ES2740000T3

ES2740000T3 - Proteínas y composiciones inmunogénicas para el tratamiento y la prevención de Streptococcus agalactiae

Info

Publication number: ES2740000T3
Application number: ES11717765T
Authority: ES
Inventors: Guido Grandi; Domenico Maione; Cira Rinuado
Original assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 2010-04-01
Filing date: 2011-04-01
Publication date: 2020-02-05
Anticipated expiration: 2031-04-01
Also published as: US9725488B2; GB201005625D0; US9458229B2; US20150343051A1; US20160362457A1; EP2552477A2; CN102917729A; MX349948B; US20170296645A1; NZ602693A; JP5960121B2; MX2012011157A; US10086060B2; JP2013523718A; WO2011121576A2; EP2552477B1; SG10201502583VA; WO2011121576A3; AU2011234031A1; US9079946B2

Abstract

Un polipéptido híbrido inmunogénico que comprende la secuencia de aminoácidos: -A-{-X-L-}n-Ben la que L es una secuencia de aminoácidos enlazadora opcional; A es una etiqueta de histidina N-terminal opcional; B es una etiqueta de histidina C-terminal opcional; n es un número entero de 6 o más y en la que cada X es una secuencia de aminoácidos distinta seleccionada del grupo que consiste en: a) un primer polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 38; b) un segundo polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 42; c) un tercer polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 40; d) un cuarto polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 36; e) un quinto polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 44; f) un sexto polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 46; y en el que el polipéptido híbrido es capaz de conferir protección cruzada contra cepas de GBS que expresan distintos alelos cuando se prueba en un modelo de inmunización materna de ratón/exposición de crías neonatales.

Description

DESCRIPCIÓN

Proteínas y composiciones inmunogénicas para el tratamiento y la prevención de Streptococcus agalactiae

Campo técnico

La invención proporciona proteínas y composiciones para el tratamiento y la prevención de Streptococcus agalactiae (estreptococos del grupo B; GBS, por sus siglas en inglés Group B streptococcus).

Técnica anterior

La bacteria Gram-positiva Streptococcus agalactiae (o “estreptococos del grupo B”, abreviada como “GBS”) causa una grave enfermedad, bacteremia y meningitis, en individuos inmunodeficientes y en neonatos. Existen dos tipos de infección neonatal. La primera (inicio prematuro, usualmente dentro de los 5 días después del nacimiento) se manifiesta por bacteremia y neumonía. Se contrae de forma maternofilial conforme un bebé pasa a través del canal del parto. El GBS coloniza la vagina de aproximadamente el 25 % de mujeres jóvenes y aproximadamente el 1 % de los bebés nacidos por parto vaginal de madres colonizadas se infectarán. La mortalidad es de entre el 50-70 %. La segunda es una meningitis que se presenta de 10 a 60 días después del nacimiento. Si las mujeres embarazadas son vacunadas con una cápsula tipo III de modo que los bebes se inmunicen de forma pasiva, la incidencia de la meningitis de inicio tardío se reduce pero no se elimina completamente.

La “B” en “GBS” se refiere a la clasificación de Lancefield, la cual se basa en la antigenicidad de un carbohidrato que es soluble en ácido diluido y es llamado el carbohidrato C. Lancefield identificó 13 tipos de carbohidratos C, designados de A O, que podían diferenciarse serológicamente. Los organismos que infectan más comúnmente a los seres humanos se encuentran en los grupos A, B, D y G. Dentro del grupo B, las cepas se pueden dividir en 10 serotipos (Ia, Ib, II, III, IV, V, VI, VII, VIII y XI) basándose en la estructura de su cápsula de polisacárido. El documento WO2009/027768 se refiere a la identificación de islas de adhesina dentro del genoma de los GBS y al uso de las secuencias de aminoácidos de las islas de adhesina codificadas por estas islas de adhesina, tales como GBS59 (BP-2a), en composiciones para el tratamiento o la prevención de la infección por GBS.

Se han realizado investigaciones sobre el desarrollo de vacunas a base de proteínas y a base de polisacáridos contra el GBS pero actualmente no hay ninguna vacuna contra el GBS disponible en el mercado. Por lo tanto, sigue habiendo una necesidad de vacunas eficaces contra la infección por S. agalactiae.

Es objeto de la invención proporcionar proteínas y composiciones inmunogénicas que puedan utilizarse en el desarrollo de estas vacunas.

Divulgación de la invención

Se considera que las estructuras de pilosidades en las bacterias gram-positivas son candidatas interesantes para vacunas. El GBS tiene tres variantes de pilosidades, cada una codificada por una isla de patogenia distinta, PI-1, PI-2a y PI-2b [1, 2]. Cada isla de patogenia consiste en 5 genes que codifican: la proteína de la estructura principal de la pilosidad (BP); 2 proteínas complementarias (AP1 y AP2) y 2 proteínas sortasa que están involucradas en el ensamblaje de las pilosidades. Todas las cepas de GBS portan al menos una de estas 3 islas de patogenia y las secuencias de las proteínas estructurales de la pilosidad (BP, AP1 y AP2) codificadas por estas islas de patogenia están en general bien conservadas. Sin embargo, la secuencia de la proteína de la estructura principal codificada por la isla de patogenia 2a (BP-2a), denominada en el presente documento GBS59, varía entre las cepas de GBS. La subunidad de la pilosidad de GBS59 tiene al menos siete clados y la identidad de secuencia entre estos clados es tan baja como del 48 %.

Las secuencias de aminoácidos de referencia para los siete clados de GBS59 son la SEQ ID NO: 1 (derivada de la cepa de GBS 2603), la SEQ ID NO: 2 (derivada de la cepa de GBS 515), la SEQ ID NO: 3 (derivada de la cepa de GBS CJB111), la SEQ ID NO: 4 (derivada de la cepa de GBS H36B), la SEQ ID NO: 5 (derivada de la cepa de GBS CJB110), la SEQ iD NO: 6 (derivada de la cepa de GBS DK21) y la SEQ ID NO: 7 (derivada de la cepa de GBS NEM316) en el presente documento.

El suero producido contra un clado de GBS59 determinado es activo contra otras cepas de GBS que expresan ese clado, pero no es activo contra cepas que expresan uno de los otros cinco clados, es decir hay una protección cruzada dentro de los clados, pero no una protección cruzada entre clados.

De acuerdo con la invención, se proporciona un polipéptido híbrido inmunogénico que comprende la secuencia de aminoácidos:

-A-{-X-L-}n-B

en la que L es una secuencia de aminoácidos enlazadora opcional; A es una etiqueta de histidinas N-terminal opcional; B es una etiqueta de histidinas C-terminal opcional; n es un número entero de 6 o más y en la que cada X es una secuencia de aminoácidos diferente seleccionada del grupo que consiste en:

a) un primer polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 38;

b) un segundo polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 42;

c) un tercer polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 40;

d) un cuarto polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 36;

e) un quinto polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 44;

f) un sexto polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 46;

y en el que el polipéptido híbrido es capaz de conferir protección cruzada contra cepas de GBS que expresan diferentes alelos cuando se prueba en un modelo de ratón de inmunización materna/exposición de cría neonatal.

Los diferentes clados de GBS59 están fusionados como una única cadena polipeptídica. La inclusión de múltiples clados de GBS59 como componentes vacunales mejora la cobertura de cepas de la composición inmunogénica contra GBS. Adicionalmente, los inventores han identificado dominios dentro de los clados de GBS59 que contienen epítopos responsables de inducir una respuesta inmunogénica. La composición inmunogénica incluye fragmentos de al menos seis clados diferentes de GBS59 que comprenden estos dominios, en lugar de las proteínas GBS59 de longitud completa. El uso de fragmentos de clados de GBS59 en lugar de proteínas de longitud completa facilita la preparación de una vacuna contra el GBS con cobertura de cepas mejorada.

Por lo tanto, la invención proporciona adicionalmente una composición inmunogénica que comprende un polipéptido híbrido inmunogénico de la invención.

Cuando n es 6, la fracciones X se seleccionan de las siguientes:

continuación

continuación

continuación

continuación

continuación

continuación

continuación

continuación

continuación

continuación

continuación

continuación

continuación

continuación

La invención también proporciona una célula (normalmente una bacteria) que expresa un polipéptido híbrido de la invención o comprende un ácido nucleico que codifica el polipéptido híbrido de la invención.

La proteína GBS59 se puede dividir en cuatro dominios (D1 a D4) entre el final de su péptido líder y el inicio de su anclaje de LPXTG. Estos cuatro dominios son de la siguiente manera en las SEQ ID NO: 1 a 7 y las posiciones en las secuencias de GBS59 adicionales que corresponden a esos restos se pueden identificar fácilmente mediante el alineamiento:

continuación

Con base en estudios de protección, los fragmentos útiles de GBS59 pueden conservar epítopos de al menos el dominio D3. Las primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta secuencias de aminoácidos utilizadas en los polipéptidos de la invención consisten en fragmentos de las SEQ ID NO: 1,2, 3, 4, 5, 6 o 7 que comprenden el dominio D3, como se identifica anteriormente.

En el presente documento también se desvelan subfragmentos de estos dominios que conservan epítopos necesarios para la inmunogenicidad. Las primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta o séptima secuencia de aminoácidos utilizadas en las composiciones inmunogénicas y los polipéptidos de la invención pueden consistir, así, en fragmentos de las SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 que comprenden subfragmentos del dominio D3 que conservan los epítopos necesarios para la inmunogenicidad. Los ejemplos de subfragmentos de dominios D3 se identifican a continuación. Los subfragmentos del dominio D3 identificados a continuación (las SEQ ID NO: 36, 38, 40, 42, 44, 46 y 48) son fragmentos expuestos en la superficie. El experto en la materia puede identificar fácilmente epítopos más pequeños dentro de estos fragmentos expuestos a la superficie. Por ejemplo, se ha descubierto que dos anticuerpos monoclonales (17C4/A3 y 4H11/B7, las s Eq ID NO: 262-269) se unen a un epítopo que comprende los aminoácidos 411-436 (SEQ ID NO: 270) dentro del subfragmento de D3 del clado 515 (Se Q ID NO: 38, fragmento de la SEQ ID NO: 2). Los subfragmentos del dominio D4 identificados a continuación comprenden las dos hélices (denominadas en el presente documento D4H) presentes en el N-terminal del dominio D4 y no el resto del dominio D4. Se predice que estas hélices están expuestas en la superficie.

Estos fragmentos contienen combinaciones de los dominios D2, D3 y D4 (o D4H) como se expone a continuación:

También se desvela el uso de fragmentos aún más pequeños. Por ejemplo, una tercera secuencia de aminoácidos consiste en un fragmento de la SEQ ID NO: 3 que comprende la SEQ ID n O: 78 (los aminoácidos 411 a 436 de la SEQ ID NO: 3).

Cuando se desvelan fragmentos, el fragmento de al menos t aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 1 tampoco debe estar presente dentro de las Se Q ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 ni dentro de la SEQ ID NO: 7. De forma similar, el fragmento de al menos u aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 2 tampoco debe estar presente dentro de las Se Q ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 ni dentro de la SEQ ID NO: 7. De forma similar, el fragmento de al menos v aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 3 tampoco debe estar presente dentro de las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 ni dentro de la SEQ ID NO: 7. De forma similar, el fragmento de al menos w aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 4 tampoco debe estar presente dentro de las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 ni dentro de la SEQ ID NO: 7. De forma similar, el fragmento de al menos x aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 5 tampoco debe estar presente dentro de las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 ni dentro de la SEQ ID NO: 7. De forma similar, el fragmento de al menos y aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 6 tampoco debe estar presente dentro de las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 ni dentro de la SEQ ID NO: 7. De forma similar, el fragmento de al menos z aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 7 tampoco debe estar presente dentro de las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 ni dentro de la SEQ ID NO: 6. En algunas realizaciones, cuando un fragmento de una de las SEQ ID NO: 1 a 7 se alinea como una secuencia contigua contra las otras seis SEQ ID NO, la identidad entre el fragmento y cada una de las otras seis SEQ ID NO es menor que el 75 % por ejemplo, menor que el 60 %, menor que el 50 %, menor que el 40 %, menor que el 30 %.

Un polipéptido híbrido que comprende la primera secuencia de aminoácidos, cuando se administra a un sujeto, suscitará una respuesta de anticuerpos que comprende anticuerpos que se unen a la proteína de GBS de tipo silvestre que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 (cepa 2603). En algunas realizaciones, estos anticuerpos no se unen a la proteína de GBS de tipo silvestre que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2, la proteína de GBS de tipo silvestre que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3, la proteína de GBS de tipo silvestre que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 4, la proteína de GBS de tipo silvestre que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 5, la proteína de GBS de tipo silvestre que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 6 o la proteína de GBS de tipo silvestre que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 7.

Un polipéptido híbrido que comprende la segunda secuencia de aminoácidos, cuando se administra a un sujeto, suscitará una respuesta de anticuerpos que comprende anticuerpos que se unen a la proteína de GBS de tipo silvestre que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2 (cepa 515). En algunas realizaciones, estos anticuerpos no se unen a la proteína de GBS de tipo silvestre que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1, la proteína de GBS de tipo silvestre que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3, la proteína de GBS de tipo silvestre que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 4, la proteína de GBS de tipo silvestre que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 5, la proteína de GBS de tipo silvestre que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 6 o la proteína de GBS de tipo silvestre que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 7.

Un polipéptido híbrido que comprende la tercera secuencia de aminoácidos, cuando se administra a un sujeto, suscitará una respuesta de anticuerpos que comprende anticuerpos que se unen a la proteína de GBS de tipo silvestre que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3 (cepa cjb111). En algunas realizaciones, estos anticuerpos no se unen a la proteína de GBS de tipo silvestre que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1, la proteína de GBS de tipo silvestre que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2, la proteína de GBS de tipo silvestre que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 4, la proteína de GBS de tipo silvestre que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 5, la proteína de GBS de tipo silvestre que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 6 o la proteína de GBS de tipo silvestre que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 7.

Un polipéptido híbrido que comprende la cuarta secuencia de aminoácidos, cuando se administra a un sujeto, suscitará una respuesta de anticuerpos que comprende anticuerpos que se unen a la proteína de GBS de tipo silvestre que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 4 (cepa h36b). En algunas realizaciones, estos anticuerpos no se unen a la proteína de GBS de tipo silvestre que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1, la proteína de GBS de tipo silvestre que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2, la proteína de GBS de tipo silvestre que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3, la proteína de GBS de tipo silvestre que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 5, la proteína de GBS de tipo silvestre que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 6 o la proteína de GBS de tipo silvestre que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 7.

Un polipéptido híbrido que comprende la quinta secuencia de aminoácidos, cuando se administra a un sujeto, producirá una respuesta de anticuerpos que comprende anticuerpos que se unen a la proteína de GBS de tipo silvestre que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 5 (cepa CJB110). En algunas realizaciones, estos anticuerpos no se unen a la proteína de GBS de tipo silvestre que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1, la proteína de GBS de tipo silvestre que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2, la proteína de GBS de tipo silvestre que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3, la proteína de GBS de tipo silvestre que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 4, la proteína de GBS de tipo silvestre que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 6 o la proteína de GBS de tipo silvestre que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 7.

Un polipéptido híbrido que comprende la sexta secuencia de aminoácidos, cuando se administra a un sujeto, suscitará una respuesta de anticuerpos que comprende anticuerpos que se unen a la proteína de GBS de tipo silvestre que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 6 (cepa DK21). En algunas realizaciones, estos anticuerpos no se unen a la proteína de GBS de tipo silvestre que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1, la proteína de GBS de tipo silvestre que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2, la proteína de GBS de tipo silvestre que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3, la proteína de GBS de tipo silvestre que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 4, la proteína de GBS de tipo silvestre que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 5 o la proteína de GBS de tipo silvestre que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 7.

Un polipéptido híbrido que comprende una séptima secuencia de aminoácidos, cuando se administra a un sujeto, suscitará una respuesta de anticuerpos que comprende anticuerpos que se unen a la proteína de GBS de tipo silvestre que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 7 (cepa NEM316). En algunas realizaciones, estos anticuerpos no se unen a la proteína de GBS de tipo silvestre que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1, la proteína de GBS de tipo silvestre que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2, la proteína de GBS de tipo silvestre que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3, la proteína de GBS de tipo silvestre que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 4, la proteína de GBS de tipo silvestre que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 5 o la proteína de GBS de tipo silvestre que tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 6.

Aunque las primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta y séptima secuencias de aminoácidos pueden compartir algunas secuencias en común, en conjunto tienen diferentes secuencias de aminoácidos.

También se desvelan secuencias de aminoácidos que pueden, en comparación con las SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 o fragmentos de las mismas, incluir uno o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, etc.) reemplazos conservativos de aminoácidos, es decir reemplazos de un aminoácido por otro que tiene una cadena lateral relacionada. Los aminoácidos codificados genéticamente se dividen generalmente en cuatro familias: (1) ácidos es decir aspartato, glutamato; (2) básicos es decir lisina, arginina, histidina; (3) no polares es decir alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano; y (4) polares sin carga es decir glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. La fenilalanina, el triptófano y la tirosina se clasifican algunas veces conjuntamente como aminoácidos aromáticos. En general, la sustitución de aminoácidos individuales dentro de esas familias no tiene un gran efecto sobre la actividad biológica. Se develan adicionalmente polipéptidos que tiene una o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, etc.) deleciones de aminoácidos individuales con respecto a una secuencia de referencia. Dichos polipéptidos también pueden incluir una o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, etc.) inserciones (por ejemplo, cada una de 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos) con respecto a una secuencia de referencia.

También se desvelan en el presente documento secuencias de aminoácidos que comprenden sustituciones de restos de aminoácidos involucrados en la formación de enlaces isopeptídicos dentro de GBS59, identificados a continuación en la tabla.

Los datos presentados en los ejemplos demuestran que la mutación de esos restos para alterar la formación de enlaces isopeptídicos no afecta negativamente la inmunogenicidad del polipéptido. Por consiguiente, se desvela que los polipéptidos pueden comprender sustituciones en uno o más de los restos de lisina o los restos de asparagina enumerados en la tabla anterior, por ejemplo, los restos de lisina pueden sustituirse por restos de alanina.

Polipéptidos híbridos

Diferentes clados de GBS59 utilizados en la invención se expresan como una cadena de polipéptido individual (un polipéptido “híbrido” o “quimera”). Los polipéptidos híbridos ofrecen dos ventajas principales: primero, un polipéptido que puede ser inestable o expresarse mal por sí mismo puede ser ayudado al agregar un compañero híbrido adecuado que supera el problema; segundo, la fabricación comercial se simplifica ya que se necesita emplear solo una expresión y purificación para producir dos polipéptidos que son ambos antigénicamente útiles.

Los polipéptidos híbridos pueden incluir secuencias solo de antígenos de GBS59 pero en otras realizaciones pueden incluir antígenos que no sean de GBS59. Si están presentes antígenos que no son de GBS59, estos pueden estar en el extremo No en el extremo C.

Diferentes polipéptidos híbridos se pueden mezclar juntos en una única formulación. Los híbridos se pueden combinar con antígenos de GBS59 no híbridos u otros antígenos que no sean de GBS59.

Los polipéptidos híbridos se pueden representar por la fórmula NH2-A-{-X-L-}n-B-COOH.

Por cada n casos de {-X-L-}, la secuencia de aminoácidos enlazadora -L- puede estar presente o ausente. La(s) secuencia(s) de aminoácidos enlazadora(s) -L- normalmente será(n) corta(s) (por ejemplo, 20 o menos aminoácidos, es decir 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Los ejemplos comprenden secuencias cortas de péptidos que facilitan la clonación, enlazadores de poli-glicina (es decir que comprenden Glyn, donde n = 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) y etiquetas de histidinas (es decir, Hisn donde n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más, por ejemplo, la SEQ ID NO: 79). Otras secuencias de aminoácidos enlazadoras adecuadas serán obvias para los expertos en la materia. Los enlazadores útiles son GSGS (SEQ ID NO: 80), GSGGGG (SEQ ID NO: 81) o GSGSGGGG (SEQ ID NO: 82), estando formado el dipéptido Gly-Ser a partir de un sitio de restricción de BamHI, ayudando de esta manera a la clonación y manipulación, y siendo el tetrapéptido (Gly)4 un enlazador de poli-glicina típico. Otros enlazadores adecuados, particularmente para el uso como el Ln final, son un dipéptido de Leu-Glu o Gly-Ser. Los enlazadores contendrán usualmente al menos un resto de glicina para facilitar la flexibilidad estructural, por ejemplo, una fracción -L- puede contener 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más restos de glicina. Dichas glicinas pueden estar dispuestas para incluir al menos dos glicinas consecutivas en una secuencia de dipéptido Gly-Gly o una secuencia oligo-Gly más larga, es decir Glyn, donde n = 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más.

-A- es una etiqueta de histidinas N-terminal opcional, es decir, Hisn donde n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más. Si X1 carece de su propia metionina del extremo N, -A- es preferentemente un oligopéptido (por ejemplo, con 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 aminoácidos) que proporciona una metionina en el extremo N, por ejemplo, Met-Ala-Ser o un único resto de Met. En un polipéptido naciente, la fracción -A- puede proporcionar la metionina N-terminal del polipéptido (formil-metionina, fMet, en bacterias). Sin embargo, uno o más aminoácidos pueden escindirse del extremo N de una fracción -A- naciente, de tal manera que la fracción -A- en un polipéptido maduro de la invención no incluye necesariamente una metionina N-terminal. -B- es una etiqueta de histidinas C-terminal opcional, es decir, Hisn, donde n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más, tal como la SEQ ID NO: 79c.

Es preferente que las secuencias -A-, -B- y -L- no incluyan una secuencia que comparte 10 o más aminoácidos contiguos en común con una secuencia de polipéptido humana.

En algunas realizaciones, una fracción -L - comprende un antígeno que no es de GBS59.

La invención también proporciona ácido nucleico que codifica un polipéptido híbrido de la invención.

De las diversas fracciones X y L, las combinaciones útiles incluyen, pero sin limitación:

Otras fracciones X y L y combinaciones útiles se describen a continuación:

De esta manera, los ejemplos de híbridos de la invención incluyen polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos Se Q ID NO: 83. También se desvelan en el presente documento SEQ ID NO: 84; SEQ ID NO: 85; SEQ ID NO: 86 o SEQ ID NO: 87.

Polipéptidos

Los polipéptidos utilizados con la invención se pueden preparar de muchas maneras, por ejemplo, mediante síntesis química (en su totalidad o en parte), mediante la digestión de polipéptidos más largos utilizando proteasas, mediante la traducción de ARN, mediante la purificación a partir de un cultivo de células (por ejemplo, a partir de expresión recombinante), a partir del propio organismo (por ejemplo, después del cultivo de bacterias o directamente de pacientes), etc. Un procedimiento preferido para la producción de péptidos de <40 aminoácidos de largo implica la síntesis química in vitro [3,4]. La síntesis de péptidos en fase sólida se prefiere particularmente, tal como los procedimientos basados en la química de tBoc o Fmoc [5]. La síntesis enzimática [6] también se puede utilizar en parte o completamente. Como una alternativa para la síntesis química, se puede utilizar síntesis biológica, por ejemplo, los polipéptidos se pueden producir mediante traducción. Esto se puede llevar a cabo in vitro o in vivo. Los procedimientos biológicos están restringidos en general a la producción de polipéptidos basados en L-aminoácidos, pero la manipulación de la maquinaria de traducción (por ejemplo, de moléculas de aminoacil ARNt) se puede utilizar para permitir la introducción de D-aminoácidos (o de otros aminoácidos no naturales, tales como yodotirosina o metilfenilalanina, azidohomoalanina, etc.) [7]. Sin embargo, donde se incluyen los D-aminoácidos, se prefiere utilizar la síntesis química. Los polipéptidos pueden tener modificaciones covalentes en el extremo C y/o el extremo N.

Los polipéptidos pueden tomar diversas formas (por ejemplo, nativos, fusiones, glucosilados, no glucosilados, lipidados, no lipidados, fosforilados, no fosforilados, miristoilados, no miristoilados, monoméricos, multiméricos, particulados, desnaturalizados, etc.).

Los polipéptidos se proporcionan preferentemente en una forma purificada o sustancialmente purificada, es decir, sustancialmente exentos de otros polipéptidos (por ejemplo, exentos de polipéptidos de origen natural), particularmente de otros polipéptidos de neumococos o células hospedadoras, y generalmente son al menos aproximadamente el 50 % puros (en peso) y usualmente al menos aproximadamente el 90 % puros, es decir menos de aproximadamente el 50 % y más preferentemente menos de aproximadamente el 10% (por ejemplo, el 5% o menos) de una composición está conformada de otros polipéptidos expresados.

Los polipéptidos se pueden unir a un soporte sólido. Los polipéptidos pueden comprender un marcador detectable (por ejemplo, un marcador radioactivo o fluorescente, o un marcador de biotina).

El término “polipéptido” se refiere a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados y puede estar interrumpido por moléculas diferentes de aminoácidos. Los términos también abarcan un polímero de aminoácidos que ha sido modificado naturalmente o mediante una intervención; por ejemplo, la formación de enlaces de disulfuro, glucosilación, lipidación, acetilación, fosforilación o cualquier otra manipulación o modificación, tal como la conjugación con un componente de marcaje. También están incluidos dentro de la definición, por ejemplo, los polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (que incluyen, por ejemplo, aminoácidos no naturales, etc.), así como también otras modificaciones conocidas en la técnica. Los polipéptidos pueden aparecer como cadenas individuales o cadenas asociadas. Los polipéptidos pueden ser glucosilados de manera natural o no natural (es decir, el polipéptido tiene un patrón de glucosilación que difiere del patrón de glucosilación encontrado en el polipéptido de origen natural correspondiente).

