky systému IFN, například STATI. Molekuly nukleových kyselin také zahrnují nukleotidy kódující dominantně negativní mutanty složek systému IFN; například před infekcí mutantním virem mohou být buňky transfekovány DNA kódující zkrácený, signálování neschopný mutant receptoru IFN.
Dominantně negativní mutanty, které mohou být použity podle předkládaného vynálezu pro inhibici biosyntézy IFN, zahrnují kináza-deficientní verze Jakl, TyK2 nebo transkripční faktory postrádající DNA-vazebné domény STATI a STAT2 (viz např. Krishnan, a další, 1997, Eur. J. Biochem. 247: 298-305).
Vakcíny
Vynález zahrnuje vakcíny obsahující oslabené RNA viry s negativním řetězcem se sníženou schopností antagonizovat buněčnou odpověď IFN a vhodnou pomocnou látku. Virus použitý ve vakcíně může být zvolen z mutantu nebo variant vyskytujících se v přírodě, mutagenizovaných virů nebo virů získaných metodami genetického inženýrství. Oslabené kmeny segmentovaných virů RNA mohou být také vytvořeny technikami přeuspořádání nebo použitím kombinace přístu
- Ifi CZ 306637 B6 pu reverzní genetiky a technik přeuspořádání. Mezi varianty vyskytující se v přírodě patří viry izolované z přírody stejně jako varianty vytvořené spontánně v průběhu propagace viru, které mají sníženou schopnost antagonizovat buněčnou odpověď IFN. Samotný oslabený virus může být ve vakcíně také použit jako účinná složka. Alternativně může být oslabený virus použit jako vektor nebo „kostra“ rekombinantně vyrobených vakcín. Z tohoto hlediska mohou být pro dosažení mutací nebo zavedení cizích antigenu do oslabeného viru použitého ve vakcíně využity rekombinantní techniky jako je reverzní genetika (nebo pro segmentované viry kombinace reverzní genetiky a techniky přeuspořádání). Tímto způsobem mohou být navrženy vakcíny pro imunizaci proti variantám kmenů nebo alternativně proti úplně odlišným infekčním činitelům nebo antigenům onemocnění.
Do virů podle předkládaného vynálezu pro použití ve vakcínách může být v podstatě vložena jakákoli heterologní genová sekvence. S výhodou mohou být exprimovány virem nebo jako část virů epitopy, které indukují ochrannou imunitní odpověď na jakýkoli druh patogenů nebo antigenu, které vážou neutralizační protilátky. Například mezi heterologní genové sekvence, které mohou být zavedeny do virů podle předkládaného vynálezu pro použití ve vakcínách, patří bez omezení epitopy viru lidské imunodeficience (HIV) jako je gp!20; povrchový antigen viru hepatitidy B (HBsAg); glykoproteiny herpes viru (například gD, gE); VP1 polioviru; antigenní determinanty nevirových patogenů, jako jsou bakterie a paraziti. V dalším provedení mohou být exprimovány veškeré imunoglobulinové geny nebo jejich část. Do virů podle předkládaného vynálezu mohou být například vneseny variabilní oblasti antiidiotypických imunoglobulinů, které napodobují tyto epitopy. V ještě dalším provedení mohou být exprimovány antigeny spojené s tumory.
Je možno vytvořit buď živou rekombinantní virovou vakcínu, nebo inaktivovanou rekombinantní virovou vakcínu. Živá vakcína může být výhodná, protože multiplikace v hostiteli vede k prodloužené stimulaci podobného druhu a velikosti jako v případě přirozených infekcí, a proto poskytuje dobrou, dlouhotrvající imunitu. Výroba těchto živých rekombinantních virových vakcín může být prováděna běžnými způsoby, včetně pomnožování viru v buněčné kultuře nebo v zárodečném vaku kuřecího embrya, a následnou purifikací.
Mezi vakcíny mohou patřit RNA viry s negativními řetězci upravené metodami genetického inženýrství, které mají mutace v genu NS1 nebo analogickém genu, včetně bez omezení zkrácených mutantu NS1 chřipky popsaných v pracovních příkladech dále. Vakcíny je také možno sestavit použitím přírodních variant, jako je přírodní varianta chřipky typu A A/turkey/Ore/71 nebo B/201 a B/AWBY-234, což jsou přirozené varianty chřipky typu B. Jestliže se vakcíny formulují jako živé virové vakcíny, mělo by být použito množství v rozmezí přibližně 104 pfu až přibližně 5 x 106 pfu na dávku.
Pro zavádění vakcín popisovaných výše je možno použít mnoho způsobů, mezi které patří bez omezení intranazální, intratracheální, orální, intradermální, intramuskulámí, intraperitoneální, intravenózní a subkutánní cesty. Může být výhodné zavádět virovou vakcínu přirozenou cestou infekce patogenů, pro který je vakcína navržena, nebo přirozenou cestou infekce rodičovského oslabeného viru. Jestliže se použije vakcína založená na živém viru chřipky, může být výhodné zavádět vakcínu přirozenou cestou infekce virem chřipky. K tomuto účelu muže být s výhodou použita schopnost viru chřipky indukovat živou sekreční a buněčnou imunitní odpověď. Například infekce respiračního traktu viry chřipky může indukovat silnou sekreční imunitní odpověď, například v urogenitálním systému, se současnou ochranou proti vyvolávajícímu agens konkrétního onemocnění.
Vakcína podle předkládaného vynálezu obsahující 104- 5 x 106pfu mutantních virů se změněnou IFN-antagonistickou aktivitou by mohla být podána jednou. Alternativně by mohla být vakcína podle předkládaného vynálezu, obsahující 104 — 5 x 106 pfu mutantních virů se změněnou IFNantagonistickou aktivitou, podána dvakrát nebo třikrát s intervalem 2 až 6 měsíců mezi dávkami. Alternativně by mohla být vakcína podle předkládaného vynálezu, obsahující 104 - 5 x 106 pfu
- 17CZ 306637 B6 mutantních virů se změněnou IFN-antagonistickou aktivitou, podávána tak často, jak je zapotřebí, u živočicha, s výhodou savce, a ještě výhodněji člověka.
Farmaceutické prostředky
Předkládaný vynález zahrnuje farmaceutické prostředky obsahující mutantní viry se změněnou IFN-antagonistickou aktivitou pro použití jako antivirové prostředky nebo antitumorové prostředky, nebo jako prostředky proti onemocněním citlivým na IFN. Farmaceutické prostředky mohou být použitelné jako preventivní protivirové léky a mohou být podávány jednotlivci s rizikem infekce nebo jedinci, u kterého se očekává expozice viru. Například v případě, že dítě přijde domů ze školy, kde je vystaveno několika spolužákům s chřipkou, by mohl rodič podat protivirový farmaceutický prostředek podle vynálezu sobě, dítěti a jiným členům rodiny pro prevenci virové infekce a následného onemocnění. Lidé cestující do částí světa, kde převažuje určité infekční onemocnění (například hepatitida A, malárie atd.), mohou být ošetřeni rovněž.
Alternativně mohou být farmaceutické prostředky použity pro léčení tumorů nebo pro prevenci tvorby tumorů, například u pacientů s rakovinou, nebo u pacientů s vysokým rizikem vyvinutí nádorů nebo rakoviny. Například pacienti s rakovinou mohou být ošetřeni pro prevenci další tvorby tumorů. Alternativně mohou být ošetřeni pacienti, u kterých se očekává expozice karcinogenům; jedinci, kteří se účastní čištění životního prostředí, a kteří mohou být vystaveni znečišťujícím látkám (například azbestu). Alternativně mohou být ošetřeni před expozicí i potom jednotlivci, kteří mohou být vystaveni ozáření, například pacienti vystavení vysokým dávkám záření, nebo pacienti, kteří musí brát karcinogenní léky. Použití oslabených virů podle předkládaného vynálezu jako antitumorových látek je založeno na objevu přihlašovatelů, že oslabený mutantní virus chřipky obsahující deleci ve svém IFN-antagonistickém genu, je schopen snižovat tvorbu nádorů u myší. Antitumorové vlastnosti podle vynálezu mohou alespoň z části souviset se schopností indukovat IFN a odpovědi IFN. Alternativně mohou být antitumorové vlastnosti oslabených virů podle předkládaného vynálezu spojeny s jejich schopností specificky růst v tumorových buňkách a usmrcovat je, protože je známo, že mnohé tumorové buňky jsou deficientní v systému IFN. Bez ohledu na molekulární mechanismus nebo molekulární mechanismy odpovědné za antitumorové vlastnosti mohou být viry podle vynálezu použity pro léčení tumorů nebo pro prevenci tvorby tumorů.
Předkládaný vynález dále zahrnuje mutantní viry se změněným IFN-antagonistickým fenotypem, které jsou zacíleny na specifické orgány, tkáně a/nebo buňky v těle pro indukci lokálních terapeutických nebo profylaktických účinků. Jednou výhodou tohoto přistupuje, že viry indukující IFN podle předkládaného vynálezu jsou zaměřeny na specifická místa, například místa tumoru, pro indukci IFN místně specifickým způsobem, čímž se dosahuje terapeutický účinek lépe než indukcí IFN systémově, což může vést k toxickým účinkům.
