KR20120039047A - 역유전학 시스템 - Google Patents

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KR20120039047A
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virus
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bacterial
influenza
construct
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KR1020127005113A
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필립 도르미트제르
마이클 프란티
피터 마손
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노파르티스 아게
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Abstract

본 발명은 세그먼트로 된 RNA 바이러스를 생산하기 위한 여러가지 역 유전학 시스템을 제공하는데, 여기서 시스템은 모든 그것들의 발현 구조물의 증식을 위해 세균을 필요로 하지 않는다.

Description

역유전학 시스템{REVERSE GENETICS SYSTEMS}
본 출원은 2009년 7월 31일 출원된 미국 가특허출원 제61/273,151호의 우선권을 주장하며, 그 전문은 본원에 참고로 포함된다.
기술분야
본 발명은 역 유전학의 분야이다. 더 나아가서, 본 발명은 예를 들어서, 여러가지 바이러스에 대해 예방하기 위한 백신을 제조하는데 사용하기 위한 바이러스의 제조에 관련된다.
역 유전학은 세포 배양물에서 바이러스의 재조합 발현 및 조작을 허용한다. 그것은 바이러스학 및 백신 제조에서 강력한 도구인데, 그것이 재편성(reassortant) 생산을 포함하여 바이러스의 신속한 생산 및/또는 변이를 허용하기 때문이다. 방법은 바이러스 게놈을 암호화한 다음 세포로부터 바이러스를 분리 (또는 "구급(rescuing)")하는 하나 이상의 플라스미드로 숙주 세포를 트랜스펙션하는 것을 수반한다. 그것은 양성 가닥 RNA 바이러스 [1,2], 음성 가닥 RNA 바이러스 [3,4] 및 이중 가닥 RNA 바이러스 [5]를 포함하는 RNA 바이러스의 널리 다양한 변종의 생산을 위해 사용될 수 있다.
공지의 방법의 결점은 그것들이 플라스미드에 의존한다는 것이다. 이들 플라스미드를 발생시키는 것은 세균에서 수행되어야 하는 클로닝 단계들을 요하는데, 이것은 세그먼트로 된 RNA 바이러스에 대해 수행하고 입증하기 위해 수일 내지 수주가 걸릴 수 있다. 이러한 지연은 계절 인플루엔자 백신의 연간 생산을 위한 시간계획에 지장을 주고 또한 유행병 출현에 신속한 대응을 방해한다. 더욱이, 세균의 사용은 바이러스 생산을 위한 숙주 세포를 트랜스펙션하기 위해 플라스미드가 사용될 때 세균성 오염물이 도입될 수도 있는 위험을 동반한다. 이들 결점은 참고문헌 6에서 플라스미드의 대신에 선형 발현 구조물을 사용함으로써 해결하고 있다. 선형 발현 구조물은 세균성 증식의 동안에 사용되는 증폭 및/또는 선택 서열들을 함유하지 않으며 거의 항상 바이러스 유사종의 단일 견본의 분자 클로닝을 가져온다. 이러한 선형 발현 구조물은 숙주 세포를 직접 트랜스펙션하기 위해 사용될 수 있고, 훨씬 더 많은 신속한 역 유전학 시스템을 제공한다. 즉, 참고문헌 6은 선형 구조물의 트랜스펙션이 바이러스 분리물을 수용하는 시간 내에 달성될 수 있고, 분자 클로닝에 요구되는 시간을 들이지 않고 원래의 바이러스 유사종 집단의 유용한 멤버에 접근을 허용한다는 것을 제안한다.
세그먼트로 된 바이러스에 대해 참고문헌 6에서 사용된 방법은 바이러스 세그먼트 당 하나의 선형 구조물을 사용한다. 따라서 이 방법에 의한 역 유전학 바이러스 생산은 8개의 다른 구조물로 숙주 세포의 트랜스펙션을 요한다. 본 발명의 목적은 이러한 다수회의 트랜스펙션에 대한 필요를 회피하기 위한 것이다. 보다 일반적으로는, 본 발명의 목적은 세그먼트로 된 RNA 바이러스에 대해 역 유전학을 실시하는 더욱 개선된 방법을 제공하기 위한 것이며, 특히 또한 세균의 사용을 요하지 않는 방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명은 세그먼트로 된 RNA 바이러스를 생산하기 위한 여러가지 역 유전학 시스템을 제공하는데, 여기서 시스템은 모든 그것들의 발현 구조물의 증식을 위한 세균을 요하지 않는다. 이상적으로는, 세균은 전혀 요구되지 않는다.
제 1 양태에서, 역 유전학 시스템은 적어도 두개의 바이러스 게놈 세그먼트를 암호화하는 비세균성 발현 구조물에 기초한다. 이 시스템은 완전한 바이러스 게놈의 생산을 위한 숙주 세포로 트랜스펙션되어야 하는 구조물의 수를 감소시킨다. 예를 들어서, 8개의 인플루엔자 바이러스 세그먼트를 암호화하기 위해 단일 구조물이 사용될 수 있고, 이로써 참고문헌 6과 비교하여 트랜스펙션의 복잡성에 있어서 8배 감소를 제공한다. 따라서 본 발명은 세그먼트로 된 RNA 바이러스의 적어도 두개의 다른 게놈 세그먼트를 발현하기 위한 암호화 서열을 포함하는 비세균성 발현 구조물을 제공한다. 본 발명은 또한 이 비세균성 발현 구조물을 포함하는 진핵성 숙주 세포를 제공한다. 본 발명은 또한 두개 이상의 이러한 비세균성 발현 구조물의 세트를 제공하는데, 여기서 세트는 완전한 세그먼트로 된 RNA 바이러스 게놈을 암호화한다.
제 2 양태에서, 역 유전학 시스템은 (i) 적어도 하나의 세균성 발현 구조물 및 (ii) 적어도 하나의 비세균성 발현 구조물의 조합에 기초한다. 이들 두가지 유형의 구조물의 각각은 적어도 하나의 바이러스 게놈 세그먼트를 제공한다. 이 양태는 시스템을 제조하기 위한 세균의 사용을 전적으로 회피하지는 않지만, 여전히 강력하다. 예를 들어서, 바이러스 세그먼트의 서브세트를 발현하는 구조물은 이용가능한 넓은 범위의 편리한 분자 생물학적 기술을 이용하여 세균에서 증식 및 조작될 수 있다. 이 서브세트의 세그먼트는 주에서 주로 변화되는 것이 종종 필요하지 않은 것들이 될 수 있다. 나머지 바이러스 세그먼트는 비세균성 발현 구조물에 의해 암호화될 수 있고, 이들 구조물은 세균성 작업을 요하지 않고 예고없이 신속하게 제조될 수 있다. 이 조합은 따라서 예고없이 관심있는 세그먼트에 노력이 집중될 수 있고, 구조물은 이미 이용가능한 "바탕(background)" 세그먼트의 현존하는 세트와 조합될 수 있음을 의미한다. 따라서 본 발명은 (i) 세그먼트로 된 RNA 바이러스의 하나 이상의 게놈 세그먼트에 대한 암호화 서열을 포함하는 적어도 하나의 플라스미드 및 (ii) RNA 바이러스의 하나 이상의 게놈 세그먼트에 대한 암호화 서열을 포함하는 적어도 하나의 비세균성 발현 구조물을 포함하는 발현 구조물의 세트를 제공하는데, 여기서 세균성 및 비세균성 구조물의 조합이 RNA 바이러스의 적어도 두개의 다른 게놈 세그먼트들을 제공한다. 본 발명은 또한 이 구조물 세트를 포함하는 진핵성 숙주 세포를 제공한다.
제 3 양태에서, 본 발명은 세그먼트로 된 RNA 바이러스의 적어도 두개의 다른 게놈 세그먼트에 대한 암호화 서열을 포함하는 선형 발현 구조물을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 이 세포는 세균성일 수도 있으나, 바람직하게는 진핵성이다.
제 4 양태에서, 본 발명은 인플루엔자 바이러스의 8개의 다른 게놈 세그먼트에 대한 암호화 서열을 포함하는 세균성 플라스미드를 제공하는데, 여기서 각 세그먼트의 발현은 (i) 포유동물 pol-I 프로모터 또는 (ii) 박테리오파지 폴리머라제 프로모터에 의해 제어된다. 본 발명은 또한 이 구조물을 포함하는 세포를 제공하며, 이 세포는 세균성일 수도 있고 또는 진핵성일 수도 있다.
본 발명은 또한 상기한 하나 이상의 발현 구조물(들)을 세포에 삽입하는 단계를 포함하는, 본 발명의 숙주 세포의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한 RNA 바이러스 세그먼트들의 발현이 발현 구조물로부터 일어나도록 하는 조건하에 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 본 발명의 진핵성 숙주 세포에서 RNA 발현을 위한 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 RNA 바이러스 세그먼트들의 발현이 발현 구조물로부터 일어나 바이러스를 생산하도록 하는 조건하에 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 세그먼트로 된 RNA 바이러스의 제조방법을 제공한다. 이런 식으로 생산된 바이러스는 그 다음 숙주 세포로부터 또는 숙주 세포의 배양물로부터 정제될 수도 있다. 본 발명은 또한 이 방법에 의해 얻어진 바이러스를 제공한다. 이 바이러스는 백신 제조를 위한 바이러스를 성장시키기 위해 난 또는 세포를 감염시키기 위해 사용될 수도 있다. 따라서 본 발명은 배양물 숙주(예를 들면, 난 또는 세포)를 본 발명의 바이러스로 감염시키는 단계, 바이러스를 성장시키는 단계, 그 다음 성장된 바이러스로부터 백신을 제조하는 단계를 포함하는 바이러스 백신의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한 세그먼트로 된 RNA 바이러스 게놈(예를 들면 본 발명의 비세균성 발현 구조물)의 적어도 두개의 다른 세그먼트들을 발현하는 암호화 서열을 포함하는 DNA 분자의 제조방법을 제공하는데, 여기서 DNA는 적어도 부분적으로 화학 합성에 의해 제조된다.
본 발명은 또한 (i)　DNA 분자의 복수의 중첩 단편들을 합성하는 단계, 여기서 중첩 단편들은 전체 DNA 분자에 이르며; 그리고 (ii) 단편들을 연결하여 DNA 분자를 제공하는 단계를 포함하는, 세그먼트로 된 RNA 바이러스 게놈(예를 들면 본 발명의 비세균성 발현 구조물)의 적어도 두개의 다른 세그먼트들을 발현하는 암호화 서열을 포함하는 DNA 분자의 제조방법을 제공한다. 그 다음 DNA 분자는 회수될 수 있고 본 발명의 역 유전학 방법에서 사용될 수 있다. 예를 들어서, 그것은 세그먼트로 된 RNA 바이러스의 발생을 위해 진핵성 세포로 삽입될 수 있다. 바람직하게는 DNA 분자는 그것의 회수와 진핵성 세포로의 삽입 사이에 세균성 세포로 삽입되지 않는다. 즉, 구조물은 어떤 중간 세균성 증폭없이 직접 사용된다.
본 발명은 또한 세그먼트로 된 RNA 바이러스의 발현 구조물의 라이브러리를 제공하는데, 여기서 각 발현 구조물은 바이러스의 적어도 하나의 게놈 세그먼트를 위한 암호화 서열을 포함한다. 라이브러리는 게놈의 각 세그먼트에 대한 적어도 하나의 구조물을 포함하여 전체 게놈이 라이브러리의 서브세트를 선별함으로써 표현될 수 있도록 한다. 일부 바이러스 세그먼트들은 다른 것들보다 더 빈번히 표현될 수도 있는데, 예를 들면 인플루엔자 바이러스 라이브러리는 평균보다 더 많은 HA 및 NA 세그먼트들을 포함할 수도 있다. 관심있는 원하는 바이러스 게놈을 구축하기 위해, 각 원하는 세그먼트를 암호화하는 라이브러리 멤버를 선별한 다음 발현하여 원하는 바이러스를 제공한다. 라이브러리는 백본 게놈 세그먼트의 관심있는 HA 및 NA 세그먼트들로의 신속한 재편성을 허용함으로써 인플루엔자 바이러스에 대해 특히 강력하여 백신 생산을 위한 유용한 바이러스를 생산한다.
비세균성 발현 구조물
본 발명의 제 1, 제 2 및 제 3 양태는 하나 이상의 "비세균성 발현 구조물"을 이용한다. 이 용어는 구조물이 진핵 세포내에서 거기서 암호화된 바이러스 RNA 세그먼트의 발현을 구동할 수 있으나, 그것은 세균에서 구조물의 증식에 요구되는 성분들을 포함하지 않는다는 것을 의미한다. 따라서 구조물은 세균성 복제 기원(ori)을 포함하지 않을 것이며, 보통 세균성 선별 마커(예를 들면 항생물질 저항성 마커)를 포함하지 않을 것이다. 이들 성분은 진핵성 숙주 세포에서 원하는 바이러스 RNA 발현을 구동하기 위해 요구되지 않으며 따라서 세균이 구조물의 증식에 사용되지 않을 때 잉여가 된다. 이들 증식 성분의 부재는 구조물이 세균으로 도입된다면 복제되지 않을 것이라는 것을 의미한다.
