KR101151202B1

KR101151202B1 - 수중유 에멀젼 애주번트를 포함하는 백신

Info

Publication number: KR101151202B1
Application number: KR1020097009716A
Authority: KR
Inventors: 윌리엄 리플리 주니어 발로우; 엠마뉴엘 쥴스 하논
Original assignee: 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이.
Priority date: 2006-10-12
Filing date: 2007-10-10
Publication date: 2012-06-11
Also published as: EA015817B1; IL197512A; NO20091022L; DK2086582T3; ES2397714T3; JP5230632B2; CN101522218B; MX2009003325A; JP2010505907A; US9700605B2; BRPI0717219B1; US20100183667A1; CR10726A; PT2086582E; JP2013067646A; CA2664619A1; HRP20130023T1; KR20090066323A; WO2008043774A1; BRPI0717219B8

Abstract

본 발명은 항원 또는 항원 조성물 및 수중유 에멀젼을 포함하는 애주번트 조성물을 포함하는 면역원성 조성물로서, 여기서 상기 수중유 에멀젼은 인간 용량 당 0.5-10 mg의 대사가능한 오일, 0.5-11 mg의 토콜 및 0.1-4 mg의 에멀젼화제를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다.

Description

수중유 에멀젼 애주번트를 포함하는 백신{VACCINE COMPRISING AN OIL IN WATER EMULSION ADJUVANT}

본 발명은 개선된 백신 및 면역원성 조성물 및 약제에서의 이들의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 수중유 에멀젼 애주번트를 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물 및 약제에서의 이들의 용도, 특히 다양한 항원에 대한 면역 반응을 증대시키는데 있어서 이들의 용도, 및 제조 방법에 관한 것이고, 여기서 수중유 에멀젼은 토콜(tocol), 대사가능한 오일 및 에멀젼화제를 포함한다.

개선된 면역원성을 지니는 신규한 조성물 또는 백신은 항상 요구된다. 한 가지 전략으로서, 임의의 주어진 항원에 대해 상승된 면역 반응을 시험하고 개선시키고/거나 숙주에서 반응원성/독성을 감소시키기 위해 애주번트를 이용해 왔다.

수중유 에멀젼은 그 자체로 당 분야에 널리 공지되어 있고, 애주번트 조성물로서 유용한 것으로 제안되었다 (EP 399843; WO 95/17210).

WO 95/17210은 2 내지 10%의 스쿠알렌, 2 내지 10%의 알파 토코페롤 및 0.3 내지 3%의 트윈 80을 포함하는 수중유 에멀젼 및 QS21 및/또는 3D-MPL과 조합하거나 단독으로서 이들의 용도를 기술한다.

WO99/12565는 대사가능한 오일, 사포닌 및 스테롤을 포함하는 수중유 에멀젼 조성물을 기술한다. 수중유 에멀젼은 3D-MPL를 추가로 포함한다.

WO99/11241은 대사가능한 오일 및 사포닌을 포함하는 수중유 에멀젼을 기술하고, 여기서 오일 및 사포닌은 1:1 내지 200:1의 비로 존재한다.

적합한 면역 반응을 제공하며 숙주에서 덜 반응원성인 개선된 백신 및 면역원성 조성물에 대한 요구가 여전히 남아 있다.

본 발명자들은, 보다 낮은 양의 각 성분의 수중유 에멀젼을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물 내에서 항원 또는 항원성 조성물에 대해 필적하는 면역 반응을 유지하면서 상기 조성물을 이용할 수 있다는 것을 발견하였다. 이는 숙주 수용체 내의 반응원성이 감소되는 한편 항원에 대한 면역원성의 수준이 유지되는 이점을 지닌다.

따라서, 본 발명의 첫 번째 측면에서, 항원 또는 항원성 조성물, 및 수중유 에멀젼을 포함하는 애주번트 조성물을 포함하는 면역원성 조성물이 제공되며, 여기서 상기 수중유 에멀젼은 인간 용량 당 0.5 내지 10 mg의 대사가능한 오일, 0.5 내지 11 mg의 토콜 및 0.4 내지 4 mg의 에멀젼화제를 포함한다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 항원 또는 항원성 조성물, 및 수중유 에멀젼을 포함하는 애주번트 조성물을 포함하는 백신 조성물이 제공되며, 여기서 상기 수중유 에멀젼은 인간 용량 당 0.5 내지 10 mg의 대사가능한 오일, 0.5 내지 11 mg의 토콜 및 0.4 내지 4 mg의 에멀젼화제를 포함한다.

본 발명의 추가의 측면에서, 감염 및/또는 질병을 예방하기 위한 면역원성 조성물의 제조에 있어서 항원 또는 항원성 조성물, 및 수중유 에멀젼을 포함하는 애주번트 조성물을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물의 용도가 제공되며, 여기서 상기 수중유 에멀젼은 0.5 내지 10 mg의 대사가능한 오일, 0.5 내지 11 mg의 토콜 및 0.4 내지 4 mg의 에멀젼화제를 포함한다.

추가의 측면에서, 면역원성 조성물의 항원이 유래된 병원체의 변이체로서의 병원체에 의해 야기된 감염 또는 질병에 대한 보호를 위한 상기 정의된 방법 또는 용도가 제공된다. 또 다른 구체예에서, 면역원성 조성물의 항원의 변이체로서의 항원을 포함하는 병원체에 의해 야기된 감염 또는 질병에 대한 보호를 위한 상기 정의된 방법 또는 용도가 제공된다.

도면의 간단한 설명

도 1: 임상 시험: 상이한 시점에서 항-HA 항체에 대한 기하 평균 역가(GMT)(면역원성에 대한 ATP 코호트(cohort)).

도 2: 임상 시험: 0일 및 21일째에 95% 신뢰 구간으로 HI 항체 역가에 대한 혈청보호율(SPR)(면역원성에 대한 ATP 코호트).

도 3: 임상 시험: 21일째에 95% 신뢰 구간으로 HI 항체 역가에 대한 혈청전환율(SCR)(면역원성에 대한 ATP 코호트).

도 4: 임상 시험: 21일째에 95% 신뢰 구간으로 HI 항체 역가에 대한 혈청전환 인자(SCF)(면역원성에 대한 ATP 코호트).

도 5: 마우스 연구: 이종아형 균주(용량 범위 AS03)로 프라이밍된 BALB/c 마우스에서 헤마글루티닌 억제 시험(GMT +/- IC95). 도 5A: 항-A/뉴 칼레도니아/20/99 HI 역가; 도 5B: 항-A/파나마/2007/99 HI 역가. 도 5C: 항-B/산동/7/97 HI 역가.

도 6: 마우스 연구: 이종아형 균주(용량 범위 AS03)로 프라이밍된 C57BI/6 마우스에서 헤마글루티닌 억제 시험(GMT +/- IC95).

도 7: 마우스 연구: 이종아형 균주(용량 범위 AS03)로 프라이밍된 C57BI/6 마우스로부터 PBMC에서의 세포 면역 반응(CD4+ T 세포).

도 8: 마우스 연구: 이종아형 균주로 프라이밍되고 용량 범위 AS03으로 애주번트 첨가된 저 용량 항원 (0.5 ㎍)으로 면역화된 C57BI/6 마우스로부터 PBMC에서의 세포 면역 반응(CD4+ T 세포).

도 9: 마우스 연구: 두 상이한 항원 용량: 1.5 ㎍ (A, C 및 E) 또는 0.38 ㎍ (B, D 및 F)에 대하여 면역화 14일 후 H5N1-특이적인 혈청 Ig ELISA 역가 (A 및 B) 및 항-H5N1 IgG1 (C 및 D) 및 IgG2b (E 및 F) 이소형 반응(GMT +/- IC95).

도 10: 마우스 연구: 두 상이한 항원 용량: 1.5 ㎍ (A) 또는 0.38 ㎍ (B)에 대하여 면역화(GMT +/- IC95) 21일 후 헤마글루틴화 억제 시험(GMT +/- IC95).

도 11: 마우스 연구: 용량 범위 AS03으로 애주번트 첨가된 상이한 용량의 H5N1 백신 (1.5 ㎍ 또는 0.38 ㎍): (A) 1.5 ㎍ HA Ag (항원) 또는 (B) 0.38 ㎍ HA Ag (항원)으로 면역화된 나이브 C57BI/6 마우스에서 세포 면역 반응(CD4+ T 세포).

도 12: 돼지 연구: 이종성 균주(용량 범위 AS03)로 프라이밍된 돼지에서 헤마글루티닌 억제 시험(GMT +/- IC95).

발명의 상세한 설명

본원에서 "포함하는" 및 "포함한다"라는 용어는 모든 경우에 있어서 본 발명자들에 의해 각각 "구성되는" 및 "구성된다"라는 용어와 임의로 치환가능한 것으로 의도된다.

본 발명의 "백신 조성물"에 관한 구체예는 본 발명의 "면역원성 조성물"에 관한 구체예에도 적용될 수 있고, 역으로도 가능하다.

본 발명의 일 구체예에서, 항원 또는 항원 조성물 및 수중유 에멀젼으로 구성된 애주번트 조성물을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물이 제공되며, 여기서 상기 수중유 에멀젼은 인간 용량 당 0.5 내지 10 mg의 대사가능한 오일, 0.5 내지 11 mg의 토콜 및 0.4 내지 4 mg의 에멀젼화제를 포함한다.

본 발명의 추가의 구체예에서, 항원 또는 항원 조성물 및 수중유 에멀젼을 포함하는 애주번트 조성물을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물이 제공되며, 여기서 수중유 에멀젼은 인간 용량 당 0.5 내지 10 mg의 대사가능한 오일 (예컨대 스쿠알렌), 0.5 내지 11 mg의 토콜 (예컨대 알파-토코페롤) 및 0.4 내지 4 mg의 에멀젼화제 (예컨대 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트)를 포함한다.

수중유 에멀젼 성분

본 발명의 애주번트 조성물은 수중유 에멀젼 애주번트를 포함하고, 바람직하게는 상기 에멀젼이 0.5 내지 10 mg의 대사가능한 오일, 0.5 내지 11 mg의 토콜 및 0.4 내지 4 mg의 에멀젼화제를 포함하고 적어도 70 세기%가 1 ㎛ 미만의 직경을 갖는 오일 소적을 지닌다.

수중유 조성물이 인간 투여에 적합해지기 위해서, 에멀젼 시스템의 오일상은 대사가능한 오일을 포함해야 한다. 대사가능한 오일이라는 용어의 의미는 당 분야에 널리 공지되어 있다. 대사가능한 오일은 "대사에 의해 변형될 수 있는 것"으로서 정의될 수 있다 (Dorland's Illustrated Medical Dictionay, W.B. Sanders Company, 25th edition (1974)). 오일은 수용체에게 비독성이고, 대사에 의해 변형될 수 있는, 임의의 식물성유, 어유, 동물성유 또는 합성유일 수 있다. 견과, 종자 및 곡물은 식물성유의 통상적인 공급원이다. 합성유 또한 본 발명의 일부이며, 시판되는 오일, 예컨대 NEOBEE? 등을 포함할 수 있다. 특히 적합한 대사가능한 오일은 스쿠알렌이다. 스쿠알렌(2,6,10,15,19,23-헥사메틸-2,6,10,14,18,22-테트라코사헥사엔)은 상어간유에서 대량으로, 그리고 올리브유, 밀배아유, 쌀겨오일, 및 효모에서 소량으로 발견되는 불포화 오일이며, 본 발명에 사용하기에 특히 바람직한 오일이다. 스쿠알렌은 콜레스테롤 생합성에서 중간체라는 사실에 비추어 대사가능한 오일이다[참조: Merck index, 10th Edition, entry no.8619].

적합하게는 대사가능한 오일이 0.5 내지 10 mg, 바람직하게는 1-10, 2-10, 3-9, 4-8, 5-7 또는 5-6 mg (예컨대, 2-3, 5-6 또는 9-10 mg), 구체적으로 5.35 mg 또는 2.14 mg의 양으로 애주번트 조성물에 존재한다. 본 발명의 추가의 구체예에서, 대사가능한 오일은 0.5 내지 10 mg, 바람직하게는 1-10, 2-10, 3-9, 4-8, 5-7 또는 5-6 mg (예컨대, 2-3, 5-6 또는 9-10 mg), 구체적으로 5.35 mg 또는 2.14 mg의 양으로 백신 (또는 면역원성) 조성물에 존재한다.

백신 또는 면역원성 조성물 중 대사가능한 오일의 양은 총 조성물의 비율로서 표시될 수 있다. 적합하게는, 대사가능한 오일이 총 조성물 부피의 0.5% 내지 2%, 바람직하게는 0.25 내지 2, 또는 0.25-1.75, 또는 0.5-1.65 또는 0.6-1.5 또는 0.8-1.4 또는 1-1.25% (v/v) 오일의 양으로 백신 조성물에 존재한다.

또 다른 특정 구체예에서, 대사가능한 오일이 백신 (또는 면역원성) 조성물의 총 부피의 약 1.25%의 최종 양으로 존재한다. 또 다른 특정 구체예에서, 대사가능한 오일이 총 조성물 부피의 0.25% (v/v)의 최종 양으로 존재한다.

명확히 하기 위해, v/v로 주어진 농도는 하기 전환 인자를 적용시켜 w/v의 농도로 전환될 수 있다: 5% (v/v) 스쿠알렌 농도가 4.28% (w/v) 스쿠알렌 농도와 같다.

수중유 에멀젼은 토콜을 포함한다. 토콜은 당 분야에 널리 공지되어 있고 EP0382271에 개시되어 있다. 적합하게는 토콜이 알파-토코페롤 또는 이의 유도체, 예컨대 알파-토코페롤 숙시네이트 (비타민 E 숙시네이트로서도 공지됨)이다. 상기 토콜은 애주번트 조성물에 0.5-11 mg, 바람직하게는 1-11, 2-10, 3-9, 4-8, 5-7, 5-6 (예컨대, 10-11, 5-6, 2.5-3.5 또는 1-3 mg)의 양으로 존재하는 것이 적합하다. 특정 구체예에서, 토콜은 5.94 mg 또는 2.38 mg의 양으로 존재한다. 추가의 구체예에서, 상기 토콜은 백신 (또는 면역원성) 조성물에 0.5-11 mg, 바람직하게는 1-11, 2-10, 3-9, 4-8, 5-7, 5-6 (예컨대, 10-11, 5-6, 2.5-3.5 또는 1-3 mg)의 양으로 존재하는 것이 적합하다. 특정 구체예에서, 토콜은 5.94 mg 또는 2.38 mg의 양으로 존재한다.

토콜의 양은 총 백신 또는 면역원성 조성물 부피의 비율로서 표시될 수 있다. 적합하게는 토콜이 면역원성 조성물의 총 부피의 0.25% 내지 2% (v/v)의 양으로 백신 조성물에 존재하며, 바람직하게는 0.25-2는 전체 부피의 0.25-2, 또는 0.25-1.75, 또는 0.5-1.65, 또는 0.6-1.5, 또는 0.8-1.4 또는 1-1.25 % (v/v)의 토콜을 포함한다.

바람직하게는 토콜은 백신 (또는 면역원성) 조성물의 총 부피의 0.2% 내지 2% (v/v), 보다 바람직하게는 0.5 ml의 용량 부피 중 1.25% (v/v)의 양으로 존재한다.

특정 구체예에서, 토콜은 백신 또는 면역원성 조성물의 총 부피의 약 1.25%의 최종 양으로 존재한다. 또 다른 특정 구체예에서, 토콜은 총 부피의 0.25% (v/v) 또는 0.5 ml의 용량 부피 중 1.25% (v/v) 또는 0.7 ml의 용량 부피 중 0.9% (v/v), 또는 0.5 ml의 용량 중 0.5% (v/v) 또는 0.35-0.37%, 바람직하게는 0.7 ml의 백신 또는 면역원성 용량 중 0.36%의 최종 양으로 존재한다.

명확히 하기 위해, v/v로 주어진 농도는 하기 전환 인자를 적용시켜 w/v 농도로 전환될 수 있다: 5% (v/v) 알파-토코페롤 농도는 4.8% (w/v)의 알파-토코페롤 농도와 같다.

수중유 에멀젼은 에멀져화제를 추가로 포함한다. 에멀젼화제는 적합하게는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트일 수 있다. 특정 구체예에서, 에멀젼화제는 폴리소르베이트? 80 또는 트윈? 80을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.

상기 에멀젼화제는 적합하게는 애주번트 조성물에 0.1-5, 0.2-5, 0.3-4, 0.4-3 또는 2-3 mg (예컨대, 0.4-1.2, 2-3 또는 4-5 mg)의 에멀젼화제의 양으로 존재한다. 특정 구체예에서, 에멀젼화제는 0.97 mg 또는 2.425 mg의 양으로 존재한다.

추가로, 상기 에멀젼화제는 적합하게는 백신 또는 면역원성 조성물에 0.1-5, 0.2-5, 0.3-4, 0.4-3 또는 2-3 mg (예컨대, 0.4-1.2, 2-3 or 4-5 mg)의 에멀젼화제의 양으로 존재한다. 특정 구체예에서, 에멀젼화제는 0.97 mg 또는 2.425 mg의 양으로 존재한다.

에멀젼화제의 양은 총 백신 또는 면역원성 조성물 부피의 비율로서 표시될 수 있다. 적합하게는, 에멀젼화제는 백신 (또는 면역원성) 조성물에 조성물의 총 부피의 0.125-0.8% (v/v), 바람직하게는 총 부피의 0.08-.05 또는 0.1-0.7 또는 0.2-0.6 또는 0.25-0.55 또는 0.3-0.52 또는 0.4-0.5% (v/v)의 양으로 존재한다. 특정 구체예에서, 에멀젼화제는 총 백신 또는 면역원성 조성물 부피의 1%, 0.5% 또는 0.2% (v/v)의 양으로 존재한다.

명확히 하기 위해, v/v로 주어진 농도는 하기 전환 인자를 적용시켜 w/v의 농도로 전환될 수 있다: 1.8% (v/v) 폴리소르베이트 80 농도가 1.91% (w/v) 폴리소르베이트 80 농도와 같다.

특정 구체예에서, 0.5 ml의 백신 또는 면역원성 용량 부피는 0.45% (v/v) 트윈 80을 함유하고, 0.7 ml의 용량 부피는 0.315% (v/v)의 트윈 80을 함유한다. 또 다른 특정 구체예에서, 0.5 ml의 용량은 0.18% (v/v)의 에멀젼화제를 함유하고, 0.7 ml의 백신 또는 면역원성 조성물 용량은 0.126% (v/v)의 에멀젼화제를 함유한다.

"인간 용량"이라는 용어는 인간 용도에 적합한 부피의 용량을 의미한다. 일반적으로 이것은 0.25 내지 1.5 ml이다. 일 구체예에서, 인간 용량은 0.5 ml이다. 추가의 구체예에서, 인간 용량은 0.5 ml를 초과하며, 예를 들어, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 또는 1 ml이다. 추가의 구체예에서, 인간 용량은 1 ml 내지 1.5 ml이다. 또 다른 구체예에서, 특히 면역원성 조성물이 소아 군집용일 경우, 인간 용량은 0.5 ml 미만일 수 있고, 예컨대 0.25 내지 0.5 ml이다. 본 발명은 면역원성 조성물내 애주번트의 개개 성분들 각각 또는 전부가 이전에 유용하게 고려되었던 것 보다 낮은 수준이고 통상적으로 상기 열거된 수준인 것을 특징으로 한다. 특히 적합한 조성물은 하기 애주번트 성분들을 다음과 같은 양으로 포함하며, 이는 0.5 ml의 인간 용량에서의 최종 부피이다.

