ES2656510T3 - Antígenos de Pseudomonas y combinación de antigenos - Google Patents

Abstract

Una composición inmunogénica que comprende un antígeno PSE54 (PA5340) y opcionalmente uno o más antígenos seleccionados de la lista de: un antígeno PSE44-4 (PA3526); un antígeno PSE10-1 (PA1178); un antígeno PSE21-5 (PA5112); un antígeno PSE27-1 (PA0328); un antígeno PSE52-1 (PA4765); un antígeno PSE53- 1 (PA5047); un antígeno PSE11-3 (PA1248); un antígeno PSE41-5 (PA2407); un PSE47A-2 (PA4082); PSE5-1 (PA0595); PSE13-2 (PA1954); PSE17-1 (PA3692); PSE18-2 (PA4370); PSE20-1 (PA4735); PSE23-1 (PA3647); PSE24-1 (PA0126); PSE25-1 (PA0189); PSE26-1 (PA0274); PSE28-2 (PA0537); PSE31-2 (PA0737); PSE33-2 (PA1086); PSE42-1 (PA2793); PSE45-2 (PA3535); PSE50-1 (PA4578); PSE51-4 (PA4667); PSE19-1 (PA4710); PSE34-1 (PA1106); PSE36-3 (PA1324); PSE38-1 (PA1777).

Description

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Primer grupo de antígenos

PA0328 o PSE271

[0048] El antígeno 'PA0328' está anotado como 'membrana autotransportadora exterior'. En la cepa PAO1 se anota como 'proteína hipotética' y tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 y se describe como PA0328 en la referencia 37. Esta secuencia está anotada en NCBI como GI: 15595525. Se ha demostrado recientemente que es una proteína autotransportadora relevante en la estrategia de virulencia adoptada por Pseudomonas aeruginosa a través de su actividad de aminopeptidasa específica de arginina, como en la referencia 38. Algunas veces, PA0328 se denomina aquí "PSE27-1" o "PSE27".

[0049] Antígenos PA0328 útiles pueden provocar un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administra a un ser humano.) Que reconoce la SEQ ID NO: 1 y/o puede comprender una secuencia de aminoácidos:. (A) que tiene 50%

o más de identidad (por ejemplo, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o más) a SEQ ID NO: 1; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos aminoácidos “n” consecutivos de SEQ ID NO: 1, en donde “n” es 7 o más (p. ej. 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas PA0328 incluyen variantes de SEQ ID NO: 1. Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de SEQ ID NO: 1. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 49, 50 o más) del extremo N de SEQ ID NO: 1 mientras que retiene al menos un epítopo de SEQ ID NO: 1. Los últimos 40-50 aminoácidos C-terminales de SEQ ID NO: 1 pueden omitirse útilmente. Los primeros 22 aminoácidos N-terminales de SEQ ID NO: 1 se pueden omitir útilmente. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteína.

[0050] La SEQ ID NO: 36 es un fragmento útil de SEQ ID NO: 1 ('PA032822-647'). Este fragmento omite el péptido líder en la porción N-terminal para permitir la expresión y la purificación.

PA5112 o PSE21-5

[0051] El antígeno 'PSE21-5' está anotado como "Esterasa o EstA" en la cepa PAO1. En la cepa PAO1, PSE21-5 se describe como "PA5112" y tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3. En la cepa PAO1, su identificador en NCBI es GI: 15600305 Véase Ref.37. A veces, PA5112 se denomina aquí "PSE21-5" o "PSE21".

[0052] Antígenos PSE21-5 útiles pueden provocar un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administran a un ser humano) que reconoce la SEQ ID NO: 3 y/o puede comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene 50% o más identidad (por ejemplo. 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% o más) a SEQ ID NO: 3; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos aminoácidos “n” consecutivos de SEQ ID NO: 3, en donde “n” es 7 o más (p. ej. 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas PSE21-5 incluyen variantes de SEQ ID NO: 3. Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de SEQ ID NO: 3. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N de la SEQ ID NO: 3 mientras que retiene al menos un epítopo de SEQ ID NO: 3. Los 40 aminoácidos C-terminales finales de SEQ ID NO.: 3 pueden omitirse útilmente. Los primeros 24 aminoácidos N-terminales de SEQ ID NO: 3 pueden omitirse útilmente. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteína. PSE21-5 es naturalmente una proteína larga y, por lo tanto, el uso de fragmentos es útil, por ejemplo, para la purificación, manipulación, fusión, expresión, etc.

[0053] La SEQ ID NO: 38 es un fragmento útil de SEQ ID NO: 3 ('PSE21-5 25-646). Este fragmento incluye el dominio más expuesto de PSE21-5 y se usa más fácilmente a escala industrial.

PA2407 o PSE4]-5

[0054] El antígeno "PSE41-5" está anotado como "probable proteína de adhesión". En la cepa PAO1, PSE41-5 se denomina PA2407 y tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 5 (GI: 15597603). Véase Ref.37. A veces, PA2407 se denomina aquí PSE41-5 o PSE41. A veces, PA2407 se denomina aquí PSE41-5 o PSE41.

[0055] Antígenos “PSE41-5" útiles pueden provocar un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administra a un ser humano) que reconoce la SEQ ID NO: 5 y/o puede comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene 50% o más de identidad (por ejemplo, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5 % o más) a SEQ ID NO: 5; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos aminoácidos “n” consecutivos de SEQ ID NO: 5, en donde “n” es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas "PSE41-5" incluyen variantes de SEQ ID NO: 5. Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de SEQ ID NO: 5. Otros fragmentos preferidos carecen de uno

o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N de SEQ ID NO: 5 mientras que se retiene al menos un epítopo de SEQ ID NO: 5. Los 40 aminoácidos C-terminales finales de SEQ ID NO: 5

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98%, 99%, 99,5% o más) con la SEQ ID NO: 9; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos aminoácidos “n” consecutivos de la SEQ ID NO: 9, en el que “n” es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas PSE53-1 incluyen variantes de la SEQ ID NO: 9. Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítope de la SEQ ID NO: 9. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C-terminal y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N-terminal de SEQ ID NO: 9, manteniendo al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 9. Los 40 aminoácidos C-terminal finales de la SEQ ID NO: 9 útilmente pueden omitirse. Los primeros 18 aminoácidos N-terminales de SEQ ID NO: 9 útilmente pueden omitirse. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de la proteína. PSE53-1 es, naturalmente, una proteína de longitud y por lo que el uso de fragmentos es útil por ejemplo para la purificación, la manipulación, la fusión, la expresión, etc.

[0065] SEQ ID NO: 44 es un fragmento útil de SEQ ID NO: 9 ('PSE53-1 19-479'). Este fragmento incluye el dominio más expuesto de PSE53-1 y se utiliza más fácilmente a una escala industrial. También reduce la similitud del antígeno con las proteínas humanas.

PA5340 o PSE54

[0066] El antígeno PSE54 está anotado como "probable precursor de la proteína de membrana externa” y como “proteína hipotética”. En la cepa PAO1 PSE54 es PA3526 y tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 10 (GI: 15598722). Véase Ref.37. A veces, PA5340 se denomina aquí como “PSE54”.

[0067] Antígenos PSE54 útiles pueden provocar un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administran a un ser humano) que reconocen la SEQ ID NO: 10 y/o puede comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene 50%

o más de identidad (por ejemplo, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o más) a la SEQ ID NO: 10; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos aminoácidos “n” consecutivos de SEQ ID NO: 10, en el que “n” es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas PSE54 incluyen variantes de la SEQ ID NO: 10. Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítope de la SEQ ID NO: 10. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del C-terminal y uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N-terminal de SEQ ID NO: 10, manteniendo al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 10. Los 40 aminoácidos C-terminales de SEQ ID NO: 10 útilmente se pueden omitir. Los primeros 16 aminoácidos N-terminales de SEQ ID NO: 10 útilmente pueden omitirse. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteínas. PSE54 es, naturalmente, una proteína de longitud y por lo que el uso de fragmentos es útil por ejemplo para la purificación, la manipulación, la fusión, la expresión, etc.

[0068] SEQ ID NO: 45 es un fragmento útil de SEQ ID NO: 10 (“PSE554 17-243'). Este fragmento incluye el dominio más expuesto de PSE54 y se utiliza más fácilmente a una escala industrial. También reduce la similitud del antígeno con las proteínas humanas.

PA0595 o PSE5-1

[0069] El antígeno PSE5-1 está anotado como “precursor OstA de proteína de tolerancia de disolvente orgánico”. En la cepa PAO1 PSE5-1 es PA0595 y tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 11 (GI: 15595792). Véase Ref.37. A veces, PA0595 se denomina aquí como “PSE5-1 o “PSE5”.

[0070] Antígenos PSE5-1 útiles pueden provocar un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administra a un ser humano) que reconoce la SEQ ID NO: 11 y/o puede comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene 50%

o más de identidad (por ejemplo, 60 %, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o más) con la SEQ ID NO: 11; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos aminoácidos “n” consecutivos de SEQ ID NO: 11, en el que “n” es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas PSE5-1 incluyen variantes de la SEQ ID NO: 11. Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítope de la SEQ ID NO: 11. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del C-terminal y/o uno o más aminoácidos, (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N-terminal de SEQ ID NO: 11, manteniendo al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 11. Los 40 aminoácidos C-terminales de SEQ ID NO: 11 útilmente se pueden omitir. Los primeros 33 aminoácidos N-terminales de SEQ ID NO: 11 útilmente pueden omitirse. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de la proteína. PSE5-1 es, naturalmente, una proteína de longitud y por lo que el uso de fragmentos es útil por ejemplo para la purificación, la manipulación, la fusión, la expresión, etc.

[0071] SEQ ID NO: 46 es un fragmento útil de SEQ ID NO: 11 (“PSES-1 34-924''). Este fragmento incluye el dominio más expuesto de PSE5-1 y se utiliza más fácilmente a una escala industrial.

[0072] El antígeno PSE13-2 está anotado como “proteína hipotética”. En la cepa PAO1 PSE13-2 es PA1954 y tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 12 (GI: 15597150). Véase Ref.37. A veces, PA1954 se denomina aquí como “PSE13-2” o “PSE13”.

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uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del C-terminal y/o uno o más aminoácidos y/o uno o por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N-terminal de SEQ ID NO: 18, manteniendo al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 18. Los primeros 19 aminoácidos N-terminales de SEQ ID NO: 18 útilmente se pueden omitir. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de la proteína. PSE24-1 es, naturalmente, una proteína de longitud y por lo que el uso de fragmentos es útil por ejemplo para la purificación, la manipulación, la fusión, la expresión, etc.

[0089] SEQ ID NO: 53 es un fragmento útil de SEQ ID NO: 18 (“PSE24-1 20-206). Este fragmento incluye el dominio más expuesto de PSE24-1 y se utiliza más fácilmente a una escala industrial.

PA0189 o PSE25-1

[0090] El antígeno PSE25-1 está anotado como “probable porina”. En la cepa PAO1 PSE25-1 es PA0189 y tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 19 (GI: 15595387). Véase Ref. 37. A veces, PA0189 se denomina aquí como “PSE25-1” o “PSE25”.

[0091] Antígenos PSE25-1 útiles pueden provocar un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administra a un ser humano) que reconoce la SEQ ID NO: 19 y/o puede comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene 50%

o más de identidad (por ejemplo, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o más) con la SEQ ID NO: 19; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos aminoácidos “n” consecutivos de SEQ ID NO: 19, en el que “n” es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas PSE25-1 incluyen variantes de la SEQ ID NO: 19. Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítope de la SEQ ID NO: 19. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del C-terminal y/o uno o más aminoácidos y/o uno o por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N-terminal de SEQ ID NO: 19, manteniendo al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 19. Los primeros 25 aminoácidos N-terminales de SEQ ID NO: 19 útilmente se pueden omitir. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de la proteína. PSE25-1 es, naturalmente, una proteína de longitud y por lo que el uso de fragmentos es útil por ejemplo para la purificación, la manipulación, la fusión, la expresión, etc.

[0092] SEQ ID NO: 54 es un fragmento útil de SEQ ID NO: 19 (“PSE25-1 26-452'). Este fragmento incluye el dominio más expuesto de PSE25-1 y se utiliza más fácilmente a una escala industrial.

PA0274 o PSE26-1

[0093] El antígeno PSE26-1 está anotado como “proteína hipotética”. En la cepa PAO1 PSE26-1 es PA0274 y tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 20 (GI: 15595471). Véase Ref. 37. A veces, PA0274 se denomina aquí como “PSE26-1” o “PSE26”.

[0094] Antígenos PSE26-1 útiles pueden provocar un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administra a un ser humano) que reconoce la SEQ ID NO: 20 y/o puede comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene 50%

o más de identidad (por ejemplo, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o más) con la SEQ ID NO: 20; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos aminoácidos “n” consecutivos de la SEQ ID NO: 20, en el que “n” es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas PSE26-1 incluyen variantes de la SEQ ID NO: 20. Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítope de la SEQ ID NO: 20. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del C-terminal y/o uno o más aminoácidos y/o uno o por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N-terminal de SEQ ID NO: 20, manteniendo al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 20. Los primeros 23 aminoácidos N-terminales de SEQ ID NO: 20 útilmente se pueden omitir. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de la proteína. PSE26-1 es, naturalmente, una proteína de longitud y por lo que el uso de fragmentos es útil por ejemplo para la purificación, la manipulación, la fusión, la expresión, etc.