Mutantní viry indukující IFN podle předkládaného vynálezu mohou být získány metodami genetického inženýrství použitím způsobů popsaných v přihlášce pro expresi proteinů nebo peptidů, které by zaměřily viry na konkrétní místo. Ve výhodném provedení by byly viry indukující IFN zaměřeny do míst tumorů. V takovém provedení mohou být mutantní viry sestaveny tak, aby exprimovaly kombinační místo protilátky rozpoznávající antigen specifický pro tumor s antigenem, čímž dojde k zacílení IFN-indukujícího viru na tumor. V ještě dalším provedení, kdy cílový tumor exprimuje receptor pro hormon, jako jsou tumory prsní žlázy nebo vaječníků, které exprimují estrogenové receptory, může být virus indukující IFN upraven metodami genetického inženýrství tak, aby exprimoval příslušný hormon. V ještě dalším provedení, kdy cílový hormon exprimuje receptor růstového faktoru, například VEGF, EGF nebo PDGF, může být IFN-indukující virus sestrojen tak, aby exprimoval příslušný růstový faktor nebo jeho části. Podle vynálezu mohou být tedy viry indukující viry IFN upraveny tak, aby exprimovaly jakýkoli produkt cílového genu, včetně peptidů, proteinů jako jsou enzymy, hormony, růstové faktory, antigeny nebo protilátky, které budou fungovat tak, že virus zaměří do místa, ve kterém je zapotřebí antivirového, antibakteriálního, antimikrobiálního nebo protirakovinného působení. Mezi způsoby zavádění patří bez omezení intradermální, intramuskulámí, intraperitoneální, intravenózní, subkutánní, intranazální, epidurální a orální cesty. Farmaceutické prostředky podle předkládaného vynálezu mohou být podávány jakoukoli vhodnou cestou, například infuzí nebo jednorázovou injekcí, absorpcí přes epiteliální nebo mukokutánní výstelky (například ústní sliznice, rektální a střevní sliznice atd.) a mohou být podávány spolu s jinými biologicky účinnými látkami. Podávání může být systémové nebo místní. Navíc může být ve výhodném provedení žádoucí zavádět farmaceutické prostředky podle vynálezu vhodným způsobem do plic. Může být také použito plicního podávání, například použitím inhalátoru nebo nebulizéru, a formulace s prostředkem usnadňujícím tvorbu aerosolu.
V konkrétním provedení může být žádoucí podávat farmaceutické prostředky podle vynálezu místně do oblasti, kde je zapotřebí léčení; toho může být dosaženo například bez omezení lokální infuzí při chirurgickém zákroku, místním podáním, například spolu s náplastí na ránu po chirurgickém zákroku, injekcí nebo pomocí katétru, nebo pomocí čípku nebo implantátu, kde uvedený implantát může být porézní, neporézní nebo gelový materiál, včetně membrán jako jsou sialastické membrány nebo vlákna. V jednom provedení je možno podávání provádět přímou injekcí v místě (nebo bývalém místě) maligního tumoru nebo neoplastické nebo preneoplastické tkáně.
V ještě dalším provedení může být farmaceutický prostředek dodáván systémem s řízeným uvolňováním. V jednom provedení může být použito dávkovači čerpadlo (viz Langer, výše; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14: 201; Buchwald, a další, 1980, Surgery 88: 507; Saudek, a další, 1989, N. Engl. J. Med. 321: 574). V dalším provedení mohou být použity polymemí materiály (viz Medical Applications of Controlled Release, Langer a Wise (ed.), CRC Pres, Boča Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen a Ball (ed.), Wiley, New York (1984); Ranger & Peppas, 1983, J. MacromoL Sci. Rev. Macromol. Chern. 23: 61; viz též Levy, a další, 1985, Science 228: 190; During, a další, 1989, Ann. Neurol. 25: 351 (1989); Howard, a další, 1989, J. Neurosurg. 71: 105). Vještě dalším provedení může být systém s řízeným uvolňováním umístěn v blízkosti cíle prostředku, například plic, čímž je zapotřebí pouze části systémové dávky (viz například Goodson, 1984, v Medical Applications of Controlled Release, výše, díl 2, str. 115 - 138). Další systémy s řízeným uvolňováním se diskutují v přehledu Langera (1990, Science 249: 1527 - 1533).
Farmaceutické prostředky podle předkládaného vynálezu obsahují terapeuticky účinné množství oslabeného viru a farmaceuticky přijatelný nosič. Ve specifickém provedení znamená termín „farmaceuticky přijatelný“ schválení orgánem státní správy pro kontrolu léčiv nebo orgánem uvedeným například v US lékopisu nebo jiném obecně uznávaném lékopisu pro použití u živočichů a zvláště u lidí. Termín „nosič“ označuje ředidlo, adjuvans, pomocnou látku nebo vehikulum, se kterými se farmaceutický prostředek podává. Jako kapalné nosiče mohou být také použity solné roztoky a vodné roztoky dextrózy a glycerolu, zvláště v případě roztoků určených pro injekce. Vhodné farmaceutické pomocné látky zahrnují škrob, glukózu, laktózu, sacharózu, želatinu, slad, rýži, mouku, křídu, silikagel, stearan sodný, glycerolmonostearát, talek, chlorid sodný, sušené odstředěné mléko, glycerol, propylenglykol, vodu, ethanol apod. Tyto prostředky mohou mít formu roztoků, suspenzí, emulzí, tablet, pilulek, kapslí, prášků, formulací s prodlouženým uvolňováním apod. Prostředky mohou být formulovány jako čípky. Orální prostředky mohou obsahovat standardní nosiče, jako jsou mannitol, laktóza, škrob, stearan hořečnatý, sodná sůl sacharinu, celulóza, uhličitan hořečnatý apod. ve farmaceutické čistotě. Příklady vhodných farmaceutických nosičů se popisují v publikaci „Remington's Pharmaceutical Sciences“, E. W. Martin. Tyto prostředky budou obsahovat terapeuticky účinné množství léčebné látky, s výhodou ve vyčištěné formě, spolu s vhodným množstvím nosiče, za získání formy vhodné pro řádné podávání pacientovi. Formulace by měla vyhovovat způsobu podávání.
Množství farmaceutického prostředku podle vynálezu, které bude účinné při léčení konkrétního onemocnění nebo stavu, bude záviset na povaze onemocnění nebo stavu pacienta a může být určeno standardními klinickými postupy. Navíc může být pro lepší identifikaci optimálních rozmezí dávek použit test in vitro. Přesná dávka, která má být použita ve formulaci, bude také závi
- 19CZ 306637 B6 set na způsobu podávání a vážnosti onemocnění nebo poruchy, a měla by být určena rozhodnutím ošetřujícího lékaře podle stavu každého pacienta. Vhodná rozmezí dávek pro podávání však budou obecně přibližně 104 - 5 x 106pfu a mohou být podávána jednou nebo vícekrát v intervalech podle potřeby. Farmaceutické prostředky podle vynálezu, obsahující 104 - 5 x 106 pfu mutantních virů se změněnou IFN-antagonistickou aktivitou, mohou být podávány intranazálně, intratracheálně, intramuskulárně nebo subkutánně. Účinné dávky mohou být extrapolovány z křivek závislosti odpovědi na dávce odvozených z testovacích modelů na zvířatech nebo z experimentů in vitro.
Příklady uskutečnění vynálezu
Příklad 1: Tvorba a charakterizace mutantních virů chřipky typu A se zkráceným NS1
Materiály a metody
Virus chřipky A/PR/8/34 (PR8) byl pomnožen v desetidenních kuřecích embryích při teplotě 37 °C. Virus chřipky A 25A-1, přeuspořádaný virus obsahující segment NS z kmene A/Leningrad/134/47/57 adaptovaný na chlad a ostatní geny z viru PR8 (Egorov, a další, 1994, Vopr. Virusol. 39: 201 - 205; Shaw, a další, 1996, v Options of the control of influenza III, ed. Brown, Hampson Webster (Elsevier Science) str. 433 - 436) byl pěstován, v buňkách Věro při 34 °C. Virus 25A-1 je v savčích buňkách teplotně senzitivní, a byl použit jako pomocný virus pro získání transfekčního viru NS1/99. Pro pěstování viru chřipky byly použity buňky Věro a buňky MDCK udržované v minimálním esenciálním médiu (MEM) s obsahem 1 g/ml trypsinu (Difco Laboratories, Detroit, Michigan). Buňky Věro, byly také použity pro selekci, purifikaci plaků a titraci viru NS1/99. Buňky MDCK byly udržovány v DMEM (Dulbecco's minimal essential medium) s obsahem 10 % teplem inaktivovaného fetálního telecího séra. Buňky Věro byly pěstovány v médiu AIM-V (Life Technologies, Grand Island, NY).
Plasmid pT3NSl/99, obsahující formu NS1 zkrácenou na C-konci o délce 99 aminokyselin, byl získán následujícím/způsobem. Nejprve byl plasmid pPUC19-T3/NS PR8, obsahující úplný gen NS viru PR8 obklopený promotorem T3 RNA polymerázy a restrikčním místem BpuAl, amplifikován metodou reverzní PCR (Ochman, a další, 1988, Genetics 120: 621 - 623) s použitím vhodných primerů. Získaná cDNA obsahující zkrácený gen NS1 byla fosforylována, štěpena Klenowovým fragmentem, samoligována a pomnožena v E. coli kmen TG1. Konstrukt získaný po vyčištění byl nazván pT3NSl/99 a jeho struktura byla ověřena sekvenováním. Plasmidy pro expresi proteinů NP, PB1, PB2 a PA viru PR8 (pHMG-NP, pHMG-PBl, pHMG-PB2 a pHMGPA) byly popsány dříve (Pleschka, a další, 1996, J. Virol. 70: 4188 - 4192). Plasmid pPOLI-NSRB byl vyroben substitucí otevřeného čtecího rámce CAT plasmidu pPOLI—CAT—RT (Pleschka, a další, 1996, J. Virol. 70: 4188 - 4192) RT-PCR produktem odvozeným z kódující oblasti genu NS viru chřipky A/WSN/33 (WSN). Tento plasmid exprimuje segment NS-specifické virové RNA viru WSN pod řízením zkráceného promotoru lidské polymerázy I.
