BRPI0717219B1

BRPI0717219B1 - composição imunogênica, e, uso de uma composição imunogênica

Info

Publication number: BRPI0717219B1
Application number: BRPI0717219-2A
Authority: BR
Inventors: William Ripley Ballou, Jr.; Emmanuel Jules Hanon
Original assignee: Glaxosmithkline Biologicals S.A.
Priority date: 2006-10-12
Filing date: 2007-10-10
Publication date: 2021-01-19
Also published as: EA015817B1; KR101151202B1; IL197512A; NO20091022L; DK2086582T3; ES2397714T3; JP5230632B2; CN101522218B; MX2009003325A; JP2010505907A; US9700605B2; US20100183667A1; CR10726A; PT2086582E; JP2013067646A; CA2664619A1; HRP20130023T1; KR20090066323A; WO2008043774A1; BRPI0717219B8

Abstract

COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, E, USO DE UMA COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA. A presente invenção proporciona composição imunogênica compreendendo um antígeno ou composição de antígeno e composição adjuvante compreendendo uma emulsão de Óleo-em-água, sendo quantidade efetiva a dita emulsão de Óleo-em-água compreende 0,5 - 10 mg de Óleo metabolizável, 0,5 - 11 mg de tocol e 0,1 - 4 mg de agente emulsificador, por dose para humano.

Description

CAMPO TÉCNICO

[001] A presente invenção refere-se às composições imunogênicas e de vacina aperfeiçoadas e ao seu uso em medicina. Em particular a invenção refere-se às formulações imunogênicas ou de vacina compreendendo um adjuvante de emulsão de óleo-em-água e ao seu uso em medicina, em particular ao seu uso em aumento de respostas imunes a vários antígenos, e aos métodos de preparação, sendo que a emulsão de óleo-em-água compreende um tocol, um óleo metabolizável e um agente emulsificador.

FUNDAMENTO TÉCNICO

[002] Composições ou vacinas novas com uma imunogenicidade aperfeiçoada são sempre necessárias. Como uma estratégia, adjuvantes têm sido usados para tentar e melhorar a resposta imune produzida por qualquer antígeno dado e/ou para reduzir reatogenicidade / toxicidade no hospedeiro.

[003] Emulsões de óleo-em-água per se são bem conhecidas na arte, e têm sido sugeridas em serem úteis como composições de adjuvante (EP 399843; WO 95/17210).

[004] WO 95/17210 mostra emulsões de óleo-em-água compreendendo de 2 a 10% de esqualeno, de 2 a 10% de alfa-tocoferol, e de 0,3 a 3% de tween 80 e seu uso sozinhas ou em combinação com QS21 e/ou 3D-MPL.

[005] WO 99/12565 mostra composições de emulsão de óleo-em- água compreendendo um óleo metabolizável, uma saponina e um esterol. As emulsões de óleo-em-água adicionalmente compreendem 3D-MPL.

[006] WO 99/11241 mostra emulsões de óleo-em-água compreendendo óleo metabolizável e uma saponina, sendo que o óleo e a saponina estão presentes em uma razão de entre 1:1 e 200:1.

[007] Ainda há uma necessidade de composições imunogênicas e de vacina aperfeiçoadas que proporcionem uma resposta imune adequada e sejam menos reatogênicas no hospedeiro.

DECLARAÇÃO DA INVENÇÃO

[008] Os presentes inventores têm descoberto que composições imunogênicas ou de vacina compreendendo quantidades menores de cada componente da emulsão de óleo-em-água podem ser usadas mantendo simultaneamente uma resposta imune comparável contra um antígeno ou uma composição antigênica dentro de dita composição. Isto traz a vantagem de manter o nível de imunogenicidade contra um antígeno enquanto que a reatogenicidade dentro do paciente recipiente hospedeiro é reduzida.

[009] Conseqüentemente, no primeiro aspecto da presente invenção, é proporcionada uma composição imunogênica compreendendo um antígeno ou uma composição antigênica, e uma composição adjuvante compreendendo uma emulsão de óleo-em-água, sendo que dita emulsão de óleo-em-água compreende 0,5 -10 mg de óleo metabolizável, 0,5 - 11 mg de tocol e 0,4 - 4 mg de agente emulsificador, por dose para humano.

[0010] Em outro aspecto da presente invenção, é proporcionada uma composição de vacina compreendendo um antígeno ou uma composição antigênica, e uma composição adjuvante compreendendo uma emulsão de óleo-em-água, sendo que dita emulsão de óleo-em-água compreende 0,5 - 10 mg de óleo metabolizável, 0,5 - 11 mg de tocol e 0,4 - 4 mg de agente emulsificador, por dose para humano.

[0011] Em um outro aspecto da invenção é proporcionado o uso de uma composição imunogênica ou de vacina compreendendo um antígeno ou uma composição antigênica, e uma composição adjuvante compreendendo uma emulsão de óleo-em-água sendo que dita emulsão de óleo-em-água compreende 0,5 - 10 mg de óleo metabolizável, 0,5 - 11 mg de tocol e 0,4 - 4 mg de agente emulsificador na manufatura de uma composição imunogênica para a prevenção de infecção e/ou doença.

[0012] Em um outro aspecto, é proporcionado um método ou uso como definido acima, para proteção contra infecção ou doença causada por um patógeno que uma variante do patógeno do qual o antígeno na composição imunogênica é derivado. Em outra modalidade, é proporcionado um método ou uso como definido acima para proteção contra infecções ou doença causadas por um patógeno que compreende um antígeno que é uma variante daquele antígeno na composição imunogênica.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0013] Figura 1: Teste clínico: Média Geométrica de títulos (GMTs) para anticorpo anti-HA em instantes de tempo diferentes (coorte de ATP para imunogenicidade).

[0014] Figura 2: Teste clínico: taxa de soroproteção (SPR) para título de anticorpo anti-HI com intervalo de confiança (IC) de 95% em dia 0 e dia 21 (coorte ATP para imunogenicidade).

[0015] Figura 3: Teste clínico: taxa de soroconversão (SCR) para título de anticorpo anti-HI com intervalo de confiança de 95% em dia 21 (coorte ATP para imunogenicidade).

[0016] Figura 4: Teste clínico: fator de soroconversão (SCF) para título de anticorpo anti-HI com intervalo de confiança de 95% em dia 21 (coorte ATP para imunogenicidade).

[0017] Figura 5: Estudo em camundongos: Teste de inibição de hemaglutinina (GMT +/- IC95) em camundongos BALB/c inoculados com cepas hetero-subtípicas (faixa de dose AS03). Figura 5A: Títulos de anti- A/New Caledonia/20/99 HI; Figura 5B: Títulos de anti-A/Panama/2007/99 HI. Figura 5C: Títulos de anti-B/Shandong/7/97 HI.

[0018] Figura 6: Estudo em camundongos: Teste de inibição de hemaglutinina (GMT +/- IC95) em camundongos BALB/c inoculados com cepas hetero-subtípicas (faixa de dose AS03).

[0019] Figura 7: Estudo em camundongos: Resposta imune celular (célula-T CD4+) em PBMC de camundongos C57BI/6 inoculados com cepas hetero-subtípicas (faixa de dose AS03).

[0020] Figura 8: Estudo em camundongos: Resposta imune celular (célula-T CD4+) em PBMC de camundongos C57BI/6 inoculados com cepas hetero-subtípicas e imunizados com antígeno em dose baixa (0,5 μg) adjuvantado com faixa de dose AS03.

[0021] Figura 9: Estudo em camundongos: Títulos de Ig de soro específica para H5N1 em ELISA (A e B) e respostas isotípicas de IgG1anti- H5N1 (C e D) e de IgG2b anti-H5N1 (E e F) no dia 14 após imunização (GMT +/-IC95) para duas doses de antígeno diferentes: 1,5 μg (A, C e E) ou 0,38 μg (B, D e F)

[0022] Figura 10: Estudo em camundongos: Teste de inibição de hemaglutinação (GMT +/- IC95) no dia 21 pós-imunização (GMT +/- IC95) para duas doses de antígeno diferentes: 1,5 μg (A) ou 0,38 μg (B).

[0023] Figura 11: Estudo em camundongos: Resposta imune celular (célula-T CD4+) em camundongos C57BI/6 inexperientes imunizados com dose diferente de vacina de H5N1 (1,5 ou 0,38 μg) adjuvantada com faixa de dose AS03: (A) 1,5 μg de HA Ag (antígeno) ou (B) 0,38 μg de HA Ag (antígeno).

[0024] Figura 12: Estudos em porco. Teste de inibição de hemaglutinina (GMT +/- IC95) em porcos inoculados com cepas homólogas (faixa de dose AS03).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0025] Os termos "compreendendo", "compreende", e "compreendem" são aqui intencionados pelos inventores para serem opcionalmente adequados com os termos "consistindo de", "consistindo de", "consiste de" e "consistem de", respectivamente, em qualquer caso.

[0026] Modalidades aqui relacionadas às "composições de vacina" da invenção também são aplicáveis às modalidades relacionadas às "composições imunogênicas" da invenção, e vice versa.

[0027] Em uma modalidade da invenção é proporcionada uma vacina ou composição imunogênica compreendendo um antígeno ou uma composição de antígeno e uma composição adjuvante consistindo de uma emulsão de óleo-em-água, sendo que a dita emulsão de óleo-em-água compreende 0,5 -10 mg de óleo metabolizável, 0,5 - 11 mg de tocol e 0,4 - 4 mg de agente emulsificador, por dose para humano.

[0028] Em uma outra modalidade da invenção é proporcionada uma vacina ou composição imunogênica compreendendo um antígeno ou uma composição de antígeno e uma composição adjuvante compreendendo uma emulsão de óleo-em-água, sendo que a emulsão de óleo em água compreende 0,5 - 10 mg de óleo metabolizável, (tal como esqualeno), 0,5 - 11 mg de tocol (tal como alfa-tocoferol e 0,4 - 4 mg de agente emulsificador (tal como monooleato de polioxietileno-sorbitana), por dose para humano. Componente Emulsão de Óleo-em-Água

[0029] A composição adjuvante da invenção compreende um adjuvante de emulsão de óleo-em-água, preferivelmente dita emulsão compreende um óleo metabolizável em uma quantidade de 0,5-10 mg, a tocol em uma quantidade de 0,5-11 mg e um agente emulsificador em uma quantidade de 0.4 - 4 mg e tendo gotículas de óleo das quais pelo menos 70% em intensidade possuem diâmetros menores do que 1 μm.

[0030] Com o propósito de que qualquer composição de óleo-em- água seja adequada para administração a humano, a fase oleosa do sistema de emulsão tem que compreender um óleo metabolizável. O significado do termo óleo metabolizável é bem conhecido na arte. Metabolizável pode ser definido como 'sendo capaz de ser transformado por metabolismo' (Dorland's Illustrated Medical Dictionary, W.B. Sanders Company, 25th edition (1974)). O óleo pode ser qualquer óleo vegetal, óleo de peixe, óleo animal ou óleo sintético, que é não tóxico para o paciente recipiente e é capaz de ser transformado por metabolismo. Nozes, sementes, e grãos são fontes comuns de óleos vegetais. Óleos sintéticos também são parte desta invenção e podem incluir óleos comercialmente disponíveis tal como NEOBEE® e outros. Um óleo metabolizável particularmente adequado é esqualeno. Esqualeno (2,6,10,15,19,23-Hexametil-2,6,10,14,18,22-tetracosahexaeno) é um óleo insaturado que é encontrado em quantidades grandes em óleo de fígado de tubarão, e em quantidades menores em azeite de oliva, óleo de germe de trigo, óleo de farelo de arroz, e levedura, e é um óleo particularmente preferido para uso nesta invenção. Esqualeno é um óleo metabolizável em virtude do fato de que ele é um intermediário na biossíntese de colesterol (Merck Index, 10th Edition, entrada de número 8619).

[0031] Adequadamente o óleo metabolizável está presente na composição adjuvante em uma quantidade de 0,5-10 mg, preferivelmente 110, 2-10, 3-9, 4-8, 5-7, ou 5-6 mg (e.g. 2-3, 5-6, ou 9-10 mg), especificamente 5,35 mg ou 2,14 mg. Em uma outra modalidade da invenção, o óleo metabolizável está presente na composição de vacina (ou imunogênica) em uma quantidade de 0,5-10 mg, preferivelmente 1-10, 2-10, 3-9, 4-8, 5-7, ou 56 mg (e.g. 2-3, 5-6, ou 9-10 mg), especificamente 5,35 mg ou 2,14 mg.

[0032] A quantidade de óleo metabolizável em composição imunogênica ou vacina pode ser expressada como uma percentagem da composição total. Adequadamente o óleo metabolizável está presente na composição de vacina em uma quantidade de 0,5% a 2%, preferivelmente 0,25 - 2, ou 0,25-1,75, ou 0,5-1,65, ou 0,6-1,5, ou 0,8 -1,4 ou 1-1,25 % (v/v) de óleo do volume da composição total.

[0033] Em outra modalidade específica, o óleo metabolizável está presente em uma quantidade final de cerca de 1,25% do volume total da composição de vacina (ou imunogênica). Em outra modalidade específica, o óleo metabolizável está presente em uma quantidade final de 0,25% (v/v) do volume da composição total.

[0034] Para tornar mais claro, concentrações dadas em v/v podem ser convertidas em concentrações em p/v pela aplicação do seguinte fator de conversão: uma concentração de esqualeno de 5% (v/v) é equivalente a uma concentração de esqualeno de 4,28% (p/v).

[0035] A emulsão de óleo-em-água compreende um tocol. Tocóis são bem conhecidos na arte e são descritos em EP0382271. Adequadamente o tocol é alfa-tocoferol ou um seu derivado tal como succinato de alfa- tocoferol(também conhecido como succinato de vitamina E). Dito tocol está adequadamente presente na composição adjuvante em uma quantidade de 0,511 mg, preferivelmente 1-11, 2-10, 3-9, 4-8, 5-7, 5-6 (e.g. 10-11, 5-6, 2,5-3,5 ou 1-3 mg). Em uma modalidade específica o tocol está presente em uma quantidade de 5,94 mg ou 2,38 mg. Em uma outra modalidade, dito tocol está adequadamente presente na composição de vacina (ou imunogênica) em uma quantidade de 0,5-11 mg, preferivelmente 1-11, 2-10, 3-9, 4-8, 5-7, 5-6 (e.g. 10-11, 5-6, 2,5-3,5 ou 1-3 mg). Em uma modalidade específica o tocol está presente em uma quantidade de 5,94 mg ou 2,38 mg.

[0036] A quantidade de tocol pode ser expressada como uma percentagem do volume de composição de vacina ou imunogênica total. Adequadamente tocol está presente na composição de vacina em uma quantidade de 0,25% a 2% (v/v) do volume total da composição imunogênica, preferivelmente a 0,25-2 compreende 0,25 - 2, ou 0,25-1,75, ou 0,5-1,65, ou 0,6-1,5, ou 0,8 -1,4 ou 1-1,25 % (v/v) de tocol do volume total.

[0037] Preferivelmente tocol está presente em uma quantidade de entre 0,2% e 2% (v/v) do volume total da composição de vacina (ou imunogênica), mais preferivelmente em uma quantidade de 1,25% (v/v) em um volume de dose de 0,5 mL.

[0038] Em uma modalidade específica, o tocol está presente em um volume final de cerca de 1,25% do volume total da composição imunogênica ou de vacina. Em outra modalidade específica, o tocol está presente em um volume total de 0,25% (v/v) do volume total ou 1,25% (v/v) em volume de dose de 0,5 mL ou 0,9% (v/v), em volume de dose de 0,7 mL, ou 0,5% (v/v) em dose de 0,5 mL ou 0,35-0,37 %, preferivelmente 0,36% em dose imunogênica ou de vacina de 0,7 mL.

[0039] Para tornar mais claro, concentrações dadas em v/v podem ser convertidas em concentração em p/v pela aplicação do seguinte fator de conversão: uma concentração de 5% (v/v) de alfa-tocoferol é equivalente a uma concentração de 4,8% (p/v) de alfa-tocoferol.

[0040] A emulsão de óleo-em-água adicionalmente compreende um agente emulsificador. O agente emulsificador pode ser adequadamente monooleato de polioxietileno-sorbitana. Em uma modalidade particular o agente emulsificador pode ser selecionado do grupo compreendendo: Polisorbate® 80 ou Tween® 80 .

[0041] Dito agente emulsificador está adequadamente presente na composição adjuvante em uma quantidade de 0,1-5, 0,2-5, 0,3-4, 0,4-3 ou 2-3 mg (e.g. 0,4-1,2, 2-3 ou 4-5 mg) de agente emulsificador. Em uma modalidade específica o agente emulsificador está presente em uma quantidade de 0,97 mg ou 2,425 mg.

[0042] Ademais, dito agente emulsificador está adequadamente presente na composição imunogênica ou de vacina em uma quantidade de 0,15, 0,2-5, 0,3-4, 0,4-3 ou 2-3 mg (e.g. 0,4-1,2, 2-3 ou 4-5 mg) de agente emulsificador. Em uma modalidade específica o agente emulsificador está presente em uma quantidade de 0,97 mg ou 2,425 mg.

[0043] A quantidade de agente emulsificador pode ser expressada como uma percentagem do volume de composição de vacina ou imunogênica total. Adequadamente o agente emulsificador está presente na composição de vacina (ou imunogênica) em uma quantidade de 0,125-0,8% (v/v) do volume total da composição, preferivelmente a 0,08-,05, ou 0,1-0,7, ou 0,2-0,6, ou 0,25-0,55, ou 0,3-0,52 ou 0,4-0,5% (v/v) do volume total. Em uma modalidade específica o agente emulsificador está presente em uma quantidade de 1%, 0,5% ou 0,2% (v/v) do volume de composição de vacina ou imunogênica total.

[0044] Para tornar mais claro, concentrações dadas em v/v podem ser convertidas em concentração em p/v pela aplicação do seguinte fator de conversão: uma concentração de 1,8% (v/v) de polissorbato 80 é equivalente a uma concentração de 1,91% (p/v) de polissorbato 80.

[0045] Em uma modalidade específica, um volume de dose de vacina ou imunogênica de 0,5 mL contém 0,45% (v/v) de Tween 80, e um volume de dose de 0,7 mL contém 0,315% (v/v) de Tween 80. Em outra modalidade específica uma dose de 0,5 mL contém 0,18% (v/v) de agente emulsificador e uma dose de composição imunogênica ou de vacina de 0,7 mL contém 0,126% (v/v) de agente emulsificador.