비세균성 구조물은 선형 또는 원형일 수 있다. 선형 구조물이 더 일반적이나(참고문헌 6에서 참조), 원형 구조물이 또한 사용될 수 있다. 원형 구조물은 선형 구조물을 원형으로 함으로써 만들어질 수 있고 그 반대로도 할 수 있다. 이러한 원형화의 방법은 참고문헌 6에 기술되어 있다. 원형 구조물의 선형화는 여러가지 쉬운 방법으로, 예를 들면 하나 이상의 제한 효소(들)를 이용함으로써 또는 핵산 증폭 기술(예를 들면, PCR)을 사용하여 템플레이트(원형 템플레이트 포함)로부터 증폭에 의해 달성될 수 있다.
비세균성 구조물은 하나 이상의 바이러스 RNA 세그먼트(들)에 대한 암호화 서열을 포함한다. 제 1 및 제 3 양태에 대한 구조물은 적어도 두개의 다른 바이러스 RNA 세그먼트들을 암호화한다. 암호화된 세그먼트들이 발현될 수 있고 그 다음 바이러스 RNA들로서 기능하는데 이것들은 패키징하여 비리온으로 될 수 있고 재조합 발현된 바이러스를 제공한다. 따라서 구조물은 단독으로 또는 다른 구조물들과 조합하여 역 유전학에 의해 RNA 바이러스를 생산하기에 적합하다.
구조물은 보통 이중 가닥 DNA로 만들어질 것이다. 이러한 구조물은 편리하게는 DNA 합성 및 조립체의 공지의 방법에 의해 편리하게 만들어질 수 있다. 현대의 기술은 많은 게놈 세그먼트들을 가질지라도 완전한 바이러스를 암호화하는 합성 DNA 분자를 제공할 수 있다. 예를 들면, 인플루엔자 바이러스 게놈의 모든 8개 세그먼트들을 발현하는 구조물은 약 25,000 염기쌍(25kbp)의 DNA를 요하는데, 이것은 현 구조물 합성의 용량 내에 있고, 예를 들어서 참고문헌 7은 개별 ~5kbp 합성 단편들의 조립에 의해 32kbp 유전자의 화학적 합성을 보고하며, 참고문헌 8은 약 5kbp, 7kbp, 24kbp, 72kbp 또는 144kbp 길이의 중간 단계들을 통해 583kbp 합성 염색체의 생산을 보고한다. 더 상세한 내용은 이하 참조.
이러한 합성 방법은 구조물을 제공하는(특히 선형 구조물을 제공하는) 바람직한 방법이다. 그러나, 화학적 합성을 사용하는 대신에, 구조물을 위한 DNA를 역전사에 의해 RNA 바이러스로부터 제조하여 cDNA를 제공할 수 있고, 그 다음, 여분의 DNA 서열을 cDNA에 (예를 들면 라이게이션에 의해) 연결할 수 있고 또는 cDNA를 더 큰 DNA 구조물에 포함시킬 수 있다. 일부 구체예에서는, 효소학적 및 화학적 방법의 혼합, 예를 들어서 역전사와 이어서 말단에 화학적 부가가 사용된다.
어떤 세균성 증식 요소들이 없을 뿐만 아니라, 비세균성 구조물은 또한 어떤 세균성 DNA 변형도 또한 없을 수 있다. 따라서 구조물은 메틸화 아데닌 잔기를 포함하지 않을 수도 있고, 어떤 시토신 잔기도 CpG 디뉴클레오티드 모티프와 관련될 것이고, 즉 메틸화된 시토신이 없을 것이고 구아니딘으로 이어지지 않는다.
구조물은 어떤 적합한 트랜스펙션 방법에 의해, 예를 들면 일렉트로포레이션, 리포펙션, DEAE-덱스트란, 인산 칼슘 침전, 리포좀, 유전자 총, 마이크로입자 충격 또는 마이크로인젝션에 의해 숙주 세포에 도입될 수 있다. 일단 트랜스펙션되면, 숙주 세포는 구조물에서 유전자 요소들을 인식할 것이고 암호화된 바이러스 RNA 세그먼트들을 발현하기 시작할 것이다.
구조물 합성
상기한 바와 같이, DNA 발현 구조물은 적어도 부분적으로 화학적 합성에 의해 제조될 수 있다. 구조물은 세그먼트로 된 RNA 바이러스 게놈의 적어도 두개의 다른 세그먼트들을 발현하기 위한 (그리고 바람직하게는 세그먼트로 된 RNA 바이러스의 완전한 게놈을 발현하기 위한) 암호화 서열을 포함하며 편리하게는 참고문헌 8에 개시된 합성 방법을 사용하여 제조될 수 있다.
합성 방법은 원하는 DNA 서열을 단편들로 개념상 분할하는 것을 수반한다. 이들 단편은 다시 개념상 한번 이상 분할될 수 있고, 궁극적으로, 선택된 DNA 합성 방법에 의해, 예를 들어서 포스포르아미다이트 화학에 의해 제조될 수 있는 각각의 크기인 단편들의 세트에 도달한다. 이들 단편은 그 다음 합성되고 연결되어 개념상 분할 단계로부터 더 긴 단편들을 제공하고, 이들 더 긴 단편들은 연결되는 등 완전한 서열이 궁극적으로 제조될 때까지 한다. 이런 식으로 참고문헌 8은 여러 단계들로 ~104 50량체 올리고뉴클레오티드를 조립함으로써 583kbp 게놈을 제조하였다. 50량체는 카세트 5-7kb 길이로 조립되었고, 이들 카세트는 그 다음 ~24kbp 단편들로 조립되었고, 이것은 그 다음 ~72kbp 단편들로 조립된 다음, ~144kbp로, 그 다음 두개의 ~290kbp 구조물을 제공하였는데, 이것은 최종적으로 연결되어 완전한 게놈을 제공하였다.
단편들은 중첩하도록 설계되어, 이로써 그것들을 올바른 순서로 조립하도록 허용한다. 예를 들어서, 카세트는 적어도 80bp 만큼 중첩되어, 이로써 그것들의 조립체가 ~24kbp 단편들, 등으로 가능하게 한다. 따라서 방법은 원하는 DNA 분자의 복수의 중첩하는 단편들의 합성을 수반하여, 중첩 단편들이 전체 DNA 분자에 이르도록 한다. 각 단편의 양 단부들은 이웃하는 5' 또는 3' 단편과 중첩하고, 중첩을 요하지 않는 선형 분자의 말단 단편은 제외한다(그러나 원형 분자를 합성하기 위해서는, 두 말단 단편은 중첩해야 한다). 각 단계에서 단편들은 벡터들에서 예를 들면 플라스미드 또는 BAC 또는 YAC 벡터들에서 삽입물로서 유지될 수도 있다. 합성 공정 동안에 단편들의 조립은 시험관내 및/또는 생체내 재조합을 수반할 수 있다. 시험관내 방법에 대해서는, 단편의 말단에서 오버행(overhang)을 노출시키기 위해 3' 엑소뉴클레아제로 분해가 사용될 수 있고, 그 다음 중첩 단편에서 상보 오버행이 어닐링될 수 있고, 이어서 연결부 수선될 수 있다("반추 조립체(chewback assembly)"). 생체내 방법에 대해서는, 예를 들어서 참고문헌 8에 개시된 TAR 클로닝 방법을 사용하여 중첩 클론들이 조립될 수 있다. 100kbp 미만의 단편에 대해서는 (예를 들면 인플루엔자 바이러스 게놈의 모든 세그먼트를 암호화하기에 충분히 쉽게) 시험관내 재조합 방법에 단지 의존하는 것이 쉽게 가능하다.
다른 합성 방법이 사용될 수도 있다. 예를 들어서, 참고문헌 7은 ~5kbp의 단편을 합성한 다음 종래의 클로닝 방법에 의해 더 긴 서열들로 조립하는 방법을 개시한다. 미정제된 40 염기 합성 올리고뉴클레오티드가 자동화된 PCR-기초 유전자 합성에 의해 500-800-bp 신톤(synthons)으로 만들어지고, 이들 신톤은 작은 수의 엔도뉴클레아제 및 "선별에 의한 라이게이션"을 사용하여 멀티신톤 ~5kbp 세그먼트들로 연결된다. 이들 큰 세그먼트들은 이어서 종래의 클로닝에 의해 더 긴 서열들로 조립될 수 있다. 이 방법은 32kbp DNA 분자를 쉽게 제공할 수 있는데, 이것은 완전한 인플루엔자 바이러스를 암호화하기에 쉽게 충분하다.
유사하게, 참고문헌 9는 완전한 서열에 이른 7개의 DNA 단편으로부터 32kb 분자를 조립하는 방법을 개시한다. 7개의 DNA의 단부들은 독특한 접합으로 조작되었고, 이로써 단지 인접 단편들의 조립을 허용하였다. 각 DNA의 단부들에서 상호연결 제한 부위 접합들은 체계적으로 제거된 조립체이다.
일단 전체 DNA 분자가 조립되었을 때, 그것은 정제되고 DNA가 세균 내부에 존재하는 중간 단계를 수반하지 않고, 바이러스 생산을 위한 진핵 세포로 직접 삽입될 수 있다.
이들 방법에 의해 제조될 때, 본 발명의 DNA 발현 구조물은 하나 이상의 "워터마크(watermark)" 서열들을 포함할 수 있다. 이것들은 DNA에서 정보를 확인 또는 암호화하기 위해 사용될 수 있는 서열들이다. 그것은 비암호화 또는 암호화 서열들로 될 수 있다. 가장 통상적으로, 그것은 아미노산 서열을 변경하지 않고 암호화 서열 내의 정보를 암호화한다. 세그먼트로 된 RNA 바이러스 게놈을 암호화하는 DNA에 대해, 어떤 워터마크 서열도 유전자 사이(intergenic) 부위에 이상적으로 포함되는데 동의의(synonymous) 코돈 변화들이 암호화된 RNA 세그먼트들에 대해 실질적인 생물학적 효과를 가질 수 있기 때문이다.
플라스미드
본 발명의 제 2 및 제 4 양태는 플라스미드의 사용을 수반한다. 이들 플라스미드는 편리하게는 세균에서 증식될 수 있고 따라서 세균성 복제 기원(ori)을 포함하고, 보통 세균성 선별 마커(예를 들면 항생물질 저항성 마커)를 또한 포함한다. 따라서 플라스미드는 상기 논의된 비세균성 발현 구조물과 (서열 및 기능에 의해) 쉽게 구별된다. 일반적인 용어로, 플라스미드는 역 유전학에 대해 본 분야에서 이미 공지된 플라스미드와 같은 것일 수 있으나, 종래기술은 바이러스 구급을 위해비세균성 발현 구조물과 조합한 그것들의 사용은 개시하지 않는다.
플라스미드는 또한 바이러스 생산이 일어날 수 있는 진핵성 숙주 세포에서 생존하기 위한 필요한 유전자 요소를 포함한다. 따라서 플라스미드는 세균성 숙주에서 증식, 조작 및/또는 증폭될 수 있지만 진핵성 숙주에서 바이러스 RNA 발현을 구동할 수 있는 셔틀 플라스미드이다.
플라스미드는 적어도 하나의 바이러스 RNA 세그먼트 (제 4 양태에서 8개의 인플루엔자 바이러스 세그먼트)를 암호화하고 진핵성 숙주 세포에서 이들 암호화 서열은 발현될 수 있으며 그 다음 바이러스 RNA들로서 기능하는데 이것들은 비리온으로 패키징되어 재조합 발현된 바이러스를 제공할 수 있다.
플라스미드는 어떤 적합한 트랜스펙션 방법에 의해, 예를 들면 일렉트로포레이션, 리포펙션, 유전자 총 또는 마이크로인젝션에 의해 진핵성 숙주 세포에 도입될 수 있다. 일단 트랜스펙션되면, 숙주 세포는 구조물에서 유전자 요소들을 인식할 것이고 암호화된 바이러스 RNA 세그먼트(들)을 발현하기 시작할 것이다.
플라스미드가 다수의 RNA 세그먼트들을 암호화할 때, 플라스미드내 재조합을 최소화하기 위한 단계들이 취해질 수 있다. 다수의 동일한 프로모터 및 터미네이터(pol-I 및 pol-II 둘다)의 존재는 이 위험을 증가시킬 수 있는데, 세균성 증식의 동안에 높은 카피 수를 제공하는 ori의 사용이 그럴 수 있는 것과 같다. 따라서 플라스미드는 세균에서 존재할 때 유리하게는 비교적 낮은 카피 수, 예를 들면, E.coli 세포 당 50개 미만의 카피들을 갖는다. 여러가지 낮은 카피 수의 벡터들이 이용가능한데, 예를 들면 참고문헌 10에서 사용된 벡터, p15a ori 또는 플라스미드 F ori [11], 등을 포함하는 벡터들이다. 다른 서열들을 갖는 프로모터를 사용하는 것 및/또는 여분의 프로모터를 제공하는 잉여 암호화 영역을 포함하는 것을 회피하는 것이 또한 유용하다. 이들과 같은 단계들은 플라스미드의 안정성을 개선할 수 있다.
발현 구조물
본 발명에서 사용된 비세균성 및 플라스미드 발현 구조물은 바이러스 RNA 세그먼트(들)를 암호화한다. 이들 암호화 서열은 적합한 진핵성 숙주 세포에서 발현되어 바이러스 RNA를 제공하는데 이것들은 비리온으로 패키징되어 재조합 발현된 바이러스를 제공할 수 있다.
