CN101522218B - 包含水包油乳液佐剂的疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了包含抗原或者抗原组合物和佐剂组合物的免疫原性组合物，所述佐剂组合物包含水包油乳液，其中所述水包油乳液包含0.5-10mg可代谢油、0.5-11mg母育酚和0.1-4mg乳化剂，每人剂量。

Description

包含水包油乳液佐剂的疫苗
技术领域
本发明涉及改善的疫苗和免疫原性组合物及其在药物中的用途。本发明尤其涉及包含水包油乳液佐剂的疫苗或者免疫原性制剂及其在药物中的用途，尤其是其在增强对各种抗原的免疫应答方面的用途，并涉及制备方法，其中所述水包油乳液包含母育酚、可代谢油和乳化剂。
技术背景
始终需要具有改善的免疫原性的新组合物或者疫苗。作为一种策略，佐剂已经被用于尝试和改善对任意给定抗原产生的免疫应答和/或降低宿主中的反应原性/毒性。
水包油乳液实质上是本领域公知的，已经被建议用作佐剂组合物(EP 399843；WO95/17210)。
WO95/17210公开了包含2到10％角鲨烯，2到10％α生育酚和0.3到3％Tween 80的水包油乳液，以及其单独的或者与QS21和/或3D-MPL组合的用途。
WO99/12565公开了包含可代谢油、皂苷和甾醇的水包油乳液组合物。所述水包油乳液还包含3D-MPL。
WO99/11241公开了包含可代谢油和皂苷的水包油乳液，其中油和皂苷以1∶1到200∶1之间的比例存在。
仍然需要改善的疫苗和免疫原性组合物，以便提供合适的免疫应答并且在宿主中是较低反应原性的。
发明陈述
本发明人发现，可以使用包含更低量的水包油乳液各组分的疫苗或者免疫原性组合物，并且仍然保持抗所述组合物内抗原或者抗原组合物的类似免疫应答。这具有以下优点：保持针对抗原的免疫原性水平，并且降低宿主受体内的反应原性。
因此，在本发明的第一个方面，提供包含抗原或者抗原组合物和佐剂组合物的免疫原性组合物，所述佐剂组合物包含水包油乳液，其中所述水包油乳液包含0.5-10mg可代谢油、0.5-11mg母育酚和0.4-4mg乳化剂，每人剂量。
在本发明的另一方面，提供包含抗原或者抗原组合物和佐剂组合物的疫苗组合物，所述佐剂组合物包含水包油乳液，其中所述水包油乳液包含0.5-10mg可代谢油、0.5-11mg母育酚和0.4-4mg乳化剂，每人剂量。
在本发明的另一方面，提供疫苗或者免疫原性组合物在制备用于预防感染和/或疾病的免疫原性组合物中的用途，所述疫苗或者免疫原性组合物包含抗原或者抗原组合物和佐剂组合物，所述佐剂组合物包含水包油乳液，其中所述水包油乳液包含0.5-10mg可代谢油、0.5-11mg母育酚和0.4-4mg乳化剂。
在另一方面，提供用于预防由病原体引起的感染或者疾病的方法或者如上文所述的用途，所述病原体是作为所述免疫原性组合物中抗原来源的病原体的变体。在另一个实施方案中，提供用于预防由病原体引起的感染或者疾病的方法或者如上文所述的用途，所述病原体包含一种抗原，所述抗原是免疫原性组合物中所述抗原的变体。
附图简述
图1：临床试验：不同时间点(用于免疫原性的ATP群组)抗HA抗体的几何平均滴度(GMT)。
图2：临床试验：第0天和21天(用于免疫原性的ATP群组)具有95％置信区间的HI抗体滴度的血清保护率(SPR)。
图3：临床试验：第21天(用于免疫原性的ATP群组)具有95％置信区间的HI抗体滴度的血清转化率(SCR)。
图4：临床试验：第21天(用于免疫原性的ATP群组)具有95％置信区间的HI抗体滴度的血清转化因子(SCF)。
图5：小鼠研究：用异种亚型株(剂量范围AS03)初免(primed)的BALB/c小鼠的血细胞凝集抑制试验(GMT+/-IC95)。图5A：抗-A/新喀里多尼亚(New Caledonia)/20/99HI滴度；图5B：抗-A/巴拿马(Panama)/2007/99HI滴度。图5C：抗-B/山东(Shandong)/7/97HI滴度。
图6：小鼠研究：用异种亚型株(剂量范围AS03)初免的C57BI/6小鼠的血细胞凝集抑制试验(GMT+/-IC95)。
图7：小鼠研究：用异种亚型株(剂量范围AS03)初免的C57BI/6小鼠的细胞免疫应答(CD4+T细胞)。
图8：小鼠研究：C57BI/6小鼠PBMC中的细胞免疫应答(CD4+T细胞)，所述小鼠用异种亚型株初免，并用剂量范围AS03佐剂化的低剂量抗原(0.5μg)免疫。
图9：小鼠研究：两种不同抗原剂量：1.5μg(A、C和E)或者0.38μg(B，D和F)免疫后第14天，H5N1-特异性血清Ig ELISA滴度(A和B)以及抗H5N1 IgG1(C和D)和IgG2b(E和F)同型应答(GMT+/-IC95)。
图10：小鼠研究：两种不同抗原剂量1.5μg(A)或者0.38μg(B)免疫后第21天的血凝抑制试验(GMT+/-IC95)。
图11：小鼠研究：用剂量范围AS03佐剂化的不同剂量H5N1疫苗(1.5或者0.38μg)免疫的未免疫C57BI/6小鼠的细胞免疫应答(CD4+T细胞)：(A)1.5μg HA Ag(抗原)或者(B)0.38μg HA Ag(抗原)。
图12：猪研究：用同源株(剂量范围AS03)初免的猪的血细胞凝集抑制试验(GMT+/-IC95)。
发明详述
本发明人旨在术语“包括”、“包含”和“含有”在本文各种情况下任选分别用术语“由...组成”替换。
本文关于本发明“疫苗组合物”的实施方案也适用于关于本发明“免疫原性组合物”的实施方案，反之亦然。
在本发明的一个实施方案中，提供了包含抗原或者抗原组合物和佐剂组合物的疫苗或者免疫原性组合物，所述佐剂组合物包含水包油乳液，其中所述水包油乳液包含0.5-10mg可代谢油、0.5-11mg母育酚和0.4-4mg乳化剂，每人剂量。
在本发明的另一个实施方案中，提供包含抗原或者抗原组合物和佐剂组合物的疫苗或者免疫原性组合物，所述佐剂组合物包含水包油乳液，其中所述水包油乳液包含0.5-10mg可代谢油(诸如角鲨烯)、0.5-11mg母育酚(诸如α-生育酚)和0.4-4mg乳化剂(诸如聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯)，每人剂量。
水包油乳液组分
本发明的佐剂组合物包含水包油乳液佐剂，优选的所述乳液包含量为0.5-10mg的可代谢油、量为0.5-11mg的母育酚以及量为0.4-4mg的乳化剂，并具有油滴，油滴的至少70％(以强度计)具有小于1μm的直径。
为了使任意水包油组合物适合给人施用，乳液系统的油相必须包含可代谢油。术语可代谢油的含义是本领域公知的。可代谢可以被定义为“能够通过代谢被转化”(Dorland′s Illustrated Medical Dictionary，W.B.Sanders Company，第25版(1974))。所述油可以是任意植物油，鱼油，动物油或者合成油，它们对受体是无毒的，能够通过代谢被转化。坚果、种子和谷物是常用的植物油来源。合成油也是本发明的一部分，可以包括商品化供应的油诸如
Figure G200780038231XD00041
等。尤其合适的可代谢油是角鲨烯。角鲨烯(2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-二十四碳六烯)是一种不饱和油，大量存在于鲨鱼肝油中，少量存在于橄榄油、麦胚芽油、米糠油和酵母中，是用于本发明特别优选的油。角鲨烯是可代谢油，缘于以下事实：其是胆固醇生物合成的中间体(Merck index，第10版，编目流水号8619)。
适宜地，可代谢油以下述量存在于佐剂组合物：0.5-10mg，优选的1-10、2-10、3-9、4-8、5-7或者5-6mg(例如2-3、5-6或者9-10mg)，尤其是5.35mg或者2.14mg。在本发明另一个实施方案中，可代谢油以下述量存在于疫苗(或者免疫原性)组合物：0.5-10mg，优选的1-10、2-10、3-9、4-8、5-7或者5-6mg(例如2-3、5-6或者9-10mg)，尤其是5.35mg或者2.14mg。
疫苗或者免疫原性组合物中可代谢油的量可以被表示为总组合物的百分比。适宜地，可代谢油以下述量存在：油占组合物总体积的0.5％到2％，优选0.25-2％，或者0.25-1.75％，或者0.5-1.65％，或者0.6-1.5％，或者0.8-1.4％或者1-1.25％(v/v)。
在另一个具体实施方案中，可代谢油以疫苗(或者免疫原性)组合物总体积的大约1.25％的最终量存在。在另一个具体实施方案中，可代谢油以组合物总体积的大约0.25％(v/v)的最终量存在。
为了更清楚，可以通过下列换算因子将以v/v表示的浓度转换为以w/v表示的浓度：5％(v/v)角鲨烯浓度等同于4.28％(w/v)角鲨烯浓度。
水包油乳液包含母育酚。母育酚是本领域公知的，描述于EP0382271。适宜地，母育酚是α-生育酚或者其衍生物，诸如α-生育酚琥珀酸酯(亦称为维生素E琥珀酸酯)。适宜地，所述母育酚以下述量存在于佐剂组合物：0.5-11mg，优选的1-11、2-10、3-9、4-8、5-7、5-6(例如10-11、5-6，2.5-3.5或者1-3mg)。在一个具体实施方案中，母育酚以5.94mg或者2.38mg的量存在。在另一个实施方案中，所述母育酚适宜地以下述量存在于疫苗(或者免疫原性)组合物：0.5-11mg，优选的1-11、2-10、3-9、4-8、5-6(例如10-11、5-6，2.5-3.5或者1-3mg)。在一个具体实施方案中，母育酚以5.94mg或者2.38mg的量存在。
母育酚的量可以被表示为疫苗或者免疫原性组合物总体积的百分比。适宜地，母育酚以免疫原性组合物总体积的0.25％到2％(v/v)存在于疫苗组合物，优选地，母育酚占总体积的0.25-2％，包括0.25-2％，或者0.25-1.75％，或者0.5-1.65％，或者0.6-1.5％，或者0.8-1.4％或者1-1.25％(v/v)。
优选地，母育酚以疫苗(或者免疫原性)组合物总体积的0.2％到2％(v/v)的量存在，更优选以0.5ml剂量体积的1.25％(v/v)的量存在。
在一个具体实施方案中，母育酚以疫苗或者免疫原性组合物总体积的大约1.25％的最终量存在。在另一个具体实施方案中，母育酚以总体积0.25％(v/v)的最终量存在，或者以0.5ml剂量体积的1.25％(v/v)的最终量存在，或者以0.7ml剂量体积的0.9％(v/v)的最终量存在，或者以0.5ml剂量的0.5％(v/v)的最终量存在，或者以0.7ml疫苗或者免疫原性剂量的0.35-0.37％、优选0.36％的最终量存在。
为了更清楚，可以通过下列换算因子将以v/v表示的浓度转换为以w/v表示的浓度：5％(v/v)α-生育酚浓度等同于4.8％(w/v)α-生育酚浓度。
水包油乳液还包含乳化剂。乳化剂可以适宜的是聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯。在一个具体实施方案中，乳化剂可以选自：80或者
Figure G200780038231XD00052
80。
所述乳化剂适宜地以0.1-5、0.2-5、0.3-4、0.4-3或者2-3mg(例如0.4-1.2、2-3或者4-5mg)乳化剂的量存在于佐剂组合物。在一个具体实施方案中，乳化剂以0.97mg或者2.425mg的量存在。
此外，所述乳化剂适宜地以0.1-5、0.2-5、0.3-4、0.4-3或者2-3mg(例如0.4-1.2、2-3或者4-5mg)乳化剂的量存在于疫苗或者免疫原性组合物。在一个具体实施方案中，乳化剂以0.97mg或者2.425mg的量存在。
乳化剂的量可以被表示为疫苗或者免疫原性组合物总体积的百分比。适宜地，所述乳化剂以组合物总体积0.125-0.8％(v/v)的量存在于疫苗(或者免疫原性)组合物，优选以总体积的0.08-.05％，或者0.1-0.7％，或者0.2-0.6％，或者0.25-0.55％，或者0.3-0.52％或者0.4-0.5％(v/v)的量存在。在一个具体实施方案中，所述乳化剂以疫苗或者免疫原性组合物总体积的1％、0.5％或者0.2％(v/v)的量存在。
为了更清楚，可以通过下列换算因子将以v/v表示的浓度转换为以w/v表示的浓度：1.8％(v/v)Polysorbate 80浓度等同于1.91％(w/v)Polysorbate 80浓度。
在一个具体实施方案中，0.5ml疫苗或者免疫原性剂量体积包含0.45％(v/v)Tween 80，0.7ml剂量体积包含0.315％(v/v)Tween 80。在另一个具体实施方案中，0.5ml剂量包含0.18％(v/v)乳化剂，0.7ml疫苗或者免疫原性组合物剂量包含0.126％(v/v)乳化剂。
术语“人剂量”表示采用适用于人的体积的剂量。通常该剂量在0.25到1.5ml之间。在一个实施方案中，人剂量是0.5ml。在另一个实施方案中，人剂量大于0.5ml，例如0.6、0.7、0.8、0.9或者1ml。在另一个实施方案中，人剂量在1ml到1.5ml之间。在另一个实施方案中，尤其是当免疫原性组合物用于儿科群体时，人剂量可以小于0.5ml，诸如0.25到0.5ml之间。本发明的特征在于，免疫原性组合物内佐剂的每种或者全部单项组分的水平低于先前认为有效的水平，并且通常如上文所述。尤其合适的组合物包含下列量的下列佐剂组分，采用0.5ml的人剂量终体积：
表1
Figure G200780038231XD00071
本发明还提供包含上文指定量的上文指定单项组分的佐剂组合物，例如但不唯一的如表1所示。通常这种佐剂组合物将采用适合人剂量的体积。当佐剂采用与抗原组合物液态形式组合的液态形式时，所述佐剂组合物将采用适合人剂量的体积，该体积是人剂量预期终体积的一部分，诸如人剂量预期终体积的一半，例如对于0.7ml的预期人剂量来说是350μl体积，或者对于0.5ml的预期人剂量来说是250μl体积。当与抗原组合物组合时，所述佐剂组合物被稀释以提供疫苗的最终人剂量。这种剂量的终体积显然是不同的，这取决于佐剂组合物初始体积以及向佐剂组合物中添加的抗原组合物的体积。在选择性实施方案中，使用液体佐剂重建冻干的抗原组合物。在该实施方案中，所述佐剂组合物的适合人剂量的体积与人剂量的终体积近似相等。将所述液体佐剂组合物添加到包含冻干抗原组合物的小瓶中。最终人剂量可以在0.5到1.5ml之间变化。