[0046] O termo "dose para humano" significa uma dose que está em um volume adequado para uso humano. Geralmente esta está entre 0,25 e 1,5 mL. Em uma modalidade, uma dose para humano é 0,5 mL. Em uma outra modalidade, uma dose para humano é maior do que 0,5 mL, por exemplo 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 ou 1 mL. Em uma outra modalidade, uma dose para humano está entre 1 mL e 1,5 mL. Em outra modalidade, em particular quando a composição imunogênica é para população pediátrica, uma dose para humano pode ser menor do que 0,5 mL tal como entre 0,25 e 0,5 mL. A invenção é caracterizada pelo fato de que os componentes individuais do adjuvante dentro da composição imunogênica está/estão em um nível menor do que previamente considerado útil e é/são tipicamente como recitado acima. Composições particularmente adequadas compreendem os seguintes componentes adjuvantes nas seguintes quantidades que estão em um volume final de dose para humano de 0,5 mL: Tabela 1

[0047] A invenção adicionalmente proporciona uma composição adjuvante compreendendo os componentes individuais como aqui definidos e na quantidade definida acima, por exemplo mas não exclusivamente como ilustrado em Tabela 1. Tipicamente uma tal uma composição adjuvante estará em um volume adequado de dose para humano. Onde o adjuvante está em uma forma líquida para ser combinada com uma forma líquida de uma composição antigênica, a composição adjuvante estará em um volume adequado de dose para humano que é uma fração do volume final intencionado da dose para humano, tal como por exemplo aproximadamente metade do volume final intencionado da dose para humano, por exemplo um volume de 350 μL para uma dose para humano intencionada de 0,7ml, ou um volume de 250 μL para uma dose para humano intencionada de 0,5 mL. A composição adjuvante é diluída quando combinada com a composição de antígeno para proporcionar ao dose para humano final da vacina. O volume final de tal dose claro que variará dependendo do volume inicial da composição adjuvante e do volume de composição de antígeno adicionado na composição adjuvante. Em uma modalidade alternativa, adjuvante líquido é usado para reconstituir uma composição de antígeno liofilizada. Nesta modalidade, o volume adequado de dose para humano da composição adjuvante é aproximadamente igual ao volume de dose para humano. A composição adjuvante líquida é adicionada no frasco contendo a composição de antígeno liofilizada. A dose para humano final pode variar entre 0,5 e 1,5 mL.

[0048] O método de produzir emulsões de óleo-em-água é bem conhecido pela pessoa experiente na arte. Comumente, o método compreende misturar a fase oleosa contendo tocol com um tensoativo tal como uma solução de PBS/TWEEN80™, seguido por homogeneização usando um homogeneizador, estará claro para um homem experiente na arte que um método compreendendo passar a mistura duas vezes através de uma agulha de seringa seria adequado para homogeneizar volumes pequenos de líquido. Igualmente, o processo de emulsificação em microfluidizador (máquina M110S Microfluidics, máximo de 50 passagens, por um período de 2 minutos em pressão máxima de entrada de 600 kPa (pressão de saída de cerca de 85.000 kPa) poderia ser adaptado pelo homem experiente na arte para produzir volumes menores ou maiores de emulsão. A adaptação poderia ser realizada por experimentação rotineira compreendendo a medição da emulsão resultante até ser alcançada uma preparação com gotículas de óleo do diâmetro exigido.

[0049] Em uma emulsão de óleo-em-água, o óleo e o emulsificador devem estar em um veículo aquoso. O veículo aquoso pode ser, por exemplo, solução salina tamponada com fosfato.

[0050] Preferivelmente os sistemas de emulsão de óleo-em-água da presente invenção têm um tamanho de gotícula de óleo pequeno dentro da faixa submicrométrica. Adequadamente os tamanhos de gotícula estarão dentro da faixa de 120 a 750 nm, mais preferivelmente tamanhos de 120 a 600 nm em diâmetro. Mais preferivelmente a emulsão de óleo-em-água contém gotículas de óleo das quais pelo menos 70% em intensidade são menores do que 500 nm em diâmetro, mais preferivelmente pelo menos 80% em intensidade são menores do que 300 nm em diâmetro, mais preferivelmente pelo menos 90% em intensidade estão dentro da faixa de 120 a 200 nm em diâmetro.

[0051] O tamanho de gotícula de óleo, i.e. diâmetro, de acordo com a presente invenção é dado em intensidade. Há várias maneiras de determinar o diâmetro do tamanho de gotícula de óleo em intensidade. Intensidade é medida pelo uso de um instrumento dimensionador, adequadamente por espalhamento de luz dinâmica tal como o Malvern Zetasizer 4000 ou preferivelmente o Malvern Zetasizer 3000HS. Um procedimento detalhado é dado em Example II,2. Uma primeira possibilidade é determinar o tamanho médio z ZAD por espalhamento de luz dinâmica (espectroscopia de correlação PCS-Photon); este método adicionalmente dá o índice de polidispersão (PDI), e ambos ZAD e PDI são calculados com o algoritmo de cumulantes. Estes valores não exigem o conhecimento do índice de refração de partícula. Uma segunda média é para calcular o diâmetro da gotícula de óleo pela determinação da distribuição de tamanho de partícula inteira por outro algoritmo, quer o Contin, ou NNLS, ou o "Malvern" o automático (o algoritmo pré-estabelecido proporcionado pelo instrumento dimensionador). Na maioria das vezes, como o índice de refração de partícula de uma composição complexa é desconhecido, apenas a distribuição de intensidade é tomada em consideração, e se necessário a média de intensidade originada desta distribuição. Imunoestimulantes Opcionais

[0052] Em uma outra modalidade da invenção é proporcionada uma vacina ou composição imunogênica compreendendo um antígeno ou uma composição de antígeno e uma composição adjuvante compreendendo uma emulsão de óleo-em-água e opcionalmente um ou mais outros imunoestimulantes, sendo que a dita emulsão de óleo-em-água compreende 0,5 - 10 mg de óleo metabolizável, 0,5-11 mg de tocol e 0,4 - 4 mg de agente emulsificador.

[0053] Em uma modalidade a composição adjuvante compreende uma emulsão de óleo-em-água como aqui descrita. Em uma outra modalidade a composição adjuvante pode adicionalmente compreender um ou mais adjuvantes ou imunoestimulantes adicionais. Em uma outra modalidade a composição adjuvante opcionalmente compreende um ou mais adjuvantes ou imunoestimulantes adicionais diferentes de QS21 e/ou MPL.

[0054] O adjuvante adicional opcional é selecionado do grupo: uma saponina, lipídeo A ou um seu derivado, um oligonucleotídeo imunoestimulatório, um alquil-glicosaminida-fosfato, um sal de metal, um agonista de receptor Toll-like ou suas combinações. É preferido que o adjuvante seja um agonista de receptor Toll-like em particular um agonista de receptor Toll-like 2, 3, 4, 7, 8 ou 9, ou uma saponina. É adicionalmente preferido que o sistema adjuvante compreenda dois ou mais adjuvantes da lista acima. Combinações preferivelmente contêm um adjuvante saponina (em particular QS21) e/ou um agonista de receptor Toll-like 4 tal como 3D-MPL ou um agonista de receptor Toll-like 9 tal como um oligonucleotídeo imunoestimulatório contendo CpG. Outras combinações preferidas compreendem uma saponina (em particular QS21) e um agonista de receptor Toll-like 4 tal como uma saponina (em particular QS21) e um ligante de receptor Toll-like 4 tal como 3D-MPL ou um alquil-glicosaminida-fosfato.

[0055] Em uma modalidade o adjuvante adicional é um ligante de receptor Toll-like (TLR) 4, preferivelmente um agonista tal como um derivado de lipídeo A particularmente monofosforil-lipídeo A ou mais particularmente monofosforil-lipídeo A 3-desacilado (3D-MPL).

[0056] 3D-MPL está disponível sob a marca comercial MPL® em GlaxoSmithKline Biologicals North America e primariamente promove respostas de célula-T CD4+ com um fenótipo de IFN-g (Th1). Pode ser produzido de acordo com os métodos mostrados em GB 2 220.211 A. Quimicamente é uma mistura de monofosforil-lipídeo A 3-desacilado com 3, 4, 5 ou 6 cadeias aciladas. Preferivelmente nas composições da presente invenção 3-D-MPL de partículas pequena é usado. 3F-MPL de partícula pequena tem um tamanho de partícula tal que pode ser esterilmente filtrado através de um filtro de 0,2 μm. Tais preparações são descritas no Pedido de Patente Internacional No. WO 94/21292. Derivados sintéticos de lipídeo A são conhecidos e considerados como sendo agonistas de TLR 4 incluindo, mas não limitados a: OM174 (2-desóxi-6-o- [2-desóxi-2-[(R)-3-dodecanoil-óxi- tetradecanoil-amino]-4-o-fosfono-p-D-glico-piranosil]-2-[(R)-3-hidróxi- tetradecanoil-amino]-α-D-glico-piranosil-di-hidrogeno-fosfato), (WO 95/14026) OM 294 DP (3S,9 R)-3-[(R)-dodecanoil-óxi-tetradecanoil- amino]-4-oxo-5-aza-9(R)-[(R)-3-hidróxi-tetradecanoil-amino]-decan-1,10- diol, 1,10-bis(di-hidrogeno-fosfato) (W099 /64301 e WO 00/0462 ) OM 197 MP-Ac DP (3S,9R) -3-[(R)-dodecanoil-óxi- tetradecanoil-amino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3-hidróxi-tetradecanoil-amino]- decan-1,10-diol, 1-di-hidrogeno-fosfato 10-(6-amino-hexanoato) (WO 01/46127)

[0057] Outros ligantes de TLR4 que podem ser usados são alquil- glicosaminida-fosfatos (AGPs) tais como aqueles mostrados em WO9850399 ou US6303347 (processos para a preparação de AGPs também são mostrados), ou sais farmaceuticamente aceitáveis de AGPs são mostrados em US6764840. Alguns AGPs são agonistas de TLR4, e alguns são antagonistas de TLR4. Ambos são considerados como adjuvantes úteis.

[0058] Outros ligantes de TLR-4 adequados, capazes de causar uma resposta de sinalização através de TLR-4 (Sabroe et al., Jl 2003 p1630-5) são, por exemplo, lipopolissacarídeo de bactérias gram-negativas e seus derivados, ou seus fragmentos, em particular um derivado não-tóxico de LPS (tal como 3D-MPL). Outros agonistas de TLR adequados são: proteína de choque térmico (HSP) 10, 60, 65, 70, 75 ou 90; Proteína A tensoativa, oligossacarídeos de hialuronana, fragmentos de sulfato de heparano, fragmentos de fibronectina, peptídeos de fibrinogênio, e b-defensina-2, muramil-dipeptídeo (MDP) ou proteína F de vírus sincicial respiratório. Em uma modalidade o agonista de TLR é HSP 60, 70 ou 90.

[0059] Receptores Toll-like (TLRs) são receptores de transmembrana de tipo I, evolucionariamente conservados entre insetos e humanos. Dez TLRs têm sido até agora estabelecidos (TLRs 1-10) (Sabroe et al., Jl 2003 p1630-5). Membros da família de TLR têm domínios intracelulares e extracelulares similares; tem sido mostrado que seus domínios extracelulares têm seqüências repetidas ricas em leucina, e seus domínios intracelulares são similares à região intracelular de receptor de interleucina - 1 (IL-1R). Células TLR são expressadas diferencialmente dentre células imunes e outras células (incluindo células epiteliais vasculares, adipócitos, miócitos cardíacos e células epiteliais intestinais). O domínio intracelular dos TLRs pode interagir com a proteína adaptadora Myd88, que também possui o domínio IL-1R em sua região citoplásmica, levando à ativação NF-KB de citocinas; esta rota Myd88 é um modo pelo qual liberação de citocina é realizada por ativação de TLR. A expressão principal de TLRs é em tipos de célula tais como células apresentadoras de antígeno (e.g. células dendríticas, macrófagos etc).

[0060] Ativação de células dendríticas por estimulação através dos TLRs leva à maturação de células dendríticas, e à produção de citocinas inflamatórias tal como IL-12. Pesquisa realizada até agora tem verificado que TLRs reconhecem tipos diferentes de agonistas, embora alguns agonistas sejam comuns para vários TLRs. Agonistas de TLR são predominantemente derivados de bactérias ou vírus, e incluem moléculas tais como flagelina ou lipopolissacarídeo (LPS) bacteriano.

[0061] "Agonista de TLR" significa um componente que é capaz de causar uma resposta de sinalização atravpes de uma rota de sinalização por TLR, quer como um ligante direto quer indiretamente através de geração de ligante endógeno ou exógeno (Sabroe et al., Jl 2003 p1630-5).

[0062] Em outra modalidade, agonistas de moléculas de TLR naturais ou sintéticos são usados como imunoestimulantes adicionais opcionais. Estes poderiam incluir, mas não são limitados a TLR2, TLR3, TLR7, TLR8 e TLR9.

[0063] Em uma modalidade da presente invenção, é usado um agonista de TLR que é capaz de causar uma resposta de sinalização através de TLR-1 (Sabroe et al., Jl 2003 p1630-5). Adequadamente, o agonista de TLR capaz de causar uma resposta de sinalização através de TLR-1é selecionado de: lipopeptídeos (LPs) triacilados; modulina solúvel em fenol; LP de Mycobacterium tuberculosis; S-(2,3-bis(palmitoil-óxi)-(2-RS)-propil)-N- palmitoil-(R)-Cys-(S)-Ser-(S)-Lys(4)-OH, tricloridrato (Pam3Cys) LP que imita a terminação amina acetilada de uma lipoproteína bacteriana e OspA LP de Borrelia burgdorfei.

[0064] Em uma modalidade alternativa, é usado um agonista de TLR que é capaz de causar uma resposta de sinalização através de TLR-2 (Sabroe et al., Jl 2003 p1630-5). Adequadamente, o agonista de TLR capaz de causar uma resposta de sinalização através deTLR-2 é um ou mais de uma lipoproteína, um peptidoglicano, um lipopeptídeo bacteriano de M. tuberculosis, B. burgdorferi, T. pallidum; peptidoglicanos de espécies incluindo f Staphylococcus aureus; ácidos lipoteicóicos, ácidos manurônicos, Neisseria porins, fímbrias bacterianas, fatores de Yersina virulence, virions CMV, hemaglutinina de sarampo, e zimosano de levedura.

[0065] Em uma modalidade alternativa, é usado um agonista de TLR que é capaz de causar uma resposta de sinalização através de TLR-3 (Sabroe et al., Jl 2003 p1630-5). Adequadamente, o agonista de TLR capaz de causar uma resposta de sinalização através deTLR-3 é RNA de fita dupla (dsRNA), ou ácido poliinosínico-policitidílico (Poly IC), um padrão de ácido nucleico molecular associado com infecção viral.

[0066] Em uma modalidade alternativa, é usado um agonista de TLR que é capaz de causar uma resposta de sinalização através de TLR-5 (Sabroe et al., Jl 2003 p1630-5). Adequadamente, o agonista de TLR capaz de causar uma resposta de sinalização através de TLR-5 é flagelina bacteriana.

[0067] Em uma modalidade alternativa, é usado um agonista de TLR que é capaz de causar uma resposta de sinalização através de TLR-6 (Sabroe et al., Jl 2003 p1630-5). Adequadamente, o agonista de TLR capaz de causar uma resposta de sinalização através de TLR-6 é lipoproteína micobacteriana, LP di-acilado, e modulina solúvel em fenol. Outros agonistas de TLR6 são descritos em WO2003043572.

[0068] Em uma modalidade alternativa, é usado um agonista de TLR que é capaz de causar uma resposta de sinalização através de TLR-7 (Sabroe et al., Jl 2003 p1630-5). Adequadamente, o agonista de TLR capaz de causar uma resposta de sinalização através deTLR-7 é um RNA de fita única (ssRNA), loxoribina, um análogo de guanosina em posições N7 e C8, ou um composto de imidazoquinolina, ou seu derivado. Em uma modalidade, o agonista de TLR é imiquimod. Outros agonistas de TLR7 são descritos em WO02085905.

[0069] Em uma modalidade alternativa, é usado um agonista de TLR que é capaz de causar uma resposta de sinalização através de TLR-8 (Sabroe et al., Jl 2003 p1630-5). Adequadamente, o agonista de TLR capaz de causar uma resposta de sinalização através de TLR-8 é um RNA de fita única (ssRNA), uma molécula de imidazoquinolina com atividade anti-viral, por exemplo resiquimod (R848); resiquimod também é capaz de reconhecimento por TLR-7. Outros agonistas de TLR-8 que podem ser usados incluem aqueles descritos em WO2004071459.

[0070] Oligonucleotídeos imunoestimulatórios ou qualquer outro agonista de receptor Toll-like (TLR) 9 também pode ser usado. Os oligonucleotídeos preferidos para uso em adjuvantes ou vacinas ou composições imunogênicas da presente invenção são oligonucleotídeos contendo CpG, preferivelmente contendo dois ou mais motivos CpG de dinucleotídeo separados por pelo menos três, mais preferivelmente pelo menos seis ou mais nucleotídeos. Um motivo CpG é um nucleotídeo de Citosina seguido por um nucleotídeo de Guanina. Os oligonucleotídeos de CpG da presente invenção são tipicamente desoxinucleotídeos. Em uma modalidade preferida o internucleotídeo no oligonucleotídeo é fosforoditioato, ou mais preferivelmente uma ligação fosforotioato, através de ligações fosfodiéster e outras ligações de internucleotídeo estão dentro do escopo da invenção. Também estão incluídos dentro do escopo da invenção os oligonucleotídeos com ligações internucleotídeo mistas. Métodos para produzir fosforotioato-oligonucleotídeos ou fosforoditioato são descritos em US5.666.153, US5.278.302 e WO95/26204.