바이러스 RNA 세그먼트의 발현은 RNA-암호화 서열의 상류의 프로모터에 의해 제어될 것이다. 동물 세포에서 바이러스 RNA 세그먼트를 발현하기 위한 프로모터는 DNA-의존 RNA 폴리머라제에 의해 인식될 것이고 보통 pol-I 프로모터일 것이다 (이하 참조). 그러나 다른 시스템들이 이용가능하고, 폴리머라제의 인시튜 공급원과 연관하여, T7 RNA 폴리머라제와 같은, 박테리오파지 또는 세균성 RNA 폴리머라제 프로모터를 사용하는 것이 공지되어 있다[1 [ 12 ]　WO2006/067211. 2]. 각 바이러스 세그먼트는 그것의 자체 프로모터를 가지며, 이것들은 서로 같거나 다를 수도 있다.
바이러스가 양성 가닥 RNA 바이러스인 경우 단지 바이러스 세그먼트만을 암호화하는 발현 구조물로 세포를 트랜스펙션하는 것이 종종 충분하다. 예를 들면, 폴리오바이러스 게놈을 암호화하는 플라스미드의 트랜스펙션은 감염성 폴리오바이러스의 회수를 가져왔다[1,2]. 음성 가닥 RNA 바이러스의 역 유전학은 안티센스 바이러스 RNA가 보통 비감염성이고 따라서 수명 사이클을 완결하기 위해 바이러스 단백질을 요하기 때문에 여분의 도전을 제공한다. 따라서 바이러스 폴리머라제와 같은 바이러스 단백질은 단백질로서 또는 인시튜 단백질 발현을 위한 유전자로서 유도된 세포에 공급된다.
따라서 발현 구조물은, 특히 음성 가닥 바이러스에 대해, 진핵성 세포에서 바이러스 단백질을 발현하기 위한 암호화 서열을 포함할 수도 있다. 단백질 발현을 위한 적합한 프로모터는 시토메갈로바이러스(CMV)로부터의 것들을 포함한다. 바이러스 세그먼트 및 바이러스 단백질의 공동-발현은 숙주 세포에서 바이러스의 재조합 조립체에 대해 인시튜로 모든 필요한 요소들을 제공한다. RNA-암호화 서열과 같은 구조물에 대한 단백질-암호화 서열을 포함하는 것이 유용하나, RNA 및 단백질 발현을 위한 다른 구조물을 사용하는 것도 또한 가능하다. 단백질-암호화 및 RNA-암호화 서열이 같은 구조물에 있는 경우에, 그것들은 다른 서열일 수도 있으나 대신에 같은 DNA 서열로부터 RNA 및 단백질 발현을 둘다 제공하는 두개의 다른 프로모터로부터 발현을 구동하는 것이 가능하다.
pol-I 프로모터로부터 바이러스 RNA를 발현하고 같은 DNA 서열에 부착된 pol-II 프로모터로부터 바이러스 단백질을 발현하기 위한 2-방향성 구조물이 본 분야에 공지되어 있다(예를 들면 참고문헌 1 [ 13 ]　WO01/83794. 3 참조). 두개의 프로모터는 같은 구조물로부터 다른 방향으로 (즉, 5' 에서 3' 및 3' 에서 5' 둘다) 발현을 구동하며 같은 이중 가닥 DNA의 다른 가닥 상에 있을 수 있다. 공통의 DNA 서열의 사용은 숙주 세포에 의해 요구된 발현 구조물의 총수 및/또는 길이를 감소시킨다. 2-방향성 발현 구조물은 상류 pol-II 프로모터 및 하류 pol-I 프로모터 사이에 위치된 유전자 또는 cDNA를 포함할 수 있다. pol-II 프로모터로부터의 유전자 또는 cDNA의 전사는 바이러스 단백질로 번역될 수 있는 캡핑된 양성-센스 바이러스 mRNA를 생산할 수 있는 한편, pol-I 프로모터로부터의 전사는 캡핑되지 않은 음성-센스 vRNA를 생산한다.
발현 구조물은 전형적으로 각 전사 단위에 대한 RNA 전사 종결 서열을 포함할 것이다. 종결 서열은 내인성 종결 서열 또는 숙주 세포에 내인성이 아닌 종결 서열일 수 있다. 적합한 종결 서열은 당업자들에게 명백할 것이며, 제한은 아니나, RNA 폴리머라제 I 전사 종결 서열, RNA 폴리머라제 II 전사 종결 서열, 및 리보자임을 포함한다. 더욱이, 발현 구조물은, 특히 단백질 발현에 사용된 유전자의 단부에서, mRNA들에 대한 하나 이상의 폴리아데닐화 신호를 함유할 수도 있다. 바이러스 RNA 세그먼트에 대한 암호화 서열은 전형적으로 측면에 한 단부에서 pol-I 프로모터 그리고 다른 단부에서 pol-II 프로모터가 위치하고, pol-I 프로모터 및 터미네이터 서열은 세그먼트-암호화 서열 측면에 위치하고, 차례로 측면에 pol-II 프로모터 및 터미네이터 서열이 위치한다. 이들 여러가지 서열 요소들의 서로에 기준한 간격은 폴리머라제가 올바르게 개시하고 복제를 종결하도록 하기 위해 중요하나, 이것은 달성하기가 어렵지 않다.
발현 구조물은 진핵성 세포에서 선별을 위한 선택성 마커를 포함할 수도 있다.
발현 구조물은 DNA 서열의 도입을 용이하게 하기 위해 하나 이상의 다수의 클로닝 부위를 포함할 수도 있다.
별도의 암호화 서열들이 바이러스 RNA 및 단백질에 대해 사용되는 경우, 다른 서열들을 사용하는 것이 가능한데, 예를 들면 단백질-암호화 서열이 특정 숙주 세포에서 코돈-최적화될 수 있는 한편, RNA-암호화 서열은 의문의 바이러스에 자연적인 코돈을 사용한다. RNA-암호화 서열의 코돈 최적화는 덜 유용한데 RNA가 재조합 단백질 발현에 대해서 보다 오히려 비리온 패키징에 최적이어야 하기 때문이다.
발현 숙주가 개 세포, 예컨대 MDCK 셀 라인인 경우, 단백질-암호화 영역은, 예를 들어, 야생형 개 유전자로부터 또는 개 바이러스로부터의 pol-II 프로모터를 사용하여, 및/또는 사람 세포보다 개 세포에 더 적당한 코돈 사용을 가짐으로써 개 발현에 대해 최적화될 수 있다. 예를 들어, 사람 유전자는 Phe에 대한 코돈으로서 UUC가 약간 선호되지만(54%), 개 세포에서는 더 강하게 선호된다(59%). 유사하게, 사람 세포의 Ile 코돈에 대해 주된 선호도가 없는 반면, 개 코돈의 53%는 Ile에 대한 AUC를 사용한다. 개 파르보바이러스(ssDNA 바이러스)와 같은 개 바이러스는 또한 코돈 최적화를 위한 지침을 제공하며, 예를 들어, 개 파르보바이러스의 Phe 코돈의 95%는 UUU(대 개 게놈에서 41%)이고, Ile 코돈의 68%는 AUU(대 32%), Val 코돈의 46%는 GUU(대 14%), Pro 코돈의 72%는 CCA(대 25%), Tyr 코돈의 87%는 UAU이고(대 40%), His 코돈의 87%는 CAU이고(대 39%), Gln 코돈의 92%는 CAA이고(대 25%), Glu 코돈의 81%는 GAA이고(대 40%), Cys 코돈의 94%는 UGU이고(대 42%), Ser 코돈의 단지 1%가 UCU이고(대 24%), CCC는 Phe에 대해 결코 사용되지 않고, UAG는 정지 코돈으로서 결코 사용되지 않는다. 따라서 단백질-암호화 유전자는 성질이 개 세포에서 발현을 위해 이미 최적화된 유전자와 더 유사하게 만들어질 수 있고, 따라서 발현을 용이하게 한다.
RNA 폴리머라제 I 프로모터
대부분의 역 유전학 방법은 바이러스 RNA 세그먼트들의 전사를 구동하는 RNA 폴리머라제 I(RNA pol-I) 프로모터를 포함하는 발현 벡터를 사용한다. pol-I 프로모터는 많은 바이러스들, 예를 들면 인플루엔자의 충분한 감염성을 위해 필요한 비변형 5' 및 3' 단부들을 갖는 전사물을 제공한다.
자연적인 pol-I 프로모터는 두 부분으로 이루어져 있는데, 두 별개의 영역들: 코어 프로모터와 상류 프로모터 요소(UPE)를 갖는다. 이 일반적인 편성은 대부분의 종들로부터의 pol-I 프로모터에 공통일지라도, 그러나, 프로모터의 실제 서열은 크게 다양하다. 코어 프로모터는 전사 시발점을 둘러싸며 약 -45에서 +20으로 연장되고, 전사를 개시하기에 충분하다. 코어 프로모터는 일반적으로 GC 풍부이다. 코어 프로모터 단독은 전사를 개시하기에 충분하고, 프로모터의 효율은 UPE에 의해 매우 많이 증가된다. UPE는 전형적으로 약 -180 내지 -107 이고 또한 GC 풍부이다. 프로모터의 활성은 개시전 복합체를 안정화함으로써 기능할 수도 있는 원위 인핸서-유사 서열의 존재에 의해 더 향상될 수도 있다.
pol-I 프로모터의 서열들은 사람, 개 및 닭을 포함하는 다양한 종들에서 확인되었다. 본 발명은 전형적으로, pol-I 프로모터의 활성이 좁은 숙주 범위로 제한될 수 있기 때문에 숙주 세포에 내인성인 pol-I 프로모터를 사용하기로 한다. 그러나, 어떤 상황에서는, pol-I 프로모터는 그것의 자연적인 숙주의 외부에서 활성일 수 있는데, 예를 들면 사람 pol-I 프로모터는 원숭이 세포에서 활성일 수 있고, 또한 일부 개 세포에서 활성일 수 있다.
발현 구조물은 적어도 하나의 코어 프로모터를 포함할 수 있는데; 바람직하게는 그것들은 또한 적어도 하나의 UPE를 포함하고, 그것들은 또한 하나 이상의 인핸서 요소를 포함할 수도 있다. 또한 자연적인 프로모터들의 단편을 사용하는 것도, 이들 단편이 전사를 개시할 수 있다는 조건하에 가능하다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 사람 pol-I 프로모터는 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2의 서열, 또는 그것의 변종을 포함할 수 있다. 개 프로모터가 본 발명에 따라 사용되는 경우에, 그것은 SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 5의 서열, 또는 그것의 변종을 포함할 수 있다. 역 유전학을 위한 개 pol-I 프로모터는 참고문헌 1 [ 14 ] WO2007/002008. 4 및 1 [ 15 ] WO2007/124327. 5에 개시되어 있다.
pol-I 프로모터는 프로모터가 관심있는 숙주 세포에서 작동가능하게 연결된 RNA-암호화 서열의 전사를 개시하고 구동하는 능력을 갖는다는 조건하에, (i) SEQ ID NOs: 1 내지 5 중 어떤 것에 적어도 p% 동일성을 갖는 서열, 및/또는 (ii) SEQ ID NOs: 1 내지 5 중 어떤 것의 단편을 포함할 수 있다. p의 값은 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 그 이상일 수 있다. 단편은 그 자체가 발현을 구동하기에 충분한 길이일 수도 있고(예를 들면 SEQ ID NO: 4는 SEQ ID NO: 3의 단편이다) 또는 단편은 다른 서열들에 연결되어 있을 수도 있고 이 조합은 발현을 구동할 것이다. 이러한 pol-I 프로모터가 관심있는 숙주 세포에서 발현을 구동하는 능력은 예를 들어서 프로모터의 제어하에 안티센스 리포터 유전자로 상기한 분석법(assays)을 사용하여 쉽게 평가될 수 있다.
바이러스 제조
본 발명은 변형 또는 재편성 주를 포함하는 바이러스 주의 생산에 유용하다. 기술은 DNA 구조물의 시험관내 조작을 사용하여, 바이러스 세그먼트의 조합을 발생시키는 것, 바이러스 세그먼트에서 암호화 또는 비암호화 서열의 조작을 용이하게 하는 것, 변이를 도입하는 것 등을 할 수 있다. 재편성 바이러스 주의 생산은 그것이 유행병에 대항하기 위해 백신의 신속한 생산이 필요한 상황에서 특히 유리한 재편성 시드 바이러스를 얻기 위해 필요한 시간을 상당히 감소시킬 수 있기 때문에 유용하다. 따라서, 적어도 두가지 다른 야생형 주로부터의 또는 그것으로부터 유도된 바이러스 단편을 발현하기 위해 발현 구조물들이 사용되는 것이 바람직하다.
재조합 바이러스를 생산하기 위해, 세포는 비리온을 조립하기 위해 필요한 바이러스 게놈의 모든 세그먼트를 발현해야 한다. 본 발명의 발현 구조물로 클로닝된 DNA는 바람직하게는 모든 바이러스 RNA 및 단백질을 제공하나, RNA 및 단백질의 일부를 제공하기 위해 헬퍼 바이러스를 사용하는 것도 또한 가능하다. 그러나, 헬퍼 바이러스를 사용하지 않는 시스템이 바람직하다.
본 발명의 구조물로부터 모든 바이러스 세그먼트를 제공하기 위해, 여러가지 배열이 가능하다. 제 1 양태에 따르면, 모든 바이러스 세그먼트는 비세균성 발현 구조물에 대해 암호화될 수 있는데, 단, 이들 구조물의 적어도 하나는 적어도 두개의 바이러스 게놈 세그먼트를 암호화하는 조건하에서이며(참고문헌 6과 다름); 이상적으로는, 모든 바이러스 게놈 세그먼트가 단일의 비세균성 구조물에 대해 암호화되어, 그 단일 구조물로 트랜스펙션은 관심있는 바이러스를 생산하는 능력을 갖는 숙주 세포를 제공하기에 충분하다. 반대로, 제 2 양태에 따르면, 바이러스 세그먼트는 세균성 및 비세균성 발현 구조물 사이에서 분할되고, 셀에서 그것들의 조합된 존재는 모든 바이러스 세그먼트들의 발현을 제공한다.