Tvorba viru NS1/99 byla provedena ribonukleoproteinovou (RNP) transfekcí (Luytjes, a další, 1989, Cell 59: 1107 - 1113). Ribonukleoproteiny (RNP) byly vytvořeny transkripcí T3 RNA polymerázou z pT3NSl/99 linearizovaného BpuAl v přítomnosti purifikovaného nukleoproteinu a polymerázy viru chřipky 25A-1 (Enami, a další, 1991, J. Virol. 65: 2711 - 2713). Komplexy RNP byly transfekovány do buněk Věro, které byly před tím infikovány virem 25A-1. Transfekované buňky byly inkubovány 18 h při 37 °C a supernatant byl dvakrát pasážován v buňkách Věro při 40 °C a vyčištěn pomocí plaků třikrát v buňkách Věro potažených agarovým překrývacím médiem při 37 °C. Izolovaný virus NS1/99 byl analyzován RT-PCR použitím specifických primerů. Transfekční virus standardního typu byl vytvořen následujícím způsobem: Buňky Věro v miskách o průměru 35 mm byly transfekovány plasmidy pHMG-NP, pHMG-PBl, pHMGPB2, pHMG-PA a pPOLI-NS-RB, jak bylo popsáno výše (Pleschka, a další, 1996, J. Virol. 70:
-20CZ 306637 B6
4188 - 4192). Dva dny po transfekci byly buňky infikovány 5 x 104 pfu viru delNSl a inkubovány ještě dva dny při 37 °C. Buněčný supernatant byl jednou pasážován v buňkách MDCK a dvakrát v kuřecích embryích. Transfekční viry byly klonovány metodou limitního zředění ve vejcích. Genomová RNA z purifikovaného transfekčního viru NS1/99 byla analyzována elektroforézou na polyakrylamidovém gelu, jak bylo popsáno výše (Zheng, a další, 1996, Virology 217: 242 251). Exprese zkráceného proteinu NS1 virem NS1/99 byla ověřena imunoprecipitací značených infikovaných buněčných extraktů použitím králičího polyklonálního antiséra proti NS1.
Alantoická dutina kuřecích embryí ve stáří 6, 10 a 14 dnů byla zaočkována přibližně 103 pfu PR8, NS1/99 nebo delNSl (ve kterém je deletovaný celý gen NS1), vejce byla inkubována při 37 °C 2 dny a viry přítomné v alantoické kapalině byly titrovány testem hemaglutinace (HA).
Skupiny pěti myší BALB/c (Taconic Farms) byly zaočkovány intranazálně 5 x 106 pfu, 1,5 x 105 pfu, nebo 5 x 103 pfu viru A/PR/8/34 (PR8) standardního typu nebo viru NS1/99. Očkování bylo prováděno v anestézii s použitím 50 μΐ MEM s obsahem vhodného počtu jednotek schopných tvořit plaky příslušného viru. Zvířata byla denně pozorována, a když se značně zhoršil stav, byla usmrcena. V následujícím experimentu byla všem myším, které přežily, podána o čtyři týdny později dávka 100 LD50 viru PR8 standardního typu. Všechny postupy byly prováděny podle metodiky N1H péče o laboratorní zvířata a jejich použití.
Výsledky: oslabení virů chřipky typu A delecemi NS1
Přihlašovatelé již ukázali, že virus chřipky typu A, u kterého byla provedena delece genu NS1 (delNSl virus), je schopen růst do titrů přibližně 107 pfu/ml v buňkách deficientních na produkci interferonu typu I (IFN), jako jsou buňky Věro. Tento virus však nebyl schopen replikace a nemohl způsobovat onemocnění u myší (Garcia-Sastre, a další, 1998, Virology 252: 324). Naopak virus delNSl byl schopen růstu a usmrcování myší STATI-/-. Tyto výsledky ukázaly, že protein NS1 viru chřipky typu A je faktorem virulence, který se účastní inhibice antivirových odpovědí hostitele zprostředkovaných IFN typu I. Následující experimenty byly prováděny pro zjištění, zda by bylo možno vytvořit viry chřipky, které by měly vlastnosti z hlediska virulence někde mezi standardním typem a viry delNSl, deleci částí genu NS1, a zda by mohly mít některé z těchto virů optimální vlastnosti pro použití jako živé oslabené vakcíny proti virům chřipky, tj. stabilitu a vhodné vyvážení mezi oslabením, imunogenicitou a růstem v substrátech vhodných pro přípravu vakcín, jako jsou kuřecí embrya.
Pro testování této hypotézy byl vytvořen virus chřipky A/PR/8/34 (PR8), ve kterém byl modifikován gen NS1 s cílem řídit expresi zkráceného proteinu NS1 obsahujícího pouze 99 aminokyselin na aminovém konci spolu s 230 aminokyselinami proteinu NS1 standardního typu. Tento virus (NS1-99) byl získán transfekci RNP metodami genetického inženýrství získaného genu NS s použitím 25A-1 pomocného viru jak bylo popsáno dříve (Garcia-Sastre, a další, 1998, Virology 252: 324). Analýza exprese NS1 v buňkách infikovaných virem odhalila zkrácenou povahu proteinu NS1 viruNSl-99.
Byla analyzována schopnost virů delNSl, NS1-99 a PR8 standardního typu růst v kuřecích embryích různého stáří. Podstata tohoto experimentu je založena na tom, že schopnost embryí ve vejcích syntetizovat a odpovídat na IFN typu I za vhodné stimulace závisí na stáří. Jak schopnost indukce IFN, tak i schopnost reagovat začínají ve stáří přibližně 10 dnů, a potom s věkem exponenciálně vzrůstají (Sekellick, a další. 1990, In Vitro Cell. Dev. Biol. 26: 997; Sekellick & Marcus, 1985 J. Interferon Res. 5: 657). Použití vajec různého stáří tedy představuje jedinečný systém pro testování schopnosti různých virů inhibovat odpovědi IFN. Vejce stáří 6, 10 a 14 dnů byla inokulována přibližně 103 pfu virů PR8, NS1-99 nebo delNSl inkubovaných při 37 °C 2 dny, a potom byly viry přítomné v alantoické tekutině titrovány testem hemaglutinace (HA). Jak je ukázáno v tabulce 3, zatímco viry standardního typu rostly na podobné titry HA v embryích ve stáří 6, 10 a 14 dnů, virus delNSl se replikoval do detekovatelného titru HA pouze ve vejcích stáří 6 dnů. Naopak virus NS1-99 ukazoval chování na rozmezí mezi virem delNSl a virem
-21 CZ 306637 B6 standardního typu, a byl schopen růst do vysokých titrů HA podobných titrům viru standardního typu ve vejcích stáří 10 dnů, ale ne již ve vejcích starých 14 dnů.
Tabulka 3
Replikace viru v kuřecích embryích
Virus Stáří vajec Titr1 zjištěný hemaglutinací
6 dnů 10 dnů 14 dnů
WTPR82 2,048 4,096 1,071
NS1/99 N.D.3 2,048 <2
delNSl 64 <2 <2
1 Titry znamenají nejvyšší zředění, při kterém dojde k hemaglutinační aktivitě.
2 Virus chřipky A/PR/8/34 standardního typu.
3 Nebylo stanoveno.
Vlastnosti viru NS1-99 z hlediska oslabení byly dále studovány u myší. K. tomuto účelu byly skupiny pěti myší BALC/c intranazálně infikovány 5 x 106 pfu, 1,5 x 105 nebo 1,5 x 103 pfu virů PR8 standardního typu nebo NS1-99. Myší potom byly monitorovány v průběhu tří týdnů na přežití. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 4. Virus NS1-99 měl hodnotu LD50 alespoň o tři řády vyšší než byla hodnota u viru standardního typu.
Tabulka 4
Oslabení viru NS1-99 u myší
Virus Infekční dávka (pfu) Počet zvířat, která přežila
5 x 106 1,5 x 105 5 x 103
WT PR81 1/5 1/5 1/5
NS1-99 3/5 5/5 5/5
1 Virus chřipky A/PR/8/34 standardního typu.
Příklad 2: Vytvoření a charakterizace NS1-zkrácených mutant u viru chřipek typu B
Materiály a metody
Podrobnosti experimentu jsou podobné jako v příkladu 1. Dva mutantní viry chřipky typu B, B/610B5B/201 (B/201) a B/AWBY-234, o délce 127 aminokyselin, popřípadě 90 aminokyselin(proteiny NS1 zkrácené na C-konci) (Norton, a další, 1987 Virology 156: 204; Tobita, a další, 1990, Virology 174: 314), byly odvozeny z koinfekčních experimentů ve tkáňové kultuře zahrnující viry B/Yamagata/1/73 (B/Yam) a A/Aichi/2/68 v přítomnosti protilátky anti-A (H3N2). Růst
- 22 CZ 306637 B6 mutantních virů chřipky v embryích ve vejcích různého stáří byl porovnáván se schopností růstu rodičovského viru B/Yam, který má protein NSI o délce 281 aminokyselin standardního typu. Vejce stáří 6, 10 a 14 dnů byla očkována přibližně 103 pfu Β/Yam, B/201 nebo B/AWBY-234, inkubována při 35 °C 2 dny a viry přítomné v alantoické kapalině byly titrovány testem HA.
Potom byly vlastnosti z hlediska oslabení virů B/201 a B/AWBY-234 určovány u myší. Skupiny tří myší BALB/c byly intranazálně infikovány 3 x 105 pfu viru B/YAM standardního typu nebo mutantních virů B/201 a B/AWBY/234 a schopnost těchto virů replikovat se byla určována měřením titrů virů v plicích tři dny po infekci, protože virus Β/Yam standardního typu nevyvolává u myší zjevné známky onemocnění.
Výsledky
Tabulka 5
Replikace viru chřipky typu B v kuřecích embryích
Virus Stáří vajec Titr zjištěný hemaglutinací
6 dnů 10 dnů 14 dnů
B/Yam 362 256 <2
B/201 32 <2 <2
B/AWBY-234 8 <2 <2
Výsledky zjišťování růstu virů chřipky typu B standardního typu nebo mutantních v kuřecích embryích ukázané v tabulce 5 dokazují, že jako v případě viru typu A, zkrácení NSI na karboxylovém konci viru chřipky typu B odpovídá za nižší výtěžek replikace u starších kuřecích embryí, které se vyznačují účinnou odpovědí IFN. Toto zjištění ukazuje, že NSI viru chřipky typu B se také účastní inhibice odpovědí u hostitele, a že delece v genu NSI viru chřipky typu B vede k oslabenému fenotypu.
Výsledky experimentů s replikací u myší se uvádějí v tabulce 6. Titry virů B/201 a B/AWBY234 byly přibližně o tři řády nižší než titry B/Yam, což ukazuje, že zkrácení karboxykoncové domény NSI viru chřipky typu B odpovídají za oslabený fenotyp u myší.
Tabulka 6
Replikace viru chřipky/typu B v plicích u myší
Virus Titry v plicích 3 dny po infekci (pfu/plíci)
B/Yam 2 x 104 1 x 104 3 X 10
B/201 30 <10 60
B/AWBY-234 <10 40 <10
-23 CZ 306637 B6
Ochrana proti infekci virem chřipky standardního typu u myší imunizovaných viry chřipky typu A a B obsahujícími delece ve svých proteinech NS1