También se proporciona un procedimiento para producir polipéptidos de la invención, que comprende cultivar una célula hospedadora de la invención en condiciones que inducen la expresión del polipéptido. Aunque la expresión del polipéptido puede tener lugar en Streptococcus, la invención utilizará usualmente un hospedador heterólogo para la expresión. El hospedador heterólogo puede ser procariótico (por ejemplo, una bacteria) o eucariótico. Será usualmente E. coli, pero otros hospedadores adecuados incluyen Bacillus subtilis, Vibrio cholerae, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Neisseria lactamica, Neisseria cinerea, Mycobacteria (por ejemplo, M. tuberculosis), levaduras, etc.

Además, se desvela en el presente documento un procedimiento de producción de un polipéptido de la invención, en el que el polipéptido se sintetiza en parte o completamente utilizando medios químicos.

Ácidos nucleicos

La invención también proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido híbrido de la invención. Por ejemplo, la invención proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido híbrido que comprende una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 83. La invención proporciona de esta manera un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 88 (que codifica el polipéptido de la SEQ ID NO: 83).

La invención también proporciona un ácido nucleico que comprende secuencias de nucleótidos que tienen identidad de secuencia con tales secuencias de nucleótidos. Dichos ácidos nucleicos incluyen aquellos que utilizan codones alternativos para codificar el mismo aminoácido. En particular, los ácidos nucleicos pueden contener codones alternativos optimizados para la expresión en microorganismos específicos. La invención proporciona de esta manera una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido híbrido que comprende una secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 83 que se ha optimizado para la expresión en E. coli. La invención proporciona de esta manera un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de: SEQ ID NO: 93 (secuencia optimizada para E. coli que codifica el polipéptido de la SEQ ID NO: 83). También se desvelan en el presente documento la SEQ ID NO: 94 (secuencia optimizada para E. coli que codifica el polipéptido de la SEQ ID NO: 84); la SEQ ID NO: 95 (secuencia optimizada para E. coli que codifica el polipéptido de la SEQ ID NO: 85); la SEQ ID NO: 96 (secuencia optimizada para E. coli que codifica el polipéptido de la s Eq ID NO: 86) o la SEQ ID NO: 97 (secuencia optimizada para E. coli que codifica el polipéptido de la SEQ ID NO: 87).

La invención también proporciona un ácido nucleico que puede hibridarse con esos ácidos nucleicos. Las reacciones de hibridación se pueden realizar en condiciones de diferente “rigurosidad”. Las condiciones que aumentan la rigurosidad de una reacción de hibridación son ampliamente conocidas y están publicadas en la técnica. Los ejemplos de condiciones relevantes incluyen (en orden de rigurosidad creciente): temperaturas de incubación de 25 °C, 37 °C, 50 °C, 55 °C y 68 °C; concentraciones de tampón de SSC 10 x, SSC 6 x, SSC 1 x, SSC 0,1 x (donde SSC es NaCl 0,15 M y tampón de citrato 15 mM) y sus equivalentes utilizando otros sistemas de tampones; concentraciones de formamida del 0 %, 25 %, 50 % y 75 %; tiempos de incubación de 5 minutos a 24 horas, soluciones de lavado de SSC 6 x, SSC 1 x, SSC 0,1 x o agua desionizada. Las técnicas de hibridación y su optimización son bien conocidas en la técnica [véase, por ejemplo, las referencias 8 y 221, etc.].

La invención incluye un ácido nucleico que comprende secuencias complementarias para esas secuencias (por ejemplo, para antisentido o sondeo, o para su uso como cebadores).

El ácido nucleico de acuerdo con la invención puede tomar diversas formas (por ejemplo, monocatenario, bicatenario, vectores, cebadores, sondas, marcados, etc.). Los ácidos nucleicos de la invención pueden ser circulares o ramificados, pero generalmente serán lineales. A menos que se especifique o se requiera de otra manera, cualquier realización de la invención que utiliza un ácido nucleico puede utilizar tanto la forma bicatenaria como cada una de las dos formas monocatenarias complementarias que constituyen la forma bicatenaria. Los cebadores y las sondas son generalmente monocatenarios, ya que son ácidos nucleicos antisentido.

Los ácidos nucleicos de la invención se proporcionan preferentemente en forma purificada o sustancialmente purificada, es decir, sustancialmente exentos de otros ácidos nucleicos (por ejemplo, exentos de ácidos nucleicos de origen natural), particularmente de otros ácidos nucleicos de GBS u otras células hospedadoras, estando generalmente al menos aproximadamente el 50 % puros (en peso) y usualmente al menos aproximadamente el 90 % puros. Los ácidos nucleicos de la invención son preferentemente ácidos nucleicos de GBS.

Los ácidos nucleicos de la invención se pueden preparar de muchas maneras, por ejemplo, mediante síntesis química (por ejemplo, síntesis de ADN de fosforamidita) en su totalidad o en parte, mediante digestión de ácidos nucleicos más grandes utilizando nucleasas (por ejemplo, enzimas de restricción), uniendo ácidos nucleicos más cortos o nucleótidos (por ejemplo, utilizando ligasas o polimerasas), a partir de bibliotecas genómicas o de ADNc, etc.

El ácido nucleico de la invención se puede unir a un soporte sólido (por ejemplo, una perla, placa, filtro, película, portaobjetos, soporte de micromatriz, resina, etc.). El ácido nucleico de la invención se puede marcar, por ejemplo, con un marcados radioactivo o fluorescente, o un marcador de biotina. Esto es particularmente útil cuando el ácido nucleico debe utilizarse en técnicas de detección, por ejemplo, cuando el ácido nucleico es un cebador, o como una sonda.

La expresión “ácido nucleico” incluye en general el significado de una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, la cual contiene desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos y/o sus análogos. Incluye ADN, ARN, híbridos de ADN/ARN. También incluye análogos de ADN o ARN, tales como aquellos que contienen estructuras principales modificadas (por ejemplo, ácidos nucleicos peptídicos (los PNA, por sus siglas en inglés peptide nucleic acids) o fosforotioatos) o bases modificadas. De esta manera, la invención incluye ARNm, ARNt, ARNr, ribozimas, ADN, ADNc, ácidos nucleicos recombinantes, ácidos nucleicos ramificados, plásmidos, vectores, sondas, cebadores, etc. Cuando un ácido nucleico de la invención tiene la forma de ARN, puede tener o no una caperuza 5'.

Los ácidos nucleicos de la invención pueden ser parte de un vector, es decir, parte de una construcción de ácido nucleico diseñada para la transducción/transfección de uno o más tipos de células. Los vectores pueden ser, por ejemplo, “vectores de clonación” que están diseñados para el aislamiento, propagación y replicación de nucleótidos insertados, “vectores de expresión” que están diseñados para la expresión de una secuencia de nucleótidos en una célula hospedadora, “vectores víricos” que están diseñados para dar como resultado la producción de un virus recombinante o una partícula similivírica o “vectores lanzadera”, que comprenden los atributos de más de un tipo de vector. Los vectores preferidos son plásmidos. Una “célula hospedadora” incluye una célula individual o un cultivo de células que puede ser o puede haber sido un receptor de ácido nucleico exógeno. Las células hospedadoras incluyen la progenie de una célula hospedadora individual y la progenie puede no ser necesariamente completamente idéntica (en la morfología o en el complemento de ADN total) a la célula precursora original debido a una mutación y/o cambio natural, accidental o deliberado. Las células hospedadoras incluyen células transfectadas o infectadas in vivo o in vitro con un ácido nucleico de la invención.

Cuando un ácido nucleico es ADN, se apreciará que “U” en una secuencia de ARN será reemplazado por “T” en el ADN. De forma similar, cuando un ácido nucleico es ARN, se apreciará que “T” en una secuencia de ADN será reemplazado por “U” en el ARN.

El término “complemento” o “complementario”, cuando se utiliza en relación con ácidos nucleicos, se refiere al apareamiento de bases de Watson-Crick. De esta manera, el complemento de C es G, el complemento de G es C, el complemento de A es T (o U) y el complemento de T (o U) es A. También es posible utilizar bases tales como I (la purina inosina) por ejemplo, para complementar pirimidinas (C o T).

Los ácidos nucleicos de la invención se pueden utilizar, por ejemplo: para producir polipéptidos in vitro o in vivo; como sondas de hibridación para la detección de ácido nucleico en muestras biológicas; para generar copias adicionales de los ácidos nucleicos; para generar ribozimas u oligonucleótidos antisentido; como cebadores o sondas de ADN monocatenario o como oligonucleótidos formadores de triple cadena.

También se desvela un procedimiento de producción de ácido nucleico de la invención, en el que el ácido nucleico se sintetiza en parte o en su totalidad utilizando medios químicos.

La invención proporciona vectores que comprenden secuencias de nucleótidos de la invención (por ejemplo, vectores de clonación o expresión) y células hospedadoras transformadas con dichos vectores.

Composiciones inmunogénicas

Los polipéptidos híbridos de la invención son útiles como principios activos en composiciones inmunogénicas. Dichas composiciones inmunogénicas pueden ser útiles como vacunas. Estas vacunas pueden ser ya sea profilácticas (es decir, para prevenir una infección) o terapéuticas (es decir, para tratar una infección), pero normalmente serán profilácticas.

De esta manera, las composiciones pueden ser farmacéuticamente aceptables. Incluirán usualmente componentes además de los antígenos, por ejemplo, incluirán normalmente uno o más transportadores y/o excipientes farmacéuticos. Un análisis completo de estos componentes está disponible en una referencia [216].

Las composiciones se administrarán generalmente a un mamífero en forma acuosa. Sin embargo, antes de la administración la composición puede haber estado en forma no acuosa. Por ejemplo, aunque algunas vacunas se fabrican en forma acuosa, luego se llenan y se distribuyen y administran también en forma acuosa, otras vacunas se liofilizan durante la fabricación y se reconstituyen en una forma acuosa al momento del uso. De esta manera, una composición de la invención puede ser seca, tal como una formulación liofilizada.

La composición puede incluir conservantes tales como tiomersal o 2-fenoxietanol. Sin embargo, se prefiere que la vacuna debe estar sustancialmente exenta de (es decir, menos de 5 ^g/ml) material de mercurio, por ejemplo, exento de tiomersal. Las vacunas que no contienen mercurio son más preferidas. Las vacunas sin conservantes son particularmente preferidas.

Para controlar la tonicidad, se prefiere incluir una sal fisiológica, tal como una sal de sodio. Se prefiere el cloruro de sodio (NaCl), que puede estar presente entre 1 y 20 mg/ml, por ejemplo, aproximadamente 10+2 mg/ml de NaCl. Otras sales que pueden estar presentes incluyen cloruro de potasio, fosfato dihidrógeno de potasio, dihidrato de fosfato de disodio, cloruro de magnesio, cloruro de calcio, etc.

Las composiciones tendrán generalmente una osmolalidad entre 200 mOsm/kg y 400 mOsm/kg, preferentemente entre 240-360 mOsm/kg y se encontrarán más preferentemente dentro del intervalo de 290-310 mOsm/kg.

Las composiciones pueden incluir uno o más tampónes. Los tampónes típicos incluyen: un tampón de fosfato; un tampón de Tris; un tampón de borato; un tampón de succinato; un tampón de histidina (particularmente con un adyuvante de hidróxido de aluminio) o un tampón de citrato. Los tampónes se incluirán normalmente en el intervalo de 5-20 mM.

El pH de una composición estará generalmente entre 5,0 y 8,1 y más normalmente entre 6,0 y 8,0, por ejemplo, 6,5 y 7,5, o entre 7,0 y 7,8.

La composición es preferentemente estéril. La composición es preferentemente no pirogénica, por ejemplo, que contenga <1 UE (unidad de endotoxina, una medida estándar) por dosis y preferentemente <0,1 UE por dosis. Preferentemente, la composición no contiene gluten.

La composición puede incluir material para una inmunización individual o puede incluir material para múltiples inmunizaciones (es decir, un kit de “multidosis”). La inclusión de un conservante se prefiere en la disposición multidosis. Como una alternativa a la inclusión (o además) de un conservante en composiciones de multidosis, las composiciones pueden estar contenidas en un envase que tiene un adaptador aséptico para la retirada de material.

Las vacunas para seres humanos se administran normalmente en un volumen de dosificación de aproximadamente 0,5 ml, aunque se puede administrar media dosis (es decir, aproximadamente 0,25 ml) a los niños.

Las composiciones inmunogénicas de la invención también pueden comprender uno o más agentes inmunorreguladores. Preferentemente, uno o más de los agentes inmunorreguladores incluyen uno o más adyuvantes. Los adyuvantes pueden incluir un adyuvante de TH1 y/o un adyuvante de TH2, analizados adicionalmente más adelante.

Los adyuvantes que se pueden utilizar en composiciones de la invención incluyen, pero sin limitación:

A. Composiciones que contienen minerales

Las composiciones que contienen minerales que son adecuadas para el uso como adyuvantes en la invención incluyen sales minerales, tales como sales de aluminio y sales de calcio. La invención incluye sales minerales tales como hidróxidos (por ejemplo, oxihidróxidos), fosfatos (por ejemplo, hidroxifosfatos, ortofosfatos), sulfatos, etc. [por ejemplo, véanse los capítulos 8 y 9 de la referencia 9] o mezclas de diferentes compuestos minerales, en las que los compuestos tienen cualquier forma adecuada (por ejemplo, gel, cristalinos, amorfos, etc.) y en las que se prefiere la adsorción. Las composiciones que contienen minerales también se pueden formular como una partícula de sal metálica.

Los adyuvantes conocidos como “hidróxido de aluminio” son normalmente sales de oxihidróxido de aluminio, las cuales son usualmente al menos parcialmente cristalinas. El oxihidróxido de aluminio, que puede representarse por la fórmula AlO(OH), se puede distinguir de otros compuestos de aluminio, tal como el hidróxido de aluminio Al(OH)3, mediante la espectroscopía infrarroja (IR), en particular por la presencia de una banda de adsorción a 1070 cm-1 y una saliente fuerte a 3090-3100 cm-1 [capítulo 9 de la referencia 9]. El grado de cristalinidad de un adyuvante de hidróxido de aluminio se refleja por la anchura de la banda de difracción a media altura (WHH, por sus siglas en inglés de width of the diffraction band at half height), en las que las partículas pobremente cristalinas muestran un ensanchamiento de línea más grande debido a los tamaños más pequeños de los cristalitos. El área superficial aumenta conforme aumenta la WHH y se ha observado que los adyuvantes con valores más altos de WHH tienen mayor capacidad de adsorción de antígenos. Una morfología fibrosa (por ejemplo, como se observa en las micrografías electrónicas de transmisión) es típica de los adyuvantes de hidróxido de aluminio. El pI de los adyuvantes de hidróxido de aluminio es normalmente de aproximadamente 11, es decir, el propio adyuvante tiene una carga superficial positiva a pH fisiológico. Se han informado para los adyuvantes de hidróxido de aluminio capacidades de adsorción de entre 1,8-2,6 mg de proteína por mg de Al+++ a pH 7,4.

Los adyuvantes conocidos como “fosfato de aluminio” son normalmente hidroxifosfatos de aluminio, que también contienen frecuentemente una pequeña cantidad de sulfato (es decir, sulfato de hidroxifosfato de aluminio). Se pueden obtener mediante precipitación y las condiciones de reacción y concentraciones durante la precipitación influyen en el grado de sustitución de hidroxilos por fosfato en la sal. Los hidroxifosfatos tienen generalmente una relación molar de PO4/Al entre 0,3 y 1,2. Los hidroxifosfatos se pueden distinguir del AlPO4 estricto por la presencia de grupos hidroxilo. Por ejemplo, una banda de espectro de IR a 3164 cm-1 (por ejemplo, cuando se calienta a 200 °C) indica la presencia de hidroxilos estructurales [capítulo 9 de la referencia 9].

La relación molar de PO4/AP+ de un adyuvante de fosfato de aluminio estará generalmente entre 0,3 y 1,2, preferentemente entre 0,8 y 1,2 y más preferentemente 0,95+0,1. El fosfato de aluminio será generalmente amorfo, particularmente para las sales de hidroxifosfato. Un adyuvante típico es el hidroxifosfato de aluminio amorfo con una relación molar de PO4/Al entre 0,84 y 0,92, incluido a 0,6 mg de Al3+/ml. El fosfato de aluminio será generalmente particulado (por ejemplo, una morfología similar a una placa como se observa en las micrografías electrónicas de transmisión). Los diámetros típicos de las partículas están en el intervalo de 0,5-20 ^m (por ejemplo, aproximadamente 5-10 ^m) después de cualquier adsorción de antígenos. Se han informado para los adyuvantes de fosfato de aluminio capacidades de adsorción de entre 0,7-1,5 mg de proteína por mg de Al+++ a pH 7,4.

El punto de carga cero (PZC, por sus siglas en inglés de point of zero charge) del fosfato de aluminio está relacionado inversamente con el grado de sustitución de hidroxilo por fosfato, y este grado de sustitución puede variar dependiendo de las condiciones de reacción y la concentración de reactivos utilizados para preparar la sal mediante precipitación. El PZC también se altera al cambiar la concentración de iones de fosfato libres en solución (más fosfato = PZC más ácido) o al agregar un tampón tal como un tampón de histidina (hace el PZC más básico). Los fosfatos de aluminio utilizados de acuerdo con la invención tendrán generalmente un PZC de entre 4,0 y 7,0, más preferentemente de entre 5,0 y 6,5, por ejemplo, de aproximadamente 5,7.

Las suspensiones de sales de aluminio utilizadas para preparar composiciones de la invención pueden contener un tampón (por ejemplo, un tampón de fosfato o de histidina, o de Tris), pero esto no siempre es necesario. Las suspensiones son preferentemente estériles y sin pirógenos. Una suspensión puede incluir iones de fosfato acuosos, libres, por ejemplo, presentes en una concentración entre 1,0 y 20 mM, preferentemente entre 5 y 15 mM, y más preferentemente de aproximadamente 10 mM. Las suspensiones también pueden comprender cloruro de sodio.

En una realización, un componente adyuvante incluye una mezcla de tanto un hidróxido de aluminio como un fosfato de aluminio. En este caso, puede haber más fosfato de aluminio que hidróxido, por ejemplo, una relación en peso de al menos 2:1, por ejemplo, >5:1, >6:1, >7:1, >8:1, >9:1, etc.

La concentración de Al+++ en una composición para la administración a un paciente es preferentemente menor que 10 mg/ml, por ejemplo, <5 mg/ml, <4 mg/ml, <3 mg/ml, <2 mg/ml, <1 mg/ml, etc. Un intervalo preferido es de entre 0,3 y 1 mg/ml. Se prefiere un máximo de <0,85 mg/dosis.

B. Emulsiones Oleosas

Las composiciones de emulsiones oleosas que son adecuadas para su uso como adyuvantes en la invención incluyen emulsiones de escualeno-agua, tal como MF59 [Capítulo 10 de la referencia 9; véase también la referencia 10] (Escualeno al 5 %, Tween 80 al 0,5 % y Span 85 al 0,5 %, formulados en partículas submicrométricas utilizando un microfluidizador). También se pueden utilizar el adyuvante completo de Freund (ACF) y el adyuvante incompleto de Freund (AIF).

Se conocen diversas emulsiones de aceite en agua adecuadas son conocidas e incluyen normalmente al menos un aceite y al menos un tensioactivo, en las que el(los) aceite(s) y el(los) tensioactivo(s) son biodegradables (metabolizables) y biocompatibles. Las gotitas de aceite en la emulsión tienen generalmente un diámetro menor que 5 ^m y ventajosamente, la emulsión comprende gotitas de aceite con un diámetro submicrométrico, en las que estos tamaños pequeños se logran con un microfluidizador para proporcionar emulsiones estables. Se prefieren las gotitas con un tamaño menor que 220 nm ya que se pueden someter a esterilización por filtro.

La invención se puede utilizar con aceites tales como los de una fuente animal (tal como pescado) o vegetal. Las fuentes de aceites vegetales incluyen nueces, semillas y granos. El aceite de cacahuete, el aceite de soja, el aceite de coco y el aceite de oliva, los más disponibles comúnmente, ejemplifican los aceites de frutos secos. Se puede utilizar el aceite de jojoba, por ejemplo, obtenido de la semilla de jojoba. Los aceites de semillas incluyen el aceite de cártamo, aceite de semilla de algodón, aceite de semilla de girasol, aceite de semilla de sésamo y similares. En el grupo de granos, el aceite de maíz es el que está más fácilmente disponible, pero también se pueden utilizar el aceite de otros granos de cereales tales como trigo, avena, centeno, arroz, tef, triticale y similares. Los ésteres de ácidos grasos de 6-10 átomos de carbono de glicerol y 1,2-propanodiol, aunque no se encuentran naturalmente en los aceites de semillas, se pueden preparar mediante hidrólisis, separación y esterificación de los materiales apropiados partiendo de los aceites de frutos secos y semillas. Las grasas y aceites de la leche de mamífero son metabolizables y, por lo tanto, se pueden utilizar en la práctica de la presente invención. Los procedimientos para la separación, purificación, saponificación y otros medios necesarios para obtener aceites puros de fuentes animales son bien conocidos en la técnica. La mayoría de los pescados contienen aceites metabolizables que se pueden recuperar fácilmente. Por ejemplo, el aceite de hígado de bacalao, los aceites de hígado de tiburón y el aceite de ballena, tal como el esperma de ballena, ejemplifican varios de los aceites de pescado que se pueden utilizar en el presente documento. Varios aceites de cadena ramificada se sintetizan bioquímicamente en unidades de isopreno de 5 átomos de carbono y se denominan generalmente como terpenoides. El aceite de hígado de tiburón contiene un terpenoide insaturado, ramificado conocido como escualeno, 2,6,10,15,19,23-hexametil-2,6,10,14,18,22-tetracosahexaeno. Otros aceites preferidos son los tocoferoles (véase a continuación). Las emulsiones de aceite en agua que comprenden escualeno se prefieren particularmente. Se pueden utilizar mezclas de aceites.

Los tensioactivos se pueden clasificar por su “EHL” (equilibrio hidrófilo/lipófilo). Los tensioactivos preferidos de la invención tienen un EHL de al menos 10, preferentemente de al menos 15 y más preferentemente de al menos 16. La invención se puede utilizar con tensioactivos que incluyen, pero sin limitación: los tensioactivos de ésteres de polioxietilen-sorbitán (denominados comúnmente como los Tween), especialmente polisorbato 20 y polisorbato 80; copolímeros de óxido de etileno (OE), óxido de propileno (OP) y/u óxido de butileno (OB), comercializados con el nombre comercial DOWFAXMR, tales como los copolímeros de bloque lineales de OE/OP; octoxinoles, que pueden variar en el número de grupos repetitivos de etoxi (oxi-1,2-etanodiilo), en el que el octoxinol-9 (Tritón X-100 o f-octilfenoxipolietoxietanol) es de interés particular; (octilfenoxi)polietoxietanol (IGEPAL CA-630/NP-40); fosfolípidos tales como fosfatidilcolina (lecitina); éteres grasos de polioxietileno derivados de alcoholes laurílico, cetílico, estearílico y oleílicos (conocidos como tensioactivos Brij), tal como éter monolaurílico de trietilenglicol (Brij 30); y ésteres de sorbitán (conocidos comúnmente como los SPAN), tal como trioleato de sorbitán (Span 85) y monolaurato de sorbitán. Los tensioactivos preferidos para la inclusión en la emulsión son Tween 80 (monooleato de polioxietilen-sorbitán), Span 85 (trioleato de sorbitán), lecitina y Tritón X-100. Como se mencionó anteriormente, los detergentes tal como Tween 80 pueden contribuir a la estabilidad térmica observada en los ejemplos a continuación.

Se pueden utilizar mezclas de tensioactivos, por ejemplo, mezclas de Tween 80/Span 85. También es adecuada una combinación de un éster de polioxietilen-sorbitán tal como monooleato de polioxietilen-sorbitán (Tween 80) y un octoxinol tal como f-octilfenoxipolietoxietanol (Tritón X-100). Otra combinación útil comprende laureth 9 más un éster de polioxietilensorbitán y/o un octoxinol.

Las cantidades preferidas de tensioactivos ( % en peso) son: ésteres de polioxietilen-sorbitán (tal como Tween 80) del 0,01 a 1 %, en particular aproximadamente el 0,1 %; polioxietanoles de octil- o nonilfenoxi (tales como Tritón X-100 u otros detergentes de la serie Tritón) del 0,001 a 0,1 %, en particular del 0,005 a 0,02 %; éteres de polioxietileno (tal como laureth 9) del 0,1 a 20 %, preferentemente del 0,1 a 10 % y en particular del 0,1 a 1 % o aproximadamente del 0,5 %.

Los adyuvantes específicos de emulsiones de aceite en agua que son útiles con la invención incluyen, pero sin limitación:

• Una emulsión submicrométrica de escualeno, Tween 80 y Span 85. La composición de la emulsión en volumen puede ser de escualeno aproximadamente al 5 %, polisorbato 80 aproximadamente al 0,5 % y Span 85 aproximadamente al 0,5 %. En términos de peso, estas relaciones se vuelven escualeno al 4,3 %, polisorbato 80 al 0,5 % y Span 85 al 0,48 %. Este adyuvante es conocido como “MF59” [11-13], como se describe con mayor detalle en el Capítulo 10 de la referencia 14 y el capítulo 12 de la referencia 15. La emulsión MF59 incluye ventajosamente iones de citrato, por ejemplo, un tampón de citrato de sodio 10 mM.

