JP6008741B2 - 肺炎球菌ＲｒｇＢクレイドの組み合わせ - Google Patents

肺炎球菌ＲｒｇＢクレイドの組み合わせ Download PDF

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Description

（技術分野）
本発明は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（肺炎球菌）に対する免疫化の分野内にある。
（発明の背景）
Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅは、ＲｌｒＡ転写調節因子、ＬＰＸＴＧ型細胞壁ソーティングシグナルを有する３つの線毛サブユニット、ならびに線毛ポリマーの合成および補助的な線毛成分の組み込みに関与している３つのソルターゼ酵素をコードする７つの遺伝子を有する１４ｋｂの島（ｉｓｌｅｔ）によってコードされる線毛−１（ＰＩ−１）として知られる線毛を有する。ＲｒｇＢは、構造の骨格を形成する主要サブユニットであり、その他の２つのピリン（ＲｒｇＡ、ＲｒｇＣ）は、補助的な構造タンパク質である（非特許文献１［１］、非特許文献２［２］、特許文献１［３］、および非特許文献３［４］）。ＲｒｇＡは、主要な線毛−１アドヘシンであり、ＲｒｇＡを欠く細菌は、野生型生物よりも上皮細胞に対して接着性が低い。
国際公開第２００７／１１６３２２号
Ｂａｒｏｃｃｈｉ ｅｔ ａｌ． ＰＮＡＳ ＵＳＡ （２００６） １０３：２８５７−６２． Ｂａｇｎｏｌｉ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． （２００８） １９０（１５）：５４８０−９２． ＬｅＭｉｅｕｘ ｅｔ ａｌ． Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ （２００６） ７４：２４５３−６．
（発明の概要）
本発明は、
（ａ）（ｉ）配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、および／もしくは（ｉｉ）配列番号１に由来する少なくとも７個の連続するアミノ酸の断片からなる、アミノ酸配列を含む第１のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド、
（ｂ）（ｉ）配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、および／もしくは（ｉｉ）配列番号２に由来する少なくとも７個の連続するアミノ酸の断片からなる、アミノ酸配列を含む第２のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド、ならびに／または
（ｃ）（ｉ）配列番号３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、および／もしくは（ｉｉ）配列番号３に由来する少なくとも７個の連続するアミノ酸の断片からなる、アミノ酸配列を含む第３のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド
のうちの少なくとも２つを含む免疫原性組成物に関する。
本発明はまた、
（ａ）（ｉ）配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、および／もしくは（ｉｉ）配列番号１に由来する少なくとも７個の連続するアミノ酸の断片からなる、アミノ酸配列を含む第１のアミノ酸配列、
（ｂ）（ｉ）配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、および／もしくは（ｉｉ）配列番号２に由来する少なくとも７個の連続するアミノ酸の断片からなる、アミノ酸配列を含む第２のアミノ酸配列、ならびに／または
（ｃ）（ｉ）配列番号３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、および／もしくは（ｉｉ）配列番号３に由来する少なくとも７個の連続するアミノ酸の断片からなる、アミノ酸配列を含む第３のアミノ酸配列
のうちの少なくとも２つを含むポリペプチドにも関する。
本発明はさらに、
アミノ酸配列：
Ａ−｛−Ｘ−Ｌ−｝ｎ−Ｂ
［式中、各Ｘは、請求項１で定義される、第１のポリペプチド、第２のポリペプチドまたは第３のポリペプチドのアミノ酸配列であり、Ｌは、任意選択のリンカーアミノ酸配列であり、Ａは、任意選択のＮ末端アミノ酸配列であり、Ｂは、任意選択のＣ末端アミノ酸配列であり、ｎは、２以上の整数である］
を含むポリペプチドに関する。場合により、ポリペプチドは、請求項１に定義される、第１、第２および第３のポリペプチドのうちの少なくとも２つを含む。
特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、配列番号１１、１３、１５、１７、１９および２１からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
本発明はまた、
（ａ）（ｉ）配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、および／もしくは（ｉｉ）配列番号１に由来する少なくとも７個の連続するアミノ酸の断片からなる、アミノ酸配列を含む第１のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド、
（ｂ）（ｉ）配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、および／もしくは（ｉｉ）配列番号２に由来する少なくとも７個の連続するアミノ酸の断片からなる、アミノ酸配列を含む第２のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド、ならびに／または
（ｃ）（ｉ）配列番号３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、および／もしくは（ｉｉ）配列番号３に由来する少なくとも７個の連続するアミノ酸の断片からなる、アミノ酸配列を含む第３のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド
のうちの少なくとも２つを発現する細菌にも関する。
本願は一実施形態において以下の項目を提供する：
（項目１）
（ａ）
（ｉ）配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、および／もしくは
（ｉｉ）配列番号１に由来する少なくとも７個の連続するアミノ酸の断片からなる
アミノ酸配列を含む第１のアミノ酸配列を含む、第１のポリペプチド、
（ｂ）
（ｉ）配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、および／もしくは
（ｉｉ）配列番号２に由来する少なくとも７個の連続するアミノ酸の断片からなる
アミノ酸配列を含む第２のアミノ酸配列を含む、第２のポリペプチド、ならびに／または
（ｃ）
（ｉ）配列番号３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、および／もしくは
（ｉｉ）配列番号３に由来する少なくとも７個の連続するアミノ酸の断片からなる
アミノ酸配列を含む第３のアミノ酸配列を含む、第３のポリペプチド
のうちの少なくとも２つを含む、免疫原性組成物。
（項目２）
（ａ）
（ｉ）配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、および／もしくは
（ｉｉ）配列番号１に由来する少なくとも７個の連続するアミノ酸の断片からなる
アミノ酸配列を含む、第１のアミノ酸配列、
（ｂ）
（ｉ）配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、および／もしくは
（ｉｉ）配列番号２に由来する少なくとも７個の連続するアミノ酸の断片からなる
アミノ酸配列を含む、第２のアミノ酸配列、ならびに／または
（ｃ）
（ｉ）配列番号３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、および／もしくは
（ｉｉ）配列番号３に由来する少なくとも７個の連続するアミノ酸の断片からなる
アミノ酸配列を含む、第３のアミノ酸配列
のうちの少なくとも２つを含む、ポリペプチド。
（項目３）
アミノ酸配列：
Ａ−｛−Ｘ−Ｌ−｝ ｎ −Ｂ
（式中、各Ｘは、項目１で定義される、第１のポリペプチド、第２のポリペプチドまたは第３のポリペプチドのアミノ酸配列であり、Ｌは、任意選択のリンカーアミノ酸配列であり、Ａは、任意選択のＮ末端アミノ酸配列であり、Ｂは、任意選択のＣ末端アミノ酸配列であり、ｎは、２以上の整数である）
を含む、ポリペプチド。
（項目４）
配列番号１１、１３、１５、１７、１９および２１からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、項目２または項目３に記載のポリペプチド。
（項目５）
（ａ）
（ｉ）配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、および／もしくは
（ｉｉ）配列番号１に由来する少なくとも７個の連続するアミノ酸の断片からなる
アミノ酸配列を含む第１のアミノ酸配列を含む、第１のポリペプチド、
（ｂ）
（ｉ）配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、および／もしくは
（ｉｉ）配列番号２に由来する少なくとも７個の連続するアミノ酸の断片からなる
アミノ酸配列を含む第２のアミノ酸配列を含む、第２のポリペプチド、ならびに／または
（ｃ）