[0095] SEQ ID NO: 55 es un fragmento útil de SEQ ID NO: 20 (“PSE26-1 24-256'). Este fragmento incluye el dominio más expuesto de PSE26-1 y se utiliza más fácilmente a una escala industrial.

PA0537 o PSE28-2

[0096] El antígeno PSE28-1 está anotado como “proteína hipotética conservada”. En la cepa PAO1 PSE28-1 es PA0537 y tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 21 (GI: 15595734). Véase Ref. 37. A veces, PA0537 se denomina aquí como “PSE28-1” o “PSE28”.

[0097] Antígenos PSE28-1 útiles pueden provocar un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administra a un ser humano) que reconoce la SEQ ID NO: 21 y/o puede comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene 50%

o más de identidad (por ejemplo, 60 %, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o más) con la SEQ ID NO: 21; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos aminoácidos “n”

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más expuesto de PSE50-1 y se utiliza más fácilmente a una escala industrial.

PA4667 o PSE51-4

[0115] El antígeno PSE51-4 está anotado como “proteína hipotética”. En la cepa PAO1 PSE51-4 es PA4667 y tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 30 (GI: 15599862). Véase Ref. 37. A veces, PA4667 se denomina aquí como “PSE51-4” o “PSE51”.

[0116] Antígenos PSE51-4 útiles pueden provocar un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administra a un ser humano) que reconoce la SEQ ID NO: 30 y/o puede comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene 50%

o más de identidad (por ejemplo, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o más) con la SEQ ID NO: 30; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos aminoácidos “n” consecutivos de SEQ ID NO: 30, en el que “n” es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas PSE51-4 incluyen variantes de la SEQ ID NO: 30. Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítope de la SEQ ID NO: 30. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del C-terminal y/o uno o más aminoácidos y/o uno o por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 19, 20, 25, 30 o más) del extremo N-terminal de SEQ ID NO: 30, manteniendo al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 30. Los primeros 31 aminoácidos N-terminales de SEQ ID NO: 30 útilmente puede omitirse. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de la proteína. PSE51-4 es, naturalmente, una proteína de longitud y por lo que el uso de fragmentos es útil por ejemplo para la purificación, la manipulación, la fusión, la expresión, etc.

[0117] SEQ ID NO: 65 es un fragmento útil de SEQ ID NO: 30 (“PSE51-4 32-590"). Este fragmento incluye el dominio más expuesto de PSE51-4 y se utiliza más fácilmente a una escala industrial.

PA1106 o PSE34-1

[0118] El antígeno PSE34-1 está anotado como “proteína hipotética”. En la cepa PAO1 PSE34-1 es PA1106 y tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 24 (GI: 15596303). Véase Ref. 37. A veces, PA1106 se denomina aquí como “PSE34-1” o “PSE34”.

[0119] Antígenos PSE34-1 útiles pueden provocar un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administra a un ser humano) que reconoce la SEQ ID NO: 24 y/o pueden comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene 50%

o más de identidad (por ejemplo, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o más) a la SEQ ID NO: 24; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos aminoácidos “n” consecutivos de SEQ ID NO: 24, en el que “n” es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas PSE34-1 incluyen variantes de la SEQ ID NO: 24. Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítope de la SEQ ID NO: 24. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del C-terminal y/o uno más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N-terminal de SEQ ID NO: 24, manteniendo al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 24. Los primeros 20 aminoácidos N-terminales de SEQ ID NO: 24 útilmente se pueden omitir. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de la proteína. PSE34-1 es, naturalmente, una proteína de longitud y por lo que el uso de fragmentos es útil por ejemplo para la purificación, la manipulación, la fusión, la expresión, etc.

[0120] SEQ ID NO: 59 es un fragmento útil de SEQ ID NO: 24 (“PSE34-1 21-237"). Este fragmento incluye el dominio más expuesto de PSE34-1 y se utiliza más fácilmente a una escala industrial.

PA1324 o PSE36-3

[0121] El antígeno PSE36-3 está anotado como “proteína hipotética”. En la cepa PAO1 PSE36-3 es PA1324 y tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 25 (GI: 15596521). Véase Ref. 37. A veces, PA1324 se denomina aquí como “PSE36-3” o “PSE36”.

[0122] PA1324 se postula para involucrarse en el transporte de unión y de azúcares o polisacáridos asociados con la matriz de peptidoglicano durante la formación de biopelícula. [43]

[0123] Antígenos PSE36-3 útiles pueden provocar un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administra a un ser humano) que reconoce la SEQ ID NO: 25 y/o pueden comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene 50%

o más de identidad (por ejemplo, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o más) con la SEQ ID NO: 25; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos aminoácidos “n” consecutivos de SEQ ID NO: 25, en el que “n” es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas PSE36-3 incluyen variantes de la SEQ ID NO: 25. Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítope de la SEQ ID NO: 25. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del C-terminal y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N-terminal de SEQ ID NO: 25,

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manteniendo al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 25. los primeros 19 aminoácidos N-terminales de SEQ ID NO: 25 útilmente se pueden omitir. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de la proteína. PSE36-3 es, naturalmente, una proteína de longitud y por lo que el uso de fragmentos es útil por ejemplo para la purificación, la manipulación, la fusión, la expresión, etc.

[0124] SEQ ID NO: 60 es un fragmento útil de SEQ ID NO: 25 (“PSE36-3"20 -170"). Este fragmento incluye el dominio más expuesto de PSE36-3 y se utiliza más fácilmente a una escala industrial.

Segundo grupo de antígeno

PA1178 o PSE10

[0125] El antígeno “PSE10” está anotado como “PhoP/Q y proteína de membrana externa inducible de baja Mg2 +”. En la cepa PAO1 PSE10 se llama también como OprH [44] y tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2. En la cepa PAO1 PSE10 está anotado como PA1178 y su identificador NCBI es GI: 15596375. Véase Ref. 37. A veces, PA1178 se denomina aquí como “PSE10-1” o “PSE10”.

[0126] Antígenos PSE10 útiles pueden provocar un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administra a un ser humano) que reconoce la SEQ ID NO: 2 y/o puede comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene 50% o más de identidad (por ejemplo, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o más) a la SEQ ID NO: 2; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos aminoácidos “n” consecutivos de la SEQ ID NO: 2, en el que “n” es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas PSE10 incluyen variantes de la SEQ ID NO: 2. Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítope de la SEQ ID NO: 2. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del C-terminal y/o uno o más aminoácidos y/o uno o por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más) del extremo N-terminal de SEQ ID NO: 2, conservando al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 2. Los primeros aminoácidos 21 N-terminal de la SEQ ID NO: 2 útilmente pueden omitirse. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de la proteína. El uso de fragmentos es útil por ejemplo para la purificación, la manipulación, la fusión, la expresión, etc.

[0127] SEQ ID NO: 37 es un fragmento útil de SEQ ID NO: 2 (“PSE10 22-200"). Este fragmento incluye el dominio más expuesto de PSE10 y se utiliza más fácilmente a una escala industrial.

PA1248 o PSE11-3

[0128] El antígeno “PSE11-3” está anotado como “precursor AprF de proteína de membrana externa de secreción de proteasa de alcalina”. En la cepa PAO1 PSE11-3 es PA1248 y tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 4. En la cepa PAO1 el identificador NCBI es GI: 15596445. Véase la referencia 37 y 45.

[0129] A veces, PA1248 se denomina aquí como “PSE11-3” o “PSE11”.

[0130] Antígenos PSE11-3 útiles pueden provocar un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administra a un ser humano) que reconoce la SEQ ID NO: 4 y/o puede comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene 50% o más de identidad (por ejemplo, 60%, 65%, 70% 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%., 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o más) con la SEQ ID NO: 4; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos aminoácidos “n” consecutivos de la SEQ ID NO: 4, en el que “n” es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas PSE11-3 incluyen variantes de la SEQ ID NO: 4. Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítope de la SEQ ID NO: 4. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del C-terminal y/o uno o más aminoácidos y/o uno o por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N-terminal de SEQ ID NO: 4, conservando al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 4. los primeros aminoácidos 18 N-terminales de SEQ ID NO: 4 útilmente se pueden omitir. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de la proteína. PSE11-3 es, naturalmente, una proteína de longitud y por lo que el uso de fragmentos es útil por ejemplo para la purificación, la manipulación, la fusión, la expresión, etc. En referencia 45 este antígeno se describe como un factor de virulencia conocidos y se ensayó como antígeno.

[0131] SEQ ID NO: 39 es un fragmento útil de SEQ ID NO: 4 (“PSE11-3 19-481). Este fragmento incluye el dominio más expuesto de PSE11-3 y se utiliza más fácilmente a una escala industrial.

PA4765 o PSE52-1

[0132] El antígeno PSE52-1 está anotado como “Precursor OmlA de lipoproteína de la membrana exterior”. En la cepa PAO1 PSE52-1 es PA4765 y tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 8 (GI: 15599959). Véase Ref. 37. A veces, PA4765 se denomina aquí como “PSE52-1” o “PSE552”.

[0133] Se ha descrito desde 1999 como perteneciente a la familia de proteínas de membrana externa como en la

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cualquiera del “segundo grupo de antígeno".

Polipéptidos híbridos

[0152] Los antígenos usados en la invención pueden estar presentes en la composición como polipéptidos separados individuales. Dónde más de se utiliza un antígeno, sin embargo, no tienen que estar presentes como polipéptidos separados. En su lugar, al menos dos (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, o más) antígenos pueden expresarse como una cadena polipeptídica simple (un polipéptido “híbrido”). Polipéptidos híbridos ofrecen dos ventajas principales: primero, un polipéptido que puede ser inestable o mal expresado solo puede ser asistido por la adición de una pareja híbrida adecuada que supera el problema; segundo, la fabricación comercial se simplifica como sólo una expresión y purificación se necesita emplear para producir dos polipéptidos que son ambos antigénicamente útil. El polipéptido híbrido puede comprender dos o más secuencias de polipéptidos del primer grupo de antígenos. El polipéptido híbrido puede comprender una o más secuencias de polipéptidos del primer grupo de antígenos y una o más secuencias de polipéptidos del segundo grupo de antígeno. Por otra parte, el polipéptido híbrido puede comprender dos o más secuencias de polipéptidos de cada uno de los antígenos mencionados anteriormente, o dos

o más variantes del mismo antígeno en los casos en los que la secuencia tiene variabilidad parcial a través de las cepas.

[0153] Los híbridos que consiste en secuencias de aminoácidos de dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve,

o diez antígenos son útiles. En particular, se prefieren los híbridos que consisten en secuencias de aminoácidos de dos, tres, cuatro, o cinco antígenos, tales como dos o tres antígenos.

[0154] Los polipéptidos híbridos diferentes pueden ser mezclados juntos en una única formulación. Los híbridos pueden combinarse con los antígenos no híbridos seleccionados de entre los grupos de antígenos primero, segundo

o tercero. Dentro de tales combinaciones, un antígeno puede estar presente en más de un polipéptido híbrido y/o como un polipéptido no híbrido. Se prefiere, sin embargo, que un antígeno está presente ya sea como un híbrido o como un no híbrido, pero no como ambos.

[0155] Los polipéptidos híbridos también se pueden combinar con conjugados o antígenos no de P.aeruginosa como se describe anteriormente.

[0156] Los polipéptidos híbridos pueden ser representados por la fórmula NH2-A-{-XL-}n-B-COOH, en la que: X es una secuencia de aminoácidos de un antígeno P. aeruginosa, como se describe anteriormente; L es una secuencia de engarce de aminoácidos opcional; A es una secuencia de aminoácidos N-terminal opcional; B es una secuencia de aminoácidos C-terminal opcional; n es un número entero de 2 o más (por ejemplo 2, 3, 4, 5, 6, etc.). Por lo general, n es 2 o 3.

[0157] Si un resto -X-tiene una secuencia de péptido líder en su forma de tipo salvaje, esto puede ser incluido u omitido en la proteína híbrida. En algunas realizaciones, se eliminarán los péptidos líder a excepción que el resto -Xsituado en el extremo N-terminal de la proteína híbrida es decir, el péptido líder de X1 se mantendrá, pero los péptidos líder de X2... Xn se omitirá. Esto es equivalente a la eliminación de todos los péptidos líder y usando el péptido líder de X1 como resto -A-.