Aby bylo možno zjistit, zda jsou myši imunizované oslabenými viry chřipky typu A a B obsahujícími zkrácené proteiny NS1 proti zkušebnímu podávání odpovídajících virů standardního typu, byl proveden následující experiment. Myši BALB/c byly imunizovány intranazálně virem A/NS1-99 a o tři týdny později byly infikovány stonásobkem 100 LD50 viru chřipky A/PR/8/34 standardního typu. Imunizovaná zvířata byla chráněna před úmrtím, zatímco všechna kontrolní zvířata po podání zahynula (viz tab. 7). Ve druhém experimentu byly myši BALB/c intranazálně imunizovány viry chřipky typu Β B/201 nebo B/AWBY-234 exprimujícími zkrácené proteiny NS1. O tři týdny později byl myším podán v množství 3 x 105 pfu virus chřipky standardního typu B/Yam/1/73. Protože tento kmen viru chřipky typu B neindukuje u myší příznaky onemocnění, stupeň ochrany byl určen měřením titrů viru v plicích 3 dny po podání. Zatímco nevakcinovaná kontrolní zvířata měla titry přibližně 104 pfu/plíce, v plicích imunizovaných zvířat nebyly viry detekovány (viz tab. 8). Tato zjištění ukazují, že viry chřipky typu A stejně jako typu B, obsahující modifikované geny NS1, jsou schopny indukovat u myší imunitní odpověď, která zcela chrání proti následnému podání viru standardního typu.
Tabulka 7
Přežívání myší imunizovaných virem chřipky A/NS1-99 po testovacím podání stonásobku LD50 viru chřipky A/PR/8/34standardního typu
Imunizační dávka viru A/NS1-99 Počet myší, které přežily/celkový počet
5 x 106 pfu 3/3
1,5 x 105 pfu 4/4
PBS 0/5
Tabulka 8
Titry virů v plicích myší imunizovaných viry chřipky B/201 a B/AWBY-234 po testovacím podání 3 x 105 pfu viru chřipky B/Yamagata/73 standardního typu
Imunizační dávka Titry v plicích (pfu/plíce)
3 x 105 pfu B/201 <101, <101, <101, <101, <101
3 x 105 pfu B/AWBY-234 <101, <101, <101, <101, <101
PBS 2,5 x 104, 1 x 104, 1,7 x 104, 3 x 105, 5 x 105
Příklad 3: Indukce interferonu typu I v embryích ve vejcích infikovaných virem delNSl
Schopnost viru delNSl, tj. viru chřipky A postrádajícího gen NS1, indukovat sekreci IFN typu I v kuřecích embryích byla zjišťována v následujícím experimentu. K tomuto účelu byla infikována desetidenní kuřecí embrya 5 x 103 pfu virů delNSl nebo PR8 standardního typu. Osmnáct hodin po inkubaci při 37 °C byla sklizena alantoická tekutina a dialyzována proti kyselému pH
-24CZ 306637 B6 přes noc, aby se inaktivovaly infekční viry. Po zpracování pomocí kyselého pH byly vzorky dialyzovány proti PBS a potom byly testovány na aktivitu IFN stanovením nejvyššího ředění s ochrannými účinky proti infekci VSV (přibližně 200 pfu) v buňkách CEF. Výsledky uvedené v tabulce 9 ukazují, že v nepřítomnosti NS1 jsou viry chřipky typu A silnějšími induktory IFN.
Tabulka 9
Indukce IFN ve vejcích
Virus IFN (U/ml)
PR8 <16, <16
delNSl 400, 400
mock <16, <16
Příklad 4: Antivirová aktivita viru delNSl
Eliminace IFN-antagonistického (NS1) genu z chřipky typu A může u viru vést ke schopnosti indukovat vysoké hladiny IFN. V takovém případě bude virus delNSl „interferovat“ s replikací virů senzitivních na interferon. Aby bylo možno testovat tuto možnost, přihlašovatelé testovali schopnost viru delNSl inhibovat replikaci viru chřipky A/WSN/33, běžně používaného laboratorního kmene viru chřipky (WSN), ve vejcích. Jak je vidět na obr. 1, působení pouze dvou pfu viru delNSl bylo schopno snížit konečné titry viru WSN v alantoické tekutině o jeden řád. Navíc vedlo působení 2 x 104 pfu viru delNSl k prakticky úplnému zastavení replikace WSN ve vejcích. Virus delNSl byl také schopen interferovat s replikací jiných kmenů virů chřipky typu A (H1N1 a H3N2), viru chřipky typu B a odlišných virů jako virus Sendai ve vejcích (obr. 2).
Na základě těchto výsledků přihlašovatelé dále zjišťovali schopnost viru delNSl interferovat s replikací viru chřipky standardního typu u myší. I když léčení IFN typu I v tkáňové kultuře zabrání replikaci viru chřipky typu A in vitro, ošetření myši IFN není schopné replikaci virů chřipky zabránit (Haller, 1981, Current Top Microbiol. Immunol. 92: 25 - 52). Tak je tomu u většiny inbredních kmenů myší kromě myší A2G. Myši A2G, stejně jako značná část divokých myší (přibližně 75 %), obsahují alespoň jednu intaktní alelu Mxl, zatímco většina laboratorních kmenů jsou Mxl-/- (Haller, 1986, Current Top Microbiol. Immunol. 127: 331 -337). Protein Mxl, který je homologem lidského proteinu MxA (Aebi, 1989, Mol. Cell. Biol. 11: 5062), je silným inhibitorem replikace viru chřipky (Haller, 1980, Nature 283: 660). Tento protein není exprimován konstitutivně, ale jeho exprese je indukována transkripčně interferonem typu I. Myši A2G tedy mohou být použity pro testování schopnosti induktorů IFN stimulovat antivirovou odpověď proti virům chřipky typu A (Haller, 1981, Current Top Microbiol. Immunol. 92: 25 - 52).
Přihlašovatelé intranazálně infikovali osm čtyřtýdenních myší A2G 5 x 106 pfu vysoce patogenního izolátu viru chřipky A/PR/8/34 (Haller, 1981, Current Top Microbiol. Immunol. 92: 25 52). Polovina myší dostala intranazálně 5 x 106 pfu delNSl o 24 hodin dříve, než došlo k infekci PR8. Další čtyři myši byly ošetřeny samotným PBS. Byly monitorovány změny tělesné hmotnosti a přežívání. Tyto výsledky ukazují, že působení delNSl bylo schopno chránit myši A2G proti úmrtí indukovanému virem chřipky a tělesnému úbytku. Stejné ošetření nebylo účinné u myší Mxl—/-, což ukazuje, že mechanismus ochrany před viry byl zprostředkován Mxl, tj. IFN.
-25 CZ 306637 B6
Příklad 5: Antitumorové vlastnosti viru delNSl u myší
Protože bylo zjištěno, že IFN typu 1 a/nebo induktory IFN typu 1 mají antitumorové vlastnosti (Belardelli a Gresser, 1996 Immunology Today 17: 369 - 372; Qin, a další, 1998, Proc. Nati. Acad. Sci. 95: 14411 - 14416), je možné, že léčení tumorů virem delNSl by mohlo zprostředkovat ústup tumoru. Alternativně by mohl mít virus delNSl onkolytické vlastnosti, tj. může být schopen specificky růst a zabíjet tumorové buňky, u kterých je známo, že mnoho z nich má deficience v systému IFN. Aby bylo možno testovat antitumorovou aktivitu viru delNSl, byl proveden následující experiment s použitím buněčné linie vyššího karcinomu CT26.WT v modelu tumoru u myší, zjišťujícím plicní metastázy (Restifo, a další, 1998 Virology 249: 89 - 97). 5 x 105 buněk CT26.WT bylo intravenózně vstříknuto dvanácti myším BALB/c stáří 6 týdnů. Polovina myší byla intranazálně ošetřena 106 pfu viru delNSl každých 24 hodin ve dnech 1, 2 a 3 po inokulaci. Dvanáct dnů po injekci tumoru byly myši usmrceny a byly počítány metastázy v plicích. Jak je ukázáno v tabulce 10, ošetření delNSl způsobilo podstatný úbytek plicních metastáz u myší.
Tabulka 10
Antitumorová aktivita viru delNSl v myších BALB/C, kterým byly podány tumorové buňky CT26.WT
Počet metastáz v plicích
Podání PBS Podání delNSl
Myš 1 >250 120
Myš 2 >250 28
Myš 3 >250 9
Myš 4 >250 6
Myš 5 >250 2
Myš 6 >250 1
Příklad 6: Protein NS1 inhibuje translokaci IRF-3 v průběhu infekce virem chřipky
Dále popisované výsledky ukazují, že protein NS1 viru chřipky je odpovědný za inhibici odpovědi typu 1 IFN proti viru, a že mutace/delece v tomto proteinu vedou k získání oslabených virů v důsledku zvýšení odpovědi IFN při infekci. Je známo, že syntéza IFN typu I při virové infekci může být spuštěna dvojřetězcovou RNA (dsRNA). IRF-3 je transkripční faktor, který se obvykle nachází v inaktivní formě v cytoplazmě savčích buněk. Dvojřetězcová RNA indukuje fosforylaci (aktivaci) transkripčního faktoru IRF-3, což vede k jeho přemístění do jádra, kde indukuje transkripci specifických genů včetně genů kódujících IFN typu 1 (Weaver, a další, 1998, Mol. Cell. Biol. 18: 1359). Pro zjištění, zda NS1 chřipky působí na IRF-3, byla monitorována lokalizace IRF-3 v buňkách CV1 infikovaných virem PR8 standardního typu nebo virem delNSl chřipky typu A. Obr. 3 ukazuje, že v buňkách infikovaných PR8 je translokace IRF-3 minimální (v méně než 10 % buněk). Naopak přibližně 90 % buněk infikovaných delNSl ukázalo nukleární lokalizaci IRF-3. Bylo možné částečně inhibovat translokaci IRF-3 v buňkách infikovaných delNSl expresí NS1 z plasmidu in trans. Výsledky ukazují, že NS1 viru chřipky typu A je schopen inhibovat translokaci IRF-3 u buněk infikovaných virem. Je pravděpodobné, že NS1 viru chřipky
-26CZ 306637 B6 zabrání aktivaci IRF-3 zprostředkované dsRNA sekvestrací dsRNA vytvořené během infekce virem, což vede k inhibicí syntézy IFN.
Předkládaný vynález není omezen konkrétními provedeními popisovanými v příkladech, která se považují pouze za jednotlivé ilustrace určitých aspektů vynálezu; do rozsahu předkládaného vynálezu spadají jakékoli konstrukty nebo viry, které jsou funkčně ekvivalentní. Odborníkům v oboru budou z předchozího popisu a výkresů samozřejmě zjevné různé modifikace vynálezu, navíc k ukázaným a popsaným provedením. Také tyto modifikace mají spadat do rámce přiložených nároků.
U různých zde citovaných odkazů jsou jejich obsahy zařazeny ve svém celku.