（ｉ）配列番号３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、および／もしくは
（ｉｉ）配列番号３に由来する少なくとも７個の連続するアミノ酸の断片からなる
アミノ酸配列を含む第３のアミノ酸配列を含む、第３のポリペプチド
のうちの少なくとも２つを発現する、細菌。
（項目６）
配列番号８３のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
図１は、５つのＲｒｇＢキメラおよび対照を用いる菌血症研究の結果を示す。図は、ＣＦＵ／ｍｌである。各印は、単一マウスのデータを示す。 図２は、５つのＲｒｇＢキメラおよび対照を用いる死亡率研究の結果を示す。図は日数での生存期間である。各印は、単一マウスのデータを示す。 図３は、４つのレーンを有するゲルを示す。左から右へ、レーンは、ＭＷマーカー、Ｉ−ＩＩ−ＩＩＩキメラ、Ｉ−ＩＩ−ＩＩＩキメラおよびＢＳＡ標準物を含有する。矢印は、２１４ｋＤａのＭＷを示す。 図４Ａは、ＴＩＧＲ４ ＲｒｇＢに対して生じた４つのｍＡｂまたは生理食塩水対照を使用する受動的防御データを示す。ｙ軸は、２４時間菌血症のＣＦＵ／ｍｌを示す。図４Ｂは、ＴＩＧＲ４ ＲｒｇＢに対して生じた４つのｍＡｂを用いる死亡率研究の結果を示す。 図５および６は、ＴＩＧＲ４配列（図５）または６Ｂ配列（図６）に対して生じたｍＡｂを使用するウエスタンブロットを示す。レーンは、左から右へ、マーカー、ＲｒｇＢ Ｉ−ＩＩ−ＩＩＩ、ＲｒｇＢ ＩＩ−Ｉ−ＩＩＩ、ＲｒｇＢ ＩＩ−ＩＩＩ−Ｉ、ＲｒｇＢ ＩＩＩ−Ｉ−ＩＩ、ＲｒｇＢ ＩＩＩ−ＩＩ−Ｉ、ＲｒｇＢ ＴＩＧＲ４、ＲｒｇＢ ６Ｂ、ＲｒｇＢ ２３Ｆ、ＢＳＡ対照である。 図５および６は、ＴＩＧＲ４配列（図５）または６Ｂ配列（図６）に対して生じたｍＡｂを使用するウエスタンブロットを示す。レーンは、左から右へ、マーカー、ＲｒｇＢ Ｉ−ＩＩ−ＩＩＩ、ＲｒｇＢ ＩＩ−Ｉ−ＩＩＩ、ＲｒｇＢ ＩＩ−ＩＩＩ−Ｉ、ＲｒｇＢ ＩＩＩ−Ｉ−ＩＩ、ＲｒｇＢ ＩＩＩ−ＩＩ−Ｉ、ＲｒｇＢ ＴＩＧＲ４、ＲｒｇＢ ６Ｂ、ＲｒｇＢ ２３Ｆ、ＢＳＡ対照である。 図７は、アラム（ａｌｕｍ）アジュバント添加Ｉ−ＩＩ−ＩＩＩキメラ、ＩＩＩ−ＩＩ−Ｉキメラ、ＴＩＧＲ４またはアラム単独を用いる免疫化後の（Ａ）菌血症および（Ｂ）死亡率データを示す。図７Ａでは、データは、ＣＦＵ／ｍｌであり、図７Ｂでは、データは、日数での生存期間である。 図８は、ＴＩＧＲ４株に対するＯＰＫＡ結果を示し、血清希釈に対するＯＰＫＡ死滅％を示す。菱形は、正の対照血清を示し、免疫前血清は、塗りつぶした四角であり、ｘ軸近くに見え、その他の５本の線は５つのキメラに対して生じた血清のものである。 図９は、配列番号１〜３および８５〜９６の同一性％に基づいた系図を示す。配列番号を表示している。 図１０は、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型６Ｂに対するＯＰＫＡ結果を示し、血清希釈に対する死滅％を示す。 図１１は、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型６Ｂに対するＯＰＫＡ結果を示し、最大１／１３１２２０希釈の血清希釈に対する死滅％を示す。 図１２は、種々の用量のＩＩＩ−ＩＩ−Ｉキメラを用いる免疫化後の（Ａ）菌血症および（Ｂ）死亡率データを示す。図１２Ａでは、データは、ＣＦＵ／ｍｌであり、図１２Ｂでは、データは、日数での生存期間である。 図１３は、２０μｇのＲｒｇＢ ＩＩＩ−ＩＩ−Ｉキメラを用いる免疫化後の（Ａ）菌血症および（Ｂ）死亡率データを示す。図１３Ａでは、データは、ＣＦＵ／ｍｌであり、図１３Ｂでは、データは、日数での生存期間である。 図１４は、ＭＦ５９アジュバントを使用したＩＩＩ−ＩＩ−Ｉ ＲｒｇＢキメラが、防御的であることを実証する。菱形は、アジュバント添加ＲｒｇＢキメラを示し、丸は、ＭＦ５９単独を示す。 図１５は、ＲｒｇＢ ＩＩＩ−ＩＩ−Ｉキメラを用いる皮下免疫化後の（Ａ）菌血症および（Ｂ）死亡率データを示す。図１５Ａでは、データは、ＣＦＵ／ｍｌであり、図１５Ｂでは、データは、日数での生存期間である。 図１６は、２４時間菌血症アッセイにおいて、正常ウサギ血清（ＮＲＳ）対照と比較して、ＲｒｇＢ ＩＩＩ−ＩＩ−Ｉキメラが、受動的防御研究において機能的抗体の産生を誘発することを示す。 図１７は、（Ａ）ＴＩＧＲ４および（Ｂ）ＳＴ３５Ｂに対するＯＰＫＡ結果を示し、血清希釈に対する死滅％を示す。菱形は、抗Ｔ４を示し、丸は、ＲｒｇＢ ＩＩＩ−ＩＩ−Ｉキメラを示し、四角は、ＮＳＫを示す。 図１８は、ＴＩＧＲ４株に対するＯＰＫＡ結果を示し、これは、ＯＰＡ活性が、特異的に、ＲｒｇＢ ＩＩＩ−ＩＩ−Ｉキメラに対して生じた抗体によるものであることを示す。 図１９は、単一ＲｒｇＢドメインがインビボで防御をもたらすことを示す。三角は、ＲｒｇＢキメラを示し、菱形は、Ｄ１ドメインを示し、四角は、Ｄ４ドメインを示し、丸は、アラムを示す。 図２０は、ＴＩＧＲ４ ＲｒｇＢに対して生じた４つの防御的ｍＡｂの各々を用いて結合について試験された、種々のＲｒｇＢドメイン（単一ドメインＤ１、Ｄ２、Ｄ３およびＤ４ならびにマルチドメイン断片Ｄ１〜３、Ｄ２〜４、Ｄ３〜４）のウエスタンブロット分析を示す。 図２１は、トリプシン消化ＲｒｇＢに対するモノクローナル抗体２３Ｆ８／Ｃ１０結合を用いて実施したウエスタンブロット分析を示す。 図２２（Ａ）は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ線毛骨格Ｓｐｙ０１２８のドメイン１結晶構造に対するＲｒｇＢドメインＤ１アミノ酸配列のモデルである。（Ｂ）は、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＲｒｇＢ結晶構造（Ｄ２〜Ｄ３）およびモデル化Ｄ１ドメインである。（Ｃ）は、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ線毛の３Ｄ再構築電子密度マップである。 図２３は、さらなるポリペプチド抗原の種々の組み合わせと組み合わせた場合の（２０μｇ抗原）、ＲｒｇＢ ＩＩＩ−ＩＩ−Ｉキメラを用いるｉ．ｐ．免疫化後の６Ｂ−Ｆｉｎｌａｎｄ株（ｉ．ｖ．チャレンジ）に対する（Ａ）４８時間菌血症および（Ｂ）死亡率データを示す。図２３Ａでは、データは、ＣＦＵ／ｍｌであり、図２３Ｂでは、データは、日数での生存期間である。（Ａ）および（Ｂ）の両方において、列１は、ｓｐｒ００５７、ｓｐｒ００９６およびｓｐｒ２０２１の組み合わせを示し、列２は、ＳＰ２２１６−１、ＳＰ１７３２−３およびＰｓａＡの組み合わせを示し、列３は、ＲｒｇＢ ＩＩＩ−ＩＩ−Ｉキメラを示し、列４は、ｓｐｒ００５７、ｓｐｒ００９６およびｓｐｒ２０２１と組み合わせたＲｒｇＢ ＩＩＩ−ＩＩ−Ｉキメラを示し、列５は、ＳＰ２２１６−１、ＳＰ１７３２−３およびＰｓａＡと組み合わせたＲｒｇＢ ＩＩＩ−ＩＩ−Ｉキメラを示し、列６は、アラム対照を示す。 図２４は、さらなるポリペプチド抗原の種々の組み合わせと組み合わせた場合の（２０μｇ抗原）、ＲｒｇＢ ＩＩＩ−ＩＩ−Ｉキメラを用いるｉ．ｐ．免疫化後の３５Ｂ−ＳＭＥ１５株（ｉ．ｖ．チャレンジ）に対する（Ａ）４８時間菌血症および（Ｂ）死亡率データを示す。図２４Ａでは、データは、ＣＦＵ／ｍｌであり、図２４Ｂでは、データは、日数での生存期間である。（Ａ）および（Ｂ）の両方において、列１は、ｓｐｒ００５７、ｓｐｒ００９６およびｓｐｒ２０２１の組み合わせを示し、列２は、ＳＰ２２１６−１、ＳＰ１７３２−３およびＰｓａＡの組み合わせを示し、列３は、ＲｒｇＢ ＩＩＩ−ＩＩ−Ｉキメラを示し、列４は、ｓｐｒ００５７、ｓｐｒ００９６およびｓｐｒ２０２１と組み合わせたＲｒｇＢ ＩＩＩ−ＩＩ−Ｉキメラを示し、列５は、ＳＰ２２１６−１、ＳＰ１７３２−３およびＰｓａＡと組み合わせたＲｒｇＢ ＩＩＩ−ＩＩ−Ｉキメラを示し、列６は、アラム対照を示す。 図２５は、タグのないＩＩＩ−ＩＩ−Ｉキメラおよびアラム対照（ｉ．ｐ．免疫化、ＴＩＧＲ４ ２．１Ｅ＋０２ ＣＦＵ／マウスを用いるｉ．ｐ．チャレンジ）と比較した、ポリヒスチジンタグを含有するＩＩＩ−ＩＩ−Ｉキメラを使用する（Ａ）２４時間菌血症アッセイおよび（Ｂ）死亡率データを示す。（Ａ）では、データは、ＣＦＵ／ｍｌであり、（Ｂ）では、日数での生存期間である。 図２６は、（ｉ）タグのないＩＩＩ−ＩＩ−Ｉキメラ、（ｉｉ）ｓｐｒ００５７、ｓｐｒ００９６およびｓｐｒ２０２１の組み合わせ、（ｉｉｉ）タグのないＩＩＩ−ＩＩ−Ｉキメラとさらに組み合わせた、ｓｐｒ００５７、ｓｐｒ００９６およびｓｐｒ２０２１の組み合わせならびに（ｉｖ）アラム対照（ｉ．ｐ．免疫化、ＴＩＧＲ４ １．６Ｅ＋０２ＣＦＵ／マウスを用いるｉ．ｐ．チャレンジ）と比較した、ポリヒスチジンタグを含有するＩＩＩ−ＩＩ−Ｉキメラを使用する、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける２４時間菌血症アッセイを示す。 図２７は、タグのないＩＩＩ−ＩＩ−Ｉキメラおよびアラム対照（ｉ．ｐ．免疫化、３５Ｂ−ＳＭＥ１５ ４．６Ｅ＋０７ＣＦＵ／マウスを用いるｉ．ｖ．チャレンジ）と比較した、ポリヒスチジンタグを含有するＩＩＩ−ＩＩ−Ｉキメラを使用する（Ａ）４８時間菌血症アッセイおよび（Ｂ）死亡率データを示す。（Ａ）では、データは、ＣＦＵ／ｍｌであり、（Ｂ）では、日数での生存期間である。 図２８は、タグのないＩＩＩ−ＩＩ−Ｉキメラおよびアラム対照（ｉ．ｐ．免疫化、６ＢＦｉｎｌａｎｄ１２ ９．４Ｅ＋０７ＣＦＵ／マウスを用いるｉ．ｖ．チャレンジ）と比較した、ポリヒスチジンタグを含有するＩＩＩ−ＩＩ−Ｉキメラを使用する（Ａ）４８時間菌血症アッセイおよび（Ｂ）死亡率データを示す。（Ａ）では、データは、ＣＦＵ／ｍｌであり、（Ｂ）では、日数での生存期間である。 図２９は、タグのないＩＩＩ−ＩＩ−Ｉキメラおよびアラム対照（ｉ．ｐ．