[0158] Para cada instancia n de {-XL-}, secuencia de aminoácidos de engarce -L-puede estar presente o ausente. por ejemplo, cuando n = 2 el híbrido puede ser NH2-X1 -L1-X2-L2-COOH, NH2-X1-X2-COOH, NH2-X1-L1-X2-COOH, NH2-X1-X2-L2-COOH, etc. Secuencia de aminoácidos de enlace -L-típicamente será corta (por ejemplo, 20 o menos aminoácidos, es decir, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Ejemplos comprenden secuencias de péptidos cortas que facilitan la clonación, enlazadores de poli-glicina (es decir, que comprenden Glyn donde n = 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) (SEQ ID NO: 71), y etiquetas de histidina (es decir, Sun donde n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) (SEQ ID NO: 72). Otras secuencias de aminoácido de enlazador adecuadas serán evidentes para los expertos en la técnica. Un enlazador útil es GSGGGG (SEQ ID NO: 67) o GSGSGGGG (SEQ ID NO: 68), con el dipéptido Gly-Ser estando formado a partir de un sitio de restricción BamHI, ayudando así a la clonación y manipulación, y el (Gly)4 (SEQ ID NO: 73) tetrapéptido siendo un enlazador de poli-glicina típico. Otros enlazadores adecuados, en particular para su uso como Ln definitiva son ASGGGS (SEQ ID NO: 69) o un dipéptido Leu-Glu.

[0159] -A-es una secuencia de aminoácidos N-terminal opcional. Será típicamente corta (por ejemplo, 40 o menos aminoácidos, es decir, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Los ejemplos incluyen secuencias líder para dirigir el tráfico de proteínas, o secuencias de péptidos cortas que facilitan la clonación o purificación (por ejemplo, etiquetas de histidina, es decir, Sun donde n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más)(SEQ ID NO: 72). Una etiqueta útil contiene una secuencia de 6 histidinas consecutivas (SEQ ID NO: 70), teniendo en su inicio un homólogo o heterólogo de inicio metionina y/o una alanina, es decir, SEQ ID NO 66. Otras secuencias de aminoácidos N-terminales adecuados serán evidentes para los expertos en la técnica. Si X1 carece de su propia metionina N-terminal, -A-es preferentemente un oligopéptido (por ejemplo con 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 aminoácidos) que proporciona una metionina de N-terminal por ejemplo, Met-Ala-Ser, o un único residuo de Met.

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preferiblemente por el algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman como se describe anteriormente. Tales ácidos nucleicos incluyen los que utilizan codones alternativos para codificar el mismo aminoácido.

[0173] La divulgación también proporciona ácido nucleico que puede hibridar con estos ácidos nucleicos. Las reacciones de hibridación se pueden realizar bajo condiciones de diferente "rigurosidad". Las condiciones que aumentan la rigurosidad de una reacción de hibridación son ampliamente conocidas y publicadas en la técnica. Ejemplos de condiciones relevantes incluyen (en orden de rigurosidad creciente): temperaturas de incubación de 25°C, 37°C, 50°C, 55°C y 68°C; concentraciones de tampón de 10 x SSC, 6 x SSC, 1 x SSC, 0,1 x SSC (donde SSC es 0,15 M NaCl y 15 mM de tampón citrato) y sus equivalentes usando otros sistemas de tampón; concentraciones de formamida de 0%, 25%, 50% y 75%; tiempos de incubación de 5 minutos a 24 horas; 1, 2, o más etapas de lavado; tiempos de incubación de lavado de 1, 2, o 15 minutos; y soluciones de lavado de 6 x SSC, 1 x SSC, 0,1 x SSC, o agua desionizada. Las técnicas de hibridación y su optimización son bien conocidas en la técnica.

[0174] En algunas realizaciones, el ácido nucleico de la invención se hibrida con una diana en condiciones de baja rigurosidad; en otras realizaciones que se hibrida bajo condiciones de astringencia intermedia; en formas de realización preferidas, se hibrida en condiciones de alta rigurosidad. Un conjunto ejemplar de las condiciones de hibridación de rigurosidad baja es de 50°C y 10 x SSC. Un conjunto ejemplar de condiciones de hibridación de rigurosidad intermedia es de 55°C y 1 x SSC. Un conjunto ejemplar de condiciones de hibridación de alta rigurosidad es 68°C y 0,1 x SSC.

[0175] La invención incluye ácido nucleico que comprende secuencias complementarias a estas secuencias (por ejemplo, para antisentido o sondeo, o para su uso como cebadores).

[0176] Los ácidos nucleicos de la invención se pueden utilizar en reacciones de hibridación (por ejemplo, transferencias Northern o Southern, o en microensayos de ácidos nucleicos o “chips de genes”) y las reacciones de amplificación (por ejemplo, PCR, SDA, SSSR, LCR, TMA, NASBA, etc) y otras técnicas de ácidos nucleicos.

[0177] El ácido nucleico de acuerdo con la invención puede adoptar diversas formas (por ejemplo, monocatenario, bicatenario, vectores, cebadores, sondas, etiquetado, etc.). Los ácidos nucleicos de la invención pueden ser circulares o ramificados, pero generalmente serán lineales. A menos que se especifique o requiera lo contrario, cualquier realización de la invención que utiliza un ácido nucleico puede utilizar tanto la forma de doble hebra como cada una de dos formas de una sola hebra complementarias que componen la forma de doble cadena. Los cebadores y las sondas son generalmente de cadena sencilla, como son los ácidos nucleicos antisentido.

[0178] Los ácidos nucleicos de la divulgación se proporcionan preferiblemente en forma purificada o sustancialmente purificada es decir, sustancialmente libre de otros ácidos nucleicos (por ejemplo, libres de ácidos nucleicos de origen natural), particularmente de otras pseudomonas o ácidos nucleicos de la célula huésped, en general, siendo al menos aproximadamente el 50% pura (en peso), y por lo general al menos aproximadamente 90% puro. Los ácidos nucleicos de la invención son preferiblemente ácidos nucleicos de pseudomonas.

[0179] Los ácidos nucleicos de la invención se pueden preparar de muchas maneras, por ejemplo por síntesis química (por ejemplo, la síntesis de fosforamidita de ADN) en su totalidad o en parte, mediante la digestión de ácidos nucleicos más largos usando nucleasas (por ejemplo, enzimas de restricción), por unirse a ácidos nucleicos más cortos o nucleótidos (por ejemplo, usando ligasas o polimerasas), a partir de bibliotecas genómicas o de ADNc,

etc.

[0180] el ácido nucleico de la invención puede estar unido a un soporte sólido (por ejemplo, una perla, placa, filtro, película, diapositiva, apoyo de micromatriz, resina, etc.). Ácido nucleico de la invención puede marcarse por ejemplo con un marcador radiactivo o fluorescente, o una etiqueta de biotina. Esto es particularmente útil cuando el ácido nucleico se va a utilizar en técnicas de detección, por ejemplo cuando el ácido nucleico es un cebador o como sonda.

[0181] El término "ácido nucleico" incluye, en general, significa una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, que contienen desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, y/o sus análogos. Incluye los híbridos de ADN, ARN, ADN/ARN. También incluye análogos ADN o ARN, tales como los que contienen esqueletos modificados (por ejemplo ácidos nucleicos peptídicos. (PNAS) o rothioates fosfo) o bases modificadas. Así, la invención incluye ARNm, ARNt, ARNr, ribozimas, ADN, ADNc, ácidos nucleicos recombinantes, ácidos nucleicos ramificados, plásmidos, vectores, sondas, cebadores, etc. donde el ácido nucleico de la invención toma la forma de ARN, puede

o puede no tener una tapa 5”.

[0182] Los ácidos nucleicos de la descripción pueden ser parte de un vector es decir, parte de una construcción de ácido nucleico diseñado para traslaso/transfección de uno o más tipos de células. Los vectores pueden ser, por ejemplo, "vectores de clonación" que están diseñados para el aislamiento, la propagación y la replicación de los nucleótidos insertados, "vectores de expresión" que están diseñados para la expresión de una secuencia de nucleótidos en una célula huésped, "vectores virales" que está diseñados para resultar en la producción de un virus recombinante o partícula similar a virus, o "vectores de lanzadera", que comprenden los atributos de más de un tipo

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de vector. Los vectores preferidos son plásmidos. Una "célula huésped" incluye un cultivo de células o célula individual que puede ser o ha sido un receptor de ácido nucleico exógeno. Las células huésped incluyen la progenie de una única célula huésped, y la progenie puede no ser necesariamente completamente idéntica (en morfología o en complemento de ADN total) a la célula parental original debido a mutación natural, accidental, o deliberada y/o cambio. Las células huésped incluyen células transfectadas o infectadas in vivo o in vitro con un ácido nucleico de la invención.

[0183] Cuando un ácido nucleico es ADN, se apreciará que "U" en una secuencia de ARN será reemplazado por "T" en el ADN. Asimismo, cuando un ácido nucleico es ARN, se apreciará que "T" en una secuencia de ADN será reemplazado por "U" en el ARN.

[0184] El término "complemento" o "complementario" cuando se usa en relación con ácidos nucleicos se refiere a apareamiento de bases Watson-Crick. Por lo tanto el complemento de C es G, el complemento de G es C, el complemento de A es T (o U), y el complemento de T (o U) es A. También es posible utilizar bases tales como I (la inosina de purina) por ejemplo para complementar las pirimidinas (C o T).

[0185] Los ácidos nucleicos de la descripción se pueden utilizar, por ejemplo: para producir polipéptidos; como sondas de hibridación para la detección de ácido nucleico en muestras biológicas; para generar copias adicionales de los ácidos nucleicos; para generar ribozimas u oligonucleótidos antisentido; como cebadores o sondas de ADN de cadena sencilla; o como la formación de oligonucleótidos formadores de triple hebra.

[0186] La presente divulgación proporciona un procedimiento para producir ácido nucleico de la invención, en el que el ácido nucleico se sintetiza en parte o en total utilizando medios químicos.

[0187] La descripción proporciona vectores que comprenden secuencias de nucleótidos de la invención (por ejemplo, clonación o vectores de expresión) y células huésped transformadas con tales vectores.

[0188] Amplificación de ácido nucleico de acuerdo con la invención puede ser cuantitativa y/o en tiempo real.

[0189] Para ciertas realizaciones de la invención, los ácidos nucleicos son preferiblemente al menos 7 nucleótidos de longitud (por ejemplo, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 225, 250, 275, 300 nucleótidos o más).

[0190] Para ciertas realizaciones de la invención, los ácidos nucleicos son preferiblemente como máximo 500 nucleótidos de longitud (por ejemplo, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15 nucleótidos o más cortos).

[0191] Los cebadores y sondas de la invención, y otros ácidos nucleicos usados para la hibridación, son preferentemente entre 10 y 30 nucleótidos de longitud (por ejemplo 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40 o más nucleótidos).

Cepas y variantes

[0192] Los antígenos se han definido anteriormente con referencia a la nomenclatura (por ejemplo, "PA0328"), a "PSE52" o a "PSE seguido de un número natural, que indica el número de clon, es decir, PSE52-1, etc." o a los respectivos números SEQ ID NOS.

[0193] La Tabla 1 a continuación asocia estos tres sistemas de numeración/asignación a numeración pública disponible de PAO1 existente.

[0194] La numeración PAO1 se refiere al genoma de cepa PAO1 de P. aeruginosa que se describe ampliamente en términos de análisis genómico en referencia 37.

[0195] Anotaciones funcionales para cada antígeno se dan también en las bases de datos.

[0196] Así, un aminoácido ejemplar y secuencia de nucleótidos de cualquiera de estos antígenos se pueden encontrar fácilmente en secuencia de bases de datos pública de la cepa PAO1, pero la invención no se limita a las secuencias de las cepas PAO1. Técnicas estándar de búsqueda y alineación se pueden utilizar para identificar en cualquiera de estas (u otras) secuencias de genoma adicionales del homólogo de cualquier secuencia particular de la cepa PAO1. Por otra parte, las secuencias disponibles de la cepa PAO1 se pueden utilizar para diseñar cebadores para la amplificación de secuencias homólogas de otras cepas. Así, la invención no se limita a esta cepa, sino más bien abarca tales variantes y homólogos de otras cepas de P. aeruginosa, así como las variantes no naturales. En general, las variantes adecuadas de un SEQ ID NO particular incluyen sus variantes alélicas, sus formas polimórficas, sus homólogos, sus ortólogos, sus parálogos, sus mutantes, etc.

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[0197] Así, por ejemplo, los polipéptidos utilizados con la invención pueden, en comparación a la SEQ ID NO en el presente documento, incluir una o más (por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, etc) sustituciones de aminoácidos, tales como sustituciones conservativas (es decir, sustituciones de un aminoácido con otro que tienen una cadena lateral relacionada). Aminoácidos codificados genéticamente se dividen generalmente en cuatro familias: (1) ácidas es decir, aspartato, glutamato; (2) básicas es decir, lisina, arginina, histidina; (3) no polares, es decir, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano; y (4) polares sin carga es decir, glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. La fenilalanina, el triptófano y la tirosina se clasifican a veces conjuntamente como aminoácidos aromáticos. En general, la sustitución de aminoácidos individuales dentro de estas familias no tiene un efecto importante sobre la actividad biológica. Los polipéptidos también pueden incluir una

o más (por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, etc) deleciones de aminoácido con respecto a las secuencias SEQ ID NO. Los polipéptidos también pueden incluir una o más (por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, etc) inserciones (por ejemplo, cada uno de 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos) con respecto a las secuencias SEQ ID NO.