제 1 양태로도, 하나 이상의 발현 구조물 사이에서 바이러스 세그먼트를 분할하는 것이 유리할 수 있다. 예로서, 인플루엔자 A 바이러스의 백신 생산 주를 들면, 8개의 세그먼트 중 6개는 전형적으로 해가 가도 변하지 않으며, 매 시즌마다 이 일정한 바이러스 백본은 계절 HA 및 NA 세그먼트들에 의해 보충된다. 이 상황에서 한 구조물에 대한 6개의 백본 세그먼트를 암호화하고, 제 2 구조물에 대해서 함께 또는 제 2 및 제 3 구조물에 대해서 별도로 두가지 다른 가변적 세그먼트를 암호화하는 것이 도움이 될 수 있다. 이것은 계절적 변형이 더 소형 구조물에서 수행되도록 허용하며, 또한 백본 구조물을 백본 발현에 대해 특이적으로 최적화되도록 허용한다.
바이러스
본 발명의 방법은 어떤 세그먼트로된 RNA 바이러스로도 실시될 수 있다. 이러한 바이러스는 양성 가닥, 음성 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다.
바이러스가 음성 가닥 RNA 바이러스인 경우, 바이러스는 파라믹소비리다에(Paramyxoviridae), 뉴모비리나에(Pneumovirinae), 라브도비리다에(Rhabdoviridae), 필로비리다에(Filoviridae), 보르나비리다에(Bornaviridae), 오르소믹소비리다에(Orthomyxoviridae), 분야비리다에(Bunyaviridae), 또는 아레나비리다에(Arenaviridae)로 구성되는 군으로부터 선택되는 과(family)로부터 나온다. 추가로, 바이러스는 파라믹소바이러스(Paramyxovirus), 오르소믹소바이러스(Orthomyxovirus), 레스피로바이러스(Respirovirus), 모르빌리바이러스(Morbillivirus), 루불라바이러스(Rubulavirus), 헤니파바이러스(Henipavirus), 아불라바이러스(Avulavirus), 뉴모바이러스(Pneumovirus), 메타뉴모바이러스(Metapneumovirus), 베시클로바이러스(Vesiculovirus), 리사바이러스(Lyssavirus), 에페메로바이러스(Ephemerovirus), 사이토르하브도바이러스(Cytorhabdovirus), 뉴클레오하브도바이러스(Nucleorhabdovirus), 노비르하브도바이러스(Novirhabdovirus), 마르부르그바이러스(Marburgvirus), 에볼라바이러스(Ebolavirus), 보르나바이러스(Bornavirus), 인플루엔자바이러스 A(Influenzavirus A), 인플루엔자바이러스 B(Influenzavirus B), 인플루엔자바이러스 C(Influenzavirus C), 토고토바이러스(Thogotovirus), 이사바이러스(Isavirus), 오르소분야바이러스(Orthobunyavirus), 한타바이러스(Hantavirus), 나이로바이러스(Nairovirus), 프레보바이러스(Phlebovirus), 토스포바이러스(Tospovirus), 아레나바이러스(Arenavirus), 오피오바이러스(Ophiovirus), 테누이바이러스(Tenuivirus), 또는 델타바이러스(Deltavirus)로 구성되는 군으로부터 선택되는 속으로부터의 바이러스이다. 특정 구체예에서, 음성 가닥 RNA 바이러스는 센다이 바이러스(Sendai virus), 홍역 바이러스(Measles virus), 멈프스 바이러스(Mumps virus), 헨드라 바이러스(Hendra virus), 뉴캐슬병바이러스(Newcastle disease virus), 사람 호흡기세포융합바이러스(Human respiratory syncytial virus), 조류 뉴모바이러스(Avian pneumovirus), 수포성 구내염 인디아나 바이러스(Vesicular stomatitis Indiana virus), 광견병 바이러스, 소 유행열 바이러스(Bovine ephemeral fever virus), 레터스 네크로틱 옐로 바이러스(Lettuce necrotic yellows virus), 감자 황고병 바이러스(Potato yellow dwarf virus), 전염성 조혈 괴사 바이러스(Infectious hematopoietic necrosis virus), 빅토리아호 마르부르그바이러스(Lake Victoria marburgvirus), 자이르 에볼라 바이러스(Zaire ebolavirus), 보르나병 바이러스(Borna disease virus), 인플루엔자 바이러스(Influenza virus), 토고토 바이러스(Thogoto virus), 전염성 연어 패혈 바이러스(infectious salmon anemia virus), 부니암웨라바이러스(Bunyamwera virus), 한탄 바이러스(Hantaan virus), 두그베 바이러스(Dugbe virus), 리프트 밸리열 바이러스(Rift Valley fever virus), 토마토 반점 윌트 바이러스(Tomato spotted wilt virus), 림프구성 맥락수막염바이러스(Lymphocytic choriomeningitis virus), 시트러스 소로시스 바이러스(Citrus psorosis virus), 벼줄무늬잎마름병바이러스(Rice stripe virus) 및 델타 간염 바이러스(Hepatitis delta virus)로 구성되는 군으로부터 선택된다. 바람직한 구체예에서, 바이러스는 인플루엔자 바이러스이다(하기 참조).
바이러스가 양성 가닥 RNA 바이러스인 경우, 바이러스는 아르테리비리데(Arteriviridae), 코로나비리다에(Coronaviridae), 피코르나비리다에(Picornaviridae) 및 로니비리다에(Picornaviridae)로 구성되는 군으로부터 선택되는 과로부터 나온다. 추가로, 바이러스는 아테리바이러스(Arterivirius), 코로나바이러스(Coronavirus), 엔테로바이러스(Enterovirus), 토로바이러스(Torovirus), 오카바이러스(Okavirus), 리노바이러스(Rhinovirus), 헤파토바이러스(Hepatovirus), 카르디오바이러스(Cardiovirus), 아프토바이러스(Aphthovirus), 파레코바이러스(Parechovirus), 에르보바이러스(Erbovirus), 코부바이러스(Kobuvirus) 및 테스코바이러스(Teschovirus)로 구성되는 군으로부터 선택되는 속으로부터의 바이러스 일 수 있다. 특정 구체예에서, 바이러스는 중증 급성 호흡기 증후군(SARS) 바이러스, 폴리오 바이러스, 사람 엔테로바이러스 A(HEV-A), 사람 엔테로바이러스 B(HEV-B), 사람 엔테로바이러스 C, 사람 엔테로바이러스 D, A형 간염 및 사람 리노바이러스 A 및 B로 구성되는 군으로부터 선택된다.
바이러스가 이중 가닥 RNA 바이러스인 경우, 바이러스는 비르나비리다에(Birnaviridae), 시스토비리다에(Cystoviridae), 히포비리다에(Hypoviridae), 파르티티비리다에(Partitiviridae), 레오비리다에(Reoviridae) 및 토티비리다에(Totiviridae)로 구성되는 군으로부터 선택되는 과로부터 나올 수 있다. 더욱이, 바이러스는 아쿠아비르나바이러스(Aquabirnavirus), 아비비르나바이러스(Avibirnavirus), 엔토모비르나바이러스(Entomobirnavirus), 시스토바이러스(Cystovirus), 파르티티바이러스(Partitivirus), 알파크립토바이러스(Alphacryptovirus), 베타크립토바이러스(Betacryptovirus), 아쿠아레오바이러스(Aquareovirus), 콜티바이러스(Coltivirus), 시포바이러스(Cypovirus), 피지바이러스(Fijivirus), 이드노레오바이러스(Idnoreovirus), 미코레오바이러스(Mycoreovirus), 오르비바이러스(Orbivirus), 오르소레오바이러스(Orthoreovirus), 오리자바이러스(Oryzavirus), 피토레오바이러스(Phytoreovirus), 로타바이러스(Rotavirus) 및 세아도르나바이러스(Seadornavirus)로 구성되는 군으로부터 선택되는 속으로부터의 바이러스 일 수 있다.
본 발명은 빠른 돌연변이를 겪는 바이러스에 특히 적당하며 재조합 접근은 이후에 추가로 증식되어 적합한 백신을 얻을 수 있는 바이러스의 더 빠른 분리를 허용한다. 따라서, 바람직한 구체예에서 바이러스는 인플루엔자이다.
인플루엔자 바이러스
본 발명은 역 유전학이 잘 특성화된 인플루엔자 A 바이러스 및 인플루엔자 B 바이러스와 함께 사용하기에 특히 적합하다. 인플루엔자 바이러스는 세그먼트로 된 음성 가닥 RNA 바이러스들이다. 인플루엔자 A 및 B 바이러스는 8개의 세그먼트들(PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M 및 NS)을 갖는 한편, 인플루엔자 C 바이러스는 7개를 가졌다(NA 세그먼트가 없음). 바이러스는 보통 복제를 개시하기 위해 적어도 4개의 바이러스 단백질(PB1, PB2, PA 및 핵단백질)의 존재를 요한다. 적어도 이들 4개의 바이러스 단백질은 따라서 단백질 암호화 발현 구조물에 의해 제공되어야 한다.
인플루엔자 A 바이러스에 대한 바람직한 발현 시스템은 복수의 다른 야생형 균주로부터 유래되는 게놈 세그먼트들을 암호화한다. 시스템은 PR/8/34 균주(A/Puerto Rico/8/34)로부터 1개 이상의(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개) 게놈 세그먼트를 암호화할 수 있지만, 보통 이것/이것들은 PR/8/34 HA 세그먼트를 포함하지 않을 것이고 보통 PR/8/34 NA 세그먼트를 포함하지 않을 것이다. 따라서 시스템은 PR/8/34로부터의 세그먼트들 NP, M, NS, PA, PB1 및/또는 PB2 중 적어도 하나(가능하게는 6개 모두)를 암호화할 수 있다..
인플루엔자 A 바이러스에 대해 다른 유용한 발현 시스템은 AA/6/60 인플루엔자 바이러스(A/Ann Arbor/6/60)로부터의 1개 이상의(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6) 게놈 세그먼트를 암호화할 수 있지만, 보통 이것/이것들은 AA/6/60 HA 세그먼트를 포함하지 않을 것이고 보통 AA/6/60 NA 세그먼트를 포함하지 않을 것이다. 따라서 시스템은 AA/6/60로부터의 세그먼트 NP, M, NS, PA, PB1 및/또는 PB2 중 적어도 하나(가능하게는 6개 모두)를 암호화할 수 있다.
인플루엔자 B 바이러스에 대한 발현 시스템은 복수의 다른 야생형 주로부터 유도된 게놈 세그먼트를 암호화할 수도 있다. 시스템은 AA/1/66 인플루엔자 바이러스(B/Ann Arbor/1/66)로부터의 1개 이상의 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6) 게놈 세그먼트를 암호화할 수 있지만, 보통 이것/이것들은 AA/1/66 HA 세그먼트를 포함하지 않을 것이고 보통 AA/1/66 NA 세그먼트를 포함하지 않을 것이다. 따라서 시스템은 AA/1/66으로부터의 세그먼트 NP, M, NS, PA, PB1 및/또는 PB2 중 적어도 하나를 암호화할 수 있다.
A/PR/8/34, AA/6/60, AA/1/66 균주들로부터의 바이러스 세그먼트 및 서열은 널리 이용가능하다. 그것들의 서열은 공공 데이터베이스, 예를 들어, GI:89779337, GI89779334, GI:89779332, GI:89779320, GI:89779327, GL89779325, GI:89779322, GI89779329에서 이용가능하다.
일부 구체예에서는 게놈이 NS1 바이러스 단백질을 암호화하지 않거나, 또는 NS1 단백질이 절단되어 있는 인플루엔자 바이러스를 제공하는 것이 유리할 수도 있다. NS1 녹아웃 변이체는 참고문헌 16에 기술되어 있다. 절단(truncations)은 본 분야에 공지되어 있고(예를 들면 참고문헌 17 및 18 참조) NS1의 처음 N-말단 126개 아미노산 만을 남기는 절단을 포함한다. 이들 NS1-변이체 바이러스 주는 살아있는 약독화된 인플루엔자 백신을 제조하기에 특히 적합하다.
인플루엔자 바이러스(및 어떤 다른 바이러스들)에 대한 역 유전학 시스템은 숙주 세포에서 부수 단백질의 발현을 유발하는 발현 구성체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 비-바이러스 세린 프로테아제(예를 들어, 트립신)를 발현시키는 것이 유리할 수 있다.
상기한 바와 같이, 몇가지 발현 구조물들 간의 바이러스 세그먼트들을 분할하는 것이 유리할 수 있다. 이것은 또한 인플루엔자 바이러스에 대해 사실이다.