• Una emulsión que comprende escualeno, un a-tocoferol y polisorbato 80. Estas emulsiones pueden tener escualeno del 2 al 10 %, tocoferol del 2 al 10 % y Tween 80 del 0,3 al 3 %, y la relación en peso de escualeno:tocoferol es preferentemente <1 (por ejemplo, 0,90) ya que esto proporciona una emulsión más estable. El escualeno y el Tween 80 pueden estar presentes en una relación en volumen de aproximadamente 5:2 o en una relación en peso de aproximadamente 11:5. Una emulsión de ese tipo se puede preparar al disolver Tween 80 en PBS para proporcionar una solución al 2 %, luego mezclar 90 ml de esta solución con una mezcla de (5 g de DL-a-tocoferol y 5 ml de escualeno), luego microfluidizar la mezcla. La emulsión resultante puede tener gotitas de aceite submicrométricas, por ejemplo, con un diámetro promedio entre 100 y 250 nm, preferentemente de aproximadamente 180 nm.

• Una emulsión de escualeno, un tocoferol y un detergente Tritón (por ejemplo, Tritón X-100). La emulsión también puede incluir un 3d-MPL (véase a continuación). La emulsión puede contener un tampón de fosfato.

• Una emulsión que comprende un polisorbato (por ejemplo, polisorbato 80), un detergente Tritón (por ejemplo, Tritón X-100) y un tocoferol (por ejemplo, un succinato de a-tocoferol). La emulsión puede incluir estos tres componentes en una relación en masa de aproximadamente 75:11:10 (por ejemplo, polisorbato 80 750 ^g/ml, Tritón X-100 110 |ig/ml y succinato de a-tocoferol 100 ^g/ml) y estas concentraciones deben incluir cualquier contribución de estos componentes de antígenos. La emulsión también puede incluir escualeno. La emulsión también puede incluir un 3d-MPL (véase a continuación). La fase acuosa puede contener un tampón de fosfato.

• Una emulsión de escualeno, polisorbato 80 y poloxámero 401 (“PluronicMR L121”). La emulsión se puede formular en una solución salina tamponada con fosfato, pH 7,4. Esta emulsión es un vehículo de suministro útil para dipéptidos de muramilo y se ha utilizado con treonil-MDP en el adyuvante “SAF-1” [16] (Thr-MDP al 0,05-1 %, escualano al 5 %, Pluronic L121MR al 2,5 % y polisorbato 80 al 0,2 %). También se puede utilizar sin Thr-MDP, como en el adyuvante “AF” [17] (escualano al 5 %, Pluronic L121 al 1,25 % y polisorbato 80 al 0,2 %). Se prefiere la microfluidización.

• Una emulsión que comprende escualeno, un disolvente acuoso, un tensioactivo no iónico, hidrófilo de éter polioxietilen-alquílico (por ejemplo, éter polioxietilen (12)-cetoestearílico) y un tensioactivo no iónico, hidrófobo (por ejemplo, un éster de sorbitán o un éster de manida, tal como monooleato de sorbitán o “Span 80”). La emulsión es preferentemente termorreversible y/o tiene al menos el 90 % de las gotitas de aceite (en volumen) con un tamaño menor que 200 nm [18]. La emulsión también puede incluir uno o más de: alditol; un agente crioprotector (por ejemplo, un azúcar, tal como dodecilmaltosida y/o sacarosa); y/o un alquilpoliglucósido. Tales emulsiones pueden liofilizarse.

• Una emulsión que tiene del 0,5-50 % de un aceite, 0,1-10 % de un fosfolípido y 0,05-5 % de un tensioactivo no iónico. Como se describe en la referencia 19, los componentes de fosfolípidos preferidos son fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol, fosfatidilglicerol, ácido fosfatídico, esfingomielina y cardiolipina. Los tamaños submicrométricos de las gotitas son ventajosos.

• Una emulsión submicrométrica de aceite en agua de un aceite no metabolizable (tal como aceite mineral ligero) y al menos un tensioactivo (tal como lecitina, Tween 80 o Span 80). Se pueden incluir aditivos, tal como la saponina QuilA, colesterol, un conjugado de saponina-lipófilo (tal como GPI-0100, descrito en la referencia 20, producido mediante la adición de amina alifática a desacilsaponina mediante el grupo carboxilo de ácido glucurónico), bromuro de dimetiidioctadecilamonio y/o N,N-dioctadecil-N,N-bis(2-hidroxietil)propanodiamina.

• Una emulsión que comprende un aceite mineral, un alcohol graso, etoxilado, lipófilo, no iónico y un tensioactivo hidrófilo no iónico (por ejemplo, un alcohol graso etoxilado y/o un copolímero de bloque de polioxietilenopolioxipropileno) [21].

• Una emulsión que comprende un aceite mineral, un alcohol graso, etoxilado, hidrófilo, no iónico y un tensioactivo lipófilo, no iónico (por ejemplo, un alcohol graso, etoxilado y/o un copolímero de bloque de polioxietilenopolioxipropileno) [21].

• Una emulsión en la cual se asocian como micelas helicoidales una saponina (por ejemplo, QuilA o QS21) y un esterol (por ejemplo, un colesterol) [22].

Los antígenos y los adyuvantes en una composición estarán normalmente en una mezcla al momento del suministro a un paciente. Las emulsiones se pueden mezclar con un antígeno durante la fabricación, o de forma extemporánea, al momento del suministro. De esta manera, el adyuvante y el antígeno pueden mantenerse separados en una vacuna envasada o distribuida, listos para la formulación final al momento del uso. El antígeno estará generalmente en una forma acuosa, de tal manera que la vacuna se prepara finalmente al mezclar dos líquidos. La relación en volumen de los dos líquidos para el mezclado puede variar (por ejemplo, entre 5:1 y 1:5) pero es en general de aproximadamente 1:1.

C. Formulaciones de saponina [capítulo 22 de la referencia 91

Las formulaciones de saponina también se pueden utilizar como adyuvantes en la invención. Las saponinas son un grupo heterogéneo de glucósidos de esterol y glucósidos triterpenoides que se encuentran en la corteza, hojas, tallos, raíces e incluso flores de una amplia gama de especies vegetales. La saponina de la corteza del árbol Quillaia saponaria Molina ha sido estudiada ampliamente como adyuvante. La saponina también se puede obtener comercialmente a partir de Smilax ornata (zarzaparrilla), Gypsophilla paniculata (velo de novia) y Saponaria officianalis (raíz de jabón). Las formulaciones de adyuvantes de saponina incluyen formulaciones purificadas, tal como QS21, así como también formulaciones lipídicas, tal como los ISCOM (siglas del inglés immunostimulating complex). La QS21 se comercializa como StimulonMR.

Las composiciones de saponina se han sido purificado utilizando HPLC y RP-HPLC. Las fracciones purificadas, específicas que utilizan estas técnicas han sido identificadas, incluyendo QS7, QS17, QS18, QS21, Qh -A, QH-B y QH-C. Preferentemente, la saponina es QS21. Un procedimiento de producción de QS21 se desvela en la referencia 23. Las formulaciones de saponina también pueden comprender un esterol, tal como colesterol [24].

Las combinaciones de saponinas y colesteroles se pueden utilizar para formar partículas singulares llamadas complejos inmunoestimulantes (los ISCOM) [capítulo 23 de la referencia 9]. Los ISCOM también incluyen normalmente un fosfolípido tal como fosfatidiletanolamina o fosfatidilcolina. Se puede utilizar en los ISCOM cualquier saponina conocida. Preferentemente, el ISCOM incluye uno o más de QuilA, QHA y QHC. Los ISCOM se describen adicionalmente en las referencias 24-26. Opcionalmente, los ISCOM pueden estar desprovistos de detergente adicional [27].

En las referencias 28 y 29 se puede encontrar una revisión del desarrollo de adyuvantes basados en saponina.

D. Virosomas y partículas similivíricas

Los virosomas y las partículas similivíricas (las VLP, por sus siglas del inglés virus-likeparticles) también se pueden utilizar como adyuvantes en la invención. Estas estructuras contienen generalmente una o más proteínas de un virus combinadas o formuladas opcionalmente con un fosfolípido. Generalmente no son patógenas, no se replican y generalmente no contienen nada del genoma vírico nativo. Las proteínas víricas se pueden producir de manera recombinante o se pueden aislar de virus completos. Estas proteínas víricas adecuadas para el uso en virosomas o VLP incluyen proteínas derivadas del virus de la gripe (tales como HA o NA), virus de Hepatitis B (tal como proteínas del núcleo o de la cápside), virus de la Hepatitis E, virus del sarampión, virus Sindbis, Rotavirus, virus de la Fiebre Aftosa, Retrovirus, virus de Norwalk, virus del Papiloma humano, VIH, fagos ARN, fago Qp (tal como proteínas de la cubierta), fago GA, fago fr, fago AP205 y Ty (tal como la proteína p1 del retrotransposón Ty). Las VLP se discuten adicionalmente en las referencias 30-35. Los virosomas se discuten adicionalmente en, por ejemplo, la referencia 36.

E. Derivados bacterianos o microbianos

Los adyuvantes adecuados para su uso en la invención incluyen derivados bacterianos o microbianos tales como derivados no tóxicos de lipopolisacáridos enterobacterianos (LPS), derivados de Lípido A, oligonucleótidos inmunoestimulantes y toxinas ribosilantes de ADP, y derivados desintoxicados de los mismos.

Los derivados destoxificados de LPS incluyen el lípido A de monofosforilo (MPL) y MPL 3-O-desacilado (3dMPL). El 3dMPL es una mezcla de 3 lípidos A de monofosforilo des-O-acilado con 4, 5 o 6 cadenas aciladas. Una forma preferida de “partícula pequeña” de 3 lípidos A de monofosforilo des-O-acilado se da desvela en la referencia 37. Tales “partículas pequeñas” de 3dMPL son suficientemente pequeñas para esterilizarlas por filtración a través de una membrana de 0,22 ^m [37]. Otros derivados de LPS no tóxicos incluyen los miméticos del lípido A de monofosforilo, tales como los derivados de fosfato de aminoalquil-glucosaminida, por ejemplo, RC-529 [38,39].

Los derivados del lípido A incluyen derivados del lípido A de Escherichia coli tal como OM-174. El OM-174 se describe por ejemplo en las referencias 40 y 41.

Los oligonucleótidos inmunoestimulantes que son adecuados para su uso como adyuvantes en la invención incluyen secuencias de nucleótidos que contienen un motivo CpG (una secuencia de dinucleótido que contiene una citosina no metilada unida por un enlace de fosfato a una guanosina). También se ha demostrado que los ARN bicatenarios y oligonucleótidos que contienen secuencias palindrómicas o poli(dG) son inmunoestimulantes.

Los CpG pueden incluir modificaciones/análogos de nucleótidos tales como modificaciones de fosforotioato y pueden ser bicatenarios o de monocatenarios. Las referencias 42, 43 y 44 desvelan posibles sustituciones de análogos, por ejemplo, el reemplazo de guanosina por 2'-desoxi-7-desazaguanosina. El efecto adyuvante de los oligonucleótidos de CpG se discute adicionalmente en las referencias 45-50.

La secuencia de CpG puede dirigirse al TLR9, tal como el motivo de GTCGTT o TTCGTT [51 ]. La secuencia de CpG puede ser específica para inducir una respuesta inmunitaria de Th1, tal como un ODN de CpG-A o puede ser más específica para inducir una respuesta de linfocitos B, tal como un ODN CpG-B. Los ODN de CpG-A y CpG-B se analizan en las referencias 52-54. Preferentemente, el CpG es un ODN de CpG-A.

Preferentemente, el oligonucleótido de CpG se construye de modo que el extremo 5' sea accesible para el reconocimiento del receptor. Opcionalmente, dos secuencias de oligonucleótidos de CpG se pueden unir a sus extremos 3' para formar “inmunómeros”. Véanse, por ejemplo, las referencias 53 y 55-57.

Un adyuvante particularmente útil basado en oligonucleótidos inmunoestimulantes es conocido como IC-31MR [58]. De esta manera, un adyuvante utilizado con la invención puede comprender una mezcla de (i) un oligonucleótido (por ejemplo, de entre 15-40 nucleótidos) que incluye al menos un (y preferentemente múltiples) motivos de CpI (es decir, una citosina unida a una inosina para formar un dinucleótido) y (ii) un polímero policatiónico, tal como un oligopéptido (por ejemplo, de entre 5-20 aminoácidos) que incluye al menos una (y preferentemente múltiples) secuencia de tripéptidos Lys-Arg-Lys. El oligonucleótido puede ser un desoxinucleótido que comprende una secuencia de 26-meros 5 '-(iC)13-3' (SEQ ID NO: 98). El polímero policatiónico puede ser un péptido que comprende una secuencia de 11-meros KLKLLLLLKLK (SEQ ID NO: 99).

Las toxinas ribosilantes de ADP bacterianas y los derivados destoxificados de las mismas se pueden utilizar como adyuvantes en la invención. Preferentemente, la proteína procede de E. coli (enterotoxina termoinestable de E. coli “LT”), colérica (“CT”) o de tos ferina (“PT”). El uso de toxinas ribosilantes de ADP destoxificadas como adyuvantes de las mucosas se describe en la referencia 59 y como adyuvantes parenterales en la referencia 60. La toxina o toxoide está preferentemente en la forma de una holotoxina, que comprende las subunidades tanto A como B. Preferentemente, la subunidad A contiene una mutación de destoxificación; preferentemente, la subunidad B no está mutada. Preferentemente, el adyuvante es un mutante de LT destoxificado, tal como LT-K63, LT-R72 y LT-G192. El uso de toxinas ribosilantes de ADP y derivados destoxificados de las mismas, particularmente LT-K63 y LT-R72, como adyuvantes se puede encontrar en las referencias 61-68. Un mutante de CT útil es CT-E29H [69]. La referencia numérica para las sustituciones de aminoácidos se basa preferentemente en los alineamientos de las subunidades A y B de las toxinas ribosilantes de ADP expuestos en la referencia 70.

F. Inmunomoduladores humanos

Los inmunomoduladores humanos que son adecuados para su uso como adyuvantes en la invención incluyen citocinas, tales como interleucinas (por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-l2 [71], etc.) [72], interferones (por ejemplo, interferón-y), factor estimulante de colonias de macrófagos y factor de necrosis tumoral. Un inmunomodulador preferido es IL-12.

G. Bioadhesivos y Mucoadhesivos

Los bioadhesivos y los mucoadhesivos también se pueden utilizar como adyuvantes en la invención. Los bioadhesivos adecuados incluyen microesferas de ácido hialurónico esterificado [73] o mucoadhesivos tales como derivados reticulados de ácido poli(acrílico), alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, polisacáridos y carboximetilcelulosa. El quitosán y los derivados del mismo también se pueden utilizar como adyuvantes en la invención [74].

H. Micropartículas

Las micropartículas también se pueden utilizar como adyuvantes en la invención. Las micropartículas (es decir, una partícula de -100 nm a -150 ^m de diámetro, más preferentemente de -200 nm a -30 ^m de diámetro y muy preferentemente de -500 nm a -10 ^m de diámetro) formadas a partir de materiales que son biodegradables y no son tóxicos (por ejemplo, un ácido poli(a-hidroxi), un ácido polihidroxibutírico, un poliortoéster, un polianhídrido, una policaprolactona, etc.), con poli(lactida-co-glicólido), son preferentes, tratadas opcionalmente para tener una superficie con carga negativa (por ejemplo, con SDS) o una superficie con carga positiva (por ejemplo, con un detergente catiónico, tal como CTAB).

I. Liposomas (Capítulos 13 y 14 de la referencia 9)

Los ejemplos de formulaciones de liposomas adecuadas para su uso como adyuvantes se describen en las referencias 75-77.

J. Formulaciones de éter polioxietilénico y éster polioxietilénico

Los adyuvantes adecuados para su uso en la invención incluyen éteres polioxietilénicos y ésteres polioxietilénicos [78]. Dichas formulaciones incluyen además tensioactivos de éster de polioxietilen-sorbitán en combinación con un octoxinol [79] así como tensioactivos de éter o éster polioxietilenalquílico en combinación con al menos un tensioactivo no iónico adicional tal como octoxinol [80]. Los éteres de polioxietileno preferidos se seleccionan del siguiente grupo: éter polioxietilen-9-laurílico (laureth 9), éter polioxietilen-9-esteorílico, éter polioxietilen-8-esteorílico, éter polioxietilen-4-laurílico, éter polioxietilen-35-laurílico y éter polioxietilen-23-laurílico.

K. Polifosfaceno (PCPP)

Las formulaciones de PCPP se describen, por ejemplo, en las referencias 81 y 82.

L. Péptidos de muramilo

Los ejemplos de péptidos de muramilo adecuados para su uso como adyuvantes en la invención incluyen N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP) y N acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanin-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina MTP-PE).

M. Compuestos de imidazoquinolona

Los ejemplos de compuestos de imidazoquinolona adecuados para su uso como adyuvantes en la invención incluyen Imiquamod y sus homólogos (por ejemplo, “Resiquimod 3M”), descritos adicionalmente en las referencias 83 y 84. La invención también puede comprender combinaciones de aspectos de uno o más de los adyuvantes identificados anteriormente. Por ejemplo, las siguientes composiciones de adyuvantes se pueden utilizar en la invención: (1) una saponina y una emulsión de aceite en agua [85]; (2) una saponina (por ejemplo, QS21) un derivado de LPS no tóxico (por ejemplo, 3dMPL) [86]; (3) una saponina (por ejemplo, QS21) un derivado de LPS no tóxico (por ejemplo, 3dMPL) un colesterol; (4) una saponina (por ejemplo, QS21) 3dMPL IL-12 (opcionalmente un esterol) [87]; (5) combinaciones de 3dMPL con, por ejemplo, QS21 y/o emulsiones de aceite en agua [88]; (6) SAF, que contiene escualeno al 10 %, Tween 80MR al0,4 %, polímero de bloque pluronic L121 al 5 % y thr-MDP, ya sea microfluidizado en una emulsión submicrométrica o sometido a agitación vorticial para generar una emulsión de tamaño de partícula más grande. (7) Sistema adyuvante RibiMR (RAS), (Ribi Immunochem) que contiene escualeno al 2 %, Tween 80 al 0,2 % y uno o más componentes de la pared celular bacteriana del grupo que consiste en monofosforil lípido A (MPL), dimicolato de trehalosa (TDM) y esqueleto de pared celular (CWS, por sus siglas del inglés cell wall skeleton), preferentemente MPL CWS (DetoxMR) y (8) una o más sales minerales (tal como una sal de aluminio) un derivado no tóxico de LPS (tal como 3dMPL).

Otras sustancias que actúan como agentes inmunoestimulantes se desvelan en el capítulo 7 de la referencia 9.

El uso de un adyuvante de hidróxido de aluminio y/o fosfato de aluminio es útil, particularmente en los niños, y los antígenos se absorben generalmente en estas sales. Las emulsiones de escualeno en agua también se prefieren, particularmente en los ancianos. Las combinaciones de adyuvantes útiles incluyen combinaciones de adyuvantes de Th1 y Th2 tales como CpG y alumbre o resiquimod y alumbre. Se puede utilizar una combinación de fosfato de aluminio y 3dMPL.

Las composiciones de la invención pueden suscitar tanto una respuesta inmunitaria mediada por células como una respuesta inmunitaria humoral.

Se piensa generalmente que dos tipos de linfocitos T, los linfocitos CD4 y CD8, son necesarios para iniciar y/o potenciar la inmunidad mediada por células y la inmunidad humoral. Los linfocitos T CD8 pueden expresar un correceptor de CD8 y son los denomina comúnmente linfocitos T Citotóxicos (los CTL) Los linfocitos T CD8 son capaces de reconocer o interactuar con antígenos presentados en las moléculas de MHC Clase I.

Los linfocitos T CD4 pueden expresar un correceptor de CD4 y se denominan comúnmente linfocitos T auxiliares. Los linfocitos T CD4 son capaces de reconocer péptidos antigénicos unidos a moléculas de MHC clase II. Tras la interacción con una molécula de MHC clase II, los linfocitos CD4 pueden secretar factores tales como citocinas. Esas citocinas secretadas pueden activar linfocitos B, linfocitos T citotóxicos, macrófagos y otras células que participan en una respuesta inmunitaria. Los linfocitos T auxiliares o linfocitos CD4+ se pueden dividir adicionalmente en dos subconjuntos funcionalmente distintos: fenotipo TH1 y fenotipo TH2, que difieren en sus citocinas y función efectora.

Los linfocitos TH1 activados potencian la inmunidad celular (incluyendo un incremento en la producción de CTL específica para antígenos) y por lo tanto tienen un valor particular en la respuesta a infecciones intracelulares. Los linfocitos TH1 activados pueden secretar uno o más de IL-2, IFN-y y TNF-p. Una respuesta inmunitaria de TH1 puede dar como resultado reacciones inflamatorias locales al activar macrófagos, linfocitos NK (citolíticos naturales) y linfocitos T citotóxicos CD8 (los CTL). Una respuesta inmunitaria de TH1 también puede actuar para expandir la respuesta inmunitaria al estimular el crecimiento de linfocitos B y T con IL-12. Los linfocitos B estimulados por TH1 pueden secretar la IgG2a.

Los linfocitos TH2 activados potencian la producción de anticuerpos y por lo tanto son valiosos en la respuesta a infecciones extracelulares. Los linfocitos t H2 activados pueden secretar uno o más de IL-4, IL-5, IL-6 e IL-10. Una respuesta inmunitaria de TH2 puede dar como resultado la producción de IgG1, IgE, IgA y linfocitos B de memoria para la protección futura.

Una respuesta inmunitaria potenciada puede incluir una o más de una respuesta inmunitaria de TH1 potenciada y una respuesta inmunitaria de t H2.

Una respuesta inmunitaria de TH1 pueden incluir uno o más de un incremento en los CTL, un incremento en una o más de las citocinas asociadas con una respuesta inmunitaria de TH1 (tales como IL-2, IFN-y y TNF-p), un incremento de los macrófagos activados, un incremento de la actividad de los NK o un incremento de la producción de IgG2a. Preferentemente, la respuesta inmunitaria de TH1 potenciada incluirá un incremento en la producción de IgG2a.

Una respuesta inmunitaria de TH1 se puede suscitar utilizando un adyuvante de TH1. Un adyuvante de TH1 suscitará generalmente niveles incrementados de producción de IgG2a con respecto a la inmunización del antígeno sin adyuvante. Los adyuvantes de TH1 adecuados para su uso en la invención pueden incluir, por ejemplo, formulaciones de saponina, virosomas y partículas similivíricas, derivados no tóxicos de un lipopolisacárido enterobacteriano (LPS), oligonucleótidos inmunoestimulantes. Los oligonucleótidos inmunoestimulantes, tales como los oligonucleótidos que contienen un motivo de CpG, son adyuvantes de TH1 preferidos para su uso en la invención.

Una respuesta inmunitaria de TH2 puede incluir uno o más de un incremento de una o más de las citocinas asociadas con una respuesta inmunitaria de TH2 (tal como IL-4, IL-5, IL-6 e IL-10), o un incremento en la producción de IgG1, IgE, IgA y linfocitos B de memoria. Preferentemente, la respuesta inmunitaria de TH2 incrementada incluirá un incremento en la producción de IgG1.

Una respuesta inmunitaria de TH2 se puede suscitar utilizando un adyuvante de TH2. Un adyuvante de TH2 suscitará generalmente niveles incrementados de producción de IgG1 con respecto a la inmunización del antígeno sin adyuvante. Los adyuvantes de TH2 adecuados para su uso en la invención incluyen, por ejemplo, composiciones que contienen minerales, emulsiones de aceite y toxinas ribosilantes de ADP, y derivados destoxificados de las mismas. Las composiciones que contienen minerales, tales como sales de aluminio, son adyuvantes de TH2 preferidos para su uso en la invención.

Una composición puede incluir una combinación de un adyuvante de TH1 y un adyuvante de TH2. Preferentemente, tal composición suscita una respuesta de TH1 potenciada y una respuesta de TH2 potenciada, es decir, un incremento de la producción de tanto IgG1 como IgG2a con respecto a la inmunización sin un adyuvante. Aún más preferentemente, la composición que comprende una combinación de un adyuvante de TH1 y uno de TH2 suscita una respuesta inmunitaria de TH1 incrementada y/o una respuesta inmunitaria de TH2 incrementada con respecto a la inmunización con un único adyuvante (es decir, con respecto a la inmunización con un adyuvante de TH1 solo o la inmunización con un adyuvante de TH2 solo).

La respuesta inmunitaria puede ser una o ambas de una respuesta inmunitaria de TH1 y una respuesta de TH2.

Preferentemente, la respuesta inmunitaria proporciona una o ambas de una respuesta de TH1 potenciada y una respuesta de TH2 potenciada.

La respuesta inmunitaria potenciada puede ser una o ambas de una respuesta inmunitaria sistémica y una de las mucosas. Preferentemente, la respuesta inmunitaria proporciona una o ambas de una respuesta inmunitaria sistémica potenciada y una respuesta inmunitaria de las mucosas potenciada. Preferentemente, la respuesta inmunitaria de las mucosas es una respuesta inmunitaria de TH2. Preferentemente, la respuesta inmunitaria de las mucosas incluye un incremento en la producción de IgA.

Las infecciones por estreptococos pueden afectar diversas áreas del cuerpo y de esta manera las composiciones de la invención se pueden preparar en diversas formas. Por ejemplo, las composiciones se pueden preparar como inyectables, como soluciones o suspensiones líquidas. También se pueden preparar formas sólidas adecuadas para la solución en, o suspensión en, vehículos líquidos antes de la inyección (por ejemplo, una composición liofilizada o una composición secada por pulverización). La composición se puede preparar para la administración tópica, por ejemplo, como una pomada, crema o polvo. La composición se puede preparar para la administración oral, por ejemplo, como un comprimido o una cápsula, como una pulverización o como un jarabe (opcionalmente saborizado). La composición se puede preparar para la administración por vía pulmonar, por ejemplo, como un inhalador, utilizando un polvo fino o una pulverización. La composición se puede preparar como un supositorio u óvulo vaginal. La composición se puede preparar para la administración nasal, ótica u ocular, por ejemplo, como gotas. La composición puede estar en forma de un kit, diseñado de tal manera que se reconstituya una composición combinada justo antes de la administración a un paciente. Tales kits pueden comprender uno o más antígenos en forma líquida y uno o más antígenos liofilizados.