[0198] De manera similar, un polipéptido utilizado con la invención puede comprender una secuencia de aminoácidos que:

es idéntica (es decir, 100% idéntica) a una secuencia descrita en el listado de secuencias;

comparte identidad de secuencia (por ejemplo, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o más) con una secuencia descrita en el listado de secuencias;

tiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 (o más) alteraciones de aminoácidos individuales (deleciones, inserciones, sustituciones), que pueden estar en lugares separados o pueden ser contiguos, en comparación con las secuencias de (a) o (b);

cuando se alinea con una secuencia particular de la lista de secuencias utilizando un algoritmo de alineamiento por pares, moviendo cada una ventana móvil de aminoácidos x de N-terminal a C-terminal (tal como para una alineación que se extiende a aminoácidos p, donde p>x, hay p-x+1 tales ventanas) tiene al menos aminoácidos x·y idénticos alineados, donde: x se selecciona de 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200; y se selecciona de 0,50, 0,60, 0,70, 0,75, 0,80, 0,85, 0,90, 0,91, 0,92, 0,93, 0,94, 0,95, 0,96, 0,97, 0,98, 0,99; y si x·y no es un número entero, entonces se redondea al entero más cercano. El algoritmo de alineamiento por pares preferido es el algoritmo global de alineación Needleman-Wunsch [52], utilizando parámetros por defecto (por ejemplo, con sanción de abertura de hueco = 10,0, y con sanción de abertura de extensión = 0,5, usando la matriz de puntuación EBLOSUM62). Este algoritmo se implementa convenientemente en la herramienta de aguja en el paquete EMBOSS [53].

[0199] Cuando se utilizan polipéptidos híbridos, los antígenos individuales dentro del híbrido (es decir, restos individuales -X-) pueden ser de una o más cepas. Cuando n = 2, por ejemplo, X2 puede ser de la misma cepa que X1

o de una cepa diferente. Cuando n = 3, las cepas podrían ser (i) X1 = X2 = X3 (ii) X1 = X2 ≠ X3 (iii) X1 ≠ X2 = X3 (iv) X1 = ̸ X2 ≠ X3o (v) X1= X3≠ X2, etc.

[0200] Dentro del grupo (c), deleciones o sustituciones pueden ser en el N-terminal y/o C-terminal, o pueden estar comprendidas entre los dos extremos. Así, un truncamiento es un ejemplo de una deleción. Los truncamientos pueden implicar eliminación de hasta 40 (o más) aminoácidos en el extremo N-terminal y/o C-terminal. El truncamiento N-terminal puede eliminar péptidos líder, por ejemplo, para facilitar la expresión recombinante en un huésped heterólogo. El truncamiento C-terminal puede eliminar las secuencias de anclaje, por ejemplo, para facilitar la expresión recombinante en un huésped heterólogo.

[0201] En general, cuando un antígeno comprende una secuencia que no es idéntica a una completa secuencia P. aeruginosa de la lista de secuencias (por ejemplo, cuando comprende una lista de secuencias con <100% de identidad de secuencia con la misma, o cuando comprende un fragmento de los mismos), se prefiere en cada caso individual que el antígeno puede obtener un anticuerpo que reconoce la completa respectiva secuencia P. aeruginosa.

Bacterias mutantes

[0202] La presente descripción también proporciona una bacteria P. aeruginosa en la que uno o más de los antígenos de los diversos grupos de antígenos de la invención ha/han sido noqueados (véase Ref. 46). Las técnicas para producir bacterias knockout son bien conocidas, y knockout de genes de cepas P. aeruginosa se han reportado es decir, en la Ref. 54. Una mutación knockout puede estar situada en la región codificante del gen o puede estar dentro de sus regiones de control transcripcional (por ejemplo, dentro de su promotor). Una mutación knockout reducirá el nivel de ARNm que codifica el antígeno a <1% del producido por la bacteria de tipo salvaje, preferiblemente <0,5%, más preferiblemente <0,1%, y más preferiblemente a 0%.

[0203] La divulgación también proporciona P. aeruginosa en el que uno o más de los antígenos de los diversos grupos de antígenos de la invención tiene una mutación que inhibe su actividad. El gen que codifica el antígeno tendrá una mutación que cambia la secuencia de aminoácidos codificada. La mutación puede implicar la deleción, sustitución y/o inserción, cualquiera de los cuales puede implicar uno o más aminoácidos.

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[0204] La divulgación también proporciona una bacteria, tal como una bacteria P. aeruginosa, que hiper-expresa un antígeno de la invención.

[0205] La divulgación también proporciona una bacteria, tal como una bacteria P. aeruginosa, que expresa constitutivamente un antígeno de la invención. La descripción también proporciona un E. coli que comprende un gen que codifica un antígeno de la invención, en el que el gen está bajo el control de un promotor inducible.

[0206] Bacterias mutantes son particularmente útiles para la preparación de vesículas de membrana externa bacterianas que incluyen antígenos P. aeruginosa (por ejemplo, antígenos de la invención), que pueden ser utilizados como inmunógenos [55-57].

Composiciones inmunogénicas y medicamentos

[0207] Las composiciones inmunogénicas de la invención pueden ser útiles como vacunas. Las vacunas de acuerdo con la invención pueden ser o bien profilácticas (es decir, para prevenir la infección) o terapéuticas (es decir, para tratar la infección), pero normalmente serán profilácticas.

[0208] Las composiciones pueden por tanto ser farmacéuticamente aceptables. Por lo general, incluir componentes además de los antígenos, por ejemplo, que típicamente incluyen uno o más vehículos farmacéuticos y/o excipientes.

[0209] Las composiciones generalmente se administrarán a un mamífero en forma acuosa. Antes de la administración, sin embargo, la composición puede haber estado en una forma no acuosa. Por ejemplo, aunque algunas vacunas se fabrican en forma acuosa, luego se llenan y se distribuyen y se administran también en forma acuosa, otras vacunas se liofilizan durante la fabricación y se reconstituyen en una forma acuosa en el momento de uso. Así, una composición de la invención se puede secar, tal como una formulación liofilizada.

[0210] La composición puede incluir conservantes tales como tiomersal o 2-fenoxietanol. Se prefiere, sin embargo, que la vacuna debe ser sustancialmente libre de (es decir, menos de 5 µg/ml) de material mercurial por ejemplo tiomersal libre. Las vacunas que no contienen mercurio son más preferidas. Vacunas sin conservantes son particularmente preferidas.

[0211] Para mejorar la estabilidad térmica, una composición puede incluir un agente de protección de la temperatura. Más detalles de tales agentes se proporcionan a continuación.

[0212] Para controlar la tonicidad, se prefiere incluir una sal fisiológica, tal como una sal de sodio. Se prefiere el cloruro de sodio (NaCl), que puede estar presente en entre 1 y 20 mg/ml, por ejemplo aproximadamente 10+2 mg/ml de NaCl. Otras sales que pueden estar presentes incluyen cloruro potásico, dihidrógeno fosfato de potasio, dihidrato fosfato disódico, cloruro de magnesio, cloruro de calcio, etc.

[0213] Las composiciones generalmente tendrán una osmolalidad de entre 200 mOsm/kg y 400 mOsm/kg, preferentemente entre 240-360 mOsm/kg, y caerán más preferiblemente dentro del intervalo de 290-310 mOsm/kg.

[0214] Las composiciones pueden incluir uno o más tampones. Los tampones típicos incluyen: un tampón fosfato; un tampón Tris; un tampón borato; un tampón succinato; un tampón de histidina (en particular con un adyuvante de hidróxido de aluminio); o un tampón citrato. Tampones estarán normalmente incluidos en el rango 5-20MM.

[0215] El pH de una composición generalmente será de entre 5,0 y 8,1, y más típicamente entre 6,0 y 8,0, por ejemplo 6,5 y 7,5, o entre 7,0 y 7,8.

[0216] La composición es preferiblemente estéril. La composición es preferentemente no pirogénica por ejemplo, que contiene <1 UE (unidad de endotoxina, una medida estándar) por dosis, y preferiblemente <0,1 UE por dosis. La composición es el gluten preferiblemente libre.

[0217] La composición puede incluir material para una única inmunización o puede incluir material para inmunizaciones múltiples (es decir, un kit “multidosis”). La inclusión de un conservante se prefiere en las disposiciones multidosis. Como alternativa (o además) a la inclusión de un conservante en composiciones de dosis múltiples, las composiciones pueden estar contenidas en un recipiente que tiene un adaptador aséptico para la eliminación de material.

[0218] Vacunas humanas se administran típicamente en un volumen de dosis de aproximadamente 0,5 ml, aunque un medio de la dosis (es decir, aproximadamente 0,25 ml) se puede administrar a niños.

[0219] Las composiciones inmunogénicas de la invención también pueden comprender uno o más agentes inmunorreguladores. Preferiblemente, uno o más de los agentes inmunorreguladores incluyen uno o más adyuvantes. Los adyuvantes pueden incluir un adyuvante TH1 y/o un adyuvante de TH2, o un agonista de TLR7 se analiza más adelante.

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[0220] Así, la invención proporciona una composición inmunogénica que comprende una combinación de:

(1)

uno o más antígeno(s) seleccionado(s) de entre el grupo de antígenos primero, segundo, y adicional (como se ha definido anteriormente); y

(2)

un adyuvante, tal como un adyuvante de hidróxido de aluminio (por ejemplo, uno o más antígenos pueden ser adsorbidos en hidróxido de aluminio).

[0221] Por ejemplo, la descripción proporciona una composición inmunogénica que comprende una combinación de un antígeno de sta006 y un adyuvante, tal como un adyuvante de hidróxido de aluminio. Del mismo modo, la descripción proporciona una composición inmunogénica que comprende una combinación de un antígeno de sta011 y un adyuvante, tal como un adyuvante de hidróxido de aluminio. Estas composiciones son idealmente tamponadas por ejemplo con un tampón de histidina.

[0222] Los adyuvantes que pueden usarse en composiciones de la invención incluyen, pero no están limitados a:

A. Composiciones que contienen minerales

[0223] Composiciones que contienen minerales adecuados para uso como adyuvantes en la invención incluyen sales minerales, tales como sales de aluminio y sales de calcio (o mezclas de los mismos). Las sales de calcio incluyen fosfato de calcio (por ejemplo, Las partículas "tope" descritas en la ref. 58). Las sales de aluminio incluyen hidróxidos, fosfatos, sulfatos, etc., con las sales que tienen cualquier forma adecuada (por ejemplo gel, cristalina, amorfa, etc.). Se prefiere la adsorción de estas sales (por ejemplo, Todos los antígenos se pueden adsorber). Las composiciones que contienen minerales también pueden formularse como una partícula de sal metálica [59].

[0224] Los adyuvantes conocidos como hidróxido de aluminio y fosfato de aluminio se pueden utilizar. La invención puede utilizar cualquiera de los adyuvantes "fosfato" o "hidróxido" que son de uso general como adyuvantes. Los adyuvantes conocidos como "hidróxido de aluminio" son típicamente sales de oxihidróxido de aluminio, que son por lo general al menos parcialmente cristalino. Los adyuvantes conocidos como "fosfato de aluminio" son típicamente hidroxifosfatos de aluminio, a menudo también contiene una pequeña cantidad de sulfato (es decir, sulfato de hidroxifosfato de aluminio). Pueden ser obtenidos por precipitación, y las condiciones de reacción y las concentraciones durante la precipitación influyen en el grado de sustitución de fosfato por hidroxilo en la sal.

[0225] Una morfología fibrosa (por ejemplo, como se ve en micrografías electrónicas de transmisión) es típica de los adyuvantes de hidróxido de aluminio. El pI de adyuvantes de hidróxido de aluminio es típicamente de aproximadamente 11 es decir, el adyuvante en sí tiene una carga superficial positiva a pH fisiológico. Capacidades de adsorción de entre 1,8 -2,6 mg de proteína por mg de Al+++ a pH 7,4 se han reportado para los adyuvantes de hidróxido de aluminio.

[0226] Los adyuvantes de fosfato de aluminio tienen en general una relación molar PO4/Al entre 0,3 y 1,2, preferiblemente entre 0,8 y 1,2, y más preferiblemente 0,95+0,1. El fosfato de aluminio será generalmente amorfo, en particular para las sales de hidroxifosfato. Un adyuvante típico es hidroxifosfato de aluminio amorfo con Relación molar PO4/Al entre 0,84 y 0,92, incluido a 0,6 mg de Al3+/ml. El fosfato de aluminio será generalmente de partículas (por ejemplo, morfología de tipo placa como se ve en micrografías electrónicas de transmisión). Los diámetros típicos de las partículas están en el intervalo de 0,5-20 µm (por ejemplo, aproximadamente 5-10 µm) después de cualquier adsorción de antígeno. Capacidades de adsorción de entre 0,7-1,5 mg de proteína por mg de Al+++ a pH 7,4 se han reportado para los adyuvantes de fosfato de aluminio.