한 구체예에서, 제 1 비세균성 발현 구조물은 인플루엔자 바이러스 A 또는 B 게놈 세그먼트들 PB2, PB1, PA, NP 및 NS에 대한 암호화 서열을 포함한다. 제 2 비세균성 구조물은 인플루엔자 바이러스 A 또는 B 게놈 세그먼트 HA에 대한 암호화 서열을 포함한다. NA 및 M 게놈 세그먼트들은 제 1 구조물 상에서 암호화되거나("7:1" 시스템을 제공함) 또는 제 1 구조물 상에서 암호화되거나(5:3 시스템을 제공함), 또는 M 세그먼트는 제 1 구조물 상에 있고 NA 세그먼트는 제 2 구조물 상에 있다(6:2). 인플루엔자 A 바이러스에 대해, 제 1 구조물은 이상적으로는 PR/8/34, AA/6/60 또는 AA/1/66 주로부터의 세그먼트들을 암호화한다. 제 2 구조물 상에서 암호화된 세그먼트들은 제 1 구조물 상의 세그먼트들과 다른 주(들)로부터 올 수 있고, 이로써 인플루엔자 백신 제조에 앞서 정규적으로 수행되는 주 재편성을 용이하게 한다. 8개의 바이러스 세그먼트들에 대한 암호화 서열의 각각은 vRNA로서 발현을 구동하는 프로모터, 예를 들면 pol-I 프로모터를 갖는다. 제 1 구조물은 또한 예를 들어서, 각각 pol-II 프로모터의 제어 하에, 적어도 PB1, PB2, PA 및 NP 바이러스 단백질을 발현하기 위한 암호화 서열을 포함해야 한다. 유용하게는, 구조물의 전체 길이를 감소시키기 위해(따라서 안정성을 증가시킴), PB1, PB2, PA 및 NP 세그먼트들에 대한 암호화 서열은 측면에 한 단부에서 pol-I 프로모터 그리고 다른 단부에서 pol-II 프로모터가 위치하여, 2-방향성 발현이 같은 DNA 암호화 서열로부터의 바이러스 세그먼트 및 바이러스 단백질을 제공할 수 있도록 한다. 따라서 pol-I 프로모터 및 터미네이터 서열은 바이러스 세그먼트를 암호화하는 서열 측면에 위치하고, 이들은 pol-II 프로모터 및 터미네이터 서열에 의해 둘러싸일 수도 있다. 선형 구조물의 쌍은 pol-I 및 pol-II 프로모터를 인식하는 동물 세포로(예를 들면, MDCK 또는 PER.C6 세포들과 같은 포유동물 세포들로) 트랜스펙션되어 감염성 인플루엔자 바이러스를 제공할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 세균성 플라스미드는 인플루엔자 바이러스 A 또는 B 게놈 세그먼트들 PB2, PB1, PA, NP 및 NS에 대한 암호화 서열을 포함한다. 비세균성 구조물(바람직하게는 선형임)은 인플루엔자 바이러스 A 또는 B 게놈 세그먼트 HA에 대한 암호화 서열을 포함한다. NA 및 M 게놈 세그먼트들은 플라스미드 상에서 암호화되거나("7:1" 시스템을 제공함) 또는 비세균성 구조물 상에서 암호화되거나(5:3 시스템을 제공함), 또는 M 세그먼트는 플라스미드 상에 있고 NA 세그먼트는 비세균성 구조물 상에 있다(6:2). 인플루엔자 A 바이러스에 대해, 비세균성 구조물은 이상적으로는 PR/8/34, AA/6/60 또는 AA/1/66 주로부터의 세그먼트들을 암호화한다. 비세균성 구조물 상에서 암호화된 세그먼트들은 플라스미드 상의 세그먼트들과 다른 주(들)로부터 올 수 있고, 이로써 인플루엔자 백신 제조에 앞서 정규적으로 수행되는 주 재편성을 용이하게 한다. 8개의 바이러스 세그먼트들에 대한 암호화 서열의 각각은 vRNA로서 발현을 구동하는 프로모터, 예를 들면 pol-I 프로모터를 갖는다. 플라스미드는 또한 예를 들어서, 각각 pol-II 프로모터의 제어 하에, 적어도 PB1, PB2, PA 및 NP 바이러스 단백질을 발현하기 위한 암호화 서열을 포함해야 한다. 유용하게는, 플라스미드의 전체 길이를 감소시키기 위해(따라서 안정성을 증가시킴), PB1, PB2, PA 및 NP 세그먼트들에 대한 암호화 서열은 측면에 한 단부에서 pol-I 프로모터 그리고 다른 단부에서 pol-II 프로모터가 위치하여, 2-방향성 발현이 같은 DNA 암호화 서열로부터의 바이러스 세그먼트 및 바이러스 단백질을 제공할 수 있도록 한다. 따라서 pol-I 프로모터 및 터미네이터 서열은 바이러스 세그먼트를 암호화하는 서열 측면에 위치하고, 이들은 pol-II 프로모터 및 터미네이터 서열에 의해 둘러싸일 수도 있다. 플라스미드 및 비세균성 구조물들은 사용에 앞서 따로따로 유지되나, 그 다음 둘다 pol-I 및 pol-II 프로모터를 인식하는 동물 세포로(예를 들면, MDCK 또는 PER.C6 세포들과 같은 포유동물 세포들로) 트랜스펙션되어 감염성 인플루엔자 바이러스를 제공할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 비세균성 구조물(바람직하게는 선형임)은 인플루엔자 바이러스 A 또는 B 게놈 세그먼트들 PB2, PB1, PA, NP 및 NS에 대한 암호화 서열을 포함한다. 세균성 플라스미드는 인플루엔자 바이러스 A 또는 B 게놈 세그먼트 HA에 대한 암호화 서열을 포함한다. NA 및 M 게놈 세그먼트들은 비세균성 구조물 상에서 암호화되거나("7:1" 시스템을 제공함); 또는 플라스미드 상에서 암호화되거나(5:3 시스템을 제공함); 또는 별도의 플라스미드 상에서 암호화되거나(5:1:1:1 시스템을 제공함); 또는 NA 세그먼트는 HA와 같은 플라스미드 상에 있는 한편 M 세그먼트는 비세균성 구조물 상에 있고(6:2); 또는 NA 세그먼트는 제 2 플라스미드 상에 있고 M 세그먼트는 비세균성 구조물 상에 있다(6:1:1). 인플루엔자 A 바이러스에 대해, 비세균성 구조물은 이상적으로는 PR/8/34, AA/6/60 또는 AA/1/66 주로부터의 세그먼트들을 암호화한다. 플라스미드 상에서 암호화된 세그먼트들은 비세균성 구조물 상의 세그먼트들과 다른 주(들)로부터 올 수 있고, 이로써 인플루엔자 백신 제조에 앞서 정규적으로 수행되는 주 재편성을 용이하게 한다. 8개의 바이러스 세그먼트들에 대한 암호화 서열의 각각은 vRNA로서 발현을 구동하는 프로모터, 예를 들면 pol-I 프로모터를 갖는다. 비세균성 구조물은 또한 예를 들어서, 각각 pol-II 프로모터의 제어 하에, 적어도 PB1, PB2, PA 및 NP 바이러스 단백질을 발현하기 위한 암호화 서열을 포함해야 한다. 유용하게는, 비세균성 구조물의 전체 길이를 감소시키기 위해, PB1, PB2, PA 및 NP 세그먼트들에 대한 암호화 서열은 측면에 한 단부에서 pol-I 프로모터 그리고 다른 단부에서 pol-II 프로모터가 위치하여, 2-방향성 발현이 같은 DNA 암호화 서열로부터의 바이러스 세그먼트 및 바이러스 단백질을 제공할 수 있도록 한다. 따라서 pol-I 프로모터 및 터미네이터 서열은 바이러스 세그먼트를 암호화하는 서열 측면에 위치하고, 이들은 pol-II 프로모터 및 터미네이터 서열에 의해 둘러싸일 수도 있다. 플라스미드 및 비세균성 구조물들은 사용에 앞서 따로따로 유지되나, 그 다음 둘다 pol-I 및 pol-II 프로모터를 인식하는 동물 세포로(예를 들면, MDCK 또는 PER.C6 세포들과 같은 포유동물 세포들로) 트랜스펙션되어 감염성 인플루엔자 바이러스를 제공할 수 있다.
그러나, 일부 구체예에서는, 완전한 바이러스 게놈을 암호화하기 위해 단일 구조물이 사용된다. 따라서 본 발명은 모든 8개의 인플루엔자 바이러스 A 또는 B 게놈 세그먼트들을 발현하기 위한 암호화 서열들을 포함하는 비세균성 발현 구조물을 제공한다. 이 구조물은 이상적으로는 예를 들어서 22-26kbp 사이의 선형 구조물이다. 8개의 바이러스 세그먼트들에 대한 암호화 서열의 각각은 vRNA로서 발현을 구동하는 프로모터, 예를 들면 pol-I 프로모터를 갖는다. 구조물은 또한 예를 들어서, 각각 pol-II 프로모터의 제어 하에, 적어도 PB1, PB2, PA 및 NP 바이러스 단백질을 발현하기 위한 암호화 서열을 포함해야 한다. 유용하게는, 구조물의 전체 길이를 감소시키기 위해, PB1, PB2, PA 및 NP 세그먼트들에 대한(바람직하게는 모든 8개의 바이러스 세그먼트들에 대한) 암호화 서열은 측면에 한 단부에서 pol-I 프로모터 그리고 다른 단부에서 pol-II 프로모터가 위치하여, 2-방향성 발현이 같은 DNA 암호화 서열로부터의 바이러스 세그먼트 및 바이러스 단백질을 제공할 수 있도록 한다. 따라서 pol-I 프로모터 및 터미네이터 서열은 바이러스 세그먼트를 암호화하는 서열 측면에 위치하고, 이들은 pol-II 프로모터 및 터미네이터 서열에 의해 둘러싸일 수도 있다. 이 선형 구조물은 pol-I 및 pol-II 프로모터를 인식하는 동물 세포로(예를 들면, MDCK 또는 PER.C6 세포들과 같은 포유동물 세포들로) 트랜스펙션되어 감염성 인플루엔자 바이러스를 제공할 수 있다.
세포
본 발명은 발현 구조물로 트랜스펙션 후 관심의 바이러스를 발현할 수 있는 어떤 세포에서도 수행될 수 있다. 본 발명은, 예를 들어 1차 세포가 대안으로서 사용될 수 있지만 셀 라인을 전형적으로 사용할 것이다. 세포는 전형적으로 포유동물일 것이지만, 원숭이나 곤충 세포도 사용될 수 있다. 적합한 포유동물 세포는, 제한되는 것은 아니지만, 햄스터, 소, 영장류(사람 및 원숭이를 포함함) 및 개 세포를 포함한다. 신장 세포, 섬유아세포, 망막 세포, 폐 세포 등과 같은 다양한 세포 형태가 사용될 수 있다. 적합한 햄스터 세포의 예들은 명칭 BHK21 또는 HKCC를 갖는 셀 라인들이다. 적합한 원숭이 세포는, 예를 들어 아프리카 그린 원숭이 세포, 예칸대 Vero 셀 라인에서와 같은 신장세포이다[19-21]. 적당한 개 세포는, 예를 들어 CLDK 및 MDCK 셀 라인에서와 같은 신장세포이다. 적합한 조류 세포는 배아 줄기 세포들, EB45, EB14, 및 EB14-074로부터 유도된 EBx 셀라인을 포함한다[2 [ 22 ] WO2006/108846. 2].
추가의 적당한 세포는, 제한되는 것은 아니지만, CHO; 293T; MRC 5; PER.C6 [23]; FRhL2; WI-38 등을 포함한다. 적합한 세포는, 예를 들어 ATCC(American Type Cell Culture) 콜렉션으로부터[24], Coriell Cell Repositories [25]로부터 또는 ECACC(European Collection of Cell Cultures)로부터 널리 이용가능하다. 예를 들어, ATCC는 카탈로그 번호 CCL 81, CCL 81.2, CRL 1586 및 CRL-1587 하에서 다양한 다른 Vero 세포를 공급하고, 그것은 카탈로그 번호 CCL 34 하에서 MDCK 세포를 공급한다. PER.C6은 기탁번호 96022940 하에서 ECACC로부터 이용가능하다.
본 발명에서 사용을 위한 바람직한 세포(특히 성장하는 인플루엔자 바이러스에 대해)는 Madin Darby 개 신장으로부터 유래되는 MDCK 세포이다[26-28]. 원래의 MDCK 세포는 CCL 34로서 ATCC로부터 이용가능하다. 이들 또는 다른 MDCK 세포의 유도체가 사용되는 것이 바람직하다. 이러한 유도체는, 예를 들어 현탁 배양물에서 성장을 위해 적합하게 된 MDCK 세포를 개시하는 참고문헌 26에서 기술되었다(DSM ACC 2219로서 기탁된 'MDCK 33016' 또는 '33016-PF'). 더 나아가서, 참고문헌 29는 무혈청 배양물 내 현탁액에서 성장하는 MDCK-유래 세포를 개시한다(FERM BP-7449로서 기탁된 'B-702'). 일부 구체예에서, 사용된 MDCK 셀 라인은 종양형성성일 수 있으나, 비 종양형성성 MDCK 세포를 사용하는 것도 또한 포함된다. 예를 들면, 참고문헌 30은 'MDCK-S' (ATCC PTA-6500), 'MDCK-SF101' (ATCC PTA-6501), 'MDCK-SF102' (ATCC PTA-6502) 및 'MDCK-SF103' (ATCC PTA-6503)을 포함하는 비 종양형성성 MDCK 세포를 개시한다. 참고문헌 31은 'MDCK.5F1' 세포(ATCC CRL 12042)를 포함하는, 감염에 높은 민감성을 갖는 MDCK 세포를 개시한다.