Claims (25)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Použití oslabeného viru chřipky získaného genetickým inženýrstvím pro výrobu léčiva pro použití při prevenci nebo léčení infekčního onemocnění citlivého na interferon u subjektu, kde genom oslabeného viru získaného genetickým inženýrstvím kóduje zkrácený protein NS1, který má od 1 do 130 aminokyselin proteinu NS1 kmene viru chřipky, od 1 do 120 aminokyselin proteinu NS1 kmene viru chřipky, od 1 do 110 aminokyselin proteinu NS1 kmene viru chřipky, od 1 do 100 aminokyselin proteinu NS1 kmene viru chřipky, od 1 do 99 aminokyselin proteinu NS1 kmene viru chřipky, od 1 do 90 aminokyselin proteinu NS1 kmene viru chřipky, od 1 do 89 aminokyselin proteinu NS1 kmene viru chřipky, od 1 do 70 aminokyselin proteinu NS1 kmene viru chřipky, nebo od 1 do 60 aminokyselin proteinu NS1 kmene viru chřipky, kde N-koncová aminokyselina má číslo 1, a virus chřipky získaný genetickým inženýrstvím má sníženou schopnost antagonizovat buněčnou odpověď na interferon, a kde oslabený virus chřipky získaný genetickým inženýrstvím, kódující zkrácený protein NS1, který má od 1 do 89 aminokyselin proteinu NS1 kmene viru chřipky, je virus chřipky B.
  2. 2. Použití podle nároku 1, při kterém genom oslabeného viru chřipky získaného genetickým inženýrstvím kóduje zkrácený protein NS1, který má od 1 do 130 aminokyselin proteinu NS1 kmene viru chřipky, od 1 do 120 aminokyselin proteinu NS1 kmene viru chřipky, od 1 do 110 aminokyselin proteinu NS1 kmene viru chřipky, od 1 do 100 aminokyselin proteinu NS1 kmene viru chřipky, nebo od 1 do 90 aminokyselin proteinu NS1 kmene viru chřipky.
  3. 3. Použití podle nároku 1, při kterém genom oslabeného viru chřipky získaného genetickým inženýrstvím kóduje zkrácený protein NS1, který má od 1 do 99 aminokyselin proteinu NS1 kmene viru chřipky.
  4. 4. Použití podle nároku 1, při kterém genom oslabeného viru chřipky získaného genetickým inženýrstvím kóduje zkrácený protein NS1, který má od 1 do 89 aminokyselin proteinu NS1 kmene viru chřipky B.
  5. 5. Použití podle nároku 1, při kterém genom oslabeného viru chřipky získaného genetickým inženýrstvím kóduje zkrácený protein NS1, který má od 1 do 70 aminokyselin proteinu NS1 kmene viru chřipky, nebo 1 až 60 aminokyselin proteinu NS1 kmene viru chřipky.
  6. 6. Použití podle nároku 1 nebo 3, kde oslabený virus chřipky je NS1/99.
  7. 7. Použití podle nároků 1, 2, 3 nebo 5, kde oslabený virus chřipky, jehož genom kóduje zkrácený protein NS1, který má od 1 do 130 aminokyselin, od 1 do 120 aminokyselin, od 1 do 110 aminokyselin, od 1 do 100 aminokyselin, od 1 do 99 aminokyselin, od 1 do 90 aminokyselin, od
    -27CZ 306637 B6
    1 do 70 aminokyselin, nebo od 1 do 60 aminokyselin proteinu NS1 kmene viru chřipky, je virus chřipky A.
  8. 8. Použití podle kteréhokoli z nároků 1 až 5, kde oslabený virus chřipky je virus chřipky B.
  9. 9. Použití podle kteréhokoli z předcházejících nároků, kde infekční onemocnění je virová infekce.
  10. 10. Použití podle nároku 9, kde virová infekce je infekce virem chřipky.
  11. 11. Použití podle kteréhokoli z předcházejících nároků, kde koncentrace oslabeného viru chřipky je přibližně 104 až přibližně 5 x 106 pfu.
  12. 12. Použití podle kteréhokoli z předcházejících nároků, kde léčivo je formulované pro intradermální, intramuskulární, intraperitoneální, intravenózní, subkutánní, intranazální, epidurální nebo orální podávání.
  13. 13. Použití podle kteréhokoli z nároků 1 až 11, kde léčivo je formulované pro plicní podávání.
  14. 14. Použití podle kteréhokoli z předcházejících nároků, kde subjekt je člověk.
  15. 15. Oslabený virus chřipky získaný genetickým inženýrstvím, kde genom oslabeného viru chřipky získaného genetickým inženýrstvím kóduje zkrácený protein NS1, který má od 1 do 130 aminokyselin proteinu NS1 kmene viru chřipky, od 1 do 120 aminokyselin proteinu NS1 kmene viru chřipky, od 1 do 110 aminokyselin proteinu NS1 kmene víru chřipky, od 1 do 100 aminokyselin proteinu NS1 kmene viru chřipky, od 1 do 99 aminokyselin proteinu NS1 kmene viru chřipky, od 1 do 90 aminokyselin proteinu NS1 kmene viru chřipky, od 1 do 89 aminokyselin proteinu NS1 kmene viru chřipky, od 1 do 70 aminokyselin proteinu NS1 kmene viru chřipky, nebo od 1 do 60 aminokyselin proteinu NS1 kmene viru chřipky, kde N-koncová aminokyselina je číslo 1, a virus chřipky získaný genetickým inženýrstvím má sníženou schopnost antagonizovat buněčnou odpověď na interferon, pro použití při léčení nebo prevenci infekčního onemocnění citlivého na interferon u subjektu, a kde oslabený virus chřipky získaný genetickým inženýrstvím kódující zkrácený protein NS1, který má od 1 do 89 aminokyselin proteinu NS1 kmene viru chřipky, je virus chřipky B.
  16. 16. Oslabený virus chřipky získaný genetickým inženýrstvím pro použití podle nároku 15, ve které genom oslabeného viru chřipky získaného genetickým inženýrstvím kóduje zkrácený protein NS1, který má od 1 do 130 aminokyselin proteinu NS1 kmene viru chřipky, od I do 120 aminokyselin proteinu NS1 kmene viru chřipky, od 1 do 110 aminokyselin proteinu NS1 kmene viru chřipky, od 1 do 100 aminokyselin proteinu NS1 kmene viru chřipky, od 1 do 99 aminokyselin proteinu NS1 kmene viru chřipky, nebo od 1 do 90 aminokyselin proteinu NS1 kmene viru chřipky.
  17. 17. Oslabený virus chřipky získaný genetickým inženýrstvím pro použití podle nároku 15, ve kterém genom oslabeného viru chřipky získaného genetickým inženýrstvím kóduje zkrácený protein NS1, který má od 1 do 89 aminokyselin proteinu NS1 kmene viru chřipky B.
  18. 18. Oslabený virus chřipky získaný genetickým inženýrstvím pro použití podle nároku 15, ve kterém genom oslabeného viru chřipky získaného genetickým inženýrstvím kóduje zkrácený protein NS1, který má od 1 do 70 aminokyselin proteinu NS1 kmene viru chřipky, nebo od 1 do 60 aminokyselin proteinu NS1 kmene viru chřipky.
  19. 19. Oslabený virus chřipky získaný genetickým inženýrstvím pro použití podle nároků 15, 16 nebo 18, kde oslabený virus chřipky, jehož genom kóduje zkrácený protein NSI, který má od 1 do 130 aminokyselin, od 1 do 120 aminokyselin, od 1 do 110 aminokyselin, od 1 do 100 amino
    -28CZ 306637 B6 kyselin, od 1 do 99 aminokyselin, od 1 do 90 aminokyselin, od 1 do 70 aminokyselin, nebo od 1 do 60 aminokyselin proteinu NS1 kmene viru chřipky, je virus chřipky A.
  20. 20. Oslabený virus chřipky získaný genetickým inženýrstvím pro použití podle kteréhokoli z nároků 15 až 18, kde oslabený virus chřipky je virus chřipky B.
  21. 21. Oslabený virus chřipky získaný genetickým inženýrstvím pro použití podle kteréhokoli z nároků 15 až 20, kde virus je formulovaný pro intradermální, intramuskulámí, intraperitoneální, intravenózní, subkutánní, intranazální, epidurální nebo orální podávání.
  22. 22. Oslabený virus chřipky získaný genetickým inženýrstvím pro použití podle kteréhokoli z nároků 15 až 20, kde virus je formulovaný pro plicní podávání.
  23. 23. Oslabený virus chřipky získaný genetickým inženýrstvím pro použití podle kteréhokoli z nároků 15 až 22, kde infekční onemocnění je virová infekce.
  24. 24. Oslabený virus chřipky získaný genetickým inženýrstvím pro použití podle nároku 23, kde virová infekce je infekce virem chřipky.
  25. 25. Oslabený virus chřipky získaný genetickým inženýrstvím podle kteréhokoli z nároků 15 až 24, kde subjekt je člověk.
CZ2011-316A 1998-06-12 1999-06-11 Oslabený virus chřipky a vakcína CZ306637B6 (cs)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US8910398P 1998-06-12 1998-06-12
US10883298P 1998-11-18 1998-11-18
US11768399P 1999-01-29 1999-01-29
PCT/US1999/013142 WO1999064570A1 (en) 1998-06-12 1999-06-11 Novel methods and interferon deficient substrates for the propagation of viruses