표 1

본 발명은 상기 본원에 정의된 개개 성분들을 상기 정의된 양으로 포함하는 애주번트 조성물을 추가로 제공하나, 예를 들어 표 1에 예시된 대로 한정되는 것은 아니다. 통상적으로, 상기 애주번트 조성물은 인간 용량에 적합한 부피일 것이다. 애주번트가 항원성 조성물의 액체 형태와 조합된 액체 형태일 경우, 애주번트 조성물은 인간 용량의 의도된 최종 부피의 일부인 인간 용량에 적합한 부피일 것이고, 예컨대 인간 용량의 의도된 최종 부피의 대략 절반, 예를 들어 0.7 ml의 의도된 인간 용량의 경우 350 ㎕의 부피 또는 0.5 ml의 의도된 인간 용량의 경우 250 ㎕의 부피이다. 애주번트 조성물은 최종 인간 용량의 백신을 제공하기 위해 항원 조성물과 조합될 때 희석된다. 이러한 용량의 최종 부피는 물론 애주번트 조성물의 초기 부피 및 애주번트 조성물에 첨가된 항원 조성물의 부피에 의존하여 달라질 것이다. 대안적인 구체예에서, 액체 애주번트를 이용하여 냉동건조된 항원 조성물을 재구성한다. 이 구체예에서, 애주번트 조성물의 인간 용량에 적합한 부피는 인간 용량의 최종 부피와 거의 동일하다. 액체 애주번트 조성물은 냉동건조된 항원 조성물을 함유하는 바이알에 첨가한다. 최종 인간 용량은 0.5 내지 1.5 ml로 다양할 수 있다.

수중유 에멀젼을 제조하는 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 일반적으로, 이 방법은 토콜-함유 오일상을 PBS/트윈80™ 용액과 같은 계면활성제와 혼합시키고, 균질화기를 이용하여 균질화시키는 것을 포함하며, 혼합물을 주사기 바늘을 통해 2회 통과시키는 것을 포함하는 방법이 적은 부피의 액체를 균질화시키는데 적합할 것임이 당업자에게 명백할 것이다. 동등하게, 더 적거나 더 많은 부피의 에멀젼을 제공하기 위해 미세유동화기(M110S 미세유동 기계, 최대 50회 통과, 6 바아의 최대 압력 투입으로 2분간 (약 850 바아의 출력 압력))에서의 에멀젼화 공정이 당업자에 의해 적용될 수 있었다. 적용은, 요구되는 직경을 지니는 오일 소적을 갖는 제조물이 달성될 때까지 생성된 에멀젼의 측정을 포함하는 통상적인 실험에 의해 달성될 수 있었다.

수중유 에멀젼에서, 오일 및 에멀젼화제는 수성 담체 중에 존재하여야 한다. 수성 담체는, 예를 들어 포스페이트 완충된 염수일 수 있다.

바람직하게는 본 발명의 수중유 에멀젼 시스템은 서브-미크론 범위의 작은 오일 소적 크기를 지닌다. 적합하게는, 소적 크기는 직경이 120 내지 750 nm, 보다 바람직하게는 120 내지 600 nm일 것이다. 가장 바람직하게는, 수중유 에멀젼은 오일 소적의 70 세기% 이상이 500 nm 미만의 직경인 오일 소적을 함유하고, 보다 바람직하게는 80 세기% 이상이 300 nm 미만의 직경이며, 보다 바람직하게는 90 세기% 이상이 120 내지 200 nm의 직경 범위이다.

본 발명에 따른 오일 소적 크기, 즉 직경은 세기에 의해 제공된다. 오일 소적의 직경 크기를 세기에 의해 측정하는 여러 방법이 존재한다. 세기는 사이징 기계를 사용하여, 적합하게는 맬버른 제타사이저 4000 또는 바람직하게는 맬버른 제타사이저 3000HS와 같은 동적 광 산란에 의해 측정된다. 상세한 절차는 실시예 II.2에서 제공된다. 첫 번째 가능한 방법은 동적 광 산란법에 의해 z 평균 직경 ZAD를 측정하는 것이다 (PCS-광양자 상관 분광학); 이 방법은 추가로 다분산성 지수(PDI)를 제공하며, ZAD 및 PDI 둘 모두는 누적평가 알고리즘(cumulants algorithm)으로 계산된다. 이들 값은 입자 굴절 지수를 알 필요가 없다. 두 번째 수단은 또 다른 알고리즘인 콘틴(Contin) 또는 NNLS, 또는 자동 "맬버른" 알고리즘(사이징 기계에 의해 제공된 디폴트(default) 알고리즘)에 의해 전(whole)입자 크기 분포를 측정함으로써 오일 소적의 직경을 계산하는 것이다. 대개의 경우, 복합 조성물의 입자 굴절 지수는 알려져 있기 않기 때문에, 세기 분포만이 고려되며, 필요에 따라 이러한 분포로부터 비롯된 세기 평균이 고려된다.

임의의 면역자극제

본 발명의 추가의 구체예에서 항원 또는 항원 조성물 및 수중유 에멀젼 및 임의로 하나 이상의 추가의 면역자극제를 포함하는 애주번트 조성물을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물이 제공되며, 여기서 상기 수중유 에멀젼은 0.5-10 mg의 대사가능한 오일, 0.5-11 mg의 토콜 및 0.4-4 mg의 에멀젼화제를 포함한다.

일 구체예에서, 애주번트 조성물은 본원에 정의된 수중유 에멀젼을 포함한다. 추가의 구체예에서, 애주번트 조성물은 하나 이상의 추가의 애주번트 또는 면역자극제를 또한 포함할 수 있다. 추가의 구체예에서, 애주번트 조성물은 QS21 및/또는 MPL이 아닌 하나 이상의 추가의 애주번트 또는 면역자극제를 임의로 포함한다.

임의의 추가의 애주번트는 사포닌, 지질 A 또는 이의 유도체, 면역자극성 올리고누클레오티드, 알킬 글루코사미니드 포스페이트, 금속염, 톨형(toll-like) 수용체 효능제 또는 이들의 조합물의 군으로부터 선택된다. 애주번트가 톨형 수용체 효능제, 특히 톨형 수용체 2, 3, 4, 7, 8 또는 9의 효능제 또는 사포닌인 것이 바람직하다. 애주번트 시스템이 상기 목록으로부터의 둘 이상의 애주번트를 포함하는 것이 또한 바람직하다. 조합물은 바람직하게는 사포닌 (특히 QS21) 애주번트 및/또는 톨형 수용체 4 효능제, 예컨대 3D-MPL 또는 톨형 수용체 9 효능제, 예컨대 CpG 함유 면역자극성 올리고누클레오티드를 함유한다. 다른 바람직한 조합물은 사포닌 (특히 QS21) 및 사포닌 (특히 QS21)과 같은 톨형 수용체 4 효능제 및 톨형 수용체 4 리간드, 예컨대 3D-MPL 또는 알킬 글루코사미니드 포스페이트를 포함한다.

일 구체예에서, 추가의 애주번트는 톨형 수용체(TLR) 4 리간드, 바람직하게는 효능제, 예컨대 지질 A의 유도체, 특히 모노포스포릴 지질 A, 또는 보다 특히 3-데아실화 모노포스포릴 지질 A(3D-MPL)이다.

3D-MPL은 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 노스 어메리카에 의해 상표 MPL?로 시판되며, 주로 IFN-g(Th1) 표현형과의 CD4+ T 세포 반응을 촉진한다. 3D-MPL은 GB 2 220 211 A에 기술된 방법에 따라 제조될 수 있다. 화학적으로는, 3D-MPL은 3-데아실화 모노포스포릴 지질 A와 3, 4, 5 또는 6 아실화 사슬의 혼합물이다. 바람직하게는, 본 발명의 조성물에서는 소입자 3D-MPL이 사용된다. 소입자 3D-MPL은 0.22㎛ 필터를 통해 살균 여과될 수 있도록 하는 입자 크기를 갖는다. 이러한 제제는 국제 특허 출원 WO 94/21292에 개시되어 있다. 지질 A의 합성 유도체가 공지되어 있고, 이는 하기를 포함하나 이로 제한되지 않는 TLR 4 효능제로 고려된다:

OM174 (2-데옥시-6-o-[2-데옥시-2-[(R)-3-도데카노일옥시테트라-데카노일아미노]-4-o-포스포노-β-D-글루코피라노실]-2-[(R)-3-히드록시테트라데카노일아미노]-α-D-글루코피라노실디히드로겐포스페이트), (WO 95/14026)

OM 294 DP (3S, 9R)-3-[(R)-도데카노일옥시테트라데카노일아미노]-4-옥소-5-아자-9(R)-[(R)-3-히드록시테트라데카노일아미노]데칸-1,10-디올,1,10-비스(디히드로게노포스페이트)(WO 99/64301 및 WO 00/0462)

OM 197 MP-Ac DP (3S-, 9R)-3-[(R)-도데카노일옥시테트라데카노일아미노]-4-옥소-5-아자-9-[(R)-3-히드록시테트라데카노일아미노]데칸-1,10-디올,1-디히드로게노포스페이트 10-(6-아미노헥사노에이트)(WO 01/46127)

이용될 수 있는 다른 TLR4 리간드는 WO9850399 또는 US6303347 (AGP를 제조하는 방법도 기술되어 있다)에 개시된 것들과 같은 알킬 글루코사미니드 포스페이트(AGP), 또는 US6764840에 개시된 AGP의 약제학적으로 허용되는 염이다. 일부 AGP는 TLR4 효능제이고, 일부는 TLR4 길항제이다. 둘 모두는 애주번트로서 유용한 것으로 고려된다.

TLR-4를 통해 시그널링 반응을 야기할 수 있는 다른 적합한 TLR-4 리간드 (Sabroe et al, Jl 2003 p1630-5)는 예를 들어 그램-음성 세균의 리포폴리사카라이드 및 이의 유도체, 또는 이의 단편, 특히 LPS의 무독성 유도체이다 (예컨대, 3D-MPL). 다른 적합한 TLR 효능제로는 열 쇼크 단백질 (HSP) 10, 60, 65, 70, 75 또는 90; 계면활성제 단백질 A, 히알루로난 올리고사카라이드, 헤파란 설페이트 단편, 피브로넥틴 단편, 피브리노겐 펩티드 및 b-데펜신-2, 무라밀 디펩티드 (MDP) 또는 호흡기세포 융합 바이러스의 F 단백질이 있다. 일 구체예에서, TLR 효능제는 HSP 60, 70 또는 90이다.

톨형 수용체 (TLR)는 곤충과 인간 사이에 진화적으로 보존된 타입 I 트랜스막 수용체이다. 지금까지 10개의 TLR이 확립되었다 (TLR 1-10) (Sabroe et al, Jl 2003 p1630-5). TLR 과의 멤버는 유사한 세포외 및 세포내 도메인을 지닌다; 이들의 세포외 도메인은 류신-부화 반복 서열을 지니고, 이들의 세포내 도메인은 인터루킨-1 수용체 (IL-1R)의 세포내 영역과 유사한 것으로 나타났다. TLR 세포는 면역 세포 및 다른 세포 (혈관 상피 세포, 지방세포, 심장 근육세포 및 창자 상피세포 포함) 간에 다르게 발현된다. TLR의 세포내 도메인은 세포질 영역에 IL-1R 도메인을 소유하는 어댑터(adaptor) 단백질 Myd88과 상호작용할 수 있어서 시토킨의 NF-KB 활성화를 초래한다; 이러한 Myd88 경로는 시토킨 방출이 TLR 활성화에 의한 영향을 받는 한 방법이다. TLR의 주요 발현은 항원 제시 세포(예컨대, 가지 세포, 매크로파지 등)와 같은 세포 유형에 있다.

TLR을 통한 자극에 의한 가지 세포의 활성화는 가지 세포를 성숙시키고, IL-12와 같은 염증 시토킨을 생성한다. 지금까지 수행된 연구로부터, 일부 효능제가 여러 TLR에 공통이긴 하나 TLR이 상이한 유형의 효능제를 인식함이 밝혀졌다. TLR 효능제는 주로 세균 또는 바이러스로부터 유래되고, 플라겔린(flagellin) 또는 세균 리포폴리사카라이드 (LPS)와 같은 분자를 포함한다.

"TLR 효능제"는 직접 리간드 또는 내인성 또는 외인성 리간드의 생성을 통해 간접적으로, TLR 시그널링 경로를 통해 시그널링 반응을 야기할 수 있는 성분을 의미한다 (Sabroe et al, Jl 2003 p1630-5).

또 다른 구체예에서, TLR 분자의 다른 천연 또는 합성 효능제를 임의의 추가의 면역자극제로서 이용한다. 이들은 TLR2, TLR3, TLR7, TLR8 및 TLR9에 대한 효능제를 포함할 수 있으나, 이로 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구체예에서, TLR-1을 통해 시그널링 반응을 야기할 수 있는 TLR 효능제를 이용한다 (Sabroe et al, Jl 2003 p1630-5). 적합하게는, TLR-1을 통해 시그널링 반응을 야기할 수 있는 TLR 효능제가 하기로부터 선택된다: 트리-아실화 리포펩티드 (LP); 페놀-가용성 모둘린; 미코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) LP; S-(2,3-비스(팔미토일옥시)-(2-RS)-프로필)-N-팔미토일-(R)-Cys-(S)-Ser-(S)-Lys(4)-OH, 세균 지단백질의 아세틸화 아미노 말단을 모방하는 트리히드로클로라이드 (Pam₃Cys) LP 및 보렐리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi)로부터의 OspA LP.

대안적인 구체예에서, TLR-2를 통해 시그널링 반응을 야기할 수 있는 TLR 효능제를 이용한다 (Sabroe et al, Jl 2003 p1630-5). 적합하게는, TLR-2를 통해 시그널링 반응을 야기할 수 있는 TLR 효능제는 지단백질, 펩티도글리칸, M 투베르쿨로시스(M tuberculosis), B 부르그도르페리(B burgdorferi), T 팔리둠(T pallidum)으로부터의 세균 리포펩티드; 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)를 포함하는 종으로부터의 펩티도글리칸; 리포테이코산, 만누론산, 네이세리아 포린, 세균 핌브리애, 예르시나 독성 인자, CMV 비리온, 홍역 헤마글루티닌, 및 효모로부터의 지모산 중 하나 이상이다.

대안적인 구체예에서, TLR-3을 통해 시그널링 반응을 야기할 수 있는 TLR 효능제를 이용한다 (Sabroe et al, Jl 2003 p1630-5). 적합하게는, TLR-3을 통해 시그널링 반응을 야기할 수 있는 TLR 효능제는 이중 가닥 RNA (dsRNA), 또는 바이러스 감염과 관련된 분자 핵산 패턴인 폴리이노시닉-폴리시티딜릭산 (Poly IC)이다.

대안적인 구체예에서, TLR-5를 통해 시그널링 반응을 야기할 수 있는 TLR 효능제를 이용한다 (Sabroe et al, Jl 2003 p1630-5). 적합하게는, TLR-5를 통해 시그널링 반응을 야기할 수 있는 TLR 효능제는 세균 플라겔린이다.

대안적인 구체예에서, TLR-6을 통해 시그널링 반응을 야기할 수 있는 TLR 효능제를 이용한다 (Sabroe et al, Jl 2003 p1630-5). 적합하게는, TLR-6을 통해 시그널링 반응을 야기할 수 있는 TLR 효능제는 미코세균 지단백질, 디-아실화된 LP 및 페놀-가용성 모둘린이다. 추가로, TLR-6 효능제는 WO2003043572에 개시되어 있다.

대안적인 구체예에서, TLR-7을 통해 시그널링 반응을 야기할 수 있는 TLR 효능제를 이용한다 (Sabroe et al, Jl 2003 p1630-5). 적합하게는, TLR-7을 통해 시그널링 반응을 야기할 수 있는 TLR 효능제는 단일 가닥 RNA (ssRNA), 아이옥소리빈, 위치 N7 및 C8에서의 구아노신 동족체, 또는 이미다조퀴놀린 화합물 또는 이의 유도체이다. 일 구체예에서, TLR 효능제는 이미퀴모드이다. 추가로, TLR-7 효능제는 WO02085905에 개시되어 있다.

대안적인 구체예에서, TLR-8을 통해 시그널링 반응을 야기할 수 있는 TLR 효능제를 이용한다 (Sabroe et al, Jl 2003 p1630-5). 적합하게는, TLR-8을 통해 시그널링 반응을 야기할 수 있는 TLR 효능제는 단일 가닥 RNA (ssRNA), 항-바이러스 활성을 갖는 이미다조퀴놀린 분자, 예를 들어 레시퀴모드 (R848)이다; 레시퀴모드는 TLR-7에 의해서도 인식될 수 있다. 이용될 수 있는 다른 TLR-8 효능제는 WO2004071459에 개시되어 있다.

면역자극성 올리고누클레오티드 또는 임의의 다른 톨형 수용체(TLR) 9 효능제도 이용될 수 있다. 본 발명의 애주번트 또는 백신 또는 면역원성 조성물에 이용되는 바람직한 올리고누클레오티드는 CpG 함유 올리고누클레오티드, 바람직하게는 적어도 3개, 보다 바람직하게는 적어도 6개 이상의 누클레오티드에 의해 분리된 둘 이상의 디누클레오티드 CpG 모티프를 함유하는 올리고누클레오티드이다. CpG 모티프는 시토신 누클레오티드 다음에 구아닌 누클레오티드가 따라 오는 것이다. 본 발명의 CpG 올리고누클레오티드는 통상적으로 데옥시누클레오티드이다. 바람직한 구체예에서, 포스포다이에스테르 및 다른 인터누클레오티드 결합이 본 발명의 범위내에 있으나, 올리고누클레오티드의 인터누클레오티드는 포스포로디티오에이트이거나, 보다 바람직하게는 포스포로티오에이트 결합이다. 혼합된 인터누클레오티드 결합을 갖는 올리고누클레오티드도 본 발명의 범위내에 포함된다. 포스포로티오에이트 올리고누클레오티드 또는 포스포로디티오에이트를 생성하는 방법이 US 5,666,153, US 5,278,302 및 WO95/26204에 개시되어 있다.

바람직한 올리고누클레오티드의 예는 하기 서열을 지닌다. 서열은 포스포로티오에이트 개질된 인터누클레오티드 결합을 함유하는 것이 바람직하다.

올리고 1 (서열번호 1): TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT (CpG 1826)

올리고 2 (서열번호 2): TCT CCC AGC GTG CGC CAT (CpG 1758)

올리고 3 (서열번호 3): ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG

올리고 4 (서열번호 4): TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (CpG 2006)

올리고 5 (서열번호 5): TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (CpG 1668)

올리고 6 (서열번호 6): TCG ACG TTT TCG GCG CGC GCC G (CpG 5456)

대안적인 CpG 올리고누클레오티드는 상기 바람직한 서열을 포함할 수 있고, 여기에 대수롭지 않은 결실 또는 첨가를 갖는다. 본 발명에서 이용되는 CpG 올리고누클레오티드는 당 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 합성될 수 있다 (예를 들어, EP 468520 참조). 편리하게는, 이러한 올리고누클레오티드가 자동 합성기를 이용하여 합성될 수 있다.