바이러스 구급을 위해 한 가지 이상의 세포 유형의 혼합물을 사용하는 것이 가능하나, 단일 세포 유형을 사용하는, 예를 들어 단일클론 세포를 사용하는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 세포는 단일 셀 라인으로부터 나온다. 바이러스의 후속 증식을 위해 하류에서, 예를 들면, 바이러스 성장의 동안에, 같은 셀 라인이 사용될 수도 있다.
바람직하게는, 세포는 통상적인 오염원을 피하기 위해 혈청의 부재하에서 배양된다. 진핵 세포 배양물에 대해 다양한 무혈청 배지가 당업자에게 공지되어 있다(예를 들어, Iscove's 배지, 울트라 CHO 배지(BioWhittaker), EX-CELL (JRH Biosciences)). 더 나아가서, 무단백질 배지가 사용될 수도 있다(예를 들어, PF-CHO (JRH Biosciences)). 다르게는, 복제를 위한 세포는 또한 통상적인 혈청-함유 배지(예를 들어, 0.5% 내지 10% 소 태아 혈청이 있는 MEM 또는 DMEM 배지)에서 배양될 수 있다.
세포는 점착성 배양물 또는 현탁액에 있을 수 있다.
백신
본 발명은 본 발명의 숙주 세포에 의해 생산된 인플루엔자 바이러스를 제공한다. 인플루엔자 바이러스는 여러가지 방법으로, 예를 들면, 백신 제조를 위한 시드 바이러스로서 사용될 수 있다.
따라서 본 발명은 백신을 생산하기 위해 구급된 바이러스를 이용한다.
백신(특히 인플루엔자 바이러스에 대한 것)은 일반적으로 생 바이러스 또는 불활성화 바이러스 중 하나에 기초한다. 예를 들면, 참고문헌 32의 chapters 17 및 18 참조. 불활성화 백신은 전 비리온, '분할(split)' 비리온, 또는 정제된 표면 항원에 기초할 수 있다. 항원들은 또한 바이로좀(virosomes)의 형태로 존재할 수 있다. 본 발명은 이들 종류의 백신의 어떤 것도 제조하기 위해 사용될 수 있다.
불활성화 바이러스가 사용되는 경우, 백신은 전 비리온, 분할 비리온, 또는 정제된 표면 항원(헤마그글루티닌을 포함하고, 보통 또한 뉴라미니다아제를 포함하는 인플루엔자에 대한 것)을 포함할 수 있다. 바이러스를 불활성화하기 위한 화학적 수단은 하나 이상의 하기 약제의 유효량으로 처리를 포함한다: 세정제, 포름알데히드, β-프로피오락톤, 메틸렌 블루, 소랄렌, 카르복시풀러렌(C60), 바이너리 에틸아민, 아세틸 에틸렌이민, 또는 이들의 조합. 바이러스 불활성화의 비-화학적 방법은, 예를 들어 UV 광 또는 감마 조사와 같이 당업계에 공지되어 있다.
비리온은 바이러스-함유 유체, 예를 들어 요막액(allantoic fluid) 또는 세포 배양물 상청액으로부터 여러가지 방법에 의해 수확될 수 있다. 예를 들면, 정제 과정은 비리온을 붕괴하는 세정제를 포함하는 선형 수크로오스 구배 용액을 사용하는 띠원심분리를 수반할 수 있다. 항원은 그 다음에 선택적 희석 후 투석여과에 의해 정제될 수 있다.
분할 비리온은 세정제(예를 들어, 에틸 에테르, 폴리소르베이트 80, 데옥시콜레이트, 트리-N-부틸 포스페이트, Triton X-100, Triton N101, 세틸트리메틸암모늄 브로마이드, Tergitol NP9, 등)로 정제된 비리온을 처리하여 서브비리온 제제를 생산함으로써 얻어지고, 'Tween-에테르' 분할 공정을 포함한다. 인플루엔자 바이러스의 스플리팅 방법은, 예를 들어 당업계에 잘 알려져 있다, 예를 들어 참고문헌 33-38 등 참조. 바이러스의 분할은 분할제의 붕괴 농도로 감염성이든 비-감염성이든 전체 바이러스를 붕괴 또는 단편화함으로써 수행된다. 붕괴는 바이러스 단백질의 전체 또는 부분적인 용해화를 초래하여 바이러스의 일체성을 변경시킨다. 바람직한 분할제는 비-이온성 및 이온성 (예를 들어, 양이온성) 계면활성제, 예를 들면, 알킬글리코시드, 알킬티오글리코시드, 아실 당, 술포베타인, 폴리옥시에틸렌알킬에테르, N,N-디알킬-글루카미드, 헤카메그(Hecameg), 알킬페녹시-폴리에톡시에탄올, NP9, 4차 암모늄 화합물, 사르코실, CTAB(세틸 트리메틸 암모늄 브로마이드), 트리-N-부틸 포스페이트, 세타블론, 미리스틸트리메틸암모늄 염, 리포펙틴, 리포펙타민, 및 DOT-MA, 옥틸- 또는 노닐페녹시 폴리옥시에탄올(예를 들어, Triton X-100 또는 Triton N101과 같은 Triton 계면활성제), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르(Tween 계면활성제), 폴리옥시에틸렌 에테르, 폴리옥시에틸렌 에스테르 등이다. 하나의 유용한 분할 과정은 데옥시콜산 나트륨 및 포름알데히드의 연속적인 효과를 사용하고, 분할은 초기 비리온 정제 동안(예를 들어, 수크로오스 밀도 구배 용액에서) 일어날 수 있다. 따라서 분할 과정은 비리온-함유 물질의 정화(비-비리온 물질을 제거하기 위함), 수확한 비리온의 농축(예를 들어, CaHPO4 흡착과 같은 흡착 방법을 사용함), 비-비리온 물질로부터 전체 비리온의 분리, 밀도 구배 원심분리 단계에서 분할제를 사용하는 비리온의 분할(예를 들어, 데옥시콜산 나트륨과 같은 분할제를 함유하는 수크로오스 구배를 사용함), 이어서 원치않는 물질을 제거하기 위한 여과(예를 들어, 초미세여과)를 수반할 수 있다. 분할 비리온은 인산나트륨-완충된 등장 염화나트륨 용액에서 유용하게 재현탁될 수 있다.
정제된 인플루엔자 바이러스 표면 항원 백신은 표면 항원 헤마그글루티닌, 및 전형적으로 또한 뉴라미니다아제를 포함한다. 정제된 형태로 이들 단백질을 제조하기 위한 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. FLUVIRIN™, AGRIPPAL™ 및 INFLUVAC™ 제품은 인플루엔자 서브유닛 백신이다.
다른 형태의 불활성화 항원은 바이로좀이다[39](무 핵산 바이러스 유사 리포좀 입자). 바이로좀은 세정제로 바이러스의 용해화와 이어서 뉴클레오캡시드의 제거 및 바이러스 당단백질을 함유하는 막의 복원에 의해 제조될 수 있다. 바이로좀을 제조하기 위한 또 다른 방법은 과량의 인지질에 바이러스 막 당단백질을 첨가하여 그것의 막에서 바이러스 단백질을 갖는 리포좀을 제공하는 것을 수반한다.
본 발명은 또한 생 백신을 생산하기 위해 사용될 수도 있다. 이러한 백신은 보통 비리온 함유 액으로부터 비리온을 정제함으로써 제조된다. 예를 들면, 액은 원심분리에 의해 투명하게 하고, 완충액(예를 들어서, 수크로스, 인산칼륨, 및 글루탐산 일나트륨을 함유함)으로 안정화시킬 수 있다.
바이러스는 약독화될 수 있다. 바이러스는 온도-민감성일 수 있다. 바이러스는 저온-적응될 수 있다. 이들 3가지 특징들은 항원으로서 생 바이러스를 사용할 때 특히 유용하고, 역 유전학은 이러한 바이러스 주들을 제조하기 위해 특히 유용하다.
HA는 불활성화 인플루엔자 백신에서 주요 면역원이고, 백신 투여용량은 SRID에 의해 전형적으로 측정되는 HA 수준을 기준으로 표준화되어 있다. 현존하는 백신은 전형적으로 주 당 약 15㎍의 HA를 함유하나, 예를 들어, 어린이 또는 유행병 상황에서, 또는 보조제를 사용할 때 더 낮은 용량이 사용될 수 있다. 더 높은 용량(예를 들어 3x 또는 9x 용량[40,41])이 사용된 것과 같이, 1/2(즉, 주 당 7.5㎍ HA), 1/4 및 1/8 과 같은 분할 용량이 사용되었다. 따라서 백신은 인플루엔자 주 당 0.1 내지 150㎍, 바람직하게는 0.1 내지 50㎍, 예를 들어 0.1-20㎍, 0.1-15㎍, 0.1-1O㎍, 0.1-7.5㎍, 0.5-5㎍ 등의 HA를 포함할 수 있다. 특정 용량은 주 당, 예를 들어, 약 45, 약 30, 약 15, 약 10, 약 7.5, 약 5, 약 3.75, 약 1.9, 약 1.5 등을 포함한다.
생 백신에 대해, 투여용량은 HA 함량보다 오히려 중앙 조직 배양물 감염성 용량(TCID50)에 의해 측정되고, 주 당 106 내지 108 (바람직하게는 106.5-107.5)의 TCID50이 전형적이다.
본 발명에서 사용되는 인플루엔자 주는 야생형 바이러스에서 발견되는 바와 같은 천연 HA 또는 변형된 HA를 가질 수 있다. 예를 들어, 조류 종에서 매우 병원성이 되는 바이러스를 야기하는 결정 요인(예를 들어, HA1/HA2 절단 부위 주변의 과-염기성 영역)을 제거하기 위해 HA를 변형시키는 것은 알려져 있다. 역 유전학의 사용은 이러한 변형을 용이하게 한다.
백신에서 사용을 위한 인플루엔자 바이러스 주는 계절에 따라 변화한다. 유행기간 사이에, 백신은 전형적으로 2가지의 인플루엔자 A 주(H1N1 및 H3N2) 및 한 가지의 인플루엔자 B 주를 포함하며, 3가의 백신이 전형적이다. 본 발명은 또한 H2, H5, H7 또는 H9 서브타입 균주와 같은 유행의 바이러스 균주(즉, 백신 수용자 및 일반적인 사람 집단이 면역학적으로 나이브(naive)한 주, 특히 인플루엔자 A 바이러스)를 사용할 수 있고, 유행의 균주에 대한 인플루엔자 백신은 1가일 수 있고 또는 유행 균주에 의해 보충되는 정상적인 3가의 백신을 기초로 할 수 있다. 그러나, 계절과 백신에 포함되는 항원의 성질에 의존하여, 본 발명은 하나 이상의 HA 서브타입 H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 또는 H16에 대해 예방할 수 있다. 본 발명은 하나 이상의 인플루엔자 A 바이러스 NA 서브타입 N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8 또는 N9에 대해서 예방할 수 있다.
게다가 유행기 사이의 균주에 대한 면역화에 적당할 뿐만 아니라, 본 발명의 조성물은 유행성 또는 잠재적으로-유행성인 균주에 대한 면역화를 위해 특히 유용하다. 유행성의 발생을 야기하는 가능성을 제공하는 인플루엔자 주의 특성은: (a) 현재-순환하는 사람 주에서의 헤마그글루티닌과 비교하여 새로운 헤마글루티닌, 즉, 십년 이상 동안 사람 집단에서 드러나지 않았던 것(예를 들어, H2) 또는 이전에 사람 집단에서 전혀 보이지 않았던 것(예를 들어, 단지 새 집단에서만 일반적으로 발견된 H5, H6 또는 H9)을 함유하여, 사람 집단은 주의 헤마그글루티닌에 면역학적으로 나이브하게 된다는 것이고; (b) 사람 집단에서 수평으로 전달될 수 있다는 것; (c) 사람에게 병원성이라는 것이다. H5 헤마그글루티닌 형을 가지는 바이러스는 H5N1 주와 같은 유행성 인플루엔자에 대한 면역화를 위해 바람직하다. 다른 가능한 주는 H5N3, H9N2, H2N2, H7N1 및 H7N7, 및 어떤 다른 출현하는 잠재적으로 유행성인 주를 포함한다. 본 발명은 비-사람 동물 집단 내지 사람, 예를 들어, 돼지-기원 H1N1 인플루엔자 주를 퍼뜨릴 수 있는 또는 퍼진 잠재적인 유행성 바이러스 주에 대한 예방에 특히 적합하다. 본 발명은 따라서 비-사람 동물 뿐만 아니라 사람에게 백신 접종하기에 적합하다.
항원이 유용하게 조성물에 포함될 수 있는 다른 주들은 저항성 유행성 주[43]를 포함하는 항바이러스 치료에 저항성인(예를 들어, 오셀타미비르(oseltamivir)[42] 및/또는 자나미비르(zanamivir)에 저항성인) 주들이다.
본 발명의 조성물은 인플루엔자 A 바이러스 및/또는 인플루엔자 B 바이러스를 포함하는, 하나 이상의(예를 들어 1, 2, 3, 4 또는 그 이상) 인플루엔자 바이러스 주로부터의 항원(들)을 포함할 수 있다. 백신이 하나 이상의 인플루엔자 주를 포함하는 경우, 다른 주들은 전형적으로 별개로 성장되고 바이러스가 수확되고 항원이 제조된 후 혼합되었다. 따라서 본 발명의 공정은 하나 이상의 인플루에자 주로부터의 항원들을 혼합하는 단계를 포함할 수 있다. 2가지의 인플루엔자 A 바이러스 주와 한 가지의 인플루엔자 B 바이러스 주로부터의 항원을 포함하는 3가의 백신이 전형적이다. 4가의 백신도 또한 유용하다. 2가지의 인플루엔자 A 바이러스 주와 2가지의 인플루엔자 B 바이러스 주, 또는 3가지 인플루엔자 A 바이러스 주와 한가지 인플루엔자 B 바이러스 주를 포함하는 4가의 백신이 또한 유용하다[44].