Cuando una composición se debe preparar de forma extemporánea antes del uso (por ejemplo, cuando un componente se presenta en forma liofilizada) y se presenta como un kit, el kit puede comprender dos viales o puede comprender una jeringa lista para utilizarse y un vial, utilizándose el contenido de la jeringa para reactivar el contenido del vial antes de la inyección.

Las composiciones inmunogénicas utilizadas como vacunas comprenden una cantidad inmunológicamente eficaz de antígeno(s), así como cualquier otro componente, según sea necesario. Por “cantidad inmunológicamente eficaz”, se da a entender que la administración de esa cantidad a un individuo ya sea en una dosis individual o como parte de una serie, es eficaz para el tratamiento o la prevención. Esta cantidad varía dependiendo de la salud y el estado físico del individuo a tratar, la edad, el grupo taxonómico del individuo a tratar (por ejemplo, un primate no humano, primate, etc.), la capacidad del sistema inmunitario del individuo para sintetizar anticuerpos, el grado de protección deseado, la formulación de la vacuna, la evaluación de la situación médica por parte del médico que trata el caso y otros factores relevantes. Se espera que la cantidad se encontrará en un intervalo relativamente amplio que se puede determinar a través de ensayos rutinarios.

Inmunización con ácido nucleico

En el presente documento se desvelan los ácidos nucleicos (normalmente ADN) que codifican polipéptidos, para proporcionar las composiciones, procedimientos y usos basados en la inmunización de ácido nucleico [89 a 96].

El ácido nucleico que codifica el inmunógeno se expresa in vivo después del suministro a un paciente y el inmunógeno expresado estimula entonces el sistema inmunitario. El principio activo tomará normalmente la forma de un vector de ácido nucleico que comprende: (i) un promotor; (ii) una secuencia que codifica el inmunógeno, unida operativamente al promotor; y opcionalmente (iii) un marcador de selección. Los vectores preferidos pueden comprender además (iv) un origen de replicación; y (v) un terminador de transcripción corriente abajo de y unido operativamente a (ii). En general, (i) y (v) serán eucarióticos y (iii) y (iv) serán procarióticos.

Los promotores preferidos son promotores víricos, por ejemplo, de citomegalovirus (CMV). El vector también puede incluir secuencias reguladoras de la transcripción (por ejemplo, potenciadores) además del promotor y que interactúan funcionalmente con el promotor. Los vectores preferidos incluyen el potenciador/promotor de CMV intermedio-temprano y los vectores más preferidos también incluyen el intrón A de CMV. El promotor se une operativamente a una secuencia corriente abajo que codifica un inmunogénico, de tal manera que la expresión de la secuencia que codifica el inmunógeno está bajo control del promotor.

Cuando se utiliza un marcador, funciona preferentemente en un hospedador microbiano (por ejemplo, en un procariota, en una bacteria, en una levadura). El marcador es preferentemente un marcador de selección procariótico (por ejemplo, transcrito bajo el control de un promotor procariótico). Por conveniencia, los marcadores típicos son genes de resistencia a antibióticos.

El vector es preferentemente un vector episómico o extracromosómico que se replica de manera autónoma, tal como un plásmido.

El vector comprende preferentemente un origen de replicación. Se prefiere que el origen de replicación sea activo en procariotas pero no en eucariotas.

Los vectores preferidos incluyen, de esta manera, un marcador procariótico para la selección del vector, un origen de replicación procariótico, pero un promotor eucariótico para impulsar la transcripción de la secuencia que codifica el inmunógeno. Por lo tanto, los vectores (a) se amplificarán y se seleccionarán en hospedadores procarióticos sin la expresión de polipéptidos, pero (b) se expresan en hospedadores eucarióticos sin ser amplificados. Este ordenamiento es ideal para los vectores de inmunización con ácido nucleico.

El vector puede comprender una secuencia terminadora de la transcripción eucariótica corriente abajo de la secuencia codificante. Esto puede potenciar los niveles de transcripción. Cuando la secuencia codificante no la tiene por sí misma, el vector comprende preferentemente una secuencia de poliadenilación. Una secuencia de poliadenilación preferida es una que procede de la hormona de crecimiento bovina.

El vector puede comprender un sitio de clonación múltiple.

Además de las secuencias que codifican el inmunógeno y un marcador, el vector puede comprender una segunda secuencia codificante eucariótica. El vector también puede comprender un IRES corriente arriba de dicha segunda secuencia para permitir la traducción de un segundo polipéptido eucariótico a partir del mismo transcrito que el inmunógeno. Alternativamente, la secuencia codificante del inmunógeno puede estar corriente abajo de un IRES.

El vector puede comprender motivos de CpG no metilados, por ejemplo, secuencias de ADN no metiladas que tienen en común una citosina que precede a una guanosina, flanqueada por dos purinas 5' y dos pirimidinas 3'. En su forma no metilada, se ha demostrado que estos motivos de ADN son estimuladores potentes de varios tipos de células inmunitarias.

Los vectores se pueden suministrar de una manera dirigida. Las técnicas de suministro de ADN mediadas por receptores se describen en, por ejemplo, las referencias 97 a 102. Las composiciones terapéuticas que contienen un ácido nucleico se administran en un intervalo de aproximadamente 100 ng a aproximadamente 200 mg de ADN para la administración local en un protocolo de terapia génica. Los intervalos de concentración de aproximadamente 500 ng a aproximadamente 50 mg, de aproximadamente 1 ^g a aproximadamente 2 mg, de aproximadamente 5 ^g a aproximadamente 500 ^g y de aproximadamente 20 ^g a aproximadamente 100 ^g de ADN también se pueden utilizar durante un protocolo de terapia génica. Los factores tales como el procedimiento de acción (por ejemplo, para potenciar o inhibir los niveles del producto génico codificado) y la eficacia de transformación y expresión son consideraciones que afectarán la dosificación necesaria para la eficacia definitiva. Cuando se desea una mayor expresión en un área de tejido más grande, se pueden precisar cantidades más grandes del vector o las mismas cantidades administradas de nuevo en un protocolo sucesivo de administraciones, o varias administraciones a diferentes partes de tejido adyacentes o cercanas para obtener un resultado terapéutico positivo. En todos los casos, la experimentación de rutina en ensayos clínicos determinará los intervalos específicos para un efecto terapéutico óptimo.

Los vectores se pueden suministrar utilizando vehículos de suministro génico. El vehículo de suministro génico puede ser de origen vírico o no vírico (véase, en general, las referencias 103 a 106).

Los vectores basados en virus para el suministro de un ácido nucleico deseado y la expresión en una célula deseada son bien conocidos en la técnica. Los vehículos basados en virus ejemplares incluyen, pero sin limitación, retrovirus recombinantes (por ejemplo, las referencias 107 a 117), vectores basados en alfavirus (por ejemplo, vectores de virus Sindbis, virus del bosque Semliki (ATCC VR-67; ATCC VR-1247), virus del Río Ross (ATCC VR-373; ATCC VR-1246) y virus de encefalitis equina venezolana (ATCC Vr -923; ATCC v R-1250; ATCC VR 1249; ATCC VR-532); los híbridos o quimeras de estos virus también se pueden utilizar), vectores de poxvirus (por ejemplo, virus de la variolovacuna, viruela aviar, viruela del canario, virus de la variolovacuna de Ankara modificado, etc.), vectores de adenovirus y vectores de virus adeno-asociados (AAV) (por ejemplo, véanse las referencias 118 a 123). También se puede emplear la administración de ADN unido a adenovirus inactivado [124].

También se pueden emplear vehículos y procedimientos de suministro no víricos que incluyen, pero sin limitación, ADN condensado, policatiónico unido o no unido a adenovirus inactivados solos [por ejemplo, 124], ADN unido a ligando [125], células de vehículos de suministro de células eucarióticas [por ejemplo, referencias 126 a 130] y neutralización de cargas nucleicas o fusión con membranas celulares. El ADN desnudo también se puede emplear. Los procedimientos ejemplares de introducción de ADN desnudo se describen en las referencias 131 y 132. Los liposomas (por ejemplo, inmunoliposomas) que pueden actuar como vehículos de suministro génico se describen en las referencias 133 a 137. Se describen estrategias adicionales en las referencias 138 y 139.

El suministro no vírico adicional que es adecuado para el uso incluye sistemas de suministro mecánicos tal como la estrategia descrita en la referencia 139. Por otra parte, la secuencia codificante y el producto de expresión de ésta se pueden suministrar a través de la deposición de materiales de hidrogel fotopolimerizado o el uso de radiación ionizante [por ejemplo, referencias 140 y 141]. Otros procedimientos convencionales para el suministro de genes que se pueden utilizar para el suministro de la secuencia codificante incluyen, por ejemplo, el uso de una pistola de partículas de mano para la transferencia de genes [144] o el uso de radiación ionizante para activar los genes transferidos [140 y 141].

El suministro de ADN utilizando micropartículas de PLG {poli(lactida-co-glicólido)} es un procedimiento particularmente preferido, por ejemplo, mediante la adsorción a las micropartículas, las cuales son tratadas opcionalmente para tener una superficie con carga negativa (por ejemplo, tratadas con SDS) o una superficie con carga positiva (por ejemplo, tratadas con un detergente catiónico, tal como CTAB).

Procedimientos de tratamiento y administración de la vacuna

En el presente documento se desvela un procedimiento para generar una respuesta inmunitaria en un mamífero, que comprende la etapa de administrar una cantidad eficaz de una composición inmunogénica de la invención. La respuesta inmunitaria es preferentemente protectora e implica preferentemente inmunidad mediada por anticuerpos y/o células. El procedimiento puede provocar una respuesta de refuerzo.

La invención también proporciona polipéptidos híbridos para su uso como un medicamento, por ejemplo, para su uso para provocar una respuesta inmunitaria en un mamífero.

La invención también proporciona el uso de polipéptidos híbridos en la fabricación de un medicamento para provocar una respuesta inmunitaria en un mamífero.

Al provocar una respuesta inmunitaria en el mamífero mediante estos usos y procedimientos, el mamífero puede protegerse contra una enfermedad y/o infección causada por GBS, por ejemplo, contra la meningitis.

En el presente documento se desvela un dispositivo de suministro llenado previamente con una composición inmunogénica de la invención.

El mamífero es preferentemente un ser humano. El ser humano puede ser un niño (por ejemplo, un niño pequeño o lactante), un adolescente o un adulto. Una vacuna destinada a niños también se puede administrar a adultos, por ejemplo, para evaluar la seguridad, dosificación, inmunogenicidad, etc.

Una forma de verificar la eficacia de un tratamiento terapéutico involucra el seguimiento de una infección con neumococos después de la administración de las composiciones de la invención. Una forma de verificar la eficacia del tratamiento profiláctico implica analizar los sueros pos-inmunización en pruebas convencionales; por ejemplo, los sueros se pueden analizar en un ensayo de destrucción opsonofagocítico (OPKA, por sus siglas del inglés opsonophagocytic killing assay), indicando la capacidad de opsonisar bacterias la eficacia de protección. Otra forma de verificar la eficacia del tratamiento profiláctico implica una exposición pos-inmunización en un modelo animal de infección por GBS, por ejemplo, cobayas o ratones. Un modelo de ese tipo se describe en la referencia 143. Otra forma de evaluar la inmunogenicidad de las composiciones de la presente invención es expresar los polipéptidos de manera recombinante para explorar sueros o secreciones de las mucosas de pacientes por inmunotransferencia y/o micromatrices. Una reacción positiva entre el polipéptido y la muestra del paciente indica que el paciente ha montado una respuesta inmunitaria frente al polipéptido en cuestión. Este procedimiento también se puede utilizar para identificar antígenos inmunodominantes y/o epítopos dentro de los antígenos.

Las composiciones de la invención se administrarán en general directamente a un paciente. El suministro directo se puede llevar a cabo mediante inyección parenteral (por ejemplo, por vía subcutánea, intraperitoneal, intravenosa, intramuscular o al espacio intersticial de un tejido) o por vía mucosa, tal como mediante la administración rectal, oral (por ejemplo, comprimido, pulverización), vaginal, tópica, transdérmica o transcutánea, intranasal, ocular, ótica, pulmonar u otra administración a las mucosas.

La invención se puede utilizar para suscitar inmunidad sistémica y/o de las mucosas, preferentemente para suscitar una inmunidad sistémica y/o de las mucosas potenciada.

Preferentemente, la inmunidad sistémica y/o de las mucosas potenciada se refleja en una respuesta inmunitaria de TH1 y/o TH2 potenciada. Preferentemente, la respuesta inmunitaria potenciada incluye un incremento en la producción de IgG1 y/o IgG2a, y/o IgA.

La dosificación puede ser mediante una pauta de dosis individuales o un programa de dosis múltiples. Las dosis múltiples se pueden utilizar en una pauta de inmunización primaria y/o en una pauta de inmunización de refuerzo. En una pauta de múltiples dosis, las diversas dosis se pueden proporcionar por las mismas rutas o por rutas diferentes, por ejemplo, una primera dosis parenteral y una dosis de refuerzo a las mucosas, una primera dosis a las mucosas y una dosis de refuerzo parenteral, etc. Múltiples dosis se administrarán normalmente al menos con 1 semana de separación (por ejemplo, aproximadamente 2 semanas, aproximadamente 3 semanas, aproximadamente 4 semanas, aproximadamente 6 semanas, aproximadamente 8 semanas, aproximadamente 10 semanas, aproximadamente 12 semanas, aproximadamente 16 semanas, etc.).

Las vacunas preparadas de acuerdo con la invención se pueden utilizar para tratar tanto a niños como a adultos. De esta manera, un paciente humano puede ser menor de 1 año de edad, menor de 5 años de edad, de 1-5 años de edad, de 5 15 años de edad, de 15 a 55 años de edad o al menos de 55 años de edad. Los pacientes preferidos para recibir las vacunas son los pacientes ancianos (por ejemplo, >50 años de edad, >60 años de edad y preferentemente >65 años de edad), los jóvenes (por ejemplo, <5 años de edad), pacientes hospitalizados, trabajadores sanitarios, personas de cualquier órgano militar y personal militar, mujeres embarazadas, enfermos crónicos o inmunodeficientes. En general, las vacunas se pueden utilizar para tratar a mujeres embarazadas y a adolescentes. Sin embargo, las vacunas no son adecuadas solamente para esos grupos y se pueden utilizar de manera más general en una población.

Las vacunas producidas mediante la invención se pueden administrar a pacientes sustancialmente al mismo tiempo que (por ejemplo, durante la misma consulta médica o visita a un profesional sanitario o centro de vacunación) otras vacunas, por ejemplo, sustancialmente al mismo tiempo que una vacuna contra la rubéola, vacuna contra varicela, vacuna contra difteria, vacuna antitetánica, vacuna contra la tos ferina, vacuna contra DTT, vacuna contra poliovirus inactivada, vacuna contra virus de la hepatitis B, vacuna conjugada contra meningococo (tal como una vacuna tetravalente A-C-W135-Y), vacuna contra virus respiratorio sincitial, vacuna contra virus del papiloma humano, vacunas contra virus de la gripe (que incluyen una vacuna contra virus de la gripe pandémico), etc.

Las vacunas de la invención también se pueden administrar a pacientes sustancialmente al mismo tiempo que (por ejemplo, durante la misma consulta médica o visita a un profesional sanitario) un compuesto antivírico y en particular un compuesto antiviral que es activo contra el virus de la gripe (por ejemplo, oseltamivir y/o zanamivir). Estos antivirales incluyen inhibidores de la neuraminidasa, tales como el ácido (3R,4R,5S)-4-acetilamino-5-amino-3(1-etilpropoxi)-1-ciclohexen-1-carboxílico o el ácido 5-(acetilamino)-4-[(aminoiminometil)-amino]-2,6-anhidro-3,4,5-tridesoxi-D-glicero-D-galactonon-2-enónico, incluyendo ésteres de los mismos (por ejemplo, los ésteres etílicos) y sales de los mismos (por ejemplo, las sales de fosfato). Un antiviral preferido es el ácido (3R,4R,5S)-4-acetilamino-5-amino-3(1-etilpropoxi)-1-ciclohexen-1-carboxílico, éster etílico, fosfato (1:1), también conocido como fosfato de oseltamivir (TAMIFLUMR).

Combinaciones

Una composición útil para la inmunización comprende un polipéptido híbrido de la invención. Además, una composición puede incluir: (i) uno o más polipéptidos adicionales que suscitan respuestas de anticuerpos contra proteínas de GBS, particularmente contra proteínas de GBS diferentes de GBS59; (ii) un sacárido capsular de GBS; y/o (iii) uno o más inmunógenos adicionales que suscitan respuestas de anticuerpos que reconocen epítopos de organismos diferentes de GBS.

Combinaciones con antígenos de polipéptido adicionales [1441

Los polipéptidos híbridos de la invención se pueden combinar con uno o más (es decir 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o los 10) antígenos de polipéptido seleccionados del grupo que consiste en: (1) un antígeno (GBS80); (2) un antígeno de GBS67; (3) un antígeno de GBS1523; (4) un antígeno de g Bs 104; (5) un antígeno de GBS1524; (6) un antígeno de GBS3; (7) un antígeno de SAN1483; (8) un antígeno de GBS147; (9) un antígeno de GBS328; y/o (10) un antígeno de GBS84.

Estos antígenos adicionales se pueden agregar como polipéptidos separados. Como una alternativa, se pueden agregar como híbridos, por ejemplo, un híbrido GBS80-GBS1523. Como una alternativa adicional, se pueden fusionar al polipéptido híbrido de GBS59, por ejemplo, un híbrido de GBS59-GBS80.

Cualquiera de estas combinaciones también puede incluir uno o más sacáridos capsulares de GBS que se conjugarán normalmente con proteína(s) transportadora(s). La información adicional acerca de tales sacáridos y la conjugación se proporciona a continuación.

GBS80

La secuencia original de 'GBS80' (SAG0645) se anotó en la referencia 145 como una proteína de la familia de anclajes de superficie de la pared celular (véase GI: 22533660). A fines de referencia, la secuencia de aminoácidos de GBS80 de longitud completa encontrada en la cepa 2603 se proporciona en el presente documento como la SEQ ID NO: 177. Los polipéptidos de GBS80 preferidos para el uso con la invención comprenden una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 60 % o más de identidad (por ejemplo, el 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 177; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 177, en los que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas de GBS80 incluyen variantes de la SEQ ID NO: 177.

Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 177. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo Cy/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N de la s Eq ID NO: 177 mientras retengan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 177. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteína.

El GBS80 de tipo silvestre contiene una región de secuencia líder o señal N-terminal en los aminoácidos 1-37 de la SEQ ID NO: 177. Uno o más aminoácidos de la región de secuencia líder o señal de GBS80 se puede eliminar, por ejemplo, la SEQ ID NO: 178. La secuencia de tipo silvestre también contiene una región transmembrana C-terminal en los aminoácidos 526-543 de la SEQ ID NO: 177. Uno o más aminoácidos de la región transmembrana y/o una región citoplasmática se pueden eliminar, por ejemplo, la SEQ ID NO: 179. El GBS80 de tipo silvestre contiene un motivo de aminoácidos indicativo de un anclaje de pared celular en los aminoácidos 521-525 de la SEQ ID NO: 177. En algunos sistemas de células hospedadoras recombinantes, puede ser útil eliminar este motivo para facilitar la secreción de un polipéptido GBS80 recombinante de la célula hospedadora. De esta manera, las regiones transmembrana y/o citoplasmáticas y el motivo de anclaje de pared celular se pueden eliminar de GBS80, por ejemplo, la SEQ ID NO: 180. Alternativamente, en algunos sistemas de células hospedadoras recombinantes, puede ser útil usar el motivo de anclaje de pared celular para anclar el polipéptido expresado de manera recombinante a la pared celular. El dominio extracelular del polipéptido expresado puede escindirse durante la purificación o el polipéptido recombinante puede dejarse unido a ya sea células hospedadoras inactivadas o a membranas celulares en la composición final, por ejemplo, la SEQ ID NO: 181. Un fragmento particularmente inmunogénico del GBS80 de tipo silvestre está localizado hacia el extremo N del polipéptido, y es la SEQ ID NO: 182.

GBS67

La secuencia original de 'GBS67' (SAG1408) se anotó en la referencia 145 como una proteína de la familia de anclajes de superficie de la pared celular (véase GI: 22534437). A fines de referencia, la secuencia de aminoácidos de GBS67 de longitud completa encontrada en la cepa 2603 se proporciona en el presente documento como la SEQ ID NO: 183. Los polipéptidos de GBS67 preferidos para el uso con la invención comprenden una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 60 % o más de identidad (por ejemplo, el 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 183; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 183, en los que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas de GBS67 incluyen variantes de la SEQ ID No : 183. Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 183. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N de la s Eq ID NO: 183 mientras retengan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 183. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteína.

El GBS67 de tipo silvestre contiene una región transmembrana en el extremo C que se puede eliminar, por ejemplo, para proporcionar la SEQ ID NO: 184. También contiene motivos de aminoácidos indicativos de un anclaje de pared celular (LPXTG e IPMTG). En algunos sistemas de células hospedadoras recombinantes, puede ser preferible eliminar este motivo para facilitar la secreción a partir de la célula hospedadora. Por consiguiente, en un fragmento preferido de GBS67 para su uso en la invención, el motivo transmembrana y de anclaje a pared celular se eliminan (SEQ ID NO: 185). Alternativamente, en algunos sistemas de células hospedadoras recombinantes, puede ser preferible utilizar el motivo de anclaje de pared celular para anclar el polipéptido expresado de forma recombinante a la pared celular. El dominio extracelular del polipéptido expresado puede escindirse durante la purificación o el polipéptido recombinante puede dejarse unido ya sea a células hospedadoras inactivadas o membranas celulares en la composición final.

Se han sido identificado en GBS67 tres motivos de pilina, que contienen restos de lisina conservados. Los restos de lisina conservados están en los restos de aminoácido 478 y 488, en los restos de aminoácido 340 y 342 y en los restos de aminoácido 703 y 717. Se piensa que las secuencias de pilina, en particular los restos de lisina conservados, son importantes para la formación de estructuras de tipo pilosidades, oligoméricas, de GBS67. Los fragmentos preferidos de GBS67 incluyen al menos un resto de lisina conservado. También se han identificado en GBS67 dos cajas de E que contienen restos de glutámico conservados. Los fragmentos preferidos de GBS67 incluyen al menos un resto de ácido glutámico conservado. El GBS67 contiene varias regiones predichas que forman estructuras de hélice alfa. Es probable que tales regiones de hélice alfa formen estructuras de superhélice y pueden estar involucradas en la oligomerización de GBS67. El GBS67 también contiene una región que es homóloga al dominio Cna_B de la proteína de superficie de unión a colágeno de S. aureus (pfam05738). Esta puede formar una estructura de sándwich beta. El GBS67 contiene una región que es homóloga a un dominio de tipo A del factor von Willebrand (vWF), que también puede estar retenido en los fragmentos de GBS67.

Los fragmentos particularmente inmunogénicos de GBS67 de tipo silvestre de la cepa 2603 están localizados hacia el extremo N del polipéptido y son la SEQ ID NO: 186 y la SEQ ID NO: 187.

En la cepa H36B existe una variante de GBS67 (SAI1512). Esta secuencia de 'GBS67' variante (SAG1408) se anotó en la referencia 146 como una proteína de la familia de anclajes de superficie de la pared celular (véase GI: 77405751). A fines de referencia, la secuencia de aminoácidos de GBS67 de longitud completa encontrada en la cepa H36B se proporciona en el presente documento como la SEQ ID NO: 188. Los polipéptidos de GBS67 preferidos para el uso con la invención comprenden una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 60 % o más de identidad (por ejemplo, el 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 188; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 188, en los que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 188. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N de la s Eq ID NO: 188 mientras retengan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 188. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteína.

La invención incluye el uso de fragmentos de GBS67 de la cepa H36B que son análogos a los fragmentos de GBS67 de la cepa 2603 analizados en detalle anteriormente, por ejemplo, que carecen de la región transmembrana del extremo C, que carecen de la región transmembrana y/o del motivo de anclaje de pared celular (LPXTG e IPMTG), que contienen motivos de pilina conservados o restos de lisina dentro de los motivos de pilina, que contienen restos de ácido glutámico conservados, regiones de hélice alfa, el dominio Cna_B y/o el dominio de tipo A de (vWF). Los fragmentos particularmente inmunogénicos de GBS67 de tipo silvestre de la cepa H36B están localizados hacia el extremo N del polipéptido y son la SEQ ID NO: 189 y la SEQ ID NO: 190.

En las cepas CJB111, 515, NEM316, DK21 y CJB110 también existen variantes de GBS67. A fines de referencia, las secuencias de aminoácidos de GBS67 de longitud completa como se encuentra en las cepas CJB111, 515, NEM316, DK21 y CJB110 se proporcionan en el presente documento como las SEQ ID NO: 191, 194, 197, 200 y 203. Los polipéptidos de GBS67 preferidos para su uso con la invención comprenden una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 60 % o más de identidad (por ejemplo, el 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con las SEQ ID NO: 191,192, 193, 194 o 195; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de las SEQ ID NO: 191, 194, 197, 200 y 203, en los que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de las SEQ ID NO: 191, 194, 197, 200 o 203. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) de del extremo N de las SEQ ID NO: 191, 194, 197, 200 o 203 mientras que conservan al menos un epítopo de las SEQ ID NO: 191, 194, 197, 200 o 203. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteína.