따라서, 또 다른 구체예에서, 애주번트 조성물은 TLR-1 효능제, TLR-2 효능제, TLR-3 효능제, TLR-4 효능제, TLR-5 효능제, TLR-6 효능제, TLR-7 효능제, TLR-8 효능제, TLR-9 효능제 또는 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택된 추가의 면역자극제를 또한 포함한다.

본 발명에 사용하기 위한 또 다른 적합한 면역자극제는 쿠일(Quil) A 및 이의 유도체이다. 쿠일 A는 남아메리카에 자생하는 퀴라자 사포나리아 모리나(Quillaja saponaria Molina) 나무로부터 분리된 사포닌 제제이며, 애주번트 활성을 갖는 것으로 1974년 달스가드(Dalsgaard) 등("Saponin adjuvants", Archiv. fur die gesamte Virusforschung, Vol. 44, Springer Verlag, Berlin, p243-254)에 의해 처음으로 기술되었다. 쿠일 A와 관련된 독성 없이 애주번트 활성을 보유한 쿠일 A의 정제된 단편(EP 0 362 278), 예를 들어 QS7 및 QS21(또한 QA7 및 QA21로서 공지되어 있음)이 HPLC에 의해 단리되었다. QS-21은 퀴라자 사포나리아 모리나의 껍질로부터 유래된 천연 사포닌이며, 이는 CD8+ 세포독성 T 세포(CTL), Th1 세포 및 현저한 IgG2a 항체 반응을 유도하며, 본 발명의 내용상 바람직한 사포닌이다.

특히 바람직한 QS21의 특정 제형이 기술되었으며, 이러한 제형은 추가로 스테롤을 포함한다(WO 96/33739). 스쿠알렌 및 사포닌(임의로 QS21)이 포함되는 경우, 스테롤 (임의로 콜레스테롤)을 제형에 포함시켜 이것이 에멀젼 중 오일의 총 수준을 감소시키도록 하는 것이 유리하다. 이것은 제조 비용을 감소시키고, 백신접종의 전반적인 편의를 개선시키며, 개선된 IFN-γ 생성과 같은, 초래되는 면역 반응의 질적 및 양적 개선을 야기한다. 따라서, 본 발명의 애주번트 시스템은 통상적으로 대시가능한 오일:사포닌(w/w)을 200:1 내지 300:1의 비로 포함하며, 또한 본 발명은 1:1 내지 200:1, 임의로 20:1 내지 100:1, 또는 실질적으로 48:1의 임의의 범위의 "저(low) 오일" 형태로 이용될 수 있는데, 이러한 백신은 반응원성 프로필을 훨씬 감소시키면서, 모든 성분들의 유리한 애주번트 특성을 보유한다. 따라서, 일부 구체예에서 스쿠알렌:QS21 (w/w)의 비는 1:1 내지 250:1 또는 20:1 내지 200:1 또는 20:1 내지 100:1의 범위이거나, 실질적으로 48:1이다. 임의로, 스테롤(예컨대, 콜레스테롤)도 본원에 개시된 사포닌:스테롤의 비로 존재하도록 포함된다.

항원 및 항원 조성물

백신 또는 면역원성 제형은 인간 또는 동물 병원체에 대해 면역 반응을 일으킬 수 있는 항원 또는 항원성 조성물을 함유할 것이다.

적합하게는, 상기 항원 또는 항원성 조성물은 하기 중 하나 이상으로부터 유래된다: HIV-1 (예를들어, gag 또는 이의 단편, 예를들어 p24, tat, nef, gp120 또는 gp160, 또는 이들중 임의의 것의 단편), 인간 헤르페스 바이러스, 예를들어 gD 또는 이의 유도체 또는 최조기 (Immediate Early) 단백질, 예를들어 HSV1 또는 HSV2로부터의 ICP27, 시토메갈로바이러스 (특히, 인간) (예를들어, gB 또는 이의 유도체), 로타바이러스 (생-약독된 바이러스 포함), 엡스타인 바 바이러스 (예를들어, gp350 또는 이의 유도체), 수두대상포진 바이러스 (예를들어, gpⅠ, Ⅱ 및 IE63), 또는 간염 바이러스, 예를들어 B형 간염 바이러스 (예를들어, B형 간염 표면 항원 또는 이의 유도체), A형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스 및 E형 간염 바이러스, 또는 기타 바이러스 병원체, 예를들어 파라믹소바이러스: 호흡기세포 융합 바이러스 (예를들어, F, N, M 및 G 단백질 또는 이의 유도체), SARS 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 홍역 바이러스, 이하선염 바이러스, 인간 파필로마 바이러스 (예를들어, HPV6, 11, 16, 18), 플라비바이러스 (예를들어, 황열병 바이러스, 뎅기 바이러스, 참진드기매개뇌염 바이러스, 일본뇌염 바이러스) 또는 인플루엔자 바이러스 (전체 생 또는 불활성화 바이러스, 난(egg) 또는 MDCK 세포에서 성장한 스플리트 인플루엔자 바이러스, 또는 전체 인플루엔자 바이로솜 (문헌[R. Gluck, Vaccine, 1992, 10, 915-920]에 기술됨), 또는 이의 정제된 단백질 또는 재조합 단백질, 예를들어 HA, NP, NA 또는 M 단백질, 또는 이들의 조합물), 또는 세균 병원체, 예를들어 나이세리아종, 예를들어 N. 고노레아 (N. gonorrhea) 및 N. 메닌지티디스 (예를들어, 캡슐 당류 및 이의 컨주게이트, 트랜스페린-결합 단백질, 락토페린 결합 단백질, PiIC, 부착소); S. 피오게네스 (S. pyogenes) (예를들어, M 단백질 또는 이의 단편, C5A 프로테아제, 지질테이코산), S. 아갈락티애 (S. agalactiae), S. 뮤탄스 (S. mutans); H. 듀크레이 (H. ducreyi); 모락셀라종, 예를들어 브란하멜라 카타랄리스 (Branhamella catarrhalis)로도 공지된 M. 카타랄리스 (M. catarrhalis) (예를들어, 고분자량 및 저분자량 부착소 및 인베이신(invasin)); 보르데텔라종, 예를들어 B. 퍼투시스 (B. pertussis) (예를들어, 퍼탁틴 (pertactin), 퍼투시스 독소 또는 이의 유도체, 섬유상 헤마글루티닌, 아데닐레이트 시클라아제, 핌브리애(fimbriae)), B. 파라퍼투시스 (B. parapertussis) 및 B. 브론키셉티카 (B. bronchiseptica); 미코박테리움종, 예를들어 M. 투베르쿨로시스 (M. tuberculosis) (예를들어, ESAT6, 항원 85A, -B 또는 -C), M. 보비스 (M. bovis), M. 레프래 (M. leprae), M. 아비움 (M. avium), M. 파라투베르쿨로시스 (M. paratuberculosis), M. 스메그마티스 (M. smegmatis); 레지오넬라종, 예를들어 L. 뉴모필라 (L. pneumophila); 에스체리치아종, 예를들어 장독성 E. 콜라이 (E. coli) (예를들어, 집락화 인자, 열-민감 독소 또는 이의 유도체, 열-안정 독소 또는 이의 유도체), 장출혈성 E. 콜라이, 장병원성 E. 콜라이 (예를들어, 시가 독소-유사 독소 또는 이의 유도체); 비브리오종, 예를들어 V. 콜레라 (V. cholera) (예를들어, 콜레라 독소 또는 이의 유도체); 시겔라종, 예를들어 S. 손네이 (S. sonnei), S. 디센테리애 (S. dysenteriae), S. 플렉스네리이 (S. flexnerii); 예르시니아종, 예를들어 Y. 엔테로콜리티카 (Y. enterocolitica) (예를들어, Yop 단백질), Y. 페스티스 (Y. pestis), Y. 슈도튜베르쿨로시스 (Y. pseudotuberculosis); 캄필로박터종, 예를들어 C. 제주니 (C. jejuni) (예를들어, 독소, 부착소 및 인베이신) 및 C. 콜라이; 살모넬라종, 예를들어 S. 타이피 (S. typhi), S. 파라타이피 (S. paratyphi), S. 콜레라에수이스 (S. choleraesuis), S. 엔테리티디스 (S. enteritidis); 리스테리아종, 예를들어 L. 모노사이토게네스 (L. monocytogenes); 헬리코박터종, 예를들어 H. 파이로리 (H. pylori) (예를들어, 요소분해효소, 카탈라아제, 공포화 독소); 슈도모나스종, 예를들어 P. 에어루기노사 (P. aeruginosa); 스타필로코커스종, 예를들어 S. 아우레우스 (S. aureus), S. 에피더미디스 (S. epidermidis); 엔테로코커스종, 예를들어 E. 파에칼리스 (E. faecalis), E. 파에시움 (E. faecium); 클로스트리듐종, 예를들어 C. 테타니 (C. tetani) (예를들어, 테타누스 독소 및 이의 유도체), C. 보튤리늄 (C. botulinum) (예를들어, 보튤리늄 독소 및 이의 유도체), C. 디피실레 (C. difficile) (예를들어, 클로스트리듐 독소 A 또는 B 및 이의 유도체); 바실러스종, 예를들어 B. 안트라시스 (B. anthracis) (예를들어, 보툴리늄 독소 및 이의 유도체); 코리네박테리움종, 예를들어 C. 디프테리애 (C. diphtheriae) (예를들어, 디프테리아 독소 및 이의 유도체); 보렐리아종, 예를들어 B. 부르그도르페리 (B. burgdorferi) (예를들어, OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. 가리니이 (B. garinii) (예를들어, OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. 아프젤리이 (B. afzelii) (예를들어, OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. 안데르소니이 (B. andersonii) (예를들어, OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. 헤름시이 (B. hermsii); 에를리키아종, 예를들어 E. 에퀴이 (E. equi) 및 인간 과립구 에를리히아 중독증의 작용제; 리케차종, 예를들어 R. 리케치이 (R. rickettsii); 클라미디아종, 예를들어 C. 트라코마티스 (C. trachomatis) (예를들어, MOMP, 헤파린-결합 단백질), C. 뉴모니애 (C. pneumoniae) (예를들어, MOMP, 헤파린-결합 단백질), C. 시타시 (C. psittaci); 렙토스피라종, 예를들어 L. 인테로간스 (L. interrogans); 트레포네마종, 예를들어 T. 팔리둠 (T. pallidum) (예를들어, 희귀 외막 단백질), T. 덴티콜라 (T. denticola), T. 하이오디센테리애 (T. hyodysenteriae); 또는 기생충, 예를들어 플라스모디움종, 예를들어 P. 팔시파룸 (P. falciparum); 톡소플라스마종, 예를들어 T. 곤디이 (T. gondii) (예를들어, SAG2, SAG3, Tg34); 엔타모에바종, 예를들어 E. 히스톨리티카 (E. histolytica); 바베시아종, 예를들어 B. 마이크로티 (B. microti); 트리파노소마종, 예를들어 T. 크루지 (T. cruzi); 지알디아종, 예를들어 G. 람블리아 (G. lamblia); 레시마니아종, 예를들어 L. 메이저 (L. major); 뉴모시스티스종, 예를들어 P. 카리니이 (P. carinii); 트리코모나스종, 예를들어 T. 바기날리스 (T. vaginalis); 스키소스토마종, 예를들어 S. 만소니 (S. mansoni), 또는 효모, 예를들어 캔디다종, 예를들어 C. 알비칸스 (C. albicans); 크립토코커스종, 예를들어 C. 네오포르만스 (C. neoformans).

본 발명의 조성물은 알레르기의 예방 또는 치료에 이용될 수 있다. 이러한 백신은 알레르겐 특이적인 항원 및 알레르겐 비-특이적인 항원을 포함할 것이다.

M. 투베르쿨로시스(M. tuberculosis)에 대한 기타 바람직한 특정 항원은 예를 들어 Tb Ra12, Tb H9, Tb Ra35, Tb38-1, Erd 14, DPV, MTI, MSL, mTTC2 및 hTCC1 (WO 99/51748)이다. M. 투베르쿨로시스(M. tuberculosis)에 대한 단백질은 또한 M. 투베르쿨로시스(M. tuberculosis)의 두 개 이상, 바람직하게는 세 개의 폴리펩티드가 보다 큰 단백질에 융합된 융합 단백질 및 변이체를 포함한다. 바람직한 융합체는 Ra12-TbH9-Ra35, Erd14-DPV-MTI, DPV-MTI-MSL, Erd14-DPV-MTI-MSL-mTCC2, Erd14-DPV-MTI-MSL, DPV-MTI-MSL-mTCC2 및 TbH9-DPV-MTI (WO 99/51748)를 포함한다.

클라미디아에 대한 가장 바람직한 항원은 고분자량 단백질 (HMW)(WO 99/17741), ORF3 (EP 366 412), 및 추정 막 단백질(Pmp)을 포함한다. 백신 제형의 다른 클라미디아 항원은 WO 99/28475에 개시된 군으로부터 선택될 수 있다.

바람직한 세균 백신은 S. 뉴모니애(S. pneumoniae)를 포함하는 스트렙토코커스 종으로부터 유래된 항원 (예를 들어, PsaA, PspA, 스트렙토라이신, 콜린-결합 단백질) 및 단백질 항원 뉴모라이신 (Biochem Biophys Acta, 1989, 67, 1007; Rubins et al., Microbial Pathogenesis, 25, 337-342), 및 이의 돌연변이 무독화 유도체 (WO 90/06951; WO 99/03884)를 포함한다. 기타 바람직한 세균 백신은 헤모필루스 종, 예를들어 H. 인플루엔자(H. influenzae) 타입 B, 비유형성(non typeable) H. 인플루엔자(H. influenzae)로부터 유래된 항원, 예를 들어 OMP26, 고분자량 부착소, P5, P6, 단백질 D 및 지단백질 D, 및 핌브린 및 핌브린 유래된 펩티드 (US 5,843,464) 또는 이들의 다중 복사 변이체 또는 융합 단백질을 포함한다.

B형 간염 표면 항원의 유도체가 당 분야에 널리 공지되어 있고, 그 중에서도 유럽 특허 출원 EP-A-414 374; EP-A-0304 578, 및 EP 198-474에 개시된 PreS1, PreS2 S 항원을 포함한다. 바람직한 일 측면에서, 본 발명의 백신 제형은, 특히 CHO 세포에서 발현된 HIV-1 항원, gp120을 포함한다. 추가의 구체예에서, 본 발명의 백신 제형은 상기 정의된 gD2t를 포함한다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 청구된 애주번트를 함유하는 백신은 생식기 사마귀의 원인으로 간주되는 인간 파필로마 바이러스 (HPV) (HPV 6 또는 HPV 11 등), 및/또는 자궁경부암의 원인이 되는 HPV 바이러스 (HPV16, HPV18 등)로부터 유래되는 항원을 포함한다.

특히 바람직한 형태의 생식기 사마귀 예방 또는 치료용 백신은 L1 단백질, 및 HPV 단백질 E1, E2, E5, E6, E7, L1 및 L2로부터 선택된 하나 이상의 항원을 포함하는 융합 단백질을 포함한다.

가장 바람직한 형태의 융합 단백질은 WO 96/26277에 기술된 L2E7, 및 WO 99/10375에 기술된 단백질D(1/3)-E7이다.

바람직한 HPV 자궁경부 감염 또는 암의 예방 또는 치료용 백신 조성물은 HPV 16 또는 18 항원을 포함할 수 있다.

특히 바람직한 HPV 16 항원은 조기 단백질 E6 또는 E7과 단백질 D 담체와의 융합에 의해 형성된 단백질 D - HPV 16으로부터의 E6 또는 E7 융합체, 또는 이의 조합물; 또는 E6 또는 E7과 L2의 조합물을 포함한다 (WO 96/26277).

대안적으로, HPV 16 또는 18 조기 단백질 E6 및 E7은 단일 분자, 바람직하게는 단백질 D - E6/E7 융합체로 제공될 수 있다. 이러한 백신은 임의로 HPV 18로부터의 E6 및 E7 단백질중 하나 또는 둘 모두를 함유할 수 있고, 바람직하게는 단백질 D - E6 또는 단백질 D - E7 융합체 단백질 또는 단백질 D E6/E7 융합 단백질의 형태로 함유할 수 있다.

본 발명의 백신은 기타 HPV 균주, 바람직하게는 HPV 31 또는 33으로부터의 항원을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 백신 또는 면역원성 조성물은 말라리아를 야기시키는 기생충으로부터 유래된 항원, 예를들어 포자소체 단백질 (CS 단백질), RTS,S, MSP1, MSP3, LSA1, LSA3, AMA1 및 TRAP를 포함하는 플라스모디움 팔시파룸(Plasmodium falciparum)으로부터 유래된 항원을 추가로 포함한다. RTS는 B형 간염 표면 항원의 preS2 부분의 4개의 아미노산을 통해 B형 간염 바이러스의 표면 (S)항원에 연결된 P. 팔시파룸(P. falciparum)의 포자소체 (CS) 단백질의 실질적으로 모든 C-말단 부분을 포함하는 하이브리드 단백질이다. 이의 전체 구조는 UK 특허 출원 No.9124390.7을 우선권으로 청구하는 국제공개 번호 WO 93/10152로 공개된 국제 특허 출원 번호 PCT/EP92/02591에 기술되어 있다. 효모 RTS에서 발현되어 지단백질 입자로서 생성되고, HBV로부터의 S 항원과 함께 발현되는 경우, RTS,S로 공지된 혼합 입자가 생성된다. TRAP 항원은 국제공개번호 WO 90/01496로 공개된 국제 특허 출원 번호 PCT/GB89/00895에 기술되어 있다. 다단계 말라리아 백신의 성분이 되는 후보인 듯한 플라스모디아 항원은 P. 팔시파룸(P. falciparum) MSP1, AMA1, MSP3, EBA, GLURP, RAP1, RAP2, 시퀘스트린(Sequestrin), PfEMP1, Pf332, LSA1, LSA3, STARP, SALSA, PfEXP1, Pfs25, Pfs28, PFS27/25, Pfs16, Pfs48/45, Pfs230 및 플라스모디움 종의 이들의 유사체이다. 본 발명의 일 구체예는 말라리아 백신인데, 여기서 항원 제제는 하나 이상의 추가의 말라리아 항원과 조합된 RTS,S의 CS 부분과 같은 RTS,S 또는 CS 단백질 또는 이의 단편을 포함하며, 둘 중 하나 또는 둘 모두는 본 발명에 따른 시가 독소 B 서브유닛에 부착될 수 있다. 하나 이상의 추가의 말라리아 항원은, 예를 들어 MPS1, MSP3, AMA1, LSA1 또는 LSA3으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.

제형은 또한 항-종양 항원을 함유할 수 있고, 이는 암의 면역요법 치료에 유용하다. 예를 들어, 애주번트 제형은 전립선암, 유방암, 직장결장암, 폐암, 췌장암, 신장암 또는 흑색종에 대한 것들과 같은 종양 거부 항원의 유용성을 지닌다. 예시적인 항원으로는 MAGE 1 및 MAGE 3 및 또는 기타 MAGE 항원 (흑색종 치료용), PRAME, BAGE, 또는 GAGE (Robbins and Kawakami, 1996, Current Opinions in Immunology 8, pps 628-636; Van den Eynde et al., International Journal of Clinical & Laboratory Research (submitted 1997); Correale et al. (1997), Journal of the National Cancer Institute 89, p293)가 있다. 실제로, 이러한 항원은 광범위한 종양 유형, 예를들어 흑색종, 폐암종, 육종 및 방광암종에서 발현된다. 기타 종양-특이적 항원이 본 발명의 애주번트와 사용되기에 적합하며, 이에 제한되는 것은 아니나 종양-특이적 강글리오사이드, 전립선 특이적 항원(PSA) 또는 Her-2/neu, KSA(GA733), PAP, 맘마글로빈, MUC-1, 암배아 항원(CEA), p501S(프로스테인)를 포함한다. 따라서, 본 발명의 일 측면에서, 본 발명에 따른 애주번트 조성물 및 종양 거부 항원을 포함하는 백신이 제공된다. 일 측면에서, 종양 항원은 Her-2/neu이다.