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ306637B6 true CZ306637B6 (cs) 2017-04-12

Family

ID=27376229

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20004635A CZ302601B6 (cs) 1998-06-12 1999-06-11 Oslabený virus chripky
CZ2011-316A CZ306637B6 (cs) 1998-06-12 1999-06-11 Oslabený virus chřipky a vakcína

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20004635A CZ302601B6 (cs) 1998-06-12 1999-06-11 Oslabený virus chripky

Country Status (24)

Country Link
US (12) US6669943B1 (cs)
EP (4) EP2316923B1 (cs)
JP (7) JP4837827B2 (cs)
KR (2) KR20060080249A (cs)
CN (1) CN1312725A (cs)
AT (1) ATE351901T1 (cs)
AU (2) AU771110B2 (cs)
BR (1) BR9911163A (cs)
CA (2) CA2334850C (cs)
CY (1) CY1113689T1 (cs)
CZ (2) CZ302601B6 (cs)
DE (1) DE69934885T2 (cs)
DK (4) DK2316923T3 (cs)
ES (4) ES2281177T3 (cs)
HU (1) HUP0102441A3 (cs)
IL (6) IL140264A0 (cs)
MX (2) MXPA00012403A (cs)
NO (1) NO20006328L (cs)
NZ (2) NZ509055A (cs)
PL (3) PL212316B1 (cs)
PT (1) PT1085904E (cs)
RU (1) RU2236252C2 (cs)
SK (3) SK288567B6 (cs)
WO (2) WO1999064068A1 (cs)

Families Citing this family (77)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030044384A1 (en) 1997-10-09 2003-03-06 Pro-Virus, Inc. Treatment of neoplasms with viruses
US7470426B1 (en) 1997-10-09 2008-12-30 Wellstat Biologics Corporation Treatment of neoplasms with viruses
US7780962B2 (en) 1997-10-09 2010-08-24 Wellstat Biologics Corporation Treatment of neoplasms with RNA viruses
PL212316B1 (pl) * 1998-06-12 2012-09-28 Sinai School Medicine Zastosowania preparatów szczepionek, zastosowania preparatów farmaceutycznych oraz sposoby wytwarzania szczepionek
EP1390046A4 (en) * 1999-04-15 2005-04-20 Wellstat Biologics Corp TREATMENT OF NEOPLASMS WITH VIRUSES
ES2260057T3 (es) 1999-09-17 2006-11-01 Wellstat Biologics Corporation Virus oncolitico.
US8147822B1 (en) 1999-09-17 2012-04-03 Wellstat Biologics Corporation Oncolytic virus
AU2001250352B2 (en) * 2000-03-02 2006-01-12 Polymun Scientific Immunbiologische Forschung Gmbh Recombinant influenza a viruses
AU2001257001A1 (en) 2000-04-10 2001-10-23 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Screening methods for identifying viral proteins with interferon antagonizing functions and potential antiviral agents
DE10020505A1 (de) * 2000-04-26 2001-10-31 Conzelmann Karl Klaus RSV NS Proteine antagonisieren die Interferon (IFN) Antwort
KR20030061810A (ko) * 2000-09-25 2003-07-22 폴리문 사이언티픽 임무노이비오로기쉐 포르슝 게엠베하 생균 백신과 제조 방법
ES2522526T3 (es) 2001-02-14 2014-11-14 Anthrogenesis Corporation Placenta post-parto de mamíferos, su uso y células troncales placentarias de la misma
WO2002094423A1 (en) 2001-05-22 2002-11-28 Access Business Group International Llc Method and apparatus for blending and dispensing liquid compositions
US7282599B2 (en) 2001-07-16 2007-10-16 Avir Green Hills Biotechnology Research Devlopment Trade Ag Dithiocarbamate antiviral agents and methods of using same
US7037707B2 (en) * 2003-09-04 2006-05-02 St. Jude Children's Research Hospital Method for generating influenza viruses and vaccines
ES2694123T3 (es) 2004-06-01 2018-12-18 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Virus de la gripe porcina modificado por ingeniería genética y usos de los mismos
WO2006088481A2 (en) * 2005-02-15 2006-08-24 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Genetically engineered equine influenza virus and uses thereof
AT502275B8 (de) * 2005-08-08 2007-08-15 Greenhills Biotechnology Res D Immunantwort-induzierende zusammensetzungen
PL2251034T3 (pl) * 2005-12-02 2018-07-31 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Chimeryczne wirusy prezentujące nienatywne białka powierzchniowe i zastosowania tych wirusów
EP1911836A1 (en) 2006-10-12 2008-04-16 AVIR Green Hills Biotechnology Trading GmbH Medium supplement for virus production
US7860646B2 (en) * 2007-04-16 2010-12-28 The Boeing Company Method and apparatus for routing ocean going vessels to avoid treacherous environments
WO2008144067A1 (en) * 2007-05-21 2008-11-27 Board Of Regents, University Of Texas System Methods and compositions for treatment of cancer using oncolytic rsv activity
EP2045323A1 (en) * 2007-10-05 2009-04-08 Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade Ag Linear expression constructs for production of influenza virus particles
EP2048237A1 (en) 2007-10-05 2009-04-15 Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade Ag Replication deficient Influenza virus for the expression of heterologous sequences
EP2072058A1 (en) 2007-12-21 2009-06-24 Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade Ag Modified influenza virus
US8108138B2 (en) * 2008-10-02 2012-01-31 The Boeing Company Optimal vehicle router with energy management system
WO2010060921A1 (en) 2008-11-25 2010-06-03 Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade Ag METHOD FOR PRODUCTION OF pH STABLE ENVELOPED VIRUSES
EP2233568A1 (en) 2009-03-19 2010-09-29 Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade AG Novel method for generation of RNA virus
EP2376628B1 (en) 2008-12-16 2018-05-16 Ology Bioservices, Inc. Production of influenza vaccines
EP2233152A1 (en) 2009-03-24 2010-09-29 Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade Ag High growth reassortant influenza A virus
US8935174B2 (en) * 2009-01-16 2015-01-13 The Boeing Company Analyzing voyage efficiencies
WO2010091262A1 (en) 2009-02-05 2010-08-12 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Chimeric newcastle disease viruses and uses thereof
EP2413962A1 (en) 2009-03-30 2012-02-08 Mount Sinai School of Medicine Influenza virus vaccines and uses thereof
USH2283H1 (en) 2009-04-27 2013-09-03 Novartis Ag Vaccines for protecting against influenza
WO2010144797A2 (en) 2009-06-12 2010-12-16 Vaccine Technologies, Incorporated Influenza vaccines with enhanced immunogenicity and uses thereof
JP2012531929A (ja) * 2009-07-06 2012-12-13 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド バイオプロセシング
IN2012DN00729A (cs) 2009-07-22 2015-06-19 Avir Green Hills Biotechnology
WO2011014504A1 (en) 2009-07-27 2011-02-03 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Recombinant influenza virus vectors and uses thereof
US8828406B2 (en) 2009-07-30 2014-09-09 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Influenza viruses and uses thereof
KR20120039047A (ko) 2009-07-31 2012-04-24 노파르티스 아게 역유전학 시스템
EP2295543A1 (en) * 2009-09-11 2011-03-16 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Method for the preparation of an influenza virus
CA2792537A1 (en) 2010-03-30 2011-10-06 Mount Sinai School Of Medicine Influenza virus vaccines and uses thereof
US8597637B1 (en) 2010-05-18 2013-12-03 Weidong Zhang Breast cancer therapy using an engineered respiratory syncytial virus
EP2576773A2 (en) * 2010-06-02 2013-04-10 Avir Green Hills Biotechnology Research Development Trade AG Methods and helper viruses for the generation of rna virus
US9044499B1 (en) 2010-06-22 2015-06-02 Weidong Zhang NS1/2-deficient respiratory syncytial virus and melanoma treatment
US8377901B2 (en) * 2010-07-07 2013-02-19 The University Of Manitoba Target host factors for treating viral infection
CN102021149B (zh) * 2010-07-27 2013-04-24 张卫东 基因ns1缺陷型呼吸道合胞病毒及其治疗肺癌的应用
CN102021148A (zh) * 2010-07-27 2011-04-20 张卫东 一种基因ns1缺陷型呼吸道合胞病毒及其应用
EP2758075B1 (en) 2011-09-20 2023-05-03 Icahn School of Medicine at Mount Sinai Influenza virus vaccines and uses thereof
US9157746B2 (en) 2011-11-16 2015-10-13 The Boeing Company Vessel routing system
JP2016508133A (ja) 2012-12-18 2016-03-17 アイカーン スクール オブ メディシン アット マウント サイナイ インフルエンザウイルスワクチン及びその使用
CN103330723A (zh) * 2013-01-14 2013-10-02 艾克星（武汉）生物医药科技有限公司 基因工程呼吸道合胞病毒（△ns1 rsv)在治疗癌症药物中的用途
BR112015021414B1 (pt) 2013-03-14 2020-11-10 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai vírus da doença newcastle e seus usos
US9908930B2 (en) 2013-03-14 2018-03-06 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Antibodies against influenza virus hemagglutinin and uses thereof
SG11201607130RA (en) 2014-02-27 2016-09-29 Viralytics Ltd Combination method for treatment of cancer
JP2018504412A (ja) 2015-01-23 2018-02-15 アイカーン スクール オブ メディシン アット マウント サイナイ インフルエンザウイルスワクチン接種レジメン
CN107250353B (zh) 2015-02-26 2021-07-23 勃林格殷格翰动物保健有限公司 二价猪流感病毒疫苗
US10947512B2 (en) 2015-08-14 2021-03-16 Research Institute At Nationwide Children's Hospital Respiratory syncytial virus having altered NS1 protein function and related materials and methods
RU2628690C2 (ru) * 2015-11-06 2017-08-21 Общество С Ограниченной Ответственностью 'Фарминтерпрайсез' Аттенуированные гриппозные векторы для профилактики и/или лечения инфекционных заболеваний, а также для лечения онкологических заболеваний
RU2660562C2 (ru) * 2016-03-30 2018-07-06 Общество с ограниченной ответственностью "ФАРМИНТЕРПРАЙСЕЗ БИОТЕХ" Аттенуированный гриппозный вектор и мукозальная универсальная гриппозная вакцина на его основе
EA037571B1 (ru) * 2015-11-06 2021-04-15 Общество с ограниченной ответственностью "ФАРМИНТЕРПРАЙСЕЗ БИОТЕХ" Аттенуированный вирус гриппа а, аттенуированный грипозный вектор, фармацевтическая композиция и их применение для профилактики или лечения инфекционных заболеваний, а также для лечения онкологических заболеваний
CA3005980A1 (en) 2015-11-24 2017-06-01 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Production of viruses in avian eggs
CN108603188A (zh) 2015-11-24 2018-09-28 联邦科学技术研究组织 在细胞培养物中产生病毒
EP3471767A4 (en) 2016-06-15 2020-01-15 Icahn School of Medicine at Mount Sinai INFLUENZA VIRUS HEMAGGLUTININS AND USES THEREOF
WO2018115308A1 (en) 2016-12-22 2018-06-28 Blue Sky Vaccines Gmbh Method for purifying virus
EP3596202A4 (en) 2017-03-14 2021-01-27 The Regents of the University of California GENOME-WIDE IDENTIFICATION OF IMMUNEVASIONAL FUNCTIONS IN A VIRUS
EP3606555A4 (en) 2017-04-07 2021-08-04 Icahn School of Medicine at Mount Sinai INFLUENZA VIRUS TYPE B ANTI-NEURAMINIDASE ANTIBODIES AND THEIR USES
JOP20190256A1 (ar) 2017-05-12 2019-10-28 Icahn School Med Mount Sinai فيروسات داء نيوكاسل واستخداماتها
US11339377B2 (en) 2017-11-08 2022-05-24 Bluesky Immunotherapies Gmbh SO3 chromatography for use in a method for virus purification
US20220160863A1 (en) 2019-01-24 2022-05-26 Blue Sky Vaccines Gmbh High growth influenza virus
WO2020163768A1 (en) * 2019-02-07 2020-08-13 Duke University Stabilized 9 and 10 segmented influenza viruses as a vaccine platform and methods of making and using same
KR102370100B1 (ko) * 2019-02-15 2022-03-07 아이디바이오 주식회사 이종 인플루엔자 a 바이러스에 대한 면역/치료반응을 형성하는 신규한 재조합 인플루엔자 바이러스 및 이를 포함하는 유전자 전달체 및 치료백신
JP7222552B2 (ja) * 2020-01-30 2023-02-15 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 豚デルタコロナウイルスの増殖方法
WO2022112595A1 (en) * 2020-11-30 2022-06-02 Bluesky Immunotherapies Gmbh Novel replication deficient influenza a virus inducing high levels of type i interferon
WO2022125789A1 (en) * 2020-12-09 2022-06-16 Yale University Compositions and methods for treating, ameliorating, and/or preventing viral infections
EP4351623A1 (en) 2021-06-09 2024-04-17 Icahn School of Medicine at Mount Sinai Gene combination as a broad spectrum antiviral
CN115896035B (zh) * 2022-12-22 2024-04-16 苏州沃美生物有限公司 一种应用于病毒扩增的Vero细胞株、其构建方法及应用