[0227] El punto de carga cero (PZC) de fosfato de aluminio está inversamente relacionado con el grado de sustitución de fosfato por hidroxilo, y este grado de sustitución puede variar dependiendo de las condiciones de reacción y concentración de los reactivos usados para preparar la sal por precipitación. PZC también se altera cambiando la concentración de iones fosfato libres en solución (más fosfato = PZC más ácido) o por adición de un tampón tal como un tampón de histidina (hace PZC más básico). Fosfatos de aluminio usados de acuerdo con la invención generalmente tendrán un PZC de entre 4,0 y 7,0, más preferiblemente entre 5,0 y 6,5, por ejemplo aproximadamente 5,7.

[0228] Las suspensiones de sales de aluminio utilizadas para preparar composiciones de la invención pueden contener un tampón (por ejemplo, un fosfato o una histidina o un tampón Tris), pero esto no siempre es necesario. Las suspensiones son preferentemente estériles y libres de pirógenos. Una suspensión puede incluir iones fosfato acuosos libres, por ejemplo, presente en una concentración entre 1,0 y 20 mM, preferiblemente entre 5 y 15 mM, y más preferiblemente aproximadamente 10 mM. Las suspensiones pueden comprender también cloruro de sodio.

[0229] La invención puede utilizar una mezcla de tanto un hidróxido de aluminio como un fosfato de aluminio. En este caso puede haber más de fosfato de aluminio que hidróxido por ejemplo, una relación en peso de al menos 2: 1, por ejemplo ≥ 5: 1, ≥ 6: 1, ≥ 7: 1, ≥ 8: 1, ≥ 9: 1, etc.

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[0230] La concentración de Al+++ en una composición para administración a un paciente es preferiblemente menor que 10 mg/ml por ejemplo ≤ 5 mg/ml, ≤ 4 mg/ml, ≤ 3 mg/ml, ≤ 2 mg/ml, ≤ 1 mg/ml, etc. Un intervalo preferido es entre 0,3 y 1 mg/ml. Se prefiere un máximo de 0,85 mg/dosis.

B. Emulsiones de aceite

[0231] Las composiciones de emulsiones de aceite adecuadas para su uso como adyuvantes en la invención incluyen emulsiones de escualeno-agua, tales como MF59 [capítulo 10 de la ref. 63; véase también ref. 60] (5% de escualeno, 0,5% de Tween 80, y 0,5% de Span 85, formulados en partículas submicrométricas usando un microfluidizador). El adyuvante completo de Freund (CFA) y el adyuvante incompleto de Freund (IFA) también se pueden utilizar.

[0232] Se conocen varios adyuvantes de emulsión de aceite-en-agua, y típicamente incluyen al menos un aceite y al menos un tensioactivo, con el aceite y tensioactivo biodegradable (metabolizable) y biocompatible.

[0233] Las gotas de aceite en la emulsión son en general menos de 5 µm de diámetro, y lo ideal sería tener un diámetro inferior a la micra, lográndose estos pequeños tamaños con un microfluidizador para proporcionar emulsiones estables. Se prefieren gotas con un tamaño inferior a 220 nm, ya que pueden ser sometidas a un filtrado de esterilización.

[0234] La emulsión puede comprender aceites tales como los de un animal (como el pescado) o fuente vegetal. Las fuentes de aceites vegetales incluyen nueces, semillas y granos. El aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite de coco y aceite de oliva, los más comúnmente disponibles, ejemplifican los aceites de frutos secos. El aceite de jojoba se puede utilizar por ejemplo, obtenido de la semilla de jojoba. Los aceites de semillas incluyen el aceite de cártamo, aceite de semilla de algodón, aceite de semilla de girasol, aceite de semilla de sésamo y similares. En el grupo de los granos, el aceite de maíz es el más fácilmente disponible, pero el aceite de otros granos de cereales tales como trigo, avena, centeno, arroz, tef, tritical y similares también se puede utilizar. 6-10 ésteres de ácidos grasos de carbono de glicerol y 1,2-propanodiol, aunque no se producen de forma natural en los aceites de semillas, se pueden preparar mediante hidrólisis, separación y esterificación de los materiales apropiados a partir de los aceites de frutos secos y de semillas. Las grasas y aceites de la leche de mamífero son metabolizables y por lo tanto se pueden usar en la práctica de esta invención. Los procedimientos para la separación, purificación, saponificación y otros medios necesarios para obtener aceites puros de fuentes animales se conocen bien en la técnica. La mayoría de los peces contienen aceites metabolizables que pueden ser recuperados fácilmente. Por ejemplo, el aceite de hígado de bacalao, aceites de hígado de tiburón, y el aceite de ballena tal como esperma de ballena ejemplifican varios de los aceites de pescado que se pueden usar en el presente documento. Una serie de aceites de cadena ramificada se sintetizan bioquímicamente en unidades de isopreno de 5 carbonos y se denominan generalmente como terpenoides. Aceite de hígado de tiburón contiene un terpenoide ramificado, insaturado conocido como escualeno, 2,6,10,15,19,23-hexametilo-2,6,10,14,18,22-tetracosahexaeno, que se prefiere particularmente en el presente documento. Escualano, el análogo saturado del escualeno, también es un aceite preferido. Los aceites de pescado, incluidos el escualeno y escualano, están fácilmente disponibles de fuentes comerciales o pueden obtenerse por métodos conocidos en la técnica. Otros aceites preferidos son los tocoferoles (véase más adelante). Las mezclas de aceites se pueden utilizar.

[0235] Los tensioactivos se pueden clasificar por su “HLB” (equilibrio hidrófilo/lipófilo). Los tensioactivos preferidos de la invención tienen un HLB de al menos 10, preferiblemente al menos 15, y más preferiblemente al menos 16. La invención se pueden usar con tensioactivos que incluyen, pero no se limitan a: los tensioactivos de ésteres de polioxietileno sorbitán (comúnmente denominado Tweens), especialmente polisorbato 20 y polisorbato 80; copolímeros de óxido de etileno (EO), óxido de propileno (PO), y/o óxido de butileno (BO), que se vende bajo el nombre comercial DOWFAXTM, tales como copolímeros de bloque lineal de OE/OP; octoxinoles, que pueden variar en el número de repetición de grupos de etoxi (oxi-1,2-etanodiilo), con octoxinol-9 (Triton X-100, o toctilfenoxipolietoxietanol) siendo de particular interés; (octilfenoxi)polietoxietanol (IGEPAL CA-630/NP-40); fosfolípidos tales como fosfatidilcolina (lecitina); etoxilatos de nonilfenol, tales como la serie TergitolTM NP; éteres de poli oxietileno grasos derivados de alcoholes de laurilo, cetilo, estearilo y oleilo (conocidos como tensioactivos Brij), tales como éter de monolaurilo de trietileneglicol (Brij 30); y ésteres de sorbitán (comúnmente conocidos como los tramos), tales como trioleato de sorbitán (Span 85) y monolaurato de sorbitán. Se prefieren los tensioactivos no iónicos. Los tensioactivos preferidos para incluir en la emulsión son Tween 80 (monooleato de polioxietileno sorbitano), Span 85 (trioleato de sorbitano), lecitina y Triton X-100.

[0236] Las mezclas de tensioactivos se pueden utilizar por ejemplo mezclas Tween 80/Span 85. Una combinación de un éster de sorbitán de polioxietileno, tales como monooleato de sorbitán de polioxietileno (Tween 80) y un octoxinol tal como t-octilfenoxipolietoxietanol-(Triton X-100) también es adecuado. Otra combinación útil comprende laureth éster de sorbitán 9 más un polioxietileno y/o un octoxinol.

[0237] Las cantidades preferidas de tensioactivos (% en peso) son: ésteres de sorbitán de polioxietileno (tales como Tween 80) 0,01 a 1%, en particular aproximadamente 0,1%; octilo-o nonilfenoxi polioxietanoles (tales como Triton X-100, u otros detergentes de la serie Triton) 0,001 a 0,1%, en particular 0,005 a 0,02%; éteres de polioxietileno

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dimetiidioctadecilamonio y/o N,N-dioctadecilo-N,N-bis (2-hidroxietilo) propanodiamina.

Una emulsión en la que una saponina (por ejemplo, QuilA o QS21) y un esterol (por ejemplo, un colesterol) están asociados como micelas helicoidales [73].

Una emulsión que comprende un aceite mineral, un lipófilo alcohol graso etoxilado no iónico y un tensioactivo no iónico hidrófilo (por ejemplo, un alcohol graso etoxilado y/o copolímero de bloque de polioxietileno-polioxipropileno) [74].

[0240] En algunas realizaciones una emulsión puede mezclarse con antígeno extemporáneamente, en el momento de la entrega, y por lo tanto el adyuvante y el antígeno se pueden mantener por separado en una vacuna envasada

o distribuida, preparada para la formulación final en el momento de uso. En otras realizaciones una emulsión se mezcla con el antígeno durante la fabricación, y por lo tanto la composición se envasa en una forma con adyuvante líquido. El antígeno estará generalmente en una forma acuosa, de manera que la vacuna se prepara finalmente al mezclar dos líquidos. (La relación de volumen de los dos líquidos para mezclar puede variar por ejemplo, entre 5: 1 y

1: 5), pero es generalmente de aproximadamente 1: 1. Cuando las concentraciones de los componentes se dan en las descripciones anteriores de emulsiones específicas, estas concentraciones son normalmente para una composición sin diluir, y la concentración después de la mezcla con una solución de antígeno se disminuirá por lo tanto.

[0241] Cuando una composición incluye un tocoferol, cualquiera de los tocoferoles α, β, γ, δ,  o  se pueden utilizar, pero se prefieren -tocoferoles. El tocoferol puede tomar varias formas, por ejemplo, diferentes sales y/o isómeros. Las sales incluyen sales orgánicas, tales como succinato, acetato, nicotinato, etc. D-α-tocoferol y DL-α-tocoferol pueden ambos ser utilizados. Los tocoferoles pueden incluirse ventajosamente en las vacunas para su uso en pacientes de edad avanzada (por ejemplo, de 60 años o mayores) porque se ha informado que la vitamina E tiene un efecto positivo sobre la respuesta inmune en este grupo de pacientes [75]. También tienen propiedades antioxidantes que pueden ayudar a estabilizar las emulsiones [76]. Un α-tocoferol preferido es DL-α-tocoferol, y la sal preferida de este tocoferol es el succinato. Se ha encontrado que la sal de succinato coopera con los ligandos relacionados con TNF in vivo.

C. Formulaciones de saponina

[0242] Las formulaciones de saponina también pueden utilizarse como adyuvantes en la invención. Las saponinas son un grupo heterogéneo de glucósidos de esterol y glucósidos triterpenoides que se encuentran en la corteza, hojas, tallos, raíces e incluso flores de una amplia gama de especies de plantas. Saponina de la corteza del árbol Molina Quillaia saponaria se ha estudiado ampliamente como adyuvante. La saponina también se puede obtener comercialmente de Smilax ornata (zarzaparrilla), Gypsophila paniculata (velo de novia) y Saponaria officinalis (raíz de jabón). Formulaciones de adyuvantes de saponina incluyen formulaciones purificadas, tales como QS21, así como formulaciones lipídicas, tales como ISCOM. QS21 se comercializa como StimulonTM.

[0243] Las composiciones de saponina se han purificado usando HPLC y RP-HPLC. Fracciones purificadas específicas usando estas técnicas han sido identificadas, incluyendo QS7, QS17, QS18, QS21, QH-A, QH-B y QH-

C. Preferiblemente, la saponina es QS21. Un método de producción de QS21 se describe en la ref 77. Formulaciones de saponina también pueden comprender un esterol, tal como colesterol [78].

[0244] Las combinaciones de saponinas y colesteroles pueden utilizarse para formar partículas únicas denominadas complejos inmunoestimulantes (ISCOM) [capítulo 23 de la ref. 63]. ISCOM también incluyen típicamente un fosfolípido tal como fosfatidiletanolamina o fosfatidilcolina. Cualquier saponina conocida puede utilizarse en los ISCOM. Preferiblemente, el ISCOM incluye uno o más de QuilA, QHA y QHC. ISCOM se describen adicionalmente en las refs. 78-. Opcionalmente, los ISCOM pueden estar desprovistos de detergente adicional [80].

[0245] Una revisión del desarrollo de adyuvantes basados en saponina se puede encontrar en la ref. 81.

E. Derivados bacterianos o microbianos

[0246] Los adyuvantes adecuados para su uso en la invención incluyen derivados bacterianos o microbianos tales como derivados no tóxicos de lipopolisacárido enterobacteriano (LPS), derivados del lípido A, oligonucleótidos inmunoestimuladores y toxinas ADP-ribosilatantes y derivados desintoxicados de las mismas.

[0247] Los derivados no tóxicos de LPS incluyen monofosforilo lípido A (MPL) y MPL 3-O-desacilado (3dMPL). 3dMPL es una mezcla de lípido A de monofosforilo 3 de-O-acilado con 4, 5 o 6 cadenas aciladas. Una forma preferida "partícula pequeña" de lípido A de monofosforilo 3 de-O-acilado se describe en la ref. 82. Tales "partículas pequeñas" de 3dMPL son lo suficientemente pequeñas para esterilizarse por filtración a través de un 0,22 µm de membrana [82]. Otros derivados de LPS no tóxicos incluyen miméticos de monofosforilo lípido A, tales como derivados de aminoalquilo de fosfato de glucosaminida, por ejemplo, RC-529 [83].