[0071] Exemplos de oligonucleotídeos preferidos têm as seguintes seqüências. As seqüências preferivelmente contêm ligações internucleotídeo modificas por fosforotioato. OLIGO 1(SEQ ID NO:1): TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT (CpG 1826) OLIGO 2 (SEQ ID NO:2): TCT CCC AGO GTG CGC CAT (CpG 1758) OLIGO 3(SEQ ID NO:3): ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG OLIGO 4 (SEQ ID NO:4): TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (CpG 2006) OLIGO 5 (SEQ ID NO:5): TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (CpG 1668) OLIGO 6 (SEQ ID NO:6): TCG ACG TTT TCG GCG CGC GCC G (CpG 5456)

[0072] Oligonucleotídeos CpG alternativos podem compreender as seqüências preferidas acima pelo fato de que possuem adições ou deleções irrelevantes nos mesmos. Os oligonucleotídeos CpG utilizados na presente invenção podem ser sintetizados por qualquer método conhecido na arte (por exemplo veja EP 468520). Convenientemente, tais oligonucleotídeos podem ser sintetizados utilizando um sintetizador automático.

[0073] Conseqüentemente, em outra modalidade, a composição adjuvante adicionalmente compreende um imunoestimulante adicional que é selecionado do grupo consistindo de: um agonista de TLR-1, um agonista de TLR-2 agonist, TLR-3, um agonista de TLR-4 agonist, TLR-5, um agonista de TLR-6 agonist, TLR-7, um agonista de TLR-8, um agonista de TLR-9, ou uma combinação dos mesmos.

[0074] Outros imunoestimulantes preferidos para uso na presente invenção é Quil A e seus derivados. Quil A é uma preparação de saponina isolada de árvore da América do Sul Quilaja Saponaria Molina e foi primeiro descrita como tendo atividade adjuvante por Dalsgaard et al. em 1974 ("Saponin adjuvants", Archiv. für die gesamte Virusforschung, Vol. 44, Springer Verlag, Berlin, p243-254). Têm sido isolados por HPLC fragmentos purificados de Quil A que retêm atividade adjuvante sem a toxicidade associada com Quil A (EP 0.362.278), por exemplo QS7 e QS21 (também conhecido como QA7 e QA21). QS-21 é uma saponina comum derivada da casca de Quillaja saponaria Molina que induz células T citotóxicas CD8+ (CTLs), células Th1 e uma resposta de anticorpo IgG2a predominante e é uma saponina preferida no contexto da presente invenção.

[0075] Têm sido descritas formulações particulares de QS21 que são particularmente preferidas, estas formulações adicionalmente compreendem um esterol (W096/33739). Onde esqualeno e uma saponina (opcionalmente QS21) estão incluídos, é benéfico também incluir um esterol (opcionalmente colesterol) na formulação porque este permite uma redução no nível total de óleo na emulsão. Isto leva a um custo de manufatura reduzido, melhoria no conforto total da vacinação, e também melhorias quali IFN-y. Conseqüentemente, o sistema adjuvante da presente invenção tipicamente compreende uma razão (p/p) de óleo metabolizável : saponina de dentro da faixa de of 200:1 a 300:1, também a presente invenção pode ser usada em uma forma "baixa em óleo" cuja faixa opcional é 1:1 a 200:1, opcionalmente 20:1 a 100:1, ou substancialmente 48:1, esta vacina retém propriedades de adjuvante de todos os componentes, com um perfil de reatogenicidade muito reduzido. Conseqüentemente, algumas modalidades têm uma razão (p/p) de esqualeno : QS21 dentro da faixa de 1:1 a 250:1, ou 20:1 a 200:1, ou 20:1 to 100:1, ou substancialmente 48:1. Opcionalmente um esterol (e.g. colesterol) também está incluído em uma razão de saponina : esterol como aqui descrita. Antígenos e Composição de Antígeno

[0076] As formulações imunogênicas ou de vacina conterão um antígeno ou uma composição antigênica capaz de induzir uma resposta imune contra um patógeno de animal ou de humano.

[0077] Adequadamente, dito antígeno ou dita composição de antígeno é derivado(a) de um ou mais dos seguintes: HIV-1, (tal como gag ou seus fragmentos tais como p24, tat, nef, gp120 ou gp160 ou fragmentos de qualquer um destes), vírus do herpes humano, tal como gD ou seus derivados ou proteína Precoce Imediata tal como ICP27 de HSV1 ou HSV2, citomegalovírus ((esp de Humano)(tal como gB ou seus derivados), Rotavírus (incluindo vírus vivos atenuados), vírus Epstein Barr (tal comos gp350 ou seus derivados), Vírus Varicela Zóster tal como gpl, II e IE63), ou de um vírus de hepatite tal como vírus de hepatite B (por exemplo antígeno de Superfície de Hepatite B ou um seu derivado), vírus de hepatite A, vírus de hepatite C e vírus de hepatite E, ou de outros patógenos virais, tais como paramixovírus: Vírus Sincicial Respiratório (tal como proteínas F, N, M e G ou seus derivados), vírus SARS, vírus de parainfluenza, vírus do sarampo, vírus da caxumba, Vírus do Papiloma Humano (por exemplo HPV6, 11, 16, 18, ), flavivírus (e.g. Vírus da Febre Amarela, Vírus da Dengue, vírus da encefalite de carrapato, Vírus da Encefalite Japonesa) ou Vírus Influenza (vírus inteiro vivo ou inativado, vírus de influenza dividida, crescido em ovos ou células MDCK, ou virossomos flu inteiros (como descrito por R. Gluck, Vaccine, 1992, 10, 915-920) ou purificado ou suas proteínas recombinantes, tais como proteínas HA, NP, NA, ou M, ou suas combinações), ou derivados de patógenos bacterianos tais como Neisseria spp, incluindo N. gonorrhea e N. meningitidis (por exemplo sacarídeos capsulares e seus conjugados, proteínas ligantes de transferrina, proteínas ligantes de lactoferrina, PilC, adesinas); S. pyogenes (por exemplo proteínas M ou seus fragmentos, protease C5A, ácidos lipoteicóicos), S. agalactiae, S. mutans; H. ducreyi; Moraxella spp, incluindo M. catarrhalis, também conhecido como Branhamella catarrhalis (por exemplo adesinas e e invasinas de peso molecular alto e baixo); Bordetella spp, incluindo B. pertussis (por exemplo pertactina, toxina pertussis ou seus derivados, hemaglutinina filamentosa, adenilato ciclase, fímbrias), B. parapertussis e B. bronchiseptica; Mycobacterium spp.,incluindo M. tuberculosis (por exemplo ESAT6, Antigen 85A, -B ou -C), M. bovis, M. leprae, M. avium, M. paratuberculosis, M. smegmatis; Legionella spp, incluindo L. pneumophila; Escherichia spp, incluindo E. coli enterotóxica (por exemplo fatores de colonização, toxina termo-lábil, ou seus derivados, toxina termo-estável ou seus derivados), E. coli enteroemorrágica, E. coli enteropatogênica (por exemplo toxina semelhante à toxina shiga ou seus derivados); Vibrio spp, incluindo V. cholera (por exemplo toxina de colera ou seus derivados); Shigella spp, incluindo S. sonnei, S. dysenteriae, S. flexnerii; Yersinia spp, incluindo Y. enterocolitica (por exemplo uma proteína Yop) , Y. pestis, Y. pseudotuberculosis; Campylobacter spp, incluindo C. jejuni (por exemplo toxinas, adesinas e invasinas) e C. coli; Salmonella spp, incluindo S. typhi, S. paratyphi, S. choleraesuis, S. enteritidis; Listeria spp., incluindo L. monocytogenes; Helicobacter spp, incluindo H. pylori (por exemplo urease, catalase, toxina vacuolante); Pseudomonas spp, incluindo P. aeruginosa; Staphylococcus spp., incluindo S. aureus, S. epidermidis; Enterococcus spp., incluindo E. faecalis, E. faecium; Clostridium spp., incluindo C. tetani (por exemplo toxina de tétano e seu derivado), C. botulinum (por exemplo toxina botulinum e seu derivado), C. difficile (por exemplo toxinas A ou B de Clostridium e seus derivados); Bacillus spp., incluindo B. anthracis (por exemplo botulinum toxin e seus derivados); Corynebacterium spp., incluindo C. diphtheriae (por exemplo toxina de difteria e seus derivados); Borrelia spp., incluindo B. burgdorferi (por exemplo OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. garinii (por exemplo OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. afzelii (por exemplo OspA, OspC, DbpA, DbpB,), B. andersonii (por exemplo OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. hermsii; Ehrlichia spp., incluindo £. equi e o agente da Erliquiose Granulocítica de Humano; Rickettsia spp, incluindo R. rickettsii; Chlamydia spp., incluindo C. trachomatis (por exemplo MOMP, proteínas ligantes de heparina), C. pneumoniae (por exemplo MOMP, proteínas ligantes de heparina), C. psittaci; Leptospira spp., incluindo L. interrogans; Treponema spp., incluindo T. pallidum (por exemplo as proteínas raras de membrana externa)), T. denticola, T. hyodysenteriae; ou derivados de parasitas tais como Plasmodium spp., incluindo P. falciparum; Toxoplasma spp., incluindo T. gondii (por exemplo SAG2, SAG3, Tg34); Entamoeba spp., incluindo E. histolytica; Babesia spp., incluindo B. microti; Trypanosoma spp., incluindo T cruzi; Giardia spp., incluindo G. lamblia; Leshmania spp., incluindo L. major; Pneumocystis spp., incluindo P. carinii; Trichomonas spp., incluindo T. vaginalis; Schisostoma spp., incluindo S. mansoni, ou derived from yeast such as Candida spp., incluindo C. albicans; Cryptococcus spp., incluindo C. neoformans.

[0078] Composições da presente invenção podem ser usadas para a profilaxia ou a terapia de alergia. Tais vacinas compreenderiam antígenos alérgeno-específicos e alérgeno-não-específicos.

[0079] Outros antígenos específicos preferidos para M. tuberculosis são por exemplo Tb Ra12, Tb H9, Tb Ra35, Tb38-1, Erd 14, DPV, MTI, MSL, mTTC2 e hTCC1 (WO 99/51748). Proteínas para M. tuberculosis também incluem proteínas de fusão e suas variantes onde pelo menos dois, preferivelmente três polipeptídeos de M. tuberculosis são fusionados em uma proteína maior. Fusões preferidas incluem Ra12-TbH9-Ra35, Erd14-DPV- MTI, DPV-MTI-MSL, Erd14-DPV-MTI-MSL-mTCC2, Erd14-DPV-MTI- MSL, DPV-MTI-MSL-mTCC2, TbH9-DPV-MTI (WO 99/51748).

[0080] Antígenos mais preferidos para Chlamydia incluem por exemplo a Proteína de Peso Molecular Alto (HMW) (WO 99/17741), ORF3 (EP 366 412), e proteínas de membrana putativas (Pmps). Outros antígenos para Chlamydia da formulação de vacina podem ser selecionados do grupo descrito em WO 99/28475.

[0081] Vacinas bacterianas preferidas compreendem antígenos derivados de Streptococcus spp, incluindo S. pneumoniae (por exemplo, PsaA, PspA, estreptolisina, proteínas ligantes de colina) e o antígeno de proteína Pneumolisina (Biochem Biophys Acta, 1989, 67, 1007; Rubins et al., Microbial Pathogenesis, 25, 337-342), e seus derivados destoxificados mutantes (WO 90/06951; WO 99/03884). Outras vacinas bacterianas preferidas compreendem antígenos derivados de Haemophilus spp., incluindo H. influenzae type B , non typeable H. influenzae, por exemplo OMP26, adesinas de peso molecular alto, P5, P6, proteína D e lipoproteína D, e fimbrina e peptídeos derivados de fimbrina (US 5.843.464) ou variantes de cópias múltiplas ou suas proteínas de fusão.

[0082] Derivados de antígeno de Superfície de Hepatite B são bem conhecidos na arte e incluem, inter alia, aqueles antígenos PreS1, PreS2 S descritos em pedidos de Patente Européia s EP-A-414.374; EP-A-0304.578, e EP 198.474. Em um aspecto preferido a formulação de vacina da invenção compreende o antígeno HIV-1, gp120, especialmente quando expressado em células CHO. Em uma outra modalidade, a formulação de vacina da invenção compreende gD2t como definido acima.

[0083] Em uma modalidade preferida da presente invenção vacinas contendo o adjuvante reivindicado compreendem antígeno derivado de Vírus do Papiloma Humano (HPV) considerado responsável por verrugas genitais (HPV 6 ou HPV 11 e outros), e os vírus HPV responsáveis por câncer cervical (HPV16, HPV18 e outros).

[0084] Formas particularmente preferidas de vacina terapêutica ou profilática para verruga genital compreendem proteína L1, e proteínas de fusão compreendendo um ou mais antígenos selecionados de proteínas de HPV E1, E2, E5, E6, E7, L1, e L2.

[0085] As formas mais preferidas de proteína de fusão são: L2E7 como mostrado em WO 96/26277, e proteína D(1/3)-E7 mostrada em WO99/10375.

[0086] Uma composição de vacina terapêutica ou profilática preferida para câncer ou infecção cervical por HPV, pode compreender antígenos HPV 16 ou 18.

[0087] Antígenos HPV 16 particularmente preferidos compreendem proteínas precoces E6 ou E7 em fusão com uma proteína D carreadora para formar fusões de Proteína D - E6 ou E7 de HPV 16, ou suas combinações; ou combinações de E6 ou E7 com L2 (WO 96/26277).

[0088] Alternativamente as proteínas precoces E6 e E7 de HPV 16 ou 18, podem ser apresentadas em uma molécula única, preferivelmente uma fusão de Proteína D- E6/E7. Tal vacina pode opcionalmente conter qualquer uma das ou ambas as proteínas E6 e E7 de HPV 18, preferivelmente na forma de uma proteína de fusão Proteína D - E6 ou Proteína D - E7 ou proteína de fusão D E6/E7.

[0089] A vacina da presente invenção pode adicionalmente compreender antígenos de outras cepas de HPV, preferivelmente de cepas HPV 31 ou 33.

[0090] Vacinas ou composições imunogênicas da presente invenção adicionalmente compreendem antígenos derivados de parasitas que causam Malária, por exemplo, antígenos de Plasmodia falciparum incluindo proteína circunsporozóite (proteína CS), RTS,S, MSP1, MSP3, LSA1, LSA3, AMA1 e TRAP. RTS é uma proteína híbrida compreendendo substancialmente toda a porção C-terminal da proteína circunsporozóite (CS) de P. falciparum ligada via quatro aminoácidos da porção preS2 de antígeno de superfície de Hepatite B em antígeno de superfície (S) de vírus de hepatite B. Sua estrutura inteira é mostrada no Pedido de Patente Internacional No. PCT/EP92/02591, publicado sob o Número WO 93/10152 reivindicando prioridade do pedido de patente UK No. 9124390,7. Quando expressada em levedura RTS é produzida como uma partícula de lipoproteína, e quando é co-expressada com o antígeno S de HBV produz uma partícula mista conhecida como RTS,S. Antígenos TRAP são descritos no Pedido de Patente Internacional No. PCT/GB89/00895, publicado sob WO 90/01496. Antígenos de Plasmodia que são provavelmente candidatos para serem componentes de uma vacina de Malária de multi- estágios são MSP1, AMA1, MSP3, EBA, GLURP, RAP1, RAP2, Sequestrina, PfEMPI, Pf332, LSA1, LSA3, STARP, SALSA, PfEXPI, Pfs25, Pfs28, PFS27/25, Pfs16, Pfs48/45, Pfs230 de P. falciparum e seus análogos em Plasmodium spp. Uma modalidade da presente invenção é uma vacina de malária na qual a preparação de antígeno compreende proteína RTS,S ou CS ou um seu fragmento tal como a porção CS de RTS,S, em combinação com um ou mais outros antígenos de malária, qualquer um dos quais ou ambos podem ser ligados na subunidade de toxina B Shiga de acordo com a invenção. Os um ou mais antígenos de malária podem ser selecionados por exemplo do grupo consistindo de MPS1, MSP3, AMA1, LSA1 ou LSA3.

[0091] As formulações também podem conter um antígeno anti-tumor e serem úteis para tratamento imunoterapêutico de cânceres. Por exemplo, a formulação adjuvante encontra utilidade com antígenos de rejeição de tumor tais como aqueles para cânceres de próstata, de mama, colorretal, de pulmão, pancreático, renal ou melanoma. Antígenos exemplares incluem MAGE 1 e MAGE 3 ou outros antígenos MAGE (para o tratamento de melanoma), PRAME, BAGE, ou GAGE (Robbins e Kawakami, 1996, Current Opinions in Immunology 8, pps 628-636; Van den Eynde et al., International Journal of Clinical & Laboratory Research (apresentado 1997); Correale et al. (1997), Journal of the National Cancer Institute 89, p293. De fato estes antígenos são expressados em uma ampla variedade de tipos de tumor tais como melanoma, carcinoma de pulmão, sarcoma e carcinoma de bexiga. Outros antígenos específicos de tumor são adequados para uso com os adjuvantes da presente invenção e incluem, mas não são restringidos aos gangliosídeos específicos de tumor, antígeno específico de próstata (PSA) ou Her-2/neu, KSA (GA733), PAP, mamaglobina, MUC-1, antígeno carcinoembriônico (CEA), p501S (prosteína). Conseqüentemente em um aspecto da presente invenção é proporcionada uma vacina compreendendo uma composição adjuvante de acordo com a invenção e um antígeno de rejeição de tumor. Em um aspecto, o antígeno de tumor é Her-2/neu.

[0092] Um aspecto da presente invenção provém do fato de que as vacinas compreendem uma antígeno de tumor tal como cânceres de próstata, de mama, colorretal, de pulmão, pancreático, renal ou melanoma. Conseqüentemente, as formulações podem conter antígeno associado a tumor, bem como antígenos associados com mecanismos de suporte de tumor (e.g. angiogênese, invasão de tumor). Adicionalmente, antígenos particularmente relevantes para vacinas na terapia de câncer também compreendem antígeno de membrana específico de próstata (PSMA), Antígeno de Célula-Tronco de Próstata (PSCA), p501S (prosteína), tirosinase, survivina, NY-ES01, prostase, PS108 (WO 98/50567), RAGE, LAGE, HAGE. Adicionalmente dito antígeno pode ser um hormônio auto-peptídeo tal como hormônio liberador de hormônio Gonadotropina de comprimento total (GnRH, WO 95/20600), um peptídeo curto de 10 aminoácidos de comprimento, útil no tratamento de muitos cânceres, ou em imunocastração. Vacinação

[0093] As preparações de vacina contendo composições imunogênicas da presente invenção podem ser usadas para proteger ou tratar um mamífero suscetível à infecção, por meio de administração de dita vacina via rota sistêmica ou mucosal. Estas administração podem incluir injeção via as rotas intramuscular, intraperitoneal, intradermal ou subcutânea; ou via administração mucosal nos tratos oral/alimentar, respiratório, genitourinários. Embora a vacina da invenção possa ser administrada como uma dose única, seus componentes também podem ser co-administrados juntos ao mesmo tempo ou em tempos diferentes (por exemplo conjugados de sacarídeo pneumococal poderiam ser administrados separadamente, ao mesmo tempo ou 1-2 semanas após a administração de qualquer componente proteína bacteriana da vacina para coordenação ótima das respostas imunes com respeito a um e outro). Em adição, as vacinas da invenção podem ser administradas IM para doses iniciais e IN para doses de reforço.