免疫化、ＴＩＧＲ４ ６．３Ｅ＋０５ＣＦＵ／マウスを用いるｉ．ｖ．チャレンジ）と比較した、ポリヒスチジンタグを含有するＩＩＩ−ＩＩ−Ｉキメラを使用する（Ａ）４８時間菌血症アッセイおよび（Ｂ）死亡率データを示す。（Ａ）では、データは、ＣＦＵ／ｍｌであり、（Ｂ）では、日数での生存期間である。 図３０は、アラム対照（ｉ．ｐ．免疫化、ＴＩＧＲ４を用いるｉ．ｖ．チャレンジ）と比較した、２０μｇのＩＩＩ−ＩＩ−Ｉキメラを用いる免疫化後の（Ａ）４８時間菌血症アッセイおよび（Ｂ）死亡率データを示す。（Ａ）では、データは、ＣＦＵ／ｍｌであり、（Ｂ）では、日数での生存期間である。 図３１は、アラム対照（ｉ．ｐ．免疫化、ＴＩＧＲ４を用いるｉ．ｐ．チャレンジ）と比較した、２０μｇのＩＩＩ−ＩＩ−Ｉキメラを用いる免疫化後の（Ａ）２４時間菌血症アッセイおよび（Ｂ）死亡率データを示す。（Ａ）では、データは、ＣＦＵ／ｍｌであり、（Ｂ）では、日数での生存期間である。 図３２は、アラム対照（ｉ．ｐ．免疫化、３５Ｂ−ＳＭＥ１５を用いるｉ．ｖ．チャレンジ）と比較した、２０μｇのＩＩＩ−ＩＩ−Ｉキメラを用いる免疫化後の（Ａ）２４時間菌血症アッセイおよび（Ｂ）死亡率データを示す。（Ａ）では、データは、ＣＦＵ／ｍｌであり、（Ｂ）では、日数での生存期間である。 図３３は、アラム対照（ｉ．ｐ．免疫化、６Ｂ Ｆｉｎｌａｎｄ１２を用いるｉ．ｖ．チャレンジ）と比較した、２０μｇのＩＩＩ−ＩＩ−Ｉキメラを用いる免疫化後の（Ａ）２４時間菌血症アッセイおよび（Ｂ）死亡率データを示す。（Ａ）では、データは、ＣＦＵ／ｍｌであり、（Ｂ）では、日数での生存期間である。 図３４は、極めて少量の線毛を発現するＴＩＧＲ４株（Ｔ４−）と比較して、線毛を過剰発現するＴＩＧＲ４株（Ｔ４＋）を用いてチャレンジした場合の、アラム対照（ｉ．ｐ．免疫化、ＴＩＧＲ４を用いるｉ．ｖ．チャレンジ）と比較した、ＩＩＩ−ＩＩ−Ｉキメラを用いる免疫化後の（Ａ）４８時間菌血症アッセイおよび（Ｂ）死亡率データを示す。（Ａ）では、データは、ＣＦＵ／ｍｌであり、（Ｂ）では、日数での生存期間である。 図３５は、（Ａ）線毛を過剰発現する６ＢＦｉｎｌ１２株を用いてチャレンジした場合（ｉ．ｐ．免疫化、線毛を過剰発現する６ＢＦｉｎｌａｎｄ１２ ７．０Ｅ＋０９ＣＦＵ／マウスを用いるｉ．ｖ．チャレンジ）の、および（Ｂ）極めて少量の線毛しか発現しない６ＢＦｉｎｌ１２株を用いてチャレンジした場合（ｉ．ｐ．免疫化、線毛を低発現する（ｕｎｄｅｒｅｘｐｒｅｓｓ）６ＢＦｉｎｌａｎｄ１２ ７．３Ｅ＋０９ＣＦＵ／マウスを用いるｉ．ｖ．チャレンジ）の、ＩＩ−Ｉ−ＩＩＩおよびＩＩＩ−ＩＩ−Ｉキメラを用いる免疫化後の４８時間菌血症アッセイを示す。（Ａ）および（Ｂ）は両方とも、ｓｐｒ００５７、ｓｐｒ００９６およびｓｐｒ２０２１の組み合わせ、６ＢＦｉｎｌａｎｄ−ＣＲＭ１９７結合体、およびアラムのデータも示す。（Ａ）では、データは、ＣＦＵ／ｍｌであり、（Ｂ）では、日数での生存期間である。 図３６は、１１３個の急性中耳炎Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ単離物の収集物について、線毛−１が、抗生物質に対して感受性である株と比較して、抗生物質に対して耐性である（エリスロマイシン耐性、ペニシリン耐性および多剤耐性）株において、より一般に存在していることを示す、ＭＬＳＴデータベースのインシリコ分析である。
（発明の詳細な説明）
ＲｒｇＢ線毛サブユニットは、少なくとも３つのクレイドを有する。３つのクレイドの参照アミノ酸配列は、本明細書では配列番号１、２および３である。クレイドは、そのＮ末端およびＣ末端では十分に保存されているが、その間では差異がある。配列番号１と配列番号２とは４６％同一であり、配列番号１と配列番号３とは５１％同一であり、配列番号２と配列番号３とは６５％同一である。
所与のＲｒｇＢクレイドに対する血清は、そのクレイドを発現する肺炎球菌に対して活性であるが、その他の２つのクレイドのうちの１つを発現する株に対しては活性ではなく、すなわち、クレイド内交差防御はあるが、クレイド間交差防御はないことがわかった。したがって、本発明によれば、免疫原性組成物は、ＲｒｇＢの少なくとも２つの異なるクレイドを含む。これらは、免疫原性組成物中に別個のポリペプチドとして存在してもよく、単一ポリペプチド鎖として融合されてもよい。ワクチン成分として複数のＲｒｇＢクレイドを含めることによって、線毛含有肺炎球菌に対する免疫原性組成物の株の適用範囲が改善される。さらに、線毛−１の存在と抗生物質耐性との間に有意な関連があることが観察され、この観察結果は、複数のＲｒｇＢクレイドを含む免疫原性組成物を使用する線毛−１に対する免疫化が、抗生物質処置に対して耐性である肺炎球菌に対する防御というさらなる利点を有することを示唆する。
したがって、本発明は、
（ａ）（ｉ）配列番号１に対して少なくともａ％の配列同一性を有し、および／もしくは（ｉｉ）配列番号１に由来する少なくともｘ個の連続するアミノ酸の断片からなる、アミノ酸配列を含む第１のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド、
（ｂ）（ｉ）配列番号２に対して少なくともｂ％の配列同一性を有し、および／もしくは（ｉｉ）配列番号２に由来する少なくともｙ個の連続するアミノ酸の断片からなる、アミノ酸配列を含む第２のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド、ならびに／または
（ｃ）（ｉ）配列番号３に対して少なくともｃ％の配列同一性を有し、および／もしくは（ｉｉ）配列番号３に由来する少なくともｚ個の連続するアミノ酸の断片からなる、アミノ酸配列を含む第３のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド
のうちの少なくとも２つを含む免疫原性組成物を提供する。
本発明はまた、
（ａ）（ｉ）配列番号１に対して少なくともａ％の配列同一性を有し、および／もしくは（ｉｉ）配列番号１に由来する少なくともｘ個の連続するアミノ酸の断片からなる、アミノ酸配列を含む第１のアミノ酸配列、
（ｂ）（ｉ）配列番号２に対して少なくともｂ％の配列同一性を有し、および／もしくは（ｉｉ）配列番号２に由来する少なくともｙ個の連続するアミノ酸の断片からなる、アミノ酸配列を含む第２のアミノ酸配列、ならびに／または
（ｃ）（ｉ）配列番号３に対して少なくともｃ％の配列同一性を有し、および／もしくは（ｉｉ）配列番号３に由来する少なくともｚ個の連続するアミノ酸の断片からなる、アミノ酸配列を含む第３のアミノ酸配列
のうちの少なくとも２つを含むポリペプチドも提供する。
本発明はまた、アミノ酸配列：
−Ａ−｛−Ｘ−Ｌ−｝ｎ−Ｂ−
［式中、Ｘは、上記で定義される、第１のポリペプチド、第２のポリペプチドまたは第３のポリペプチドのアミノ酸配列であり、Ｌは、任意選択のリンカーアミノ酸配列であり、Ａは、任意選択のＮ末端アミノ酸配列であり、Ｂは、任意選択のＣ末端アミノ酸配列であり、ｎは、２以上の整数（例えば、２、３、４、５、６など）である］
を含むポリペプチドも提供する。場合により、ポリペプチドは、請求項１で定義される第１、第２および第３のポリペプチドのうちの少なくとも２つを含む。通常、ｎは、２または３であり、Ｘ部分は、以下から選択される。
Figure 0006008741
 本発明はまた、
（ａ）（ｉ）配列番号１に対して少なくともａ％の配列同一性を有し、および／もしくは（ｉｉ）配列番号１に由来する少なくともｘ個の連続するアミノ酸の断片からなる、アミノ酸配列を含む第１のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド、
（ｂ）（ｉ）配列番号２に対して少なくともｂ％の配列同一性を有し、および／もしくは（ｉｉ）配列番号２に由来する少なくともｙ個の連続するアミノ酸の断片からなる、アミノ酸配列を含む第２のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド、ならびに／または
（ｃ）（ｉ）配列番号３に対して少なくともｃ％の配列同一性を有し、および／もしくは（ｉｉ）配列番号３に由来する少なくともｚ個の連続するアミノ酸の断片からなる、アミノ酸配列を含む第３のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド
のうちの少なくとも２つを発現する細胞（通常、肺炎球菌などの細菌）を提供する。
（第１、第２および第３のアミノ酸配列）
ａの値は、少なくとも７５、例えば、８０、８５、９０、９２、９４、９５、９６、９７、９８、９９またはそれ以上である。ｂの値は、少なくとも７５、例えば、８０、８５、９０、９２、９４、９５、９６、９７、９８、９９またはそれ以上である。ｃの値は、少なくとも７５、例えば、８０、８５、９０、９２、９４、９５、９６、９７、９８、９９またはそれ以上である。ａ、ｂおよびｃの値は、同一であっても、異なっていてもよい。いくつかの実施形態では、ａ、ｂおよびｃは、同一である。通常、ａ、ｂおよびｃは、少なくとも９０、例えば、少なくとも、９５である。
ｘの値は、少なくとも７、例えば８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２５、２５０である。ｙの値は、少なくとも７、例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２５、２５０である。ｚの値は、少なくとも７、例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２５、２５０である。ｘ、ｙおよびｚの値は、同一であっても、異なっていてもよい。いくつかの実施形態では、ｘ、ｙおよびｚは、同一である。