制备水包油乳液的方法是本领域技术人员公知的。通常，所述方法包括将包含母育酚的油相与表面活性剂诸如PBS/TWEEN80TM溶液混合，然后利用匀浆器均化，本领域技术人员清楚包括将混合物两次通过注射器针头的方法将适用于均化小体积的液体。同样，本领域技术人员可以使用微射流机(M110S Microfluidics机，最多50次通过，最大6巴的输入压力持续2分钟(输出压力大约850巴))的乳化步骤来产生更小或者更大体积的乳液。可以通过常规实验包括测量生成的乳液进行改变，直到获得具有所需直径的油滴的制剂。
在水包油乳液中，油和乳化剂应当在水性载体中。水性载体可以是，例如磷酸盐缓冲液。
优选地，本发明的水包油乳液系统具有亚微米范围的小油滴粒度。适宜地，油滴的直径大小在120到750nm范围内，更优选的在120到600nm范围内。最优选的，水包油乳液包含油滴，其至少70％(以强度计)的直径低于500nm，更优选的80％(以强度计)的直径低于300nm，更优选至少90％(以强度计)的直径在120到200nm范围内。
本发明的油滴粒度，即直径，以强度给出。存在数种以强度测定油滴直径大小的方法。使用粒度分析装置测量强度，适宜地通过诸如Malvern Zetasizer 4000或者优选的Malvern Zetasizer 3000HS的动态光散射。详细步骤在实施例II.2中给出。第一种可能性是通过动态光散射(PCS-Photon相关光谱法)测定z平均直径ZAD；该方法额外给出了多分散指数(PDI)，ZAD和PDI这二者均用累积量算法计算。这些值不需要颗粒折射率的信息。第二种方法是通过Contin或者NNLS的另一种算法，或者自动化“Malvern”算法(由粒度分析装置提供的默认算法)测定整体粒度分布来计算油滴直径。多数情况下，由于复杂组合物的颗粒折射率是未知的，所以只考虑强度分布，如果有需要，只考虑来源于该分布的强度平均值。
任选免疫刺激剂
在本发明的另一个实施方案中，提供包含抗原或者抗原组合物和佐剂组合物的疫苗或者免疫原性组合物，所述佐剂组合物包含水包油乳液和任选一种或者多种其他免疫刺激剂，其中所述水包油乳液包含0.5-10mg可代谢油、0.5-11mg母育酚和0.4-4mg乳化剂。
在一个实施方案中，佐剂组合物包含本文所述的油水乳液。在另一个实施方案中，佐剂组合物还可以包含一种或者多种其他佐剂或者免疫刺激剂。在另一个实施方案中，佐剂组合物任选包含除QS21和/或MPL之外的一种或者多种其他佐剂或者免疫刺激剂。
任选其他佐剂选自：皂苷，脂质A或者其衍生物，免疫刺激性寡核苷酸，烷基氨基葡糖苷磷酸酯，金属盐，toll-样受体激动剂或者其组合。优选的所述佐剂是Toll样受体激动剂，尤其是Toll样受体2，3，4，7，8或者9的激动剂，或者皂苷。进一步优选的，所述佐剂系统包含来自上文列表的两种或更多种佐剂。组合优选的包含皂苷(尤其是QS21)佐剂和/或Toll样受体4激动剂诸如3D-MPL，或者Toll样受体9激动剂诸如包含CpG的免疫刺激性寡核苷酸。其他优选的组合包含皂苷(尤其是QS21)和Toll样受体4激动剂诸如皂苷(尤其是QS21)和Toll样受体4配体诸如3D-MPL或者烷基氨基葡糖苷磷酸酯。
在一个实施方案中，其他佐剂是Toll样受体(TLR)4配体，优选的是激动剂诸如脂质A衍生物，尤其是单磷酸脂A，或者更尤其是3脱酰单磷酰脂质A(3D-MPL)。
3D-MPL购自GlaxoSmithKline Biologicals North America，商标为
Figure G200780038231XD00091
其主要促进具有IFN-g(Th1)表型的CD4+T细胞应答。其可以按照GB 2220211A公开的方法制备。在化学上，其是具有3、4、5或者6条酰化链的3-脱酰单磷酰脂质A。优选的，在本发明的组合物中使用小颗粒3D-MPL。小颗粒3D-MPL具有的粒度使其可以通过0.22μm滤器过滤除菌。这种制剂描述于国际专利申请号WO94/21292。脂质A的合成衍生物是已知的，并且被认为是TLR4激动剂，包括但不限于：
OM174(2-脱氧-6-o-[2-脱氧-2-[(R)-3-十二烷酰氧基十四烷酰基氨基]-4-o-膦酰基-β-D-吡喃葡糖基]-2-[(R)-3-羟基四癸酰基氨基]-α-D-吡喃葡糖基二氢磷酸酯)，(WO95/14026)
OM 294DP(3S，9R)-3-[(R)-十二烷酰氧基十四烷酰基氨基]-4-氧代-5-氮杂-9(R)-[(R)-3-羟基十四烷酰基氨基]癸-1，10-二醇，1，10-双(二氢磷酸酯)(WO99/64301和WO00/0462)
OM197 MP-Ac DP(3S-，9R)-3-[(R)-十二烷酰氧基十四烷酰基氨基]-4-氧代-5-氮杂-9-[(R)-3-羟基十四烷酰基氨基]癸-1，10-二醇，1-二氢磷酸酯10-(6-氨基己酸酯)(WO01/46127)
可以使用的其他TLR4配体是烷基氨基葡糖苷磷酸酯(AGP)，诸如WO9850399或者US6303347公开的那些(制备AGP的步骤也被公开)，或者如US6764840公开的药学上可接受的AGP盐。一些AGP是TLR4激动剂，而一些AGP是TLR4拮抗剂。这二者被认为均可用作佐剂。
其他合适的能够通过TLR-4引起信号转导反应的TLR-4配体(Sabroe等人，JI 2003 p1630-5)是，诸如，来自革兰氏阴性菌的脂多糖及其衍生物，或者其片段，尤其是LPS的无毒衍生物(诸如3D-MPL)。其他合适的TLR激动剂是：热休克蛋白(HSP)10、60、65、70、75或者90；表面活性蛋白A，透明质酸寡糖，硫酸乙酰肝素片段，纤维连接蛋白片段，纤维蛋白原肽和b-防卫素-2，胞壁酰二肽(MDP)或者呼吸道合胞病毒的F蛋白。在一个实施方案中，TLR激动剂是HSP60、70或者90。
Toll-样受体(TLR)是I型跨膜受体，在昆虫和人之间是进化保守的。到目前为止已经确定了10种TLRs(TLRs 1-10)(Sabroe等人，JI 2003p1630-5)。TLR家族的成员具有相似的胞外和胞内结构域；已经证明它们的胞外结构域具有富含亮氨酸的重复序列，它们的胞内结构域类似于白介素-1受体(IL-1R)的胞内区。TLR细胞在免疫细胞和其他细胞(包括血管上皮细胞，脂肪细胞，心肌细胞和肠上皮细胞)之间的表达是有差异的。TLR的胞内结构域可以与接头蛋白Myd88相互作用，而Myd88在其胞质区具有IL-1R结构域，导致细胞因子的NF-кB激活；TLR激活通过这种Myd88途径影响细胞因子释放。TLR主要在诸如抗原递呈细胞的细胞类型(例如树突状细胞，巨噬细胞等等)中表达。
通过TLR刺激的树突状细胞激活导致树突状细胞的成熟，以及炎性细胞因子诸如IL-12的生成。到目前为止进行的研究已经发现TLRs识别不同类型的激动剂，尽管一些激动剂是数种TLR共有的。TLR激动剂主要来自细菌或者病毒，包括分子诸如鞭毛蛋白或者细菌脂多糖(LPS)。
“TLR激动剂”表示作为直接配体，或者间接通过内源或者外源配体的产生，能够通过TLR信号转导途径引起信号转导反应的组分(Sabroe等人，JI2003 p1630-5)。
在另一个实施方案中，TLR分子的其他天然或者合成激动剂被用作任选其他免疫刺激剂。这些可以包括，但不限于TLR2、TLR3、TLR7、TLR8和TLR9的激动剂。
在本发明的一个实施方案中，使用能够通过TLR-1引起信号转导反应的TLR激动剂(Sabroe等人，JI2003 p1630-5)。适宜地，能够通过TLR-1引起信号转导反应的TLR激动剂选自：三酰脂肽(LPs)；酚可溶性调控蛋白；结核分枝杆菌LP；S-(2，3-双(棕榈酰基氧基)-(2-RS)-丙基)-N-棕榈酰基-(R)-Cys-(S)-Ser-(S)-Lys(4)-OH，三盐酸化(Pam3 Cys)LP，其模拟细菌脂蛋白的乙酰化氨基末端以及博氏疏螺旋体的OspALP。
在另一个实施方案中，使用能够通过TLR-2引起信号转导反应的TLR激动剂(Sabroe等人，JI2003 p1630-5)。适宜地，能够通过TLR-2引起信号转导反应的TLR激动剂是以下物质的一种或者多种：来自结核分枝杆菌(M tuberculosis)、博氏疏螺旋体(B burgdorferi)、梅毒螺旋体(T pallidum)的脂蛋白、肽聚糖、细菌脂肽；来自包括金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的种属的肽聚糖；脂磷壁酸，甘露糖醛酸，奈瑟氏菌孔蛋白，细菌菌毛，耶尔森氏菌毒性因子CMV病毒粒子，囊虫血细胞凝集素和酵母的酵母聚糖。
在一个选择性的实施方案中，使用能够通过TLR-3引起信号转导反应的TLR激动剂(Sabroe等人，JI2003 p1630-5)。适宜地，能够通过TLR-3引起信号转导反应的TLR激动剂是双链RNA(dsRNA)，聚肌胞苷酸(Poly IC)，与病毒感染有关的分子核酸模式。
在一个选择性的实施方案中，使用能够通过TLR-5引起信号转导反应的TLR激动剂(Sabroe等人，JI2003 p1630-5)。适宜地，能够通过TLR-5引起信号转导反应的TLR激动剂是细菌鞭毛蛋白。
在一个选择性的实施方案中，使用能够通过TLR-6引起信号转导反应的TLR激动剂(Sabroe等人，JI2003 p1630-5)。适宜地，能够通过TLR-6引起信号转导反应的TLR激动剂是分枝杆菌脂蛋白，二酰化LP和酚可溶性调控蛋白。其他的TLR6激动剂描述于WO2003043572。
在一个选择性的实施方案中，使用能够通过TLR-7引起信号转导反应的TLR激动剂(Sabroe等人，JI2003 p1630-5)。适宜地，能够通过TLR-7引起信号转导反应的TLR激动剂是单链RNA(ssRNA)，loxoribine，在N7和C8位的鸟苷类似物，或者咪唑并喹啉化合物，或者其衍生物。在一个实施方案中，TLR激动剂是咪喹莫特。其他的TLR7激动剂描述于WO02085905。
在一个选择性的实施方案中，使用能够通过TLR-8引起信号转导反应的TLR激动剂(Sabroe等人，JI2003 p1630-5)。适宜地，能够通过TLR-8引起信号转导反应的TLR激动剂是单链RNA(ssRNA)，具有抗病毒活性的咪唑并喹啉分子，诸如瑞喹莫德(R848)；瑞喹莫德还能够被TLR-7识别。其他可以使用的TLR-8激动剂包括在WO2004071459中描述的那些。
还可以使用免疫刺激性寡核苷酸或者任意其他Toll-样受体(TLR)9激动剂。用于本发明佐剂或者疫苗或者免疫原性组合物的优选寡核苷酸是包含CpG的寡核苷酸，优选的包含两个或者更多个二核苷酸CpG模体，所述CpG模体被至少3个，更优选的被至少6个或者更多个核苷酸分离。CpG模体是指胞嘧啶核苷酸后跟着鸟苷酸。本发明的CpG寡核苷酸通常是脱氧核苷酸。在一个优选实施方案中，寡核苷酸中的核苷酸间键是二硫代磷酸酯键，或者更优选的硫代磷酸酯键，但是磷酸二酯和其他核苷酸间键也属于本发明的范围。本发明的范围还包括具有混合核苷酸间键合的寡核苷酸。用于产生硫代磷酸酯寡核苷酸或者二硫代磷酸酯的方法描述于US5,666,153、US5,278,302和WO95/26204。
优选寡核苷酸的实例具有下列序列。所述序列优选的包含硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键合
OLIGO 1(SEQ ID NO：1)：TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT(CpG 1826)
OLIGO 2(SEQ ID NO：2)：TCT CCC AGC GTG CGC CAT(CpG 1758)
OLIGO 3(SEQ ID NO：3)：ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG
OLIGO 4(SEQ ID NO：4)：TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT(CpG 2006)
OLIGO 5(SEQ ID NO：5)：TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT(CpG 1668)
OLIGO 6(SEQ ID NO：6)：TCG ACG TTT TCG GCG CGC GCC G(CpG 5456)
另外的CpG寡核苷酸可以包含上述优选的序列，在其上具有不连续的缺失或者添加。本发明使用的CpG寡核苷酸可以利用本领域任意已知的方法(例如参见EP 468520)合成。方便地，可以利用自动合成仪来合成这种寡核苷酸。
因此，在另一个实施方案中，佐剂组合物还包含增加的免疫刺激剂，所述免疫刺激剂选自：TLR-1激动剂，TLR-2激动剂、TLR-3激动剂、TLR-4激动剂、TLR-5激动剂、TLR-6激动剂、TLR-7激动剂、TLR-8激动剂、TLR-9激动剂或者其组合。
另一种优选的用于本发明的免疫刺激剂是Quil A及其衍生物。QuilA是从南美洲树木Quilaja Saponaria Molina分离的皂苷制剂，Dalsgaard等人在1974年(“Saponin adjuvants”，Archiv.fur die gesamteVirusforschung，Vol.44，Springer Verlag，Berlin，p243-254)第一次描述了其具有佐剂活性。通过HPLC已经分离出Quil A的纯化片段，其保留了佐剂活性但没有与Quil A有关的毒性(EP 0362278)，例如QS7和QS21(亦称为QA7和QA21)。QS-21是源自Quillaja saponaria Molina树皮的天然皂苷，诱导CD8+细胞毒性T细胞(CTLs)、Th1细胞以及显著的IgG2a抗体应答，其在本发明范围内是优选的皂苷。