[0094] O teor de antígenos de proteína na vacina tipicamente estará dentro da faixa de 1-100μg, preferivelmente 5-50μg, mais tipicamente dentro da faixa de 5 - 25μg. Após uma vacinação inicial, sujeitos podem receber uma ou várias imunizações de reforço adequadamente espaçadas.

[0095] Preparação de vacina é geralmente descrita em Vaccine Design ("The subunit and adjuvante approach" (eds Powell M.F. & Newman M.J.) (1995) Plenum Press New York). Encapsulação dentro de lipossomos é descrita por Fullerton, Patente US 4.235.877.

[0096] As vacinas da presente invenção podem se armazenadas em solução ou liofilizadas. Preferivelmente a solução é liofilizada na presença de um açúcar tal como sacarose ou lactose. É ainda adicionalmente preferível que sejam liofilizadas e extemporaneamente reconstituídas antes do uso.

[0097] Em um aspecto da invenção é proporcionado um kit de vacina, compreendendo um frasco contendo uma composição imunogênica da invenção, opcionalmente na forma liofilizada, e adicionalmente compreendendo um frasco contendo um adjuvante como descrito aqui. É planejado que neste aspecto da invenção, o adjuvante será usado para reconstituir a composição imunogênica liofilizada.

[0098] Embora as vacinas da presente invenção possam ser administradas por qualquer rota, administração das vacinas descritas na pela (ID) forma uma modalidade da presente invenção. Pele humana compreende uma cutícula "córnea" externa, chamada de stratum corneum, que recobre a epiderme. Abaixo desta epiderme está uma camada chamada de derme, que por sua vez recobre o tecido subcutâneo. Pesquisadores têm mostrado que a injeção de uma vacina na pele, e em particular na derme, estimula uma resposta imune, que também pode estar associada com numerosas vantagens adicionais. Vacinação intradermal com as vacinas aqui descritas forma uma característica preferida da presente invenção.

[0099] A técnica convencional de injeção intradermal, o "procedimento mantoux", compreende etapas de limpar a pele, e então estirá- la com a mão, e com bisel de uma agulha de calibre estreito (calibre 26-31) faceando para cima a agulha é inserida em um ângulo de entre 10° e 15°. Uma vez inserido o bisel da agulha, o êmbolo da seringa com a agulha é abaixado e a agulha é adicionalmente avançada ao mesmo tempo proporcionando uma ligeira pressão para elevá-la sob a pele. O líquido é então injetado muito lentamente para deste modo formar uma bolha ou inchaço sobre a superfície da pele, seguida por uma remoção lenta da agulha.

[00100] Mais recentemente, dispositivos que são especificamente projetados para administrar agentes líquidos para dentro e através da pele têm sido descritos, por exemplo os dispositivos descritos em WO 99/34850 e EP 1092444, também os dispositivos de injeção de jato descritos por exemplo in em 01/13977; US 5.480.381, US 5.599.302, US 5.334.144, US 5.993.412, US 5.649.912, US 5.569.189, US 5.704.911, US 5.383.851, US 5.893.397, US 5.466.220, US 5.339.163, US 5.312.335, US 5.503.627, US 5.064.413, US 5.520. 639, US 4.596.556, US 4.790.824, US 4.941.880, US 4.940.460, WO 97/37705 e WO 97/13537. Métodos alternativos de administração intradermal das preparações de vacina podem incluir seringas e agulhas convencionais, ou dispositivos projetados para liberação balística de vacinas sólidas (WO 99/27961), ou remendos transdermais (WO 97/48440; WO 98/28037); ou aplicados na superfície da pele (liberação transdermal ou transcutânea WO 98/20734 ; WO 98/28037).

[00101] Quando as vacinas da presente invenção são para serem administradas à pele, ou mais especificamente para dentro da derme, a vacina está em um volume de líquido baixo, particularmente um volume de entre cerca de 0,05 mL e 0,2 mL.

[00102] O teor de antígenos nas vacinas de pele ou intradermais da presente invenção pode ser similar às doses convencionais como encontradas em vacinas intramusculares (veja acima). Contudo, é uma características das vacinas de pele ou intradermais que as formulações podem ser de "dose baixa". Conseqüentemente os antígenos de proteína em vacinas de "dose baixa" estão preferivelmente presentes em tão pouco quanto 0,1 a 10 μg, preferivelmente 0,1 a 5 μg por dose; e os antígenos de sacarídeo (preferivelmente conjugados) podem estar presentes dentro da faixa de 0,01-1 μg, e preferivelmente entre 0,01 a 0,5 μg de sacarídeo por dose.

[00103] Como aqui usado, o termo "liberação intradermal" significa liberação da vacina na região da derme na pele. Contudo, a vacina não necessariamente estará localizada exclusivamente na derme. A derme é a camada na pele localizada entre cerca de 1,0 e cerca de 2,0 mm da superfície na pele humana, mas há uma certa quantidade de variação entre indivíduos e em partes diferentes do corpo. Em geral, pode ser esperado alcançar a derme ao ir 1,5 mm abaixo da superfície d apele. A derme está localizada entre o stratum corneum e a epiderme na superfície e na camada subcutânea abaixo. Dependendo do modo de liberação, a vacina pode finalmente estar localizada apenas ou primariamente dentro da derme, ou pode finalmente estar distribuída dentro da epiderme e da derme.

[00104] A quantidade de cada antígeno em cada dose de vacina é selecionada como uma quantidade que induz uma resposta imunoprotetora sem efeitos adversos significativos em vacinas típicas. Tal quantidade variará dependendo de qual imunógeno específico é empregado e como ele está apresentado.

[00105] Em uma outra modalidade é proporcionado um método de tratamento de um indivíduo suscetível a ou sofrendo de uma doença pela administração de uma composição como substancialmente aqui descrita.

[00106] Também é proporcionado um método para prevenir um indivíduo de contrair uma doença selecionada do grupo compreendendo doenças infecciosas bacterianas e virais, doenças parasíticas, particularmente doença patogênica intracelular, doenças proliferativas tais como cânceres de próstata, de mama, colorretal, de pulmão, pancreático, renal, ovariano ou melanoma; distúrbios crônicos de não-câncer, alergia compreendendo a administração de uma composição como substancialmente aqui descrita ao dito indivíduo.

[00107] Em uma outra modalidade é proporcionada uma composição de vacina para uso em terapia ou terapia profilática de uma condição ou doença sendo que a composição de vacina compreende um antígeno ou uma composição de antígeno e uma composição adjuvante consistindo de uma emulsão de óleo-em-água compreendendo 0,5 - 10 mg de óleo metabolizável, 0,5 - 11 mg de tocol e 0,1 - 4 mg de agente emulsificador, por dose para humano.

[00108] Em uma outra modalidade é proporcionado o uso de uma composição de vacina na manufatura de um medicamento para uso em terapia profilática ou terapia de uma condição ou doença sendo que a composição de vacina compreende um antígeno ou uma composição de antígeno e uma composição adjuvante consistindo de uma emulsão de óleo-em-água compreendendo 0,5-10 mg de óleo metabolizável, 0,5- 11 mg de tocol e 0,1 - 4 mg de agente emulsificador, por dose para humano.

[00109] A invenção agora será descrita adicionalmente com referência aos seguintes exemplos não limitantes.: Exemplo I descreve métodos de leitura imunológica usados em estudos em camundongos, furões, porcos e humano.

[00110] Exemplo II descreve a preparação das formulações de adjuvante e de emulsão de óleo-em-água usadas nos estudos exemplificados.

[00111] Exemplo III mostra um teste clínico em uma população adulta de idade de 18-59 anos com uma vacina contendo uma preparação de antígeno de influenza dividida e várias doses de adjuvante AS03.

[00112] Exemplo IV mostra uma avaliação pré-clínica de vacinas de influenza dividida adjuvantadas e não-adjuvantadas (compreendendo várias doses de adjuvante AS03) em camundongos BALB/c inoculados.

[00113] Exemplo V mostra uma avaliação pré-clínica de vacinas de influenza dividida adjuvantadas e não-adjuvantadas (compreendendo várias doses de adjuvante AS03) em camundongos C57BI/16 inoculados.

[00114] Exemplo VI mostra uma avaliação pré-clínica de vacinas de influenza dividida adjuvantadas e não-adjuvantadas (compreendendo várias doses de adjuvante AS03 e antígeno em dose baixa) em camundongos C57BI/16 inoculados.

[00115] Exemplo VII mostra uma avaliação pré-clínica de vacinas de H5N1 divididas adjuvantadas e não-adjuvantadas (compreendendo várias doses de adjuvante AS03 e antígeno) em camundongos C57BI/6 inexperientes.

[00116] Exemplo VIII mostra uma avaliação pré-clínica de vacinas de influenza adjuvantadas e não-adjuvantadas em porcos Brancos Grandes inoculados Exemplo I - Métodos de leitura imunológica I.1. Métodos em camundongos I.1.1. Teste de inibição de hemaglutinação Princípio do teste (procedimento clássico).

[00117] Títulos de anticorpo anti-hemaglutinina para as três cepas do vírus de influenza (sazonal) são determinados usando o teste de inibição de hemaglutinina (HI). O princípio do teste HI é baseado na capacidade de anticorpos anti-influenza específicos de inibirem hemaglutinação de células vermelhas do sangue (RBC) pela hemaglutinina (HA) de vírus de influenza. Soros inativados por calor são tratados com Caulim e RBC para remover inibidores não específicos. Após o tratamento, diluições duplas de soros são incubadas com 4 unidades de hemaglutinação de cada cepa de influenza. Células vermelhas do sangue são então adicionadas e a inibição de aglutinação é classificada. Os títulos são expressados como o recíproco da diluição mais alta que completamente inibiu hemaglutinação. Como a primeira diluição de soros é 1:20, um nível indetectável é classificado como igual a 10. Adaptação para H5N1 (descrição específica de HI usando eritrócitos de cavalo):

[00118] Como o ensaio HI clássico para determinar anticorpos anti-HA foi documentado para não funcionar bem para a cepa H5N1, foi usado protocolo adaptado usando RBC de cavalo. Eritrócitos de cavalo são usados para as cepas Pandêmicas de H5N1. Suspensão de células vermelhas de sangue de cavalo a 0,5 % (concentração final) em tampão fosfato contendo 0,5 % de BSA (albumina de soro bovino, concentração final). Esta suspensão é preparada cada dia por lavagem da célula vermelha do sangue com o mesmo tampão fosfato e uma etapa de centrifugação subseqüente (10 min, 2000 rpm). Esta etapa de lavagem tem que ser repetida mais uma vez. Após a adição das células vermelhas de sangue de cavalo na mistura reacional de soros e suspensão viral; as placas têm que ser incubadas na temperatura ambiente (RT, 20°C +/- 2°C) por duas horas devido à velocidade de sedimentação baixa das células vermelhas de sangue de cavalo. Análise estatística

[00119] Análises estatísticas foram realizadas em títulos HI de pós- vacinação usando UNISTAT. O protocolo aplicado para análise de variância pode ser resumidamente descrito como segue: ♦ Transformação log dos dados. ♦ Teste de Shapiro-Will sobre cada população (grupo) com o propósito de verificar a normalidade da distribuição dos grupos. ♦ Teste de Cochran com o propósito de verificar a homogeneidade de variância entre as populações (grupos) diferentes. ♦ Análise de variância dos dados selecionados. ♦ Análise para interação de ANOVA bivariada. ♦ Teste de Tukey-HSD para comparações múltiplas. 1.1.2. Coloração de citocina intracelular

[00120] Esta técnica permite uma quantificação de linfócitos-T específicos para antígeno baseado na produção de citocina: células-T efetoras e/ou células-T de memória-efetora produzem IFN-y e/ou células-T de memória central produzem IL-2. PBMCs são colhidas no dia 7 após imunização.

[00121] Células linfóides são re-estimuladas in vitro na presença de inibidor de secreção (Brefeldine). Estas células são então processadas por procedimento imunofluorescente convencional usando anticorpos fluorescentes (CD4, CD8, IFN-Y e IL-2). Resultados são expressados como uma freqüência de células positivas para citocina dentro de células-T CD4/CD8. Coloração intracelular de citocinas de células-T foi realizada em PBMC 7 dias após a segunda imunização. Sangue foi colhido dos camundongos e reunido em meio RPMI+ Add heparinizado. Para sangue, suspensões de PBL diluídas com RPMI + Add foram dispostas em camadas sobre um gradiente de Linfócito-Mamífero de acordo com o protocolo recomendado (centrifugar 20 min a 2500 rpm e R.T.). As células mononucleares na interface foram removidas, lavadas 2x em RPMI + Add e suspensões de PBMCs foram ajustadas a 2 x 106 células/mL em soro fetal bovino 5% RPMI.

[00122] Estimulação in vitro por antígeno de PBMCs foi realizada em uma concentração final de 1 x 107 células/mL (tubo FACS) com Whole Fl (1μgHA/cepa) e então incubado 2 h a 37°C com a adição de anti-CD28 e anti- CD49d (1 μg/mL para ambos).

[00123] Após a etapa de reestimulação com antígeno, PBMC são incubados durante a noite a 37°C na presença de Brefeldin (1 μg/mL) a 37°C para inibir secreção de citocina. Coloração de IFN-y /IL-2/CD4/CD8 foi realizada como segue: suspensões de célula foram lavadas, ressuspensas em 50μl de PBS 1% FCS contendo 2% de reagente bloqueador Fc (1/50; 2.4G2). Após 10 min de incubação a 4°C, 50 μL de uma mistura de anti-CD4-PE (2/50) e anti-CD8 perCp (3/50) foram adicionados e incubados 30 min a 4°C. Após uma lavagem em PBS 1% FCS, células foram permeabilizadas por ressuspensão em 200 μL de Cytofix-Cytoperm (Kit BD) e incubadas 20 min a 4°C. Células foram então lavadas com Perm Wash (Kit BD) e ressuspensas com 50 μL de uma mistura de anti- IFN- Y APC (1/50) + anti-IL-2 FITC (1/50) diluída em Perm Wash. Após uma incubação de min 2 h máximo durante a noite a 4°C, células foram lavadas com Perm Wash e ressuspensas em PBS 1% FCS + 1% paraformaldeído. Análise foi realizada por FACS. Células vivas foram desbloqueadas (FSC/SSC) e aquisição foi realizada em ~ 20.000 eventos (linfócitos) ou 35.000 eventos em células-T CD4+. As percentagens de IFN-y + ou IL2+ foram calculadas em populações desbloqueadas CD4+ e CD8+. 1.1.3. ELISA de anti-H5N1.

[00124] Quantitficação de títulos de anticorpos Ig, IgG1 e IgG2b anti- H5N1 foi realizada por ELISA usando uma H5N1 dividida como revestimento. Soluções de vírus e de anticorpo foram usadas a 100 μL por cavidade. Vírus H5N1 dividido foi diluído em uma concentração final de 1 μg/mL em PBS e foi adsorvido durante a noite a 4°C nas cavidades de placas de microtítulo de 96 cavidades (Maxisorb Immunoplate Nunc 439454). As placas foram então incubadas por 1 hora a 37°C com 200 μL por cavidade de PBS contendo 1% de BSA e 0,1% de Tween 20 (tampão de saturação). Diluições de vinte e duas vezes de soros em tampão de saturação foram adicionadas nas placas revestidas com H5N1 e incubadas por 1h 30min a 37°C. As placas foram lavadas quatro vezes com PBS 0,1% Tween 20. Ig anti-camundongo conjugada-biotinilada (Prozan-E0413) diluída 1/500 ou IgG1 anti-camundongo conjugada-biotinilada (lmtech 1070-08) ,ou uma IgG2b anti-camundongo biotinilada (Imtech 1090-08) diluída 1/4000 em PBS 1% BSA 0,1% Tween 20 foi adicionada em cada cavidade e incubada por 1,30 hora a 37°C; após uma etapa de lavagem, as placas foram incubadas 30 min com uma Estreptavidina-Biotina-Preoxidase conjugada (Prozan P0397) diluída 1/10.000 em PBS 1% BSA Tween 20.

[00125] Para revelação colorimétrica, as placas foram incubadas 20 min a 22°C com uma solução de o-fenil-diamina (Sigma P4664) 0,04% H2O2 0,03% em tampão citrado 0,1 M pH 4,2. A reação foi interrompida com H2SO4 2N e microplacas foram lidas a 490-630 nm. 1.2. Métodos com furões 1.2.1. Teste de inibição de hemaglutinina (HI) Procedimento de teste.

[00126] Títulos de anticorpo anti-hemaglutinina para as três cepas de vírus de influenza foram determinadas usando o teste de inibição de hemaglutinina (HI). O princípio do teste HI é baseado na capacidade de anticorpos anti-Influenza específicos para inibir hemaglutinação de células vermelhas de sangue de galinha (RBC) pela hemaglutinina (HA) de vírus de influenza. Soros foram primeiro tratados com uma solução de neuraminidase (RDE) 25% e foram inativadas por calor para remover inibidores não- específicos. Após pré-tratamento, diluições duplas dos soros foram incubadas com 4 unidades de hemaglutinação de cada cepa de influenza. Células vermelhas de sangue de galinha foram então adicionadas e a inibição de aglutinação foi classificada. Os títulos foram expressados como o recíproco da diluição mais alta de soro que completamente inibiu hemaglutinação. Como a primeira diluição de soros foi 1:10, um nível indetectável foi classificado como um título igual a 5. Análise estatística.