断片は、それぞれの配列番号の配列に由来するエピトープを含むことが好ましい。その他の有用な断片は、それぞれの配列番号のＣ末端から１個または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個またはそれ以上）および／またはＮ末端から１個または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個またはそれ以上）を欠き、一方で、その少なくとも１つのエピトープを保持する。Ｎ末端での２０〜２５個のアミノ酸の末端切断、例えば、配列番号１〜３のいずれかの（または配列番号８５〜９６のいずれか１つの）アミノ酸１〜２３の除去は、好都合である。
ＲｒｇＢタンパク質は、そのリーダーペプチドとそのＬＰＸＴＧアンカーとの間で４つのドメイン（Ｄ１〜Ｄ４）に分けることができる。これらの４つのドメインは、配列番号１〜３において以下のとおりであり、これらの残基に対応するさらなるＲｒｇＢ配列における位置は、アラインメントによって容易に同定できる。
Figure 0006008741
 受動的防御研究に基づいて、ＲｒｇＢの有用な断片は、少なくともドメインＤ１および／またはＤ４に由来するエピトープを保持し得る。図２０に示されるように、ドメインＤ１、ドメインＤ４およびドメインＤ２〜Ｄ４を含有する断片と結合する抗体が作製されている。したがって、好ましい断片は、ドメインＤ１、ドメインＤ４およびドメインＤ２〜Ｄ４を含有する断片を含む。
配列番号１の適した断片は、配列番号４である。
配列番号２の適した断片は、配列番号５である。
配列番号３の適した断片は、配列番号６である。
配列番号１に由来する少なくともｘ個の連続するアミノ酸の断片はまた、配列番号２内または配列番号３内に存在しないはずである。同様に、配列番号２に由来する少なくともｙ個の連続するアミノ酸の断片はまた、配列番号１内または配列番号３内に存在しないはずである。同様に、配列番号３に由来する少なくともｚ個の連続するアミノ酸の断片はまた、配列番号１内または配列番号２内に存在しないはずである。したがって、いくつかの実施形態では、配列番号１の断片は、好ましくは、配列番号１のアミノ酸３１〜６１４の間であり、配列番号２の断片は、好ましくは、配列番号２のアミノ酸３１〜５９３の間であり、配列番号３の断片は、好ましくは、配列番号３のアミノ酸３１〜６０３の間である。配列番号１に由来する少なくともｘ個の連続するアミノ酸の断片はまた、配列番号８５、８８および／または８９のうちのいずれか１つに存在し得る。同様に、配列番号２に由来する少なくともｙ個の連続するアミノ酸の断片はまた、配列番号８６、９０、９１、９４および／または９６のうちのいずれか１つに存在し得る。同様に、配列番号３に由来する少なくともｚ個の連続するアミノ酸の断片はまた、配列番号８７、９２、９３および／または９５のうちのいずれか１つに存在し得る。いくつかの実施形態では、配列番号１〜３のうちの１つに由来する断片が、他の２つの配列番号に対して連続する配列としてアラインメントされると、その断片と、他の２つの配列番号の各々との間の同一性は、７５％未満、例えば、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満である。
エピトープマッピング研究に基づいて、配列番号１のエピトープは、配列番号１の残基３２と１４１との間、より詳しくは、配列番号１の残基５５と８９との間に同定されている。したがって、配列番号１の有用な断片は、配列番号１の残基３２〜１４１および配列番号１の残基５５〜８９を含む。
第１のアミノ酸配列を含むポリペプチドは、被験体に投与されると、配列番号１のアミノ酸配列を有する野生型肺炎球菌タンパク質（株ＴＩＧＲ４）と結合する抗体を含む抗体反応を誘発する。いくつかの実施形態では、これらの抗体は、配列番号２のアミノ酸配列を有する野生型肺炎球菌タンパク質とも、配列番号３のアミノ酸配列を有する野生型肺炎球菌タンパク質とも結合しない。
第２のアミノ酸配列を含むポリペプチドは、被験体に投与されると、配列番号２のアミノ酸配列を有する野生型肺炎球菌タンパク質（株Ｆｉｎｌａｎｄ６Ｂ−１２）と結合する抗体を含む抗体反応を誘発する。いくつかの実施形態では、これらの抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を有する野生型肺炎球菌タンパク質とも、配列番号３のアミノ酸配列を有する野生型肺炎球菌タンパク質とも結合しない。
第３のアミノ酸配列を含むポリペプチドは、被験体に投与されると、配列番号３のアミノ酸配列を有する野生型肺炎球菌タンパク質（株Ｔａｉｗａｎ２３Ｆ−１５）と結合する抗体を含む抗体反応を誘発する。いくつかの実施形態では、これらの抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を有する野生型肺炎球菌タンパク質とも、配列番号２のアミノ酸配列を有する野生型肺炎球菌タンパク質とも結合しない。
第１、第２および第３のアミノ酸配列は、共通の一部の配列を共有し得るが、全体的には、それらは異なるアミノ酸配列を有する。
本発明が、２つのＲｒｇＢクレイドのみを使用する場合、組成物またはポリペプチドは、（ａ）上記で定義される第１のアミノ酸配列および（ｂ）上記で定義される第２のアミノ酸配列の両方を含み得る。代替実施形態では、組成物は、（ａ）上記で定義される第１のアミノ酸配列および（ｂ）上記で定義される第３のアミノ酸配列の両方を含む。代替実施形態では、組成物は、（ａ）上記で定義される第２のアミノ酸配列および（ｂ）上記で定義される第３のアミノ酸配列の両方を含む。
本発明とともに使用されるアミノ酸配列は、配列番号１、２または３と比較して、１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０など）の保存的アミノ酸置換、すなわち、あるアミノ酸から、関連側鎖を有する別のアミノ酸への置換を含み得る。遺伝的にコードされるアミノ酸は、通常、４つのファミリー：（１）酸性アミノ酸、すなわち、アスパラギン酸、グルタミン酸、（２）塩基性アミノ酸、すなわち、リシン、アルギニン、ヒスチジン、（３）非極性アミノ酸、すなわち、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、および（４）非荷電極性アミノ酸、すなわち、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシンに分けられる。フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは、一緒に、芳香族アミノ酸として分類されることもある。一般に、これらのファミリー内での単一アミノ酸の置換は、生物活性に対して大きな影響を有さない。ポリペプチドは、参照配列に対して、１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０など）の単一アミノ酸欠失を有し得る。ポリペプチドはまた、参照配列に対して、１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０など）の挿入（例えば、１、２、３、４または５個のアミノ酸の各々）を含み得る。
本発明とともに使用されるポリペプチドは、
（ａ）配列番号１、２または３と同一（すなわち、１００％同一）であるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１、２または３と配列同一性を共有するアミノ酸配列、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の配列と比較して、別個の位置であってもよく、連続していてもよい、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０（またはそれ以上）の単一アミノ酸変更（欠失、挿入、置換）を有するアミノ酸配列、
（ｄ）ペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して配列番号１、２または３をアラインメントした場合に、Ｎ末端からＣ末端のｘ個のアミノ酸の各移動ウィンドウ（ｍｏｖｉｎｇ ｗｉｎｄｏｗ）（ｐ個のアミノ酸に及ぶアラインメントについては、ｐ＞ｘである場合には、ｐ−ｘ＋１個のこのようなウィンドウがあるような）が、少なくともｘ・ｙ個の同一であるアラインメントされたアミノ酸を有する（式中、ｘは、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００から選択され、ｙは、０．５０、０．６０、０．７０、０．７５、０．８０、０．８５、０．９０、０．９１、０．９２、０．９３、０．９４、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８、０．９９から選択され、ｘ・ｙが整数ではない場合は、最も近い整数に切り上げられる）アミノ酸配列（好ましいペアワイズアラインメントアルゴリズムは、デフォルトパラメータ（例えば、ＥＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用して、ギャップオープニングペナルティー＝１０．０、ギャップ伸長ペナルティー＝０．５を用いる）を使用する、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈのグローバルアラインメントアルゴリズムである［５］。このアルゴリズムが、ＥＭＢＯＳＳパッケージ中のニードル（ｎｅｅｄｌｅ）ツールで実施されることは好都合である［６］）
を含み得る。
群（ｃ）内で、欠失または置換は、Ｎ末端および／またはＣ末端である場合も、２つの末端の間である場合もある。したがって、末端切断は、欠失の一例である。末端切断は、Ｎ末端および／またはＣ末端での最大４０個（またはそれ以上）のアミノ酸の欠失を含み得る。