QS21的具体制剂已经被描述，尤其优选的是这些制剂还包含甾醇(WO96/33739)。当包括角鲨烯和皂苷(任选的QS21)时，有利的是在所述制剂中还包含甾醇(任选的胆固醇)，因为这可以降低乳液中油的总水平。这可以导致制备成本的降低，接种总舒适度的改善，以及所获免疫应答的定性和定量改进，诸如提高的IFN-γ生成。因此，本发明的佐剂系统通常包含的可代谢油∶皂苷比例(w/w)的范围为200∶1到300∶1，另外本发明还可以使用“低油”形式，任选范围是1∶1到200∶1，任选的20∶1到100∶1，或者基本上48∶1，这种疫苗保留了所有组分的有益佐剂性质，并且反应原性模式降低很多。因此，一些实施方案的角鲨烯∶QS21比例(w/w)范围是1∶1到250∶1，或者20∶1到200∶1，或者20∶1到100∶1，或者基本上48∶1。任选的甾醇(例如胆固醇)也被包括，以本文描述的皂苷∶甾醇的比例存在。
抗原和抗原组合物
疫苗或者免疫原性制剂将包含能够引发抗人或者动物病原体的免疫应答的抗原或者抗原组合物。
适宜地，所述抗原或者抗原组合物来源于下列中的一种或者多种：HIV-1(诸如gag或者其片段，诸如p24、tat、nef、gp120或者gp160或者这些中任一的片段)、人疱疹病毒、诸如gD或者其衍生物或者立即早期蛋白，诸如来自HSV1或者HSV2的ICP27，巨细胞病毒((尤其是人)(诸如gB或者其衍生物)，轮状病毒(包括减毒活病毒)、Epstein Barr病毒(诸如gp350或者其衍生物)、水痘带状疱疹病毒(诸如gpI、II和IE63)、或者来自肝炎病毒诸如乙型肝炎病毒(例如乙型肝炎表面抗原或者其衍生物)、甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和戊型肝炎病毒、或者来自其他病毒病原体，诸如副粘病毒：呼吸道合胞病毒(诸如F、N、M和G蛋白或者其衍生物)、SARS病毒、副流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、人乳头瘤病毒(例如HPV6、11、16、18)、黄病毒(例如黄热病毒、登革热病毒、蜱传脑炎病毒、日本脑炎病毒)或者流感病毒(完整的活病毒或者失活病毒，在卵中或者MDCK细胞中生长的裂解流感病毒，或者完整流感病毒颗粒(如R.Gluck，Vaccine，1992，10，915-920所述)或者其纯化蛋白或者重组蛋白，诸如HA、NP、NA或者M蛋白，或者其组合)、或者源自细菌性病原体诸如奈瑟氏菌(Neisseria spp)，包括淋病奈瑟氏菌(N.gonorrhea)和脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)(例如荚膜糖类及其偶联物，转铁蛋白结合蛋白，乳铁蛋白结合蛋白、PiIC、粘附素)；化脓链球菌(S.pyogenes)(例如M蛋白或者其片段，C5A蛋白酶，脂磷壁酸)、无乳链球菌(S.agalactiae)、变异链球菌(S.mutans)；杜氏嗜血菌(H.ducreyi)；莫拉氏菌(Moraxella spp)，包括粘膜莫拉氏菌(Mcatarrhalis)，也称为粘膜炎布兰汉氏球菌(Branhamella catarrhalis)(例如高分子量和低分子量的粘附素和侵袭素)；博德特氏菌(Bordetellaspp)，包括百日咳博德特氏菌(B.pertussis)(例如pertactin、百日咳毒素或者其衍生物、丝状血凝素、腺苷酸环化酶、菌毛)、副百日咳博德特氏菌(B.parapertussis)和支气管炎博德特氏菌(B.bronchiseptica)；分枝杆菌(Mycobacterium spp.)，包括结核分枝杆菌(M.tuberculosis)(例如ESAT6、抗原85A、-B或者-C)、牛分枝杆菌(M.bovis)、麻风分枝杆菌(M.leprae)、鸟分枝杆菌(M.avium)、副结核分枝杆菌(M.paratuberculosis)、耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)；军团菌(Legionellaspp)，包括侵肺军团菌(L.pneumophila)；埃希氏菌(Escherichia spp)，包括肠产毒性大肠杆菌(enterotoxic E.coli)(例如定居因子、热不稳定毒素或者其衍生物、热稳定毒素或者其衍生物)、肠出血性大肠杆菌、肠致病性大肠杆菌(例如志贺毒素样毒素或者其衍生物)；弧菌(Vibrio spp)，包括霍乱弧菌(V.cholera)(例如霍乱毒素或者其衍生物)；志贺氏菌(Shigella spp)，包括索氏志贺氏菌(S.sonnei)、痢疾志贫氏菌(S.dysenteriae)、弗氏志贫氏菌(S.flexnerii)；耶尔森氏菌(Yersinia spp)，包括小肠结肠炎耶尔森氏菌(Y.enterocolitica)(例如Yop蛋白)、鼠疫耶尔森氏菌(Y.pestis)、假结核病耶尔森氏菌(Y.pseudotuberculosis)；弯曲杆菌(Campylobacter spp)，包括空肠弯曲杆菌(C.jejuni)(例如毒素、粘附素粘附素和侵袭素)和大肠弯曲杆菌(C.coli)；沙门氏菌(Salmonellaspp)，包括伤寒沙门氏菌(S.typhi)、副伤寒沙门氏菌(S.paratyphi)、猪霍乱沙门氏菌(S.choleraesuis)、肠炎沙门氏菌(S.enteritidis)；李斯特氏菌(Listeria spp.)，包括单核细胞增生李斯特氏菌(L.monocytogenes)；螺杆菌(Helicobacter spp)，包括幽门螺杆菌(H.pylori)(例如脲酶、过氧化氢酶、空泡毒素)；假单胞菌(Pseudomonas spp)，包括铜绿假单胞菌P.aeruginosa)；葡萄球菌(Staphylococcus spp.)，包括金黄色葡萄球菌(S.aureus)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)；肠球菌(Enterococcus spp.)，包括粪肠球菌(E.faecalis)、尿肠球菌(E.faecium)；梭菌(Clostridium spp.)，包括破伤风梭菌(C.tetani)(例如破伤风毒素及其衍生物)、肉毒梭菌(C.botulinum)(例如肉毒毒素及其衍生物)、艰难梭菌(C.difficile)(例如梭菌毒素A或者B及其衍生物)；芽胞杆菌(Bacillus spp.)，包括炭疽芽胞杆菌(B.anthracis)(例如肉毒毒素及其衍生物)；棒杆菌(Corynebacteriumspp.)，包括白喉棒杆菌(C.diphtheriae)(例如白喉毒素及其衍生物)；疏螺旋体(Borrelia spp.)，包括布氏疏螺旋体(B.burgdorferi)(例如OspA、OspC、DbpA、DbpB)、格氏疏螺旋体(B.garinii)(例如OspA、OspC、DbpA、DbpB)、阿氏疏螺旋体(B.afzelii)(例如OspA、OspC、DbpA、DbpB)、B.andersonii(例如OspA、OspC、DbpA、DbpB)、赫氏疏螺旋体(B.hermsii)；埃里希氏体(Ehrlichia spp.)，包括马埃里希氏体(E.equi)和人粒细胞埃里希氏体(Ehrlichiosis)；立克次氏体(Rickettsia spp)，包括立氏立克次氏体(R.rickettsii)；衣原体(Chlamydia spp.)，包括砂眼(C.trachomatis)(例如MOMP，肝素结合蛋白)、肺炎衣原体(C.pneumoniae)(例如MOMP，肝素结合蛋白)、鹦鹉热衣原体(C.psittaci)；钩端螺旋体(Leptospira spp.)，包括问号钩端螺旋体(L.interrogans)；密螺旋体(Treponema spp.)，包括苍白密螺旋体(T.pallidum)(例如稀有外膜蛋白)、齿垢密螺旋体(T.denticola)、猪痢疾密螺旋体(T.hyodysenteriae)；或者来源于寄生物，诸如疟原虫(Plasmodium spp.)，包括恶性疟原虫(P.falciparum)；弓形虫(Toxoplasma spp.)，包括鼠弓形虫(T.gondii)(例如SAG2、SAG3、Tg34)；内变形虫(Entamoeba spp.)，包括痢疾内变形虫(E.histolytica)；巴贝虫(Babesia spp.)，包括果氏巴贝虫(B.microti)；锥虫(Trypanosoma spp.)，包括克香氏锥虫(T.cruzi)；贾第虫(Giardia spp.)，包括表吮贾第虫(G.lamblia)；利什曼虫(Leshmania spp.)，包括硕大利什曼虫(L.major)；肺囊虫(Pneumocystis spp.)，包括卡氏肺囊虫(P.carinii)；毛滴虫(Trichomonas spp.)，包括阴道毛滴虫(T.vaginalis)；血吸虫(Schisostoma spp.)，包括曼氏血吸虫(S.mansoni)，或者源自酵母诸如假丝酵母(Candida spp.)，包括白色假丝酵母(C.albicans)；隐球酵母(Cryptococcus spp.)，包括新型隐球酵母(C.neoformans)。
本发明的组合物可用于变态反应的预防或者治疗。这种疫苗将包含变应原特异性以及变应原非特异性的抗原。
结核分枝杆菌(M.tuberculosis)的其他优选特异性抗原是例如TbRa12、Tb H9、Tb Ra35、Tb38-1、Erd 14、DPV、MTI、MSL、mTTC2和hTCC1(WO 99/51748)。针对结核分枝杆菌的蛋白还包括融合蛋白及其变体，其中结核分枝杆菌的至少两个，优选的三个多肽被融合成更大的蛋白。优选的融合体包括Ra12-TbH9-Ra35、Erd 14-DPV-MTI、DPV-MTI-MSL、Erd 14-DPV-MTI-MSL-mTCC2、Erd 14-DPV-MTI-MSL、DPV-MTI-MSL-mTCC2、TbH9-DPV-MTI(WO 99/51748)。
衣原体最优选的抗原包括例如高分子量蛋白(HMW)(WO99/17741)、ORF3(EP 366412)和推定的膜蛋白(Pmps)。疫苗制剂的其他衣原体抗原可以选自WO 99/28475描述的组。
优选的细菌疫苗包含来自链球菌(Streptococcus spp)的抗原，包括肺炎链球菌(S.pneumoniae)(例如PsaA、PspA、链球菌溶血素、胆碱结合蛋白)和蛋白抗原肺炎链球菌溶血素(Biochem Biophys Acta，1989，67，1007；Rubins等人.，Microbial Pathogenesis，25，337-342)，和其突变的脱毒衍生物(WO 90/06951；WO 99/03884)。其他优选的细菌疫苗包含源自嗜血杆菌(Haemophilus spp.)的抗原，包括B型流感嗜血杆菌(H.influenzae)，不定型的嗜血杆菌，例如OMP26，高分子量粘附素、P5、P6、蛋白D和脂蛋白D、以及丝束蛋白和丝束蛋白衍生的肽(US5,843,464)或者其多重拷贝变体或者融合蛋白。
乙型肝炎表面抗原的衍生物是本领域公知的，并且尤其包括，在欧洲专利申请EP-A-414374；EP-A-0304578和EP 198-474中描述的PreS1、PreS2 S抗原。在一个优选的方面，本发明的疫苗制剂包含HIV-1抗原，gp120，尤其是在CHO细胞中表达时。在另一个实施方案中，本发明的疫苗制剂包含如上文所述的gD2t。
在本发明的一个优选实施方案中，包含所述佐剂的疫苗包含源自人乳头瘤病毒(HPV)的抗原，HPV被认为造成生殖器疣(HPV 6或者HPV 11等)，并且HPV病毒还造成子宫颈癌(HPV16、HPV18等)。
生殖器疣的预防或者治疗疫苗的尤其优选形式包含L1蛋白，和包含选自HPV蛋白E1、E2、E5、E6、E7、L1和L2的一种或者多种抗原的融合蛋白。
融合蛋白最优选的形式是：WO 96/26277公开的L2E7，和WO99/10375公开的蛋白D(1/3)-E7。
优选的HPV子宫颈感染或者癌症的预防或者治疗疫苗，组合物可以包含HPV 16或者18抗原。
尤其优选的HPV 16抗原包含早期蛋白E6或者E7，其与蛋白D载体融合，形成来自HPV 16的蛋白D-E6或者E7融合体HPV 16，或者其组合；或者E6或者E7与L2的组合(WO 96/26277)。
或者，HPV 16或者18早期蛋白E6和E7可以单分子形式存在，优选的为蛋白D-E6/E7融合体。这种疫苗任选包含HPV 18的E6和E7蛋白的任一种或两种，优选的为蛋白D-E6或者蛋白D-E7融合蛋白或者蛋白D E6/E7融合蛋白的形式。
本发明的疫苗可以另外包含来自其他HPV毒株的抗原，优选的来自毒株HPV 31或者33。
本发明的疫苗或者免疫原性组合物还包含源自可导致疟疾的寄生物的抗原，例如，来自恶性疟原虫的抗原，包括环孢子蛋白(CS蛋白)、RTS、S、MSP1、MSP3、LSA1、LSA3、AMA1和TRAP。RTS是一种杂合蛋白，含有恶性疟原虫环孢子(CS)蛋白的基本上全部C端部分，该部分经乙型肝炎表面抗原preS2部分的4个氨基酸连接到乙型肝炎病毒的抗原表面。其完整结构在国际专利申请号PCT/EP92/02591中公开，公开号为WO 93/10152，其要求UK专利申请号9124390.7的优先权。当在酵母中表达时，RTS作为脂蛋白颗粒产生，而当其与HBV的S抗原共表达时，产生被称为RTS，S的混合颗粒。TRAP抗原在国际专利申请号PCT/GB89/00895中描述，其公开号为WO 90/01496。可能是多期疟疾疫苗组分候选物的疟原虫抗原是恶性疟原虫MSP1、AMA1、MSP3、EBA、GLURP、RAP1、RAP2、钳合蛋白、PfEMPI、Pf332、LSA1、LSA3、STARP、SALSA、PfEXPI、Pfs25、Pfs28、PFS27/25、Pfs16、Pfs48/45、Pfs230和它们在疟原虫中的类似物。本发明的一个实施方案是一种疟疾疫苗，其中抗原制剂包含RTS1S或者CS蛋白或者其片段，诸如RTS，S的CS部分，它们与一种或者多种其他疟疾抗原组合，这两者中的任一种或者两种都可以按照本发明与志贺毒素B亚基连接。所述一种或者多种其他疟疾抗原可以选自例如MPS1、MSP3、AMA1、LSA1或者LSA3。