본 발명의 일 측면은 전립선암, 유방암, 직장결장암, 폐암, 췌장암, 신장암, 난소암 또는 흑색종 암과 같은 종양 항원을 포함하는 백신을 제공한다. 따라서, 제형은 종양-관련 항원 뿐 아니라 종양-지지 메커니즘 (예컨대, 혈관형성, 종양 침범)과 관련된 항원도 함유할 수 있다. 추가로, 암의 치료에 있어서 백신용으로 특히 적절한 항원은 전립선-특이적 막 항원(PSMA), 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), p501S (프로스타인), 티로시나아제, 설바이빈, NY-ESO1, 프로스타아제, PS108 (WO 98/50567), RAGE, LAGE, HAGE을 또한 포함한다. 추가로, 상기 항원은 다수의 암, 또는 면역거세의 치료에 유용한, 10개 아미노산 길이의 짧은 펩티드인 전장 생식샘자극호르몬 방출 호르몬(GnRH, WO 95/20600)과 같은 자가 펩티드 호르몬일 수 있다.

백신접종

본 발명의 면역원성 조성물을 함유하는 백신 제제를 이용하여 전신 또는 점막 경로를 통해 상기 백신을 투여함에 의해, 감염되기 쉬운 포유동물을 보호 또는 치료할 수 있다. 이러한 투여는 근내, 복막내, 진피내 또는 피하 경로를 통한 주사; 또는 구강/소화관, 기도, 비뇨생식관으로의 점막 투여를 통한 주입을 포함할 수 있다. 본 발명의 백신이 단일 용량으로서 투여될 수 있으나, 이들의 성분은 동시에 또는 상이한 시점에 함께 공동-투여될 수도 있다 (예를 들어, 폐렴알균 사카라이드 컨주게이트를, 백신의 임의의 세균 단백질 성분을 투여함과 동시에 또는 1-2주 후에 별도로 투여하여 서로와 관련된 면역 반응을 최적으로 조정할 수 있었다). 또한, 본 발명의 백신은 프라이밍 투약을 위해 IM 투여되고 부스터 투약을 위해 IN 투여될 수 있다.

백신 중 단백질 항원의 함량은 통상적으로 1-100 ㎍의 범위, 바람직하게는 5-50 ㎍, 가장 통상적으로 5-25 ㎍의 범위일 것이다. 초기 백신접종 이후에, 피검체는 적합한 간격으로 1회 또는 수 회로 부스터 면역화될 수 있다.

백신 제제는 문헌[Vaccine Design ("The subunit and adjuvant approach" (eds Powell M. F. & Newman M.J.) (1995) Plenum Press New York)]에 일반적으로 개시되어 있다. 리포좀내 캡슐화는 문헌[Fullerton, US Patent 4,235,877]에 기술되었다.

본 발명의 백신은 용액으로 저장되거나 냉동건조될 수 있다. 바람직하게는, 용액이 수크로오스 또는 락토오스와 같은 당류의 존재하에 냉동건조된다. 이들은 냉동건조되고 사용 직전에 재구성되는 것이 추가로 바람직하다.

본 발명의 일 측면에서 임의로 냉동건조된 형태로 본 발명의 면역원성 조성물을 함유하는 바이알을 포함하는 백신 키트가 제공되며, 이는 본원에 정의된 애주번트를 함유하는 바이알을 추가로 포함한다. 본 발명의 이러한 측면에서, 애주번트를 이용하여 냉동건조된 면역원성 조성물을 재구성하는 것이 구상된다.

본 발명의 백신은 임의의 경로로 투여될 수 있으나, 피부(ID)로 개시된 백신을 투여하는 것이 본 발명의 일 구체예를 형성한다. 인간 피부는 표피를 덮고 있는, 각질층(stratum corneum)이라 불리는 외부 "각질"층(horny cuticle)을 포함한다. 이 표피 아래에는 진피라 불리는 층이 있으며, 이것은 또한 피하 조직을 덮고 있다. 연구원들은, 백신을 피부, 및 특히 진피로 주사하는 것이 면역 반응을 자극하며, 이것은 다수의 추가 이점과도 관련될 수 있음을 지적하였다. 본원에 개시된 백신을 이용한 진피내 백신접종은 본 발명의 바람직한 특징을 구성한다.

진피내 주사, "망투 절차(mantoux procedure)"의 통상적인 기술은 피부를 세정하는 단계, 및 한 손으로 잡아 당기며, 좁은 게이지 바늘(26-31 게이지)의 경사가 위를 향하도록 하여 바늘을 10-15°의 각도로 삽입하는 단계를 포함한다. 일단 비스듬하게 바늘이 삽입되면, 바늘의 몸통을 낮추고 약간의 압력을 제공하면서 추가로 앞으로 밀어 이것을 피부 밑에서 들어 올린다. 이후 액체를 매우 천천히 주사함으로써 피부 표면에 물집 또는 융기를 형성하고, 이후 바늘을 천천히 빼 낸다.

보다 최근에, 액제를 피부로 또는 피부를 가로질러 투여하도록 특이하게 설계된 장치가 개시되었고, 에컨대 WO 99/34850 및 EP 1092444에 개시된 장치가 있고, 또한 제트 주사 장치가 예를 들어 WO 01/13977; US 5,480,381, US 5,599,302, US 5,334,144, US 5,993,412, US 5,649,912, US 5,569,189, US 5,704,911, US 5,383,851, US 5,893,397, US 5,466,220, US 5,339,163, US 5,312,335, US 5,503,627, US 5,064,413, US 5,520,639, US 4,596,556, US 4,790,824, US 4,941,880, US 4,940,460, WO 97/37705 및 WO 97/13537에 개시되었다. 백신 제제의 진피내 투여의 대안적인 방법은 통상적인 주사기 및 바늘, 또는 고체 백신의 탄도 전달을 위한 고안된 장치 (WO 99/27961), 또는 경피 패치 (WO 97/48440; WO 98/28037); 피부 표면에 적용되는 것 (경피 또는 피부통과 전달 WO 98/20734; WO 98/28037)을 포함할 수 있다.

본 발명의 백신을 피부, 또는 보다 구체적으로 진피에 투여하여야 할 때, 백신은 적은 액체 부피, 특히 약 0.05 ml 내지 0.2 ml의 부피이다.

본 발명의 피부 또는 진피내 백신 중 항원 함량은 근내 백신 (상기 참조)에서 보여진 통상적인 용량과 유사할 수 있다. 그러나, 제형이 "저 용량"일 수 있다는 것이 피부 또는 진피내 백신의 특징이다. 따라서, "저 용량" 백신 중 단백질 항원은 용량 당 0.1 내지 10 ㎍, 바람직하게는 0.1 내지 5 ㎍으로 적게 존재하는 것이 바람직하고; 사카라이드 (바람직하게는 컨주게이션됨) 항원은 용량 당 0.01-1 ㎍의 범위, 바람직하게는 0.01 내지 0.5 ㎍의 범위로 존재할 수 있다.

본원에 정의된 "진피내 전달"이라는 용어는 피부의 진피 영역으로의 백신의 전달을 의미한다. 그러나, 백신이 반드시 진피에만 정위되는 것은 아닐 것이다. 진피는 인간 피부의 표면으로부터 약 1.0 내지 약 2.0 mm에 위치하는 피부층이나, 개체간 그리고 몸의 다른 부위간에 어느 정도의 차이가 있다. 일반적으로, 피부 표면 아래로 1.5 mm 정도 가면 진피에 도달할 것으로 예상될 수 있다. 진피는 각질층과 표면에는 표피 및 밑으로는 피하층 사이에 위치한다. 전달 방식에 따라서, 백신은 궁극적으로 진피내에 단독으로 또는 주로 정위되거나, 궁극적으로 표피와 진피내에 분포될 수 있다.

각 백신 용량 중 각 항원의 양은 통상의 백신접종자에게서 현저한 부작용 없이 면역보호 반응을 유도하는 양으로서 선택된다. 이러한 양은 어떤 특정 면역원이 적용되는 지와 이것이 어떻게 제시되는 지에 따라서 다양할 것이다.

추가의 구체예에서, 실질적으로 본원에 개시된 조성물을 투여함에 의해 질병에 걸리기 쉽거나 질병에 걸린 개체를 치료하는 방법이 제공된다.

또한, 실질적으로 본원에 개시된 조성물을 개체에게 투여하는 것을 포함하여, 개체가 감염성 세균 및 바이러스 질병, 기생충 질병, 특히 세포내 병원성 질병, 증식성 질병, 예컨대 전립선암, 유방암, 직장결장암, 폐암, 췌장암, 신장암, 난소암 또는 흑색종; 비-암성 만성 질환, 알레르기를 포함하는 군으로부터 선택된 질병에 걸리는 것을 예방하는 방법이 제공된다.

추가의 구체예에서, 질환 또는 질병의 예방 요법 또는 치료법에 이용되는 백신 조성물이 제공되며, 여기서 백신 조성물은 항원 또는 항원 조성물 및 인간 용량 당 0.5-10 mg의 대사가능한 오일, 0.5-11 mg의 토콜 및 0.1-4 mg의 에멀젼화제를 포함하는 수중유 에멀젼으로 구성된 애주번트 조성물을 포함한다.

추가의 구체예에서, 질환 또는 질병의 예방 요법 또는 치료법에 이용되는 약제를 제조함에 있어서 백신 조성물의 용도가 제공되며, 여기서 백신 조성물은 항원 또는 항원 조성물 및 인간 용량 당 0.5-10 mg의 대사가능한 오일, 0.5-11 mg의 토콜 및 0.1-4 mg의 에멀젼화제를 포함하는 수중유 에멀젼으로 구성된 애주번트 조성물을 포함한다.

본 발명은 하기 비제한적 실시예를 참조로 하여 추가로 기술될 것이다:

실시예 I은 마우스, 흰족제비, 돼지 및 인간 연구에 사용된 면역학적 판독 방법을 기술한 것이다.

실시예 Ⅱ는 예시된 연구에 사용된 수중유 에멀젼 및 애주번트 제형의 제조 를 기술한 것이다.

실시예 Ⅲ은 스플리트 인플루엔자 항원 제제 및 다양한 용량의 AS03 애주번트를 함유하는 백신을 이용한 연령이 18-59세인 성인 개체군에서의 임상 시험을 설명한다.

실시예 Ⅳ는 프라이밍된 BALB/c 마우스에서 애주번트 첨가되고 애주번트 첨가되지 않은 스플리트 인플루엔자 백신 (다양한 용량의 AS03 애주번트 포함)의 임상전 평가를 설명한다.

실시예 Ⅴ는 프라이밍된 C57BI/6 마우스에서 애주번트 첨가되고 애주번트 첨 가되지 않은 스플리트 인플루엔자 백신 (다양한 용량의 AS03 애주번트 포함)의 임상전 평가를 설명한다.

실시예 Ⅵ은 프라이밍된 C57BI/6 마우스에서 애주번트 첨가되고 애주번트 첨가되지 않은 스플리트 인플루엔자 백신 (다양한 용량의 AS03 애주번트 및 저 용량 항원 포함)의 임상전 평가를 설명한다.

실시예 Ⅶ은 나이브 C57BI/6 마우스에서 애주번트 첨가되고 애주번트 첨가되지 않은 스플리트 H5N1 백신 (다양한 용량의 AS03 애주번트 및 항원 포함)의 임상전 평가를 설명한다.

실시예 Ⅷ은 프라이밍된 대백돈(Large White pig)에서 애주번트 첨가되고 애주번트 첨가되지 않은 인플루엔자 백신의 임상전 평가를 설명한다.

실시예 Ⅰ - 면역학적 판독 방법

Ⅰ.1. 마우스 방법

Ⅰ.1.1. 헤마글루틴화 억제 시험

시험 절차 (전통적인 절차)

세 개(계절성)의 인플루엔자 바이러스 균주에 대한 항-헤마글루티닌 항체 역가를 헤마글루틴화 억제 시험 (HI)을 이용하여 결정하였다. HI 시험의 원리는 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 (HA)에 의한 적혈구 세포 (RBC)의 헤마글루틴화를 억제하는 특정 항-인플루엔자 항체의 능력에 기초한다. 열에 의해 불활성화된 혈청을 카올린 및 RBC로 처리하여 비특이적 억제제를 제거하였다. 전처리 후, 혈청의 두 배 희석액을 4 헤마글루틴화 단위의 각각의 인플루엔자 균주와 함께 인큐베이션시켰다. 이후, 적혈구 세포를 첨가하고, 응집의 억제를 기록하였다. 헤마글루틴화를 완전하게 억제한 혈청의 가장 높은 희석액의 역수로 역가를 나타내었다. 혈청의 첫 번째 희석액은 1:20이었으므로, 검출불가능한 수준은 10과 동일한 역가로 기록하였다.

H5N1 에 대한 조정 (말 적혈구를 이용한 HI 의 구체적인 설명):

항-HA 항체를 결정하기 위한 통상적인 HI 검정은 H5N1 균주에 잘 적용되도록 문서화되어 있지 않으므로, 말 RBC를 이용하여 조정된 프로토콜을 이용하였다.

말의 적혈구를 H5N1 범유행성 균주에 대하여 이용한다. 0.5% BSA(소 혈청 알부민, 최종 농도)를 함유하는 인산염 완충액 중 0.5% (최종 농도)의 말 적혈구 현탁액. 적혈구를 동일한 인산염 완충액으로 세척하고 후속적인 원심분리 단계 (10분, 2000 rpm)를 거침에 의해 상기 현탁액을 매일 제조한다. 이러한 세척 단계는 일 회 반복되어야 한다.

말 적혈구의 낮은 침강율로 인해 말 적혈구를 혈청 및 바이러스 현탁액의 반응 믹스에 첨가시킨 후, 플레이트를 실온에서 (RT, 20℃+/-2℃) 2시간 동안 인큐베이션해야 한다.

통계적 분석

백신접종 후의 HI 역가에 대해 UNISTAT을 이용하여 통계적 분석을 수행하였다. 분산 분석에 적용된 프로토콜은 하기와 같이 간단히 기술될 수 있다:

■ 데이터의 Log 변환.

■ 그룹 분포의 정상 상태를 입증하기 위한 각각의 집단(그룹)에 대한 샤피 로-윌크 (Shapiro-Wilk) 시험.

■ 다양한 집단(그룹) 사이의 분산의 균질성을 확인하기 위한 코크란 (Cochran) 시험.

■ 선택된 데이터에 대한 분산 분석

■ 이원 분석 ANOVA의 상호작용에 대한 시험

■ 다중 비교를 위한 터키 (Tukey) HSD 시험.

Ⅰ.1.2. 세포내 시토킨 염색

본 기술은 시토킨 생성을 기초로 하여 항원 특이적 T 림프구의 정량을 가능케 한다: 이펙터 T 세포 및/또는 이펙터-기억 T 세포는 IFN-γ를 생성하고/하거나 중추 기억 T 세포는 IL-2를 생성한다. PBMC를 면역화 7일 후에 수거하였다.

림포이드 세포를 분비 억제제 (브레펠딘(Brefeldine))의 존재하에서 시험관내에서 재자극시켰다. 이후, 이러한 세포를 형광 항체 (CD4, CD8, IFN-γ 및 IL-2)를 이용하는 통상적인 면역형광 방법에 의해 처리하였다. 결과를 CD4/CD8 T 세포 내의 시토킨 양성 세포의 빈도로 나타내었다. T 세포의 시토킨의 세포내 염색을 두 번째 면역화 7일 후에 PBMC에서 수행하였다. 마우스로부터 혈액을 수거하고, 헤파린 처리된 배지 RPMI+ Add에서 풀링시켰다. 혈액에 대해서는, RPMI+ Add 희석된 PBL 현탁액을 권장 프로토콜 (2500 rpm 및 R.T에서 20분 동안 원심분리)에 따라 림포라이트-포유동물 (Lympholyte-mammal) 구배 상에 층을 이루게 하였다. 계면의 단핵 세포를 분리시키고, RPMI+ Add로 2회 세척하고, PBMC 현탁액을 RPMI 5% 우태아 혈청 중에 2 x 10⁶ 세포/ml로 조정하였다.

PBMC의 시험관내 항원 자극을 1 x 10⁷ 세포/ml (튜브 FACS)의 최종 농도의 전체 FI (1 ㎍ HA/균주)로 수행한 다음, 항-CD28 및 항-CD49d (둘 모두 1 ㎍/ml)를 첨가시켜 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다.

항원 재자극 단계 후, PBMC를 브레펠딘 (1 ㎍/ml)의 존재하에서 37℃에서 밤새 인큐베이션시켜, 시토킨 분비를 억제시켰다.

IFN-γ/IL-2/CD4/CD8 염색을 다음과 같이 수행하였다: 세포 현탁액을 세척하고, 2% Fc 차단 시약 (1/50; 2.4G2)을 함유하는 50 ㎕의 PBS 1% FCS에 재현탁시켰다. 4℃에서의 10분의 인큐베이션 후, 50 ㎕의 항-CD4-PE (2/50) 및 항-CD8 perCp (3/50)의 혼합물을 첨가하고, 4℃에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. PBS 1% FCS에서 세척한 후, 세포를 200 ㎕의 사이토픽스-사이토펌 (Cytofix-Cytoperm) (Kit BD)에 재현탁시킴으로써 투과화시키고, 4℃에서 20분 동안 인큐베이션시켰다. 이후, 세포를 펌 워시 (Perm Wash) (Kit BD)로 세척하고, 펌 워시에 희석된 50 ㎕의 항-IFN-γ APC (1/50) + 항-IL-2 FITC (1/50)의 혼합물에 재현탁시켰다. 4℃에서 최소 2시간, 최대 밤새 인큐베이션시킨 후, 세포를 펌 워시로 세척하고, PBS 1% FCS + 1% 파라포름알데히드에 재현탁시켰다. FACS에 의해 샘플 분석을 수행하였다. 살아 있는 세포를 게이팅(gating) (FSC/SSC)시키고, CD4+T 세포 상의 ~ 20,000개의 이벤트 (림프구) 또는 35,000개의 이벤트에서 포착(acquisition)을 수행하였다. IFN-γ+ 또는 IL2+의 백분율을 CD4+ 및 CD8+ 게이팅된 집단에서 계산하였다.