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[0248] Derivados de lípido A incluyen derivados de lípido A de Escherichia coli tales como OM-174. OM-174 se describe por ejemplo en las refs. 84 y 85.

[0249] Los oligonucleótidos inmunoestimuladores adecuados para uso como adyuvantes en la invención incluyen secuencias de nucleótidos que contienen un motivo CpG (una secuencia de dinucleótido que contiene una citosina no metilada unida por un enlace fosfato a una guanosina). ARN y oligonucleótidos que contienen secuencias palindrómicas o poli(dG) de doble cadena también se han demostrado ser inmunoestimulantes.

[0250] Los CpG pueden incluir modificaciones/análogos de nucleótidos tales como modificaciones de fosforotioato y pueden ser de doble cadena o de cadena sencilla. Referencias 86 y 87 dan a conocer posibles sustituciones de análogos, por ejemplo, sustitución de guanosina con 2”-desoxi-7-desazaguanosina. El efecto adyuvante de oligonucleótidos CpG se analiza adicionalmente en las referencias. 88.

[0251] La secuencia de CpG puede dirigirse a TLR9, como el motivo GTCGTT o TTCGTT [89]. La secuencia de CpG puede ser específica para inducir una respuesta inmune Th1, tal como un ODN CpG-A, o puede ser más específica para inducir una respuesta de células B, tales como CpG-B ODN. ODNs CpG-A y CpG-B se discuten en las refs. 90-. Preferiblemente, el CpG es un CpG-A ODN.

[0252] Preferiblemente, el oligonucleótido CpG se construye de manera que el extremo 5” es accesible para el reconocimiento del receptor. Opcionalmente, dos secuencias de oligonucleótidos CpG pueden estar unidas en sus extremos 3” para formar “inmunómeros”. Véase, por ejemplo, refs. 92-.

[0253] Un adyuvante útil CpG es CpG7909, también conocido como ProMuneTM (Pharmaceutical Group Coley, Inc.). Otro es CpG1826. Como alternativa, o en adición, al uso de secuencias CpG, secuencias TpG se pueden utilizar [94], y estos oligonucleótidos pueden estar libres de motivos CpG no metilados. El oligonucleótido inmunoestimulante puede ser rico en pirimidina. Por ejemplo, puede comprender más de un nucleótido de timidina consecutivo (por ejemplo, TTTT, como se describe en la ref. 94), y/o puede tener una composición de nucleótidos con >25% de la timidina (por ejemplo, > 35%,> 40%,> 50%,> 60%,> 80%, etc.). Por ejemplo, puede comprender más de un nucleótido de citosina consecutivo (por ejemplo, CCCC, como se describe en la ref. 94), y/o puede tener una composición de nucleótidos con >25% de citosina (por ejemplo, >35%, >40%, >50 %, >60%, >80%, etc.). Estos oligonucleótidos pueden estar libres de motivos CpG no metilados. Los oligonucleótidos inmunoestimuladores típicamente comprenderán al menos 20 nucleótidos. Pueden comprender menos de 100 nucleótidos.

[0254] Un adyuvante particularmente útil en torno a los oligonucleótidos inmunoestimulantes se conoce como IC31TM [95]. Así, un adyuvante utilizado con la invención puede comprender una mezcla de (i) un oligonucleótido (por ejemplo, entre 15-40 nucleótidos) que incluye al menos uno (y preferiblemente múltiples) motivos CPI (es decir, una citosina unida a una inosina para formar un dinucleótido), y (ii) un polímero policatiónico, tal como un oligopéptido (por ejemplo, entre 5-20 aminoácidos) que incluye al menos una (y preferiblemente múltiples) secuencias de tripéptido Lys-Arg-Lys. El oligonucleótido puede ser un desoxinucleótido que comprende secuencia 26-mer 5”-(IC)313”.

[0255] Toxinas de ribosilación de ADP bacterianas y derivados desintoxicados de los mismos pueden usarse como adyuvantes en la invención. Preferiblemente, la proteína se deriva de E. coli (enterotoxina termolábil E. coli "LT"), cólera ("CT") o pertussis ("PT"). El uso de toxinas de ribosilación de ADP desintoxicadas como adyuvantes de la mucosa se describe en la ref. 96 y como adyuvantes parenterales en la ref. 97. La toxina o toxoide está preferiblemente en forma de una holotoxina, que comprende ambas subunidades A y B. Preferiblemente, la subunidad A contiene una mutación detoxificante; preferiblemente la subunidad B no está mutada. Preferiblemente, el adyuvante es un mutante de LT destoxificado tal como LT-K63, LT-R72 y LT-G192. El uso de toxinas de ribosilación de ADP y derivados desintoxicados de las mismas, particularmente LT-K63 y LT-R72, como adyuvantes se pueden encontrar en las refs. 98-101. Un mutante CT útil es o CT-E29H [102]. La referencia numérica para las sustituciones de aminoácidos se basa preferentemente en los alineamientos de las subunidades A y B de ribosilación ADP de las toxinas expuestas en la ref. 103.

F. Inmunomoduladores humanos

[0256] Inmunomoduladores humanos adecuados para su uso como adyuvantes en la invención incluyen citoquinas, tales como interleucinas (por ejemplo IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 [104], etc.), interferones (por ejemplo interferón γ), factor estimulante de colonias de macrófagos y factor de necrosis tumoral. Un inmunomodulador preferido es IL-12.

G. Bioadhesivos y mucoadhesivos

[0257] Los bioadhesivos y los mucoadhesivos también pueden usarse como adyuvantes en la invención. Bioadhesivos adecuados incluyen microesferas de ácido hialurónico [105] o mucoadhesivos tales como derivados reticulados de poli(ácido acrílico), alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, polisacáridos y carboximetilcelulosa esterificados. Quitosano y derivados del mismo también se pueden usar como adyuvantes en la invención [106].

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H. Micropartículas

[0258] Las micropartículas también se pueden usar como adyuvantes en la invención. Las micropartículas (es decir. una partícula de ~ 100 nm a ~ 150 µm de diámetro, más preferentemente ~ 200 nm a ~ 30 µm de diámetro, y lo más preferentemente ~ 500 nm a ~ 10 µm de diámetro) formadas a partir de materiales que son biodegradables y no tóxicos (por ejemplo, un poli(α hidroxiácido), un poli ácido hidroxibutírico, un poliortoéster, un polianhídrido, una policaprolactona, etc.), con poli(lactida-co-glicólido) son preferidos, tratados opcionalmente para tener una superficie negativamente cargada (por ejemplo, con SDS) o una superficie cargada positivamente (por ejemplo, con un detergente catiónico, tal como CTAB).

I. Liposomas

[0259] Los ejemplos de formulaciones de liposomas adecuadas para uso como adyuvantes se describen en las referencias. 107-.

J. Éter de polioxietileno y formulaciones de éster de polioxietileno

[0260] Los adyuvantes adecuados para su uso en la invención incluyen éteres de polioxietileno y ésteres de polioxietileno [109]. Dichas formulaciones incluyen además tensioactivos de éster de polioxietileno de sorbitán en combinación con un octoxinol [110], así como éteres de alquilo de polioxietileno o tensioactivos de éster en combinación con al menos un agente tensioactivo no iónico adicional tal como un octoxinol [111]. Éteres de polioxietileno preferidos se seleccionan del siguiente grupo: polioxietileno éter de 9-laurilo (laureth 9), éter de polioxietileno-9-esteorilo, éter de polioxietileno-8-esteorilo, éter de polioxietileno-4-laurilo, éter de polioxietileno-35laurilo, y éter de polioxietileno-23-laurilo.

K. Fosfacenos

[0261] Un fosfaceno, tal como poli[di(carboxilatofenoxi)fosfaceno] ("PCPP") como se describe, por ejemplo, en las referencias 112 y 113, puede ser utilizado.

L. Péptidos de muramilo

[0262] Los ejemplos de péptidos de muramilo adecuados para uso como adyuvantes en la invención incluyen Nacetilo-muramilo-L-treonilo-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetilo-normuramilo-L-alanilo-D-isoglutamina (nor-MDP), y N-acetilmuramilo-L-alanilo-D-isoglutaminilo-L-alanina-2-(1'-2'-dipalmitoilo-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina MTP-PE).

M. Compuestos de imidazoquinolona.

[0263] Ejemplos de compuestos de imidazoquinolona adecuados para su uso adyuvantes en la invención incluyen Imiquimod ("R-837") [114], resiquimod ("-848 R") [115], y sus análogos; y sales de los mismos (por ejemplo, las sales de clorhidrato).

N. Ureas sustituidas

[0264] Ureas sustituidas útiles como adyuvantes incluyen compuestos de fórmula I, II o III, o sales de los mismos:

como se define en la referencia 116, tal como “ER 803058”, “ER 803732”, “ER 804053”, ER 804058”, “ER 804059”, “ER 804442”, “ER 804680”, “ER 804764”, ER 803022 o “ER 804057”, por ejemplo.:

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O. Adyuvantes adicionales

[0265] Los adyuvantes adicionales que pueden usarse con la invención incluyen:

40 Un derivado de fosfato de aminoalquilo glucosaminida, tales como RC-529 [117].

Un compuesto de tiosemicarbazona, tal como los descritos en la referencia 118. Los métodos de formulación, fabricación, y la detección de compuestos activos también se describen en la referencia 118. Las tiosemicarbazonas son particularmente eficaces en la estimulación de células mononucleares de sangre periférica humana para la

45 producción de citoquinas, tales como TNF-α.

Un compuesto de triptantrina, tal como los descritos en la referencia 119. Los métodos de formulación, fabricación, y la detección de compuestos activos también se describen en la referencia 119. Las tiosemicarbazonas son particularmente eficaces en la estimulación de células humanas mononucleares de sangre periférica para la

50 producción de citoquinas, tales como TNF-α.

Un análogo de nucleósido, tales como: (a) Isatorabina (ANA-245; 7-tia-8-oxoguanosina):

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y profármacos de los mismos; (b) ANA975; (c) ANA-025-1; (d) ANA380; (e) los compuestos descritos en las referencias 120 a loxoribina (7-alilo-8-oxoguanosina) [122].

5 Compuestos descritos en la referencia 123, incluyendo: compuestos de acilpiperazina, compuestos de indolediona, compuestos de tetrahidraisoquinolina (THIQ), compuestos de benzociclodiona, compuestos de aminoazavinilo, compuestos de quinolinona de aminobencimidazol (ABIQ) [124], compuestos hidraptalamida, compuestos de benzofenona, compuestos de isoxazol, compuestos de esteroles, compuestos de quinazilinona, compuestos de pirrol [125], compuestos de antraquinona, compuestos de quinoxalina, compuestos de triazina, compuestos de pirazalopirimidina, y compuestos de benzazol [126].

Compuestos que contienen lípidos unidos a un esqueleto de acíclica que contiene fosfato, como el E5564 antagonista de TLR4 [127:

15 Un polímero de polioxidonio [128] u otro derivado de polietileno-piperazina N-oxidado.

Inosina de metilo de 5”-monofosfato ("MIMP") [129].

Compuesto de pirrolizidina polihidroxilada [130], tal como uno que tiene la fórmula:

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donde R se selecciona del grupo que comprende hidrógeno, acilo lineal o ramificado, no sustituido o sustituido, saturado o insaturado, alquilo (por ejemplo, grupos, alquenilo, alquinilo y arilo cicloalquilo), o una sal farmacéuticamente aceptable o derivado del mismo. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a: casuarina, casuarina-6-α-D-glucopiranosa, 3-epi-casuarina, 7-epi casuarina, 3,7-di epi casuarina, etc.

Un ligando CDld, tal como una α-glicosilceramida [131-] (por ejemplo, α-galactosilceramida), α-glicosilceramidas 35 que contienen fitoesfingosina, OCH, KRN7000 [(2S,3S,4R)-1-O-(α-D-galactopiranosilo)-2-(N-hexacosanoilamino)1,3,4-octadecanotriol], CRONY-101, 3"-O-sulfo-galactosilceramida, etc.

Una inulina gamma [133] o un derivado del mismo, tal como algamulina.

Combinaciones de adyuvantes

[0266] La invención también puede comprender combinaciones de uno o más de los adyuvantes identificados anteriormente. por ejemplo, las siguientes composiciones de adyuvantes pueden usarse en la invención: (1) una saponina y una emulsión de aceite-en-agua [134]; (2) una saponina (por ejemplo QS21)+un derivado de LPS no tóxico (por ejemplo 3dMPL); (3) una saponina (por ejemplo QS21)+un derivado de LPS no tóxico (por ejemplo 3dMPL)+un colesterol; (4) una saponina (por ejemplo QS21)+3dMPL+IL-12 (opcionalmente+un esterol); (5) 65 combinaciones de 3dMPL con, por ejemplo, QS21 y/o emulsiones de aceite-en-agua [135]; (6) SAF, que contiene 10% de escualano, 0,4% de Tween 80TM, 5% de polímero de bloque plurónico L121 y thr-MDP, microfluidizado en

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una emulsión submicrométrica o vórtex para generar una emulsión de tamaño de partícula más grande. (7) Sistema de adyuvante RibiTM (RAS), (Ribi Immunochem) que contiene 2% de escualeno, 0,2% de Tween 80, y uno o más componentes de pared celular bacteriana del grupo que consiste en monofosforilo lípido A (MPL), dimicolato de trehalosa (TDM), y esqueleto de la pared celular (CWS), preferiblemente MPL+CWS (DetoxTM); y (8) una o más sales minerales (tales como una sal de aluminio)+un derivado no tóxico de LPS (tal como 3dMPL).