制剂还可以包含抗肿瘤抗原，并用于癌症的免疫治疗性治疗。例如，所述佐剂制剂可用于肿瘤排斥抗原，诸如针对前列腺癌，乳腺癌，结肠直肠癌，肺癌，胰腺癌，肾癌或者黑素瘤的抗原。示例性的抗原包括MAGE1和MAGE3或者其他MAGE抗原(用于黑素瘤的治疗)，PRAME，BAGE或者GAGE(Robbins and Kawakami，1996，CurrentOpinions in Immunology 8，pps 628-636；Van den Eynde等人.，International Journal of Clinical & Laboratory Research(1997年提交)；Correale等人.(1997)，Journal of the National Cancer Institute 89，p293)。实际上，这些抗原在广泛的肿瘤类型中表达，诸如黑素瘤，肺癌，肉瘤和膀胱癌。其他肿瘤特异性抗原也适用于本发明的佐剂，包括但不限于肿瘤特异性神经节苷脂，前列腺特异性抗原(PSA)或者Her-2/neu、KSA(GA733)、PAP、乳腺珠蛋白、MUC-1、癌胚抗原(CEA)、p501 S(prostein)。因此在本发明的一个方面，提供包含本发明佐剂组合物和肿瘤排斥抗原的疫苗。一方面，肿瘤抗原是Her-2/neu。
本发明一方面提供包含肿瘤抗原的疫苗，诸如针对前列腺癌，乳腺癌，结肠直肠癌，肺癌，胰腺癌，肾癌，卵巢癌或者黑素瘤的抗原。因此，所述制剂可以包含肿瘤相关抗原以及与肿瘤支持机制(例如血管生成，肿瘤侵入)有关的抗原。此外，与用于癌症治疗的疫苗特别相关的抗原还包括前列腺特异性膜抗原(PSMA)、前列腺干细胞抗原(PSCA)、p501S(prostein)、酪氨酸酶、生存素、NY-ESO1、prostase、PS108(WO 98/50567)、RAGE、LAGE、HAGE。此外，所述抗原可以是自身肽激素诸如全长的促性腺激素释放激素(GnRH、WO 95/20600)，这是一种短的10氨基酸肽，用于治疗许多癌症，或者用于免疫去势。接种
包含本发明免疫原性组合物的疫苗制剂可以用于保护或者治疗易受感染的哺乳动物，通过全身性或者粘膜途径施用所述疫苗。这类施用可以包括通过肌内、腹腔内、皮内或者皮下途径注射；或者通过粘膜施用于口腔/食道，呼吸道，泌尿生殖道。尽管本发明的疫苗可以单剂量施用，其组分也可以同时或者在不同的时候共施用(例如肺炎球菌糖类偶联物可以与疫苗的任意细菌蛋白组分分别同时施用，或者在施用疫苗的任意细菌蛋白组分后1-2周再施用，以达到相对彼此的免疫应答的最佳协调)。此外，本发明的疫苗可以肌内施用用于初免剂量，鼻内施用用于加强剂量。
疫苗中蛋白抗原的含量通常在1-100μg的范围，优选的5-50μg，最常见的是5-25μg范围。在初次接种后，受试者可以接受有足够间隔的一次或者数次加强免疫。
疫苗制备法一般描述于疫苗设计(Vaccine Design)(“The subunit andadjuvant approach“(eds Powell M.F.&Newman M.J.)(1995)PlenumPress New York)。例如Fullerton，美国专利4,235,877描述了脂质体内的包裹。
本发明的疫苗可以溶液或者冻干形式保存。优选的在糖诸如蔗糖或者乳糖存在的条件下冻干溶液。仍然优选的是它们被冻干，并在使用前重建。
一方面本发明提供疫苗试剂盒，其包括含有本发明的免疫原性组合物，任选的以冻干形式，并且还包括含有本文所述佐剂的小瓶。可以预见在本发明的这个方面，佐剂将用于重建冻干的免疫原性组合物。
尽管本发明的疫苗可以通过任意途径施用，但所述疫苗向皮肤内(ID)的施用构成本发明的一个实施方案。人皮肤包含外面的“角质化”表皮，被称为角质层，其覆盖表皮。该表皮下面是被称为真皮的一层，其依次覆盖皮下组织。研究人员已经证明将疫苗注射入皮肤，尤其是注射入真皮，将刺激免疫应答，这还同时具有其他优点。利用本文所述疫苗的皮内接种形成本发明的优选特征。
皮内注射的常规方法，“mantoux步骤”，包括以下步骤：清洁皮肤，然后用一只手展开皮肤，将窄轨针头(26-31规格)尖向上以10-15°的角度将针头插入。一旦针尖被插入，将针管放低，进行推注，同时提供轻微压力使其在皮下抬起。然后非常缓慢的注射液体，从而在皮肤表面形成气泡或者肿块，然后缓缓退出针头。
最近，特别设计成能将液体试剂施用入皮肤或者穿过皮肤的装置已经被描述，例如在WO 99/34850和EP 1092444中描述的装置，以及快速注射装置，描述于例如WO01/13977；US5,480,381、US5,599,302、US5,334,144、US5,993,412、US5,649,912、US5,569,189、US5,704,911、US5,383,851、US5,893,397、US5,466,220、US5,339,163、US5,312,335、US5,503,627、US5,064,413、US5,520,639、US4,596,556、US4,790,824、US4,941,880、US4,940,460、WO97/37705和WO97/13537。疫苗制剂皮内施用的替代方法可以包括常规注射器和针头，或者设计用于弹道递送固体疫苗的装置(WO 99/27961)，或者透皮贴(WO 97/48440；WO 98/28037)，或者作用于皮肤表面(透皮或者经皮递送WO 98/20734；WO 98/28037)。
当本发明的疫苗施用于皮肤时，或者更具体的施用入真皮时，疫苗的液体体积较小，尤其是大约0.05ml到0.2ml的体积。
本发明皮肤或者皮内接种菌苗的抗原含量与肌内接种疫苗的常规含量(参见上文)类似。但是，皮肤或者皮内接种菌苗的特征在于所述制剂可以是“低剂量”。因此“低剂量”疫苗中的蛋白抗原优选的只有0.1到10μg，优选的0.1到5μg每剂量；和糖类(优选偶联的)抗原的范围是0.01-1μg，优选的为0.01到0.5μg糖每剂量。
如本文使用的，术语“皮内递送”表示将疫苗递送到皮肤中的真皮区域。但是，疫苗没有必要仅仅定位于真皮。真皮是位于距人皮肤表面大约1.0到大约2.0mm之间的皮层，但在个体之间和不同的机体部分存在一定量的差异。通常认为在皮肤表面1.5mm以下即到达真皮。真皮位于角质层和表面的表皮之间，皮下层以下。根据递送模式，最终疫苗可以专一或者主要定位于真皮内，或者它最终分布于表皮和真皮内。
每种疫苗剂量中各抗原的量是经过选择，能够在典型接种者中诱导免疫防护反应而且没有显著不良副作用的量。这种量将根据使用的特异免疫原及其如何被呈递而不同。
在另一个实施方案中，提供通过施用基本上如本文所述的组合物治疗易患疾病或者已患疾病的个体的方法。
还提供预防个体感染疾病的方法，所述疾病选自传染性细菌和病毒疾病，寄生虫疾病，尤其是胞内致病性疾病，增殖性疾病诸如前列腺癌，乳腺癌，结肠直肠癌，肺癌，胰腺癌，肾癌，卵巢癌或者黑素瘤；非癌性慢性病，变态反应，包括将基本上如本文所述的组合物给所述个体施用。
在另一个实施方案中，提供用于疾病或者病症的预防性治疗或者治疗的疫苗组合物，其中所述疫苗组合物包含抗原或者抗原组合物和佐剂组合物，所述佐剂组合物包含水包油乳液，其中所述水包油乳液包含0.5-10mg可代谢油、0.5-11mg母育酚和0.1-4mg乳化剂，每人剂量。
在另一个实施方案中，提供疫苗组合物在制备用于疾病或者病症的预防性治疗或者治疗的药物中的用途，其中所述疫苗组合物包含抗原或者抗原组合物和佐剂组合物，所述佐剂组合物包含水包油乳液，其中所述水包油乳液包含0.5-10mg可代谢油、0.5-11mg母育酚和0.1-4mg乳化剂，每人剂量。
本发明将参考以下的非限制性实施例来进一步阐述：
实施例I描述了在小鼠、雪貂、猪和人研究中使用的免疫解读方法。
实施例II描述了用于示例性研究的水包油乳液和佐剂制剂的制备。
实施例III描述了在18-59岁的成年人群体中用包含裂解(split)流感抗原制备物和各种剂量AS03佐剂的疫苗进行的临床试验。
实施例IV显示了佐剂化和未佐剂化的裂解流感疫苗(包含各种剂量的AS03佐剂)在初免BALB/c小鼠中的临床前评价。
实施例V显示了佐剂化和未佐剂化的裂解流感疫苗(包含各种剂量的AS03佐剂)在初免C57BI/6小鼠中的临床前评价。
实施例VI显示了佐剂化和未佐剂化的裂解流感疫苗(包含各种剂量的AS03佐剂和低剂量抗原)在初免C57BI/6小鼠中的临床前评价。
实施例VII显示了佐剂化和未佐剂化的裂解H5N1疫苗(包含各种剂量的AS03佐剂和抗原)在未免疫C57BI/6小鼠中的临床前评价。
实施例VIII显示了佐剂化和未佐剂化的流感疫苗在初免大白猪中的临床前评价。
实施例I-免疫解读方法
I.1.小鼠方法
I.1.1.血凝抑制试验
试验原理(标准步骤).
使用血凝抑制试验(HI)测定针对3种(季节性)流感病毒株的抗血细胞凝集素抗体滴度。HI试验的原理是基于特异性抗流感抗体通过流感病毒血细胞凝集素(HA)抑制红细胞(RBC)的血凝集的能力。热灭活血清用高岭土和RBC处理以去除非特异性抑制剂。在预处理后，将2倍稀释的血清与4个血凝单位的每种流感株温育。然后添加红细胞，并记录凝集抑制。滴度可以表示为完全抑制血凝反应的血清最高稀释度的倒数。由于血清的第一个稀释度是1∶20，所以不能检测的水平被记录为等于10的滴度。
针对H5N1的改变(利用马红细胞的HI的具体描述)：
因为记载的用于测定抗HA抗体的经典HI分析不适用于H5N1毒株，所以使用改变的实验步骤利用马RBC。将马红细胞用于H5N1Pandemic毒株。将0.5％(终浓度)马红细胞悬浮于包含0.5％BSA(牛血清白蛋白，终浓度)的磷酸盐缓冲液。通过每天用相同的磷酸盐缓冲液洗涤红细胞以及后续的离心步骤(10分钟，2000rpm)来制备该悬液。所述洗涤步骤必须重复一次。在将马红细胞添加到血清和病毒悬液的反应混合物后，将板在室温下温育(RT，20℃+/-2℃)两小时，因为马红细胞的沉降速率较低。
统计学分析
使用UNISTAT对接种后的HI滴度进行统计学分析。用于方差分析的步骤简述如下：
◆数据的对数转换
◆对各个群体(组)的Shapiro-Wilk检验，以便验证组分布的正态性
◆Cochran检验，以便验证不同群体(组)之间的方差均一性
◆对选用数据的方差分析。
◆双向ANOVA相互作用的检验
◆用于多重比较的Tukey-HSD检验
I.1.2.胞内细胞因子染色
这项技术允许根据细胞因子生成来定量抗原特异性T淋巴细胞：效应T细胞和/或效应-记忆性T细胞产生IFN-γ和/或中枢记忆性T细胞产生IL-2。免疫后7天收集PBMC。
在分泌性抑制剂(Brefeldine)存在的条件下，体外再刺激淋巴样细胞。然后利用荧光抗体(CD4、CD8、IFN-γ和IL-2)通过常规免疫荧光法处理这些细胞。结果表示为CD4/CD8T细胞中细胞因子阳性细胞的频率。在第二次免疫后7天对PBMC进行T细胞的胞内细胞因子染色。从小鼠采血，并合并在肝素化培养基RPMI+Add中。对于血液，按照推荐的实验步骤(在室温以2500rpm离心20分钟)将RPMI+Add稀释的PBL悬液在Lympholyte-Mammal梯度上分层。去除分界面处的单核细胞，用RPMI+Add洗涤2次，然后用RPMI 5％胎牛血清将PBMC悬液调节到2×106个细胞/ml。
用Whole FI(1μg HA/毒株)以1×107个细胞/ml(管式FACS)的终浓度对PBMCs进行体外抗原刺激，然后在加入抗-CD28和抗-CD49d(均为1μg/ml)的条件下于37℃温育2小时。
抗原再刺激步骤后，在Brefeldin(1μg/ml)存在条件下将PBMC 37℃温育过夜，以抑制细胞因子分泌。IFN-γ/IL-2/CD4/CD8染色如下进行：洗涤细胞悬液，重悬于50μl包含2％Fc封闭试剂(1/50；2.4G2)的PBS 1％FCS。在4℃温育10分钟后，添加抗-CD4-PE(2/50)和抗-CD8perCp(3/50)的50μl混合物，并在4℃温育30分钟。用PBS 1％FCS洗涤后，通过重悬浮于200μl Cytofix-Cytoperm(Kit BD)并在4℃温育20分钟使细胞透化。然后用Perm Wash(Kit BD)洗涤细胞，将其重悬于50μl用Perm Wash稀释的抗-IFN-γAPC(1/50)+抗-IL-2FITC(1/50)混合物。于4℃温育最短2小时最长过夜后，细胞用Perm Wash洗涤，并重悬于PBS 1％FCS+1％多聚甲醛。通过FACS进行样品分析。对活细胞设门(FSC/SSC)，对CD4+T细胞上～20,000事件(淋巴细胞)或者35,000事件进行探测。针对CD4+和CD8+门控的群计算IFN-γ+或者IL2+的百分比。
I.1.3.抗-H5N1 ELISA
利用裂解H5N1包被，通过ELISA定量抗H5N1 Ig、IgG1和IgG2b抗体滴度。按照每孔100μl使用病毒和抗体溶液。将裂解病毒H5N1用PBS稀释到1μg/ml的终浓度，并在96孔微量滴定板(MaxisorbImmunoplate Nunc 439454)上4℃吸附过夜。然后每孔加入包含1％BSA和0.1％Tween 20的200μl PBS(饱和缓冲液)，将板在37℃温育1小时。向包被H5N1的板中添加用饱和缓冲液22倍稀释的血清，并在37℃温育1小时30分钟。板用PBS 0.1％Tween 20洗涤4次。用PBS 1％BSA0.1％Tween 201/500稀释的偶联生物素的抗小鼠Ig(Prozan-E0413)或者1/4000稀释的偶联生物素的抗小鼠IgG1(Imtech 1070-08)，或者生物素化的抗小鼠IgG2b(Imtech 1090-08)被添加到各孔，在37℃温育1.30小时；在洗涤步骤后，板与用PBS 1％BSA Tween 201/10000稀释的链霉亲和素-生物素-过氧化物酶偶联物(Prozan P0397)温育30分钟。
为了比色，板与溶于0.1M柠檬酸盐水缓冲液pH4.2的o-苯二胺(Sigma P4664)0.04％H2O2 0.03％在22℃温育20分钟。用H2SO4 2N终止反应，并在490-630nm读板。
I.2.雪貂方法
I.2.1.血凝抑制试验(HI)
测试步骤。