I.1.3. 항-H5N1 ELISA

항-H5N1 Ig, IgG1 및 IgG2b 항체 역가의 정량을 코팅으로서 스플리트 H5N1을 이용한 ELISA에 의해 수행하였다. 바이러스 및 항체 용액을 웰 당 100 ㎕로 이용하였다. 스플리트 바이러스 H5N1을 PBS에서 1 ㎍/ml의 최종 농도로 희석시키고 96 웰 미세역가 플레이트 (Maxisorb Immunoplate Nunc 439454)의 웰에 4℃에서 밤새 흡착시켰다. 이후, 플레이트를 1% BSA 및 0.1% 트윈 20을 함유하는 웰 당 200 ㎕의 PBS (포화 완충액)와 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 포화 완충액 중 혈청의 22배 희석액을 H5N1-코팅된 플레이트에 첨가하고 37℃에서 1시간 30분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS 0.1% 트윈 20으로 4회 세척하였다. PBS 1% BSA 0.1% 트윈 20에 1/500 희석된 비오티닐화-컨주게이션된 항-마우스 Ig (Prozan-E0413) 또는 1/4000 희석된 비오티닐화-컨주게이션된 항-마우스 IgG1 (Imtech 1070-08) 또는 비오티닐화된 항-마우스 IgG2b (Imtech 1090-08)를 각 웰에 첨가하고 37℃에서 1시간 30분 동안 인큐베이션하였다; 세척 단계 후, 플레이트를 PBS 1% BSA 트윈 20에 1/10000 희석된 스트렙타비딘-비오틴-프리옥시다아제 컨주게이션 (Prozan P0397)과 함께 30분 동안 인큐베이션하였다.

비색 계시를 위해, 플레이트를 0.1M 시트레이트 완충액 (pH 4.2) 중 o-페닐디아민 (Sigma P4664) 0.04% H2O2 0.03%의 용액과 함께 22℃에서 20분 동안 인큐베이션하였다. H₂SO₄ 2N으로 반응을 중단시키고 490-630 nm에서 미세플레이트를 판독하였다.

I.2. 흰족제비 방법

I.2.1. 헤마글루틴화 억제 시험 ( HI )

시험 절차

세 개의 인플루엔자 바이러스 균주에 대한 항-헤마글루티닌 항체 역가를 헤마글루틴화 억제 시험 (HI)을 이용하여 결정하였다. HI 시험의 원리는 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 (HA)에 의한 닭 적혈구 세포 (RBC)의 헤마글루틴화를 억제하는 특정 항-인플루엔자 항체의 능력에 기초한다. 혈청을 먼저 25% 뉴라미니다아제 용액 (RDE)으로 처리하고, 열-불활성화시켜 비특이적 억제제를 제거하였다. 전처리 후, 혈청의 두 배의 희석액을 4 헤마글루틴화 단위의 각각의 인플루엔자 균주와 함께 인큐베이션시켰다. 이후, 닭 적혈구 세포를 첨가하고, 응집의 억제를 기록하였다. 헤마글루틴화를 완전하게 억제한 혈청의 가장 높은 희석액의 역수로 역가를 나타내었다. 혈청의 첫번째 희석액은 1:10이었으므로, 검출불가능한 수준은 5와 동일한 역가로 기록하였다.

통계적 분석

UNISTAT을 이용하여 HI 역가 (챌린지 41일 전)에 대해 통계적 분석을 수행하였다. 분산 분석에 적용된 프로토콜은 하기와 같이 간단히 기술될 수 있다:

■ 데이터의 Log 변환.

■ 그룹 분포의 정상 상태를 입증하기 위한 각각의 집단(그룹)에 대한 샤피로-윌크 시험.

■ 다양한 집단(그룹) 사이의 분산의 균질성을 확인하기 위한 코크란 시험.

■ 일원 ANOVA의 상호작용에 대한 시험.

■ 다중 비교를 위한 터키 HSD 시험.

I.2.2. 체온 모니터링

개별적 온도를 챌린지 기간 동안 트랜스미터를 이용하여 원격측정 기록에 의해 모니터링하였다. 모든 이식물을 조사하고, 쇄신시키고, 복강내에 배치시키기 전에 DSI (Data Sciences International, Centaurusweg 123, 5015 TC Tilburg, The Netherlands)에 의해 새로운 교정을 수행하였다. 모든 동물을 상기 측정 동안 하나의 우리에서 개별적으로 사육하였다. 온도를 챌린지 4일 전부터 챌린지 7일 후까지 매 15분마다 기록하였다.

I.2.3. 비내 세척

의식이 있는 동물의 양 콧구멍에 5 ml의 PBS를 투여함으로써 비내 세척을 수행하였다. 접종물을 페트리 접시에 수거하고, 드라이아이스 상의 샘플 용기에 두었다.

비내 세척액에서의 바이러스 적정

모든 비내 샘플을 먼저 스핀 (Spin) X 필터 (Costar)를 통해 여과시켜, 임의의 세균 오염물을 제거하였다. 50 ㎕의 비내 세척물의 연속 10배 희석액을 50 ㎕의 배지를 함유하는 미세역가 플레이트 (10 웰/희석액)로 옮겼다. 이후, 100 ㎕의 MDCK 세포 (2.4 x 10⁵ 세포/ml)를 각각의 웰에 첨가하고, 5-7일 동안 35℃에서 인큐베이션시켰다.

5-7일의 인큐베이션 후, 배양 배지를 천천히 제거하고, 100 ㎕의 1/20 WST-1 함유 배지를 첨가하고, 추가로 18시간 동안 인큐베이션시켰다.

살아 있는 세포에 의한 WST-1의 환원으로 생성된 황색 포르마잔 염료의 강도는 바이러스 적정 분석의 종료시에 웰에 존재하는 살아 있는 세포의 수에 비례하며, 적절한 파장 (450 나노미터)에서 각각의 웰의 흡광도를 측정함으로써 정량된다. 컷-오프 (cut-off)는 감염되지 않은 대조 세포의 OD 평균인 0.3 OD (0.3 OD는 감염되지 않은 대조 세포의 OD의 +/- 3 StDev에 해당함)로 정의된다. OD가 컷-오프 미만인 경우 양성 스코어로 규정되고, 대조적으로 OD가 컷-오프를 초과하는 경우 음성 스코어로 규정된다. 바이러스 쉐딩 (shedding) 역가를 "리드 및 뮌크(Reed and Muench)" 방법에 의해 결정하였고, Log TCID50/ml로 나타내었다.

I.3. 돼지 방법

I.3.1. 헤마글루틴화 억제 시험 ( HI )

시험 절차

통계적 분석

■ 데이터의 Log 변환.

■ 일원 ANOVA의 상호작용에 대한 시험.

■ 다중 비교를 위한 터키 HSD 시험.

I.4. 인간에서의 면역 반응을 평가하기 위한 검정

I.4.1. 헤마글루틴화 억제 분석

인플루엔자에 대한 세계보건기구 협력센터, 미국 질병통제센터 (Atlanta, USA (1991))에 의해 기술되는 방법을 이용하여 HI 항체를 측정함으로써 면역 반응을 결정하였다.

항체 역가 측정을 4 헤마글루틴화-억제 단위 (4 HIU)의 적절한 항원 및 0.5% 닭 적혈구 현탁액을 이용하는 표준화되고 광범위하게 인정된 미세법을 이용하여 해동된 동결 혈청 샘플에서 수행하였다. 열 처리 및 수용체-파괴 효소에 의해 비특이적 혈청 억제제를 제거하였다.

수득된 혈청을 HI 항체 수준에 대해 평가하였다. 1:10의 최초 희석으로부터 출발하여, 희석액 시리즈 (2배)를 1:20480의 최종 희석까지 제조하였다. 적정 종점을 헤마글루틴화의 완전 억제 (100%)를 나타낸 가장 높은 희석 단계로 택하였다. 모든 분석을 이중으로 수행하였다.

I.4.2. 뉴라미니다아제 억제 분석

페투인(fetuin)-코팅된 미세역가 플레이트에서 분석을 수행하였다. 항혈청의 2배 희석 시리즈를 제조하고, 표준화된 양의 인플루엔자 A H3N2, H1N1 또는 인플루엔자 B 바이러스와 혼합시켰다. 시험은 페투인으로부터 뉴라민산을 효소적으로 방출시키는 뉴라미니다아제의 생물학적 활성을 기초로 하였다. 말단 뉴라민산의 절단 후, β-D-갈락토오스-N-아세틸-갈락토사민이 언마스킹 (unmasking)되었다. 호스라디쉬 퍼옥시다아제 (HRP)-표지된, 갈락토오스 구조에 특이적으로 결합하는 아라키스 히포가에아 (Arachis hypogaea)로부터의 땅콩 응집소를 웰에 첨가하였다. 결합된 응집소의 양을 검출할 수 있었고, 테트라메틸벤지딘 (TMB)과의 기질 반응으로 정량하였다. 바이러스 뉴라미니다아제 활성을 여전히 50% 이상 억제하는 것으로 나타낸 가장 높은 항체 희석액이 NI 역가이다.

I.4.3. 중화 항체 분석

해동된 동결 혈청 샘플에서 중화 항체 측정을 수행하였다. 혈청 내에 함유된 항체에 의한 바이러스 중화를 미세중화 분석으로 결정하였다. 이러한 분석에서 혈청을 추가 처리 없이 사용하였다. 각각의 혈청을 삼중으로 시험하였다. 표준화된 양의 바이러스를 혈청의 연속 희석액과 함께 혼합하고, 인큐베이션시켜, 바이러 스에 항체가 결합하도록 하였다. 이후, 소정량의 MDCK 세포를 함유하는 세포 현탁액을 바이러스 및 항혈청의 혼합물에 첨가하고, 33℃에서 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 기간 후, 바이러스 복제를 닭 적혈구 세포의 헤마글루틴화에 의해 가시화시켰다. 혈청의 50%의 중화 역가를 리드 및 뮌크 (Reed and Muench) 방법에 의해 계산하였다.

I.4.4. 세포 매개된 면역성을 시토킨 유세포분석 ( CFC )에 의해 평가하였다

말초 혈액 항원-특이적 CD4 및 CD8 T 세포를 이들의 상응하는 항원과 함께 인큐베이션시켜 IL-2, CD40L, TNF-알파 및 IFN를 생성시키기 위해 시험관내에서 재자극시킬 수 있었다. 이후, 세포 표현형 뿐만 아니라 세포내 시토킨 생성의 통상적인 면역형광 표지 후에 유세포분석에 의해 항원-특이적 CD4 및 CD8 T 세포를 계수할 수 있었다. 본 연구에서, 인플루엔자 백신 항원 뿐만 아니라 특정 인플루엔자 단백질로부터 유래된 펩티드를 항원으로 사용하여 인플루엔자-특이적 T 세포를 재자극시켰다. 결과를 CD4 또는 CD8 T 세포 아집단 내의 시토킨(들)-양성 CD4 또는 CD8 T 세포의 빈도로 나타내었다.

I.4.5. 통계적 방법

I.4.5.1. 일차 종점

· 백신접종 후의 7일의 후속 기간 (즉, 백신접종일 및 이후의 6일) 및 전체 기간 동안 권유된 국소적 및 전신적 증후 및 증상의 백분율, 강도 및 백신접종과의 관련성.

· 백신접종 후의 21일의 후속 기간 (즉, 백신접종일 및 이후의 20일) 및 전 체 기간 동안 권유되지 않은 국소적 및 전신적 증후 및 증상의 백분율, 강도 및 백신접종과의 관련성.

· 전체 연구 동안의 심각한 부작용의 발생.

I.4.5.2. 이차 종점

체액성 면역 반응의 경우:

관찰된 변화:

· 0일 및 21일: 백신 내에 존재하는 3개의 인플루엔자 바이러스 균주의 각각에 대해 별개로 시험된 혈청 헤마글루틴화-억제 (HI) 및 NI 항체 역가 (항-H1N1, 항-H3N2 & 항-B-항체).

· 0일 및 21일: 백신 내에 존재하는 3개의 인플루엔자 바이러스 균주의 각각에 대해 별개로 시험된 중화 항체 역가.

유도된 변화 (95% 신뢰구간):

· 백신접종 전 및 후의 95% 신뢰구간 (95% CI)을 지니는 혈청 HI 항체의 기하 평균 역가 (GMT).

· 21일에서 95% CI를 지니는 혈청전환률^*

· 21일에서 95% CI를 지니는 전환 인자^**

· 21일에서 95% CI를 지니는 혈청보호율^***

· 모든 시점에서의 혈청 NI 항체 GMT (95% 신뢰구간을 지님).

* 혈청전환률은 각각의 백신 균주에 대해, 0일에 비해 21일에서의 혈청 HI 역가가 4배 이상 증가한 백신접종자의 백분율로 정의된다.

** 전환 인자는 각각의 백신 균주에 대해, 0일에 비해 21일에서의 혈청 HI GMT의 증가 배수로 정의된다.

*** 보호율은 백신접종 (각각의 백신 균주에 대해) 후에, 일반적으로 보호를 나타내는 것으로 인정되는 혈청 HI 역가가 40인 백신접종자의 백분율로 정의된다.

일부 임상 시험의 경우, 반응원성/안전성이 이차 종점일 수 있고, 면역원성이 일차 종점일 수 있음을 이해하여야 한다.

세포 매개된 면역 ( CMI ) 반응의 경우

관찰된 변화

0일 및 21일: 다양한 시험에서의 10⁶개의 세포당 시토킨-양성 CD4/CD8 세포의 빈도. 각각의 시험은 하기 항원에 대한 CD4/CD8 T 세포의 반응을 정량한다:

· 펩티드 인플루엔자 (pf) 항원 (이러한 항원의 정확한 특성 및 기원은 제공되거나/설명되어야 함).

· 스플리트 인플루엔자 (sf) 항원.

· 전체 인플루엔자 (wf) 항원.

유도된 변화:

· 두개 이상의 상이한 시토킨 (CD40L, IL-2, IFNγ, TNFα)을 생성하는 세포.

· 적어도 CD40L 및 또 다른 시토킨 (IL-2, TNFα, IFNγ)을 생성하는 세포.

· 적어도 IL-2 및 또 다른 시토킨 (CD40L, TNFα, IFNγ)을 생성하는 세포.

· 적어도 IFNγ 및 또 다른 시토킨 (IL-2, TNFα, CD40L)을 생성하는 세포.

· 적어도 TNFα 및 또 다른 시토킨 (IL-2, CD40L, IFNγ)을 생성하는 세포.

I.3.5.3. 면역원성의 분석

면역원성 분석은 전체 백신접종된 코호트를 기초로 하였다. 각각의 처리 그룹에 대해, 하기 파라미터 (95% 신뢰구간을 지니는 것)를 계산하였다:

· 0일 및 21일에서의 HI 및 NI 항체 역가의 기하 평균 역가 (GMT).

· 0일 및 21일에서의 중화 항체 역가의 기하 평균 역가 (GMT).

· 21일에서의 전환 인자.

· 0일과 비교하여 21일에서의 혈청 HI 역가가 4배 이상 증가된 백신접종자의 백분율로 정의된 21일에서의 혈청전환률 (SC).

· 혈청 HI 역가가 1:40인 백신접종자의 백분율로 정의된 21일에서의 보호율.

· 반응에서의 CD4/CD8 T-림프구 분비의 빈도를 각각의 백신접종 그룹, 각각의 시점 (0일, 21일) 및 각각의 항원 (펩티드 인플루엔자 (pf), 스플리트 인플루엔자 (sf) 및 전체 인플루엔자 (wf))에 대해 요약하였다 (기술통계).

· 각각의 5개의 상이한 시험에서의 각각의 백신접종 그룹 및 각각의 항원 (pf, sf 및 wf)에 대한 시점 (후-전) 반응 사이의 개별적 차이의 기술통계.

· 3개의 그룹 사이의 위치 차이를 비교하기 위해 비파라미터적(non- parametric) 시험 (Kruskall-Wallis test)을 이용하였고, 각각의 5개의 상이한 시험에서의 각각의 항원에 대해 통계적 p-값을 계산하였다. 모든 유의성 시험은 양측-꼬리 (two-tailed) 시험이었다. 0.05 이하의 P-값을 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.

실시예 Ⅱ - 수중유 에멀젼 및 애주번트 제형의 제조

달리 설명되지 않는 한, 후속되는 실시예에서 사용된 오일/물 에멀젼은 2 가지의 오일(알파-토코페롤 및 스쿠알렌)으로 제조된 유기상과 에멀젼화제로서 트윈 80을 함유하는 PBS의 수성상으로 구성된다. 달리 설명되지 않는 한, 후속되는 실시예에서 사용된 수중유 에멀젼 애주번트 제형은 다음 수중유 에멀젼 성분(최종 농도)을 포함함으로써 제조되었다: 2.5% 스쿠알렌 (v/v), 2.5% 알파-토코페롤 (v/v), 0.9% 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트 (v/v) (트윈 80), 참조 WO 95/17210. 후속되는 실시예에서 ASO3으로 지칭되는 본 에멀젼을 다음과 같이 2배 농축물로서 제조하였다.

II .1. 에멀젼 SB62 의 제조

임상 및 임상전 실시예 섹션에 보고된 연구에 이 방법을 이용하였다. SB62 에멀젼의 제조는 소수성 성분(DL-α-토코페롤 및 스쿠알렌)으로 구성된 오일상과 수용성 성분(음이온 세정제 트윈 80 및 PBS mod(개질됨), pH 6.8)을 함유하는 수성상을 강한 진탕하에 혼합함으로써 수행된다. 교반하면서, 오일상(전체 부피의 1/10)을 수성상(전체 부피의 9/10)에 옮기고, 혼합물을 15분 동안 실온에서 교반한다. 생성되는 혼합물을 이어서 미세유동화기(15000 PSI - 8 사이클 또는 실시예 III에 보고된 임상 시험에 사용된 애주번트에서 3 사이클)의 상호작용 챔버에서 전단, 충격 및 공동화 작용력에 가하여 미크론 이하 점적(100 내지 200nm 사이에 분포)을 생성시킨다. 초래된 pH는 6.8 ± 0.1이다. SB62 에멀젼을 이어서 0.22㎛ 막을 통해서 여과하여 무균화시키고, 무균 벌크 에멀젼을 2 내지 8℃에서 큐팩(Cupac) 컨테이너에 냉장 저장한다. 무균의 불활성 가스(질소 또는 아르곤)을 SB62 에멀젼 최종 벌크 컨테이너의 빈 공간에 15초 이상 동안 플러싱한다.

SB62 에멀젼의 최종 조성은 다음과 같다:

트윈 80: 1.8 % (v/v) 19.4 mg/ml; 스쿠알렌: 5 % (v/v) 42.8 mg/ml; α-토코페롤: 5 % (v/v) 47.5 mg/ml; PBS-mod: NaCl 121 mM, KCl 2.38 mM, Na₂HPO₄ 7.14 mM, KH₂PO₄ 1.3 mM; pH 6.8 ± 0.1.

실시예 Ⅲ - 스플리트 인플루엔자 항원 제제 및 다양한 용량의 AS03 애주번트를 함유하는 백신을 이용한 연령이 18-59세인 성인 개체군에서의 임상 시험

Ⅲ.1. 소개

두 용량의 애주번트 AS03을 지니는 글락소스미스클라인 바이올로지칼즈 저 용량 인플루엔자 후보 백신 (즉, 균주 당 5 ㎍의 HA 함유)의 면역원성, 안전성 및 반응원성을 평가하기 위해 제 2기, 제어된 랜덤 단일 블라인드 연구를 2006년에 18세 내지 59세의 성인 개체군에서 수행하였다.

체액 면역 반응 (즉, 항-헤마글루티닌)을 AS03 애주번트 첨가된 백신의 일 용량을 근내 투여한 지 21일 후에 측정하였다. 플루아릭스(Fluarix™)를 기준으로 서 이용하였다.