[00127] Análises estatísticas foram realizadas sobre os títulos HI (Dia 41, antes do desafio) usando UNISTAT. O protocolo aplicado para análise de variância pode ser resumidamente descrito como segue: ■ Transformação log dos dados. ■ Teste de Shapiro-Will sobre cada população (grupo) com o propósito de verificar a normalidade da distribuição dos grupos. ■ Teste de Cochran com o propósito de verificar a homogeneidade de variância entre as populações (grupos) diferentes. ■ Teste para interação de ANOVA univariada. ■ Teste de Tukey-HSD para comparações múltiplas. 1.2.2. Monitoração de temperatura corporal

[00128] Temperaturas individuais foram monitoradas durante o período de desafio com os transmissores e por registro de telemetria. Todos os implantes foram checados e renovados e uma calibração nova foi realizada por DSI (Data Sciences International, Centaurusweg 123, 5015 TC Tilburg, Países-Baixos) antes do posicionamento em cavidade intraperitoneal. Todos os animais foram individualmente alojados em gaiola única durante as medições. Temperaturas foram registradas a cada 15 minutos 4 dias antes do desafio até 7 dias após o desafio. 1.2.3. Lavagens nasais

[00129] As lavagens nasais foram realizadas por administração de 5 mL de PBS em ambas as narinas de animais acordados. O inóculo foi coletado em uma placa de Petri e deixado em recipientes de amostra sobre gelo seco. Titulação viral em lavagens nasais

[00130] Todas as amostras nasais foram primeiro esterilmente filtradas através de filtros Spin X (Costar) para remover qualquer contaminação bacteriana. 50 μL de diluições décuplas seriais de lavagens nasais foram transferidas para placas de microtítulo contendo 50 μL de meio (10 cavidades/diluição). 100 μL de células MDCK (2,4 x 105 células/mL) foram então adicionados em cada cavidade e incubados a 35°C por 5-7dias.

[00131] Após 5-7 dias de incubação, o meio de cultura é cuidadosamente removido e 100 μL de um meio contendo 1/20 WST-1 são adicionados e incubados por outras 18 h.

[00132] A intensidade do corante de formazano amarelo sob redução de WST-1 por células viáveis é proporcional ao número de células viáveis presentes na cavidade no final do ensaio de titulação viral e é quantificada pela medição da absorbância de cada cavidade no comprimento de onda apropriado (450 nanômetros). O corte é definido como a OD média de células de controle não infectadas - 0,3 OD (0,3 OD corresponde a +/- 3 Desvio Padrão de OD de células de controle não infectadas). Um escore positivo é definido quando OD é < corte e em contraste um escore negativo é definido quando OD é > corte. Títulos de excreção viral foram determinados por "Reed e Muench" e expressados como Log TCID50/mL. 1.3. Métodos com porco 1.3.1. Teste de inibição de hemaglutinina (HI) Procedimento de teste.

[00133] Títulos de anticorpo anti-hemaglutinina para as três cepas de vírus de influenza foram determinadas usando o teste de inibição de hemaglutinina (HI). O princípio do teste HI é baseado na capacidade de anticorpos anti-Influenza específicos para inibir hemaglutinação de células vermelhas de sangue de galinha (RBC) pela hemaglutinina (HA) de vírus de influenza. Soros foram primeiro tratados com uma solução de neuraminidase (RDE) 25% e foram inativadas por calor para remover inibidores não- específicos. Após pré-tratamento, diluições duplas dos soros foram incubadas com 4 unidades de hemaglutinação de cada cepa de influenza. Células vermelhas de sangue de galinha foram então adicionadas e a inibição de aglutinação foi classificada. Os títulos foram expressados como o recíproco da diluição mais alta de soro que completamente inibiu hemaglutinação. Como a primeira diluição de soros foi 1:10, um nível indetectável foi classificado como um título igual a 5. Análise estatística.

[00134] Análises estatísticas foram realizadas sobre os títulos HI (Dia 41, antes do desafio) usando UNISTAT. O protocolo aplicado para análise de variância pode ser resumidamente descrito como segue: ■ Transformação log dos dados. ■ Teste de Shapiro-Will sobre cada população (grupo) com o propósito de verificar a normalidade da distribuição dos grupos. ■ Teste de Cochran com o propósito de verificar a homogeneidade de variância entre as populações (grupos) diferentes. ■ Teste para interação de ANOVA univariada. ■ Teste de Tukey-HSD para comparações múltiplas. 1.4. Ensaios para avaliar a resposta imune em humanos 1.4.1. Ensaio de inibição de hemaglutinação

[00135] A resposta imune foi determinada pela medição de anticorpos HI usando o método described pelo WHO Collaborating Centre for Influenza, Centres for Disease Control, Atlanta, USA (1991).

[00136] Medições de título de anticorpo foram conduzidas em amostras de soro descongeladas com um micrométodo abrangentemente validado usando 4 unidades de inibição de hemaglutinação (4 HIU) dos antígenos apropriados e uma suspensão de eritrócitos de ave a 0,5%. Inibidores de soro não-específicos foram removidos por tratamento com calor e enzima destruidora de receptor.

[00137] Os soros obtidos foram avaliados para níveis de anticorpo anti- HI. Partindo com uma diluição inicial de 1:10, uma série de diluições (por um fator de 2) foi preparada até uma diluição final de 1:20.480.

[00138] O ponto final da titulação foi considerado como a etapa de diluição mais alta que mostrou inibição completa (100%) de hemaglutinação. Todos os ensaios foram realizados duas vezes. 1.4.2. Ensaio de inibição de neuraminidase

[00139] O ensaio foi realizado em placas de microtítulo revestidas com fetuína. Uma série de diluição dupla do anti-soro foi preparada e misturada com uma quantidade padronizada de vírus de influenza A H3N2, H1N1 ou influenza B. O teste foi baseado na atividade biológica da neuraminidase que enzimaticamente libera ácido neuramínico de fetuína. Após clivagem do ácido neuramínico terminal β-D-glactose-N-acetil-galactosamina foi desmarcada. Aglutinina de amendoim Arachis hypogaea marcada com peroxidade de rábano (HRP), que se liga especificamente em estruturas de galactose, foi adicionada nas cavidades. A quantidade de aglutinina ligada pode ser detectada e quantificada em uma reação de substrato com tetra-metil- benzidina (TMB). A diluição de anticorpo mais alta que ainda inibe a atividade de neuraminidase viral em pelo menos 50% foi indicada como o título de Nl. 1.4.3. Ensaio de anticorpo neutralizador

[00140] Medições de anticorpo neutralizador foram conduzidas em amostras de soro congeladas descongeladas. Neutralização de vírus por anticorpos contidos no soro foi determinada em um ensaio de microneutralização. Os soros foram usados sem tratamento adicional no ensaio. Cada soro foi testado três vezes. Uma quantidade padronizada de vírus foi misturada com diluições seriais de soro e incubada para permitir ligação dos anticorpos no vírus. Uma suspensão de células, contendo uma quantidade definida de células MDCK foi então adicionada na mistura de vírus e anti- soro e incubada a 33°C. Após o período de incubação, replicação de vírus foi visualizada por hemaglutinação de células vermelhas de sangue de galinha. O título de neutralização de 50% de um soro foi calculado pelo método e Reed e Muench. 1.4.4. Imunidade mediada por célula foi avaliada por citometria de fluxo de citocina (CFC)

[00141] Células-T CD4 e CD8 específicas para antígeno de sangue periférico podem ser reestimuladas in vitro para produzirem IL-2, CD40L, TNF-alfa e IFN se incubadas com seu antígeno correspondente. Conseqüentemente, células-T CD4 e CD8 T específicas para antígeno podem ser enumeradas por citometria de fluxo após marcação de imunofluorescência convencional de fenótipo celular bem como produção de citocinas intracelulares. No presente estudo, antígeno de vacina de influenza bem como peptídeos derivados de proteína de influenza específica foram usados como antígeno para reestimular as células-T específicas para influenza. Resultados foram expressados como uma freqüência de célula-T CD4 ou CD8 positiva para citocina(s) dentro da sub-população de célula-T CD4 ou CD8. 1.4.5. Métodos estatísticos 1.4.5.1. Pontos finais primários • Percentagem, intensidade e relação com vacinação de sintomas e sinais gerais e locais solicitados durante um período de acompanhamento de 7 dias (i.e. dia de vacinação e 6 dias subseqüentes) após vacinação e total. • Percentagem, intensidade e relação com vacinação de sintomas e sinais gerais e locais não-solicitados durante um período de acompanhamento de 21 dias (i.e. dia de vacinação e 20 dias subseqüentes) após vacinação e total. • Ocorrência de efeitos adversos sérios durante o estudo inteiro. 1.4.5.2. Pontos finais secundários Para a resposta imune humoral: Variáveis observadas: • Em dias 0 e 21: títulos de anticorpo NI e inibição de hemaglutinação (HI) de soro, testados separadamente contra cada uma das três cepas de vírus de influenza representadas na vacina (anticorpos anti- H1N1, anti-H3N2 & anti-B). • Em dias 0 e 21: títulos de anticorpos neutralizadores, testados separadamente contra cada uma das três cepas de vírus de influenza representados na vacina. Variáveis derivadas (com intervalos de confiança de 95%): • Média Geométrica de títulos (GMTs) de anticorpos HI de soro com intervalos de confiança de 95% (IC 95%) de pré- e pós-vacinação • Taxas de soroconversão* com IC 95% no dia 21. • Fatores de conversão** com IC 95% no dia 21. • Taxas de soroproteção*** com IC 95% no dia 21. • GMTs de anticorpo NI de soro (com intervalos de confiança de 95%) em todos os instantes de tempo. • Taxa de soroconversão definida como a percentagem de vacinas que têm pelo menos um aumento quádruplo em títulos de HI de soro no dia 21 comparado com dia 0, para cada cepa de vacina. **Fator de conversão definido como o aumento de vezes em GMTs de HI de soro no dia 21 comparado com dia 0, para cada cepa de vacina. • **Taxa de proteção definida como a percentagem de vacinas com um título de HI de soro = 40 após vacinação (para cada cepa de vacina) que normalmente é aceita como indicando proteção.

[00142] Deve ser entendido, que para alguns testes clínicos, reatogenicidade/segurança podem ser pontos finais secundários, e imunogenicidade pode ser ponto final primário. Para a resposta imune mediada por célula (CMI) Variável observada

[00143] Em dias 0 e 21: freqüência de células CD4/CD8 positivas para citocina por 106 em testes diferentes.

[00144] Cada teste quantifica a resposta de célula-T CD4/CD8 para: • Antígeno de peptídeo de influenza (pf) (a natureza e a origem precisas destes antígenos precisam ser dadas / explicadas). • Antígeno de influenza dividida (sf). • Antígeno de influenza (wf). Variáveis derivadas: • células produzindo pelo menos duas citocinas diferentes (CD40L, IL-2, IFNY, TNFα). • células produzindo pelo menos CD40L e outra citocina (IL-2, TNFα, IFNY). • células produzindo pelo menos IL-2 e outra citocina (CD40L, TNFα, IFNY). • células produzindo pelo menos IFNY e outra citocina (IL-2, TNFα, CD40L). • células produzindo pelo menos TNFα e outra citocina (IL-2, CD40L, IFNY). 1.3.5.3. Análise de imunogenicidade

[00145] A análise de imunidade foi baseada na coorte vacinada total. Para cada grupo de tratamento, os seguintes parâmetros (com intervalos de confiança de 95%) foram calculados: • Média Geométrica de títulos (GMTs) de títulos de anticorpos HI e NI em dias 0 e 21. • Média Geométrica de títulos (GMTs) de títulos de anticorpo neutralizador em dias 0 e 21. • Fatores de conversão no dia 21. • Taxas de soroconversão (SC) no dia 21 definida como a percentagem dos vacinados que têm pelo menos um aumento quádruplo em títulos de HI de soro no dia 21 comparado com dia 0. • Taxas de proteção no dia 21 definida como a percentagem de vacinados com um título de HI de soro =1:40. • A freqüência de linfócitos-T CD4/CD8 secretando em resposta foi resumida (estatística descritiva) para cada grupo de vacinação, em cada instante de tempo (Dia 0, Dia 21) e para cada antígeno (Peptídeo de influenza (pf), influenza dividida (sf) e influenza inteira (wf)). • Estatística descritiva em diferença individual entre respostas (Pós-Pré) de instante de tempo para cada grupo de vacinação e cada antígeno (pf, sf, e wf) em 5 testes diferentes. • Um teste não-paramétrico(teste de Kruskall-Wallis) foi usado para comparar as diferenças de locação entre os 3 grupos e valor-p estatístico foram calculados para cada antígeno em cada um de 5 testes diferentes. Todos os testes de significância foram bivariados. Valores-p menores do que ou iguais a 0,05 foram considerados estatisticamente significativos. Exemplo II - Preparação das formulações de adjuvante e de emulsão de óleo- em-água

[00146] A não ser que seja enunciado de outro modo, a emulsão de óleo-em-água usada nos exemplos subseqüentes é composta de uma fase orgânica feita de 2 óleos (alfa-tocoferol e esqualeno), e uma fase aquosa de PBS contendo Tween 80 como agente emulsificador. A não ser que seja enunciado de outro modo as formulações adjuvantes de emulsão de óleo-em- água usadas nos exemplos subseqüentes foram preparadas compreendendo o seguinte componente emulsão de óleo-em-água (concentrações finais dadas): 2,5% de esqualeno (v/v), 2,5% de alfa-tocoferol (v/v), 0,9% de monooleato de polioxietileno-sorbitana (v/v) (Tween 80), veja WO 95/17210. Esta emulsão, chamada de AS03 nos exemplos subseqüentes, foi preparada como segue como um concentrado duplo. 11.1. Preparação de emulsão SB62

[00147] Este método foi usado nos estudos relatados nas seções de exemplos pré-clínicos e clínicos. A preparação da emulsão SB62 é feita por misturação sob agitação forte de uma fase oleosa composta de componentes hidrofóbicos (DL-α-tocoferol e esqualeno) e uma fase aquosa contendo os componentes solúveis em água (o detergente aniônico Tween 80 e PBS mod (modificado), pH 6,8). Enquanto agitando, a fase oleosa (1/10 do volume total) é transferida para a fase aquosa (9/10 do volume total), e a mistura é agitada por 15 minutos na temperatura ambiente. A mistura resultante foi então submetida às forças cisalhantes, de impacto e de cavitação na câmara de interação de um microfluidificador (15000 PSI - 8 ciclos, ou 3 ciclos no adjuvante usado no teste clínico relatado em Exemplo III) para produzir gotículas submicrométricas (distribuição entre 100 e 200 nm). O pH resultante é 6,8 ± 0,1. A emulsão SB62 é então esterilizada por filtração através de uma membrana de 0,22 μm e a emulsão volumosa estéril é armazenada em recipientes Cupac a de 2°C a 8°C. Gás inerte estéril (nitrogênio ou argônio) é jateado para dentro do volume morto do recipiente volumoso final de emulsão SB62 por pelo menos 15 segundos.

[00148] A composição final da emulsão SB62 é a seguinte: Tween 80: 1,8 % (v/v) 19,4 mg/mL; Esqualeno: 5 % (v/v) 42,8 mg/mL; α-tocoferol: 5 % (v/v) 47,5 mg/mL; PBS-mod: NaCl 121 mM, KCI 2,38 mM, Na2HPO4 7,14 mM, KH2PO4 1,3 mM; pH 6,8 ±0,1. Exemplo III - Teste clínico em uma população adulta de idade de 18-59 anos com uma vacina contendo uma preparação de antígeno de influenza dividida e várias doses de adjuvante AS03 (Flu-LD-004) 11.2. Introdução

[00149] Um estudo cego simples, aleatório, controlado, de fase II, foi conduzido em uma população adulta de idade de 18-59 anos em 2006 com o propósito de avaliar as imunogenicidade, segurança e reatogenicidade da vacina de influenza candidata de dose baixa da GlaxoSmithKline Biologicals (i.e. contendo 5 μg de HA por cepa) com duas doses de adjuvante AS03. A resposta imune humoral (i.e. anti-hemaglutinina) foi medida 21 dias após administração intramuscular de uma dose de uma vacina adjuvantada com AS03. Fluarix™ foi usada como referência. 11.3. Projeto de estudo

[00150] Três grupos de sujeitos receberam em paralelo a seguinte vacina intramuscularmente: ■ um grupo de 100 sujeitos recebeu uma injeção de vacina de vírus de influenza dividida de dose baixa contendo 5 μg de HA adjuvantado com AS03 (FluLD1/1). ■ um grupo de 100 sujeitos recebeu uma injeção de vacina de vírus de influenza dividida de dose baixa contendo 5 μg de HA adjuvantado com uma meia-dose de AS03 (AD03 1/2) (FluLD1/2). ■ um grupo de 100 sujeitos recebeu uma dose de Fluarix™ (Fluarix).

[00151] Horário: uma injeção IM de vacina de influenza no dia 0, visitas no sítio de estudo no dia 0 e dia 21 com coleta de amostra de sangue (determinação de anticorpo anti-HI) e um contado adicional por telefone no dia 30 (conclusão do estudo).

[00152] A vacina de influenza dividida trivalente padrão - Fluarix™ usada neste estudo, é uma vacina comercial do ano 2006 desenvolvida e fabricada por GlaxoSmithKline Biologicals. 11.4. Objetivos do estudo 11.4.1. Objetivo primário - Avaliar a resposta imune humoral induzida pelas vacinas de estudo em termos de títulos de anticorpo anti-hemaglutinina:

[00153] Variáveis observadas em dias 0 e 21: títulos de anticorpo de inibição de hemaglutinação de soro. Variáveis derivadas (com intervalos de confiança de 95%): - Média Geométrica de títulos (GMTs) de anticorpos de soro em dias 0 e 21. - Taxas de soroconversão* no dia 21. - Fatores de conversão** no dia 21. - Taxas de proteção*** em dias 0 e 21. - Taxa de soroconversão para resposta de anticorpo anti- hemaglutinina é definida como a percentagem de vacinados que têm um título de pré-vacinação < 1:10 e um título de pós-vacinação > 1:40 ou um título de pré-vacinação > 1:10 e pelo menos um aumento quádruplo no título de pós- vacinação. - *Fator de conversão definido como o aumento de vezes em GMTs de HI de soro de pós-vacinação comparado com dia 0; - ** Taxa de proteção definida como a percentagem de vacinados com um título de HI de soro >40 após vacinação que normalmente é aceita como indicando proteção. III.3.2. Objetivo secundário

[00154] - Para avaliar a segurança e a reatogenicidade das vacinas de estudo em termos de eventos adversos locais e gerais solicitados, eventos adversos não solicitados e eventos adversos sérios: 1. Ocorrência, intensidade e relação à vacinação de sintomas e sinais gerais e locais solicitados durante um acompanhamento de 7 dias (i.e. dia de vacinação e 6 dias subseqüentes)após cada vacinação em cada grupo.