使用血凝抑制试验(HI)测定针对3种流感病毒株的抗血细胞凝集素抗体滴度。HI试验的原理是基于特异性抗流感抗体通过流感病毒血细胞凝集素(HA)抑制鸡红细胞(RBC)的血凝集的能力。血清首先用25％神经氨酸酶溶液(RDE)处理，然后热灭活以去除非特异性抑制剂。在预处理后，将2倍稀释的血清与4个血凝单位的每种流感株温育。然后添加鸡红细胞，并记录凝集抑制。滴度可以表示为完全抑制血凝反应的血清最高稀释度的倒数。由于血清的第一个稀释度是1∶10，所以不能检测的水平被记录为等于5的滴度。
统计学分析
使用UNISTAT对HI滴度(第41天，攻击前)进行统计学分析。用于方差分析的步骤简述如下：
■数据的对数转换。
■对各个群体(组)的Shapiro-Wilk检验，以便验证组分布的正态性。
■Cochran检验，以便验证不同群体(组)之间的方差均一性。
■单向ANOVA相互作用的检验。
■用于多重比较的Tuckey-HSD检验
I.2.2.体温监测
在攻击期间用传感器并通过遥测记录监测个体温度。检查和整修所有植入物，在放入腹腔之前通过DSI(Data Sciences International，Centaurusweg 123，5015TC Tilburg，The Netherlands)进行新校准。在这些测量期间所有动物都分别圈养在单独的笼中。
在攻击前4天直到攻击后7天每15分钟记录温度。
I.2.3.鼻清洗
通过在清醒动物的两个鼻孔中给予5ml PBS进行鼻清洗。将接种物收集到培养皿中，并置于干冰上的样品容器中。
鼻清洗液的病毒滴定
所有鼻样品都首先通过Spin X滤器(Costar)除菌过滤，以去除任何细菌污染物。将50μl连续10倍稀释的鼻清洗液转移至包含50μl培养基(10孔/稀释度)的微量滴定板中。然后将100μl MDCK细胞(2.4×105个细胞/ml)加入每孔，并于35℃温育5-7天。
在5-7天温育后，小心地取出培养基，加入100μl含1/20WST-1的培养基，再温育18小时。
在活细胞还原WST-1时产生的黄色甲
Figure G200780038231XD00251
染料的强度与病毒滴定实验结束时存在于孔中的活细胞数成正比，并通过在合适波长(450纳米)测量各孔的吸光度来定量。截取值定义为未感染对照细胞的OD平均值-0.3OD(0.3OD相当于未感染对照细胞OD+/-3StDev)。当OD＜截取值时定义为阳性分数，相反，当OD＞截取值时定义为阴性分数。病毒的脱落滴度通过“Reed and Muench”测定，并表示为Log TCID50/ml。
I.3.猪方法
I.3.1.血凝抑制试验(HI)
测试步骤。
使用血凝抑制试验(HI)测定针对3种流感病毒株的抗血细胞凝集素抗体滴度。HI试验的原理是基于特异性抗流感抗体通过流感病毒血细胞凝集素(HA)抑制鸡红细胞(RBC)的血凝集的能力。血清首先用25％神经氨酸酶溶液(RDE)处理，然后热灭活以去除非特异性抑制剂。在预处理后，将2倍稀释的血清与4个血凝单位的每种流感株温育。然后添加鸡红细胞，并记录凝集抑制。滴度可以表示为完全抑制血凝反应的血清最高稀释度的倒数。由于血清的第一个稀释度是1∶10，所以不能检测的水平被记录为等于5的滴度。
统计分析。
使用UNISTAT对HI滴度(第41天，攻击前)进行统计学分析。用于方差分析的步骤简述如下：
■数据的对数转换。
■对各个群体(组)的Shapiro-Wilk检验，以便验证组分布的正态性
■Cochran检验，以便验证不同群体(组)之间的方差均一性。
■单向ANOVA相互作用的检验。
■用于多重比较的Tuckey-HSD检验
I.4.评价人中免疫应答的分析
I.4.1.血细胞凝集抑制分析
使用WHO流感合作中心，疾病控制中心，Atlanta，USA(1991)描述的方法通过检测HI抗体来测定免疫应答。使用4个血凝抑制单位(4HIU)的适宜抗原和0.5％禽红细胞悬液，用标准的和综合验证过的微量法对解冻的冷冻血清样品进行抗体滴度测量。通过热处理和受体破坏酶去除非特异性血清抑制剂。评价所获血清的HI抗体水平。以1∶10起始稀释度开始进行系列稀释(以二分之一)，直到最终稀释度1∶20480。把显示完全抑制(100％)血凝反应的最高稀释度作为滴定终点。所有分析都进行两次。
I.4.2.神经氨酸酶抑制分析
在包被胎球蛋白的微量滴定板中进行分析。制备2倍连续稀释的抗血清，与标准化量的甲型流感H3N2、H1N1或者乙型流感病毒混合。测试基于神经氨酸酶的生物活性，所述神经氨酸酶从胎球蛋白酶解释放神经氨酸。在切下末端神经氨酸后，β-D-半乳糖-N-乙酰基-氨基半乳糖被暴露。向各孔添加来自花生(Arachis hypogaea)的辣根过氧化物酶(HRP)-标记的花生凝集素，其特异性结合半乳糖结构。可在含四甲基联苯胺(TMB)的底物反应中检测和定量结合凝集素的量。仍抑制病毒神经氨酸酶活性达至少50％的最高抗体稀释度被指定为NI滴度。
I.4.3.中和抗体分析
对解冻的冷冻血清样品进行中和抗体检测。利用微量中和分析测定血清中包含抗体的病毒中和。在所述分析中血清无需进一步处理即可使用。每个血清重复测试3次。将标准化量病毒与血清系列稀释物混合并温育，以使抗体结合病毒。然后将含指定量MDCK细胞的细胞悬液添加到病毒和抗血清的混合物，并在33℃温育。在温育期后，通过鸡红细胞的血凝反应显示病毒复制。利用Reed and Muench方法计算血清的50％中和滴度。
I.4.4.通过细胞因子流式细胞术(CFC)评价细胞介导的免疫
外周血抗原特异性CD4和CD8可以在体外被再刺激，以产生IL-2、CD40L、TNF-alpha和IFN，如果与其对应抗原温育。因此，可在常规免疫荧光标记细胞表型以及胞内细胞因子生成后，通过流式细胞术计数抗原特异性的CD4和CD8T细胞。在本研究中，流感疫苗抗原以及源自特定流感蛋白的肽被用作再刺激流感特异性T细胞的抗原。结果表示为CD4或者CD8T细胞亚群中细胞因子阳性CD4或者CD8T细胞的频率。
I.4.5.统计学方法
I.4.5.1.主要终点
·在接种后的7天随访期(即接种日和随后6天)以及整个过程中诉求的局部和全身征兆和症状的百分比、强度以及同接种的关联。
·在接种后的21天随访期(即接种日和随后20天)以及整个过程中主动诉求的局部和全身征兆和症状的百分比、强度以及同接种的关联。
·整个研究过程中严重不良事件的发生。
I.4.5.2.次要终点
对于体液免疫应答：
观测变量：
·第0天和21天：血清血凝抑制(HI)和NI抗体滴度，分别针对疫苗中提供的3种流感病毒株的每一种(抗-H1N1，抗-H3N2&抗-B-抗体)进行检测。
·第0天和21天：中和抗体滴度，分别针对疫苗中提供的3种流感病毒株的每一种进行测试。
衍生变量(具有95％置信区间)：
·接种前和接种后具有95％置信区间(95％CI)的血清HI抗体的几何平均滴度(GMTs)
·21天时具有95％CI的血清转化率*
·21天时具有95％CI的转化因子**
·21天时具有95％CI的血清保护率***
·在所有时间点的血清NI抗体GMTs′(具有95％置信区间)。
*血清转化率定义为相比于第0天，在第21天时针对每种疫苗株的血清HI滴度具有至少4倍增加的接种者百分比。
**转化因子定义为相比于第0天，在第21天时针对每种疫苗株的血清HI GMT的增加倍数。
***保护率定义为接种后(针对每种疫苗株)血清HI滴度＝40的接种者百分比，通常这被视为指示保护作用。
应当理解，对于一些临床试验，反应原性/安全性可以是次要终点，而免疫原性可以是主要终点。
对于细胞介导的免疫(CMI)应答
观测变量：
在第0天和21天：不同测试中每106中细胞因子阳性CD4/CD8细胞的频率。每次测试都定量CD4/CD8T细胞对以下抗原的应答：
·肽流感(pf)抗原(这些抗原的精确性质和来源不需要给出/解释)
·裂解流感(sf)抗原
·全流感(wf)抗原。
衍生变量：
·产生至少两种不同细胞因子(CD40L、IL-2、IFNγ、TNFα)的细胞
·产生至少CD40L和另一种细胞因子(IL-2、TNFα、IFNγ)的细胞
·产生至少IL-2和另一种细胞因子(CD40L、TNFα、IFNγ)的细胞
·产生至少IFNγ和另一种细胞因子(IL-2、TNFα、CD40L)的细胞
·产生至少TNFα和另一种细胞因子(IL-2、CD40L、IFNγ)的细胞
I.3.5.3.免疫原性分析
免疫原性分析基于总接种群体。对于每个治疗组，计算下列参数(具有95％置信区间)：
·在第0天和21天时HI和NI抗体滴度的几何平均滴度(GMT)
·在第0天和21天时中和抗体滴度的几何平均滴度(GMT)
·第21天时的转化因子。
·第21天时的血清转化率(SC)，定义为相比于第0天，在第21天时血清HI滴度具有至少4倍增加的接种者百分比。
·第21天时的保护率，定义为血清HI滴度＝1∶40的接种者百分比。
·在各个时间点(第0天，第21天)针对每个接种组和针对每种抗原(肽流感(pf)、裂解流感(sf)和全流感(Wf))，概述(描述统计学)应答中CD4/CD8T淋巴细胞分泌的频率。
·在各5次不同测试中对于每个接种组和每种抗原(pf、sf和wf)，在时间点(接种后-接种前)之间个体应答差异的描述统计。
·使用无参数检验(Kruskall-Wallis检验)比较3组之间的局部差异，在各5种不同的测试中计算每种抗原的统计学p-值。所有显著性检验都是双尾的。小于或等于0.05的p-值被认为是统计学显著的。
实施例II-水包油乳液和佐剂制剂的制备
除非另有说明，否则在随后的实施例中使用的油/水乳液由有机相和水相组成，所述有机相由2种油(α-生育酚和角鲨烯)组成，所述水相为包含Tween 80作为乳化剂的PBS。除非另有说明，否则在随后的实施例中使用的水包油乳液佐剂制剂都被制成包含下列水包油乳液(给出终浓度)：2.5％角鲨烯(v/v)，2.5％α-生育酚(v/v)，0.9％聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯(v/v)(Tween 80)，参见WO 95/17210。该乳液在随后的实施例中被称为AS03，如下制备两倍浓缩物。
II.1.乳液SB62的制备
在临床和临床前实施例部分报道的研究中使用这种方法。通过在强搅拌下混合由疏水组分(DL-α-生育酚和角鲨烯)组成的油相和包含水溶性组分(阴离子型去污剂Tween 80和PBS mod(改良型)，pH6.8)的水相，制备SB62乳液制剂。在搅拌的同时，将油相(1/10总体积)转移至水相(9/10总体积)，于室温搅拌混合物15分钟。然后在微流化器的相互作用腔中对获得的混合物施加剪切力、冲击力和空化力(15000PSI-8个循环，或者在实施例III报道的临床试验使用的佐剂中为3个循环)，以产生亚微米油滴(分布在100到200nm之间)。获得的pH在6.8±0.1之间。然后使SB62乳液通过0.22μm膜过滤除菌，将除菌的乳化原液冻存于2到8℃的Cupac容器中。将无菌惰性气体(氮气或者氩气)通入SB62乳化半成品容器的死体积中至少15秒。
SB62乳液的最终组成如下：
Tween 80：1.8％(v/v)19.4mg/ml；角鲨烯：5％(v/v)42.8mg/ml；α-生育酚：5％(v/v)47.5mg/ml；PBS-mod：NaCl 121mM，KCl 2.38mM，Na2HPO4 7.14mM，KH2PO4 1.3mM；pH6.8±0.1。
实施例III-在18-59岁的成年人群体中用包含裂解流感抗原制备物和各种剂量AS03佐剂的疫苗(Flu-LD-004)进行的临床试验。
III.1.导论
在2006年于18-59岁的成人群体中进行II期受控、随机、单盲研究，以便评价含两种剂量的AS03佐剂的GlaxoSmithKline Biologicals低剂量流感候选疫苗(即包含5μg HA每株)的免疫原性、安全性和反应原性。
在肌内施用1剂AS03佐剂疫苗后21天检测体液免疫应答(即抗血细胞凝集素)。FluarixTM用作参比。
III.2.研究设计
3组受试者平行的肌内接受下列疫苗：
■1组100名受试者接受注射一次用AS03作为佐剂的包含5μg HA的低剂量裂解病毒流感疫苗(FluLD1/1)
■1组100名受试者接受注射一次用半量AS03(AD031/2)作为佐剂的包含5μg HA的低剂量裂解病毒流感疫苗(FluLD1/2)
■1组100名受试者接受1个剂量的FluarixTM(Fluarix)
方案：在第0天肌内注射一次流感疫苗，在第0天和21天研究现场随访并采集血液样品(HI抗体测定)，第30天另一次电话随访(研究结论)。
在该研究中使用的标准三价裂解流感疫苗-FluarixTM是在2006年由GlaxoSmithKline Biologicals开放并生产的商品化疫苗。
III.3.研究目标
III.3.1.主要目标
-为了评价本研究疫苗诱导的体液免疫应答，根据抗血细胞凝集素的抗体滴度：
第0和21天时的观测变量：血清凝集抑制抗体滴度。
衍生变量(具有95％置信区间)：
-在第0天和21天时血清抗体的几何平均滴度(GMTs)
-第21天时的血清转化率*
-第21天时的转化因子**
-第0天和21天时的保护率***
*血细胞凝集素抗体应答的血清转化率定义为，接种前滴度＜1∶10并且接种后滴度＞1∶40的接种者的百分比，或者接种前滴度＞1∶10并且接种后滴度增加至少四倍的接种者的百分比
**转化因子定义为与第0天相比，接种后血清HI GMTs的增加倍数；
***保护率定义为接种后血清HI滴度＞40的接种者百分比，通常这被视为指示保护作用。
III.3.2.次要目标
-为了评价本研究疫苗的安全性和反应原性，根据请求的局部和全身不良事件，主动诉求的不良事件和严重不良的事件：
1.在接种后的7天随访期(即接种日和随后6天)，每组中诉求的局部和全身征兆和症状的发生率、强度以及同接种的关联。
2.在接种后的30天随访期(即接种日和随后29天)，每组中主动诉求的局部和全身征兆和症状的发生、强度以及同接种的关联。
3.整个研究过程中，每组严重不良事件的发生和关系。
III.4.疫苗组成和施用
III.4.1.疫苗制备
未佐剂化的流感疫苗是三价裂解病毒粒子、灭活流感疫苗，由3种单价病毒抗原(分别从流感株A/H1N1、A/H3N2和B制备)组成。该疫苗中存在的抗原与批准给FluarixTM疫苗的相同，所述FluarixTM疫苗在1992年以后可以在市场上作为FluarixTM(α-
Figure G200780038231XD00321