Ⅲ.2. 연구 설계

3 그룹의 피검체가 하기 백신을 근내로 동시에 투여받았다:

·5 ㎍ HA를 함유하고 AS03으로 애주번트 첨가된 저 용량 스플리트 바이러스 인플루엔자 백신을 1회 주사한 100명 피검체의 일 그룹 (FluLD1/1).

·5 ㎍ HA를 함유하고 절반 용량의 AS03으로 애주번트 첨가된 (AD03 ½) 저 용량 스플리트 바이러스 인플루엔자 백신을 1회 주사한 100명 피검체의 일 그룹 (FluLD1/2).

·일 용량의 플루아릭스™를 수용한 100명 피검체의 일 그룹 (Fluarix).

스케줄: 0일에 인플루엔자 백신의 1회 IM 주사, 0일 및 21일에 연구소 방문하여 혈액 샘플 수집 (HI 항체 결정) 및 30일에 추가로 전화 연결 (연구 결론).

본 연구에 이용된 표준 3가 스플리트 인플루엔자 백신 - 플루아릭스™는 글락소스미스클라인 바이올로지칼즈에 의해 2006년부터 개발되고 제조된 상업용 백신이다.

Ⅲ.3. 연구 목표

Ⅲ.3.1. 일차 목표

- 항-헤마글루티닌 항체 역가와 관련하여 연구 백신에 의해 유도된 체액 면역 반응 평가를 위함이다.

0일 및 21일에 관찰된 변화: 혈청 헤마글루틴화-억제 항체 역가.

유도된 변화 (95% 신뢰 구간):

- 0일 및 21일에 혈청 항체의 기하 평균 역가(GMT)

- 21일에 혈청전환율^*

- 21일에 전환 인자^**

- 0일 및 21일에 보호율^***

^*헤마글루티닌 항체 반응에 대한 혈청전환율은 백신접종 전 역가가 <1:10이고 백신접종 후 역가가 ≥1:40이거나 백신접종 전 역가가 ≥1:10이고 백신접종 후 역가가 적어도 4배의 증가를 나타내는 백신접종자의 백분율로서 정의된다.

^**전환 인자는 0일째에 비해 백신접종 후 혈청 HI GMT에 있어서의 증가 배수로서 정의된다.

^***보호율은 지시된 보호로서 일반적으로 인정된 백신접종 후 혈청 HI 역가가 ≥40인 백신접종자의 백분율로서 정의된다.

Ⅲ.3.2. 이차 목표

- 권유된(solicited) 국소적 및 전신적 불리한 사건, 권유되지 않은 불리한 사건 및 심각한 부작용과 관련하여 본 연구 백신의 안전성 및 반응원성을 평가하기 위함이다.

1. 각 그룹에서 각 백신접종 후 7일 기간 (즉, 백신접종 당일 및 추후 6일) 동안, 권유된 국소적 및 전신적 징후 및 증상의 발생, 세기 및 백신접종과의 관련성.

2. 각 그룹에서 백신접종 후 30일 기간 동안 (즉, 백신접종 당일 및 추후 29일), 권유되지 않은 국소적 및 전신적 징후 및 증상의 발생, 세기 및 백신접종과의 관련성.

3. 각 그룹에서 전체 연구 동안 심각한 부작용의 발생 및 관련성.

Ⅲ.4. 백신 조성물 및 투여

Ⅲ.4.1. 백신 제조

애주번트 첨가되지 않은 인플루엔자 백신은 세 개의 일가 바이러스 항원 벌크 (각각 인플루엔자 균주 A/H1N1, A/H3N2 및 B로부터 제조됨)으로 구성된 불활성화된 인플루엔자 백신인 3가 스플리트 비리온이다. 이 백신에 존재하는 항원은 1992년 이래로 판매 중인 플루아릭스™(α-릭스(Rix)^?)로서 이용가능한 라이센싱된 플루아릭스™ 백신과 동일하며 용량 당 15 ㎍ HA/균주를 함유한다. FluLD 임상 로트에 포함된 인플루엔자 균주는 2006/2007년 동안 북반구에서 선택되었던 균주들이다.

·A/뉴 칼레도니아/20/99 (H1N1)-유사 균주: A/뉴 칼레도니아/20/99 (H1N1) IVR-116

·A/위스콘신/67/2005 (H3N2)-유사 균주: A/위스콘신/67/2005 (H3N2) NYMCX-161

·B/말레이시아/2506/2004.

항원은 난(egg)-성장된 바이러스로부터 유래된다. 스플리팅은 불활성화 단계 이전에 나트륨 데옥시콜레이트로 수행되며, 이것은 나트륨 데옥시콜레이트 및 포름알데히드의 후속 작용을 통해 수행된다.

AS03 애주번트 첨가된 저 용량 인플루엔자 (FluLD) 백신 (임상 로트)은 시판되는 플루아릭스™ 백신 (각각 인플루엔자 균주 A/H1N1, A/H3N2 및 B로부터 제조됨)에 기초하나, 더 낮은 항원 함량을 갖고 GSK 애주번트 시스템 AS03으로 애주번트 첨가된다. AS03은 두 개의 생분해가능한 오일, 스쿠알렌 및 α-토코페롤(비타민 E), 및 계면활성제, 폴리소르베이트 80(트윈 80)을 함유하는 수중유 에멀젼 (SB62)로 구성된다. 인플루엔자 항원은 에멀젼과의 단순한 혼합에 의해 애주번트 시스템의 수성상으로 혼입된다. 백신 로트에 Flu 항원과 함께 도입되는 애주번트의 양을 달리 하여 두 제형을 시험하였다. 애주번트 첨가된 백신은 애주번트 시스템 AS03의 전체 용량(AS03) 또는 절반의 용량(AS03 ½)과 조합된, 용량 당 각 인플루엔자 바이러스 균주의 5 ㎍의 헤마글루티닌(HA)을 함유한다. 부형제는 하기와 같다: 폴리소르베이트 80 (트윈 80), 옥토시놀 10 (트리톤 X-100), 알파-토코페릴 수소 숙시네이트, 염화나트륨, 인산수소이나트륨, 인산이수소칼륨, 염화칼륨, 주사용 물. AS03 애주번트 첨가된 저 용량 인플루엔자 백신 (FluLD, 전체 또는 절반 용량의 AS03)은 보존제가 없는 백신이다. 그러나, 이들은 초기 단계의 제조 공정으로부터의 미량의 티오메르살 (용량 당 <1.25 ㎍의 Hg)을 함유한다. 이들 둘 모두는 미리-충전된 유리(타입 I) 주사기 중 단일용량(monodose) 백신으로서 0.5 ml/용량의 부피로 제공된다.

Ⅲ.4.1.1. AS03 애주번트 첨가된 인플루엔자 백신의 조성

일 용량의 FluLD (전체 또는 절반 용량의 AS03)는 0.5 ml이다. 조성이 표 3에 제공된다. 용량 당 HA 함량은 두 제형 모두에 대해 5 ㎍이고, 유일한 차이는 최종 컨테이너에 존재하는 AS03의 양이다.

표 3 AS03 애주번트 첨가된 저 용량 인플루엔자 백신의 조성 (전체 또는 절반 용량의 AS03 )

Ⅲ.4.1.2. 스플리트 불활성화된 인플루엔자 항원 제제의 생성

인플루엔자 항원은 플루아릭스™ (인플루엔자 바이러스 백신)에 포함된 것들과 동일하다. 1가 벌크는 발육란(embryonated hen's eggs)에서 개별적으로 성장한 타입 A (H1N1 및 H3N2) 및 타입 B의 3개 균주의 인플루엔자 바이러스의 작업용 시드로부터 제조된 정제되고 불활성화된 스플리트 바이러스로 구성된다. 이러한 작업용 시드는 연례 WHO 권장에 따라 WHO 협력 센터로부터 받은 균주에서 유래된다. 항원을 제조하는 공정에 대해서는 실례로서 WO 02/097072을 참조한다. 세 개의 1 가 벌크의 부피는 제형화 이전에 각 1가 벌크에서 측정된 HA 함량 및 표적 제조 부피에 기초한다.

10배 농축된 인산염 완충된 염수 (1배 농축시 pH 7.4) 및 트윈 및 α-토코페릴 수소 숙시네이트의 전-혼합물을 주사용 물에 희석시키고 5-30분 동안 실온에서 교반한다.

이후 3개의 농축된 1가 벌크를, 생성된 인산염 완충된 염수/트윈 80-α-토코페릴 수소 숙시네이트 용액에서 중간체 3가 벌크 1 mL에 대하여

20 ㎍ HA의 각 A 1가 벌크 (H1N1, H3N2)

23.32 ㎍ HA의 B 1가 벌크의 농도로 연속하여 희석시킨다 (500 ㎕의 3가 최종 벌크에 대하여 5 ㎍ HA의 각 A 1가 벌크 및 5.83 ㎍ HA의 B).

각 1가 벌크의 첨가 사이에, 혼합물을 실온에서 10-30분 동안 교반하고 마지막 1가 벌크의 첨가 후에 15-30분 동안 교반한다. "예비-풀(pre-pool)"이라고도 불리는 이러한 중간체 3가 벌크를 +2-+8℃에 유지하거나 동일한 날에 최종 제형 단계로 추가로 프로세싱할 수 있다. 예비-풀의 최종 부피는 용량 당 250 ㎕이다.

Ⅲ.4.1.3. AS03 애주번트 첨가된 백신 조성물의 제조

애주번트 첨가된 백신: LD AS03 1/1 (표 4)

10배 농축된 PBS mod (1배 농축시 pH 7.4; 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8.1 mM Na₂HPO₄, 1.47 mM KH₂PO₄, pH 7.4) 및 트윈 80, 트리톤 X-100 및 VES (균주에 존재하는 세정제를 고려한 양들)를 함유하는 혼합물을 주사용 물에 첨가하였다. 5 내지 30분 교반시킨 후, 각 균주 H1N1 및 H3N2 1 ml에 대하여 20 ㎍의 HA 및 B 균주 1 ml에 대하여 23.32 ㎍의 HA를 각 첨가 사이에 10 내지 30분 동안 교반하면서 첨가하였다. 15 내지 30분 동안 교반시킨 후, 적은 부피의 소위 "중간체 벌크"를 분석을 위해 버리고 +2 내지 +8℃에서 저장하였다. 중간체 벌크를 PBS mod에서 1배 농축하였다. 표적 세정제 농도는 ml 당 488 ㎍의 트윈 80, ml 당 73.6 ㎍의 트리톤 X-100 및 ml 당 66.6 ㎍의 VES이다.

이후 최종 제형을 제조하였다: 동일한 부피의 SB62 (실시예 II의 제조 참조)를 각 250 ㎕의 예비-풀 중간체 벌크에 첨가하고 30 내지 60분 동안 실온에서 혼합하였다. pH가 6.8 내지 7.5의 범위인 것이 조사되었다. 제형을 질소로 플러싱한 다음 충전 전에 +2 내지 8℃로 저장하였다.

표 4 AS03 애주번트 첨가된 저 용량 백신

애주번트 첨가된 백신: LD AS03 1/2 (표 5)

10배 농축된 PBS mod (1배 농축시 pH 7.4; 상기 조성 참조) 및 트윈 80, 트 리톤 X-100 및 VES (균주에 존재하는 세정제를 고려한 양들)를 함유하는 혼합물을 주사용 물에 첨가하였다. 5 내지 30분 교반시킨 후, 각 균주 H1N1 및 H3N2 1 ml에 대하여 20 ㎍의 HA 및 B 균주 1 ml에 대하여 23.32 ㎍의 HA를 각 첨가 사이에 10 내지 30분 동안 교반하면서 첨가하였다. 15 내지 30분 동안 교반시킨 후, 적은 부피의 소위 "중간체 벌크"를 분석을 위해 버리고 +2 내지 +8℃에서 저장하였다. 중간체 벌크를 PBS mod에서 1배 농축하였다. 표적 세정제 농도는 ml 당 488 ㎍의 트윈 80, ml 당 73.6 ㎍의 트리톤 X-100 및 ml 당 66.6 ㎍의 VES이다. 이후 최종 제형을 제조하였다: SB62를 먼저 PBS mod 완충액으로 희석시키고 실온에서 15-30분 동안 교반하였다. 이후 이렇게 희석된 동일한 부피의 SB62를 각 250 ㎕의 예비-풀 중간체 벌크에 첨가하였다. 30 내지 60분 동안 실온에서 교반시킨 후, pH가 6.8 내지 7.5의 범위인 것이 조사되었다. 제형을 질소로 플러싱한 다음 충전 전에 +2 내지 8℃로 저장하였다.

두 제형의 최종 부피는 용량 당 500 ㎕이고 최종 HA 농도는 3가 최종 벌크 1 ml에 대하여 10 ㎍의 각 A 1가 벌크 11.66 ㎍의 B 1가 벌크이다. 최종 트윈 80, 트리톤 X-100 (H3N2 1가벌크 제조로부터의 잔류물) 및 α-토코페릴 수소 숙시네이트 (α-토코페릴 수소 숙시네이트는 RRR (D-이성질체)-α-토코페롤의 에스테르 형태이다) 표적 농도는 각각 244 ㎍/ml, 58.6 ㎍/ml 및 33.3 ㎍/ml이다.

표 5 AS03 애주번트 첨가된 저 용량 백신 ( 절반용량의 애주번트 )

Ⅲ.4.2. 백신 투여

백신을 1.25-ml 살균 타입 I (Ph. Eur.) 유리 주사기에 충전시킨다. 각 주사기에 0.57 ml (범위: 0.54-0.60 ml)의 표적물을 채운다. 백신을 비-우성 팔의 어깨세모근 부위에 근내 주사하였다. 모든 백신은 미리-충전된 주사기(0.5 ml)로 제공되었다. 백신의 적합한 IM 주사를 확보하기 위해, 적어도 25G 및 적어도 2.5 cm 길이의 바늘을 이용하였다.

Ⅲ.5. 연구 개체군 결과

총 300명의 피검체가 본 연구에 포함되었다: 3 그룹 각각에 100명의 피검체. 백신접종시 백신접종된 총 코호트의 평균 연령은 36.7세이며 표준 오차가 13.67세였다. 피검체의 평균 연령 및 성별 분포는 3개의 백신 그룹 모두에서 유사하였다.

Ⅲ.6. 면역원성 결과

면역원성을 위한 ATP 코호트 (297명 피검체)에 대하여 면역원성 분석을 수행하였다.

체액 면역 반응

AS03으로 애주번트 첨가된 저 용량 인플루엔자 후보 백신에 의해 유도된 체액 면역 반응을 평가하기 위해, 하기 파라메터 (95% 신뢰 구간을 지님)를 각 처리 그룹에 대해 산출하였다:

·0일 및 21일에 HI 항체 역가의 기하 평균 역가(GMT);

·21일에 혈청전환율(SC);

·21일에 전환 인자;

·0일 및 21일에 보호율.

Ⅲ.6.1. HI 기하 평균 역가 ( GMT )

95% CI를 지니는 HI 항체에 대한 GMT를 표 10 및 도 1에 도시한다. 그룹간 조정된 GMT 비를 표 11에 제시한다.

3개 모두의 백신 균주에 대한 HI 항체의 백신접종-전 GMT는 3개의 처리 그룹에서 동일한 범위 내에 있었다. 조정된 그룹의 경우 21일에 관찰된 GMT는 3개 모두의 균주에 대하여 플루아릭스 그룹 보다 높은 경향이 있으며 A/위스콘신 백신 균주에 대하여 FluLD1/1 및 플루아릭스간에 통계적 유의성이 있다 (95% CI의 중복 없고 조정된 GMT 비는 값 1을 함유하지 않았다). 통계적 유의성이 B/말레이시아 백신 균주에 대하여 FluLD1/2 및 플루아릭스간에도 관찰되었다 (조정된 GMT 비는 값 1을 함유하지 않았다).

표 10 0일 및 21일에 항- HA 항체에 대한 혈청양성율 및 기하 평균 역가( GMT )(면역원성에 대한 ATP 코호트 )

표 11 21일에 각 백신 균주에 대한 그룹간 조정된 GMT 비 (면역원성에 대한 ATP 코호트 )

Ⅲ.6.2. 항- HI 항체 역가의 전환 인자, 혈청보호율 및 혈청전환율(인간에서 인플루엔자 백신에 대해 확립된 보호능과 관련된다)

결과는 혈청보호율에 대하여 표 6-도 2, 혈청전환율에 대하여 표 7-도 3 및 전환 인자에 대하여 표 8-도 4에 기재되어 있다.

혈청보호율에 대하여 유럽 당국에 의해 요구되는 역치 (70%)가 모든 그룹에서 도달되었다 (94.9% 이상). 각 백신 균주에 대하여, 3 그룹의 21일째 혈청보호율은 동일한 범위내에 있었다.

혈청전환율에 대하여 유럽 당국에 의해 요구되는 역치 (40%)가 모든 그룹에서 도달되었다 (65% 이상).

A/뉴 칼레도니아 백신 균주의 경우, 3 그룹의 21일째 SCR은 동일한 범위내에 있었다.

A/위스콘신 백신 균주의 경우, FluLD1/1 그룹에 대한 21일째 SCR은 플루아릭스 그룹에 비해 높게 나타나는 경향이 있었다. FluLD1/2 그룹에 대한 21일째 SCR은 플루아릭스 그룹과 동일한 범위내에 있었다.

B/말레이시아 백신 균주의 경우, FluLD1/2 그룹에 대한 21일째 SCR은 플루아릭스 그룹에 비해 높게 나타나는 경향이 있었다. FluLD1/1 그룹에 대한 21일째 SCR은 플루아릭스 그룹과 동일한 범위내에 있었다.

혈청전환 인자에 대하여 유럽 당국에 의해 요구되는 역치 (2.5)가 모든 그룹에서 도달되었다 (6.2 이상).

A/뉴 칼레도니아 백신 균주의 경우, 3 그룹의 21일째 SCF는 동일한 범위내에 있는 것으로 나타났다. FluLD1/2 그룹에 대해 관찰된 값은 플루아릭스 그룹에 대해 관찰된 값 보다 낮았으나 FluLD1/2 그룹에서의 보다 높은 백신접종-전 혈청보호율로 설명될 수 있었다.

A/위스콘신 백신 균주의 경우, FluLD1/1 그룹의 21일째 SCF는 플루아릭스 그룹에 비해 높게 나타나는 경향이 있었다. FluLD1/2 그룹에 대한 21일째 SCF는 플루아릭스 그룹과 동일한 범위내에 있었다.

B/말레이시아 백신 균주의 경우, 두 애주번트 첨가된 그룹의 21일째 SCF는 플루아릭스 그룹에 비해 높게 나타나는 경향이 있었다.

표 6 0일 및 21일에 HI 항체 역가에 대한 혈청보호율 ( SPR )(면역원성에 대한 ATP 코호트 )

표 7 21일에 HI 항체 역가에 대한 혈청전환율 ( SCR )(면역원성에 대한 ATP 코호트 )

표 8 21일에 HI 항체 역가에 대한 혈청전환 인자 ( SCF )(면역원성에 대한 ATP 코호트)

Ⅲ.7. 안전성 결론

플루아릭스 그룹에 비해 애주번트 첨가된 백신 그룹에서 권유되고 (국소/전신) 및 권유되지 않은 징후와 관련된 높은 반응원성이 본 연구에서 관찰된 전체적인 경향이었다.