La invención incluye el uso de fragmentos de GBS67 de las cepas CJB111, 515, NEM316, DK21 y CJB110 que son análogos a los fragmentos de GBS67 de la cepa 2603 analizados en detalle anteriormente, por ejemplo, que carecen de la región transmembrana del extremo C, que carecen de la región transmembrana y/o el motivo de anclaje de pared celular (LPXTG e IPMTG), que contienen motivos de pilina conservadas o restos de lisina dentro de las motivos de pilina, que contienen restos de ácido glutámico conservados, regiones de hélice alfa, el dominio Cna_B y/o el dominio de tipo A de (vWF). Los fragmentos particularmente inmunogénicos de GBS67 de tipo silvestre de las CJB111,515, NEM316, DK21 y CJB110 están localizados hacia el extremo N del polipéptido y son la SEQ ID NO: 192 y la SEQ iD NO: 193 (CJB111), la SEQ ID NO: 195 y la SEQ ID NO: 196 (515), la SEQ ID NO: 198 y la SEQ ID NO: 199 (NEM316), la SEQ ID NO: 201 y la SEQ ID NO: 202 (DK21), y la SEQ ID NO: 204 y la SEQ ID NO: 205 (CJB110).

GBS1523

La secuencia original de 'GBS1523' (SAN1518; Spbl) se anotó en la referencia 146 como una proteína de la familia de anclajes de superficie de la pared celular (véase Gl: 77408651). A fines de referencia, la secuencia de aminoácidos de GBS1523 de longitud completa como se encuentra en la cepa COH1 se proporciona en el presente documento como la SEQ ID NO: 206. Los polipéptidos de GBS1523 preferidos para su uso con la invención comprenden una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene 60 % o más de identidad (por ejemplo, el 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 206; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 206, en los que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas de GBS1523 incluyen variantes de la SEQ ID NO: 206. Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 206. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N de la SEQ ID NO: 206 mientras que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 206. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteína.

El GBS1523 de tipo silvestre contiene una región de secuencia líder o señal N-terminal en los aminoácidos 1 a 29 de la SEQ ID NO: 206 que puede eliminarse en los fragmentos, por ejemplo, la SEQ ID NO: 207. La secuencia de tipo silvestre contiene un motivo de aminoácidos indicativo de anclaje a pared celular (LPSTG) en los aminoácidos 468-472 de la SEQ ID NO: 206. En algunos sistemas de células hospedadoras recombinantes, puede ser preferible eliminar este motivo para facilitar la secreción de un polipéptido recombinante a partir de la célula. Alternativamente, puede ser preferible utilizar el motivo de anclaje de pared celular para anclar el polipéptido expresado de forma recombinante a la pared celular. El dominio extracelular del polipéptido expresado puede escindirse durante la purificación o el polipéptido recombinante puede dejarse unido a las células hospedadoras inactivadas o membranas celulares en la composición final. También se ha identificado en los aminoácidos 419-429 de la SEQ ID NO: 206 una caja de E que contiene un resto de glutámico conservado, con un ácido glutámico conservado en el resto 423. El motiva de caja de E puede ser importante para la formación de estructuras de tipo pilosidades, oligoméricas y de esta manera los fragmentos útiles de GBS1523 pueden incluir el resto de ácido glutámico conservado. Se ha identificado un mutante de GBS1523 en el cual la glutamina (Q) en la posición 41 de la SEQ ID NO: 206 está sustituida por una lisina (K), como resultado de una mutación de un codón en la secuencia de nucleótidos codificante de CAA a AAA. Esta sustitución puede estar presente en las secuencias de GBS1523 y los fragmentos de GBS1523 (por ejemplo, la SEQ ID NO: 208).

Cuando las composiciones incluyen tanto GBS80 como GBS1523, se puede utilizar un polipéptido híbrido. Los ejemplos de híbridos de GBS80-GBS1523 se encuentran en la referencia 147 e incluyen los polipéptidos de las SEQ ID NO: 209 212.

GBS104

La secuencia original de 'GBS104' (SAG0649) se anotó en la referencia 145 como una ‘proteína de la familia de anclajes de superficie de la pared celular' (véase GI: 22533664). A fines de referencia, la secuencia de aminoácidos de GBS104 de longitud completa como se encuentra en la cepa 2603 se proporciona en el presente documento como la SEQ ID NO: 213. Los polipéptidos de GBS104 preferidos para su uso con la invención comprenden una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 60 % o más de identidad (por ejemplo, el 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la s Eq ID NO: 213; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos ‘n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID n O: 213, en los que ‘n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas de GBS104 incluyen variantes de la Se Q ID NO: 213. Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 213. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N de la SEQ ID NO: 213 mientras que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 213. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteína.

GBS1524

A fines de referencia, la secuencia de aminoácidos de GBS1524 de longitud completa se proporciona en el presente documento como la SEQ ID NO: 214. Los polipéptidos de GBS1524 preferidos para su uso con la invención comprenden una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 60 % o más de identidad (por ejemplo, el 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 214; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos ‘n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 214, en los que ‘n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas de GBS1524 incluyen variantes de la SEQ ID NO: 214. Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 214. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N de la SEQ ID NO: 214 mientras que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 214. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteína.

GBS3

La secuencia original de ‘GBS3' (SAG2603; BibA) se anotó en la referencia 145 como ‘una proteína de patogenicidad' (véase GI:22535109). A fines de referencia, la secuencia de aminoácidos de GBS3 de longitud completa como se encuentra en la cepa 2603 se proporciona en el presente documento como la SEQ ID NO: 215. Los polipéptidos de GBS3 preferidos para su uso con la invención comprenden una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 60 % o más de identidad (por ejemplo, el 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99%, 99,5% o más) con la SEQ ID NO: 215; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos ‘n' aminoácidos consecutivos de la s Eq ID NO: 215, en los que ‘n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas de GBS3 incluyen variantes de la SEQ iD NO: 215. Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 215. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N de la SEQ ID NO: 215 mientras que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 215. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteína.

GBS3 de tipo silvestre contiene una región de secuencia líder o señal N-terminal en los aminoácidos 1 a 36 de la SEQ ID NO: 215 que puede retirarse de los fragmentos, por ejemplo, la SEQ ID NO: 216. GBS3 también contiene un motivo de aminoácidos indicativo de un anclaje de pared celular (LPXTG), una región transmembrana y dominios citoplásmicos (véase la referencia 148. La región de secuencia líder o señal, los dominios transmembrana y citoplásmicos y el motivo de anclaje de pared celular se pueden eliminar todos de GBS3 para dejar un fragmento que comprende los segmentos de superhélice y ricos en prolina como se exponen posteriormente (SEQ ID NO: 217). Los fragmentos alternativos de GBS3 pueden comprender: la región de secuencia señal y el segmento de superhélice (SEQ ID NO: 218); el segmento de superhélice (SEQ ID NO: 219); o la región de secuencia señal, el segmento de superhélice y el segmento rico en prolina (SEQ ID NO: 220).

Las variantes de GBS3 existen en la cepa 515 (SAL2118), la cepa CJB111 (SAM1974) y la cepa COH1 (SAN2207). Las secuencias de aminoácidos de referencia para GBS3 de longitud completa en la cepa 515, la cepa CJB111 y la cepa COH1 se proporcionan en el presente documento como la SEQ ID No : 221, SEQ ID n O: 222 y SEQ ID NO: 223, respectivamente. De esta manera, los polipéptidos de GBS3 para su uso con la invención también pueden comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 60 % o más de identidad (por ejemplo, el 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 222 o SEQ ID NO: 223; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 222 o SEQ ID NO: 223, en los que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas de GBS3 incluyen variantes de la s Eq ID NO: 221, SEQ ID n O: 222 o SEQ iD NO: 223. Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 221, SeQ ID NO: 222 o SEQ ID NO: 223. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N de la SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 222 o SEQ ID NO: 223 mientras que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 221, SEQ ID n O: 222 o SEQ ID NO: 223. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteína.

La invención incluye el uso de fragmentos de GBS3 de las cepas 515, cjb111 y cohl que son análogos a fragmentos de GBS3 de la cepa 2603 discutidos en detalle anteriormente, por ejemplo, que carecen de la región de secuencia líder o señal N-terminal; que comprenden los segmentos de superhélice y ricos en prolina; que comprenden la región de secuencia señal y el segmento de superhélice; que comprenden el segmento de superhélice; o que comprenden la región de secuencia señal, el segmento de superhélice y el segmento rico en prolina.

SAN1485

La secuencia original de 'SAN1485' se anotó en la referencia 146 como una 'proteína de la familia de anclajes de superficie de la pared celular' (véase Gl: 77408233). A fines de referencia, la secuencia de aminoácidos de SAN1485 de longitud completa como se encuentra en la cepa COH1 se proporciona en el presente documento como la SEQ ID NO: 224. Los polipéptidos de SAN1485 preferidos para su uso con la invención comprenden una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 60 % o más de identidad (por ejemplo, el 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la s Eq ID NO: 224; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID n O: 224, en los que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas de SAN1485 incluyen variantes de la Se Q ID NO: 224. Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 224. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N de la SEQ ID NO: 224 mientras que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 224. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteína.

GBS147

La secuencia original de 'GBS147' (SAG0416) se anotó en la referencia 145 como 'una posible proteasa' (véase Gl:22533435). A fines de referencia, la secuencia de aminoácidos de GBS147 de longitud completa como se encuentra en la cepa 2603 se proporciona en el presente documento como la SEQ ID NO: 225. Los polipéptidos de GBS147 preferidos para su uso con la invención comprenden una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 60 % o más de identidad (por ejemplo, el 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99%, 99,5% o más) con la SEQ ID NO: 225 y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 225, en los que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas de GBS147 incluyen variantes de la SEQ ID NO: 225. Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 225. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N de la SEQ ID NO: 225 mientras que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 225.

GBS328

La secuencia de original 'GBS328' (SAG1333) se anotó en la referencia 145 como ‘proteína de la familia de 5'-nucleotidasa' (véase GI: 22534359). A fines de referencia, la secuencia de aminoácidos de GBS328 de longitud completa como se encuentra en la cepa 2603 se proporciona en el presente documento como la SEQ ID NO: 226. Los polipéptidos de GBS328 preferidos para su uso con la invención comprenden una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 60 % o más de identidad (por ejemplo, el 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 226; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos ‘n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 226, en los que ‘n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas de GBS328 incluyen variantes de la SEQ ID NO: 226. Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 226. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N de la SEQ ID NO: 226 mientras que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 226. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteína.

GBS84

La secuencia de original ‘GBS84' (SAG0907) se anotó en la referencia 145 como ‘una posible lipoproteína' (véase GI: 22533929). A fines de referencia, la secuencia de aminoácidos de GBS84 de longitud completa como se encuentra en la cepa 2603 se proporciona en el presente documento como la SEQ ID NO: 227. Los polipéptidos de GBS84 preferidos para su uso con la invención comprenden una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 60 % o más de identidad (por ejemplo, el 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 227; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos ‘n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 227, en los que ‘n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas de GBS84 incluyen variantes de la SEQ ID NO: 227. Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 227. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N de la SEQ ID NO: 227 mientras que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 227. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteína.

Combinaciones con sacáridos de GBS

Los polipéptidos híbridos de GBS59 se pueden combinar con uno o más sacáridos capsulares de GBS, que se conjugarán normalmente con proteína(s) transportadora(s). De esta manera, la invención proporciona una composición inmunogénica que comprende una combinación de:

(1) un polipéptido híbrido de GBS59 de la invención; y

(2) uno o más sacáridos capsulares de GBS.

Un sacárido utilizado en el componente (2) de esta combinación está presente idealmente como un conjugado que comprende una fracción de sacárido y una fracción de proteína transportadora. La fracción transportadora en el conjugado puede ser un polipéptido de GBS59 individual, un polipéptido de GBS59 híbrido, un polipéptido de GBS que nos sea de GBS59 o un polipéptido que no sea de GBS.

El sacárido es del sacárido capsular de GBS. El sacárido puede ser un polisacárido que tiene el tamaño que se produce durante la purificación del sacárido de la bacteria o puede ser un oligosacárido conseguido mediante la fragmentación de tal polisacárido.

Una composición puede incluir un sacárido capsular de uno o más de los siguientes serotipos estreptocócicos: Ia, Ib, Ia/c, II, III, IV, V, VI, VII y VIII. Una composición puede incluir múltiples serotipos, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 serotipos. Es útil la inclusión de un sacárido de uno o más de los serotipos Ia, Ib, II, III y V. Los sacáridos capsulares de cada uno de estos cinco serotipos incluyen: (a) un resto de ácido W-acetil-neuramínico (NeuNAc) terminal (denominado comúnmente como ácido siálico), que en todos los casos está unido 2 ^ 3 a un resto de galactosa; y (b) un resto de W-acetil-glucosamina (GlcNAc) dentro del núcleo de trisacárido.

Los sacáridos utilizados de acuerdo con la invención pueden estar en su forma nativa o pueden haberse modificado. Por ejemplo, el sacárido puede ser más corto que el sacárido capsular nativo o puede estar modificado químicamente. Por ejemplo, el sacárido puede ser des-O-acetilado (parcial o completamente), des-N-acetilado (parcial o completamente) o N-propionado (parcial o completamente), etc. La des-acetilación puede producirse antes, durante o después de la conjugación, pero se produce preferentemente antes de la conjugación. Dependiendo del sacárido particular, la desacetilación puede afectar o no a la inmunogenicidad. La importancia de la O-acetilación en los sacáridos de GBS en diversos serotipos se analiza en la referencia 1549, y en algunas realizaciones, la O-acetilación de restos de ácido siálico en las posiciones 7, 8 y/o 9 se conserva antes, durante y después de la conjugación, por ejemplo, por protección/desprotección, por reacetilación, etc. Sin embargo, normalmente el sacárido de GBS utilizado en la presente invención no tiene sustancialmente O-acetilación de restos de ácido siálico en las posiciones 7, 8 y/o 9. El efecto de la des-acetilación etc. puede evaluarse mediante ensayos rutinarios. Otra modificación posible es la eliminación de restos de ácido siálico del sacárido, tales como ácidos siálicos terminales de cadena lateral [150]. En particular, cuando un sacárido capsular de serotipo V se utiliza en la invención, se puede modificar mediante la desialización como se describe en la referencia [150]. El sacárido capsular de serotipo V de GBS desialilado se puede preparar mediante el tratamiento del sacárido capsular de serotipo V de GBS purificado en condiciones ligeramente ácidas (por ejemplo, ácido sulfúrico 0,1 M a 80 °C durante 60 minutos) o mediante el tratamiento con neuraminidasa, como se describe en la referencia [150]. En otro ejemplo, los polisacáridos de longitud completa pueden despolimerizarse para proporcionar fragmentos más cortos para su uso con la invención, por ejemplo, mediante la hidrólisis en ácido suave, mediante calentamiento, mediante cromatografía por tamaños, etc. Se ha informado que la longitud de cadena afecta la inmunogenicidad de los sacáridos de GBS en conejos [151]. En particular, cuando un sacárido capsular de serotipo II y/o III se utiliza en la invención, se puede despolimerizar como se describe en la referencia 152. El presente documento describe una despolimerización parcial de los sacáridos capsulares de tipo II y tipo III mediante la escisión desaminativa suave a fragmentos antigénicos con restos de 2,5-anhidro-D-manosa terminales-reductores.

Los sacáridos capsulares se pueden purificar mediante técnicas conocidas, como se describe en las referencias en el presente documento, tal como la referencia 153. Un procedimiento típico comprende la extracción con una base, centrifugación, filtración, tratamiento con ARNasa/ADNasa, tratamiento con proteasa, concentración, cromatografía de exclusión por tamaños, ultrafiltración, cromatografía de intercambio aniónico y ultrafiltración adicional. Como una alternativa, se puede utilizar el procedimiento de purificación descrito en la referencia 154. Este procedimiento implica la extracción con una base, tratamiento con etanol/CaCh, precipitación de CTAB y re-solubilización.

Sin embargo, la invención no está limitada a sacáridos purificados a partir de fuentes naturales y los sacáridos se pueden obtener mediante otros procedimientos, tal como síntesis parcial o total.

Los sacáridos se conjugarán normalmente con una proteína transportadora. En general, la conjugación covalente de sacáridos con transportadores potencia la inmunogenicidad de los sacáridos ya que los convierte de antígenos independientes de T a antígenos dependientes de T, permitiendo de esta manera la sensibilización para la memoria inmunológica.

La conjugación de sacáridos de GBS se ha informado ampliamente, por ejemplo, véanse las referencias 155 a 162. El procedimiento típico de la técnica anterior para la conjugación de sacáridos de GBS comprende la aminación reductiva de un sacárido purificado para una proteína transportadora tal como un toxoide tetánico (TT) o CRM197 [156]. La aminación reductiva implica un grupo amina en la cadena lateral de un aminoácido en el transportador y un grupo aldehído en el sacárido. Como los sacáridos capsulares de GBS no incluyen un grupo aldehído en su forma natural, entonces éste se genera normalmente antes de la conjugación mediante oxidación (por ejemplo, oxidación de peryodato) de una porción de los restos de ácido siálico del sacárido [156, 163]. Se ha demostrado que las vacunas de conjugados para cada uno de los serotipos Ia, Ib, II, III y V de GBS preparadas de esta manera son seguras e inmunogénicas en seres humanos [164].

Las proteínas transportadoras preferidas son toxinas bacterianas, tales como las toxinas diftérica o tetánica, o toxoides o mutantes de los mismos. Estas se utilizan comúnmente en vacunas de conjugados. Una proteína transportadora en un conjugado puede ser o no uno de los antígenos de GBS59 de (1). Si no es un antígeno de GBS59 puede ser en cambio un antígeno de GBS diferente. En algunas realizaciones, sin embargo, el transportador no es un antígeno de GBS y puede ser, por ejemplo, una toxina o toxoide bacteriano.

Las proteínas transportadoras típicas son los toxoides diftérico o tetánico, o mutantes de los mismos. Los fragmentos de toxinas o toxoides también se pueden utilizar, por ejemplo, el fragmento C del toxoide tetánico [165]. El mutante CRM197 de toxina diftérica [166-169] es particularmente útil con la invención. Otras proteínas transportadoras, adecuadas incluyen el complejo de proteínas de membrana exterior de N. meningitidis [169], péptidos sintéticos [170,171], proteínas de choque térmico [172,173], proteínas de tos ferina [174,175], citocinas, [176], linfocinas [186], hormonas [186], factores de crecimiento, proteínas artificiales que comprenden múltiples epítopos de linfocitos T CD4+ humanos de diversos antígenos procedentes de patógenos [177], tal como N19 [178], la proteína D de H. influenzae [179-181], proteínas de captación de hierro [182], toxina A o B de C. difficile [183], exoproteína A recombinante de P. aeruginosa (rEPA) [184], etc.

Cuando una composición incluye más de un conjugado, cada conjugado puede utilizar la misma proteína transportadora o una proteína transportadora diferente.

En algunas realizaciones, un conjugado individual puede portar sacáridos de múltiples serotipos [185]. Usualmente, sin embargo, cada conjugado incluirá un sacárido de un único serotipo.

Los conjugados pueden tener transportador en exceso (p/p) o sacárido en exceso (p/p). En algunas realizaciones, un conjugado puede incluir pesos iguales de cada uno. Por ejemplo, se pueden utilizar conjugados con una relación de sacárido:proteína (p/p) de entre 1:5 y 5:1, en particular, relaciones entre 1:5 y 2:1.

La molécula transportadora puede conjugarse covalentemente al transportador directamente o a través de un enlazador. Las uniones directas a la proteína se pueden lograr mediante, por ejemplo, la aminación reductiva entre el sacárido y el transportador, como se describe en, por ejemplo, las referencias 186 y 187. Primero, puede ser necesario activar el sacárido, por ejemplo, mediante oxidación. Las uniones a través de un grupo enlazador se pueden hacer utilizando cualquier procedimiento conocido, por ejemplo, los procedimientos descritos en las referencias 188 y 189. Un tipo preferido de unión es un enlazador de ácido adípico, que se puede formar mediante el acoplamiento de un grupo -NH2 libre (por ejemplo, introducido a un glucano por aminación) con ácido adípico (utilizando, por ejemplo, activación de diimida) y luego el acoplamiento de una proteína al producto intermedio resultante de sacárido-ácido adípico [190,191]. Otro tipo preferido de unión es un enlazador de carbonilo, que se puede formar mediante la reacción de un grupo hidroxilo libre de un sacárido CDI [192, 193] seguido por la reacción con una proteína para formar una unión de carbamato. Otros enlazadores incluyen p-propionamido [194], nitrofenil-etilamina [195], haluros de haloacilo [196], uniones glucosídicas [197], ácido 6-aminocaproico [198], ADH [199], fracciones de C4a C12 [200], etc. También se puede utilizar condensación de carbodiimida [201].

Combinaciones con antígenos que no sean de GBS

Los polipéptidos híbridos de GBS59 se pueden utilizar en combinación con antígenos que no sean de GBS. De esta manera, la invención proporciona una composición inmunogénica que comprende una combinación de:

(1) un polipéptido híbrido; y

(2) uno o más antígenos seleccionados del grupo que consiste en: toxoide diftérico; toxoide tetánico; uno o más antígenos de tos ferina, antígeno de superficie del virus de la hepatitis B; un antígeno de poliovirus inactivado; un conjugado del antígeno de sacárido capsular del serogrupo C de Neisseria meningitidis; un conjugado del antígeno de sacárido capsular del serogrupo Y de Neisseria meningitidis; un conjugado del antígeno de sacárido capsular del serogrupo W135 de Neisseria meningitidis; un conjugado del antígeno de sacárido capsular del serogrupo A de Neisseria meningitidis; uno o más antígenos de la gripe; y uno o más antígenos de virus del papiloma humano.

El toxoide diftérico se puede obtener mediante el tratamiento (por ejemplo, utilizando formaldehído) de una toxina diftérica de Corynebacterium diphtheriae. Los toxoides diftéricos se desvelan con mayor detalle en, por ejemplo, el capítulo 13 de la referencia 202.

El toxoide tetánico se puede obtener mediante el tratamiento (por ejemplo, utilizando formaldehído) de una toxina tetánica de Clostridium tetani. Los toxoides tetánicos se desvelan con mayor detalle en el capítulo 27 de la referencia 202.

Los antígenos de tos ferina en vacunas son ya sea celulares (célula entera, Pw) o acelulares (Pa). La invención puede utilizar cualquier tipo de antígeno de tos ferina. La preparación de antígenos celulares de tos ferina está bien documentada (por ejemplo, véase el capítulo 21 de la referencia 202), por ejemplo, se puede obtener mediante la inactivación por calor del cultivo en fase I de B. pertussis. El(los) antígeno(s) acelular(es) de tos ferina comprende(n) antígenos purificados de B. pertussis específicos, ya sea purificados de la bacteria nativa o purificados después de la expresión en un hospedador recombinante. Es usual utilizar más de un antígeno acelular y de esta manera una composición puede incluir uno, dos o tres de los siguientes antígenos de B. pertussis bien conocidos y bien caracterizados: (1) toxina destoxificada de tos ferina (toxoide de tos ferina o 'PT') (2) hemaglutinina filamentosa ('FHA'); (3) pertactina (también conocida como la 'proteína de la membrana externa de 69 kiloDaltons'). La FHA y la pertactina pueden tratarse con formaldehído antes del uso de acuerdo con la invención. El PT puede destoxificarse mediante el tratamiento con formaldehído y/o glutaraldehído pero, como una alternativa para este procedimiento de destoxificación químico, puede ser un PT mutante en el cual la actividad enzimática se ha reducido mediante mutagénesis [203]. Los antígenos acelulares de tos ferina adicionales que se pueden utilizar incluyen fimbrias (por ejemplo, aglutinógenos 2 y 3).

El antígeno de superficie del virus de la hepatitis B (HBsAg) es el componente principal de la cápside del virus de la hepatitis B. Se produce convenientemente mediante expresión recombinante en una levadura, tal como Saccharomyces cerevisiae.

Los antígenos de poliovirus inactivado (IPV) se preparan a partir de virus producidos en un cultivo de células y luego inactivados (por ejemplo, utilizando formaldehído). Debido a que la poliomielitis puede ser provocada por uno de tres tipos de poliovirus, como se explica en el capítulo 24 de la referencia 202, una composición puede incluir tres antígenos de poliovirus: poliovirus de Tipo 1 (por ejemplo, cepa Mahoney), poliovirus de Tipo 2 (por ejemplo, cepa MEF-1) y poliovirus de Tipo 3 (por ejemplo, cepa Saukett).

Cuando una composición incluya uno de un toxoide diftérico, un toxoide tetánico o un antígeno acelular de tos ferina en el componente (2), entonces incluirá usualmente los tres, es decir, el componente (2) incluirá una combinación de D-T-Pa.

Cuando una composición incluya uno de un toxoide diftérico, un toxoide tetánico o un antígeno celular de tos ferina en el componente (2), entonces incluirá usualmente los tres, es decir, el componente (2) incluirá una combinación de D-T-Pw.

Los antígenos de virus del papiloma humano incluyen las proteínas de la cápside L1, las cuales se pueden ensamblar para formar estructuras conocidas como partículas similivíricas (VLP). Las VLP se pueden producir mediante la expresión recombinante de L1 en células de levadura (por ejemplo, en S. cerevisiae) o en células de insecto (por ejemplo, en células de Spodoptera, tal como S. frugiperda o en células de Drosophila). Para las células de levadura, los vectores plasmídicos pueden portar el(los) gen(es) de L1; para las células de insecto, los vectores de baculovirus pueden portar el(los) gen(es) de L1. Más preferentemente, la composición incluye las VLP de L1 de las cepas tanto HPV-16 como HPV-18. Se ha demostrado que esta combinación bivalente es altamente eficaz [204]. Además de las cepas HPV-16 y HPV-18, también es posible incluir las VLP de L1 de las cepas HPV-6 y HPV-11 para proporcionar una combinación tetravalente.