)购得，包含15μgHA/株每剂量。临床批中包括的流感株FluLD是选自2006/2007北半球的毒株：
·A/新喀里多尼亚/20/99(H1N1)-样毒株：A/新喀里多尼亚/20/99(H1N1)IVR-116
·A/威斯康星(Wisconsin)/67/2005(H3N2)-样毒株：A/威斯康星/67/2005(H3N2)NYMCX-161
·B/马来西亚(Malaysia)/2506/2004。
抗原来源于在卵中培育的病毒。在灭活步骤前通过脱氧胆酸钠进行裂解，所述灭活步骤通过随后的脱氧胆酸钠和甲醛作用进行。
AS03佐剂化的低剂量流感(FluLD)疫苗(临床批)基于商品化供应的FluarixTM疫苗(分别从流感株A/H1N1、A/H3N2和B制备)，但具有更低的抗原含量，并用GSK佐剂系统AS03佐剂化。AS03由水包油乳液(SB62)组成，所述水包油乳液包含两种可生物降解的油，角鲨烯和α-生育酚(维生素E)，以及表面活性剂，Polysorbate 80(Tween 80)。通过与乳液简单混合将流感抗原掺入所述佐剂系统的水相。已经检测了两种制剂，其差别在于疫苗批中与Flu抗原一起引入的佐剂量。每剂量的佐剂化疫苗包含每种流感病毒株的5μg血细胞凝集素(HA)，并与佐剂系统AS03全量(AS03)或者半量(AS031/2)混合。赋形剂如下所示：Polysorbate 80(Tween 80)，辛苯昔醇10(Octoxynol 10)(TritonX-100)，α-生育酚氢琥珀酸酯，氯化钠，磷酸氢二钠，磷酸二氢钾，氯化钾，注射用水。AS03佐剂化的低剂量流感疫苗(FluLD，全量或者半量AS03)是不含防腐剂的疫苗。但是，它们包含来自制备步骤早期的痕量硫柳汞(每剂量＜1.25μg Hg)。这两者都作为单剂量疫苗以0.5ml/剂量的体积提供在玻璃(I型)预填充注射器中。
III.4.1.1.AS03佐剂化的流感疫苗的组成
1个剂量的FluLD(全量或者半量的AS03)相当于0.5ml。组成提供于表3。对两种制剂来说每个剂量的HA含量均是5μg，唯一差异是最终容器中存在的AS03量。
表3AS03佐剂化低剂量流感疫苗的组成(全量和半量的AS03)
  组分   每剂量的量(0.5ml)
  灭活的裂解病毒粒子-A/新喀里多尼亚/20/99(H1N1)IVR-116-A/威斯康星/67/2005(H3N2)NYMCX-161-B/马来西亚/2506/2004 5μg HA5μg HA5μg HA
  佐剂(全剂量/半剂量)-SB62乳液(总体积)·角鲨烯·DL-α-生育酚·Polysorbate 80(Tween 80) 0.250mL10.70mg/5.35mg11.88mg/5.94mg4.85mg/2.425mg
  Polysorbate 80(Tween 80)   0.122mg
  辛苯昔醇10(Triton X-100)   0.0283mg
  α-生育酚氢琥珀酸酯   0.01665mg
  氯化钠   4mg
  磷酸氢二钠   0.575mg
  磷酸二氢钾   0.100mg
  氯化钾   0.101mg
  注射用水   加至0.50ml
缩写：HA＝血细胞凝集素。
当使用AS03全剂量时，Polysorbate 80的总含量相当于4.972mg每剂量，而当使用AS03半剂量时，Polysorbate 80的总含量相当于2.547mg每剂量。
III.4.1.2.灭活的裂解流感抗原制备物的产生
流感抗原与FluarixTM(流感病毒疫苗)中包含的那些相同。单价原液由纯化的灭活裂解病毒组成，所述病毒从在含胚鸡蛋中培养的3种流感病毒株(A型(H1N1和H3N2)和B型)的工作毒种制备。这些工作毒种来源于按照每年WHO的推荐从WHO合作中心接收的毒株。为了说明，给出WO 02/097072作为制备抗原步骤的参考文献。3种单价原液的体积基于配制前各个单价原液中检测的HA含量，还基于目标制备体积。
10倍浓缩的磷酸盐缓冲液(当1倍浓缩时pH7.4)以及Tween 80和α-生育酚氢琥珀酸酯在水中稀释用于注射，然后在室温下搅拌5-30分钟。然后将3种浓缩的单价原液连续稀释入磷酸盐缓冲液/Tween 80-α-生育酚氢琥珀酸酯溶液达到以下浓度：
20μg HA每种A单价原液(H1N1，H3N2)
23.32μg HA B单价原液
每ml三价半成品(bulk)(5μg HA每种A单价原液和5.83μg HAB/500μl三价成品(final bulk))。
在加入每种单价原液之间，于室温搅拌混合物10-30分钟，并在加入最后一种单价原液之后搅拌15-30分钟。这种三价半成品还被称为“预备库(pre-pool)”，可保存于+2到+8℃，或者在同一天进一步加工为成品。预备库的终体积是250μl每剂量。
III.4.1.3.含AS03佐剂的疫苗组合物的制备
佐剂化疫苗：LD AS031/1(表4)
向注射用水中添加PBS mod 10倍浓缩液(当1倍浓缩时pH7.4；137mM NaCl，2.7mM KCl，8.1mM Na2HPO4，1.47mM KH2PO4，pH7.4)以及包含Tween 80，Triton X-100和VES(数量需考虑毒株中存在的去污剂)的混合物。在搅拌5到30分钟后，添加20μg HA每ml的各株H1N1和H3N2，以及23.32μg HA每ml的B株，在每次添加之间搅拌10到30分钟。在搅拌15到30分钟后，取出少量所谓的“半成品”用于分析，在+2到+8℃之间保存。半成品溶于PBS mod 1倍浓缩液。目标去污剂浓度是488μg Tween 80每ml，73.6μg Triton X-100每ml和66.6μg VES每ml。
然后制备成品：将等体积的SB62(参见实施例II)加入各250μl预备库半成品，并在室温下混合30到60分钟。检查pH在6.8到7.5的范围之间。制剂中通入氮气，填充前在+2到8℃之间保存。
表4AS03佐剂化的低剂量疫苗
Figure G200780038231XD00351
(1)：成品缓冲液组成是：137mM NaCl，2.7mM KCl，8.1mM Na2HPO4，1.47mM KH2PO4，pH7.4
佐剂化疫苗：LD AS03 1/2(表5)
向注射用水中添加PBS mod 10倍浓缩液(当1倍浓缩时pH7.4；137mM NaCl，2.7mM KCl，8.1mM Na2HPO4，1.47mM KH2PO4，pH7.4)以及包含Tween 80，Triton X-100和VES(数量需考虑毒株中存在的去污剂)的混合物。在搅拌5到30分钟后，添加20μg HA每ml的各株H1N1和H3N2，以及23.32μg HA每ml的B株，在每次添加之间搅拌10到30分钟。在搅拌15到30分钟后，取出少量所谓的“半成品”用于分析，在+2到+8℃之间保存。PBS mod在半成品中1倍浓缩。目标去污剂浓度是488μg Tween 80每ml，73.6μg Triton X-100每ml和66.6μg VES每ml。
然后制备成品：首先用PBS mod稀释SB62，然后在室温搅拌15-30分钟。然后将等体积的该稀释SB62加入各250μl半成品的预备库。在室温搅拌30到60分钟后，检查pH的范围介于6.8到7.5之间。制剂中通入氮气，填充前在+2到8℃之间保存。
两种制剂的终体积是500μl每剂量，最终的HA浓度是10μg每A单价原液每ml三价成品和11.66μg B单价原液每ml三价成品。最终的Tween 80、Triton X-100(来自H3N2单价原液制备的残留)和α-生育酚氢琥珀酸酯(α-生育酚氢琥珀酸酯是RRR(D异构体)-α-生育酚的酯形式)的目标浓度分别是244μg/ml、58.6μg/m和33.3μg/ml。
表5AS03佐剂化的低剂量疫苗(半量佐剂)
Figure G200780038231XD00361
(1)：成品缓冲液组成是：137mM NaCl，2.7mM KCl，8.1mM Na2HPO4，1.47mM KH2PO4，pH7.4
III.4.2.疫苗施用
将疫苗填充入1.25-ml无菌I型(Ph.Eur.)玻璃注射器。每次注射达到0.57ml的目标(范围：0.54-0.60ml)。疫苗肌内施用于非惯用臂的三角肌区。所有疫苗作为预填充注射器(0.5ml)提供。为了确保疫苗的正确肌内注射，使用至少25G和长至少2.5厘米的针头。
III.5研究群体结果
该研究共招募了300名受试者：每组100名受试者。接种时全部接种群体的平均年龄是36.7岁，标准偏差13.67岁。受试者的平均年龄和性别分布在3个疫苗组之间是相似的。
III.6免疫原性结果
对用于免疫原性的ATP群体(297名受试者)进行免疫原性分析。
体液免疫应答
为了评价用AS03佐剂化的低剂量流感候选疫苗诱导的体液免疫应答，计算每个治疗组的下列参数(具有95％置信区间)：
·在第0天和21天时HI抗体滴度的几何平均滴度(GMTs)；
·第21天时的血清转化率(SC)；
·第21天时的转化因子；
·第0天和21天时的保护率。
III.6.1 HI几何平均滴度(GMT)
具有95％CI的HI抗体的GMTs显示于表10和图1。组间修正的GMT比例显示于表11。
3个治疗组中针对所有3种疫苗株的HI抗体的接种前GMTs处于相同范围内。第21天时观察到对于所有3种毒株来说，佐剂化组的GMTs趋向于比Fluarix组更高，对A/威斯康星疫苗株来说在FluLD1/1和Fluarix之间存在统计学差异(无95％CIs重叠，修正的GMT比例不包含值)。对B/马来西亚疫苗株来说在FluLD1/2和Fluarix之间也观察到统计学差异(修正的GMT比例不包含值1)。
表10-第0天和21天时(用于免疫原性的ATP群体)针对抗-HA抗体的血清阳性率和几何平均滴度(GMT)
FluLD1/1＝含全量AS03佐剂的低剂量流感疫苗(5μg HA/株)
FluLD1/2＝含半量AS03佐剂的低剂量(5μg HA/株)
Fluarix＝Fluarix疫苗
GMT＝几何平均抗体滴度
N＝具有可用结果的受试者数目
n/％＝血清阳性的受试者(HI滴度＞＝1∶10)的数目/百分比
95％CI＝95％置信区间，LL＝下限，UL＝上限
MIN/MAX＝最小值/最大值
PRE＝接种前第0天
PI(D21)＝接种后第21天
表11-第21天时针对每种疫苗的群组间修正的GMT比例(用于免疫原性的ATP群组)
Figure G200780038231XD00391
FluLD1/1＝含全量AS03佐剂的低剂量流感疫苗(5μg HA/株)
FluLD1/2＝含半量AS03佐剂的低剂量(5μg HA/株)
Fluarix＝Fluarix疫苗
修正的GMT＝对基线滴度修正的几何平均抗体滴度
N＝接种前和接种后结果可用的受试者的数目
95％CI＝修正GMT比例(Ancova模型：对超过2组的基线滴度合并方差的修正)的95％置信区间；LL＝下限，UL＝上限
III.6.2抗HI抗体滴度的转化因子，血清保护率和血清转化率(与人类中流感疫苗建立的保护作用的关联)
结果示于表6-图2是血清保护率，表7-图3是血清转化率，和表8-图4是转化因子。欧洲官方要求的血清保护率的阈值(70％)在所有组中都已达到(至少94.9％)。对于每个疫苗株，第21天时3组的血清保护率都在相同范围内。
欧洲官方要求的血清转化率的阈值(40％)在所有组中都已达到(至少65％)。
对于A/新喀里多尼亚疫苗株，第21天时3组的SCR都在相同范围内。
对于A/威斯康星疫苗株，与Fluarix组相比，第21天时FluLD1/1组的SCR趋向于更高。第21天时FluLD1/2组的SCR与Fluarix组相比均在相同范围内。
对于B/马来西亚疫苗株，与Fluarix组相比，第21天时FluLD1/2组的SCR趋向于更高。第21天时FluLD1/1组的SCR与Fluarix组相比均在相同范围内。
欧洲官方要求的血清转化因子的阈值(2.5)在所有组中都已达到(至少6.2)。
对于A/新喀里多尼亚疫苗株，第21天时3组的SCF似乎都在相同范围内。FluLD1/2的观测值低于Fluarix组的观测值，这可以由FluLD1/2组中更高的接种前血清保护率来解释。
对于A/威斯康星疫苗株，与Fluarix组相比，第21天时FluLD1/1组的SCF趋向于更高。第21天时FluLD1/2组的SCF与Fluarix组相比均在相同范围内。
对于B/马来西亚疫苗株，与Fluarix组相比，第21天时两种佐剂化组的SCF趋向于更高。
表6-第0天和21天时(用于免疫原性的ATP群体)针对HI抗体滴度的血清保护率(SPR)
Figure G200780038231XD00411
FluLD1/1＝含全量AS03佐剂的低剂量流感疫苗(5μgHA/株)
FluLD1/2＝含半量AS03佐剂的低剂量(5μg HA/株)
Fluarix＝Fluarix疫苗
N＝具有可用结果的受试者数目
n/％＝血清阳性的受试者(HI滴度＞＝401/DIL)的数目/百分比
95％CI＝95％置信区间，LL＝下限，UL＝上限
PRE＝接种前第0天
PI(D21)＝接种后第21天
数据来源＝附表IIIA
表7-第0天和21天时(用于免疫原性的ATP群体)针对HI抗体滴度的血清转化率(SCR)
Figure G200780038231XD00421
FluLD1/1＝含全量AS03佐剂的低剂量流感疫苗(5μg HA/株)
FluLD1/2＝含半量AS03佐剂的低剂量(5μg HA/株)
Fluarix＝Fluarix疫苗
血清转化定义为：
对最初血清阴性的受试者，接种后抗体滴度＞＝401/DIL
对于最初血清阳性的受试者，接种后抗体滴度是接种前抗体滴度的＞＝4倍
N＝接种前和接种后结果可用的受试者的数目
n/％＝血清转化受试者的数目/百分比
95％CI＝95％置信区间，LL＝下限，UL＝上限
表8-第0天和21天时(用于免疫原性的ATP群体)针对HI抗体滴度的血清转化因子(SCF)
Figure G200780038231XD00431
FluLD1/1＝含全量AS03佐剂的低剂量流感疫苗(5μg HA/株)
FluLD1/2＝含半量AS03佐剂的低剂量(5μg HA/株)
Fluarix＝Fluarix疫苗
N＝接种前和接种后结果可用的受试者的数目
SCF＝血清转化因子或者几何平均比例(平均[log10(PI(D21)/PRE)])