Family Cites Families (53)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4071618A (en) * 1974-09-03 1978-01-31 Research Foundation For Microbial Diseases Of Osaka University Process for preparing virus disease live vaccines
US4215051A (en) 1979-08-29 1980-07-29 Standard Oil Company (Indiana) Formation, purification and recovery of phthalic anhydride
JPS57136528A (en) 1981-02-09 1982-08-23 Hayashibara Biochem Lab Inc Preparation of viral vaccine
US4873191A (en) 1981-06-12 1989-10-10 Ohio University Genetic transformation of zygotes
US4769330A (en) 1981-12-24 1988-09-06 Health Research, Incorporated Modified vaccinia virus and methods for making and using the same
JPS5939831A (ja) 1982-08-27 1984-03-05 Biseibutsu Kagaku Kenkyusho:Kk 豚用インフルエンザウイルス不活化ワクチン
US5106619A (en) * 1983-12-20 1992-04-21 Diamond Scientific Co. Preparation of inactivated viral vaccines
US4693981A (en) * 1983-12-20 1987-09-15 Advanced Genetics Research Institute Preparation of inactivated viral vaccines
JPS60202827A (ja) * 1984-03-28 1985-10-14 Chibaken 弱毒痘そうワクチン株
US5786199A (en) 1989-08-28 1998-07-28 The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Recombinant negative strand RNA virus expression systems and vaccines
US5854037A (en) 1989-08-28 1998-12-29 The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Recombinant negative strand RNA virus expression systems and vaccines
US5840520A (en) * 1989-08-28 1998-11-24 Aviron Recombinant negative strand RNA virus expression systems
US5166057A (en) * 1989-08-28 1992-11-24 The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Recombinant negative strand rna virus expression-systems
US5766601A (en) 1990-08-08 1998-06-16 University Of Massachusetts Medical Center Cross-reactive influenza a immunization
ES2112335T3 (es) 1991-10-07 1998-04-01 Biogen Inc Procedimiento profilactico o terapeutico de enfermedades de la piel causadas por celulas que presentan antigenos por medio de inhibidores de la interaccion entre cd2 y lfa-3.
US6162432A (en) * 1991-10-07 2000-12-19 Biogen, Inc. Method of prophylaxis or treatment of antigen presenting cell driven skin conditions using inhibitors of the CD2/LFA-3 interaction
ES2053413T3 (es) 1992-05-14 1997-11-16 Polymun Scient Immunbio Forsch Peptidos que inducen anticuerpos que neutralizan aislados de vih-1 geneticamente divergentes.
US7344722B1 (en) 1993-06-29 2008-03-18 The Regents Of The University Of Michigan Cold-adapted influenza virus
ES2210273T5 (es) 1994-07-18 2010-03-29 Conzelmann, Karl-Klaus, Prof. Dr. Virus con arn de cadena negativa no segmentado recombinante infeccioso.
US6300090B1 (en) 1994-07-29 2001-10-09 The Rockefeller University Methods of use of viral vectors to deliver antigen to dendritic cells
US6146873A (en) 1994-11-10 2000-11-14 Baxter Aktiengesellschaft Production of orthomyxoviruses in monkey kidney cells using protein-free media
US7153510B1 (en) 1995-05-04 2006-12-26 Yale University Recombinant vesiculoviruses and their uses
DE69510207T3 (de) 1995-08-09 2007-02-15 Schweiz. Serum- & Impfinstitut Bern Verfahren zur Herstellung von infektiösen minussträngigen RNA-Viren
US5840565A (en) * 1995-08-22 1998-11-24 The Regents Of The University Of California Methods for enhancing the production of viral vaccines in PKR-deficient cell culture
AU727923B2 (en) 1995-09-27 2001-01-04 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Production of infectious respiratory syncytial virus from cloned nucleotide sequences
GB9605808D0 (en) * 1996-03-20 1996-05-22 Isis Innovation CFTR gene regulator
BRPI9710363B8 (pt) 1996-07-15 2021-07-06 Us Gov Health & Human Serv partìcula de vìrus sincicial respirátorio recombinante (rsv) infeccioso atenuado, vacina para induzir proteção contra o vìrus sincicial respiratório recombinante (rsv), vetor de expressão, e, método de produção de um vìrus sincicial respiratório recombinante (rsv) infeccioso.
AU4427897A (en) 1996-09-27 1998-04-17 American Cyanamid Company 3' genomic promoter region and polymerase gene mutations responsible for att enuation in viruses of the order designated mononegavirales
US6330090B1 (en) * 1997-02-14 2001-12-11 Photonetics Optical fiber wavelength, multiplexer and demultiplexer
US6030785A (en) * 1997-03-05 2000-02-29 University Of Washington Screening methods to identify agents that selectively inhibit hepatitis C virus replication
US5891705A (en) * 1997-04-08 1999-04-06 Pentose Pharmaceuticals, Inc. Method for inactivating a virus
US6884414B1 (en) 1997-04-30 2005-04-26 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Recombinant influenza viruses expressing tumor-associated antigens as antitumor agents
KR100702523B1 (ko) 1997-05-23 2007-04-04 더 가번먼트 오브 더 유나이티드 스테이츠 오브 아메리카, 에즈 레프리젠티드 바이 더 디파트먼트 오브 헬쓰 앤드 휴먼 서비시즈 클로닝된 뉴클레오타이드 서열로부터 약독화된파라인플루엔자 바이러스를 제조하는 방법
DE69837764T2 (de) 1997-07-11 2008-01-31 Yale University, New Haven Rhabdovirus mit gentechnisch veränderter hülle
KR20010030630A (ko) 1997-09-19 2001-04-16 윌리암 에이취 캘넌, 에곤 이 버그 약독화 호흡 신시티아 바이러스
PL212316B1 (pl) 1998-06-12 2012-09-28 Sinai School Medicine Zastosowania preparatów szczepionek, zastosowania preparatów farmaceutycznych oraz sposoby wytwarzania szczepionek
DK1098961T3 (da) * 1998-06-12 2008-05-26 Andrej Y Dr Egorov Gensplejsede svækkede vira, der inducerer interferon
US6146642A (en) 1998-09-14 2000-11-14 Mount Sinai School Of Medicine, Of The City University Of New York Recombinant new castle disease virus RNA expression systems and vaccines
US6544785B1 (en) 1998-09-14 2003-04-08 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Helper-free rescue of recombinant negative strand RNA viruses
AT407958B (de) * 1999-02-11 2001-07-25 Immuno Ag Inaktivierte influenza-virus-vakzine zur nasalen oder oralen applikation
DE60033284T3 (de) 1999-07-14 2014-10-30 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai In vitro-rekonstitution von segmentierten, negativstrang-rna-viren
AU2001250352B2 (en) 2000-03-02 2006-01-12 Polymun Scientific Immunbiologische Forschung Gmbh Recombinant influenza a viruses
AU2001257001A1 (en) * 2000-04-10 2001-10-23 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Screening methods for identifying viral proteins with interferon antagonizing functions and potential antiviral agents
DE10020505A1 (de) 2000-04-26 2001-10-31 Conzelmann Karl Klaus RSV NS Proteine antagonisieren die Interferon (IFN) Antwort
KR20030061810A (ko) 2000-09-25 2003-07-22 폴리문 사이언티픽 임무노이비오로기쉐 포르슝 게엠베하 생균 백신과 제조 방법
AUPR343601A0 (en) * 2001-02-28 2001-03-29 Dickins, Philip Trenching machine
WO2004043404A2 (en) 2002-11-13 2004-05-27 Rutgers, The State University Process for designing inhibitors of influenza virus non-structural protein 1
ES2694123T3 (es) * 2004-06-01 2018-12-18 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Virus de la gripe porcina modificado por ingeniería genética y usos de los mismos
WO2006088481A2 (en) 2005-02-15 2006-08-24 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Genetically engineered equine influenza virus and uses thereof
US20070116717A1 (en) 2005-08-01 2007-05-24 Shneider Alexander M Influenza vaccine compositions and methods
AT502275B8 (de) * 2005-08-08 2007-08-15 Greenhills Biotechnology Res D Immunantwort-induzierende zusammensetzungen
PL2251034T3 (pl) 2005-12-02 2018-07-31 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Chimeryczne wirusy prezentujące nienatywne białka powierzchniowe i zastosowania tych wirusów
US7507411B2 (en) 2006-06-23 2009-03-24 University Of Saskatchewan Attenuated influenza NS1 variants