[00155] 2. Ocorrência, intensidade e relação à vacinação de sintomas e sinais gerais e locais não-solicitados durante um acompanhamento de 30 dias (i.e. dia de vacinação e 29 dias subseqüentes) após a vacinação em cada grupo.

[00156] 3. Ocorrência e relação de eventos adversos sérios durante o período de estudo inteiro em cada grupo. 111.4. Composição e administração de vacina 111.4.1. Preparação de vacina

[00157] A vacina de influenza não-adjuvantada é uma vacina de influenza inativada, de virion dividido trivalente consistindo de três volumes de antígeno viral monovalente (preparados respectivamente de cepas A/H1N1, A/H3N2 e B). Os antígenos presentes nesta vacina são iguais aos da vacina licenciada Fluarix™ que está disponível como Fluarix ™ (a-Rix®) desde 1992 e contém 15 μg de HA/cepa por dose. As cepas de influenza incluídas nos lotes clínicos de FluLD são aquelas que foram escolhidas para o Hemisfério Norte 2006/2007: • Cepa A/New Caledonia/20/99 (H1N1)-semelhante: A/New Caledonia/20/99 (H1N1) IVR-116. • Cepa A/Wisconsin/67/2005 (H3N2)-semelhante: A/Wisconsin/67/ 2005 (H3N2) NYMCX-161. • B/Malaysia/2506/2004.

[00158] Os antígenos são derivados de vírus crescidos em ovo. Divisão é realizada com desoxicolato de sódio antes da etapa de inativação, que é realizada através de ação subseqüente de desoxicolato de sódio e formaldeído.

[00159] A vacina de influenza de dose baixa (FluLD) adjuvantada com AS03 (lotes clínicos) é baseada na vacina comercialmente disponível Fluarix™ (preparada a partir de respectivamente cepas de influenza A/H1N1, A/H3N2 e B), mas com um teor de antígeno mais baixo e adjuvantada com sistema adjuvante GSK de AS03. AS03 consiste de uma emulsão de óleo-em- água (SB62) que contém dois óleos biodegradáveis, esqualeno e α-tocoferol (Vitamina E), e um tensoativo, polissorbato 80 (Tween 80). Antígenos de influenza são incorporados na fase aquosa do sistema adjuvante por misturação simples com a emulsão. Duas formulações têm sido testadas, diferindo pela quantidade de adjuvante introduzida com os antígenos Flu no lote de vacina. As vacinas adjuvantadas contêm 5 μg de hemaglutinina (HA) de cada cepa de vírus de influenza por dose, combinada com uma dose inteira (AS03) ou metade de uma dose (AS03 14) do sistema adjuvante AS03. Os excipientes são os seguintes: polissorbato 80 (Tween 80), octoxinol 10 (Triton X-100), hidrogeno-succinato de alfa-tocoferila, cloreto de sódio, hidrogeno- fosfato de dissódio, di-hidrogeno-fosfato de potássio, cloreto de potássio, água para injeção. As vacinas de influenza de dose baixa adjuvantadas com AS03 (FluLD, dose total ou meia dose de AS03) são vacinas livres de conservantes. Contudo, contêm quantidades traço de tiomersal (< 1,25 μg de Hg por dose) dos estágios iniciais do processo de manufatura. São ambas apresentadas como vacinas de monodose em seringas de vidro pré-cheias (Tipo I) em um volume de 0,5 mL/dose. III.4.1.1. Composição de vacina de influenza adjuvantada com AS03

[00160] Uma dose de FluLD (dose total ou meia dose de AS03) corresponde a 0,5 mL. A composição é fornecida em Tabela 3. O teor de HA por dose é 5 μg para ambas as formulações, a única diferença sendo a quantidade de AS03 presente nos recipientes finais. Tabela 3 Composição de vacina de influenza de dose baixa adjuvantada com AS03 (dose total e meia dose deAS03)

Abreviações: HA = Hemaglutinina. O teor total em Polissorbato 80 corresponde a 4,972 mg por dose quando dose total de AS03 é usada, e 2,547 mg por dose quando meia dose de AS03 é usada. III. 4.1.2. Produção de preparação de antígeno de influenza inativado dividido

[00161] Os antígenos de influenza são idênticos àqueles incluídos em Fluarix™ (Vacina de Vírus de Influenza). Os volumes monovalentes consistem de vírus divididos inativados purificados que são preparados de sementes de trabalho das três cepas de vírus de influenza, tipo A (H1N1 e H3N2) e tipo B, que são crescidos individualmente em ovos de galinha embrionados. Estas sementes de trabalho são derivadas de cepas que são recebidas de um centro colaborador de WHO seguindo as recomendações anuais de WHO. Para o processo de preparação dos antígenos referência é feita, por meio de ilustração, a WO 02/097072. Os volumes dos três volumes monovalentes são baseados no teor de HA medido em cada volume monovalente antes da formulação e no volume de fabricação alvo.

[00162] Uma solução salina tamponada com fosfato concentrada 10 vezes (pH 7,4 quando 1 vez concentrada) e uma pré-mistura de Tween 80 e hidrogeno-succinato de α-tocoferila são diluídas em água para injeção, seguido por agitação durante 5-30 minutos na temperatura ambiente. Os três volumes monovalentes concentrados são então sucessivamente diluídos na solução salina tamponada com fosfato resultante / solução de hidrogeno- succinato de α-tocoferila - Tween 80 resultante para uma concentração de: 20 μg de HA de cada volume monovalente A (H1N1, H3N2) 23,32 μg de HA de volume monovalente B por mL de volume trivalente intermediário (5 μg de HA de cada volume monovalente A e 5,83 μg de HA de B / 500 μL de volume final trivalente).

[00163] Entre as adições de cada volume monovalente, a mistura é agitada por 10 - 30 minutos na temperatura ambiente e por 15 - 30 minutos após adição do último volume monovalente. Este volume trivalente intermediário também chamado de "pré-coleção" pode ser mantido a +2°C - +8°C ou adicionalmente processado para a etapa de formulação final no mesmo dia. O volume final de pré-coleção é de 250 μL por dose. III.4.1.3. Preparação das composições de vacina com adjuvante AS03 Vacina adjuvantada: LP AS03 1/1 (Tabela 4)

[00164] PBS mod 10 vezes concentrado (pH 7,4 quando uma vez concentrado; NaCl 137 mM, KCI 2,7 mM, Na2HPO4 8,1 mM, KH2PO4 1,47 mM, pH 7,4) bem como uma mistura contendo Tween80, Triton X-100 e VES (quantidades levando em consideração o detergente presente nas cepas) são adicionados na água para injeção. Após 5 a 30 minutos de agitação, 20 μg de HA por mL de cada cepa H1N1 e H3N2 e 23,32 μg de HA por mL de cepa B são adicionados com 10 a 30 minutos de agitação entre cada adição. Após 15 a 30 minutos de agitação, um volume pequeno do denominado "volume intermediário" é separado para análise e armazenado entre +2°C e +8°C. O volume intermediário está em PBS mod 1 vez concentrado. As concentrações de detergente do alvo são 488 μg de Tween 80 por mL, 73,6 μg de Triton X100 por mL e 66,6 μg de VES por mL.

[00165] A formulação final é então preparada: um volume igual de SB62 (veja preparação em Exemplo II) é adicionado em cada 250 μL de volume intermediário de pré-coleção e misturado durante 30 a 60 minutos na temperatura ambiente. pH é checado para faixa entre 6,8 e 7,5. Formulação é jateada com nitrogênio e então armazenada entre +2°C e 8°C antes do enchimento. Tabela 4 Vacina de dose baixa adjuvantada com AS03

(1): A composição de volume final de tampão é: NaCl 137 mM, KCI 2,7 mM, Na2HPO4 8,1 mM, KH2PO4 1,47 mM, pH 7,4 Vacina adjuvantada: LP AS03 1/2 (Tabela 5)

[00166] PBS mod 10 vezes concentrado (pH 7,4 quando uma vez concentrado - veja composição acima) bem como uma mistura contendo Tween 80, Triton X-100 e VES (quantidades considerando o detergente presente nas cepas) são adicionados em água para injeção. Após 5 a 30 minutos de agitação, 20 μg de HA por mL de cada cepa H1N1 e H3N2 e 23,32 μg de HA por mL de cepa B são adicionados com 10 a 30 minutos de agitação entre cada adição. Após 15 a 30 minutos de agitação, um volume pequeno denominado "volume intermediário" é tirado para análise e armazenado entre +2°C e +8°C. PBS mod é 1 vez concentrado no volume intermediário. As concentrações de detergente alvo são 488 μg de Tween 80 por mL, 73,6 μg de Triton X-100 por mL e 66,6 μg de VES por mL.

[00167] Formulação final é então preparada: SB62 é primeiro diluído com o tampão PBS mod e agitado por 15 - 30 minutos na RT. Um volume igual deste SB62 diluído é então adicionado em cada 250 μL de pré-coleção de volume intermediário. Após 30 a 60 minutos de agitação a RT, pH é checado para faixa entre 6,8 e 7,5. Formulação é jateada com nitrogênio e então armazenada entre +2°C e 8°C antes do enchimento.

[00168] O volume final de ambas formulações é de 500 μL por dose 500 e a concentração final de HA é de 10 μg de cada volume monovalente A e 11,66 μg de volume monovalente B por mL de volume final trivalente. Concentrações finais alvo de Tween 80, Triton X-100 (residual de manufatura de monovolume de H3N2) e hidrogeno-succinato de α-tocoferila (hidrogeno- succinato de α-tocoferila é uma forma de éster de RRR (isômero D)-α- tocoferol) são 244 μg/mL, 58,6 μg/mL e 33,3 μg/mL, respectivamente. Tabela 5 Vacina de dose baixa adjuvantada com AS03 (meia-dose de adjuvante)

(1): A composição de volume final de tampão é: NaCl 137 mM, KCI 2,7 mM, Na2HPO4 8,1 mM, KH2PO4 1,47 mM, pH 7,4 III.4.2. Administração de vacina

[00169] A vacina é adicionada em seringas de vidro estéreis de Tipo I (Ph. Eur.) de 1,25-mL. Cada seringa é cheia até um alvo de 0,57 mL (faixa: 0,54-0,60 mL). As vacinas foram administradas intramuscularmente na região deltóide do braço não-dominante. Todas as vacinas foram apresentadas como seringas pré-cheias (0,5 mL). Com o propósito de garantir injeção IM apropriada da vacina, foi usada uma agulha de pelo menos 25G e pelo menos 2,5 cm de comprimento. III.5 Resultados de população de estudo

[00170] Um total de 300 sujeitos foi inscrito neste estudo: 100 sujeitos em cada um dos 3 grupos. A idade média da coorte vacinada total no momento da vacinação foi 36,7 anos. A idade média e a distribuição de sexo dos sujeitos através dos 3 grupos de vacina foram similares. III.6 Resultados de imunogenicidade

[00171] Análise de imunogenicidade foi realizada sobre coorte de ATP para imunogenicidade (297 sujeitos). Respostas imunes humorais

[00172] Com o objetivo de avaliar a resposta imune humoral induzida pela vacina candidata de influenza de dose baixa adjuvantada com AS03, os seguintes parâmetros (com intervalos de confiança de 95%) foram calculados para cada grupo de tratamento: • Média Geométrica de títulos (GMTs) de títulos de anticorpo anti-HI em dias 0 e 21; • Taxas de soroconversão (SC) em dias 21; • Fatores de conversão no dia 21; • Taxas de proteção no dia 0 e 21. III. 6.1 Média Geométrica de títulos (GMT) de HI

[00173] Os GMTs para anticorpos HI com IC 95% são mostradas em Tabela 10 e Figura 1. Razões de GMT ajustadas entre grupos são mostradas em Tabela 11.

[00174] GMTs de pré-vacinação para anticorpos HI para todas as 3 cepas de vacina estão dentro da mesma faixa nos 3 grupos de tratamento. As GMTs observadas no dia 21 para grupos adjuvantados tendem a ser maiores do que as do grupo Fluarix para todas as 3 cepas com uma diferença estatística (sem sobreposição de CIs de 95% e razão de GMT ajustada não contém o valor 1) entre FluLD1/1 e Fluarix para a cepa de vacina A/Wisconsin. Uma diferença estatística (razão de GMT ajustada não contém o valor 1) também foi observada entre FluLD1/2 e Fluarix para a cepa de vacina B/Malaysia. Tabela 10 - Taxas de soropositividade e média geométrica de títulos (GMTs) para anticorpo anti-HA nos dias 0 e 21 (coorte ATP para imunogenicidade)

FluLD1/1 = vacina de influenza de dose baixa (5 μg de HA/cepa) com dose total de adjuvante AS03 ' FluLD1/2 = vacina de influenza de dose baixa (5 μg de HA/cepa) com meia dose de adjuvante AS03 ' Fluarix = vacina Fluarix GMT = Média geométrica de títulos de anticorpo N = Número de indivíduos com resultados disponíveis n/% = número/percentagem de indivíduos soropositivos (título de HI >= 1:10) IC 95% = intervalo de confiança de 95%, LL = limite inferior, UL = limite superior MIN/MAX = mínimo/máximo PRE = Pré-vacinação no dia 0 PI (D21) = Pós-vacinação no Dia 21 TABELA 11 - Razões de GMT ajustadas entre grupos para cada cepa de vacina no dia 21 (coorte ATP para imunogenicidade)

FluLD1/1 99 275,2 Fluarix 98 212,7 FluLD1/1 /Fluarix 1,29 0,96 1,74 FluLD1/2 99 303,4 Fluarix 98 212,6 FluLD1/2/Fluarix 1,43 1,06 1,92 FluLD1/1 = vacina de influenza de dose baixa (5 μg de HA/cepa) com dose total de adjuvante AS03 ' FluLD1/2 = vacina de influenza de dose baixa (5 μg de HA/cepa) com meia dose de adjuvante AS03 ' Fluarix = vacina Fluarix GMT ajustada = média geométrica de títulos de anticorpo ajustada para título de linha base N = Número de sujeitos com ambos os resultados de pré- e pós-vacinação disponíveis IC 95% = intervalo de confiança de 95% para a razão de GMT ajustada (modelo Ancova: ajuste para título de linha base - vacina reunida com mais de 2 hrupos); LL = limite inferior, UL = limite superior III.6.2 Fatores de conversão de títulos de anticorpo anti-HI, taxas de soroproteção e taxas de soroconversão (correlaciona com proteção como estabelecida para vacina de influenza em humanos)

[00175] Resultados são apresentados em Tabela 6 - Figura 2 para taxas de soroproteção, Tabela 7 - Figura 3 para taxas de soroconversão e Tabela 8 - Figura 4 para fatores de conversão.

[00176] O limite exigido pelas Autoridades Européias para as taxas de soroproteção (70 %) foi alcançado em todos os grupos (pelo menos 94,9 %). Para cada cepa de vacina, as taxas de soroproteção no dia 21 para os 3 grupos estiveram dentro da mesma faixa.

[00177] O limite exigido pelas Autoridades Européias para as taxas de soroconversão (40 %) foi alcançado em todos os grupos (pelo menos 65 %).

[00178] Para a cepa de vacina A/New Caledonia, a SCR no dia 21 para os 3 grupos esteve dentro da mesma faixa.

[00179] Para a cepa de vacina A/Wisconsin, a SCR no dia 21 para o grupo FluLD1/1 tendeu a ser maior comparada com o grupo grupo Fluarix. A SCR no dia 21 para o grupo FluLD1/2 esteve dentro da mesma faixa comparada com o grupo Fluarix.

[00180] Para a cepa de vacina B/Malaysia, a SCR no dia 21 for the FluLD1/2 grupo tendeu a ser mais alta comparada com o grupo Fluarix. A SCR no dia 21 para o grupo FluLD1/1 grupo esteve dentro da mesma faixa comparada com o grupo Fluarix.

[00181] O limite exigido pelas Autoridades Européias para os fatores de conversão (2,5) foi alcançado em todos os grupos (pelo menos 6,2).

[00182] Para a cepa de vacina A/New Caledonia, o SCF no dia 21 para os 3 grupos pareceu estar dentro da mesma faixa. O valor observado para grupo FluLD1/2 foi menor do que o valor observado para o grupo Fluarix mas pôde ser explicado pela taxa de soroproteção de pré-vacinação mais alta no grupo FluLD1/2.

[00183] Para a cepa de vacina A/Wisconsin, o SCF no dia 21 para o grupo FluLD1/1 tendeu a ser mais alto para o grupo Fluarix. A SCF no dia 21 para o grupo FluLD1/2 grupo esteve dentro da mesma faixa comparada com o grupo Fluarix.