95％CI＝95％置信区间，LL＝下限，UL＝上限
III.7安全性结论
根据诉求(局部/全身)和主动诉求的症状，佐剂化疫苗组相对于Fluarix组更高的反应原性是本研究中观察到的普遍趋势。
佐剂化疫苗中AS03含量的降低对所有的全身和局部3级症状都有显著影响。
与Fluarix组(35％)相比，佐剂化疫苗组中主动诉求症状的发生趋向于更高(受试者的55％和47％)。
根据这些结果可以总结得出，候选疫苗的反应原性和安全性是令人满意并且临床上可接受的。
III.8.整体结论
III.8.1.免疫原性结果
本研究的主要目标是评价由含两种不同浓度的AS03佐剂的低剂量流感疫苗以及Fluarix引发的体液免疫应答(抗HI抗体滴度)。
第21天，3种疫苗超过了欧洲官方对每年注册的裂解病毒粒子流感疫苗的要求(“关于协调流感疫苗要求的指导说明”，用于免疫学评价每年的毒株变化-CPMP/BWP/214/96)。与Fluarix组相比，佐剂组中的GMTs趋向于更高，对于A/威斯康星(FluLD1/1vs.Fluarix)和B/马来西亚疫苗株(FluLD1/2vs.Fluarix)来说观察到统计学显著的差异。在所有3个疫苗组中观察到类似的血清保护率，范围从94.9％到99％。观察到佐剂组的血清转化率和血清转化因子高于Fluarix组。来自该试验的数据还显示，由含半量AS03佐剂的疫苗诱导的免疫原性与全量佐剂诱导的免疫原性相当。
III.8.2反应原性和安全性结果
AS03佐剂化的低剂量流感候选疫苗的施用在所研究的群体中(即18到59岁之间的成人)是安全的，在临床上也是良好耐受的。与全量佐剂疫苗相比，半量佐剂疫苗显示诉求的局部和全身症状发生率显著下降。
实施例IV-佐剂化和未佐剂化的裂解流感疫苗(包含各种剂量的AS03佐剂)在初免BALB/c小鼠中的临床前评价。
IV.1.实验设计和目标
对流感初免小鼠进行实验，以便评价以该水包油佐剂配制的AS03流感疫苗诱导的体液应答的增加。为了模拟人体中的环境，使用经过异种亚型株初免的小鼠进行实验。
IV.1.1.治疗/组(表9)
每组27只成年雌性BALB/c小鼠在第0天用三价福尔马林灭活全流感病毒(每株5μg HA)鼻内初免(20μl体积)。初免毒株包括所述疫苗中包括毒株的早期漂移变体(5μg HA灭活的全H1N1 A/约翰内斯堡/82/96，H3N2A/悉尼/5/97，B/哈尔滨/7/94)。28天后，给小鼠肌内接种总体积50μl的单剂量疫苗候选物。用只包含裂解抗原的制剂(三价裂解普通疫苗(split plain))的制剂或者用两种剂量AS03AS03(全量或者1/5)佐剂化的包含裂解抗原的制剂免疫小鼠。用于免疫的毒株包括H1N1A/新喀里多尼亚/20/99，H3N2A/巴拿马/2007/99，B/山东/7/97病毒抗原(1.5μg/株，人剂量的1/10)。
表9
  组别   抗原/制剂   其他治疗
  1   三价裂解疫苗(Trivalent split)/普通疫苗(未佐剂化)   D0异源初免
  2   三价裂解疫苗/AS03   D0异源初免
  3   三价裂解疫苗/AS031/5   D0异源初免
IV.1.2.疫苗制剂的制备
制备Tween 80、Triton X100和维生素E琥珀酸酯(VES)的预混合物，以便在疫苗中达到750μg/ml Tween 80、110μg/ml Triton X100和100μg/ml VES的终浓度。计算预混合物使用的数量时需要考虑毒株中已经存在的去污剂和VES数量。
制备1升10倍浓缩的盐水缓冲液(PBS pH7.4)：向0.800升注射用水中添加NaCl 80g，KCl 2g，Na2HPO4 11.44g，KH2PO4 2g。溶解后，用注射用水补足到1.0升。当10倍稀释时pH应该为7.4。
三价裂解疫苗/普通疫苗
按照下列顺序即时制备50μl剂量的制剂：注射用水+盐水缓冲液(10倍浓缩的PBS pH7.4)+预混合物，室温下磁力搅拌5分钟，+1.5μgHA H1N1株，室温下磁力搅拌10分钟，+1.5μg HA H3N2株，室温下磁力搅拌10分钟，+1.5μg HA B株，室温下磁力搅拌15分钟。所述制剂在制备结束后数小时内注射。
三价裂解疫苗/AS03
制备Tween 80、Triton X100和维生素E琥珀酸酯(VES)的预混合物，以便在疫苗中达到750μg/ml Tween 80、110μg/ml Triton X100和100μg/ml VES的终浓度。计算预混合物使用的数量时需要考虑毒株中已经存在的去污剂和VES数量。
按照下列顺序即时制备50μl剂量的制剂：注射用水+盐水缓冲液(10倍浓缩的PBS pH7.4)+预混合物，室温下磁力搅拌5分钟，+1.5μgHA H1N1株，室温下磁力搅拌10分钟，+1.5μg HA H3N2株，室温下磁力搅拌10分钟，+1.5μg HA B株，室温下磁力搅拌15分钟，对于全量AS03+25μl SB62乳液或者对于1/5剂量AS03+5μl SB62乳液，室温下磁力搅拌15分钟。所述制剂在制备结束后数小时内注射。
IV.1.3.解读(表10)
在免疫前(第28天)和免疫后14天(27只小鼠/组)检测对接种的体液免疫应答。通过血细胞凝集抑制(HI)试验检测血清样品。
表10
  解读   时间点   样品类型   分析方法
  体液应答   D28、D42   血清   IHA
IV.2.结果
IV.2.1.体液免疫
结果显示于图5。在这种异种亚型初免继之以单次接种的小鼠模型中，与普通疫苗相比，AS03及其稀释物显示诱导更高的HI滴度。对于所有的甲型流感株，观察到HI滴度统计学显著的增加(p＜0.05)。对于H1H1株，在AS03和AS03 1/5之间还观察到HI滴度的显著差异(p＜0.05)。与普通疫苗相比，AS03的剂量降低不能增加针对所有3种毒株的HI滴度。只观察到非常低的抗B毒株(B/山东)的应答；这可能归因于用于初免和疫苗的B毒株之间显著的抗原漂移。
IV.3.结果概述和结论
总之，与普通疫苗相比，当利用AS03佐剂化疫苗时，在异种亚型株初免的动物中观察到HI滴度的增加。全量AS03最适合用于获得抗所有3种流感疫苗株的高HI滴度。
实施例V-佐剂化和未佐剂化的裂解流感疫苗(包含各种剂量的AS03佐剂)在初免C57BI/6小鼠中的临床前评价。
V.1.实验设计和目标
对流感初免小鼠进行实验，以便评价以该水包油佐剂配制的AS03流感疫苗诱导的体液应答和细胞应答的增加。为了模拟人体中的环境，使用经过异种亚型株初免的小鼠进行实验。
V.1.1.治疗/组(表11)
每组25只成年雌性C57BI/6小鼠在第0天用三价福尔马林灭活全流感病毒(每株5μg HA)鼻内初免(20μl体积)。初免毒株包括所述疫苗中包括毒株的早期漂移变体(5μg HA灭活的全H1N1A/北京/262/95，H3N2 A/巴拿马/2007/99，B/山东/7/97)。28天后，给小鼠肌内接种总体积100μl的单剂量疫苗候选物。用只包含裂解抗原的制剂(三价裂解普通疫苗)的制剂或者用三种剂量AS03(全量，1/2或者1/5)佐剂化的包含裂解抗原的制剂免疫小鼠。用于免疫的毒株包括H1N1 A/新喀里多尼亚/20/99，H3N2A/纽约/55/2004，B/江苏(Jiangsu)/10/2003病毒抗原(1.5μg/株，人剂量的1/10)。
表11
  组别   抗原/制剂   其他治疗
  1   三价裂解疫苗/普通疫苗(未佐剂化)   D0异源初免
  2   三价裂解疫苗/AS03   D0异源初免
  3   三价裂解疫苗/AS031/2   D0异源初免
  4   三价裂解疫苗/AS031/5   D0异源初免
  5   PBS   D0异源初免
V.1.2.疫苗制剂的制备
三价裂解疫苗/普通疫苗
按照下列顺序即时制备100μl剂量的制剂：注射用水+盐水缓冲液(按照实施例IV的教导制备10倍浓缩的PBS pH7.4)+Fluarix临床批DFLUA014(最终剂量1.5μg每株)。
三价裂解疫苗/AS03
按照下列顺序即时制备100μl剂量的制剂：注射用水+盐水缓冲液(按照实施例IV的教导制备10倍浓缩的PBS pH7.4)+Fluarix临床批DFLUA014(最终剂量1.5μg每株)+对于全量是25μl SB62乳液或者对于1/2剂量是12.5μl SB62乳液或者对于1/5剂量是5μl SB62乳液。所述制剂在制备结束后数小时内注射。
V.1.3.解读(表12)
在免疫后21天(10只小鼠/组)检测对接种的体液免疫应答，并通过血细胞凝集抑制(HI)试验检测血清样品。在免疫后7天通过胞内细胞因子染色(ICS)检测细胞免疫应答。
表12
  解读   时间点   样品类型   分析方法
  体液应答   D49   血清   IHA
  细胞应答   D35   PBMCs   ICS
V.2.结果
V.2.1.体液免疫(10只小鼠/组)
结果显示于图6。在这种异种亚型初免继之以单次接种的小鼠模型中，与普通疫苗相比，AS03及其稀释物(1/2和1/5)显示诱导更高的HI滴度。对于所有3种毒株，在接受全量AS03或者降低剂量AS03佐剂化疫苗的小鼠之间没有观察到HI滴度的差异。
V.2.2.细胞免疫(15只小鼠/组)
结果显示于图7。与用三价裂解普通疫苗免疫的小鼠相比，无论AS03的稀释度是多少，在用AS03佐剂化三价裂解疫苗免疫的小鼠中观察到更高的CD4+T细胞应答。与用全量AS03佐剂化的三价裂解疫苗免疫的小鼠中诱导的应答相比，当小鼠用更低剂量的AS03佐剂化的三价裂解疫苗免疫时，观察到细胞应答更低的趋势。
V.3.结果概述和结论
总之，与普通疫苗相比，当利用AS03佐剂化疫苗时，在异种亚型株初免的动物中观察到体液应答和细胞应答的增加。在用全量或者部分剂量的AS03佐剂免疫的小鼠之间观察到类似大小的体液免疫。但是，佐剂量的降低与CD4+T细胞应答降低的趋势有关。
实施例VI-对佐剂化和未佐剂化的裂解流感疫苗(包含各种剂量的AS03佐剂和低剂量抗原)在初免C57BI/6小鼠中诱导的细胞免疫应答的临床前评价。
VI.1.实验设计和目标
在流感初免小鼠中进行实验，以便评价通过AS03流感疫苗诱导的细胞免疫应答的增加，所述流感疫苗包含低剂量抗原(0.5μg/株，人剂量的1/30)，并用所述水包油佐剂配制。为了模拟人体中的环境，使用经过异种亚型株初免的小鼠进行实验。
VI.1.1.治疗/组(表13)
每组15只成年雌性C57BI/6小鼠在第0天用三价福尔马林灭活全流感病毒(每株5μg HA)鼻内初免(20μl体积)。初免毒株包括所述疫苗中包括毒株的早期漂移变体(5μg HA灭活的全H1N1 A/北京/262/95，H3N2A/巴拿马/2007/99，B/山东/7/97)。28天后，给小鼠肌内接种总体积50μl的单剂量疫苗候选物。用只包含裂解抗原的制剂(三价裂解普通疫苗)的制剂或者用三种剂量AS03(全量，1/2或者1/5)佐剂化的包含裂解抗原的制剂免疫小鼠。用于免疫的毒株包括H1N1 A/新喀里多尼亚/20/99，H3N2A/纽约/55/2004，B/江苏/10/2003病毒抗原(0.5μg/株，人剂量的1/30)。
表13
  组别   抗原/制剂   其他治疗
  1   三价裂解疫苗/普通疫苗(未佐剂化)   D0异源初免
  2   三价裂解疫苗/AS03   D0异源初免
  3   三价裂解疫苗/AS031/2   D0异源初免
  4   三价裂解疫苗/AS031/5   D0异源初免
  5   PBS   D0异源初免
VI.1.2.疫苗制剂的制备
三价裂解疫苗/普通疫苗
按照下列顺序即时制备50μl剂量的制剂：注射用水+盐水缓冲液(按照实施例IV的教导制备10倍浓缩的PBS pH7.4)+Fluarix临床批DFLUA014(最终剂量0.5μg每株)。
三价裂解疫苗/AS03
按照下列顺序即时制备50μl剂量的制剂：注射用水+盐水缓冲液(按照实施例IV的教导制备10倍浓缩的PBS pH7.4)+Fluarix临床批DFLUA014(最终剂量1.5μg每株)+对于全量是25μl SB62乳液或者对于1/2剂量是12.5μl SB62乳液或者对于1/5剂量是5μl SB62乳液。所述制剂在制备结束后数小时内注射。
VI.1.3.解读(表14)
在免疫后7天通过胞内细胞因子染色检测细胞免疫应答。
表14
  解读   时间点   样品类型   分析方法
  细胞应答   D35   PBMCs   ICS
VI.2.结果
VI.2.1.细胞免疫
结果显示于图8。与用三价裂解普通疫苗免疫的小鼠相比，在用AS03(全量或者1/2剂量)佐剂化三价裂解疫苗免疫的小鼠中观察到稍微更高的CD4+T细胞应答。与用三价裂解普通疫苗或者用全量或者半量AS03佐剂化的疫苗免疫的小鼠中诱导的应答相比，当小鼠用1/5AS03剂量佐剂化的三价裂解疫苗免疫时，观察到更高的细胞应答。
VI.3.结果概述和结论
总之，与普通疫苗相比，当利用AS03佐剂化疫苗时，在异种亚型株初免的动物中观察到CD4+T细胞应答的最小增加。在实验中没有观察到佐剂的剂量应答，实际上1/5AS03剂量诱导的抗原特异性CD4+T细胞频率要高于在更高佐剂量中观察到的频率。总的来说这些数据与其他临床前实验不一致，可能暗示该特定实验的技术问题。
实施例VII-佐剂化和未佐剂化的裂解H5N1疫苗(包含各种剂量的AS03佐剂和抗原)在未免疫C57BI/6小鼠中的临床前评价。
VII.1.实验设计和目标
对H5N1未免疫小鼠进行实验，以便评价以该水包油佐剂配制的AS03 H5N1裂解疫苗的体液应答和细胞应答的增加。就大范围流行的疾病来说，预计全部世界人口对新传播的大流行性感冒株都是没有免疫力的。由于这种无免疫力的状况，大流行病疫苗可能需要两个疫苗剂量来保护个体免受新流感株引起的感染和严重疾病。为了体现这种先前暴露的缺乏，开发出一种未免疫小鼠模型来评价疫苗的免疫原性。
VII.1.1.治疗/组(表15)
每组15只成年雌性未免疫C57BI/6小鼠在第0天和28天用总体积50μl的大流行H5N1疫苗候选物肌内免疫。用只包含裂解H5N1抗原的制剂(H5N1裂解普通疫苗)的制剂或者用不同剂量AS03(双倍量，全量，1/2或者1/5)佐剂化的包含裂解抗原的制剂免疫小鼠。用于免疫的毒株包括H5N1 A/越南(Vietnam)/1194/04病毒抗原(1.5或者0.38μg/株，相当于人剂量的1/10)。没有使用含双倍AS03剂量的制剂，而是联合注射50μl H5N1裂解疫苗/AS03全量+1个50μl剂量AS03。