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
EGOROV, A. et al.: "Transfectant Influenza A Viruses with Long Deletions in the NS1 Protein Grow Efficiently in Vero Cells", Journal of Virology, vol. 72, no. 8, srpen 1998, str. 6437 - 6441 *
GARCIA-SASTRE, A. et al.: "Influenza A Virus Lacking the NS1 Gene Replicates in Interferon-Deficient Systems", Virology, vol. 252, no. 2, prosinec 1998, str. 324 -330 *

Also Published As

Publication number Publication date
US6573079B1 (en) 2003-06-03
WO1999064570A9 (en) 2000-03-09
ES2281177T3 (es) 2007-09-16
IL140265A (en) 2008-06-05
JP4837827B2 (ja) 2011-12-14
JP2002517470A (ja) 2002-06-18
EP2316923A3 (en) 2014-04-09
CZ20004635A3 (en) 2001-06-13
EP1086207A1 (en) 2001-03-28
NO20006328D0 (no) 2000-12-12
WO1999064068A9 (en) 2000-03-09
NZ509055A (en) 2004-02-27
US20090053264A1 (en) 2009-02-26
JP5829655B2 (ja) 2015-12-09
AU771110B2 (en) 2004-03-11
SK19072000A3 (sk) 2001-09-11
DK2316923T3 (en) 2018-01-08
US20100158942A1 (en) 2010-06-24
US20120258134A1 (en) 2012-10-11
CY1113689T1 (el) 2016-06-22
JP2010142248A (ja) 2010-07-01
US9352033B2 (en) 2016-05-31
CA2334895A1 (en) 1999-12-16
US8765139B2 (en) 2014-07-01
DK1085904T3 (da) 2013-02-25
WO1999064068A1 (en) 1999-12-16
JP2002517229A (ja) 2002-06-18
US6669943B1 (en) 2003-12-30
EP1086207B1 (en) 2007-01-17
AU770619B2 (en) 2004-02-26
ATE351901T1 (de) 2007-02-15
HUP0102441A2 (hu) 2001-10-28
US20160279227A1 (en) 2016-09-29
JP2014036654A (ja) 2014-02-27
US20040109877A1 (en) 2004-06-10
PL398576A1 (pl) 2012-10-08
AU4434599A (en) 1999-12-30
CA2334850C (en) 2013-11-26
PL212316B1 (pl) 2012-09-28
DK2316924T3 (en) 2018-01-02
EP1086207A4 (en) 2003-01-22
ES2653557T3 (es) 2018-02-07
DE69934885D1 (de) 2007-03-08
US7494808B2 (en) 2009-02-24
IL140264A (en) 2008-03-20
PL200977B1 (pl) 2009-02-27
KR100637937B1 (ko) 2006-10-23
EP1085904B1 (en) 2012-11-28
BR9911163A (pt) 2002-01-15
NO20006328L (no) 2001-02-02
PL346212A1 (en) 2002-01-28
PT1085904E (pt) 2013-03-05
NZ509054A (en) 2004-01-30
KR20060080249A (ko) 2006-07-07
US7588768B2 (en) 2009-09-15
US20140341948A1 (en) 2014-11-20
ES2400445T3 (es) 2013-04-09
DE69934885T2 (de) 2007-11-08
IL140264A0 (en) 2002-02-10
JP2011050384A (ja) 2011-03-17
EP1085904A4 (en) 2004-12-29
RU2236252C2 (ru) 2004-09-20
JP4531255B2 (ja) 2010-08-25
EP2316923A2 (en) 2011-05-04
JP2010099081A (ja) 2010-05-06
PL219128B1 (pl) 2015-03-31
JP2013226154A (ja) 2013-11-07
AU4434399A (en) 1999-12-30
SK288200B6 (sk) 2014-06-03
DK1086207T3 (da) 2007-05-29
KR20010052782A (ko) 2001-06-25
EP1085904A1 (en) 2001-03-28
US6852522B1 (en) 2005-02-08
EP2316924A3 (en) 2014-03-19
MXPA00012402A (es) 2003-07-14
EP2316924B1 (en) 2017-10-11
CA2334850A1 (en) 1999-12-16
EP2316924A2 (en) 2011-05-04
JP5810134B2 (ja) 2015-11-11
HUP0102441A3 (en) 2004-10-28
US20100233785A1 (en) 2010-09-16
WO1999064570A1 (en) 1999-12-16
JP5081220B2 (ja) 2012-11-28
IL140265A0 (en) 2002-02-10
SK288544B6 (sk) 2018-03-05
EP2316923B1 (en) 2017-10-18
SK288567B6 (sk) 2018-06-01
IL188362A0 (en) 2008-03-20
MXPA00012403A (es) 2003-05-15
CZ302601B6 (cs) 2011-08-03
US20050054074A1 (en) 2005-03-10
CA2334895C (en) 2016-01-19
US9387240B2 (en) 2016-07-12
US20090203114A1 (en) 2009-08-13
ES2650500T3 (es) 2018-01-18
CN1312725A (zh) 2001-09-12
US8057803B2 (en) 2011-11-15
IL189766A0 (en) 2008-08-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9387240B2 (en) Attenuated negative strand viruses with altered interferon antagonist activity for use as vaccines and pharmaceuticals

Legal Events

Date Code Title Description
MK4A Patent expired

Effective date: 20190611