인플루엔자 백신의 제조를 위한 바이러스는 난에서 또는 세포 배양물에서 성장될 수 있다. 백신을 위한 인플루엔자 바이러스 성장에 대한 현 표준 방법은 SPF 유정란(embryonated SPF hen eggs)을 사용하며, 바이러스는 난 내용물(뇨막강액)로부터 정제된다. 세포 배양물을 사용하여 OPTAFLU™ 제품을 만든다. 세포는 바람직하게는 백신 생산에 사용된 바이러스를 성장시키기 위한 무혈청 또는 무단백질 배지에서 배양된다. 세포의 배양은 바람직하게는 30 내지 40℃의 온도에서 일어난다. 세포는 30-36℃ 또는 32-34℃의 온도에서 또는 33℃에서 바이러스 성장 동안에 배양될 수 있다. 이 온도 범위에서 감염된 세포의 인큐베이션은 백신 사용을 위한 개선된 인플루엔자 바이러스의 생산을 가져온다[45]. 바이러스는 점착 배양물에서 또는 현탁액에서 세포 상에서 성장시킬 수 있다. 마이크로캐리어 배양물이 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 세포는 이와 같이 현탁액에서의 성장을 위해 적합하게 될 수 있다. 세포 배양물에서의 성장은 바이러스를 일으킨 역 유전학을 위해 사용된 것과 같은 세포 유형을 사용할 수도 있다.
방법은 배양물 액으로부터 바이러스 또는 그것들의 항원의 수확 및 분리의 성장후 단계를 포함할 수 있다. 바이러스 또는 단백질의 분리의 동안에, 세포는 분리, 여과 또는 한외여과와 같은 표준 방법에 의해 배양 배지로부터 분리된다. 바이러스 또는 그것들의 항원은 그 다음 구배 원심분리, 여과, 침전, 크로마토그래피, 등과 같은 당업자에게 충분히 공지된 방법에 따라 농축한 다음 정제된다. 본 발명에 따라 바이러스를 정제의 동안에 또는 후에 불활성화하는 것도 바람직하다. 바이러스 불활성화는 예를 들어서, 정제 공정 내의 어느 시점에서 β-프로피오락톤 또는 포름알데히드에 의해 일어날 수 있다.
숙주 세포 DNA
바이러스가 셀 라인에서 분리되고 및/또는 성장된 경우, DNA의 어떤 종양 유발 활성을 최소화하기 위해 최종 백신의 잔여 셀 라인 DNA의 양을 최소화하는 것이 표준 실시이다. 따라서 본 발명에 따라서 제조되는 백신 조성물은 미량의 숙주 세포 DNA가 존재할 수 있을지라도, 바람직하게는 용량 당 잔여 숙주 세포 DNA 10ng 미만(바람직하게는 1ng 미만, 및 더 바람직하게는 100pg 미만)을 함유한다.
임의의 잔여 숙주 세포 DNA의 평균 길이가 500bp 미만, 예를 들어 400bp 미만, 300bp 미만, 200bp 미만, 100 bp 미만 등인 것이 바람직하다.
DNA를 오염시키는 것은 표준 정제 과정, 예를 들어 크로마토그래피 등을 사용하여 백신 제조 동안 제거될 수 있다. 잔여 숙주 세포 DNA의 제거는 예를 들어, DNase를 사용함으로써 뉴클레아제 처리에 의해 향상될 수 있다. 숙주 세포 DNA 오염을 감소시키는 편리한 방법은 먼저 바이러스 성장 동안 사용될 수 있는 DNase(예를 들어, 벤조나제)를 사용하는 단계, 다음에 비리온 파괴 동안 사용될 수 있는 양이온성 세제(예를 들어, CTAB)를 사용하는 단계의 2-단계 처리를 수반하는 참고문헌 46 및 47에서 개시되어 있다. β-프로피오락톤과 같은 알킬화제로 처리는 또한 숙주 세포 DNA를 제거하기 위해 사용될 수 있고, 유리하게는 또한 불활성 비리온을 불활성화하기 위해 사용될 수 있다[48].
약제학적 조성물
본 발명에 따라서 제조되는 백신 조성물은 약제학적으로 허용가능하다. 그것들은 보통 항원들에 더하여 성분을 포함하는데, 예를 들어, 그것들은 전형적으로 한 가지 이상의 약제학적 담체(들) 및/또는 부형제(들)을 포함한다. 하기 설명하는 바와 같이, 보조제가 또한 포함될 수도 있다. 이러한 성분들의 충분한 논의는 참고문헌 49에서 이용가능하다.
백신 조성물은 일반적으로 수성 형태일 것이다. 그러나, 일부 백신은 건조 형태, 예를 들어 주사 가능한 고체 또는 패치 상의 건조된 또는 중합화된 제제의 형태일 수 있다.
백신 조성물은 티메로살과 같은 보존제를 포함할 수 있다. 그러나, 수은함유 물질이 실질적으로 없는(즉, 5㎍/㎖ 미만), 예를 들어, 무-티메로살이어야 한다[37,50]. 수은을 함유하지 않는 백신이 더 바람직하다. α-토코페롤 숙시네이트는 수은 화합물에 대한 대안으로서 포함될 수 있다[37]. 보존제가 없는 백신이 특히 바람직하다.
등장성을 조절하기 위해, 나트륨 염과 같은 생리적 염을 포함하는 것을 바람직하다. 1 내지 20mg/㎖로 존재할 수 있는 염화나트륨(NaCl)이 바람직하다. 존재할 수 있는 다른 염은 염화칼륨, 인산이수소칼륨, 인산2나트륨 무수물, 염화마그네슘, 염화칼슘 등을 포함한다.
백신 조성물은 일반적으로 200 mOsm/kg 내지 400 mOsm/kg, 바람직하게는 240-360 mOsm/kg의 삼투압을 가질 것이고, 더 바람직하게는 290-310 mOsm/kg의 범위에 있을 것이다. 삼투압은 백신접종에 의해 야기되는 통증에 영향을 미치지 않는 것으로 이전에 보고되었지만[51], 그럼에도 이 범위로 삼투압을 유지하는 것이 바람직하다.
백신 조성물은 하나 이상의 완충액을 포함할 수 있다. 백신 조성물의 pH는 일반적으로 5.0 내지 8.1, 및 더 전형적으로는 6.0 내지 8.0, 예를 들어 6.5 내지 7.5, 또는 7.0 내지 7.8일 것이다.
백신 조성물은 바람직하게는 멸균이다. 백신 조성물은 예를 들어, 투여용량 당 <1 EU (엔도톡신 단위, 표준 측정), 및 바람직하게는 투여용량 당 <0.1 EU를 함유하는, 바람직하게는 비-발열성이다. 백신 조성물은 바람직하게는 글루텐이 없다.
본 발명의 백신 조성물은, 특히 분할 또는 표면 항원 백신에 대해, 세제, 예를 들어 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 계면활성제('Tweens'로 알려짐), 옥톡시놀(예컨대 옥토시놀-9(Triton X-1OO) 또는 t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올), 세틸 트리메틸 암모늄 브로마이드('CTAB'), 또는 데옥시콜산 나트륨을 포함할 수 있다. 세제는 단지 미량으로 존재할 수 있다. 따라서 백신은 각각 1mg/㎖ 미만의 옥톡시놀-10 및 폴리소르베이트 80을 포함할 수 있다. 미량의 다른 잔여 성분들은 항생제일 수 있다(예를 들어, 네오마이신, 카나마이신, 폴리믹신 B).
백신 조성물은 단일 면역화를 위한 물질을 포함할 수 있고 또는 다수회 면역화를 위한 물질을 포함할 수 있다(즉, '다수회용량' 키트). 보존제의 포함은 다수회용량 배치에서 바람직하다. 다수회용량 조성물에서 보존제를 포함하는 것에 대한 대안으로서(또는 더하여), 조성물은 물질의 제거를 위한 무균성 어댑터를 갖는 용기에 함유될 수도 있다.
인플루엔자 백신은 절반의 용량(즉, 약 0.25㎖)이 어린이에게 투여될 수도 있지만, 전형적으로 약 0.5㎖의 용량 부피로 투여된다.
본 발명의 조성물(또는 키트 구성요소)을 위한 적합한 용기는 바이알, 주사기(예를 들면 일회용 사전충전된 주사기), 코 분무기, 등을 포함한다. 이들 용기는 멸균되어야 한다. 바이알은 1회 용량의 백신을 포함할 수 있고, 또는 1회 용량 이상('다수회용량' 바이알), 예를 들면 10회 용량을 포함할 수도 있다. 바람직한 바이알은 무색 유리로 만들어진다. 바이알은, 특히 다수회용량 바이알의 경우에, 그것의 내용물의 무균성 제거를 허용하는 캡을 가질 수도 있다. 용기는 절반-용량 부피를 나타내도록, 예를 들어서 어린이에게 전달을 용이하게 하도록 표시될 수도 있다. 예를 들면, 0.5ml 용량을 함유하는 주사기에 0.25ml 부피를 나타내는 표시를 할 수 있다.
유리 용기(예를 들면 주사기 또는 바이알)가 사용되는 경우에, 그때는 소다석회 유리보다는 붕규산 유리로 만들어진 용기를 사용하는 것이 바람직하다.
성분을 주사기로 패키징하는 경우, 주사기는 거기에 부착된 바늘을 가질 수 있다. 바늘이 부착되어 있지 않으면, 별도의 주사기를 조립 및 사용을 위해 주사기와 함께 둘 수 있다. 이러한 바늘은 집에 넣어 있을 수 있다. 안전 바늘이 바람직하다. 1-인치 23-게이지, 1-인치 25-게이지 및 5/8-인치 25-게이지 바늘이 전형적이다.
보조제
본 발명의 백신 조성물은 유리하게는 보조제는 포함하는데, 이것은 조성물을 받은 환자에서 유발된 면역 반응(체액성 및/또는 세포성)을 향상시키는 기능을 할 수 있다. 바람직한 보조제는 수중유 에멀젼을 포함한다. 여러가지 이러한 보조제는 공지이고, 그것들은 전형적으로 적어도 하나의 오일 및 적어도 하나의 계면활성제를 포함하며, 오일(들) 및 계면활성제(들)은 생분해성(대사가능) 및 생체적합성이다. 에멀젼 중의 오일 방울들은 일반적으로 직경이 5㎛ 미만이고 이상적으로는 미크론이하 직경을 가지며, 이들 작은 크기들은 안정한 에멀젼을 제공하기 위해 마이크로유동화기로 달성된다. 220nm 미만의 크기를 갖는 방울들이 바람직한데 그것들이 여과멸균될 수 있기 때문이다.
본 발명에 유용한 특정 수중유 에멀젼 보조제는, 제한되는 것은 아니지만 다음을 포함한다:
● 스쿠알렌, Tween 80, 및 Span 85의 미크론이하 에멀젼. 에멀젼의 조성물은 약 5부피% 스쿠알렌, 약 0.5부피% 폴리소르베이트 80 및 약 0.5% Span 85일 수 있다. 중량조건에서, 이들 비율은 4.3% 스쿠알렌, 0.5% 폴리소르베이트 80 및 0.48% Span 85이다. 이 보조제는 참고문헌 55의 Chapter 10 및 참고문헌 56의 Chapter 12에서 더욱 상세하게 설명되는 'MF59'로서 알려져 있다[52-54]. MF59 에멀젼은 유리하게는 시트레이트 이온, 예를 들어, 1OmM 시트르산나트륨 완충액을 포함한다.
● 스쿠알렌, DL-α-토코페롤, 및 폴리소르베이트 80 (Tween 80)의 에멀젼. 에멀젼은 인산염 완충 식염수를 포함할 수 있다. 그것은 또한 Span 85 (예를 들어, 1 %로) 및/또는 레시틴을 포함할 수 있다. 이들 에멀젼은 2 내지 10% 스쿠알렌, 2 내지 10% 토코페롤 및 0.3 내지 3% Tween 80을 가질 수 있고, 스쿠알렌:토코페롤의 중량비는 이것이 더욱 안정한 에멀젼을 제공하기 때문에 바람직하게는 ≤ 1이다. 스쿠알렌과 Tween 80은 약 5:2의 부피비 또는 약 11:5의 중량비로 존재할 수 있다. 하나의 이러한 에멀젼은 PBS 중에 Tween 80을 용해하여 2% 용액을 제공한 다음, 90㎖의 이 용액과 (5g의 DL-α-토코페롤과 5㎖ 스쿠알렌)의 혼합물을 혼합함으로써 만들어질 수 있다. 결과된 에멀젼은 100 내지 250nm, 바람직하게는 약 180nm의 평균 직경으로 미크론이하 오일 방울을 가질 수 있다. 에멀젼은 또한 3-탈-O-아실화된 모노포스포릴 지질 A(3d-MPL)를 포함할 수 있다. 다른 유용한 이 종류의 에멀젼은, 사람 투여 용량 당, 0.5-10 mg 스쿠알렌, 0.5-11 mg 토코페롤, 및 0.1-4 mg 폴리소르베이트 80을 포함할 수 있다[57].