一般に、本発明のポリペプチドが、配列番号１〜３に由来する完全な肺炎球菌配列と同一でない配列を含む場合（例えば、配列番号１〜３に由来する完全な肺炎球菌配列に対して＜１００％の配列同一性を有する配列リストを含む場合、またはその断片を含む場合）、各個々の場合において、ポリペプチドが、完全な肺炎球菌配列を認識する抗体を誘発し得ることが好ましい。
参照のために、配列番号１〜３および８５〜９６は、４５個の異なる株において同定されている、１５個の特有のＲｒｇＢ配列である。これらの配列のいずれも、本発明を実施するのに使用してよい。したがって、例えば、本発明とともに使用するための第１のポリペプチドは、以下の群（１）において列挙される配列番号のうちのいずれか１つを含み得、本発明とともに使用するための第２のポリペプチドは、以下の群（２）において列挙される配列番号のうちのいずれか１つを含み得、本発明とともに使用するための第３のポリペプチドは、以下の群（３）において列挙される配列番号のうちのいずれか１つを含み得る。群（１）〜（３）は以下のとおりである。
（１）配列番号１、８５、８８、８９
（２）配列番号２、８６、９０、９１、９４、９６
（３）配列番号３、８７、９２、９３、９５。
（ハイブリッドポリペプチド）
本発明において使用される種々のＲｒｇＢクレイドは、別個のポリペプチドとして存在しなくてもよく、代わりに、単一ポリペプチド鎖（「ハイブリッド」ポリペプチドまたは「キメラ」）として発現されてもよい。ハイブリッドポリペプチドは、２つの主な利点を提供する。第１に、それ自体では、安定でない、または不十分にしか発現されない可能性があるポリペプチドが、その問題を克服するために適したハイブリッドパートナーを加えることによって補助され得る。第２に、両方とも抗原的に有用である２つのポリペプチドを製造するために、商業的生産が、１つの発現および精製のみが使用されることが必要であるように単純化される。
ハイブリッドポリペプチドは、ＲｒｇＢ抗原のみに由来する配列を含み得るが、その他の実施形態では、その他の線毛サブユニットなどの非ＲｒｇＢ抗原（通常、肺炎球菌非ＲｒｇＢ抗原）を含み得る。非ＲｒｇＢ抗原が存在する場合には、これらは、いずれか２つのＲｒｇＢ配列のＮ末端、いずれか２つのＲｒｇＢ配列のＣ末端である場合も、２つのＲｒｇＢ配列の間である場合もある。
種々のハイブリッドポリペプチドを、単一の処方物中で一緒に混合してもよい。ハイブリッドは、非ハイブリッドＲｒｇＢ抗原またはその他の非ＲｒｇＢ抗原と組み合わせてもよい。
ハイブリッドポリペプチドは、式ＮＨ２−Ａ−｛−Ｘ−Ｌ−｝ｎ−Ｂ−ＣＯＯＨによって表され得る。
−Ｘ−部分が、リーダーペプチド配列をその野生型の形態で有する場合には、これは、ハイブリッドタンパク質では、含まれる場合も、省かれる場合もある。いくつかの実施形態では、リーダーペプチドは、ハイブリッドタンパク質のＮ末端に位置する−Ｘ−部分のものを除いて欠失される。すなわち、Ｘ１のリーダーペプチドは保持されるが、Ｘ２・・・Ｘｎのリーダーペプチドは省かれる。これは、すべてのリーダーペプチドを欠失させて、Ｘ１のリーダーペプチドを部分−Ａ−として使用することと同等である。
｛−Ｘ−Ｌ−｝のｎ個各々の例について、リンカーアミノ酸配列−Ｌ−は、存在する場合も存在しない場合もある。例えば、ｎ＝２の場合には、ハイブリッドは、ＮＨ２−Ｘ１−Ｌ１−Ｘ２−Ｌ２−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−Ｘ１−Ｘ２−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−Ｘ１−Ｌ１−Ｘ２−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｌ２−ＣＯＯＨなどであり得る。リンカーアミノ酸配列（複数可）−Ｌ−は、通常、短いもの（例えば、２０個以下のアミノ酸、すなわち、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１個）となる。例として、クローニングを容易にする短いペプチド配列、ポリグリシンリンカー（すなわち、Ｇｌｙｎ（ここで、ｎ＝２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上）を含む）およびヒスチジンタグ（すなわち、Ｈｉｓｎ（ここで、ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上））が含まれる。その他の適したリンカーアミノ酸配列は、当業者には明らかである。有用なリンカーとして、ＧＳＧＧＧＧ（配列番号７）またはＧＳＧＳＧＧＧＧ（配列番号８）があり、ＢａｍＨＩ制限部位からＧｌｙ−Ｓｅｒジペプチドが形成され、したがって、クローニングおよび操作を補助し、（Ｇｌｙ）４テトラペプチドは典型的なポリグリシンリンカーである。特に、最終Ｌｎとして使用するための、その他の適したリンカーとして、Ｌｅｕ−ＧｌｕジペプチドまたはＧｌｙ−Ｓｅｒがある。リンカーは、通常、構造的柔軟性を促進するために、少なくとも１個のグリシン残基を含む。例えば、−Ｌ−部分は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれ以上のグリシン残基を含み得る。このようなグリシンは、Ｇｌｙ−Ｇｌｙジペプチド配列において、またはより長いオリゴＧｌｙ配列、すなわち、Ｇｌｙｎ（ここで、ｎ＝２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上）において、少なくとも２つの連続するグリシンを含むよう配置され得る。
−Ａ−は、任意選択のＮ末端アミノ酸配列である。これは、通常、短いもの（例えば、４０個以下のアミノ酸、すなわち、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１個）となる。例として、タンパク質輸送を方向付けるリーダー配列またはクローニングもしくは精製を容易にする短いペプチド配列（例えば、ヒスチジンタグ、すなわち、Ｈｉｓｎ（ここで、ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上））が含まれる。その他の適したＮ末端アミノ酸配列は、当業者には明らかである。Ｘ１が、それ自体のＮ末端メチオニンを欠く場合には、−Ａ−は、Ｎ末端メチオニンを提供するオリゴペプチド（例えば、１、２、３、４、５、６、７または８個のアミノ酸を含む）、例えば、Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｓｅｒまたは単一Ｍｅｔ残基であることが好ましい。新生ポリペプチドでは、−Ａ−部分が、ポリペプチドのＮ末端メチオニン（細菌では、ホルミル−メチオニン、ｆＭｅｔ）を提供し得る。しかし、１個または複数のアミノ酸が、新生−Ａ−部分のＮ末端から切断される場合があり、その結果、本発明の成熟ポリペプチドでは、−Ａ−部分は、必ずしもＮ末端メチオニンを含まない。
−Ｂ−は、任意選択のＣ末端アミノ酸配列である。これは、通常、短いもの（例えば、４０個以下のアミノ酸、すなわち、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１個）となる。例として、タンパク質輸送を方向付ける配列、クローニングもしくは精製を容易にする短いペプチド配列（例えば、ヒスチジンタグ、すなわち、Ｈｉｓｎ（ここで、ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上）、例えば、配列番号９を含む）またはタンパク質の安定性を増強する配列が挙げられる。その他の適したＣ末端アミノ酸配列、例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、チオレドキシン、Ｓ．ａｕｒｅｕｓプロテインＡの１４ｋＤａの断片、ビオチン化ペプチド、マルトース結合性タンパク質、エンテロキナーゼｆｌａｇなどは、当業者には明らかである。
−Ａ−、−Ｂ−および−Ｌ−配列は、ヒトポリペプチド配列と１０個またはそれ以上の連続するアミノ酸を共有する配列を含まないことが好ましい。
いくつかの実施形態では、−Ｌ−部分は、非ＲｒｇＢ抗原を含む。いくつかの実施形態では、−Ａ−部分は、非ＲｒｇＢ抗原を含み、−Ｂ−部分が非ＲｒｇＢ抗原を含む場合もある。
本発明はまた、本発明のハイブリッドポリペプチドをコードする核酸を提供する。
種々のＡ、Ｂ、ＸおよびＬ部分のうち、有用な組み合わせとして、それだけには限らないが、以下が挙げられる。
Figure 0006008741
 したがって、本発明のハイブリッドの例として、配列番号１１（配列番号１２によってコードされる）、配列番号１３（配列番号１４によってコードされる）、配列番号１５（配列番号１６によってコードされる）、配列番号１７（配列番号１８によってコードされる）、配列番号１９（配列番号２０によってコードされる）、配列番号２１（配列番号２２によってコードされる）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられる。
本発明は、配列番号１１、１３、１５、１７、１９または２１のうちのいずれか１つに対して少なくともｉ％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。ｉの値は、５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９またはそれ以上から選択され得る。
（ポリペプチド）