애주번트 첨가된 백신 중 AS03 함량의 감소는 전신적이고 국소적인 3 등급 징후에 현저한 영향력을 지녔다.

권유되지 않은 징후의 발생은 플루아릭스 그룹에 비해 (35%) 애주번트 첨가된 백신 그룹에서 (피검체의 55% 및 47%) 높게 나타나는 경향이 있었다.

이러한 결과로부터, 후보 백신의 반응원성 및 안전성 프로필이 만족스럽고 임상적으로 허용될 수 있는 것으로 결론내릴 수 있었다.

Ⅲ.8. 전체 결론

Ⅲ.8.1. 면역원성 결과

본 연구의 1차 목적은 두 상이한 농도의 AS03 애주번트를 지니는 저 용량 인플루엔자 백신 및 플루아릭스에 의해 유도된 체액 면역 반응 (항-HI 항체 역가)을 측정하는 것이었다.

21일에, 3개 백신은 스플리트 비리온 인플루엔자 백신의 연례 기명을 위한 유럽 당국의 요건을 초과하였다 ("Note for Guidance on Harmonisation of Requirements for influenza Vaccines" for the immuno-logical assessment of the annual strain changes -CPMP/BWP214/96). GMT는 플루아릭스 그룹에 비해 애주번트 첨가된 그룹에서 높은 경향이 있으며, A/위스콘신 (FluLD1/1 대 플루아릭스) 및 B/말레이시아 백신 균주 (FluLD1/2 대 플루아릭스)에 대하여 통계적으로 유의한 차 이가 관찰되었다. 유사한 혈청보호율이 3개 모두의 백신 그룹에서 발견되었고 그 범위는 94.9% 내지 99%였다. 혈청전환율 및 혈청전환 인자는 플루아릭스 그룹 보다 애주번트 첨가된 그룹에서 높게 관찰되었다. 이 시험으로부터의 데이터는 절반용량의 AS03 애주번트가 첨가된 백신에 의해 유도된 면역원성이 전체용량의 애주번트로 유도된 면역원성에 필적하였음을 또한 나타내었다.

Ⅲ.8.2. 반응원성 및 안전성 결과

AS03이 애주번트 첨가된 저 용량 인플루엔자 후보 백신의 투여는 본 연구 개체군, 즉 18세 내지 59세의 성인에서 안전하고 임상적으로 잘 관용된다. 절반용량 애주번트 첨가된 백신은 전체용량 애주번트 첨가된 백신에 비해 권유된 국소적 및 전신적 징후의 빈도에 있어서 상당한 감소를 나타내었다.

실시예 Ⅳ - 프라이밍된 BALB /c 마우스에서 애주번트 첨가되고 애주번트 첨가되지 않은 스플리트 인플루엔자 백신 (다양한 용량의 AS03 애주번트 포함)의 임상전 평가

Ⅳ.1. 실험 설계 및 목적

인플루엔자-프라이밍된 마우스에서의 실험을 수행하여 본 수중유 애주번트와 제형화된 인플루엔자 백신에 의해 유도된 AS03에 의한 체액 반응에서의 증가를 평가하였다. 인간 상태를 흉내내기 위해, 이종아형 균주로 프라이밍된 마우스를 이용하여 실험을 수행하였다.

Ⅳ.1.1. 처리/그룹 (표 9)

27마리의 성체 암컷 BALB/c 마우스의 그룹을 0일째에 3가 전(whole), 포르말 린-불활성화된 인플루엔자 바이러스 (각 균주에 대해 5 ㎍의 HA)로 비내 프라이밍시켰다 (20 ㎕의 부피). 프라이밍 균주는 백신에 포함된 것들에 대한 조기 드리프트(earlier drift) 변이체 (5 ㎍의 HA 전 불활성화된 H1N1 A/요하네스버그/82/96, H3N2 A/시드니/5/97, B/하빈/7/94)로 구성되었다. 28일 후, 마우스를 총 50 ㎕ 부피의 단일 용량의 백신 후보로 근내 백신접종하였다. 마우스를 스플리트 항원만을 함유하는 제형 (3가 스플리트 플레인) 또는 두 용량의 AS03 (전체 또는 1/5)으로 애주번트 첨가된 스플리트 항원을 함유하는 제형으로 면역시켰다. 면역화에 이용된 균주는 H1N1 A/뉴 칼레도니아/20/99, H3N2 A/파나마/2007/99, B/산동/7/97 바이러스 항원 (1.5 ㎍/균주, 인간 용량의 1/10)을 포함하였다.

표 9

Ⅳ.1.2. 백신 제형의 제조

트윈 80, 트리톤 X100 및 비타민 E 숙시네이트 (VES)의 프리믹스를 제조하여 최종 농도가 750 ㎍/ml의 트윈 80, 110 ㎍/ml의 트리톤 X100 및 100 ㎍/ml의 VES의 백신에 도달하도록 하였다. 프리믹스에 이용된 양들은 균주에 이미 존재하는 세정제 및 VES의 양을 고려하여 산출되었다.

1 리터의 10배 농축된 염수 완충액 (PBS pH 7.4)의 제조: 0.800 ℓ의 주사용 물에, NaCl 80 g, KCl 2 g, Na₂HPO₄ 11.44 g, KH₂PO₄ 2 g을 첨가한다. 용해시킨 후 주사용 물로 1.0L가 되게 한다. 10배 희석시, pH는 7.4일 것이다.

3가 스플리트 / 플레인

다음 순서에 따라서 50 ㎕의 일 용량 제형을 즉석에서 제조한다: 주사용 물 + 염수 완충액 (10배 농축된 PBS pH 7.4) + 프리믹스, 실온에서 5분 자기 교반, + 1.5 ㎍ HA H1N1 균주, 실온에서 10분 자기 교반, + 1.5 ㎍ HA H3N2 균주, 실온에서 10분 자기 교반, + 1.5 ㎍ HA B 균주, 실온에서 15분 자기 교반. 제조를 완료한 후 1시간 이내에 제형을 주사한다.

3가 스플리트 / AS03

트윈 80, 트리톤 X100 및 비타민 E 숙시네이트 (VES)의 프리믹스를 제조하여 최종 농도가 750 ㎍/ml의 트윈 80, 110 ㎍/ml의 트리톤 X100 및 100 ㎍/ml의 VES의 백신에 도달하게 하였다. 프리믹스에 이용된 양들은 균주에 이미 존재하는 세정제 및 VES의 양을 고려하여 산출되었다.

다음 순서에 따라서 50 ㎕의 일 용량 제형을 즉석에서 제조한다: 주사용 물 + 염수 완충액 (10배 농축된 PBS pH 7.4) + 프리믹스, 실온에서 5분 자기 교반, + 1.5 ㎍ HA H1N1 균주, 실온에서 10분 자기 교반, + 1.5 ㎍ HA H3N2 균주, 실온에서 10분 자기 교반, + 1.5 ㎍ HA B 균주, 실온에서 15분 자기 교반, + 전체용량 AS03의 경우 25 ㎕의 SB62 에멀젼 또는 1/5 용량 AS03의 경우 5 ㎕의 SB62 에멀젼, 실온에서 15분 자기 교반. 제조를 완료한 후 1시간 이내에 제형을 주사한다.

Ⅳ.1.3. 판독 (표 10)

백신접종에 대한 체액 면역 반응을 면역화 전 (28일) 및 면역화 14일 후 (27 마리 마우스/그룹)에 측정하였다. 혈청 샘플을 헤마글루틴화 억제(HI) 시험에 의해 시험하였다.

표 10

판독	시점	샘플 유형	분석 방법
체액 반응	D28, D42	혈청	IHA

Ⅳ.2. 결과

Ⅳ.2.1. 체액 면역성

결과를 도 5에 제공한다. 이종아형 프라이밍 후 단일 백신접종된 마우스 모델에서, AS03 및 이의 희석액은 플레인 백신에 비해 높은 HI 역가를 유도하는 것으로 나타났다. 모든 인플루엔자 A 균주에 대하여, 통계적으로 유의한 HI 역가의 증가가 관찰되었다 (p<0.05). H1N1 균주의 경우, HI 역가에서의 현저한 유의성도 AS03 및 AS03 1/5간에 관찰되었다 (p<0.05). 감소된 용량의 AS03은 3개 모두의 균주에서 플레인 백신에 비해 HI 역가를 증가시키지 못했다. B 균주에 대해서는 매우 낮은 반응이 관찰되었다 (B/산동); 이것은 아마도 프라이밍에 사용된 B 균주 및 백신간의 현저한 항원성 드리프트 때문일 것이다.

Ⅳ.3. 결과 및 결론의 요약

결론적으로, HI 역가의 증가가 플레인 백신과 비교하여 AS03 애주번트 첨가된 백신 이용시 이종아형 균주로 프라이밍된 동물에서 관찰되었다. 전체용량의 AS03이 3개 모두의 인플루엔자 백신 균주에 대해 강한 HI 역가를 수득하는데 최적이었다.

실시예 V - 프라이밍된 C57BI /6 마우스에서 애주번트 첨가되고 애주번트 첨가되지 않은 스플리트 인플루엔자 백신 (다양한 용량의 AS03 애주번트 포함)의 임상전 평가

V.1. 실험 설계 및 목적

인플루엔자-프라이밍된 마우스에서의 실험을 수행하여 본 수중유 애주번트와 제형화된 인플루엔자 백신에 의해 유도된 AS03에 의한 체액 및 세포 반응에서의 증가를 평가하였다.

인간 상태를 흉내내기 위해, 이종아형 균주로 프라이밍된 마우스를 이용하여 실험을 수행하였다.

V.1.1. 처리/그룹 (표 11)

25마리의 성체 암컷 C57BI/6 마우스의 그룹을 0일째에 3가 전(whole), 포르말린-불활성화된 인플루엔자 바이러스 (각 균주에 대해 5 ㎍의 HA)로 비내 프라이밍시켰다 (20 ㎕의 부피). 프라이밍 균주는 백신에 포함된 것들에 대한 조기 드리프트 변이체 (5 ㎍의 HA 전 불활성화된 H1N1 A/베이징/262/95, H3N2 A/파나마/2007/99, B/산동/7/97)로 구성되었다. 28일 후, 마우스를 총 100 ㎕ 부피의 단일 용량의 백신 후보로 근내 백신접종하였다. 마우스를 스플리트 항원만을 함유하는 제형 (3가 스플리트 플레인) 또는 세 용량의 AS03 (전체, 1/2 또는 1/5)으로 애주번트 첨가된 스플리트 항원을 함유하는 제형으로 면역시켰다. 면역화에 이용된 균주는 H1N1 A/뉴 칼레도니아/20/99, H3N2 A/뉴욕/55/2004, B/지앙수/10/2003 바이러스 항원 (1.5 ㎍/균주, 인간 용량의 1/10)을 포함하였다.

표 11

V.1.2. 백신 제형의 제조

3가 스플리트 / 플레인

다음 순서에 따라서 100 ㎕의 일 용량 제형을 즉석에서 제조한다: 주사용 물 + 염수 완충액 (실시예 Ⅳ에 교시된 대로 제조된 10배 농축된 PBS pH 7.4) + 플루아릭스 임상 로트 DFLUA014 (최종 용량 중 균주 당 1.5 ㎍).

3가 스플리트 / AS03

다음 순서에 따라서 100 ㎕의 일 용량 제형을 즉석에서 제조한다: 주사용 물 + 염수 완충액 (실시예 IV에 교시된 대로 제조된 10배 농축된 PBS pH 7.4) + 플루아릭스 임상 로트 DFLUA014 (최종 용량 중 균주 당 1.5 ㎍) + 전체용량의 경우 25 ㎕의 SB62 에멀젼 또는 1/2 용량의 경우 12.5 ㎕의 SB62 에멀젼 또는 1/5 용량의 경우 5 ㎕의 SB62 에멀젼. 제조를 완료한 후 1시간 이내에 제형을 주사한다.

V.1.3. 판독 (표 12)

백신접종에 대한 체액 면역 반응을 면역화 21일 후 (10마리 마우스/그룹)에 측정하였고, 혈청 샘플을 헤마글루틴화 억제(HI) 시험에 의해 시험하였다. 세포 면역 반응을 세포내 시토킨 염색(ICS)에 의해 면역화 7일 후에 시험하였다.

표 12

판독	시점	샘플 유형	분석 방법
체액 반응	D49	혈청	IHA
세포 반응	D35	PBMC	ICS

V.2. 결과

V.2.1. 체액 면역성 (10마리 마우스/그룹)

결과를 도 6에 제공한다. 이종아형 프라이밍 후 단일 백신접종된 마우스 모델에서, AS03 및 이의 희석액(1/2 및 1/5)은 플레인 백신에 비해 높은 HI 역가를 유도하는 것으로 나타났다. 3개 모두의 균주에 대하여, 전체용량 AS03 또는 감소된 용량의 AS03으로 애주번트 첨가된 백신을 투여받은 마우스 간에 HI 역가의 차이는 관찰되지 않았다.

V.2.2. 세포 면역성 (15마리 마우스/그룹)

결과를 도 7에 제공한다. AS03의 희석과 무관하게, 3가 스플리트 플레인으로 면역된 마우스에 비해 AS03-애주번트 첨가된 3가 스플리트 백신으로 면역된 마우스에서 보다 높은 CD4+ T 세포 반응이 관찰되었다. 전체용량의 AS03으로 애주번트 첨가된 3가 스플리트로 면역된 마우스에서 유도된 반응에 비해, 마우스를 저 용량의 AS03으로 애주번트 첨가된 3가 스플리트로 면역시킬 때, 더 낮은 세포 반응의 경향이 관찰되었다.

V.3. 결과 및 결론의 요약

결론적으로, 체액 및 세포 반응의 증가가 플레인 백신과 비교하여 AS03 애주 번트 첨가된 백신 이용시 이종아형 균주로 프라이밍된 동물에서 관찰되었다. 유사한 크기의 체액 반응이 전체용량 또는 부분용량의 AS03 애주번트로 면역화된 마우스 간에 관찰되었다. 그러나, 애주번트 용량의 감소는 CD4+ T 세포 반응의 크기를 감소시키는 경향과 관련되었다.

실시예 Ⅵ - 프라이밍된 C57BI/6 마우스에서 애주번트 첨가되고 애주번트 첨가되지 않은 스플리트 인플루엔자 백신 (다양한 용량의 AS03 애주번트 및 저 용량 항원 포함)에 의해 유도된 세포 면역 반응의 임상전 평가

Ⅵ.1. 실험 설계 및 목적

인플루엔자-프라이밍된 마우스에서의 실험을 수행하여 저 용량 항원을 함유하고 (0.5 ㎍/균주, 인간 용량의 1/30) 본 수중유 애주번트와 제형화된 인플루엔자 백신에 의해 유도된 AS03에 의한 세포 면역 반응에서의 증가를 평가하였다.

Ⅵ.1.1. 처리/그룹 (표 13)

15마리의 성체 암컷 C57BI/6 마우스의 그룹을 0일째에 3가 전(whole), 포르말린-불활성화된 인플루엔자 바이러스 (각 균주에 대해 5 ㎍의 HA)로 비내 프라이밍시켰다 (20 ㎕의 부피). 프라이밍 균주는 백신에 포함된 것들에 대한 조기 드리프트 변이체 (5 ㎍의 HA 전 불활성화된 H1N1 A/베이징/262/95, H3N2 A/파나마/2007/99, B/산동/7/97)로 구성되었다. 28일 후, 마우스를 총 50 ㎕ 부피의 단일 용량의 백신 후보로 근내 백신접종하였다. 마우스를 스플리트 항원만을 함유하는 제형 (3가 스플리트 플레인) 또는 세 용량의 AS03 (전체, 1/2 또는 1/5)으로 애주번트 첨가된 스플리트 항원을 함유하는 제형으로 면역시켰다. 면역화에 이용된 균주는 H1N1 A/뉴 칼레도니아/20/99, H3N2 A/뉴욕/55/2004, B/지앙수/10/2003 바이러스 항원 (0.5 ㎍/균주, 인간 용량의 1/30)을 포함하였다.

표 13

Ⅵ.1.2. 백신 제형의 제조

3가 스플리트 / 플레인

다음 순서에 따라서 50 ㎕의 일 용량 제형을 즉석에서 제조한다: 주사용 물 + 염수 완충액 (실시예 Ⅳ에 교시된 대로 제조된 10배 농축된 PBS pH 7.4) + 플루아릭스 임상 로트 DFLUA014 (최종 용량 중 균주 당 0.5 ㎍).

3가 스플리트 / AS03

다음 순서에 따라서 50 ㎕의 일 용량 제형을 즉석에서 제조한다: 주사용 물 + 염수 완충액 (실시예 IV에 교시된 대로 제조된 10배 농축된 PBS pH 7.4) + 플루아릭스 임상 로트 DFLUA014 (최종 용량 중 균주 당 0.5 ㎍) + 전체용량의 경우 25 ㎕의 SB62 에멀젼 또는 1/2 용량의 경우 12.5 ㎕의 SB62 에멀젼 또는 1/5 용량의 경우 5 ㎕의 SB62 에멀젼. 제조를 완료한 후 1시간 이내에 제형을 주사한다.

Ⅵ.1.3. 판독 (표 14)

세포 면역 반응을 세포내 시토킨 염색에 의해 면역화 7일 후에 시험하였다.

표 14

판독	시점	샘플 유형	분석 방법
세포 반응	D35	PBMC	ICS

Ⅵ.2. 결과

Ⅵ.2.1. 세포 면역성

결과를 도 8에 제공한다. 약간 더 높은 CD4+ T 세포 반응이 3가 스플리트 플레인으로 면역된 마우스에 비해 AS03 (전체 또는 1/2 용량)으로 애주번트 첨가된 3가 스플리트 백신으로 면역된 마우스에서 관찰되었다. 3가 스플리트 플레인으로 면역되거나 전체용량 또는 절반용량의 AS03으로 애주번트 첨가된 마우스에서 유도된 반응에 비해, 마우스를 1/5의 AS03 용량으로 애주번트 첨가된 3가 스플리트로 면역시킬 때, 더 높은 세포 반응이 관찰되었다.

Ⅵ.3. 결과 및 결론의 요약

결론적으로, CD4+ T 세포 반응에서의 최소 증가가 플레인 백신과 비교하여 AS03 애주번트 첨가된 백신 이용시 이종아형 균주로 프라이밍된 동물에서 관찰되었다. 이 실험에서 어떠한 애주번트 용량 반응도 관찰되지 않았고, 실제로 1/5의 AS03 용량이 더 높은 애주번트 용량에서 나타난 것 보다 높은 항원 특이적인 CD4+ T 세포의 빈도를 유도하였다. 전반적인 이러한 데이터는 다른 임상전 실험과 일치하지 않으며 특정 실험의 기술적 문제로 제안될 수 있다.

실시예 Ⅶ - 나이브 C57BI /6 마우스에서 애주번트 첨가되고 애주번트 첨가되지 않은 스플리트 H5N1 백신 (다양한 용량의 AS03 애주번트 및 항원 포함)의 임상 전 평가

Ⅶ.1. 실험 설계 및 목적

H5N1-나이브 마우스에서의 실험을 수행하여 본 수중유 애주번트와 제형화된 H5N1 스플리트 백신에 의해 유도된 AS03에 의한 체액 및 세포 면역 반응에서의 증가를 평가하였다. 범유행성(pandemic)의 경우에, 전세계의 개체군이 새롭게 순환되는 범유행성 인플루엔자 균주에 면역학적으로 나이브일 것으로 예상된다. 이 나이브 면역 상태로 인해, 범유행성 백신은 개체를 감염 및 새로운 인플루엔자 균주에 의해 야기된 심각한 질병으로부터 보호하기 위해 두 백신 용량을 요구할 것이다. 이러한 사전 노출의 결여를 나타내기 위해, 백신 면역원성을 평가하는 나이브 마우스 모델을 개발하였다.