[0267] Se prefiere particularmente el uso de un hidróxido de aluminio y/o adyuvante de fosfato de aluminio, y los antígenos son generalmente adsorbidos a estas sales. El fosfato de calcio es otro adyuvante preferido. Otras combinaciones de adyuvantes preferidos incluyen combinaciones de adyuvantes Th1 y Th2, tales como CpG y alumbre o resiquimod y alumbre. Una combinación de fosfato de aluminio y 3dMPL puede ser utilizado.

[0268] Las composiciones de la invención pueden provocar una respuesta inmunitaria tanto celular mediada como respuesta inmunitaria humoral. Esta respuesta inmune inducirá preferiblemente anticuerpos de larga duración (por ejemplo, de neutralización) y una inmunidad mediada por células que pueden responder rápidamente tras la exposición a pseudomonas.

[0269] Se cree que dos tipos de células T, células CD4 y CD8 son generalmente necesarios para iniciar y/o mejorar la inmunidad mediada por células y la inmunidad humoral. Células T CD8 pueden expresar un co-receptor CD8 y se denominan comúnmente como linfocitos T citotóxicos (CTL). Células T CD8 son capaces de reconocer o interactuar con los antígenos que se muestran en las moléculas de MHC de clase I.

[0270] las células T CD4 pueden expresar un co-receptor CD4 y se denominan comúnmente como células T auxiliares. Las células T CD4 son capaces de reconocer péptidos antigénicos unidos a moléculas de MHC de clase

II. Tras la interacción con una molécula de MHC de clase II, las células CD4 pueden secretar factores tales como citoquinas. Estas citoquinas secretadas pueden activar las células B, células T citotóxicas, macrófagos y otras células que participan en una respuesta inmune. Las células T auxiliares o células CD4+ se pueden dividir en dos subconjuntos funcionalmente distintos: fenotipo TH1 y fenotipos TH2 que difieren en su función de las citocinas y el efector.

[0271] Las células TH1 activadas mejoran inmunidad celular (incluyendo un aumento en la producción de CTL específica de antígeno) y por lo tanto son de valor particular en la respuesta a las infecciones intracelulares. Células TH1 activadas pueden secretar una o más de IL-2, IFN-γ, y TNF-β. Una respuesta inmune TH1 puede resultar en reacciones inflamatorias locales por los macrófagos de activación, las células NK (aniquilante natural), y las células T CD8 citotóxicas (CTL). Una respuesta inmune TH1 también puede actuar para ampliar la respuesta inmune mediante la estimulación de crecimiento de células B y T con IL-12. Células B estimuladas por TH1 pueden secretar IgG2a.

[0272] Las células TH2 activadas mejoran la producción de anticuerpos y son por lo tanto de valor en la respuesta a las infecciones extracelulares. Células TH2 activadas pueden secretar una o más de IL-4, IL-5, IL-6, y IL-10. Una respuesta inmune TH2 puede resultar en la producción de IgG1, IgE, IgA y células B de memoria para la protección futura.

[0273] Una respuesta inmune mejorada puede incluir una o más de una respuesta inmune TH1 mejorada y una respuesta inmune Th2.

[0274] Una respuesta inmune A TH1 puede incluir uno o más de un aumento en CTLs, un aumento en una o más de las citocinas asociadas con una respuesta inmune TH1 (tales como IL-2, IFN-γ, y TNF-β), un aumento en los macrófagos activados, un aumento en la actividad de NK, o un aumento en la producción de IgG2a. Preferiblemente, la respuesta inmune TH1 mejorada incluirá un aumento en la producción de IgG2a.

[0275] Una respuesta inmune A TH1 puede ser generarse usando un adyuvante TH1. Un adyuvante TH1 generalmente provocará niveles incrementados de producción de IgG2a relativa a la inmunización del antígeno sin adyuvante. Los adyuvantes de TH1 adecuados para su uso en la invención pueden incluir, por ejemplo, formulaciones de saponina, virosomas y partículas similares a virus, derivados no tóxicos de lipopolisacárido enterobacteriano (LPS), los oligonucleótidos inmunoestimulantes. Los oligonucleótidos inmunoestimuladores, tales como oligonucleótidos que contienen un motivo CpG, se prefieren adyuvantes TH1 para su uso en la invención.

[0276] Una respuesta inmune A TH2 puede incluir uno o más de un incremento en una o más de las citoquinas asociadas con una respuesta inmunitaria TH2 (tal como IL-4, IL-5, IL-6 e IL-10), o un aumento en la producción de células B de memoria IgGl, IgE, e IgA. Preferiblemente, la respuesta inmune mejorada TH2 incluirá un aumento en la producción de IgG1.

[0277] Una respuesta inmune A TH2 puede ser obtenida usando un adyuvante TH2. Un adyuvante TH2 generalmente provocará niveles incrementados de producción de IgG1 relativos a la inmunización del antígeno sin adyuvante. Adyuvantes TH2 adecuados para su uso en la invención incluyen, por ejemplo, composiciones minerales que contienen emulsiones de aceite, y de ribosilación de toxinas ADP y derivados detoxificados de los mismos.

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secuencia que codifica inmunógeno es bajo el control del promotor.

[0306] Cuando se usa un marcador, preferentemente funciona en un huésped microbiano (por ejemplo, en un procariota, en una bacteria, en una levadura). El marcador es preferiblemente un marcador seleccionable procariota (por ejemplo, transcrito bajo el control de un promotor procariota). Por conveniencia, los marcadores típicos son genes de resistencia a antibióticos.

[0307] El vector de la invención es preferiblemente un vector episomal o extracromosómico de replicación autónoma, tal como un plásmido.

[0308] El vector de la invención comprende preferentemente un origen de replicación. Se prefiere que el origen de replicación esté activo en procariotas, pero no en eucariotas.

[0309] Los vectores preferidos incluyen por lo tanto un marcador de procariota para la selección del vector, un origen de replicación procariota, pero un promotor eucariota para dirigir la transcripción de la secuencia que codifica inmunógeno. Los vectores serán por lo tanto (a) amplificados y seleccionados en huéspedes procariotas sin la expresión del polipéptido, pero (b) se expresarán en huéspedes eucariotas sin amplificarse. Esta disposición es ideal para los vectores de inmunización de ácidos nucleicos.

[0310] El vector de la invención puede comprender una secuencia terminadora de la transcripción eucariótica aguas abajo de la secuencia codificante. Esto puede mejorar los niveles de transcripción. Cuando la secuencia de codificación no tiene su propio, el vector de la invención comprende preferiblemente una secuencia de poliadenilación. Una secuencia de poliadenilación preferida es de la hormona de crecimiento bovina.

[0311] El vector de la invención puede comprender un sitio de clonación múltiple.

[0312] Además de las secuencias que codifican el inmunógeno y un marcador, el vector puede comprender una segunda secuencia de codificación eucariota. El vector también puede comprender un IRES aguas arriba de dicha segunda secuencia con el fin de permitir la traducción de un segundo polipéptido eucariota de la misma transcripción como el inmunógeno. Alternativamente, la secuencia de codificación inmunógena puede ser aguas abajo de un IRES.

[0313] El vector de la invención puede comprender motivos CpG no metilados, por ejemplo, secuencias de ADN no metiladas que tienen en común una citosina anterior a una guanosina, flanqueada por dos purinas 5' y dos pirimidinas 3'. En su forma no metilada estos motivos de ADN se han demostrado ser potentes estimuladores de varios tipos de células inmunes.

[0314] Los vectores pueden ser administrados en una forma dirigida. Técnicas de administración de ADN mediada por receptores se describen en la técnica conocida. Las composiciones terapéuticas que contienen un ácido nucleico que se administran en un intervalo de aproximadamente 100 ng a aproximadamente 200 mg de ADN para administración local en un protocolo de terapia génica. Rangos de concentración de aproximadamente 500 ng a aproximadamente 50 mg, aproximadamente 1 µg a aproximadamente 2 mg, aproximadamente 5 µg a aproximadamente 500 µg, y aproximadamente de 20 µg a aproximadamente 100 µg de ADN también se pueden utilizar durante un protocolo de terapia génica. Factores tales como el método de acción (por ejemplo, para potenciar

o inhibir los niveles del producto génico codificado) y la eficacia de la transformación y expresión son consideraciones que afectarán la dosificación requerida para la eficacia final. Cuando se desea una mayor expresión sobre una zona más grande de tejido, mayores cantidades de vector o las mismas cantidades administradas de nuevo en un protocolo sucesivo de administraciones, o varias administraciones a diferentes porciones de tejido adyacentes o cercanas pueden ser necesarias para efectuar un resultado terapéutico positivo. En todos los casos, la experimentación rutinaria en ensayos clínicos determinará los intervalos específicos para el efecto terapéutico óptimo.

[0315] Los vectores se pueden administrar usando vehículos de administración de genes. El vehículo de suministro de genes puede ser de origen viral o no viral (véase en general la referencia 139).

[0316] Los vectores basados en virus para la administración de un ácido nucleico deseado y la expresión en una célula deseada son bien conocidos en la técnica. Vehículos basados en virus ejemplares incluyen, pero no se limitan a, retrovirus recombinantes (por ejemplo, referencias 140 a ), vectores basados en alfavirus (por ejemplo, vectores de virus Sindbis, virus del bosque Semliki (ATCC VR-67;. ATCC VR-1247), virus del Río Ross (ATCC VR-373; ATCC VR-1246) y virus de la encefalitis equina venezolana (ATCC VR-923; ATCC VR-1250; ATCC VR 1249; ATCC VR532); híbridos o quimeras de estos virus también se pueden usar), vectores de poxvirus (por ejemplo, vaccinia, viruela aviar, viruela del canario, vaccinia Ankara modificada, etc.), vectores de adenovirus, y vectores de virus adenoasociados (AAV) (por ejemplo, véase refs. 142 a ). La administración de ADN ligado a adenovirus muerto [144] se puede emplear también.

[0317] Vehículos de administración no virales y los métodos se pueden emplear también, incluyendo, pero no

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x+10%.

[0328] Las referencias a una identidad de secuencia porcentual entre dos secuencias de aminoácidos significa que, cuando alineadas, ese porcentaje de aminoácidos son los mismos en la comparación de las dos secuencias. Esta

5 alineación y el porcentaje de homología o identidad de secuencia pueden determinarse usando programas de software conocidos en la técnica, por ejemplo los descritos en la sección 7.7.18 de ref. 162. Una alineación preferida es determinada por el algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman usando una búsqueda de huecos afines con una penalización de hueco abierto de 12 y una penalización de extensión de hueco de 2, matriz BLOSUM de 62. El algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman se describe en la ref. 163.

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MODOS PARA LLEVAR A CABO LA INVENCIÓN

Selección de antígenos

15 [0329] Proteínas de P. aeruginosa se han seleccionado para su uso como componentes de la vacuna sobre la base de la combinación de varios criterios, que incluyen los siguientes:

Predicción de localización celular, a través de la cual se atribuyó prioridad a las proteínas predichas como "membrana externa", "periplásmica", extracelular" y “desconocida”. En relación a las proteínas de última definición 20 predichas por tener una “localización desconocida” celular que a menudo se compone de múltiples dominios, de los

cuales uno en realidad se puede exponer a la superficie.

Homología significativa con factores de virulencia conocidos, vacunas candidatas de otras especies

25 La falta de una homología significativa con proteínas humanas codificadas por el genoma humano secuenciado, con el fin de limitar la probabilidad de generación de respuesta autoinmune o vacuna inducida por autoinmunidad.

La falta de una homología significativa con proteínas de E. coli, teniendo en cuenta que las proteínas que tienen homólogos en muchas especies bacterianas, o bien patógenos o no patógenos tienen una mayor probabilidad de 30 tener funciones de mantenimiento de la casa y por lo tanto tienen menos probabilidades de ser buenos antígenos.

Conservación sobre un panel de al menos 5 de los 7 genomas de P. aeruginosa totalmente secuenciados.

Se considera que la longitud de la secuencia de aminoácidos útil es de al menos 150 aa 35

Datos de microensayos. La expresión in vitro de repertorio de proteínas derivadas de P. aeruginosa PAO1 fue ensayada para analizar los cambios en la expresión génica en condiciones anaeróbicas como las que se encuentran en el moco de pacientes FQ (fibrosis quística) en comparación con las condiciones aeróbicas encontradas en el medio ambiente. La prioridad se asignó a las proteínas cuya expresión se mantuvo en ambas condiciones de cultivo

40 de células aeróbicas y anaeróbicas.