● 스쿠알렌, 토코페롤 및 Triton 세제(예를 들어, Triton X-100)의 에멀젼. 에멀젼은 또한 3d-MPL을 포함할 수 있다(하기 참조). 에멀젼은 인산염 완충액을 함유할 수 있다. 에멀젼은 또한 3d-MPL을 포함할 수 있다(하기 참조). 에멀젼은 인산 완충액을 함유할 수 있다.
● 폴리소르베이트(예를 들어, 폴리소르베이트 80), Triton 세제(예를 들어, Triton X-100) 및 토코페롤(예를 들어, α-토코페롤 숙시네이트)를 포함하는 에멀젼. 에멀젼은 이들 3가지 성분을 약 75 : 11 : 10 (예를 들어, 750㎍/㎖ 폴리소르베이트 80, 11O㎍/㎖ Triton X-100 및 1OO㎍/㎖ α-토코페롤 숙시네이트)의 중량 비율로 포함할 수 있고, 이들 농도는 항원으로부터 이들 성분의 어떤 기여를 포함하여야 한다. 에멀젼은 또한 스쿠알렌을 포함할 수 있다. 에멀젼은 또한 3d-MPL을 포함할 수 있다(하기 참조). 수층은 인산염 완충액을 함유할 수 있다.
● 스쿠알렌, 폴리소르베이트 80 및 폴록사머 401 ("Pluronic™ L121")의 에멀젼. 에멀젼은 인산염 완충 식염수, pH 7.4에서 제형화될 수 있다. 이 에멀젼은 무라밀 디펩티드에 대한 유용한 전달 비히클이고, "SAF-1" 보조제에서 트레오닐-MDP와 함께 사용되었다[58](0.05-1% Thr-MDP, 5% 스쿠알렌, 2.5% Pluronic L121 및 0.2% 폴리소르베이트 80). 이는 또한 "AF" 보조제에서와 같이, Thr-MDP 없이 사용될 수 있다[59](5% 스쿠알렌, 1.25% Pluronic L121 및 0.2% 폴리소르베이트 80). 미세유동화가 바람직하다.
● 스쿠알렌, 수성 용매, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르 친수성 비이온성 계면활성제(예를 들어, 폴리옥시에틸렌 (12) 세토스테아릴 에테르) 및 소수성 비이온성 계면활성제(예를 들어, 소르비탄 에스테르 또는 만니드 에스테르, 예컨대 소르비탄 모노올레이트 또는 'Span 80')를 포함하는 에멀젼. 에멀젼은 바람직하게는 열가역적이고 및/또는 200 nm 미만의 크기를 갖는 적어도 90%의 오일 방울(부피)을 갖는다[60]. 에멀젼은 또한 하나 이상의 알디톨; 동결보호제(예를 들어, 도데실말토사이드 및/또는 수크로스와 같은 당); 및/또는 알킬폴리글리코시드를 포함할 수도 있다. 에멀젼은 TLR4 작용제를 포함할 수 있다[61]. 이러한 에멀젼은 동결건조될 수 있다.
● 스쿠알렌, 폴록사머 105 및 Abil-Care의 에멀젼[62]. 보조제 백신에서 이들 성분의 최종 농도(중량)은 5% 스쿠알렌, 4% 폴록사머 105(플루로닉 폴리올) 및 2% Abil-Care 85 (Bis-PEG/PPG-16/16 PEG/PPG-16/16 디메티콘; 카프릴/카프릭 트리글리세라이드)이다.
● 0.5-50%의 오일, 0.1-10%의 인지질, 및 0.05-5%의 비이온성 계면활성제를 갖는 에멀젼. 참고문헌 63에서 설명된 바와 같이, 바람직한 인지질 성분은 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜글리세롤, 포스파티드산, 스핑고미엘린 및 카르디올리핀이다. 미크론이하 방울 크기가 유리하다.
● 사포닌(예를 들어, QuilA 또는 QS21) 및 스테롤(예를 들어, 콜레스테롤)이 나선형 미셀로서 회합되는 에멀젼[64].
일부 구체예에서 에멀젼은 전달시 즉석에서 항원과 혼합될 수 있고, 따라서 보조제 및 항원은 포장되거나 또는 유통된 백신에서 개별적으로 유지되어, 사용시 최종 제형을 준비할 수 있다. 다른 구체예에서, 에멀젼은 제조 동안 항원과 혼합되고, 따라서 조성물은 액체 보조 형태로 포장된다.
치료 방법, 및 백신의 투여
본 발명은 본 방법에 따라서 제조되는 백신을 제공한다. 이들 백신 조성물은 사람 또는 돼지 같은 비-사람 동물 피험자에게 투여에 적당하며, 본 발명은 본 발명의 조성물을 피험자에게 투여하는 단계를 포함하는, 피험자에서 면역 반응을 상승시키는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 약제로서 사용을 위한 본 발명의 조성물을 제공하고, 피험자에서 면역 반응을 상승시키기 위한 약제의 제조를 위한 본 발명의 조성물의 사용을 제공한다.
이들 방법 및 사용에 의해 상승되는 면역 반응은 일반적으로 항체 반응, 바람직하게는 예방 항체 반응을 포함할 것이다.
본 발명의 조성물은 다양한 방법으로 투여될 수 있다. 가장 바람직한 면역화 경로는 근육내 주사에 의하지만(예를 들어, 팔 또는 다리로), 다른 이용가능한 경로는 피하 주사 또는 비강내[65-67]를 포함한다.
본 발명에 따라서 제조되는 백신은 어린이와 성인 둘다를 처치하는데 사용될 수 있다.
처치는 단일 용량 스케줄 또는 다수회 용량 스케줄에 의할 수 있다. 다수회 용량은 프라임 면역화 스케줄 및/또는 부스터 면역화 스케줄로 사용될 수 있다. 다수회 용량은 전형적으로 적어도 1주 간격(예를 들어, 약 2주, 약 3주, 약 4주, 약 6주, 약 8주, 약 10주, 약 12주, 약 16주 등)으로 투여될 것이다.
본 발명에 의해 제조되는 백신은 다른 백신과 실질적으로 동시에 (예를 들어, 동일한 의학적 상담 동안 또는 의료 전문가 또는 백신접종 센터를 방문) 환자에게 투여될 수 있다.
유사하게 본 발명의 백신은 항바이러스 화합물, 특히 인플루엔자 바이러스에 대해 활성인 항바이러스 화합물(예를 들어, 오셀타미비르 및/또는 자나미비르)과 실질적으로 동시에(예를 들어 동일한 의료 상담 동안 또는 의료 전문가 방문) 환자에게 투여될 수 있다.
일반
용어 "포함하는"은 "구성하는"뿐만 아니라 "포함하는"을 포함하며, 예를 들어, X를 "포함하는" 조성물은 오로지 X만으로 이루질 수도 있고, 추가적인 어떤 것 예를 들어 X + Y를 포함할 수도 있다.
단어 "실질적으로"는 "완전히"를 배제하지 않으며, 예를 들어, Y가 "실질적으로 없는" 조성물은 Y가 완전히 없을 수 있다. 필요하다면, 단어 "실질적으로"는 본 발명의 정의로부터 생략될 수 있다.
수치 x와 관련된 용어 "약"은 선택적이며, 예를 들어, x±10%를 의미한다.
구체적으로 언급되지 않는다면, 2이상의 성분들을 혼합하는 단계는 혼합의 어떤 특정 순서를 필요로 하지 않는다. 따라서 성분들은 임의의 순서로 혼합될 수 있다. 3가지 성분들이 있다면, 2성분들은 서로 혼합될 수 있고, 조합은 제3 성분 등과 혼합될 수 있다.
동물(및 특히 소) 물질이 세포의 배양물에서 사용된다면, 그것은 전염성 해면상뇌증(transmissible spongiform encephalopathies, TSEs), 및 특히 광우병(BSE)이 없는 공급원으로부터 얻어져야 한다. 전반적으로, 동물-유래 물질이 완전히 없는 세포를 배양하는 것이 바람직하다.
본 발명을 실시하기 위한 바람직한 양태
공급원 인플루엔자 바이러스는 HA 및 NA 세그먼트에 대해 S-OIV strain A/California/4/09 및 나머지 6개의 백본 세그먼트에 대해 PR/8/34이다. 이들 8개의 세그먼트를 암호화하는 DNA 서열을 제조하는데, 각 세그먼트는 측면에 한 단부에서 pol-I 프로모터 그리고 다른 단부에서 pol-I 터미네이터가 위치한다. 이들 pol-I 요소들은 CMV로부터의 pol-II 프로모터 및 pol-II 터미네이터 서열 및 polA 신호에 의해 둘러싸일 수도 있다. pol-I 프로모터는 신실한 야생형 vRNA 말단을 갖는 음성 센스 바이러스 RNA 세그먼트의 전사를 구동한다. pol-II 프로모터는 바이러스 단백질을 암호화하는 mRNA의 전사를 구동한다. 각 세그먼트에 대한 DNA 세그먼트들은 연결되어 단일의 선형 DNA 분자, ~24kbp를 제공하고, 전체 재편성 인플루엔자 바이러스 게놈을 암호화한다. 이 분자의 전체 합성은 참고문헌 8에서 Gibson et al.에 의해 개시된 일반적 방법을 따른다.
선형 DNA 구조물은 MDCK 33016 세포의 배양물로 트랜스펙션된다. 이 셀라인은 인플루엔자 바이러스 역 유전학 구급을 위한 사람 pol-I 프로모터를 인식하는 것으로 밝혀졌다. 트랜스펙션된 세포의 인큐베이션은 곧 배양 배지에서 재편성 인플루엔자 바이러스의 출현을 이끈다. 이 균주("RG-lin-CA-1")는 종래의 방법에 의해 정제될 수 있고 백신 제조를 위한 시드로서 사용될 수 있다.
본 발명은 단지 예로써만 기술되었으며 본 발명의 범위와 개념 내에 있으면서 수정들이 행해질 수도 있다는 것이 이해될 것이다.
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Claims (16)

  1. 세그먼트로 된 RNA 바이러스의 적어도 두개의 다른 게놈 세그먼트들을 발현하기 위한 암호화 서열을 포함하는 비세균성 발현 구조물.
  2. 제 1 항에 있어서, 구조물은 세균성 복제 기원 및 세균성 선택 마커를 둘다 결핍하는 것을 특징으로 하는 구조물.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 구조물은 선형인 것을 특징으로 하는 구조물.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 인플루엔자 A 또는 B 바이러스의 모든 8개의 게놈 세그먼트를 발현하기 위한 암호화 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 구조물.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 비세균성 발현 구조물을 포함하는 진핵성 숙주 세포.
  6. (i) 인플루엔자 바이러스 A 또는 B 게놈 세그먼트들 PB2, PB1, PA, NP 및 NS에 대한 암호화 서열을 포함하는 제 1 비세균성 발현 구조물 및 (ii) 인플루엔자 바이러스 A 또는 B 게놈 세그먼트 HA에 대한 암호화 서열을 포함하는 제 2 비세균성 발현 구조물을 포함하는, 발현 구조물의 세트.
  7. 제 6 항에 있어서, 제 1 또는 제 2 비세균성 발현 구조물은 NA 및 M 게놈 세그먼트들을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 세트.
  8. (i) 세그먼트로 된 RNA 바이러스의 하나 이상의 게놈 세그먼트들에 대한 암호화 서열(들)을 포함하는 적어도 하나의 플라스미드 및 (ii) RNA 바이러스의 하나 이상의 게놈 세그먼트들에 대한 암호화 서열을 포함하는 적어도 하나의 비세균성 발현 구조물을 포함하며, 여기서 세균성 및 비세균성 구조물의 조합이 RNA 바이러스의 적어도 두개의 다른 게놈 세그먼트들을 제공하는 발현 구조물의 세트.
  9. 제 8 항의 구조물의 세트를 포함하는 진핵성 숙주 세포.
  10. 세그먼트로 된 RNA 바이러스의 적어도 두개의 다른 게놈 세그먼트들에 대한 암호화 서열을 포함하는 선형 발현 구조물을 포함하는 숙주 세포.
  11. 인플루엔자 바이러스의 8개의 다른 게놈 세그먼트들에 대한 암호화 서열을 포함하며, 각 세그먼트의 발현이 포유동물 pol-I 프로모터에 의해 제어되는 세균성 플라스미드.
  12. 제 11 항의 플라스미드를 포함하는 진핵성 숙주 세포.
  13. 제 1 항 내지 제 4 항, 제 6 항 또는 제 9 항 중 어느 한 항의 구조물, 세트 또는 플라스미드를 세포에 삽입하는 단계를 포함하는 제 5 항, 제 7 항 또는 제 10 항의 숙주 세포의 제조 방법.
  14. RNA 바이러스 세그먼트들의 발현이 일어나 바이러스를 생산하도록 제 5 항, 제 8 항, 제 10 항 또는 제 12 항의 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 세그먼트로 된 RNA 바이러스의 제조 방법.
  15. (i)　DNA 분자의 복수의 중첩 단편들을 합성하는 단계, 여기서 중첩 단편들은 전체 DNA 분자에 이르며; 그리고 (ii) 단편들을 연결하여 DNA 분자를 제공하는 단계를 포함하는, 세그먼트로 된 RNA 바이러스 게놈의 적어도 두개의 다른 세그먼트들을 발현하는 암호화 서열을 포함하는 DNA 분자의 제조방법.
  16. 제 5 항, 제 8 항, 제 10 항 또는 제 12 항에 있어서, 세포는 MDCK 세포인 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
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