[00184] Para a cepa de vacina B/Malaysia, o SCF no dia 21 para os dois grupos adjuvantados tendeu a ser mais alto comparado com o grupo Fluarix. TABELA 6 - Taxas de soroproteção (SPR) para título de anticorpo anti-HI no dia 0 e dia 21 (coorte ATP para imunogenicidade)

FluLD1/1 = vacina de influenza de dose baixa (5 μg de HA/cepa) com dose total de adjuvante AS03 FluLD1/2 = vacina de influenza de dose baixa (5 μg de HA/cepa) com meia dose de adjuvante AS03 Fluarix = vacina Fluarix N = Número de indivíduos com resultados disponíveis n/% = Número/percentagem de sujeitos soroprotegidos (título de HI >= 40 1/DIL) IC 95% = intervalo de confiança de 95%, LL = limite inferior, UL = limite superior PRE = Pré-vacinação no dia 0 PI (D1) = Pós-vacinação no Dia 21 Fonte de dados = Apêndice Tabela IIIA TABELA 7 - Taxa de soroconversão (SCR) para título de anticorpo anti-HI no dia 21 (coorte ATP para imunogenicidade)

FluLD1/1 = vacina de influenza de dose baixa (5 μg de HA/cepa) com dose total de adjuvante AS03 FluLD1/2 =vacina de influenza de dose baixa (5 μg de HA/cepa) com meia dose de adjuvante AS03 Fluarix = vacina Fluarix Soroconversão definida como: Para sujeitos inicialmente soronegativos, título de anticorpo >= 40 1/DIL após vacinação Para sujeitos inicialmente soropositivos, título de anticorpo após vacinação >= 4 vezes o título de anticorpo de pré-vacinação N = Número de sujeitos com resultados de pré- e pós-vacinação disponíveis n/% = Número/percentagem de sujeitos soroconvertidos IC 95% = intervalo de confiança de 95%, LL = limite inferior, UL = limite superior TABELA 8 - Fator de soroconversão (SCF) para título de anticorpo anti-HI no dia 21 (coorte ATP para imunogenicidade)

FluLD1/1 = vacina de influenza de dose baixa (5 μg de HA/cepa) com dose total de adjuvante AS03 FluLD1/2 = vacina de influenza de dose baixa (5 μg de HA/cepa) com meia dose de adjuvante AS03 Fluarix = vacina Fluarix N = Número de sujeitos com resultados de pré- e pós-vacinação disponíveis SCF = Fator de soroconversão ou razão de média geométrica (média[log1o(PI(D21)/PRE)]) IC 95% = intervalo de confiança de 95%, LL = limite inferior, UL = limite superior 111.7 Conclusões de segurança

[00185] Uma reatogenicidade mais alta em termos de sintomas solicitados (local/geral) e não-solicitados nos grupos de vacina adjuvantada comparados com grupo Fluarix foi a tendência global observada neste estudo.

[00186] Uma redução do teor de AS03 na vacina adjuvantada tem um impacto significativa sobre todos os sintomas grais e no local de grau 3.

[00187] A ocorrência de sintomas não-solicitados tendeu a ser maior nos grupos de vacina adjuvantada (55% e 47% dos sujeitos), comparados com o grupo Fluarix (35%).

[00188] Destes resultados, pode ser concluído que o perfil de segurança e reatogenicidade das vacinas candidatas é satisfatório e clinicamente aceitável. 111.8 . Conclusões globais 111.8.1. Resultados de imunogenicidade

[00189] O objetivo primário deste estudo foi avaliar a resposta imune humoral (títulos de anticorpo anti-HI) induzidas pela vacina de influenza de dose baixa com duas concentrações diferentes de adjuvante AS03, e por Fluarix.

[00190] No Dia 21, as três vacinas ultrapassaram as exigências das Autoridades Européias para registro anual de vacinas de influenza de virion dividido ("Note for Guidance on Harmonisation of Requirements for influenza Vaccines for the immuno-logical assessment of the annual strain changes" - CPMP/BWP/214/96). GMTs tenderam a ser mais altas nos grupos adjuvantados comparados com o grupo Fluarix, com uma diferença estatisticamente significativa observada para as cepas de vacinas A/Wisconsin (Flul_D1/1 vs. Fluarix) e B/Malaysia (Flul_D1/2 vs. Fluarix). Taxas de soroproteção similares foram observadas em todos os três grupos de vacina, variando de 94,9% a 99%. Taxas de soroconversão e fatores de soroconversão foram observados em serem mais altos nos grupos adjuvantados do que no grupo Fluarix. Dados deste teste também revelaram que a imunogenicidade induzida pela vacina com metade da dosagem de adjuvante AS03 foi comparável com aquela induzida com a dose total de adjuvante. 111.8.2. Resultados de reatogenicidade e segurança

[00191] A administração da vacina candidata de influenza de dose baixa adjuvantada com AS03 foi segura e clinicamente bem tolerada na população de estudo, i.e. pessoas adultas de idade entre 18 e 59 anos. A vacina adjuvantada em meia dose mostrou um decréscimo notável na incidência de sintomas gerais e locais, comparada com a vacina adjuvantada em dose total. Exemplo IV - Avaliação pré-clínica de vacinas de influenza divididas adjuvantadas e não-adjuvantadas (compreendendo várias doses de adjuvante AS03) em camundongos BALB/c inoculados IV. 1. Objetivo e projeto experimental

[00192] Experimentos em camundongos inoculados com influenza foram realizados com o propósito de avaliar o aumento em respostas humorais induzidas por vacinas de influenza adjuvantadas com por AS03 formuladas com este adjuvante de óleo-em-água. Para simular a situação humana, foi conduzido um experimento usando camundongos inoculados com cepas hetero-subtípicas. IV.1.1. Tratamento/grupo (Tabela 9)

[00193] Grupos de 27 camundongos adultos fêmeas BALB/c foram inoculados intranasalmente (volume de 20 μL) no dia 0 com vírus de influenza inteiro, inativado com formalina (5 μg de HA para cada cepa). Cepas inoculadas consistiram de variantes de desvio precoce (5 μg de HA inteiro inativado H1N1 A/Johannesburg/82/96, H3N2 A/Sydney/5/97, B/Harbin/7/94) em relação àquelas incluídas na vacina. Vinte e oito dias mais tarde, os camundongos foram vacinados intramuscularmente com uma dose única da vacina candidata em um volume total de 50 μL. Camundongos foram imunizados com formulações contendo antígenos divididos sozinhos (comum dividida trivalente) ou formulações contendo antígenos divididos adjuvantados com duas doses de AS03 (total ou 1/5). As cepas usadas para as imunizações incluíram antígenos virais H1N1 A/New Caledonia/20/99, H3N2 A/Panama/2007/99, B/Shangdong/7/97 (1,5 μg/cepa, 1/10 da dose para humano). Tabela 9

IV.1.2. Preparação das formulações de vacina

[00194] Uma pré-mistura de Tween 80, Triton X100 e succinato de vitamina E (VES) é preparada com o propósito de alcançar uma concentração final na vacina de 750 μg/mL de Tween 80, 110 μg/mL de Triton X100 e de 100 μg/mL de VES. As quantidades usadas na pré-mistura são calculadas considerando-se as quantidades de detergente e VES já presente nas cepas.

[00195] Preparação de um litro de tampão salino 10 vezes concentrado (PBS pH 7,4): em 0,800 L de água para injeção, adicionar NaCl 80 g, KCl 2 g, Na2HPO4 11,44 g, KH2PO4 2 g. Após solubilização, ajustar para, 1,0 L com água para injeção. pH estará em 7,4 quando diluído 10 vezes. Dividido trivalente / comum

[00196] A formulação de uma dose de 50 μL é preparada extemporaneamente de acordo com a seguinte seqüência: Água para injeção + Tampão Salino (PBS 10 vezes concentrado pH 7,4) + Pré-mistura, 5 min de agitação magnética na temperatura ambiente, + 1,5 μg de cepa HA H1N1, 10 min de agitação magnética na temperatura ambiente, + 1,5 μg de cepa HA H3N2, 10 min de agitação magnética na temperatura ambiente, + 1,5 μg de cepa HA B , 15 min de agitação magnética na temperatura ambiente. As formulações são injetadas dentro da uma hora após o final de sua preparação. Dividido trivalente /AS03

[00197] Uma pré-mistura de Tween 80, Triton X100 e succinato de vitamina E (VES) é preparada com o propósito de alcançar uma concentração final na vacina de 750 μg/mL de Tween 80, 110 μg/mL de Triton X100 e 100 μg/mL de VES. As quantidades usadas na pré-mistura são calculadas considerando-se as quantidades de detergente e de VES já presentes nas cepas.

[00198] A formulação de uma dose de 50 μL é preparada extemporaneamente de acordo com a seguinte seqüência: Água para injeção + Tampão Salino (PBS 10 vezes concentrado pH 7,4) + Pré-mistura, 5 min de agitação magnética na temperatura ambiente, + 1,5 μg de cepa HA H1N1 cepa, 10 min de agitação magnética na temperatura ambiente, + 1,5 μg de cepa HA H3N2, 10 min de agitação magnética na temperatura ambiente, + 1,5 μg de cepa HA B, 15 min de agitação magnética na temperatura ambiente, + 25 μL de emulsão SB62 para AS03 em dose total ou 4 μL de emulsãSB62 para AS03 em 1/5 dose, 15 min de agitação magnética na temperatura ambiente. As formulações são injetadas dentro de uma hora após o final de sua preparação. IV . 1.3. Leituras (Tabela 10)

[00199] A resposta imune humoral à vacinação foi medida antes da imunização (dia 28) e 14 dias após imunização (27 camundongos/grupo). Amostras de soro foram testadas pelo teste de inibição de hemaglutinação (HI). Tabela 10

V V.2. Resultados VI .2.1. Imunidade humoral

[00200] Resultados são apresentados em Figura 5. Neste modelo em camundongo de inoculação hetero-subtípica por vacinação única, foi mostrado que AS03 e suas diluições induzem títulos de HI mais altos comparado com a vacina comum. Para todas as cepas de influenza A, um aumento estatisticamente significativo de títulos de HI foi observado (p < 0,05). Para a cepa H1N1, uma diferença significativa em títulos de HI também foi observada entre AS03 e AS03 1/5 (p < 0,05). Uma dose reduzida de AS03 falhou em aumentar os títulos de HI para todas as três cepas comparadas com a vacina comum. Respostas muito baixas foram observadas contra a cepa B (B/Shangdong); isto é provavelmente devido ao desvio antigênico significativo entre as cepas B usadas para a inoculação e a vacina. VII 3. Sumário dos resultados e conclusões

[00201] Em conclusão, um aumento em títulos de HI foi observado em animais inoculados com cepas hetero-subtípicas, um aumento em títulos de HI foi observado em animais inoculados com cepas hetero-subtípicas quando se usaram vacinas adjuvantadas com AS03d comparadas com a vacina comum. Uma dose total de AS03 foi ótima para obter títulos de HI robustos contra todas as três cepas de vacina de influenza. Exemplo V - Avaliação pré-clínica de vacinas de influenza divididas adjuvantadas e não-adjuvantadas (compreendendo várias doses de adjuvante AS03) em camundongos C57BI/16 inoculados VIII Projeto e objetivo experimental

[00202] Experimentos em camundongos inoculados com influenza foram realizados com o propósito de aumentar em respostas humoral e celular induzidas pelas vacinas de influenza adjuvantadas com AS03 formuladas com este adjuvante de óleo-em-água.

[00203] Para simular uma situação humana, foi conduzido um experimento usando camundongos inoculados com cepas hetero-subtípicas. IX 1.1. Tratamento/grupo (Tabela 11)

[00204] Grupos de 25 camundongos adultos fêmeas C57BI/6 foram inoculados intranasalmente (volume de 20 μL) no dia 0 com vírus de influenza inteiro, trivalente, inativado com formalina (5 μg de HA para cada cepa). Cepas inoculadas consistiram de variantes de desvio precoce (5 μg de HA inteiro inativado H1N1 A/Beijing/262/95, H3N2 A/ Panama/2007/99, B/ Shangdong/7/97) em relação àquelas incluídas na vacina. Vinte e oito dias mais tarde, os camundongos foram vacinados intramuscularmente com uma dose única da vacina candidata em um volume total de 100 μL. Camundongos foram imunizados com formulações contendo antígenos divididos sozinhos (dividido trivalente comum) ou formulações contendo antígenos divididos adjuvantados com três doses de AS03 (total, 1/2 ou 1/5). As cepas usadas para as imunizações incluíram antígenos virais H1N1 A/New Caledonia/20/99, H3N2 A/New York/55/2004, B/Jiangsu/10/2003 (1,5 μg/cepa, 1/10 da dose para humano). Tabela 11

X .1.2. Preparação das formulações de vacina Dividido trivalente / comum

[00205] As formulações para uma dose de 100 μL são preparadas extemporaneamente de acordo com a seguinte seqüência: Água para injeção + Tampão Salino (PBS 10 vezes concentrado pH 7,4 preparado como ensinado em exemplo IV) + Fluarix Clinical Lote DFLUA014 (1,5 μg por cepa na dose final). Dividido trivalente /AS03

[00206] As formulações para uma dose de 100 μL são preparadas extemporaneamente de acordo com a seguinte seqüência: Água para injeção + Tampão Salino (PBS 10 vezes concentrado pH 7,4 preparado como ensinado em exemplo IV) + Fluarix Clinical Lote DFLUA014 (1,5 μg por cepa na dose final)+ 25 μL de emulsão SB62 para dose total ou 12,5 μL de emulsão SB62 para a dose 1/2 ou 5μL de emulsão SB62 para a dose 1/5. as formulações são injetadas dentro de uma hora após o final da preparação. XI 1.3. Leituras (Tabela 12)

[00207] A resposta imune humoral foi medida 21 dias após imunização (10 camundongos/grupo) e as amostras de soro foram testadas pelo teste de inibição de hemaglutinação (HI). A resposta imune celular foi testada 7 dias após imunização por coloração de citocina intracelular (ICS). Tabela 12

XII . Resultados XIII 1. Imunidade humoral (10 camundongos/grupo).

[00208] Resultados são apresentados em Figura 6. Neste modelo em camundongo de inoculação hetero-subtípica seguida por vacinação única, foi mostrado que AS03 e suas diluições (1/2 e 1/5) induzem títulos de HI mais altos comparados com a vacina comum. Para todas as três cepas, não foram observadas diferenças de títulos de HI entre camundongos recebendo a vacina adjuvantada com uma AS03 em dose total ou AS03 em doses reduzidas. XIV .2. Imunidade celular (15 camundongos/grupo).

[00209] Resultados são apresentados em Figura 7. Seja qual for a diluição de AS03, respostas mais altas de célula-T CD4+ foram observadas em camundongos imunizados com vacina dividida trivalente adjuvantada com AS03 comparados com camundongos imunizados com vacina comum dividida trivalente. comparado com a resposta induzida em camundongos imunizados com vacina dividida trivalente adjuvantada com AS03 em dose total, foi observada uma tendência para respostas celulares mais baixas quando camundongos foram imunizados com vacina dividida trivalente adjuvantada com doses menores de AS03. XV 3. Sumário de resultados e conclusões

[00210] Em conclusão, foi observado um aumento em respostas humorais e celulares em animais inoculados com cepas hetero-subtípicas quando se usam as vacinas adjuvantadas com AS03. Uma magnitude similar de resposta humoral foi observada entre camundongos imunizados com dose total ou doses fracionadas de adjuvante AS03. Contudo, uma redução em dose de adjuvante esteve associada com uma tendência para magnitude reduzida de resposta de célula-T CD4+. Exemplo VI - Avaliação pré-clínica da resposta imune celular induzida pelas vacinas de influenza divididas adjuvantadas e não-adjuvantadas (compreendendo várias doses de adjuvante AS03 e antígeno em dose baixa) em camundongos C57BI/16 inoculados XVI 1. Objetivo e projeto experimental

[00211] Experimentos em camundongos inoculados com influenza foram realizados com o propósito de avaliar o aumento em respostas imunes celulares por AS03 induzidas por vacinas de influenza contendo antígeno em dose baixa (0,5 μg/cepa, 1/30 de dose para humano) e formuladas com este adjuvante de óleo-em-água. Para simular uma situação humana, foi conduzido um experimento usando camundongos inoculados com cepas hetero- subtípicas. XVII .1. Tratamento/grupo (Tabela 13)

[00212] Grupos de 15 camundongos adultos fêmeas C57BI/6 foram inoculados intranasalmente (volume de 20 μL) no dia 0 com vírus de influenza inteiro, trivalente, inativado com formalina (5 μg de HA para cada cepa). Cepas inoculadas consistiram de variantes de desvio precoce (5 μg de HA inteiro inativado H1N1 A/Beijing/262/95, H3N2 A/ Panama/2007/99, B/ Shangdong/7/97) em relação àquelas incluídas na vacina. Vinte e oito dias mais tarde, os camundongos foram vacinados intramuscularmente com uma dose única da vacina candidata em um volume total de 50 μL. Camundongos foram imunizados com formulações contendo antígenos divididos sozinhos (dividido trivalente comum) ou formulações contendo antígenos divididos adjuvantados com três doses de AS03 (total, 1/2 ou 1/5). As cepas usadas para as imunizações incluíram antígenos virais H1N1 A/New Caledonia/20/99, H3N2 A/New York/55/2004, B/Jiangsu/10/2003 (0,5 μg/cepa, 1/30 da dose para humano). Tabela 13

XVIII 2. Preparação das formulações de vacina Dividido trivalente / comum

[00213] As formulações para uma dose de 50 μL são preparadas extemporaneamente de acordo com a seguinte seqüência: Água para injeção + Tampão Salino (PBS 10 vezes concentrado pH 7,4 preparado como ensinado em exemplo IV) + Fluarix Clinical Lote DFLUA014 (0,5 μg por cepa na dose final). Dividido trivalente /AS03

[00214] As formulações para uma dose de 50 μL são preparadas extemporaneamente de acordo com a seguinte seqüência: Água para injeção + Tampão Salino (PBS 10 vezes concentrado pH 7,4 preparado como ensinado em exemplo IV) + Fluarix Clinical Lote DFLUA014 (0,5 μg por cepa na dose final) + 25μL de emulsão SB62 para dose total ou 12,5μL de emulsão SB62 para a dose 1/2 ou 5μL de emulsão SB62 para a dose 1/5. As formulações são injetadas dentro de uma hora após o final da preparação. XIX 1.3. Leituras (Tabela 14)

[00215] A resposta imune celular foi testada 7 dias após imunização por coloração de citocina intracelular. Tabela 14

XX .2. Resultados XXI 2.1. Imunidade celular

[00216] Resultados são apresentados em Figura 8. Respostas marginalmente mais altas de célula-T CD4+ foram observadas em camundongos imunizados com vacina dividida trivalente adjuvantada com AS03 dose total ou 1/2 dose) comparados com camundongos imunizados com vacina comum dividida trivalente. comparado com a resposta induzida em camundongos imunizados com vacina trivalente dividida comum ou adjuvantada com uma dose total ou uma meia-dose de AS03, respostas celulares mais altas foram observadas quando camundongos foram imunizados com vacina trivalente dividida adjuvantada com 1/5 da dose de AS03. XXII . Sumário de resultados e conclusões

[00217] Em conclusão, um aumento mínimo em respostas de célula-T CD4+ foi observado em animais hetero-subtípico inoculados quando se usam vacinas adjuvantadas com AS03 comparadas com a vacina comum. Nenhuma resposta de dose de adjuvante foi observada neste experimento e de fato 1/5 da dose de AS03 induziu freqüências mais altas de células-T CD4+ específicas para antígeno do que quando visto com doses de adjuvante mais altas. No todo estes dados não são consistentes com outros experimentos pré- clínicos e podem ser sugestivos de um problema técnico com este experimento particular. Exemplo VII - Avaliação pré-clínica de vacinas de H5N1 divididas adjuvantadas e não-adjuvantadas (compreendendo várias doses de adjuvante AS03 e antígeno) em camundongos C57BI/6 inexperientes XXIII 1. Objetivo e projeto experimental

[00218] Experimentos em camundongos H5N1-inexperientes foram realizados com o objetivo de avaliar o aumento em respostas imunes celulares e humorais induzidas por vacinas divididas H5N1 adjuvantadas com por AS03 formuladas com este adjuvante de óleo-em-água. No caso de uma doença pandêmica, é esperado que toda a população mundial seja imunologicamente inexperiente à cepa de influenza pandêmica recém- circulante. Devido a este estado imune inexperiente uma vacina pandêmica provavelmente exigirá duas doses de vacina para proteger os indivíduos da infecção e doença severa causadas por uma cepa de influenza nova. Para representar esta falta de exposição prévia um modelo de camundongo inexperiente foi desenvolvido para avaliar a imunogenicidade da vacina. XXIV 1.1.1. Tratamento/grupo (Tabela 15)

[00219] Grupos de 15 camundongos adultos fêmeas inexperientes C57BI/6 foram imunizados intramuscularmente nos dias 0 e 28 com vacina candidata H5N1 em um volume total de 50 μL. Camundongos foram imunizados com formulações contendo antígenos divididos H5N1 sozinhos (H5N1 dividido comum) ou formulações contendo antígenos divididos adjuvantados com diferentes doses de AS03 (dupla, total, 1/2 ou 1/5). As cepas usadas para as imunizações incluíram antígeno viral H5N1 AA0/Vietnam/1194/04 (1,5 ou 0,38 μg/cepa correspondendo 1/10 da dose para humano).