[0330] La proteína también puede adsorberse razonablemente bien a hidróxido de aluminio (véase también más adelante), que es útil para la formulación estable para la administración a los seres humanos.

45 Cobertura de la cepa

[0331] Con el fin de evaluar la conservación de los antígenos seleccionados, se usaron diversos aislados clínicos de

P. aeruginosa. Cepas clínicas de P. aeruginosa fueron aisladas de ocho pacientes con FQ pancreáticos-insuficientes que asisten a la clínica de FQ de la Medizinische Hochschule Hannover. Cepas de P. aeruginosa de los primeros

50 cultivos positivos se designan como aislados "tempranos", mientras que los aislamientos intermedios se recogieron de 1 a 5 años a partir de entonces y aislamientos finales se recogieron 7 a 16 años después de la colonización o antes de la muerte o el trasplante de pulmón. Las cepas ensayadas figuran en la siguiente Tabla.

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[0349] Sobre la base del análisis de las curvas de supervivencia de siete proteínas recombinantes adicionales se puede predecir que los resultados también pueden ser corroborados significativamente al aumentar el número de animales probados in vivo además de confirmar los datos positivos y sorprendentes preliminares de PSE11-3 (PA1248), PSE41-5 (PA2407), PSE44-4 (PA3526), PSE53-1 (PA5047), PSE21-5 (PA5112), PSE-54 (PA5340), PSE27-1 (PA0328).

[0350] Además, cuando un antígeno conocido, a saber, OprF-OprI, se utilizó solo para inmunizar ratones en el presente modelo animal, se obtuvo un 20% de supervivencia con una significación estadística de 0,0446.

[0351] Para mejorar aún más la supervivencia en este modelo in vivo, combinaciones específicas se ensayaron también mediante la combinación de las proteínas más prometedoras con el fin de aumentar aún más la eficacia de la vacuna.

Comparación de las combinaciones en comparación con sus polipéptidos individuales

[0352] Combinaciones alias conocidas como cócteles de antígenos en una única formulación también se utilizaron para inmunizar ratones. Las combinaciones fueron típicamente potenciadas con adyuvante de hidróxido de aluminio (véase el capítulo "adyuvante de formulación) y se administraron en los días 0, 21 y 35. Las inmunizaciones fueron en ratones C57BL/6NCrlBR machos de 5 semanas de edad, 10 por grupo. En el día 50 los ratones se expusieron con una dosis letal de bacterias iNActivadas por calor y la supervivencia fue seguido durante 120 horas. para la comparación, se usó PBS como control negativo y como control positivo inactivado por calor PAO1.

[0353] El aumento de la supervivencia, durante la supervisión para 120 h después del calendario de inmunización y la infección adicional con dosis letal de la cepa homóloga de Pseudomonas, cuando se compara con el grupo de control negativo, se muestra sorprendentemente mejor resultado cuando se ensayaron las siguientes combinaciones (Tabla 2): PSE47A-2+PSE53-1, PSE47A-2+PSE53-1, PSE54+PSE44-4 y PSE54+PSE21-5 siendo las más prometedoras, mientras que la combinación PSE47A-2+PSE52-1 era menos prometedora.

[0354] Se llevaron a cabo varias pruebas para comparar varias combinaciones para sus siete polipéptidos individuales (es decir PSE54 o PSE21-5 o PSE27-1, PSE44-4, PSE52-1, PSE53-1, PSE47A-2), así como OprF/I como control positivo adicional o a un control negativo sin antígeno.

[0355] Se inmunizaron ratones con cócteles de dos proteínas diferentes. Ocho cócteles tenían estadísticamente diferentes curvas de supervivencia en comparación con el grupo de control negativo (teniendo en cuenta también la composición PSE54+OprF-OprI).

[0356] En el sexto turno, se ensayaron diferentes cócteles de proteínas combinados con la PSE47A-2: PSE47A2+PSE52-1 y PSE47A-2+PSE53-1 mostraban una diferencia estadística sorprendente con respecto con el grupo de control negativo (valor p en la prueba de Mantel-Cox contra grupo de control negativo 0,0374 y 0,0373 respectivamente).

[0357] En particular, la vacunación con el cóctel PSE47A-2+PSE53-1 resultó sorprendentemente en el 30% de la supervivencia, manteniendo una buena significación estadística.

[0358] En el décimo turno, se ensayaron diferentes cócteles de proteínas combinados con el PSE54. Cinco cócteles de cada ocho dieron una curva de mortalidad significativamente diferente en comparación con el grupo de control negativo como se informa en la Tabla 2. En particular, la vacunación con los cócteles de antígenos PSE54+PSE44-4 y PSE54+PSE52-1 dio una muy buena protección de los animales lo que resulta en 40% y 33% de supervivencia de los animales, respectivamente (valor de p en la prueba de Mantel-Cox contra grupo de control negativo 0,0076 y 0,0142 respectivamente). Al volver a ponerse a prueba en el undécimo turno, el PSE54+PSE44-4 confirmó el resultado positivo que muestra un aumento de supervivencia de los animales de 57%. Otros cócteles que muestran mejor eficacia de la vacuna cuando se utilizan en combinación fueron: PSE54+PSE21-5, PSE54+PSE53-1 y PSE54+PSE10-1 (valor de p en la prueba de Mantel-Cox contra el grupo de control negativo 0,0332, 0,0085 y 0, 0025, respectivamente).

[0359] Por otra parte, este último cóctel, PSE54+PSE10-1, tuvo resultados comparables en dos turnos diferentes de inmunización que corroboran el resultado positivo y sorprendente, que resulta en la misma tasa de supervivencia de los animales (20%) en las dos vueltas.

[0360] Finalmente cuatro cócteles adicionales de diferentes proteínas (PSE27-1+PSE44-4, PSE53-1+PSE41-5 y PSE53-1+PSE52-1 y PSE54+PSE27-1) pueden llegar a ser incluso más significativos repitiendo aún más los experimentos en experimentos adicionales confirmatorios aumentando el número de animales.

[0361] A fin de mejorar aún más la capacidad de protección y en última instancia, la eficacia de la vacuna de antígenos seleccionados, se ensayó la combinación de tres proteínas. Siete grupos se ensayaron manteniendo dos proteínas fijas PSE54+PSE44-4 más una proteína variable, mientras que otros grupos ensayados fueron con

PSE47A-2+PSE52-1+PSE53-1, PSE54+PSE52-1+PSE53-1 y PSE54+PSE53-1+PSE27-1. Algunas de estas combinaciones no dieron protección animal significativa cuando se compararon con el grupo de control negativo, mientras que cuando se considera, por ejemplo, PSE54+PSE44-4+PSE47A-2 o PSE54+PSE53-1+PSE27-1 puedan proporcionar protección significativa simplemente a través de experimentos de confirmación, obtenidos mediante el

5 aumento del número de animales (véase tabla 2). Por lo tanto, parte de la combinación de tres proteínas no mejoró la protección sino que más bien parecía peor cuando se consideran dos proteínas.

[0362] Sin embargo, cuando se considera una combinación al añadir el cóctel de antígenos se incluyó también el control positivo de fusión OprF-OprI en las combinaciones adicionales.

10 [0363] Cuando se usó OprF-OprI como antígeno de proteína única de fusión mostró 20% de supervivencia con una significación estadística de 0,0446, de manera similar a otra única inmunización con antígenos prometedores individuales, mientras que cuando se utiliza en combinación con PSE54 sorprendentemente el porcentaje de supervivencia aumentó a 50% con una significación estadística similar. Además, la inmunización con los siguientes

15 antígenos en combinación PSE54+pSE27+OprF-OprI mostró sorprendentemente incluso 60% de la supervivencia con una significación estadística comparable, mientras que, teniendo en cuenta la otra combinación, a saber PSE54+PSE53+OprF-OprI no mostraron ningún efecto aditivo o eficacia de vacuna significativa inmunogénica de la inmunización de antígenos únicos, incluso en una sola inmunización usando una cantidad disminuida de cada antígeno solo (Tabla 2). Es razonable esperar que al aumentar el número de animales ensayados también esta

20 combinación específica podría proporcionar un incremento significativo en la protección inmunológica.

TABLA 1: REFERENCIA CRUZADA DE NOMENCLATURA

25

30

35

40

45

50

55

60

65

SEQ ID NOs

Etiqueta Locus PAO1 cepa Nombre interno Definiciones NCBI

1

PA0328 pSE27 autotransportador de membrana externa

2

PA1178 PSE10 PhoP/Q precursor de proteína H1 de la membrana externa inducible Mg2+ bajo

3

PA5112 PSE21 esterasa EstA

4

PA1248 PSE11 secreción de proteasa alcalina de proteína de membrana externa precursor APRF

5

PA2407 PSE41-5 proteína de adhesión putativa

6

PA3526 PSE44 precursor de proteína de membrana externa

7

PA4082 PSE47 proteína adhesiva CupB5

8

PA4765 PSE52 lipoproteína de la membrana externa precursor OmlA

9

PA5047 PSE53 lipoproteína, putativo; peptidasa

10

PA5340 PSE54 lipoproteína, putativo

11

PA0595 PSE5 precursor de OstA

12

PA1954 PSE13 proteína hipotética PA1954

13

PA3692 PSE17 Lipotoxina F

14

PA4370 PSE18 Metaloproteinasa precursor de proteína de membrana externa

15

PA4710 PSE19 precursor del receptor PhuR

16

PA4735 PSE20 proteína hipotética PA4735

17

PA3647 PSE23 proteína hipotética PA3647

18

PA0126 PSE24 proteína hipotética PA0126

19

PA0189 PSE25 porina putativa

20

PA0274 PSE26 proteína hipotética PA0274

21

PA0537 PSE28 lipoproteína putativa

22

PA0737 PSE31 lipoproteína putativa

23

PA1086 PSE33 flagelar FlgK de gancho asociado

24

PA1106 PSE34 proteína hipotética PA1106

25

PA1324 PSE36 lipoproteína putativa

26

PA1777 PSE38 membrana externa precursor OprF

27

PA2793 PSE42 lipoproteína putativa

28

PA3535 PSE45 serina proteasa putativa

29

PA4578 PSE50 proteína hipotética PA4578

30

PA4667 PSE51 proteína de dominio TPR

(continuación)

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

SEQ ID NOs

Etiqueta Locus cepa PAO1 Nombre interno Definiciones NCBI

31

PA4525 PilA tipo 4 fimbrial precursor PilA

32

Fusión OprF/I Proteína de fusión

33

PA1092 FliC Proteína flagelar

34

PA1094 FliD Proteína flagelar

35

PA1148 ExoA Exotoxina A

36

PA0328 pSE27 Fragmento sin N-terminal

37

PA1178 PSE10 Fragmento sin N-terminal

38

PA5112 PSE21 Fragmento sin N-terminal

39

PA1248 PSE11 Fragmento sin N-terminal

40

PA2407 PSE41-5 Fragmento sin N-terminal

41

PA3526 PSE44 Fragmento sin N-terminal

42

PA4082 PSE47-A2 sin N-terminal y dominio translocador

43

PA4765 PSE52 Fragmento sin N-terminal

44

PA5047 PSE53 Fragmento sin N-terminal

45

PA5340 PSE54 Fragmento sin N-terminal

46

PA0595 PSE5 Fragmento sin N-terminal

47

PA1954 PSE13 Fragmento sin N-terminal

48

PA3692 PSE17 Fragmento sin N-terminal

49

PA4370 PSE18 Fragmento sin N-terminal

50

PA4710 PSE19 Fragmento sin N-terminal

51

PA4735 PSE20 Fragmento sin N-terminal

52

PA3647 PSE23 Fragmento sin N-terminal

53

PA0126 PSE24 Fragmento sin N-terminal

54

PA0189 PSE25 Fragmento sin N-terminal

55

PA0274 PSE26 Fragmento sin N-terminal

56

PA0537 PSE28 Fragmento sin N-terminal

57

PA0737 PSE31 Fragmento sin N-terminal

58

PA1086 PSE33 Fragmento sin N-terminal

59

PA1106 PSE34 Fragmento sin N-terminal

60

PA1324 PSE36 Fragmento sin N-terminal

61

PA1777 PSE38 Fragmento sin N-terminal

62

PA2793 PSE42 Fragmento sin N-terminal

63

PA3535 PSE45 Fragmento sin N-terminal

64

PA4578 PSE50 Fragmento sin N-terminal

65

PA4667 PSE51 Fragmento sin N-terminal

66

Etiqueta histidina N/A N/A

67

Enlazador N/A N/A

68

Enlazador N/A N/A

69

Enlazador N/A N/A

70

His6 N/A Etiqueta de 6xHis sintético

71

Glyn N/A péptido sintético que abarca 2 a 10 residuos, en el que algunas posiciones pueden estar ausentes

72

Hisn N/A Péptido sintético Hisn donde n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más

73

(Gly)4 N/A Péptido sintético

imagen23

TABLA 2: RESUMEN DE RESULTADOS MODELO DE ANIMAL RATÓN

40

45

50

55

60

65

imagen24

imagen25

15

25

35

45

55

65

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Claims (1)

1. imagen1