本発明とともに使用されるポリペプチドは、多数の方法で、例えば、化学合成（全体、または部分）によって、長いポリペプチドをプロテアーゼを使用して消化することによって、ＲＮＡからの翻訳によって、細胞培養物からの（例えば、組換え発現から）、生物自体からの（例えば、細菌培養後の、または患者から直接）精製によって等で、調製できる。＜４０個アミノ酸長のペプチドの好ましい製造方法は、インビトロ化学合成を含む［７、８］。固相ペプチド合成、例えば、ｔＢｏｃまたはＦｍｏｃ［９］化学に基づく方法は、特に好ましい。酵素的合成［１０］も部分でまたは全体で使用してもよい。化学合成の代替として、生物学的合成も使用してよい。例えば、ポリペプチドは、翻訳によって製造され得る。これはインビトロで実施しても、インビボで実施してもよい。生物学的方法は、一般に、Ｌ−アミノ酸をベースとするポリペプチドの製造に制限されるが、翻訳機構の（例えば、アミノアシルｔＲＮＡ分子の）操作を使用して、Ｄ−アミノ酸の（または、ヨードチロシンまたはメチルフェニルアラニン、アジドホモアラニンなどといった、その他の非天然アミノ酸の）導入を可能にすることができる［１１］。しかし、Ｄ−アミノ酸が含まれる場合には、化学合成を使用することが好ましい。ポリペプチドは、Ｃ末端および／またはＮ末端に共有結合修飾を有し得る。
ポリペプチドは、種々の形態（例えば、天然、融合物、グリコシル化、非グリコシル化、脂質付加、非脂質付加、リン酸化、非リン酸化、ミリストイル化、非ミリストイル化、単量体、多量体、粒状、変性など）をとり得る。
ポリペプチドは、精製、または実質的に精製された形態で提供されること、すなわち、その他のポリペプチドを実質的に含まない（例えば、天然ポリペプチドを含まない）、特に、その他の肺炎球菌または宿主細胞ポリペプチドを含まないことが好ましく、一般に、少なくとも約５０％純粋（重量で）であり、通常、少なくとも約９０％純粋である。すなわち、約５０％未満、より好ましくは、約１０％未満（例えば、５％以下）の組成物が、その他の発現されたポリペプチドで構成されている。
ポリペプチドは、固相支持体に結合されていてもよい。ポリペプチドは、検出可能な標識（例えば、放射性もしくは蛍光標識またはビオチン標識）を含み得る。
用語「ポリペプチド」とは、任意の長さのアミノ酸ポリマーを指す。ポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、修飾されたアミノ酸を含んでいてもよく、非アミノ酸によって中断されていてもよい。この用語はまた、天然に、または介入、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは修飾、例えば、標識成分との結合体化によって、修飾されているアミノ酸ポリマーを包含する。また、この定義内に、例えば、１個または複数のアミノ酸の類似体（例えば、非天然アミノ酸などを含む）ならびに当技術分野で公知のその他の修飾を含有するポリペプチドも含まれる。ポリペプチドは、単一鎖または会合している鎖として生じ得る。ポリペプチドは、天然に、または非天然にグリコシル化され得る（すなわち、ポリペプチドは、対応する天然に存在するポリペプチドにおいて見られるグリコシル化パターンとは異なるグリコシル化パターンを有する）。
本発明は、ポリペプチド発現を誘導する条件下で本発明の宿主細胞を培養することを含む、本発明のポリペプチドを製造するプロセスを提供する。ポリペプチドの発現は、連鎖球菌で起こり得るが、本発明は、通常、発現のために異種宿主を使用する。異種宿主は、原核生物（例えば、細菌）であっても、真核生物であってもよい。通常、大腸菌となるが、その他の適した宿主として、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｌａｃｔａｍｉｃａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ（例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、酵母などが挙げられる。
本発明はまた、ポリペプチドが、化学的手段を使用して、部分または全体において合成される、本発明のポリペプチドを製造するプロセスを提供する。
本発明はまた、２つ以上の本発明のポリペプチドを含む組成物を提供する。
（核酸）
本発明はまた、本発明のハイブリッドポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。本発明はまた、このようなヌクレオチド配列に対して配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。このような核酸は、同一アミノ酸をコードするために代替コドンを使用するものを含む。
本発明はまた、これらの核酸とハイブリダイズできる核酸を提供する。ハイブリダイゼーション反応は、種々の「ストリンジェンシー」の条件下で実施してよい。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーを増大させる条件は、当技術分野では広く知られており、公開されている。関連条件の例として（ストリンジェンシーが増大する順に）、２５℃、３７℃、５０℃、５５℃および６８℃のインキュベーション温度、１０×ＳＳＣ、６×ＳＳＣ、１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣ（ここで、ＳＳＣは、０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび１５ｍＭクエン酸緩衝剤である）の緩衝液濃度およびその他の緩衝液系を使用するその同等物、０％、２５％、５０％および７５％のホルムアミド濃度、５分〜２４時間のインキュベーション時間、１回、２回またはそれ以上の洗浄ステップ、１分、２分または１５分の洗浄インキュベーション時間、ならびに６×ＳＳＣ、１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣまたは脱イオン水の洗浄溶液が挙げられる。ハイブリダイゼーション技術およびその最適化は、当技術分野では周知である［例えば、参考文献１２および２３９などを参照のこと］。
本発明は、これらの配列と相補的である配列を含む核酸を含む（例えば、アンチセンスもしくはプロービングのため、またはプライマーとして使用するため）。
本発明の核酸は、種々の形態（例えば、一本鎖、二本鎖、ベクター、プライマー、プローブ、標識されたものなど）をとり得る。本発明の核酸は、環状または分岐であり得るが、通常は直鎖となる。特に断りのない限り、または必要でない限り、核酸を利用する本発明の任意の実施形態は、二本鎖形態と二本鎖形態を構成する２つの相補的一本鎖形態の各々との両方を利用し得る。プライマーおよびプローブは、通常、一本鎖であり、アンチセンス核酸も同様である。
本発明の核酸は、精製、または実質的に精製された形態で、すなわち、その他の核酸を実質的に含まずに（例えば、天然に存在する核酸を含まずに）、特に、その他の肺炎球菌核酸または宿主細胞核酸を含まずに提供されることが好ましく、一般に、少なくとも約５０％純粋（重量で）、通常、少なくとも約９０％純粋である。本発明の核酸は、肺炎球菌核酸であることが好ましい。
本発明の核酸は、多数の方法で、例えば、全体または部分における化学合成（例えば、ＤＮＡのホスホラミダイト合成）によって、長い核酸をヌクレアーゼ（例えば、制限酵素）を使用して消化することによって、短い核酸またはヌクレオチドを結合することによって（例えば、リガーゼまたはポリメラーゼを使用して）、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーから等で、調製してもよい。
本発明の核酸は、固相支持体（例えば、ビーズ、プレート、フィルター、フィルム、スライド、マクロアレイ支持体、樹脂など）と結合してもよい。本発明の核酸は、例えば、放射性標識または蛍光標識またはビオチン標識を用いて標識され得る。これは、核酸が、検出技術において使用される予定である場合、例えば、核酸がプライマーである場合、またはプローブとして使用される場合は特に有用である。
用語「核酸」は、一般的な意味で、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を含み、これは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドおよび／またはそれらの類似体を含有する。ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを含む。また、ＤＮＡまたはＲＮＡ類似体、例えば、修飾された骨格を含有するもの（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはホスホロチオエート）または修飾された塩基を含有するものを含む。したがって、本発明は、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、組換え核酸、分岐核酸、プラスミド、ベクター、プローブ、プライマーなどを含む。本発明の核酸が、ＲＮＡの形態をとる場合には、５’キャップを有する場合も有さない場合もある。
本発明の核酸は、ベクターの一部、すなわち、１つまたは複数の細胞の形質導入／トランスフェクションのために設計された核酸構築物の一部であり得る。ベクターは、例えば、挿入されたヌクレオチドの単離、増幅および複製のために設計されている「クローニングベクター」、宿主細胞におけるヌクレオチド配列の発現のために設計されている「発現ベクター」、組換えウイルスまたはウイルス様粒子の産生をもたらすよう設計されている「ウイルスベクター」、または２つ以上のベクターの特質を含む「シャトルベクター」であり得る。好ましいベクターとして、プラスミドがある。「宿主細胞」は、外因性核酸のレシピエントであり得る、またはレシピエントである個々の細胞または細胞培養物を含む。宿主細胞は、単一の宿主細胞の子孫を含むが、子孫は、天然の、偶発的な、または意図的な変異および／または変化のために、最初の親細胞と必ずしも完全に同一ではない場合もある（形態学において、または全ＤＮＡ相補体において）。宿主細胞は、本発明の核酸を用いてインビボまたはインビトロでトランスフェクトされた細胞または感染した細胞を含む。