Ⅶ.1.1. 처리/그룹 (표 15)

15마리의 성체 나이브 암컷 C57BI/6 마우스의 그룹을 0일 및 28일에 총 부피가 50 ㎕인 범유행성 H5N1 백신 후보로 근내 면역시켰다. 마우스를 스플리트 H5N1 항원만을 함유하는 제형 (H5N1 스플리트 플레인) 또는 상이한 용량의 AS03 (이중, 전체, 1/2 또는 1/5)으로 애주번트 첨가된 스플리트 항원을 함유하는 제형으로 면역시켰다. 면역화에 사용된 균주는 H5N1 A/베트남/1194/04 바이러스 항원 (인간 용량의 1/10에 상응하는 1.5 또는 0.38 ㎍/균주)을 포함하였다.

어떠한 제형도 이중 AS03 용량으로 수행되지 않았고 오히려 하나의 50 ㎕ H5N1 스플리트/AS03 전체용량 + 하나의 50 ㎕ 용량 AS03을 동반주사하였다.

표 15

Ⅶ.1.2. 백신 제형의 제조

1 리터의 최종 벌크 완충액 (PBS pH 7.2±0.2)의 제조: 0.800 ℓ의 주사용 물에, NaCl 7.699 g, KCl 0.200 g, MgCl₂ x 6H₂O 0.100 g, Na₂HPO₄ x 12H₂O 2.600 g, KH₂PO₄ 0.373 g을 첨가한다. 용해시킨 후 주사용 물로 1.0L가 되게 한다.

H5N1 스플리트 / 플레인

50 ㎕ 용량의 제조:

티오메르살 (균주에서의 이의 농도를 고려한 양) 및 트리톤 X100을 최종 벌크 완충액에 첨가하였다. 제형 중의 함량 표적이 균주의 트윈 농도에 도달하였으므로 트윈 80을 첨가하지 않았다. 최종 농도는 1.5 ㎍의 제형 용량 중 티오메르살 10 ㎍/ml, 트윈 80 368 ㎍/ml 및 트리톤 X100 35 ㎍/ml이다. 0.38 ㎍의 제형 용량에서 최종 농도는 티오메르살 10 ㎍/ml, 트윈 80 93 ㎍/ml 및 트리톤 X100 8.9 ㎍ /ml이다. 5-30분간 자기 교반시킨 후, 1.5 또는 0.38 ㎍의 HA (H5N1 균주)를 첨가하였다. 제형을 30-60분 동안 교반하였다. pH를 조사하였다. 제형화를 완료한 지 1시간 내에 주사한다.

H5N1 스플리트 / AS03

50 ㎕ 용량의 제조:

티오메르살 (균주에서의 이의 농도를 고려한 양) 및 트리톤 X100을 최종 벌크 완충액에 첨가하였다. 제형 중의 함량 표적이 균주의 트윈 농도에 도달하였으므로 트윈 80을 첨가하지 않았다. 최종 농도는 1.5 ㎍의 제형 용량 중 티오메르살 10 ㎍/ml, 트윈 80 368 ㎍/ml 및 트리톤 X100 35 ㎍/ml이다. 0.38 ㎍의 제형 용량에서 최종 농도는 티오메르살 10 ㎍/ml, 트윈 80 93 ㎍/ml 및 트리톤 X100 8.9 ㎍/ml이다. 5-30분간 자기 교반시킨 후, 1.5 또는 0.38 ㎍의 HA (H5N1 균주)를 첨가하였다. 제형을 30-60분 동안 자기 교반시킨 후, 25 또는 12.5 또는 5 ㎕의 SB62 에멀젼을 첨가하였다. 제형을 30-60분간 교반하였다. pH를 조사하였다. 제형화를 완료한 지 1시간 내에 주사한다.

Ⅶ.1.3. 판독 (표 16)

체액 면역 반응을 면역화 14일 후에 (10마리의 마우스/그룹) 항-Ig, IgG1 및 IgG2b 항체 역가에 의해 측정하였다 (도 9, A-F). 체액 면역 반응을 면역화 21일 후에도 (10마리의 마우스/그룹) 항-H5N1 헤마글루티닌화 억제 검정에 의해 측정하였다 (도 10, A-B).

세포 면역 반응을 면역화 6일 후 (그룹 당 3마리 마우스의 5개 풀) 유동세포분석법에 의해 계산된 항원-특이적인 CD4+ T 세포의 세포내 시토킨 염색(ICS)에 의해 시험하였다 (도 11, A-B).

표 16

판독	시점	샘플 유형	분석 방법
체액 반응	D39	혈청	ELISA, 이소형 및 HI 역가
세포 반응	D34	PBMC	ICS

Ⅶ.2. 결과

Ⅶ.2.1. 체액 면역 반응: ELISA 및 이소형

결과를 도 9에 제공한다.

각 용량의 H5N1 스플리트 백신에서, 모든 애주번트 첨가된 그룹이 애주번트 첨가되지 않은 H5N1 스플리트 백신에 비해 높은 항-H5N1 Ig, IgG1 및 IgG2b 항체 역가를 유도하였다 (도 9 -A 내지 F).

각 용량의 H5N1 스플리트 백신; 항-H5N1 IgG1 항체 반응은 항-H5N1 IgG2b 항체 반응 보다 4-5배 더 높았다 (도 9 -C 내지 F). 1.5 ㎍ HA의 H5N1 스플리트 백신의 용량 및 각 용량의 애주번트 조합시에, 항-H5N1 Ig, IgG1 및 IgG2b 항체 반응의 어떠한 차이도 관찰되지 않았다 (도 9-A, C 및 E).

0.38 ㎍ HA의 H5N1 스플리트 백신의 용량에서, 2x-전체용량으로 애주번트 첨가된 H5N1 스플리트 백신으로 면역화시킨 후에 AS03/2 (p=0.7315) 및 AS03 1/5 (p=0.9744)로 애주번트 첨가된 H5N1 스플리트 백신에 의해 유도된 반응에 비해 더 높은 경향의 항-H5N1 Ig 역가가 관찰되었다 (도 9-B). 이러한 경향은 항-H5N1 IgG1 항체 반응에서도 관찰되었다 (도 9-D). 그러나, 통계적인 유의성이 관찰될 정도로 세기가 충분하지 않았다 (1.7배 차이에 대해 25% 세기, 또는 2배 차이에 대해 47%).

Ⅶ.2.2. 체액면역 반응: HI 역가

1.5 ㎍ HA /마우스의 용량에 관해서:

각 애주번트 용량에서, AS03-애주번트 첨가된 H5N1 스플리트 백신으로 면역된 모든 마우스가 애주번트 첨가되지 않은 H5N1 스플리트 백신으로 면역된 마우스에서 수득된 반응에 비해 높은 HI 역가를 유도하였다 (도 10-A). H5N1 스플리트 백신에 용량 범위의 AS03을 애주번트 첨가했을 때 HI 역가의 어떠한 차이도 관찰되지 않았다 (도 10-A).

용량 당 0.38 ㎍ HA 의 용량에 관해서:

각 애주번트 용량에서, AS03-애주번트 첨가된 H5N1 스플리트 백신으로 면역된 모든 마우스가 애주번트 첨가되지 않은 H5N1 스플리트 백신으로 면역된 마우스에서 수득된 반응에 비해 높은 HI 역가를 유도하였다 (도 10B).

현저하게 더 높은 HI 역가가 AS03/2로 애주번트 첨가된 H5N1 스플리트 백신에서 관찰된 반응에 비해 2x 전체용량의 AS03이 애주번트 첨가된 H5N1 스플리트 백신에서 관찰되었다 (4배 차이의 경우 p=0.032)(도 10B).

2x 전체용량의 AS03 또는 전체용량의 AS03으로 애주번트 첨가된 H5N1 스플리트 백신으로 면역된 마우스 또는 AS03/2 또는 AS03/5로 애주번트 첨가된 H5N1 스플리트 백신으로 면역된 마우스간에 HI 역가의 어떠한 차이도 관찰되지 않았다 (도 10B).

항원 용량간 비교 (1.5 ㎍ 또는 0.38 ㎍):

AS03, AS03/2 또는 AS03/5로 애주번트 첨가된 각 HA 용량의 H5N1 스플리트 백신으로 면역된 마우스간에 HI 역가의 어떠한 차이도 관찰되지 않았으나, AS03/5로 애주번트 첨가된 1.5 ㎍ HA의 스플리트 H5N1으로 면역된 마우스와 2x 전체용량AS03으로 애주번트 첨가된 0.38 ㎍ HA의 스플리트 H5N1으로 면역된 마우스간에는 차이가 있었다 (도 10). HI 역가는 더 낮은 애주번트 용량과 조합된 보다 높은 항원 용량에 비해 2x 전체용량의 AS03으로 애주번트 첨가된 0.38 ㎍ HA의 스플리트 H5N1으로 면역된 이후에 현저히 더 높았다 (AS03/5와 함께 1.5 ㎍ HA, 4배 차이에 대해 p=0.0193)(도 10).

Ⅶ.2.3. 세포 면역 반응

결과를 도 11에 제공한다.

각 용량의 H5N1 스플리트 백신 (1.5 또는 0.38 ㎍)에서 더 높은 CD4+ T 세포 반응이 애주번트 첨가되지 않은 H5N1 스플리트 백신으로 면역된 마우스에 비해 다양한 용량의 AS03으로 애주번트 첨가된 H5N1 스플리트 백신으로 면역된 마우스에서 관찰되었다 (도 11).

각 용량의 1.5 ㎍ H5N1 스플리트 백신에서, AS03 용량의 감소는 CD4+ T 세포 빈도의 감소에 상응하였다 (도 11A). 그러나, 0.38 ㎍ H5N1 스플리트 백신의 용량에서, CD4+ T 세포 반응의 어떠한 차이도 AS03-애주번트 첨가된 H5N1 스플리트 백신으로 면역된 마우스에서 상이한 애주번트 용량간에 관찰되지 않았다 (도 11B).

Ⅶ.3. 결과 및 결론의 용약

마우스에서의 면역원성 연구는, 애주번트 첨가된 H5N1 스플리트 백신이 애주번트 첨가되지 않은 H5N1 스플리트 백신에 의해 유도된 반응들에 비해 현저하게 더 높은 체액 (항-H5N1 ELISA 및 HI 역가) 및 세포 (CD4+ T 세포) 반응을 유도하였음을 나타내었다.

1.5 ㎍ 및 0.38 ㎍ 애주번트 첨가된 H5N1 스플리트 백신으로 면역된 마우스간에 체액 면역 반응에 있어서의 어떠한 항원 용량 반응 효과가 관찰되지 않았는데, 이는 상기 모델에서 용량 반응 효과를 관찰하기 위해서는 애주번트의 존재하에 심지어 더 낮은 용량의 HA가 요구될 수 있음을 시사한다.

CD4+ T 세포 반응에서의 강력한 증가가 플레인 H5N1 백신에 비해 AS03 애주번트 첨가된 H5N1 범유행성 백신 이용시 나이브 마우스에서 관찰되었다. 0.38 ㎍의 H5N1 스플리트 백신의 용량을 후보 백신으로 이용할 때 AS03 희석의 영향은 관찰되지 않았으나, 1.5 ㎍의 H5N1 스플리트 백신을 감소된 용량의 AS03으로 애주번트 첨가했을 때 CD4 T 세포 반응의 감소가 관찰되었다.

이전에 관찰된 대로, 체액 및 세포 면역 반응에서의 어떠한 차이도 전체용량의 AS03 또는 AS03/2로 애주번트 첨가된 H5N1 스플리트 백신 (어떠한 항원 용량에서)으로 면역된 마우스간에 관찰되지 않았다. 면역 반응에서의 일부 개선이 2x 전체용량 AS03을 백신 제형에 이용한 경우에 검출되었고, 따라서 면역 반응에서의 감소가 AS03/5을 백신 제형에 이용했을 때 검출되었다.

전체적으로, 여기에 보고된 데이터는 상기 백신 제형에서의 본 신규한 애주 번트 시스템의 효능을 지지한다.

실시예 Ⅷ - 프라이밍된 대백돈(Large White pig)에서 애주번트 첨가되고 애 주번트 첨가되지 않은 인플루엔자 백신의 임상전 평가

Ⅷ.1. 실험 설계 및 목적

인플루엔자-프라이밍된 돼지에서의 실험을 수행하여 본 수중유 애주번트와 제형화된 인플루엔자 백신에 의해 유도된 AS03에 의한 체액 반응에서의 증가를 평가하였다.

돼지를 이용하여 인간에 근접한 동물 모델에서 용량 범위의 AS03을 평가하였다. 돼지는 긴 목록의 생물학적 유사성을 나타내며, 이것은 돼지가 예외가 극히 적은 생리학적으로 사람에 가장 근접한 동물임을 확인시켜 준다 (Douglas R., 1972). 더욱이, 돼지에서 인플루엔자 감염의 표시가 상례로 관찰된다.

Ⅷ.1.1. 처리/그룹 (표 17)

10마리의 성체 암컷 대백돈의 그룹을 0일째에 총 부피가 200 ㎕인 3가 전(whole), 포르말린-불활성화된 인플루엔자 바이러스 (각 균주에 대해 25 ㎍의 HA)로 비내 프라이밍시켰다. 프라이밍 균주는 백신 균주와 상동인 균주로 구성되었다 (25 ㎍의 HA 전 불활성화된 H1N1 A/뉴 칼레도니아/20/99, H3N2 A/파나마/2007/99 및 B/산동/7/97)로 구성되었다. 28일 후, 돼지를 총 500 ㎕ 부피의 단일 용량의 백신 후보로 근내 백신접종하였다. 돼지를 스플리트 항원만을 함유하는 제형 (3가 스플리트 플레인) 또는 용량 범위의 AS03 (전체, 1/2 또는 1/5)으로 애주번트 첨가된 스플리트 항원을 함유하는 제형으로 면역시켰다. 면역화에 이용된 균주는 H1N1 A/뉴 칼레도니아/20/99, H3N2 A/파나마/2007/99 및 B/산동/7/97 바이러스 항원 (일 인간 용량으로서 H1N1 A/뉴 칼레도니아/20/99, H3N2 A/파나마/2007/99 균주에 대해 15 ㎍, 및 B/산동/7/97 균주에 대해 17.5 ㎍)을 포함하였다.

그룹 (10마리 돼지/그룹):

표 17

Ⅷ.1.2. 백신 제형의 제조

3가 스플리트 / 플레인

트윈 80, 트리톤 X100 및 비타민 E 숙시네이트 (VES)의 프리믹스를 제조하여 최종 농도가 750 ㎍/ml의 트윈 80, 110 ㎍/ml의 트리톤 X100 및 100 ㎍/ml의 VES의 백신에 도달하도록 하였다. 프리믹스에 이용된 양들은 균주에 대한 이들의 함량을 고려한 것이다.

다음 순서에 따라서 500 ㎕의 일 용량 제형을 즉석에서 제조한다: 주사용 물 + 염수 완충액 (실시예 Ⅳ에 교시된 대로 제조된 10배 농축된 PBS pH 7.4) + 프리믹스, 실온에서 5분간 자기 교반, + 15 ㎍ HA H1N1 균주, 실온에서 10분간 자기 교반, + 15 ㎍ HA H3N2 균주, 실온에서 10분간 자기 교반, + 17.5 ㎍ HA B 균주, 실온에서 15분간 자기 교반. 제조를 완료한 후 1시간 이내에 제형을 주사한다.

3가 스플리트 / AS03

다음 순서에 따라서 500 ㎕의 일 용량 제형을 즉석에서 제조한다: 주사용 물 + 염수 완충액 (실시예 Ⅳ에 교시된 대로 제조된 10배 농축된 PBS pH 7.4) + 프리믹스, 실온에서 5분간 자기 교반, + 15 ㎍ HA H1N1 균주, 실온에서 10분간 자기 교반, + 15 ㎍ HA H3N2 균주, 실온에서 10분간 자기 교반, + 17.5 ㎍ HA B 균주, 실온에서 15분간 자기 교반, + 250 ㎕의 전체용량 AS03에 대한 SB62 에멀젼 또는 125 ㎕의 1/2 용량 AS03에 대한 SB62 에멀젼 또는 50 ㎕의 1/5 용량 AS03에 대한 SB62 에멀젼, 실온에서 15분간 자기 교반. 제조를 완료한 후 1시간 이내에 제형을 주사한다.

Ⅷ.1.3. 판독 (표 18)

백신접종에 대한 체액 면역 반응을 비내 프라이밍 전 (0일), 면역화 전 (28일) 및 면역화 14일 후 (10마리 돼지/그룹)에 측정하였다. 혈청 샘플을 헤마글루틴화 억제 (HI) 시험에 의해 시험하였다.

표 18

판독	시점	샘플 유형	분석 방법
체액 반응	D0, D28, D42	혈청	IHA

Ⅷ.2. 결과 및 결론

Ⅷ.2.1. 체액 면역성

결과를 도 12에 제공한다. 애주번트의 희석과 무관하게, AS03 애주번트 첨가된 3가 스플리트 제형은, 비록 3개 모두의 균주에서 항상 통계적 유의성에 도달하지는 않았으나, 이종성 프라이밍의 모델에서 플레인 3가 제형에 비교하여 모든 균주에 대해 더 강한 HI 반응을 유도하였다. 애주번트 용량 효과가 균주마다 다소 상이하게 관찰되었다. B/산동과 같이 덜 면역원성인 균주의 경우, 전체용량의 AS03으로 애주번트 첨가된 3가 스플리트 백신만이 플레인 백신과 현저하게 상이하였다. 전체용량의 AS03으로 애주번트 첨가된 3가 스플리트 백신과 대조적으로, 감소된 용량의 AS03은 3개 모두의 균주에 대하여 플레인 백신에서 보여진 것들을 초과하여 HI 역가를 증가시키지 못했다.

Claims

항원 또는 항원 조성물, 및 수중유 에멀젼으로 구성된 애주번트 조성물을 포함하는 면역원성 조성물로서, 여기서 상기 수중유 에멀젼은 인간 용량 당 1-6mg의 스쿠알렌, 1-7mg의 토콜 및 0.4-3mg의 에멀젼화제를 포함하는 면역원성 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 토콜이 알파-토코페롤인 면역원성 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 에멀젼화제가 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트인 면역원성 조성물.
제 3항에 있어서, 상기 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트가 폴리소르베이트? 80 또는 트윈· 80을 포함하는 군으로부터 선택되는 면역원성 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 백신 조성물 부피가 0.4 내지 1.5 ml인 면역원성 조성물.
제 5항에 있어서, 상기 용량 부피가 0.5 ml인 면역원성 조성물.
제 5항에 있어서. 상기 용량 부피가 0.7 ml인 면역원성 조성물.
제 5항에 있어서, 상기 용량 부피가 1.0 ml인 면역원성 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 항원 또는 항원성 조성물이 인플루엔자 바이러스로부터 제조되는 면역원성 조성물.
삭제
질환 또는 질병의 예방 요법 또는 치료법에 사용되는 제 1항에 따른 면역원성 조성물.
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제