Los antígenos de la gripe pueden estar en la forma de la vacuna del virus de la gripe actual. Están disponibles actualmente diversas formas de vacunas del virus de la gripe (por ejemplo, véanse los capítulos 17 y 18 para la referencia [202]). Las vacunas se basan generalmente ya sea en virus vivos, virus inactivados, hemaglutinina recombinante o virosomas. Las vacunas inactivadas se pueden basar en viriones completos, viriones fraccionados o en antígenos de superficie purificados. El antígeno en las vacunas de la invención puede tomar la forma de un virus vivo o, más preferentemente, un virus inactivado. La vacuna puede ser, por ejemplo, una vacuna trivalente (por ejemplo, que incluye hemaglutinina de una cepa A/H1N1, una cepa A/H3N2 y una cepa B). En otras realizaciones, la vacuna es una vacuna monovalente (por ejemplo, que incluye hemaglutinina de una cepa A/H1N1 o una cepa A/H5N1). La vacuna puede tratarse con adyuvante (por ejemplo, con una emulsión de aceite en agua) o no tratarse con adyuvante.

Anticuerpos

Los anticuerpos contra antígenos de GBS se desvelan en el presente documento para la inmunización pasiva [205], por ejemplo, una combinación de anticuerpos para la administración simultánea, separada o secuencial, en la que la combinación incluye al menos dos de: (a) un anticuerpo que reconoce una primera secuencia de aminoácidos como se define anteriormente; (b) un anticuerpo que reconoce una segunda secuencia de aminoácidos como se define anteriormente; y/o (c) un anticuerpo que reconoce una tercera secuencia de aminoácidos como se define anteriormente.

Se desvela adicionalmente el uso de tales combinaciones de anticuerpos en terapia y el uso de tales combinaciones de anticuerpos en la fabricación de un medicamento. En el presente documento se describe también un procedimiento para tratar a un mamífero que comprende la etapa de administrar al mamífero una cantidad eficaz de tal combinación. Como se describe anteriormente para las composiciones inmunogénicas, estos procedimientos y usos permiten a un mamífero estar protegido contra la infección por GBS.

Los anticuerpos monoclonales que se pueden utilizar en conjunción con la invención incluyen 17C4/A3 y 4H11/B7, que se unen al fragmento expuesto en la superficie de D3 (clado 515) en los aminoácidos 411-436 (SEQ ID NO: 270). La cadena pesada de 4H11/B7 comprende los aminoácidos proporcionados en la SEQ ID NO: 263 y está codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 262. La cadena ligera de 4H11/B7 comprende los aminoácidos proporcionados en la SEQ ID NO: 265 y está codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 264. La cadena pesada de 17C4/A3 comprende los aminoácidos proporcionados en la SEQ ID NO: 267 y está codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 266. La cadena ligera de 17C4/A3 comprende los aminoácidos proporcionados en la SEQ ID NO: 269 y está codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 268.

Se desvelan adicionalmente anticuerpos con una identidad de secuencia significativa con 17C4/A3 y 4H11/B7, y moléculas de ácido nucleico que codifican tales anticuerpos. Por ejemplo, anticuerpos que tienen una cadena pesada con más del 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 % de identidad de secuencia con la cadena pesada de 4H11/B7 (Se Q ID NO: 263) y/o que tienen una cadena ligera con más del 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 % de identidad de secuencia con la cadena ligera de 4H11/B7 (SEQ ID NO: 265). Los anticuerpos que tienen una cadena pesada con más del 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 % de identidad de secuencia con la cadena pesada de 17C4/A3 (SEQ ID NO: 267) y/o que tienen una cadena ligera con más del 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 % de identidad de secuencia con la cadena ligera de 17C4/A3 (SEQ ID NO: 269), también se describen en el presente documento, como lo son moléculas de ácido nucleico con más del 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 % de identidad de secuencia con las SEQ ID NO: 262, 264, 266 o 268.

Estas secuencias de anticuerpos son secuencias de longitud completa. El experto en la materia podría utilizar los dominios variables o específicamente las regiones CDR de estos anticuerpos para generar anticuerpos alternativos tales como anticuerpos humanizados.

El término “anticuerpo” incluye moléculas de inmunoglobulina intactas, así como también fragmentos de las mismas que son capaces de unirse a un antígeno. Estas incluyen moléculas de anticuerpos híbridas (quiméricas) [206, 207]; fragmentos F(ab')2 y F(ab) y moléculas Fv; heterodímeros no covalentes [208, 209]; moléculas de Fv de monocatenario (sFv) [210]; construcciones de fragmentos de anticuerpo diméricas y triméricas; minicuerpos [211, 212]; moléculas de anticuerpos humanizados [213-215]; y cualquier fragmento funcional obtenido de estas moléculas, así como anticuerpos obtenidos a través de procedimientos no convencionales tal como la presentación en fagos. Preferentemente, los anticuerpos son anticuerpos monoclonales. Los procedimientos para obtener anticuerpos monoclonales son bien conocidos en la técnica. Se prefieren los anticuerpos humanizados o completamente humanos.

General

La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique de otra manera, procedimientos convencionales de química, bioquímica, biología molecular, inmunología y farmacología, dentro de la experiencia en la técnica. Dichas técnicas se explican completamente en la bibliografía. Véanse, por ejemplo, las referencias 216-223, etc.

La numeración “GI” se utiliza anteriormente. Un número GI, o “Identificador de GenInfo”, es una serie de dígitos asignados consecutivamente a cada registro de secuencia procesado por el NCBI cuando se agregan secuencias a sus bases de datos. El número GI no se asemeja al número de referencia del registro de secuencia. Cuando se actualiza una secuencia (por ejemplo, para la corrección o para agregar más anotación o información) recibe un nuevo número GI. De esta manera, la secuencia asociada con un número GI determinado nunca se cambia.

Cuando la invención se refiere a un “epítopo”, este epítopo puede ser un epítopo de linfocitos B y/o un epítopo de linfocitos T. Dichos epítopos se pueden identificar empíricamente (por ejemplo, utilizando PEPSCAN [224,225] o procedimientos similares) o se pueden predecir (por ejemplo, utilizando el índice antigénico de Jameson-Wolf [226], estrategias basadas en matrices [227], MAPITOPE [228], TEPITOPE [229,230], redes neuronales [231], OptiMer y EpiMer [232, 233], ADEPT [234], Tsites [235], hidrofilicidad [236], índice antigénico [237] o los procedimientos desvelados en las referencias 238-242, etc.). Los epítopos son las partes de un antígeno que son reconocidas por y se unen a los sitios de unión a antígenos de anticuerpos o receptores de linfocitos T, y también pueden denominarse “determinantes antigénicos”.

La expresión “que comprende” abarca “que incluye” así como también “que consiste”, por ejemplo, una composición “que comprende” X puede consistir exclusivamente en X o puede incluir algo adicional, por ejemplo, X Y.

La palabra “sustancialmente” no excluye “completamente”, por ejemplo, una composición que está “sustancialmente exenta” de Y puede estar completamente exenta de Y. Cuando sea necesario, la palabra “sustancialmente” puede omitirse de la definición de la invención.

El término “aproximadamente”, con respecto a un valor numérico x, es opcional y significa, por ejemplo, x+10 %.

A menos que se establezca específicamente, un procedimiento que comprende una etapa de mezcla de dos o más componentes no requiere ningún orden específico de mezclado. De esta manera, los componentes se pueden mezclar en cualquier orden. Cuando existen tres componentes, entonces dos componentes se pueden combinar entre sí y luego la combinación se puede combinar con el tercer componente, etc.

Los anticuerpos serán generalmente específicos para su objetivo. De esta manera, tendrán una afinidad más alta por la diana que por una proteína de control irrelevante, tal como la seroalbúmina bovina.

Las referencias a un porcentaje de identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos significan que, cuando se alinean, ese porcentaje de aminoácidos son los mismos en la comparación de las dos secuencias. Este alineamiento y el porcentaje de homología o identidad de secuencia se puede determinar utilizando programas informáticos conocidos en la técnica, por ejemplo, los descritos en la sección 7.7.18 de la referencia 243. Un alineamiento preferido se determina mediante el algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman, utilizando una búsqueda de huecos afines con una penalización por apertura de hueco de 12 y una penalización por extensión de hueco de 2, matriz BLOSUM de 62. El algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman se desvela en la referencia 244.

Breve descripción de los dibujos

Figuras 1: (A) alineamiento por pares entre RrgB de S. pneumoniae y la variante 515 de BP-2a de S. agalactiae; (B) Modelo de la variante 515 de BP-2a.

Figuras 2: Identificación de enlaces isopeptídicos internos mediante espectrometría de masas MALDI TOF. La proteína recombinante variante 515 de BP-2a se corrió en una SDS-PAGE de acrilamida al 4-12 %. La proteína se digirió “en gel” con Lys-C. Los péptidos producidos mediante la digestión se analizaron directamente mediante espectrometría de masas MALDI TOF (panel superior) o se modificaron con O-metilisourea antes del análisis (panel inferior). Se observaron las señales las señales para los péptidos enlazados por isopéptidos en el dominio D4 (A), D2 (B) y D3 (C).

( ♦ ) Producto de autodigestión con tripsina. (*) Pico no identificado.

Figura 3: (A) SDS-PAGE de la variante 515 de BP-2a recombinante purificada con (TS) y sin enlaces isopeptídicos (AIB). (B) Ensayo de opsonofagocitosis de antisueros de ratones producidos contra la variante 515 de BP-2a con (TS) y sin enlaces isopeptídicos (AIB).

Figuras 4: (A) Representación esquemática de cuatro dominios de la variante 515 de BP-2a; (B) Análisis por FACS en la cepa de GBS 515 con sueros de ratón producidos contra cada dominio de BP-2a; (C) Ensayo de opsonofagocitosis con sueros de ratón producidos contra cada dominio de la variante 515 de BP-2a.

Figuras 5: (A) Superposición de las variantes 515 y H36B. El mejor modelo para la variante H36B (SAI_1511) después del perfeccionamiento de bucle informó una puntuación de validación de 165,3 en comparación con el valor de puntuación alto de 215 y el valor de puntuación bajo de 96,8 esperados; (B) representación esquemática de dominios de la variante H36B de BP-2a.

Figura 6: (A) Alineamiento múltiple de secuencias de aminoácidos que corresponden a los dominios D3 más 2 hélices de los dominios D4 que albergan a la variante alélica de BP-2a; (B) representación esquemática de proteínas de fusión; (C) SDS-PAGE de proteínas de fusión recombinantes purificadas, detectadas mediante tinción con Comassie; (D) análisis por FACS en cepas de GBS que expresan diferentes variantes de BP-2a con antisueros de ratón producidos contra la proteína de fusión 6xD3; (E) ensayo de opsonofagocitosis con antisueros de ratón producidos contra las proteínas de fusión 6xD3 y 4xD3H.

Figura 7: Estructura cristalina de BP-2a-515 resuelta y perfeccionada a una resolución de 1,75 A a través de reemplazo molecular. La colección de datos y la estadística de perfeccionamiento se muestran en la Tabla 2. La unidad asimétrica cristalina contiene un dímero de dos cadenas independientes (A: restos 192-640 y B: restos 190 641), cada uno constituido de tres dominios distintos: D2 (restos 190-332), D3 (restos 333-455) y D4 (restos 456-641).

Modos para llevar a cabo la invención

El Streptococcus agalactiae (Streptococcus del Grupo B [EGB]) es la causa más común de sepsis y meningitis en neonatos y también es el colonizador principal de la mucosa anogenital de las mujeres sanas. Recientemente, se han descubierto tres tipos de pilosidades en el GBS como factores importantes de virulencia. Los genes involucrados en el ensamble de pilosidades se agrupan en locus genómicos, característicos (llamados PI-1, PI-2a y PI-2b), codificando cada uno tres proteínas que contienen un motivo LPXTG que representa los componentes estructurales de la pilosidad y dos enzimas sortasa que catalizan la polimerización de proteínas. Cada uno de estos tres tipos de pilosidades porta dos antígenos protectores. Entre éstos, la proteína de la estructura principal de la pilosidad de tipo 2a (BP-2a), mostró el grado más alto de variabilidad génica y fue capaz de mediar significativamente la actividad opsonofagocítica y de conferir protección en ratones solo contra cepas que expresaban el alelo homólogo. Para mapear los epítopos inmunodominantes y protectores de las variantes alélicas de BP-2a, se realizó una caracterización estructural de la proteína mediante modelado por homología comparativo y con base en esta información estructural, se generaron mutantes de deleción de las variantes principales que corresponden a cuatro dominios identificados de pliegue de tipo IgG. Los estudios in vitro e in vivo mostraron que solo la porción C-terminal de la proteína estuvo altamente expuesta en la superficie y fue capaz de suscitar anticuerpos opsonofagocíticos que confieren protección en ratones. En particular, el dominio D3 pareció ser el más importante para la inmunidad protectora de las cuatro variantes alélicas principales analizadas. Finalmente, los inventores demostraron que se puede generar una vacuna protectora amplia contra la infección por GBS con una proteína de fusión que contiene dominios D3 de diferentes variantes de BP-2a.

Materiales y procedimientos

Modelado por homología comparativo

Todas las simulaciones moleculares se realizaron utilizando el programa informático Discovery Studio 2.5 de Accelrys, EE.UU. Las secuencias de aminoácidos de la BP-2a (variante 515, anotación de TIGR SAL_1486 y variante H36b , anotación de TIGR SAI_1511) se utilizaron para buscar contra el Protein Data Bank (PDB) con la herramienta de programa BLAST [245]. La mejor estructura de molde para ambas secuencias de proteínas para el modelado por homología resultó ser la porción cristalina (restos 187 a 627) de RrgB (código de PDB: 650), la proteína de la estructura principal de pilosidad de S. pneumoniae, que se obtuvo de la base de datos PDB. El alineamiento de secuencias por pares entre SAL_1486 y RrgB y entre SAI_1115 y RrgB se realizó utilizando la herramienta alineamiento de múltiples secuencias en DS 2.5 seguido por modificaciones manuales para mejorar la calidad de alineamiento. Los modelos se generaron con MODELER [246] del módulo modelado de proteínas de DS 2.5, realizando tanto el modelado por homología como el perfeccionamiento de bucle para la proteína. Se han generado diez modelos y el modelo que compartió la última desviación del RMS con respecto al trazado (átomos Ca) de la estructura cristalina del molde, se seleccionó para perfeccionamientos y validaciones adicionales. La calidad de la estructura refinada obtenida para SAL_1486 se verificó con el módulo Perfil de verificación-3D en DS 2.5 y su calidad estereoquímica se examinó mediante la gráfica de Ramachandran utilizando DS 2.5. Para optimizar las regiones de bucle particulares en la estructura generada para SAI_1511, se utilizó el módulo de perfeccionamiento de bucle, basado en la mecánica molecular de CHARMm y Looper, de DS 2.5. Finalmente, las estructuras del modelo generadas se han superpuesto utilizando el módulo Alinear Estructuras de DS 2.5.

Cristalización de proteínas

Los ensayos de cristalización se establecieron en placas de microlotes de 96 pocillos (Greiner) utilizando el robot de cristalización Orxy 8.0MR (Douglas Instruments). Los cristales de BP-2a-515 crecieron después de una a dos semanas a 20 °C en una gota de 0,5 que consistía de 0,3 de proteína (180 mg/ml) en HEPES 10 mM, pH 7,0 y 0,2 p.l de solución de cristalización (PEG 4000 al 25 % (p/v), h Ep ES 0,1 M, pH 7,0 y tetrahidrato de tartrato de potasio-sodio 90 mM), se estratificaron con aceite de silicio y parafina, se mezclaron en una relación de 1:1. Los cristales se crioprotegieron en la solución de cristalización que contenía una concentración de precipitante incrementada (PEG 4000 al 40 % (p/v)). Los cristales pertenecían al grupo espacial P212121 ortorrómbico con dos cadenas de 515 de BP-2a presentes en la unidad asimétrica y un contenido calculado de disolvente de 53 %.

Solución de estructura y perfeccionamiento

Los datos de difracción de un cristal individual se recolectaron a una resolución de 1,75 A en la Instalación de Radiación de Sincrotrón Europea (Grenoble, Francia; línea de haz ID23-1). Los datos se procesaron utilizando imosflm (32) y SCALA (33) disponibles del Conjunto de Programas CCP4 (34). La estructura cristalográfica de BP-2a-515 se resolvió mediante reemplazo molecular utilizando el programa Molrep (35) y la estructura de la proteína de estructura principal de pilosidad (RrgB) de S. pneumoniae (15) (PDB 2x9W), como un modelo de búsqueda. El Modelo de salida Molrep inicial se extendió utilizando ARP/wARP (36). La estructura se perfeccioná utilizando REFMAC 5 (37) y se modeló en mapas de densidad electrónica utilizando Coot (38). Las últimas etapas del perfeccionamiento incluyeron la opción de tornillo de traslaciónlibración (TLS, del inglés: translational-libration-screw) (39). Durante la construcción y perfeccionamiento del modelo, se hizo obvio que la proteína se había escindido en el extremo N, que carecía de aproximadamente 190 restos, como se observó previamente para RrgB (15). El modelo final presenta parámetros geométricos, estereoquímicos, óptimos con el 99,1 % de restos en las regiones más favorables de la gráfica de Ramachandran, sin valores atípicos, de acuerdo con la validación llevada a cabo utilizando MolProbity (http://molprobity.biochem.duke.edu/) (40, 41). Las coordenadas atómicas y factores estructurales para los restos 190-640 de 515 de BP-2a se han depositado en the Protein Data Bank, Research Collaboratory for Structural Bioinformatics, Rutgers University, New Brunswick, NJ (http://www.rcsb.org) bajo el código de referencia 2XTL (Berman, H.M. y col., The Protein Data Bank. Nucleic Acids Res., 200028(1): pág. 235-42).

Cepas bacterianas y condiciones de cultivo

Las cepas de GBS utilizadas en este trabajo fueron 2603 V/R (serotipo V), 515 (la), CJB111 (V), H36B (serotipo Ib), 5401 (II) y 3050 (II). Las bacterias se cultivaron a 37 °C en Caldo Todd Hewitt (THB; Difco Laboratories) o en agar tripticasa de soja complementado con sangre de oveja al 5 %.

Clonación, expresión, purificación de proteínas recombinantes y antisueros.

Las cepas de GBS 515 y H36B se utilizaron como fuente de ADN para clonar las secuencias que codifican los dominios individuales (D1, D2, D3 y D4) de las variantes alélicas 515 y H36b de BP-2a. El ADN genómico se aisló mediante un protocolo convencional para bacterias gram-positivas utilizando un NucleoSpin Tissue Kit (Macherey-Nagel) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los genes que correspondían a cada dominio se clonaron primero en el vector pENTERMR/TEV/D-TOPO (Invitrogen) y luego se subclonaron en el vector pET54 DEST (etiqueta de 6xHIS N-terminal) o pET59 DEST (etiqueta de 6xHis-TRX N-terminal) (Novagen) utilizando el sistema de clonación GATEWAY (Invitrogen), con la excepción del dominio D3 de SAI_1511, que se clonó en el vector pSpeedET mediante el procedimiento de clonación PIPE [247]. Los oligonucleótidos utilizados se enumeran en la Tabla 1. Las construcciones resultantes se verificaron por secuenciación y luego se transformaron en BL21(DE3) de E. coli (Novagen) para la expresión como proteínas de fusión etiquetadas con 6His o TRX.

Las proteínas BP-2a recombinantes de longitud completa, que correspondían a las variantes alélicas 515, CJB111 y 2603 (anotación de TIGR SAL1486, SAM1372 y SAG1407, respectivamente), se produjeron como se informó previamente [2], mientras que la variante H36B de longitud completa (anotación de TIGR SAI_1511) se clonó en pET24b+ (Novagen) utilizando la cepa H36B como fuente de ADN. Se diseñaron cebadores para amplificar las regiones codificantes sin el péptido señal y la secuencia 3' terminal iniciando a partir del motivo LPXTG.

Los genes que codifican las proteínas de fusión de BP-2a, 6XD3 y 4XD3-H, se construyeron de forma sintética a partir de GENEART. Después, el gen 6XD3 se clonó en el vector el pET15 adaptado en el laboratorio utilizando la clonación PIPE en la cepa HK100 de E. coli. El gen 4XD3-H se subclonó utilizando las enzimas de restricción NdeI y XhoI en el vector de expresión pColdI (etiqueta 6xHIS N-terminal, Takara). Las construcciones finales se secuenciaron y se transformaron en BL21(DE3) (Novagen).

Para la expresión de proteínas recombinantes, los cultivos se mantuvieron a 25 °C durante 5 horas después de la inducción con IPTG 1 mM para los clones de pET o con arabinosa al 0,2 % para los clones de SpeedET. Todas las proteínas recombinantes se purificaron mediante cromatografía de afinidad y filtración en gel. En resumen, las células se recolectaron mediante centrifugación y se lisaron en un “tampón de lisis”, que contenía imidazol 10 mM, lisozima 1 mg/ml, ADNasa 0,5 mg/ml y un cóctel de inhibidores COMPLETO (Roche) en p Bs . El lisado se aclaró mediante centrifugación y se aplicó en una columna His-Trap HP (Armesham Biosciences) equilibrada previamente en PBS que contenía imidazol 10 mM. La elución de proteína se realizó utilizando el mismo tampón que contenía imidazol 250 mM, después de dos etapas de lavado utilizando tampónes de imidazol 20 mM y 50 mM. Después, se concentraron las proteínas eluidas y se cargaron en HiLoad 16/60 Superdex 75 (Amersham Biosciences) equilibrada previamente en PBS. Para la expresión de 4XD3-H se mantuvo a 37 °C hasta que la OD 600 nm alcanzó el valor de 0,7 y después de la inducción en presencia de IPTG 1 mM, la temperatura se cambió a 20 °C y el cultivo se mantuvo a esta temperatura durante toda la noche. La concentración de proteínas de las fracciones puras se calculó utilizando el ensayo BCA (PIERCE).

Los antisueros específicos para cada proteína se produjeron inmunizando ratones CD1 con las proteínas recombinantes purificadas, como se describió anteriormente [248]. Las respuestas inmunitarias específicas para las proteínas (Ig total) en los sueros agrupados se controlaron mediante ensayo de ELISA.

Mutagénesis dirigida

Para la generación de la forma mutada de la variante 515 de BP-2a, que contenía los restos de lisina involucrados en los enlaces isopeptídicos mutados a alanina, las mutaciones se introdujeron en la variante 515 de BP-2a de tipo silvestre que portaba el motivo LPXTG. Los cebadores utilizados para la amplificación del gen que codifica la variante 515 de BP-2a con el motivo LPXTG se enumeran en la Tabla 1. La mutagénesis dirigida se realizó utilizando el procedimiento PIPE y se diseñaron parejas de cebadores directo e inverso para cada mutación, como se enumera en la Tabla 1. La proteína de tipo silvestre y la forma mutada se clonaron en el vector SpeedET (etiqueta 6xHis N-terminal) y se expresaron en la cepa HK100 de E. coli. Las secuencias de las construcciones resultantes se confirmaron por secuenciación de ADN. Las proteínas se purificaron mediante cromatografía de afinidad y filtración en gel, como se describe anteriormente.

Citometría de flujo

Los sueros de ratón producidos contra un mutante de deleción purificado de las variantes 515 y H36B se analizaron en bacterias enteras por citometría de flujo para evaluar la exposición en superficie de los dominios correspondientes. Las células bacterianas en fase exponencial se fijaron en presencia de paraformaldehído al 0,08 % (peso/volumen) y se incubaron durante 1 hora a 37 °C. Después, las bacterias fijadas se lavaron una vez con PBS, se resuspendieron en suero de ternera recién nacida (Sigma) y se incubaron durante 20 minutos a 25 °C. Después, se incubaron las células durante 1 hora a 4 °C en sueros pre-inmunes o inmunes, diluidos 1:200 en tampón de dilución (PBS, suero de ternera recién nacida al 20 %, BSA al 0,1 %). Las células se lavaron en PBS- BSA al 0,1 % y se incubaron durante 1 hora adicional a 4 °C con una dilución 1:100 de F(ab)2 de cabra anti-IgG ratón conjugado con R-Ficoeritrina (Jackson ImmunoResearch Laboratories; Inc.). Después del lavado, las células se resuspendieron en PBS y se analizaron con un aparato FACS Calibur (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) utilizando el Programa informático FlowJo (Tree Star, Ashland, OR). Los datos se expresan como la diferencia de fluorescencia entre células teñidas con sueros inmunes frente a sueros pre inmunes.

Inmunotransferencia

Se cultivaron durante toda la noche cepas de Streptococcus del grupo B en THB (Difco Laboratories, Detroit, MI) hasta la fase exponencial (OD600 = 0,5). Las bacterias se sedimentaron, se lavaron en PBS y se resuspendieron en Tris-HCl 50 mM, que contenía 400 unidades de mutanolisina (Sigma-Aldrich). La suspensión bacteriana se incubó luego durante 2 horas a 37 °C y se lisó mediante congelamiento y descongelamiento. Los residuos celulares se retiraron mediante centrifugación a 14.000 rpm durante 10 minutos y la concentración de proteínas se midió mediante un ensayo de Proteínas Bio-Rad. Las proteínas celulares totales se separaron mediante geles prefabricados NuPage Novex al 4-12 % (Invitrogen) y se electrotransfirieron sobre membranas de PVDF utilizando el Sistema de Transferencia Seco iBlotMR (Invitrogen). Después del bloqueo en solución salina tamponada con fosfato 1X (PBS: NaCl 140 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO4 10m My KH2PO4 1,8 mM, pH 7,3) que contenía Tween 20 al 0,05 % y leche desnatada al 10 % durante 1 hora a temperatura ambiente, las membranas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente (TA) con anticuerpos primarios diluidos 1:500. Después del lavado tres veces en PBS que contenía Tween 20 al 0,05 % (PBST), las membranas se incubaron durante 1 hora con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (Dako). Las bandas positivas se visualizaron con el Kit Opti-4CN Substrate (Bio-Rad).