表15
  组别   抗原/制剂   抗原剂量
  1   H5N1裂解疫苗/普通疫苗(未佐剂化)   1.5μg
  2   H5N1裂解疫苗/双倍剂量AS03   1.5μg
  3   H5N1裂解疫苗/AS03   1.5μg
  4   H5N1裂解疫苗/AS031/2   1.5μg
  5   H5N1裂解疫苗/AS031/5   1.5μg
  6   H5N1裂解疫苗/普通疫苗(未佐剂化)   0.38μg
  7   H5N1裂解疫苗/双倍剂量AS03   0.38μg
  8   H5N1裂解疫苗/AS03   0.38μg
  9   H5N1裂解疫苗/AS031/2   0.38μg
  10   H5N1裂解疫苗/AS031/5   0.38μg
  11   PBS
VII.1.2.疫苗制剂的制备
制备1升成品缓冲液(PBS pH7.2±0.2)：向0.800升注射用水中添加NaCl 7.699g，KCl 0.200g，MgCl2×6H2O 0.100g，Na2HPO4×12H2O 2.600g，KH2PO4 0.373g。溶解后，用注射用水补足1.0升。
H5N1裂解疫苗/普通疫苗
50μl剂量的制备：
向成品缓冲液中添加硫柳汞(数量需要考虑其在毒株中的浓度)和Triton X100。不添加Tween 80，因为毒株中的Tween浓度已经达到制剂中的含量目标。1.5μg制剂量的终浓度是硫柳汞10μg/ml，Tween 80368μg/ml和Triton X100 35μg/ml。0.38μg制剂量的终浓度是硫柳汞10μg/ml，Tween 80 93μg/ml和Triton X100 8.9μg/ml。在磁力搅拌5-30分钟后，添加1.5或者0.38μg HA(H5N1株)。搅拌所述制剂30-60分钟。检查pH。在制备结束数小时内进行注射。
H5N1裂解疫苗/AS03
50μl剂量的制备：
向成品缓冲液中添加硫柳汞(数量需要考虑其在毒株中的浓度)和Triton X100。不添加Tween 80，因为毒株中的Tween浓度已经达到制剂中的含量目标。1.5μg制剂量的终浓度是硫柳汞10μg/ml，Tween 80368μg/ml和Triton X100 35μg/ml。0.38μg制剂量的终浓度是硫柳汞10μg/ml，Tween 80 93μg/ml和Triton X100 8.9μg/ml。在磁力搅拌5-30分钟后，添加1.5或者0.38μg HA(H5N1株)。在磁力搅拌30-60分钟后，添加25或者12.5或者5μl SB62乳液。搅拌所述制剂30-60分钟。检查pH。在制备结束数小时内进行注射。
VII.1.3.解读(表16)
在免疫后14天(10只小鼠/组)通过抗Ig、IgG1和IgG2b抗体滴度检测体液免疫应答(图9，A-F)。在免疫后21天(10只小鼠/组)还通过抗H5N1血细胞凝集抑制分析(图10，A-B)检测体液免疫应答。
在免疫后6天(每组5个库，每库3只小鼠)，通过流式细胞术对胞内细胞因子染色(ICS)的抗原特异性CD4+T细胞计数(图11，A-B)，检测细胞免疫应答。
表16
  解读   时间点   样品类型   分析方法
  体液应答   D39   血清  ELISA，同种型和HI滴度
  细胞应答   D34   PBMCs  ICS
VII.2.结果
VII.2.1.体液免疫应答：ELISA和同种型。
结果显示于图9。
与未佐剂化的H5N1裂解疫苗相比，所有含佐剂的组在各个H5N1裂解疫苗剂量都诱导更高的抗H5N1 Ig、IgG1和IgG2b抗体滴度(图9-A到F)。
在各个H5N1裂解疫苗剂量，抗H5N1 IgG1抗体应答比抗H5N1IgG2b抗体应答高4-5倍(图9-C到F)。利用1.5μg HA剂量的H5N1裂解疫苗并与各种剂量的佐剂组合，没有观察到抗H5N1 Ig、IgG1和IgG2b抗体应答的差异(图9-A、C和E)。
与用AS03/2(p＝0.7315)和AS031/5(p＝0.9744)佐剂化的H5N1裂解疫苗诱导的应答相比，利用0.38μg HA剂量的H5N1裂解疫苗，用2×全量佐剂化的H5N1裂解疫苗免疫后获得抗H5N1 Ig滴度更高的趋势(图9-B)。对于抗H5N1 IgG1抗体应答也观察到这种趋势(图9-D)。但是，这种能力不足以观察到统计学显著的差异(对于1.7倍差异是25％能力，或者对于2倍差异是47％能力)。
VII.2.2.体液免疫应答：HI滴度。
利用1.5μg HA/小鼠的剂量：
与用未佐剂化H5N1裂解疫苗免疫的小鼠中获得的应答相比，在各个佐剂量用含AS03佐剂的H5N1裂解疫苗免疫的所有小鼠都诱导更高的HI滴度(图10-A)。当H5N1裂解疫苗使用一个剂量范围的AS03作为佐剂时，没有观察到HI滴度的差异(图10-A)。
利用0.38μg HA/剂量的剂量：
与用未佐剂化H5N1裂解疫苗免疫的小鼠中获得的应答相比，在各个佐剂量用含AS03佐剂的H5N1裂解疫苗免疫的所有小鼠都诱导更高的HI滴度(图10B)。
与利用AS03/2佐剂化H5N1裂解疫苗获得的应答相比，利用2×全量AS03佐剂化的H5N1裂解疫苗观察到显著更高的HI滴度(对于4倍差异p＝0.032)(图10B)。
在利用2×全量AS03或者全量AS03佐剂化的H5N1裂解疫苗免疫的小鼠中没有观察到HI滴度的差异，或者在用AS03/2或者AS03/5佐剂化的H5N1裂解疫苗免疫的小鼠之间也没有观察到HI滴度的差异(图10B)。
抗原剂量(1.5μg或者0.38μg)之间的比较：
在用AS03、AS03/2或者AS03/5佐剂化的各种HA剂量的H5N1裂解疫苗免疫的小鼠之间没有观察到HI滴度的差异，但在用AS03/5佐剂化的1.5μg HA裂解H5N1免疫的小鼠和用2×全量AS03佐剂化的0.38μg HA裂解H5N1免疫的小鼠之间观察到HI滴度的差异(图10)。用2×全量AS03佐剂化的0.38μg HA裂解H5N1免疫后，其HI滴度显著高于用混合更低佐剂量的更高抗原剂量(1.5μg HA和AS03/5，对于4倍差异p＝0.0193)免疫后的HI滴度图10)。
VII.2.3.细胞免疫应答
结果显示于图11。
与用未佐剂化H5N1裂解疫苗免疫的小鼠相比，在用各种剂量AS03佐剂化的H5N1裂解疫苗免疫的小鼠中在各个H5N1裂解疫苗剂量(1.5或者0.38μg)都观察到更高的CD4+T细胞应答(图11)。
在1.5μg的H5N1裂解疫苗剂量，AS03剂量的降低对应于CD4+T细胞频率的降低(图11A)。但是，当剂量为0.38μg H5N1裂解疫苗时，在用于不同佐剂量的AS03佐剂化H5N1裂解疫苗免疫的小鼠之间没有观察到CD4+T细胞应答的差异(图11B)。
VII.3.结果概述和结论
小鼠中的免疫原性研究显示，佐剂化的H5N1裂解疫苗比未佐剂化的H5N1裂解疫苗诱导显著更高的体液(抗H5N1 ELISA和HI滴度)和细胞(CD4+T细胞)应答。
在用1.5μg和0.38μg佐剂化的H5N1裂解疫苗免疫的小鼠之间没有观察到体液免疫应答的抗原剂量应答效应，表明在佐剂存在的条件下，在该模型中甚至低剂量的HA也能观察到剂量应答效应。
与普通H5N1疫苗相比，当利用AS03佐剂化的H5N1大流行病疫苗时，在未免疫小鼠中观察到CD4+T细胞应答的显著增加。当0.38μg剂量的H5N1裂解疫苗被用作疫苗候选物时，没有观察到AS03稀释度的影响，但是当1.5μg H5N1裂解疫苗用剂量降低的AS03佐剂化时，观察到CD4T细胞应答的降低。
正如先前观察到的，在用全量AS03或者AS03/2佐剂化的H5N1裂解疫苗(在任一种抗原剂量)免疫的小鼠之间没有观察到体液和细胞免疫应答的差异。当在疫苗制剂中使用2×全量AS03时，检测到免疫应答的一些增强，相应的，当在疫苗制剂中使用AS03/5时，检测到免疫应答的降低。
总的说来，这里报告的数据支持这种新的佐剂系统在所述疫苗制剂中的效力。
实施例VIII-佐剂化和未佐剂化的流感疫苗在初免大白猪中的临床前评价。
VIII.1.实验设计和目标
对流感初免猪进行实验，以便评价以该水包油佐剂配制的AS03流感疫苗诱导的体液应答的增加。
使用猪是为了在接近人的动物模型中评价剂量范围的AS03。猪显示很多的生物学相似性，使这种动物与人生理学上最接近，只有个别例外(Douglas R.，1972)。此外，在猪中也经常观察到流感感染现象。
VIII.1.1.治疗/组(表17)
每组10只成年雌性大白猪在第0天用总体积200μl的三价福尔马林灭活全流感病毒(每株25μg HA)鼻内初免。初免株包括与疫苗株同源的毒株(25μg HA灭活全H1N1A/新喀里多尼亚/20/99，H3N2A/巴拿马/2007/99和B/山东/7/97)。28天后，给猪肌内接种总体积500μl的单剂量疫苗候选物。用只包含裂解抗原的制剂(三价裂解普通疫苗)免疫猪，或者用剂量范围的AS03(全量，1/2或者1/5)佐剂化的包含裂解抗原的制剂免疫猪。用于免疫的毒株包括H1N1 A/新喀里多尼亚/20/99，H3N2A/巴拿马/2007/99和B/山东/7/97病毒抗原(在一份人剂量中，对于H1N1A/新喀里多尼亚/20/99、H3N2A/巴拿马/2007/99毒株来说是15μg HA，对于B/山东/7/97毒株来说是17.5μg)。
组(10只猪/组)：
表17
  组别   抗原/制剂   其他治疗
  1   三价裂解疫苗/普通疫苗(未佐剂化)   D0异源初免
  2   三价裂解疫苗/AS03   D0异源初免
  3   三价裂解疫苗/AS031/2   D0异源初免
  4   三价裂解疫苗/AS031/5   D0异源初免
VIII.1.2.疫苗制剂的制备
三价裂解/普通疫苗
制备Tween 80、Triton X100和维生素E琥珀酸酯(VES)的预混合物，以便在疫苗中达到750μg/ml Tween 80、110μg/ml Triton X100和100μg/ml VES的终浓度。计算预混合物中使用的数量是需考虑它们在毒株中的含量。
按照下列顺序即时制备500μl剂量的制剂：注射用水+盐水缓冲液(按实施例IV的教导制备10倍浓缩的PBS pH7.4)+预混合物，室温下磁力搅拌5分钟，+15μg HA H1N1株，室温下磁力搅拌10分钟，+15μg HA H3N2株，室温下磁力搅拌10分钟，+17.5μg HA B株，室温下磁力搅拌15分钟。所述制剂在制备结束后数小时内注射。
三价裂解疫苗/AS03
制备Tween 80、Triton X100和维生素E琥珀酸酯(VES)的预混合物，以便在疫苗中达到750μg/ml Tween 80、110μg/ml Triton X100和100μg/ml VES的终浓度。计算预混合物中使用的数量是需考虑它们在毒株中的含量。
按照下列顺序即时制备500μl剂量的制剂：注射用水+盐水缓冲液(按照实施例IV的教导制备10倍浓缩的PBS pH7.4)+预混合物，室温下磁力搅拌5分钟，+15μg HA H1N1株，室温下磁力搅拌10分钟，+15μg HA H3N2株，室温下磁力搅拌10分钟，+17.5μg HA B株，室温下磁力搅拌15分钟，+对于全量AS03是250μl SB62乳液或者对于1/2剂量AS03是125μl SB62乳液或者对于1/5剂量AS03是50μl SB62乳液，室温下磁力搅拌15分钟。所述制剂在制备结束后数小时内注射。
VIII.1.3.解读(表18)
在鼻内初免前(第0天)、免疫前(第28天)和免疫后14天(10只猪/组)检测对接种的体液免疫应答。通过血细胞凝集抑制(HI)试验检测血清样品。
表18
  解读   时间点   样品类型   分析方法
  体液应答   D0、D28、D42   血清   IHA
VIII.2.结果和结论
VIII.2.1.体液免疫
结果显示于图12。无论佐剂的稀释度如何，在同源初免的所述模型中，AS03佐剂化的三价裂解制剂针对所有毒株都诱导比普通三价制剂更强的HI应答，尽管对所有3种毒株并不总是达到统计显著性。在毒株之间观察到佐剂剂量效应的微小差异。对于免疫原性较低的毒株诸如B/山东，只有全量AS03佐剂化的三价裂解疫苗才显著不同于普通疫苗。与用全量AS03佐剂化的三价裂解疫苗相反，降低剂量的AS03不能使针对所有3种毒株的HI滴度超过利用普通疫苗观察到的HI滴度。

Claims (10)

1.一种包含(1)抗原或者抗原组合物和(2)佐剂组合物的免疫原性组合物，所述佐剂组合物由水包油乳液组成，其中所述水包油乳液包含1-6mg角鲨烯、1-7mg母育酚和0.4-3mg乳化剂，每人剂量，其中所述每人剂量的体积为0.25至1.5ml。
2.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述母育酚是α-生育酚。
3.如权利要求1或2所述的免疫原性组合物，其中所述乳化剂是聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯。
4.如权利要求3所述的免疫原性组合物，其中所述聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯选自：
Figure FSB00000809212000011
80或者80。
5.如权利要求3所述的免疫原性组合物，其中所述每人剂量的体积为0.4至1.5ml。
6.如权利要求5所述的免疫原性组合物，其中所述每人剂量体积是0.5ml。
7.如权利要求5所述的免疫原性组合物，其中所述每人剂量体积是0.7ml。
8.如权利要求5所述的免疫原性组合物，其中所述每人剂量体积是1.0ml。
9.如权利要求1或2所述的免疫原性组合物，其中所述抗原或者抗原组合物是从流感病毒制备的。
10.如权利要求1-9中任意一项所述的免疫原性组合物在制备用于疾病或者病症的预防性治疗或者治疗的药物中的用途。
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