核酸がＤＮＡである場合は、当然のことではあるが、ＲＮＡ配列中の「Ｕ」は、ＤＮＡ中では「Ｔ」に置き換えられる。同様に、核酸がＲＮＡである場合は、当然のことではあるが、ＤＮＡ配列中の「Ｔ」は、ＲＮＡ中では、「Ｕ」に置き換えられる。
用語「相補体」または「相補的」とは、核酸に関連して使用される場合、ワトソン−クリック塩基対形成を指す。したがって、Ｃの相補体は、Ｇであり、Ｇの相補体は、Ｃであり、Ａの相補体は、Ｔ（またはＵ）であり、Ｔ（またはＵ）の相補体は、Ａである。例えば、ピリミジン（ＣまたはＴ）を相補するためにＩ（プリンイノシン）などの塩基を使用することも可能である。
本発明の核酸を、例えば、インビトロまたはインビボでポリペプチドを製造するために使用すること、生物学的サンプルにおける核酸の検出のためのハイブリダイゼーションプローブとして使用すること、核酸のさらなるコピーを作製するために使用すること、リボザイムまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドを作製するために使用すること、一本鎖ＤＮＡプライマーまたはプローブとして使用すること、または三重鎖形成オリゴヌクレオチドとして使用することができる。
本発明は、化学的手段を使用して部分または全体において合成される、本発明の核酸を製造するプロセスを提供する。
本発明は、本発明のヌクレオチド配列を含むベクター（例えば、クローニングベクターまたは発現ベクター）およびこのようなベクターを用いて形質転換された宿主細胞を提供する。
（免疫原性組成物）
本発明の混合物およびハイブリッドポリペプチドは、免疫原性組成物中の有効成分として有用である。このような免疫原性組成物は、ワクチンとして有用であり得る。これらのワクチンは、予防的（すなわち、感染を防ぐため）または治療的（すなわち、感染を処置するため）のいずれかであり得るが、通常、予防的となる。
したがって、組成物は、薬学的に許容され得る。それらは、普通、抗原に加えて、成分を含む。例えば、それらは、通常、１つまたは複数の薬学的キャリアおよび／または賦形剤を含む。このような成分の徹底的な考察は、参考文献２３４において入手可能である。
組成物は、通常、水性形態で哺乳動物に投与される。しかし、投与前において、組成物は非水性形態であってもよい。例えば、一部のワクチンは、水性形態で製造され、同様に水性形態で、充填され、分配され、投与されるが、その他のワクチンは、製造の際に凍結乾燥され、使用時に水性形態に再構成される。したがって、本発明の組成物は乾燥されていてもよい（例えば、凍結乾燥処方物）。
組成物は、チオメルサールまたは２−フェノキシエタノールなどの防腐剤を含み得る。しかし、ワクチンは、水銀物質を実質的に含まないようにする（すなわち、５μｇ／ｍｌ未満）べきであり、例えば、チオメルサールを含まないことが好ましい。水銀を含有しないワクチンが、より好ましい。防腐剤を含まないワクチンが、特に好ましい。
張度を制御するために、ナトリウム塩などの生理学的塩を含むことが好ましい。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が好ましく、これは、１から２０ｍｇ／ｍｌの間、例えば、約１０±２ｍｇ／ｍｌ ＮａＣｌで存在してもよい。存在してもよいその他の塩として、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二ナトリウム二水和物（ｄｉｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒａｔｅ）、塩化マグネシウム、塩化カルシウムなどが挙げられる。
組成物は、通常、２００ｍＯｓｍ／ｋｇから４００ｍＯｓｍ／ｋｇの間、好ましくは、２４０〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇの間の重量オスモル濃度を有し、２９０〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲内に入ることがより好ましい。
組成物は、１つまたは複数の緩衝剤を含み得る。通常の緩衝剤として、リン酸緩衝剤、Ｔｒｉｓ緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、ヒスチジン緩衝剤（特に、水酸化アルミニウムアジュバントと共に）またはクエン酸緩衝剤が挙げられる。緩衝剤は、通常、５〜２０ｍＭの範囲で含まれる。
組成物のｐＨは、通常、５．０から８．１の間、より通常的には、６．０から８．０の間、例えば、６．５から７．５または７．０から７．８の間となる。
組成物は、無菌であることが好ましい。組成物は、非発熱性であること、例えば、用量あたり＜１ＥＵ（エンドトキシンユニット、標準的な基準）を含有することが好ましく、用量あたり＜０．１ＥＵが好ましい。組成物は、グルテンを含まないことが好ましい。
組成物は、単一免疫化のための材料を含む場合も、複数免疫化のための材料を含む場合もある（すなわち、「複数用量」キット）。防腐剤を含むことは、複数用量準備においては好ましい。複数用量組成物では、防腐剤を含むことの代替として（または、それに加えて）、組成物は、材料を取り出すための無菌アダプターを有する容器中に含有される場合もある。
ヒトワクチンは、通常、約０．５ｍｌの投薬量で投与されるが、小児には、半分の用量（すなわち、約０．２５ｍｌ）を投与してもよい。
本発明の免疫原性組成物はまた、１つまたは複数の免疫調節性物質を含み得る。１つまたは複数の免疫調節性物質が、１つまたは複数のアジュバント、例えば、２、３、４またはそれ以上のアジュバントを含むことが好ましい。アジュバントとして、以下でさらに論じられるＴＨ１アジュバントおよび／またはＴＨ２アジュバントを挙げることができる。
本発明の組成物において使用してもよいアジュバントとして、それだけには限らないが、以下が挙げられる。
（Ａ．無機物含有組成物）
本発明においてアジュバントとして使用するのに適した無機物含有組成物として、アルミニウム塩およびカルシウム塩などの無機塩が挙げられる。本発明は、水酸化物（例えば、オキシ水酸化物）、リン酸塩（例えば、ヒドロキシリン酸塩、オルトリン酸塩）、硫酸塩などといった無機塩［例えば、参考文献１３の第８＆９章を参照のこと］、または種々の無機化合物の混合物を含み、これらの化合物は任意の適した形態（例えば、ゲル、結晶、非晶質など）をとり、吸着が好ましい。無機物含有組成物はまた、金属塩の粒子として処方してもよい。
「水酸化アルミニウム」として公知のアジュバントは、通常、普通は、少なくとも部分的に結晶であるオキシ水酸化アルミニウム塩である。式ＡｌＯ（ＯＨ）によって表すことができるオキシ水酸化アルミニウムは、赤外（ＩＲ）分光法によって、特に、１０７０ｃｍ−１での吸収帯（ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ｂａｎｄ）および３０９０〜３１００ｃｍ−１の強いショルダーの存在によって、水酸化アルミニウムＡｌ（ＯＨ）３などのその他のアルミニウム化合物と区別できる［参考文献１３の第９章］。水酸化アルミニウムアジュバントの結晶化度の程度は、半分の高さでの回折バンドの幅（ｗｉｄｔｈ ｏｆ ｔｈｅ ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ ｂａｎｄ ａｔ ｈａｌｆ ｈｅｉｇｈｔ（ＷＨＨ））によって反映され、不十分な結晶の粒子は、小さな結晶サイズのために、より大きなラインブロードニングを示す。ＷＨＨが増大するにつれ、表面積は増大し、高いＷＨＨ値を有するアジュバントが、抗原吸着のための高い能力を有するとわかった。繊維性形態（例えば、透過型電子顕微鏡において見られるような）は、水酸化アルミニウムアジュバントにとって典型的である。水酸化アルミニウムアジュバントのｐＩは、通常、約１１であり、すなわち、アジュバント自体は、生理学的ｐＨで正の表面電荷を有する。水酸化アルミニウムアジュバントについては、ｐＨ７．４で１ｍｇのＡｌ＋＋＋あたり１．８〜２．６ｍｇの間のタンパク質吸着能力が報告されている。
「リン酸アルミニウム」として公知のアジュバントは、通常、ヒドロキシリン酸アルミニウムであり、少量の硫酸塩も含有することが多い（すなわち、ヒドロキシリン酸硫酸アルミニウム）。それらは、沈殿によって得ることができ、沈殿の際の反応条件および濃度が、塩中の、ホスフェートのヒドロキシルとの置換度に影響を及ぼす。ヒドロキシリン酸塩は、通常、０．３から１．２の間のＰＯ４／Ａｌモル比を有する。ヒドロキシリン酸塩は、ヒドロキシル基の存在によって厳密なＡｌＰＯ４と区別できる。例えば、３１６４ｃｍ−１でのＩＲスペクトルバンド（例えば、２００℃に加熱した場合の）は、構造的ヒドロキシルの存在を示す［参考文献１３の第９章］。
リン酸アルミニウムアジュバントのＰＯ４／Ａｌ３＋モル比は、通常、０．３から１．２の間、好ましくは、０．８から１．２の間、より好ましくは、０．９５±０．１となる。リン酸アルミニウムは、特に、ヒドロキシリン酸塩については、通常、非晶質である。通常のアジュバントは、０．６ｍｇ Ａｌ３＋／ｍｌで含まれる、０．８４から０．９２の間のＰＯ４／Ａｌモル比を有する非晶質ヒドロキシリン酸アルミニウムである。リン酸アルミニウムは、通常、粒状（例えば、透過型電子顕微鏡において見られるプレート様の形態）となる。粒子の通常の直径は、任意の抗原吸着後に０．５〜２０μｍの範囲（例えば、約５〜１０μｍ）にある。リン酸アルミニウムアジュバントについては、ｐＨ７．４で、１ｍｇのＡｌ＋＋＋あたり０．７〜１．５ｍｇの間のタンパク質の吸着能力が報告されている。