Ensayo de opsonofagocitosis

El ensayo de opsonofagocitosis se realizó utilizando células HL-60 diferenciadas como células fagocíticas y las cepas 515, CJB111,3050 y 5401 como células diana. Las cepas de GBS se cultivaron en caldo de Todd-Hewitt (THB) hasta una fase de crecimiento semiexponencial (A650 nm=0,3). Las bacterias se recolectaron mediante centrifugación, se lavaron dos veces con solución salina fría y finalmente se resuspendieron en tampón HBSS (Invitrogen) hasta una concentración de =1,2x107 UFC/ml. Las células Hl-60 promielocíticas (ATCC, CCL-240) se expandieron en RPMI 1640 (Gibco, Invitrogen) que contenía clon Fetal I al10 % (HyClone) a 37 °C con CO2 al 5 % y se diferenciaron en células de tipo granulocitos hasta una densidad de 4x105 células/ml mediante la adición de N,N-dimetilformamida 100 mM (DMF, Sigma) al medio de cultivo. Después de 4 días, las células se recolectaron mediante centrifugación y se resuspendieron en tampón HBSS hasta una concentración de s 4x107 células/ml. En resumen, las reacciones tuvieron lugar en un volumen total de 125 p.l que contenía =3x106 células HL-60 diferenciadas, =1,5x105 UFC de células de GBS, complemento de conejo bebé al 10 % (Cedarlane) y antisueros de ratón inactivados con calor a 37 °C durante 1 hora con agitación a 600 rpm. Inmediatamente antes y después de 1 hora de incubación, una alícuota de 25 p.l se diluyó en agua destilada, estéril y se sembró en placas de agar de tripticasa de soja con sangre de oveja al 5 %. Un conjunto de controles negativos incluidos en cada experimento consistió en reacciones que contenían sueros preinmunes, reacciones sin HL-60 y reacciones con complemento inactivado con calor. La cantidad de destrucción opsonofagocítica (destrucción logarítmica) se determinó restando el logaritmo del número de colonias supervivientes en el ensayo de 1 hora del logaritmo del número de UFC en el punto de tiempo cero.

Modelo de inmunización materna activa de ratones

Se utilizó un modelo de inmunización materna/exposición de crías neonatales de infección por GBS para verificar la eficacia de protección de las proteínas producidas en ratones, como se describió previamente (Maione y col., 2005). En resumen, ratonas CD-1 (6-8 semanas de edad) se inmunizaron en los días 1 (en ACF), 21 y 35 (AIC) con ya sea PBS o 20 mg de proteína recombinante y luego se cruzaron 3 días después de la última inmunización. Dentro de las 48 horas después del nacimiento, las crías se inyectaron por vía intraperitoneal con una dosis de diferentes cepas de GBS calculadas para provocar el 90 % de mortalidad. La supervivencia de las crías se controló durante 2 días después de la exposición. El análisis estadístico se realizó utilizando la prueba exacta de Fisher. Todos los estudios en animales se realizaron de acuerdo con las directrices de Istituto Superiore di Sanita (Italia).

Resultados

Los inventores han demostrado previamente que la Proteína de la Estructural Principal de pilosidad 2a (BP-2a) en los Streptococcus del Grupo B es capaz de conferir protección en un modelo materno activo/exposición de crías en ratón [1]. Sin embargo, la existencia de siete variantes alélicas altamente variables y la demostración de que cada variante confiere protección solo contra la cepa homóloga restringe la posibilidad de utilizar este antígeno solo o en combinación con otros antígenos en una vacuna de espectro amplio contra el GBS [2]. No obstante, BP-2a es un antígeno de interés puesto que es capaz de propiciar altos niveles de destrucción opsónica de GBS cuando se somete a prueba en un ensayo de opsonofagocitosis en presencia de anticuerpos específicos. Los inventores utilizaron esta característica específica para explorar la capacidad de protección de este antígeno e identificar los epítopos inmunodominantes de BP-2a.

Modelado por homología comparativo de la variante 515 de BP-2a

Para diseñar mutantes de deleción apropiados de BP-2a, los inventores realizaron una caracterización estructural de la proteína, primero centrándose en la variante 515 (anotación de TIGR SAL_1486), mediante el modelado por homología comparativo. Se investigó el PDB en cuanto a una proteína que compartía una identidad de secuencia significativa con la BP-2a. La mejor estructura de molde encontrada fue el código de PBD 650 que corresponde a la proteína de pilosidad RrgB de S. pneumoniae. El cristal de RrgB comprende la región de los restos 187 a 647 y está dispuesto en tres dominios de tipo inmunoglobulina, portando cada uno un enlace isopeptídico estabilizante. Los primeros dos dominios (D2 y D3) están empaquetados estrechamente para formar una estructura compacta de la cual sobresalen dos hélices anti-paralelas y el tercer dominio (D4). El cristal de PDB 650 no incluye el primer dominio (D1) de la proteína RrgB.

Se alinearon las secuencias de aminoácidos de la variante 515 de BP-2a y RrgB y se informó que comparten el 43 % de identidad de secuencia y el 61 % de similitud de secuencia. La comparación de secuencias reveló que el motivo de pilina YPK, el casete de Caja de E, el motivo LPXTG y todos los restos involucrados en enlaces isopeptídicos están bien conservados (Figura 1A). El alineamiento por pares se optimizó adicionalmente de forma manual para lidiar con las estructuras secundarias, con el fin de perfeccionar la entrada del procedimiento de modelado por homología. La calidad del modelo se evaluó calculando la puntuación de compatibilidad con el módulo Profile-3D (Discovery Studio 2.5 Software Inc., San Diego, CA). El molde informó una puntuación de 168,6 en comparación con el valor de puntuación alto esperado de 201,7 y el valor de puntuación bajo de 90,7. El mejor modelo para BP-2a-515 informó una puntuación de validación calculado mediante Profile-3D de 154, mientras que las puntuaciones posibles mínima y máxima para este modelo son 92,2379 y 204,973, respectivamente. Dado que aún la estructura cristalográfica de molde no alcanza la puntuación esperada para la proteína plegada correctamente, el modelo obtuvo una puntuación de validación comparable a la del cristal.

Como se muestra en la Figura 1B, el modelo de la proteína de los inventores, que corresponde a los restos de aminoácidos 191 a 640, reveló tres dominios de pliegue de tipo IgG (D2, D3 y D4) cada uno caracterizado por un enlace isopeptídico estabilizante. Al superponer la estructura de molde frente al modelo generado, se obtuvo una r Ms D (del inglés root means square deviation, desviavión de la media cuadrática) tan baja como 1,2 A, lo que significa que la secuencia de BP-2a se ajustó bien en la estructura de molde. Solo se identificaron diferencias menores en los bucles, todas debidas a inserciones o deleciones cortas de restos. Por otra parte, la superposición de enlaces isopeptídicos cristalizados muestra que la región en las cercanías de los enlaces está relativamente conservada. En particular, hay un ácido glutámico o un ácido aspártico que cataliza enlaces, sumergidos completamente en una cavidad hidrófoba circundante. En la variante 515 de BP-2a, los restos involucrados en enlaces isopeptídicos son: Lys199-Asn325 en el dominio D2 con Asp 247 como el resto catalizador y estabilizante; Lys355-Asn437 en el dominio D3 con Glu416; y Lys463-Asn636 en el dominio D4 con Glu589. Con base en una estructura secundaria y la predicción de pliegue de la porción N-terminal de la proteína BP-2a (restos 1 a 190), los inventores formulan la hipótesis de que esta porción tiene el mismo pliegue de tipo IgG de D2, D3 y D4 (datos no mostrados).

El análisis de espectrometría de masas confirma la presencia de tres enlaces isopeptídicos internos

La SAL_1486 de longitud completa, recombinante se purificó y se utilizó para confirmar la presencia de los enlaces isopeptídicos hipotéticos a partir del estudio de modelado. El procedimiento seleccionado para su identificación se basó en la digestión total de las diversas construcciones con Lys-C y el análisis de los productos de digestión mediante la espectrometría de masas. Para acortar fácilmente los péptidos de enlace, los productos de digestión se derivatizaron con O-metilisourea, que modifica la lisina C-terminal en homoarginina con un incremento de masa de 42 Da para cada extremidad C-terminal modificada. Los péptidos con enlaces isopeptídicos son los que presentan un cambio de masa de 42 D (derivatización parcial) y 84 Da (derivatización completa). La proteína fue resistente a digestiones enzimáticas “en solución” (datos no mostrados). El enfoque que permitió la cobertura de péptidos más grande se obtuvo de la digestión “en gel” del polipéptido corrido en una SDS-PAGE. La Figura 2 informa los espectros de espectrometría de masas obtenidos de la SAL_1486 recombinante de longitud completa que permite la confirmación de los isopéptidos hipotetizados.

Un enlace isopeptídico que implica aminoácidos portados por el dominio D4 de la proteína se evidenció por el ion molecular de m/z 1762,05 Da que corresponde a la masa molecular del péptido 461FVKTNk 466 unido por un enlace isopeptídico al péptido 630DAQQVINKK638 (masa molecular esperada de 1761,90Da) (Figura 2A, panel superior). La reacción de guanidinación indujo un cambio de 42 a 84 Da de la señal que corresponde a la derivatización de péptidos C-terminal individual y doble, respectivamente, confirmando la unión covalente de los dos péptidos. De la misma manera, los enlaces isopeptídicos en los dominios D2 y D3 se asignaron a partir de los iones de m/z 2145,18 y 4040,85, que corresponden a la masa molecular del péptido 53ITVNKTWAVDGNeVn K68 unido al péptido 139NNK141 (masa molecular esperada de 2145,13Da) y del péptido 185ITYSATLNGSAVVEVLETNDVK206 unido por un enlace isopeptídico al péptido 68NTETKPQv Dk NFa Dk82 (masa molecular esperada de 4040,07 Da), respectivamente (Figuras 2B y 2C). La reacción de guanidinación confirmó la unión covalente de los péptidos por el cambio doble de masa de 42 a 84 Da. Fue notable que se identificó ningún enlace isopeptídico en la parte N-terminal que corresponde al dominio DI de la proteína recombinante de longitud completa.

Para confirmar que las lisinas involucradas en los enlaces isopeptídicos de los dominios D2, D3 y D4 correspondían exactamente a K199, K355 y K463 predichos por el modelo estructural, los inventores generaron una forma recombinante de la proteína mediante mutagénesis dirigida, en la cual estos restos de lisina se mutaron en restos de alanina (K199A/K355A/K463A). Se aplicó el mismo protocolo de digestión enzimática y análisis de espectrometría de masas y no se identificó ninguna de las señales correspondientes a los péptidos con enlaces isopeptídicos e informados anteriormente (datos no mostrados).

Estructura cristalina por rayos X de la subunidad de pilosidad BP-2a-515

Con el objetivo de identificar el(los) dominio(s) que porta(n) los epítopos protectores, se resolvió y se perfeccionó la estructura cristalina de BP-2a-515 a una resolución de 1,75 A a través de reemplazo molecular. La colección de datos y las estadísticas de perfeccionamiento se muestran en la Tabla 2. Se confirmó que la unidad cristalina asimétrica contenía un dímero de dos cadenas independientes (A: restos 192-640 y B: restos 190-641), cada uno constituido de tres dominios distintos: D2 (restos 190-332), D3 (restos 333-455) y D4 (restos 456-641) (Figuras 7). El dímero de BP-2a-515 observado no presenta interacciones intermoleculares extensas en la interfaz de asociación, por lo tanto, no se espera que el dímero se produzca en solución y es una consecuencia probable del empaquetamiento cristalino, como indica el Protein Interfaces, Surfaces and Assemblies (PISA) Service [249] en el European Bioinfomatics Institute (http://www.ebi.ac.uk/msdsrv/protjnt/pistart.html).

Aunque la cristalización se llevó a cabo utilizando la proteína de longitud completa, aproximadamente 190 aminoácidos del extremo N (dominio DI) estuvieron ausentes en el cristal, lo que sugiere que se escinden antes de la cristalización. Un comportamiento similar se informó para la proteína de pilosidad RrgB neumocócica, cuya estructura se resolvió recientemente a una resolución de 1,6 A [250] y es altamente homóloga a la estructura de BP-2a-515.

El tartrato de potasio-sodio presente en la solución de cristalización fue importante para optimizar el crecimiento de cristal y para mejorar la resolución de difracción. De hecho, tres cationes de potasio están unidos en posiciones estratégicas y estabilizantes en la estructura. Dos cationes de potasio (coordinados idénticamente) están unidos al dominio D2 en ambas cadenas y estabilizan un enlazador flexible, que conecta los dominios D3 y D4, a través de restos participantes de los dominios D2, D3 y una molécula de agua (Figuras 7). El tercer catión de potasio estabiliza un bucle flexible en el dominio D4 de la cadena A.

Se confirmó que la organización de los tres dominios muestra un pliegue de IgG modificado [250], una característica estructural ya observada para RrgB de S. pneumoniae. En efecto, la superposición de los átomos C-alfa de la cadena B de BP-2a-515 y RrgB utilizando el programa de emparejamiento C-alfa de alineamiento estructural por pares (http://bioinfo3d.cs.tau.ac.il/c_alpha_match/), produce un valor r.m.s.d de 1,37 A a lo largo de 280/452 restos. Las diferencias estructurales principales entre las dos proteínas se refieren a la ubicación espacial del dominio D3, el movimiento de dos hélices a en el dominio D4 que están conectadas al sándwich p por dos láminas p no presentes en RrgB y a regiones flexibles.

De manera similar a RrgB, cada dominio se caracteriza por un enlace isopeptídico intramolecular covalente, estabilizante, que está formado entre el grupo s-amino de las cadenas laterales de lisina y el grupo S-carboxiamida de la asparagina. Los tres enlaces isopeptídicos están presentes entre Lys199 y Asn325 (dominio d 2), Lys437 y Asn355 (dominio D3), y Lys463 y Asn636 (dominio D4), y estabilizan los elementos estructurales secundarios de sus dominios respectivos. Debido al movimiento conformacional de D3 en comparación con RrgB, este último enlace isopeptídico es el único que no se empareja con la ubicación espacial del enlace equivalente en RrgB. El área circundante alrededor de estos enlaces es principalmente hidrófoba, comprendiendo varios restos aromáticos, de acuerdo con observaciones hechas para los enlaces isopeptídicos en varias proteínas de pilosidades.

Cada uno de los cuatro dominios D1, D2, D3 y D4 parecen plegarse independientemente. Esto se demostró al expresar y purificar cada dominio de E. coli, como construcciones independientes cuyos extremos N y C se seleccionaron basándose en los límites de dominio definidos en la estructura cristalina de BP-2a-5l5. Los cuatro dominios se expresaron en forma soluble en E. coli y el análisis de Espectrometría de Masas de digestiones con tripsina de D2, D3 y D4 reveló que los dominios portaban los mismos enlaces isopeptídicos encontrados en la proteína de longitud completa (datos no mostrados). Esto sugirió que la organización estructural global de los dominios expresados independientemente se conservó suficientemente como para llevar los restos de lisina y asparagina a una distancia de reacción adecuada.

En conclusión, la estructura cristalina de la subunidad de estructura principal de PI-2a (alelo 515) indica que la proteína se organiza en cuatro dominios, para los que se demuestra que están estructurados independientemente y son estables.

Los enlaces isopeptídicos intramoleculares son prescindibles para la protección

Se ha demostrado que los enlaces isopeptídicos intramoleculares que son prescindibles para el ensamblaje de la pilosidad, contribuyen a la estabilidad estructural y proteolítica de las pilosidades. La SDS-PAGE de la proteína BP-2a de tipo silvestre y mutada mostró que la proteína sin enlaces isopeptídicos tuvo una movilidad electroforética más lenta en comparación con la forma de tipo silvestre. La presencia de reticulaciones internas dentro de la proteína nativa puede hacer que la estructura de la proteína de tipo silvestre sea más compacta y más capaz de pasar a través de la matriz del gel, mientras que la forma mutada tiene una estructura más grande que corre hasta un peso molecular más alto (Figura 3A).

Para evaluar si la presencia de estas uniones internas podría influir en la capacidad de protección de la proteína BP-2a e investigar si la proteína mutante es capaz de inducir una inmunidad de protección in vivo así como el tipo silvestre, los inventores probaron ambas proteínas en un modelo de inmunización materna de ratón [248]. Los inventores inmunizaron grupos de ratonas adultas CD1 con las proteínas recombinantes purificadas y después de tres inmunizaciones, los ratones se aparearon y la descendencia resultante se expuso a una dosis de GBS calculada para destruir aproximadamente 90 % de las crías. Los altos niveles de protección observados con la forma mutada de la proteína (Tabla 3) revelaron que la pérdida de enlaces isopeptídicos no interfirió con la capacidad de la proteína para conferir protección en ratones y para suscitar anticuerpos opsónicos (Figura 3B).

El dominio D3 está altamente expuesto en la superficie y es esencial para la protección

Basándose en la información obtenida del modelo estructural descrito anteriormente, se generaron cuatro mutantes de deleción de la variante 515 de BP-2a, dividiendo la proteína en cuatro fragmentos solapantes que corresponden a los cuatro dominios de tipo IgG predichos por el modelado (Figura 4A): D1 corresponde a la región de los aminoácidos 30 a 162; D2 corresponde a la región de los aminoácidos 156 a 338; D3 corresponde a la región de los aminoácidos 332 a 499; y D4 corresponde a la región de los aminoácidos 457 a 640.

Los fragmentos de deleción se clonaron, se expresaron en E. coli y se purificaron como proteínas recombinantes etiquetadas con HIS o TRX, como se describe en Materiales y Procedimientos. Interesantemente, los enlaces isopeptídicos presentes en los dominios D2 y D3, y D4, también se identificaron en las formas recombinantes, individuales de esos dominios, indicando que el dominio individual tuvo todos los requerimientos para la formación de este enlace covalente (datos no mostrados).

Los cuatro dominios solubles, purificados se utilizaron para inmunizar ratones CD1 y las respuestas inmunitarias específicas de la proteína (es decir, el nivel de inmunoglobulina total) se controlaron mediante un ensayo ELISA e inmunotransferencia de Western. Los sueros producidos contra cada fragmento también se analizaron mediante citometría de flujo utilizando la cepa de bacterias enteras 515 para evaluar qué dominio estaba expuesto en la pilosidad polimerizada que sobresale de la superficie bacteriana. Como se muestra en la Figura 4B, los dominios D3 y D4 estuvieron altamente expuestos a un nivel comparable a los observados con el antisuero producido contra la proteína de longitud completa. Utilizando anticuerpos anti-D2 se obtuvo un cambio débil, lo que sugiere que no está altamente expuesto, mientras que D1 no está expuesto.

Para investigar cuál de los dominios fue capaz de conferir protección contra la infección por GBS, los inventores realizaron un análisis de opsonofagocitosis in vitro utilizando sueros de ratones inmunizados y un modelo de inmunización materna activa de ratón/exposición de crías neonatales in vivo. De acuerdo con los resultados de FACS, solo los dominios D3 y D4 fueron capaces de suscitar anticuerpos opsonofagocíticos y de conferir protección en los ratones contra la infección por GBS (Figura 4C y Tablas 3 y 4). En particular, el dominio D3 mostró el nivel más alto de exposición en la superficie y de actividad opsónica.

La selección de Acm positivos en FACS y opsónicos que mapeaban en el dominio D3 confirmó que la porción C-terminal de la proteína, y en particular D3, es esencial para una inmunidad protectora (datos no mostrados).

El dominio D3 representa el epítopo inmunodominante de las variantes alélicas principales de BP-2a

Los inventores han observado que todas las variantes alélicas descritas hasta ahora, que comparten una homología de secuencias que varía del 48 % al 98 %, fueron protectoras en el modelo de ratones, aunque protegieron únicamente a crías expuestas a cepas que portaban la variante alélica utilizada para inmunizar las madres respectivas ([2] y datos no mostrados).

Para investigar si los resultados obtenidos con el alelo 515 se confirmaban en las otras variantes, se aplicó el mismo enfoque descrito anteriormente para mapear la porción inmunodominante en las variantes más representativas (llamadas 515, CJB111, H36B y 2603), que pertenecen a las dos familias principales.

Para entender si las variantes de BP-2a compartían la misma organización estructural, se generó un nuevo modelo estructural del alelo H36B (anotación de TIGR SAI_1511). Esta variante se escogió debido a que es la más divergente en términos de identidad y similitud de secuencia, de la variante 515 (el 48 % de identidad de secuencia). La proteína de pilosidad RrgB de S. pneumoniae se utilizó como estructura de molde (código de PDB: 650). Se alinearon las secuencias de aminoácidos de sA i_ 1511 y RrgB y se informó que compartían el 38 % de identidad de secuencia y el 56 % de similitud de secuencia. El modelo de sA i_ 1511, como se informa en la Figura 5A, reveló la misma estructura modular que la variante 515, que comprende 4 dominios de pliegues de tipo IgG, 3 de los cuales contienen un isopéptido interno de Lys-Asn con entornos relativamente conservados. Además, aunque la organización principal de la estructura de la proteína se conserva (RMSD = 0,9 A), en la estructura de modelo de la variante H36B hay dos bucles de inserción que no están presentes en la estructura cristalina de RrgB. El primero se extiende desde el resto 200 al 214, mientras que el segundo se extiende del resto 402 al 410 (Figura 5A). La función de estas dos regiones de bucle adicionales aún es desconocida.

Basándose en la información obtenida a partir del análisis estructural, los inventores generaron mutantes de deleción de la variante H36B, dividiendo esta variante en cuatro fragmentos solapados, expresados en E. coli y purificados como proteínas recombinantes. D1 correspondía a la región de los aminoácidos 30 a 158, D2 a la región de los aminoácidos 152 a 350, D3 a la región de los aminoácidos 343 a 493 y D4 a la región de los aminoácidos 487 a 658 (Figura 5B). Los dominios solubles, purificados se utilizaron para inmunizar ratones CD1 y los sueros producidos contra cada fragmento se probaron en ensayos de protección in vitro e in vivo.

Como se observó para la variante 515, los antisueros producidos contra el dominio D3 mostraron el cambio de fluorescencia más alto cuando probaron en un Análisis de Citometría de Flujo en células bacterianas enteras (Figura 5C) y fueron capaces de estimular una destrucción eficiente de bacterias cuando se analizaron en un ensayo de opsonofagocitosis en presencia de leucocitos polimorfonucleares humanos (los PMN) y complemento de conejo bebé (Figura 5D). Además, el dominio D3 confirió niveles significativos de protección contra la cepa de exposición, en donde la variante H36B se expresó y expuso en la superficie bacteriana bien (Tablas 5 y 6).

El dominio D3 se confirmó adicionalmente como el epítopo inmunodominante para la BP-2a en todas las variantes alélicas conocidas (datos no mostrados). Por ejemplo, como se muestra en la Tabla 7, el dominio D3 de la variante CJB111 confiere niveles significativos de protección contra la exposición con la cepa CJB111. Además, se ha descubierto que dos anticuerpos monoclonales (17C4/A3 y 4H11/B7, las SEQ ID NO: 262-269) se unen a un epítopo que comprende los aminoácidos 411-436 (SEQ ID NO: 270) dentro del subfragmento de D3 del clado 515 (SEQ ID NO: 38, fragmento de la SEQ ID NO: 2) (datos no mostrados).

Las proteínas de fusión que portan epítopos protectores confieren protección cruzada contra cepas de GBS que expresan diferentes alelos

El mapeo de los dominios D3 como la región inmunodominante y protectora de las diferentes variantes se utilizó entonces para facilitar el diseño de proteínas quiméricas para la prueba en el modelo animal, para evaluar la capacidad de esas proteínas de fusión de conferir una protección de espectro amplio.

Se generaron dos proteínas de fusión. La primera, la proteína de fusión 6XD3, está compuesta del dominio D3 de seis variantes de proteína de estructura principal (515, CJB111, H36B, DK21, 090 y 2603) (Figuras 6A y 6B). La segunda, la proteína de fusión 4XD3Hélice, está compuesta del dominio D3 más las dos hélices sobresalientes del dominio D4 de las cuatro variantes más representativas (515, CJB111, H36B y 2603) (Figuras 6A y 6B). Cada proteína de fusión se clonó y expresó en E. coli, y se purificó como proteína recombinante, como se informa en Materiales y Procedimientos (Figura 6C).

Las proteínas de fusión purificadas se utilizaron para inmunizar ratones CD1 y los sueros producidos contra cada proteína de fusión se probaron en ensayos de protección in vitro e in vivo. Para entender si los sueros eran capaces de reconocer estructuras de tipo pilosidades que contuvieran las diferentes variantes de BP-2a, se realizó un análisis de inmunotransferencia de Western y de FACS (datos no mostrados y Figura 6D). Los resultados mostraron que los sueros inmunes generados contra las dos proteínas de fusión son capaces de reconocer las estructuras de tipo pilosidades de los extractos totales. Los experimentos de opsonofagocitosis confirmaron que los antisueros contra proteínas de fusión fueron capaces de mediar la destrucción fagocítica dependiente del complemento de cepas de GBS que expresan diferentes variantes alélicas de BP-2a (Figura 6E). Además, los datos de modelo de protección in vivo muestran que ambas proteínas de fusión eran capaces de suscitar una inmunidad protectora en ratones expuestos a cepas que expresaban la variante diferente de la proteína y, de esta manera, se pueden utilizar como una vacuna ampliamente protectora contra infecciones por GBS (Tablas 8 y 9). Finalmente, la Tabla 9 muestra que el efecto protector de la proteína de fusión 6XD3 se mantiene si se utiliza una etiqueta de His.