[00220] Não foi preparada formulação com uma dose dupla de AS03 mas em vez disso uma injeção concomitante de uma dose de 50 μL de dose total de AS03 / dividida H5N1 + uma dose de 50 μL de AS03. Tabela 15

XXV .1.2. Preparação das formulações de vacina

[00221] Preparação de um litro de Tampão de Volume Final (PBS pH 7,2 ± 0,2): em 0,800 L de água para injeção, adicionar NaCl 7,699 g, KCl 0,200 g, MgCl2 x 6H2O 0,100 g, Na2HPO4 x 12 H2O 2,600 g, KH2PO4 0,373 g. Após solubilização, ajustar para 1,0 L com água para injeção H5N1 dividido/comum Preparação de uma dose de 50 μL:

[00222] Tiomersal (quantidades considerando sua concentração na cepa) e Triton X100 são adicionados no Tampão de Volume Final. Tween 80 não é adicionado porque o teor alvo na formulação é alcançado pela concentração de Tween da cepa. As concentrações finais são de 10 μg/mL para Tiomersal, 368 μg/mL para 80 e 35 μg/mL para Triton X100 na dose de formulação de 1,5 μg. São de 10 μg/mL para Tiomersal, 93 μg/mL para Tween80 e 8,9 μg/mL para Triton X100 na dose de formulação de 0,38 μg. Após 5-30 min de agitação magnética 1,5 ou 0,38 μg de HA (H5N1 cepa) são adicionados. As formulações são agitadas por 30-60 minutos. O pH é checado. Injeções ocorrem dentro de uma hora após o final da formulação. H5N1 dividido/AS03 Preparação de uma dose de 50 μL:

[00223] Tiomersal (quantidades considerando sua concentração na cepa) e Triton X100 são adicionados no Tampão de Volume Final. não é adicionado porque o teor alvo na formulação é alcançado pela concentração de Tween da cepa. As concentrações finais são de 10μg/mL para Tiomersal, 368 μg/mL para Tween 80 e 35μg/mL para Triton X100 na dose de formulação de 1,5 μg. São de 10 μg/mL para Tiomersal, 368 μg/mL para 80 e 35 μg/mL para Triton X100 na dose de formulação de 1,5 μg. São de 10 μg/mL para Tiomersal, 93 μg/mL para Tween80 e 8,9 μg/mL para Triton X100 na dose de formulação de 0,38 μg. Após 5-30min de agitação magnética 1,5 ou 0,38 μg of HA (H5N1 cepa) são adicionados. Após 5-30 min de agitação magnética 1,5 ou 0,38 μg de HA (H5N1 cepa) são adicionados. As formulações são agitadas por 30-60 minutos. O pH é checado. Injeções ocorrem dentro de uma hora após o final da formulação. XXVI 3. Leituras (Tabela 16)

[00224] A resposta imune humoral foi medida 14 dias após imunização (10 camundongos/grupo) por títulos de anticorpos Ig, IgG1 e IgG2b anti- AH5N1(Figura 9, A-F). A resposta imune humoral também foi medida 21 dias após imunização (10 camundongos/grupo) pelo ensaio de anti-inibição de hemaglutinação H5N1 (Figura 10, A-B). A resposta imune celular foi testada 6 dias após imunização (5 coleções de 3 camundongos por grupo) por coloração de citocina intracelular (ICS) de células-T CD4+ específicas para antígeno numeradas por citometria de fluxo (Figura 11, A-B). Tabela 16

XXVII . Resultados XXVIII 1. Resposta imune humoral: ELISA e isótipos. Resultados são apresentados em Figura 9.

[00225] Em cada dose de vacina dividida de H5N1, todos os grupos adjuvantados induziram títulos mais altos de Ig, IgG1 e IgG2b anti-H5N1 comparada com a vacina dividida de H5N1 não-adjuvantada (Figures 9 -A a F).

[00226] Em cada dose de vacina dividida de H5N1; a resposta de anticorpo IgG1 anti-H5N1 IgG1 foi 4-5 vezes maior do que a resposta de anticorpo IgG2b anti-H5N1 (Figuras 9 -C a F). Com uma dose de 1,5 μg de HA de vacina dividida de H5N1 e combinada com cada dose de adjuvante, não foi observada diferença de respostas de anticorpos Ig, IgG1 e IgG2b anti- H5N1 (Figuras 9-A, C e E).

[00227] Com uma dose de 0,38 μg de HA de vacina dividida de H5N1, foi observada uma tendência para títulos mais altos de Ig anti-H5N1 obtidos após imunização com vacina dividida de H5N1 adjuvantada com 2x- dose total comparada com a resposta induzida pela vacina dividida de H5N1 adjuvantada com AS03/2 (p=0,7315) e AS03 1/5 (p=0,9744) (Figura 9-B). Esta tendência também foi observada para a resposta de anticorpo IgG1 anti- H5N1 (Figura 9-D). Contudo, a potência não foi suficiente para observar uma diferença estatisticamente significativa (25% da potência para diferença de 1,7 vezes, ou 47% para uma diferença de 2 vezes). XXIX 2.2. Resposta imune humoral: títulos de HI. Com uma dose de 1,5 μg de HA/camundongos:

[00228] Em cada dose adjuvantada, todos os camundongos imunizados com vacina dividida de H5N1 adjuvantada com As03 induziram títulos de HI mais altos comparado com a resposta obtida em camundongos imunizados com a vacina dividida de H5N1 não-adjuvantada (Figura 10-A). Não foi observada diferença de títulos de HI quando vacina dividida de H5N1 foi adjuvantada com uma faixa de dose de AS03 (Figura 10-A). Com uma dose de 0,38 μg de HA/dose

[00229] Em cada dose adjuvantada, todos os camundongos imunizados com vacina dividida de H5N1 adjuvantada com As03 induziram títulos de HI mais altos comparado com a resposta obtida em camundongos imunizados com a vacina dividida de H5N1 não-adjuvantada (Figura 10B).

[00230] Títulos de HI significativamente mais altos foram observados com vacina dividida de H5N1 adjuvantada com 2x dose total de AS03 comparado com a resposta obtida com vacina dividida de H5N1 adjuvantada com AS03/2 (p=0,032 para uma diferença de 4 vezes) (Figura 10B).

[00231] Não foi observada diferença de títulos de HI em camundongos imunizados com vacina dividida de H5N1 adjuvantada com 2x dose total de AS03 ou uma dose total de AS03 ou entre camundongos imunizados com vacina dividida de H5N1 adjuvantada com AS03/2 ou AS03/5 (Figura 10B). Comparação entre dose de antígenos (1,5 μg ou 0,38 μg):

[00232] Não foi observada diferença de títulos de HI entre camundongos imunizados com cada dose HA de vacina dividida de H5N1 adjuvantada com AS03, AS03/2 ou AS03/5, exceto entre camundongos imunizados com 1,5 μg de HA H5N1 dividida adjuvantada com AS03/5 e camundongos imunizados com 0,38 μg de HA H5N1 dividida adjuvantada com 2x dose total de AS03 (Figura 10). Títulos de HI foram significativamente mais altos após imunização com 0,38 μg de HA H5N1 dividida adjuvantada com 2x dose total de AS03 comparado com as doses mais altas de antígeno combinada com a dose de adjuvante mais baixa (1,5 μg de HA com AS03/5, p=0,0193 para uma diferença de 4 vezes) (Figura 10). XXX .2.3. Resposta imune celular Resultados são apresentados em Figura 11.

[00234] Em cada dose de vacina dividida de H5N1 (1,5 μg ou 0,38 μg) respostas mais altas de célula-T CD4+ foram observadas em camundongos imunizados com vacina dividida de H5N1 adjuvantada com várias doses de AS03 comparados com camundongos imunizados com a vacina dividida de H5N1 não-adjuvantada (Figura 11).

[00235] Em uma dose de 1,5 μg vacina dividida de H5N1, uma redução das doses de AS03 correspondeu a um decréscimo em freqüências de célula-T CD4+ (Figura 11A). Contudo, em uma dose de 0,38 μg de vacina dividida de H5N1 não foi observada diferença em respostas de célula-T CD4+ entre doses de adjuvante diferentes em camundongos imunizados com vacinas divididas de H5N1 adjuvantadas com As03 (Figura 11B). XXXI 3. Sumário de resultados e conclusões

[00236] Estudos de imunogenicidade em camundongos mostraram que a vacina dividida de H5N1 adjuvantada induziu respostas humorais (anti- H5N1 ELISA e títulos de HI) e celulares (células-T CD4+) mais altas do que aquelas induzidas pela vacina dividida de H5N1 não adjuvantada.

[00237] Não foi observado efeito de resposta à dose de antígeno para a resposta entre camundongos imunizados com 1,5 μg e 0,38 μg de vacina dividida de H5N1 adjuvantada sugerindo que na presença de adjuvante até mesmo doses menores de HA podem ser exigidas para observar um efeito de resposta à dose neste modelo.

[00238] Um aumento forte em resposta de células-T CD4+ foi observado em camundongos inexperientes quando se usam as vacinas pandêmicas de H5N1 adjuvantadas com AS03 comparadas com a vacina de H5N1 comum. Não foi observado impacto de diluição de AS03 quando uma dose de 0,38 μg de vacina dividida de H5N1 foi usada como a vacina candidata, enquanto que uma diminuição de respostas de célula-T CD4 foi observada quando 1,5 μg de vacina dividida de H5N1 foi adjuvantada com a dose reduzida de AS03. Como previamente observado, não foram observadas diferenças em respostas imunes humorais e celulares entre camundongos imunizados com vacina dividida de H5N1 (em qualquer dose de antígeno) adjuvantada com uma dose total de AS03 ou com AS03/2. Alguma intensificação na resposta imune foi detectada quando 2x dose total de AS03 foi usada na formulação de vacina e conseqüentemente uma diminuição na resposta imune foi detectada quando AS03/5 foi usado na formulação de vacina.

[00239] No todo, os dados aqui relatados confirmam a potência deste novo sistema adjuvante na formulação de vacina. Exemplo VIII - Avaliação pré-clínica de vacinas de influenza adjuvantadas e não-adjuvantadas em porcos Brancos Grandes inoculados XXXII 1. Objetivo e projeto experimental

[00240] Experimento em porcos inoculados com influenza foi realizado com o propósito de avaliar o aumento em respostas humorais pelas vacinas de influenza induzidas por AS03 formuladas com este adjuvante de óleo-em-água.

[00241] Porcos foram usados com o objetivo de avaliar a faixa de dose de AS03 em um modelo animal próximo a humanos. Porcos mostram uma lista longa de analogias biológicas que estabelecem este animal como fisiologicamente mais próximo do homem com muito poucas exceções (Douglas R., 1972). Além disso, a manifestaçaõ de infecção de influenza em porcos é comumente observada. XXXIII .1. Tratamento/grupo (Tabela 17)

[00242] Grupos de 10 porcos adultos Brancos Grandes foram inoculados intranasalmente no dia 0 com vírus de influenza inteiro, trivalente, inativado com formalina (25 μg de HA para cada cepa) em um volume total de 200 μL. Cepas de inoculação consistiram de cepas homólogas às cepas de vacina (25 μg de HA inteiro inativado H1N1 A/New Caledonia/20/99, H3N2 A/Panama/2007/99 e B/Shangdong/7/97). Vinte e oito dias mais tarde, porcos foram vacinados intramuscularmente com uma dose única da vacina candidata em um volume total de 500 μL. Porcos foram imunizados com formulações contendo antígenos divididos sozinhos (trivalente dividido comum) ou formulações contendo antígenos divididos adjuvantadas com a faixa de dose de AS03 (total, 1/2 ou 1/5). As cepas usadas para as imunizações incluíram antígenos virais H1N1 A/New Caledonia/20/99, H3N2 A/Panama/2007/99 e B/Shangdong/7/97 (15μg de HA para cepas H1N1 A/New Caledonia/20/99, H3N2 A/Panama/2007/99 e 17,5 μg para cepa B/Shangdong/7/97 em uma dose para humano). Grupos (10 porcos/grupo): Tabela 17

XXXIV 1.2. Preparação das formulações de vacina Trivalente dividido / comum

[00243] Uma pré-mistura de Tween 80, Triton X100 e succinato de vitamina E (VES) é preparada com o propósito de alcançar uma concentração final na vacina de 750 μg/mL de Tween 80, 110 μg/mL de Triton X100 e 100 μg/mL de VES. As quantidades usadas na pré-mistura levam em consideração seu teor nas cepas.

[00244] A formulação de uma dose de 500 μL é preparada extemporaneamente de acordo com a seguinte seqüência: Água para injeção + Tampão Salino (PBS 10 vezes concentrado pH 7,4 preparado como ensinado em exemplo IV) + Pré-mistura, 5 min de agitação magnética na temperatura ambiente, + 15 μg de cepa HA H1N1, 10 min de agitação magnética na temperatura ambiente, + 15 μg de cepa HA H3N2, 10 min de agitação magnética na temperatura ambiente, + 17,5 μg de cepa HA B, 15 min de agitação magnética na temperatura ambiente. As formulações são injetadas dentro de uma hora após o final de sua preparação. Trivalente dividido /AS03

[00245] Uma pré-mistura de Tween 80, Triton X100 e succinato de vitamina E (VES) é preparada com o propósito de alcançar uma concentração final na vacina de 750 μg/mL de Tween 80, 110 μg/mL de Triton X100 e 100 μg/mL de VES. As quantidades usadas na pré-mistura levam em consideração seu teor nas cepas.

[00246] A formulação de uma dose de 500 μL é preparada extemporaneamente de acordo com a seguinte seqüência: Água para injeção + Tampão Salino (PBS 10 vezes concentrado pH 7,4 preparado como ensinado em exemplo IV) + Pré-mistura, 5 min de agitação magnética na temperatura ambiente, + 15 μg de cepa HA H1N1, 10 min de agitação magnética na temperatura ambiente, + 15 μg de cepa HA H3N2, 10 min de agitação magnética na temperatura ambiente, + 17,5 μg de cepa HA B, 15 min de agitação magnética na temperatura ambiente, + 250 μL de emulsão SB62 para uma dose total AS03 ou 125μL de emulsão SB62 para dose 1/2 de AS03 ou 50μL de emulsão SB62 para a dose 1/5 de AS03, 15 min de agitação magnética na temperatura ambiente. As formulações são injetadas dentro de uma hora após o final de sua preparação. VIII.1.3. Leituras (Tabela 18)

[00247] A resposta imune humoral foi medida antes da inoculação intranasal (dia 0), antes da imunização (dia 28) e 14 dias após imunização (10 porcos/grupo). Amostras de soro foram testadas pelo teste de inibição de hemaglutinação (HI). Tabela 18

VIII,2. Resultados e conclusões VIII.2.1. Imunidade humoral

[00248] Resultados são apresentados em Figura 12. Seja qual for a diluição do adjuvante, formulações divididas trivalentes com adjuvante AS03 induziram uma resposta HI mais alta para todas as cepas dom que a formulação trivalente comum neste modelo de inoculação homóloga, embora significância estatística nem sempre seja alcançada para todas as três cepas. Um efeito de dose de adjuvante dose foi observado com diferenças pequenas de cepa para cepa. Para cepas menos imunogênicas tal como B/Shangdong, apenas a vacina dividida trivalente adjuvantada com uma dose total de AS03 foi significativamente diferente da vacina comum. Em contraste à vacina dividida trivalente adjuvantada com uma dose total de AS03, uma dose reduzida de AS03 falhou em aumentar os títulos de HI para todas as três cepas acima daquelas vistas com a vacina comum.

Claims

1. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato de compreender um antígeno ou composição de antígeno e uma composição adjuvante consistindo de uma emulsão de óleo-em-água, sendo que a dita emulsão de óleo-em-água compreende 1 a 6 mg de esqualeno, 1 a 7 mg de tocol e 0,4 a 3 mg de agente emulsificador, por dose para humano.

2. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o tocol é alfa-tocoferol.

3. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o agente emulsificador é monooleato de polioxietileno-sorbitana.

4. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que o volume de dose para humano está entre 0,4 e 1,5 mL.

5. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o dito volume de dose para humano é 0,5 mL.

6. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o dito volume de dose para humano é 0,7 mL.

7. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o dito volume de dose para humano é 1,0 mL.

8. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que o antígeno ou a composição antigênica é preparado(a) a partir do vírus de Influenza.

9. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de ser para uso em terapia profilática ou terapia de uma condição ou doença.

10. Uso de uma composição imunogênica como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de ser na manufatura de um medicamento para utilização em terapia profilática ou terapia de uma condição ou doença.