Discusión

Muchos patógenos bacterianos, que incluyen el S. agalactiae (GBS), han desarrollado una amplia gama de mecanismos para escapar del sistema inmunitario de sus hospedadores o para adaptarse a una variación ambiental, por ejemplo, adoptando la estrategia de la variabilidad génica y/o la expresión diferencial de genes. Estas estrategias desempeñan un papel crucial en la capacidad de los agentes patógenos para desencadenar una enfermedad y también explican por qué tan es difícil desarrollar vacunas contra estos microorganismos. Los avances en la tecnología de secuenciación y bioinformática han dado como resultado un crecimiento exponencial de información de secuencias genómicas, y ahora están disponibles genomas completos de múltiples aislados para un gran número de patógenos. El análisis multigenómico ha revelado una variación génica inesperadamente alta entre cepas de una especie individual, con implicaciones para los programas de descubrimiento de fármacos y para vacunas eficaces. Las especies tales como los estreptococos pueden tener un genoma relativamente pequeño, pero el número total de genes prescindibles en la población permite una flexibilidad suficiente como para que las especies se adapten a una exposición ambiental.

Las islas de patogenicidad, tales como las islas de pilosidades descubiertas en los GBS y en otros agentes patógenos Gram-positivos en años recientes, pertenecen a la clase de islas genómicas, las cuales se han adquirido mediante la transferencia horizontal de genes y son un ejemplo típico de genoma prescindible. Debido a que propician la variabilidad genética, las islas genómicas desempeñan un papel importante en la evolución microbiana. Las tres islas de pilosidades identificadas en los GBS (llamadas PI-1, PI-2a y PI-2b) codifican estructuras de alto peso molecular cuyas subunidades son potenciales candidatos proteicos para vacunas. Sin embargo, puesto que los antígenos de pilina no están presentes universalmente, no están conservados y no se expresan en la superficie bacteriana de una subpoblación grande de GBS, solo una combinación de más proteínas sería adecuada para una vacuna de amplio espectro.

La proteína de estructura principal de pilosidad 2a (BP-2a), es esencial para la polimerización de la pilosidad. Aunque la BP-2a es capaz de conferir protección en ratones y de mediar la destrucción opsonofagocítica de bacterias GBS vivas a un nivel comparable a la destrucción observada con anticuerpos contra antígenos de polisacáridos capsulares, tiene el nivel más alto de variabilidad génica entre todos los antígenos de pilina. La existencia de al menos siete variantes alélicas de BP-2a sin protección cruzada bloquea la posibilidad de utilizar para una vacuna de amplio espectro este antígeno solo, excepto que se incluyan en la vacuna todos los alelos identificados.

Para un antígeno inmunogénico de múltiples variantes, tal como BP-2a, la selección de solo una pequeña porción protectora de la proteína (el dominio de pliegue D3 de la proteína de tipo IgG altamente expuesto en la superficie) permitió a los inventores diseñar racionalmente y producir proteínas quiméricas mediante la fusión de los dominios inmunodominantes individuales de los diferentes alelos sin reacción cruzada. Estas quimeras adquirieron la capacidad de conferir una protección cruzada amplia en ratones contra infecciones con cepas de GBS que expresaban todas las variantes de BP-2a. El enfoque combinado de análisis estructural y funcional informado en el presente documento, junto con el uso de herramientas de ingeniería genética, permitió a los inventores generar proteínas de fusión que contenían el dominio inmunodominante de todas las variantes principales de BP-2a mientras se conservaba la arquitectura estructural nativa del dominio seleccionado. Interesantemente, los resultados de los inventores muestran que la capacidad de los dominios de suscitar una inmunidad protectora no fue dependiente de la presencia de enlaces isopeptídicos internos.

La respuesta inmunitaria de protección cruzada de las proteínas de fusión tiene una importancia fundamental en el desarrollo de una vacuna, puesto que disminuye el riesgo de generar mutantes de escape y permite la generación de una respuesta inmunitaria protectora contra cepas del GBS genéticamente diferentes.

Tabla 1: Cebadores utilizados en los ex erimentos descritos en el resente documento

(c o n tin u a c ió n )

Tabla 2. Colección de datos y estadísticas de perfeccionamiento de BP-2a-515 (reemplazo molecular). Se utilizó un cristal para resolver la estructura. Los valores entre paréntesis son para la cubierta de resolución más alta.

BP-2a-515 (restos 190-640) Colección de datos

Grupo espacial P212121

Dimensiones de la célula

a, b, c (A) 63,7, 104,7, 159,3

a = p = y (°) 90

Resolución (A) 40-1,75 (1,75 -1,84)

f^usionar 0,099 (0,6)

I/oI 14,9 (3,7)

Completitud (%) 100 (100)

Redundancia 9,6 (9,7) Perfeccionamiento

Resolución (A) 40-1,75

N.° de reflexiones 103.7178

t^rabajo/Rlibre 18,5/21,6

N.° de átomos

Proteína 7076

Ion de potasio 3

Agua 895

B-factores

Proteína 32,3

Ion de potasio 24,8

Agua 20,2

(con tinuac ión)

D e sv iac ione s de R.m.s.

Long itudes de en lace (A) 0 ,007

Á n g u lo s de en lace (°) 1,047

Tabla 3: Resultados de un modelo de inmunización materna activa de ratón/exposición de crías neonatales para determinar la protección conferida por un dominio individual de la variante 515 de GBS59 contra la cepa 515 de streptococcus grupo B. La pro tecc ión co n fe rid a po r do m in io s in d iv idua les de la va rian te 515 de B P -2a con tra la cepa 515 de G BS eva lua da por el m ode lo de in m un izac ión m aterna activa de ra tón /expo s ic ió n de c ría s neonata les. Los va lo res de pro tecc ión se ca lcu la ron com o [(% de m uertos en el con tro l - % de m uertos con la v a cu n a )/% de m uertos en el con tro l]*100.

Tabla 4: P rotección co n fe rid a por do m in ios ind iv idua les del a le lo B P -2a -515 con tra la cep a 515 de G BS, eva luada por el m odelo de in m un izac ión m a te rn a activa de ra tón /expos ic ión de c ría s neonata les. Los va lo res de p ro te cc ió n se ca lcu la ron com o [(% de sep s is en el con tro l - % de sepsis con la vacu na )/% de sepsis en el con tro l]*100.

Tabla 5: Protección conferida por dominios individuales de la variante H36B de BP-2a contra la cepa 515 de GBS evaluada por medio del modelo de inmunización materna activa de ratón/exposición de crías neonatales. Los va lo res de pro tección se ca lcu la ron com o [(% de m ue rto s en el con tro l - % de m uertos con la va cu n a )/% de m ue rto s en el con tro l]*100.

Tabla 6: P ro tecc ión neonata l con fe rid a por dom in ios in d iv idua les de B P -2a -H 36B con tra la cep a 5401 de G BS, que exp resa la va ria n te B P -2a de H36B, eva luada por el m ode lo de in m un izac ión m aterna activa de ra tón /expos ic ión de c rías neonata les. Los va lo res de p ro tección se ca lcu la ron com o [(% de seps is en el con tro l - % de sep s is con la vacu na )/% de seps is en el con tro l]*100.

a b la 7 : Protección conferida por dominios individuales de la variante BP-2a-CJB111 contra la cepa de CJB111 de GBS, que expresa la variante CJB111 de BP-2a, evaluada por el modelo de inmunización materna activa de ratón/exposición de crías neonatales. Los valores de protección se calcularon como [(% de sepsis en el control - % de sepsis con la vacuna)/% de sepsis en el control]*100.

T a b la 8 : P ro te c c ió n m e d ia n te e l m o d e lo d e in m u n iz a c ió n m a te rn a a c t iv a d e ra tó n /e x p o s ic ió n d e c r ía s n e o n a ta le s c o n fe r id a p o r p ro te ín a s d e fu s ió n c o n tra u n p a n e l d e c e p a s d e G B S q u e e x p re s a n d ife re n te s v a r ia n te s a lé lic a s d e B P -2a . Los valores de protección se calcularon como [(% de muertos en el control - % de muertos con la vacuna)/% de muertos en el control]*100.

T a b la 9 : Protección mediante el modelo de inmunización materna activa de ratón/exposición de crías neonatales conferida por la proteína de fusión 6xD3 contra un panel de cepas de GBS que expresan diferentes variantes alélicas de BP-2a. Los valores de protección se calcularon como [(% de sepsis en el control - % de sepsis con la vacuna)/% de sepsis en el control]*100.

continuación

Tabla 10: Protección mediante el modelo de inmunización materna activa de ratón/exposición de crías neonatales conferida por proteínas de fusión con y sin etiquetas contra un panel de cepas de GBS.

LISTADO DE SECUENCIAS

SEQ ID NO:1 (GBS59 de 2603)

SEQ ID NO:2 (GBS59 de 515)

SEQ ID NO:3 (GBS59 de cjb111)

SEQ ID NO:4 (GBS59 de h36b)

SEQ ID NO:5 (GBS59 de CJB110)

SEQ ID NO:6 (GBS59 de DK21)

SEQ ID NO:7 (GBS59 de NEM316)

SEQ ID NO:8 (D12603)

SEQ ID NO:9 (D22603)

SEQ ID NO:10 (D32603)

SEQ ID NO:11 (D42603)

SEQ ID NO:12 (D1 515)

SEQ ID NO:13 (D2515)

SEQ ID NO:14 (D3515)

SEQ ID NO:15 (D4515)

SEQ ID NO:16 (D1 de cjb111)

SEQ ID NO:17 (D2 de cjb111)

SEQ ID NO:18 (D3 de cjb111)

SEQ ID NO:19 (D4 de cjb111)

SEQ ID NO:20 (D1 de h36b)

SEQ ID NO:21 (D2 de h36b)

SEQ ID NO:22 (D3 de h36b)

SEQ ID NO:23 (D4 de h36b)

SEQ ID NO:24 (D1 de CJB110)

SEQ ID NO:25 (D2 de CJB110)

SEQ ID NO:26 (D3 de CJB110)

SEQ ID NO:27 (D4 de CJB110)

SEQ ID NO:28 (D1 de DK21)

SEQ ID NO:29 (D2 de DK21)

SEQ ID NO:30 (D3 de DK21)

SEQ ID NO:31 (D4 de DK21)

SEQ ID NO:32 (D1 NEM316)

SEQ ID NO:33 (D2 NEM316)

SEQ ID NO:34 (D3 NEM316)

SEQ ID NO:35 (D4 NEM316)

SEQ ID NO:36 (subfragmento de D3 de 2603)

SEQ ID NO:37 (D4H de 2603)

SEQ ID NO:38 (subfragmento de D3 de 515)

SEQ ID NO:39 (D4H de 515)

SEQ ID NO:40 (subfragmento de D3 de cjb111)

SEQ ID NO:41 (D4H de cjb111)

SEQ ID NO:42 (subfragmento de D3 de h36b)

SEQ ID NO:43 (D4H de h36b)

SEQ ID NO:44 (subfragmento de D3 de CJB110)

SEQ ID NO:45 (D4H de CJB110)

SEQ ID NO:46 (subfragmento de D3 de DK21)

SEQ ID NO:47 (D4H de DK21)

SEQ ID NO:48 (subfragmento de D3 de NEM316)

SEQ ID NO:49 (D4H de DK21)

SEQ ID NO:50 (D3+D4 de 2603)

SEQ ID NO:51 (D3+D4H de 2603)

SEQ ID NO:52 (D2+D3+D4 de 2603)

SEQ ID NO:53 (D2+D3+D4H de 2603)

SEQ ID NO:54 (D3+D4 de 515)

SEQ ID NO:55 (D3+D4H de 515)

SEQ ID NO:56 (D2+D3+D4515)

SEQ ID NO:57 (D2+D3+D4H de 515)

SEQ ID NO:58 (D3+D4 de cjb111)

SEQ ID NO:59 (D3+D4H de cjb111)

SEQ ID NO:60 (D2+D3+D4 de cjb111)

SEQ ID NO:61 (D2+D3+D4H de cjb111)

SEQ ID NO:62 (D3+D4 de h36b)

SEQ ID NO:63 (D3+D4H de h36b)

SEQ ID NO:64 (D2+D3+D4 de h36b)

SEQ ID NO:65 (D2+D3+D4H de h36b)

SEQ ID NO:66 (D3+D4 de CJB110)

SEQ ID NO:67 (D3+D4H de CJB110)

SEQ ID NO:68 (D2+D3+D4 de CJB110)

SEQ ID NO:69 (D2+D3+D4H de CJB110)

SEQ ID NO:70 (D3+D4 de DK21)

SEQ ID NO:71 (D3+D4H de DK21)

SEQ ID NO:72 (D2+D3+D4 de DK21)

SEQ ID NO:73 (D2+D3+D4H de DK21)

SEQ ID NO:74 (D3+D4 de NEM316)

SEQ ID NO:75 (D3+D4H de NEM316)

SEQ ID NO:76 (D2+D3+D4 de NEM316)

SEQ ID NO:77 (D2+D3+D4H de NEM316)

SEQ ID NO:78 (fragmento corto de D3 de 515)

SEQ ID NO:79 (etiqueta de his)

SEQ ID NO:80 (enlazador)

SEQ ID NO:81 (enlazador)

SEQ ID NO:82 (enlazador)

SEQ ID NO:83 (Fusión E)

SEQ ID NO:84 (Fusión F)

SEQ ID NO:85 (Fusión G)

SEQ ID NO:86 (Fusión H)

SEQ ID NO:87 (Fusión I)

SEQ ID NO:88 (que codifica la Fusión E)

SEQ ID NO:89 (que codifica la Fusión f )

SEQ ID NO:90 (que codifica la Fusión G)

SEQ ID NO:91 (que codifica la Fusión h )

SEQ ID NO:92 (que codifica la Fusión I)

SEQ ID NO:93 (que codifica la Fusión E - optimizada para E. coli) SEQ ID NO:94 (que codifica la Fusión F - optimizada para E. coli) SEQ ID NO:95 (que codifica la Fusión G - optimizada para E. coli) SEQ ID NO:96 (que codifica la Fusión H -optimizada para E. coli) SEQ ID NO:97 (que codifica la Fusión I - optimizada para E. coli) SEQ ID NO:98 (adyuvante IC)

SEQ ID NO:99 (adyuvante peptídico policatiónico)

SEQ ID NO:100 (que codifica la GBS59 de 2603)

SEQ ID NO:101 (que codifica la GBS59 de 515)

SEQ ID NO:102 (que codifica la GBS59 de cjb111)

SEQ ID NO:103 (que codifica la GBS59 de h36b)

SEQ ID NO:104 (que codifica la GBS59 de CJB110)

SEQ ID NO:105 (que codifica la GBS59 de DK21)

SEQ ID NO:106 (que codifica la GBS59 de NEM316)

SEQ ID NO:107 (que codifica el D1 de 2603)

SEQ ID NO:108 (que codifica el D2 de 2603)

SEQ ID NO:109 (que codifica el D3 de 2603)

SEQ ID NO:110 (que codifica el D4 de 2603)

SEQ ID NO:111 (que codifica el D1 de 515)

SEQ ID NO:112 (que codifica el D2 de 515)

SEQ ID NO:113 (que codifica el D3 de 515)

SEQ ID NO:114 (que codifica el D4 de 515)

SEQ ID NO:115 (que codifica el D1 de cjb111)

SEQ ID NO:116 (que codifica el D2 de cjb111)

SEQ ID NO:117 (que codifica el D3 de cjb111)

SEQ ID NO:118 (que codifica el D4 de cjb111)

SEQ ID NO:119 (que codifica el D1 de h36b)

SEQ ID NO:120 (que codifica el D2 de h36b)

SEQ ID NO:121 (que codifica el D3 de h36b)

SEQ ID NO:122 (que codifica el D4 de h36b)

SEQ ID NO:123 (que codifica el D1 de CJB110)

SEQ ID NO:124 (que codifica el D2 de CJB110)

SEQ ID NO:125 (que codifica el D3 de CJB110)

SEQ ID NO:126 (que codifica el D4 de CJB110)

SEQ ID NO:127 (que codifica el D1 de DK21)

SEQ ID NO:128 (que codifica el D2 de DK21)

SEQ ID NO:129 (que codifica el D3 de DK21)

SEQ ID NO:130 (que codifica el D4 de DK21)

SEQ ID NO:131 (que codifica el D1 de NEM316)

SEQ ID NO:132 (que codifica el D2 de NEM316)

SEQ ID NO:133 (que codifica el D3 de NEM316)

SEQ ID NO:134 (que codifica el D4 de NEM316)

SEQ ID NO:135 (que codifica el subfragmento de D3 de 2603) SEQ ID NO:136 (que codifica D4H de 2603)

SEQ ID NO:137 (que codifica el subfragmento de D3 de 515) SEQ ID NO:138 (que codifica D4H de 515)

SEQ ID NO:139 (que codifica el subfragmento de D3 de cjb111) SEQ ID NO:140 (que codifica D4H de cjb111)

SEQ ID NO:141 (que codifica el subfragmento de D3 de h36b) SEQ ID NO:142 (que codifica D4H de h36b)

SEQ ID NO:143 (que codifica el subfragmento de D3 de CJB110) SEQ ID NO:144 (que codifica D4H de CJB110)

SEQ ID NO:145 (que codifica el subfragmento de D3 de DK21) SEQ ID NO:146 (que codifica D4H de DK21)

SEQ ID NO:147 (que codifica el subfragmento de D3 de NEM316) SEQ ID NO:148 (que codifica D4H de NEM316)

SEQ ID NO:149 (que codifica D3+D4 de 2603)

SEQ ID NO:150 (que codifica D3+D4H de 2603)

SEQ ID NO:151 (que codifica D2+D3+D4 de 2603)

SEQ ID NO:152 (que codifica D2+D3+D4H de 2603)

SEQ ID NO:153 (que codifica D3+D4 de 515)

SEQ ID NO:154 (que codifica D3+D4H de 515)

SEQ ID NO:155 (que codifica D2+D3+D4 de 515)

SEQ ID NO:156 (que codifica D2+D3+D4H de 515)

SEQ ID NO:157 (que codifica D3+D4 de cjb111)

SEQ ID NO:158 (que codifica D3+D4H de cjb111)

SEQ ID NO:159 (que codifica D2+D3+D4 de cjb111)

S E Q ID NO :221 (G B S 3 de 515)

S E Q ID N O :222 (G B S 3 de c jb111)

S E Q ID N O :223 (G B S 3 de c o h l)

S E Q ID N O :224 (S A N 1485 de c o h l)

S E Q ID N O :225 (G B S 147 de 2603)

S E Q ID N O :226 (G B S 328 de 2603)

S E Q ID N O :227 (G B S 84 de 2603)

S E Q ID N O :228-261 (C ebadores)

S E Q ID N O :262 (secu en c ia de A D N de 4H 11 /B 7 -V H )

S E Q ID N O :263 (secu en c ia de am inoá c ido s de 4H 11 /B 7 -V H )

S E Q ID N O :264 (secu en c ia de A D N de 4H 11 /B 7 -V Lk)

S E Q ID N O :265 (secu en c ia de am inoá c ido s de 4H 11 /B 7 -V Lk)

S E Q ID N O :266 (secu en c ia de A D N de 17C 4/A 3-V H )

S E Q ID N O :267 (secu en c ia de am inoá c ido s de 17C 4 /A 3-V H )

S E Q ID N O :268 (secu en c ia de A D N de 17C 4 /A 3-V Lk)

SEQ ID N O :269 (secu en c ia de am inoá c ido s de 17C 4/A 3-V Lk)

S E Q ID N O :270 (e p íto p o de D3 un ido m ed ian te 4H 11 /B 7 y 17C 4/A 3)

S E Q ID NO :271 (R rgB)

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[44] D o cum e n to W O 99/62923.

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Claims

R E IV IN D IC A C IO N E S

1. Un po lipép tido h íbrido in m uno gé n ico que com p ren de la secuenc ia de am inoácidos:

-A -{-X -L -}n-B -en la que L es una s e cu e n c ia de am inoá c ido s en la za d o ra opcional; A es una e tiq ue ta de h is tid ina N -te rm ina l opcional; B es una e tiq ue ta de h is tid ina C -term ina l opciona l; n es un nú m ero en te ro de 6 o m ás y en la que cad a X es una secu en c ia de am inoá c ido s d is tin ta se le cc io n a d a del g ru po que con s is te en:

a) un p rim er po lipép tido que con s is te en una secu en c ia de am inoác idos S E Q ID NO: 38;

b) un se g un do po lipép tido que cons is te en una secu en c ia de am inoá c ido s S E Q ID NO: 42;

c) un te rce r po lipép tido que con s is te en una secu en c ia de am inoá c ido s SEQ ID NO: 40;

d) un cua rto po lipép tido que con s is te en una secu en c ia de am inoác idos S E Q ID NO: 36;

e) un qu in to po lipép tido que con s is te en una secu en c ia de am inoá c ido s S E Q ID NO: 44;

f) un sex to po lipép tido que cons is te en una secuenc ia de am inoác idos S E Q ID NO: 46; y

en el que el po lipép tido h íb rid o es ca p a z de conferir p ro te cc ió n cruza da con tra cep as de G B S que expresan d is tin tos a le los cua nd o se p ru eb a en un m odelo de inm un izac ión m aterna de ra tón /expo s ic ió n de c rías neonata les.

2. El po lip ép tid o h íb rid o de la re iv ind icac ió n 1, en el que L se se lecc io na del g ru p o que co n s is te en G S G S (S E Q ID NO: 80), G S G G G G (S E Q ID NO : 81) y G S G S G G G G (S E Q ID NO: 82).

3. Un po lipép tido h íbrido que com p ren de la secu en c ia de am inoác idos S E Q ID NO: 83.

4. U na co m p os ic ión in m u no gé n ica que co m p re n d e un po lipép tido h íb rid o de a cu erd o con una cua lqu ie ra de las re iv ind icac iones 1 a 3 y uno o m ás ve h íc u lo s y/o exc ip ie n tes fa rm acé utico s.

5. La com p os ic ión in m u n o g é n ica de la re iv ind icac ió n 4, que co m p re n d e ad ic io na lm en te uno o m ás sa cá rid o s cap su la res de G BS.

6 . La com p os ic ión in m u no gé n ica de la re iv ind icac ión 5, qu e incluye un sa cá rido de uno o m ás de los se ro tipo s e s trep tocóc icos Ia, Ib, Ia/c, II, III, IV, V, VI, VII y VIII.

7. La com p osic ión in m u no gé n ica de la re iv ind icac ión 6, que in c luye un sacá rido de uno o m ás de los sero tipo s Ia, Ib, II, III y V.

8 . La com p osic ión in m u no gé n ica de una cua lqu ie ra de las re iv ind icac io ne s 4 a 7, que es una vacuna.

9. El po lipép tido h íb rid o de una cua lqu ie ra de las re iv ind icac iones 1 a 3 o la com p osic ión in m u no gé n ica de una cua lqu ie ra de las re iv ind icac io ne s 4 a 8 para su uso en terap ia .

10. El po lipép tido h íb rid o de una cua lqu ie ra de las re iv ind icaciones 1 a 3 o la com posic ión in m uno gé n ica de una cua lqu ie ra de las re iv ind icac io ne s 4 a 8, para su uso en el tra ta m ie n to o la p revenc ión de una en fe rm ed ad y/o in fecc ión p rovocada po r Streptococcus del g ru p o B (G BS), in c luyendo el tra ta m ie n to o la prevención de la m eningitis.

11. El po lipép tido h íb rid o de una cua lqu ie ra de las re iv ind icaciones 1 a 3 o la com posic ión in m uno gé n ica de una cua lqu ie ra de las re iv ind icac io ne s 4 a 8, para su uso en un p ro ced im ien to de tra ta m ie n to o p revenc ión de una en fe rm e d a d y/o in fección p ro voca da po r Streptococcus del g rupo B en un m am ífe ro , c o m p re n d ie n d o el p ro ced im ien to ad m in is tra r al m a m ífe ro una can tida d e ficaz del po lipép tido o de la com p osic ión inm unogénica .

12. El po lip ép tid o h íb rid o o co m p os ic ión in m uno gé n ica de la re iv ind icac ión 11 para su uso de acuerdo con la re iv ind icación 11, en la qu e el m a m ífe ro es un se r hum ano.

13. Un ác ido nu c le ico qu e com p ren de una se cu e n c ia de nucleó tidos que cod ifica un po lipép tido h íb rid o de acuerdo con la re iv ind icac ión 1 ,2 o 3.

14. El ác ido nucle ico de la re iv ind icac ión 13, que com p ren de una secu en c ia de nucleó tidos S E Q ID NO: 88.

15. El ác ido nucle ico de la re iv ind icac ión 13, que com p ren de una secu en c ia de nu c leó tidos S E Q ID NO: 93.

16. Un ve c to r que c o m p re n d e una s e cu e n c ia de nu c leó tidos de a cu erd o con una cua lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 13 a 15.

17. U na bacte ria qu e com p re n d e un ácido nucle ico de a cu erd o con la re iv ind icac ión 13, 14 o 15, o que exp resa un po lipép tido h íb rid o de acu erd o con la re iv ind icac ión 1, 2 o 3.