リン酸アルミニウムのゼロ電荷点（ＰＺＣ）は、ホスフェートの、ヒドロキシルとの置換度と反比例し、この置換度は、沈殿による塩の調製に使用される反応条件および反応物質の濃度に応じて変わり得る。ＰＺＣはまた、溶液中の遊離リン酸イオンの濃度を変化させることによって（より多いホスフェート＝より酸性のＰＺＣ）、またはヒスチジン緩衝剤などの緩衝剤を添加することによって（ＰＺＣをより塩基性にする）変更される。本発明に従って使用されるリン酸アルミニウムは、通常、４．０から７．０の間、より好ましくは、５．０から６．５の間、例えば、約５．７のＰＺＣを有する。
本発明の組成物を調製するために使用されるアルミニウム塩の懸濁物は、緩衝剤（例えば、リン酸緩衝剤またはヒスチジン緩衝剤またはＴｒｉｓ緩衝剤）を含み得るが、これは、必ずしも必要とは限らない。懸濁物は、無菌で、発熱物質を含まないことが好ましい。懸濁物は、例えば、１．０から２０ｍＭの間、好ましくは、５から１５ｍＭの間、より好ましくは、約１０ｍＭの濃度で存在する、遊離水性リン酸イオンを含み得る。懸濁物はまた、塩化ナトリウムを含み得る。
一実施形態では、アジュバント成分は、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウム両方の混合物を含む。この場合には、水酸化物よりも多くの、例えば、少なくとも２：１、例えば、≧５：１、≧６：１、≧７：１、≧８：１、≧９：１などの重量比のリン酸アルミニウムが存在し得る。
患者に投与するための組成物中のＡｌ＋＋＋の濃度は、１０ｍｇ／ｍｌ未満、例えば、≦５ｍｇ／ｍｌ、≦４ｍｇ／ｍｌ、≦３ｍｇ／ｍｌ、≦２ｍｇ／ｍｌ、≦１ｍｇ／ｍｌなどであることが好ましい。好ましい範囲は、０．３から１ｍｇ／ｍｌの間である。最大＜０．８５ｍｇ／用量が好ましい。
（Ｂ．オイルエマルジョン）
本発明においてアジュバントとして使用するのに適したオイルエマルジョン組成物として、ＭＦ５９などのスクアレン−水エマルジョン［参考文献１３の第１０章、参考文献１４も参照のこと］（マイクロフルイダイザーを使用してサブミクロン粒子に処方された、５％スクアレン、０．５％Ｔｗｅｅｎ８０および０．５％Ｓｐａｎ８５）が挙げられる。完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）も使用してよい。
種々の適した水中油型エマルジョンが公知であり、それらは、通常、少なくとも１つの油と、少なくとも１つの界面活性剤を含み、油（複数可）および界面活性剤（複数可）は、生分解性（代謝可能）および生体適合性である。エマルジョン中の油滴は、通常、直径５μｍ未満であり、エマルジョンが、サブミクロンの直径を有する油滴を含むことが有利であり、これらの小さいサイズは、マイクロフルイダイザーを用いて達成され、安定なエマルジョンが提供される。２２０ｎｍ未満のサイズを有する液滴は、それらを濾過滅菌法に供することができるので好ましい。
本発明は、動物（例えば、魚）または植物供給源のものなどの油を用いて使用できる。植物油の供給源として、ナッツ、種子および穀類が挙げられる。ピーナッツ油、ダイズ油、ココナッツ油およびオリーブ油は、最も一般的に市販されているものであり、例示的なナッツ油である。例えば、ホホバ豆から得られるホホバ油を使用してもよい。種子油として、サフラワー油、綿実油、ヒマワリ種子油、ゴマ種子油などが挙げられる。穀類群では、コーン油が最も容易に入手可能であるが、コムギ、オートムギ、ライムギ、コメ、テフ、ライコムギなどのその他の穀物の油も使用してよい。グリセロールおよび１，２−プロパンジオールの６〜１０個の炭素の脂肪酸エステルは、種子油中では天然には生じないが、ナッツおよび種子油から出発して、適当な材料の加水分解、分離およびエステル化によって調製してもよい。哺乳動物の乳から得た脂肪および油は、代謝可能であり、したがって、本発明の実施において使用してもよい。動物供給源から純粋な油を得るために必要な分離、精製、けん化およびその他の手段の手順は、当技術分野で周知である。ほとんどの魚は、代謝可能な油を含有し、これは容易に回収され得る。例えば、タラ肝油、サメ肝油および鯨ろうなどの鯨油は、本明細書において使用してもよい魚油のいくつかを例示するものである。いくつかの分枝鎖油は、５炭素イソプレン単位で生化学的に合成され、通常、テルペノイドと呼ばれる。サメ肝油は、スクアレンとして知られる分岐、不飽和テルペノイド、２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサエンを含有する。その他の好ましい油として、トコフェロールがある（以下参照のこと）。スクアレン（ｓｑｌａｕｅｎｅ）を含む水中油型エマルジョンが特に好ましい。油の混合物を使用してもよい。
界面活性剤は、その「ＨＬＢ」（親水性／親油性バランス）によって分類できる。本発明の好ましい界面活性剤は、少なくとも１０、好ましくは、少なくとも１５、より好ましくは、少なくとも１６のＨＬＢを有する。本発明は、それだけには限らないが、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（一般に、Ｔｗｅｅｎと呼ばれる）、特に、ポリソルベート２０およびポリソルベート８０；ＤＯＷＦＡＸＴＭ商標の下で販売されている、エチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）および／またはブチレンオキシド（ＢＯ）のコポリマー、例えば、直鎖ＥＯ／ＰＯブロックコポリマー；反復エトキシ（オキシ−１，２−エタンジイル）基の数で変わり得るオクトキシノール（オクトキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００またはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノールは特に興味深い）；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）；ホスファチジルコリン（レシチン）などのリン脂質；ラウリル、セチル、ステアリルおよびオレイルアルコールに由来するポリオキシエチレン脂肪エーテル（Ｂｒｉｊ界面活性剤として公知である）、例えば、トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ３０）；ならびにソルビタンエステル（一般に、ＳＰＡＮとして公知である）、例えば、ソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ８５）およびソルビタンモノラウラートを含む界面活性剤を用いて使用できる。エマルジョンに含めるのに好ましい界面活性剤として、Ｔｗｅｅｎ８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）、Ｓｐａｎ８５（ソルビタントリオレエート）、レシチンおよびＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００がある。上で言及したように、Ｔｗｅｅｎ８０などの洗浄剤は、以下の実施例において見られる熱安定性に寄与し得る。
界面活性剤の混合物、例えば、Ｔｗｅｅｎ８０／Ｓｐａｎ８５混合物を使用してもよい。ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ８０）などのポリオキシエチレンソルビタンエステルおよびｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）などのオキトキシノールの組み合わせも適している。別の有用な組み合わせは、ラウレス９ならびにポリオキシエチレンソルビタンエステルおよび／またはオキトキシノールを含む。
好ましい量の界面活性剤（重量％）は、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（例えば、Ｔｗｅｅｎ８０）０．０１〜１％、特に、約０．１％；オクチル−またはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００またはＴｒｉｔｏｎシリーズ中のその他の洗浄剤）０．００１〜０．１％、特に、０．００５〜０．０２％；ポリオキシエチレンエーテル（例えば、ラウレス９）０．１〜２０％、好ましくは、０．１〜１０％、特に、０．１〜１％または約０．５％である。
本発明で有用な特定の水中油型エマルジョンアジュバントとして、それだけには限らないが以下が挙げられる。
・スクアレン、Ｔｗｅｅｎ８０およびＳｐａｎ８５のサブミクロンエマルジョン。容積によるエマルジョンの組成は、約５％スクアレン、約０．５％ポリソルベート８０および約０．５％Ｓｐａｎ８５であり得る。重量でいうと、これらの比は、４．３％スクアレン、０．５％ポリソルベート８０および０．４８％Ｓｐａｎ８５となる。このアジュバントは、参考文献１８の第１０章および参考文献１９の第１２章により詳細に記載されるように「ＭＦ５９」として公知である［１５〜１７］。ＭＦ５９エマルジョンは、クエン酸イオン、例えば、１０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝剤を含むことが有利である。
・スクアレン、α−トコフェロールおよびポリソルベート８０を含むエマルジョン。これらのエマルジョンは、２〜１０％のスクアレン、２〜１０％のトコフェロールおよび０．３〜３％のＴｗｅｅｎ８０を有し得、スクアレン：トコフェロールの重量比は、≦１（例えば、０．９０）であることが好ましいが、これは、この比が、より安定なエマルジョンを提供するからである。スクアレンおよびＴｗｅｅｎ８０は、約５：２の容積比で、または約１１：５の重量比で存在し得る。１つのこのようなエマルジョンは、ＰＢＳにＴｗｅｅｎ８０を溶解して、２％溶液を得、次いで、９０ｍｌのこの溶液を、（５ｇのＤＬ−α−トコフェロールおよび５ｍｌのスクアレン）の混合物と混合すること、次いで、混合物をマイクロフルイダイズすることによって作製できる。得られたエマルジョンは、例えば、平均直径が１００〜２５０ｎｍの間、好ましくは、約１８０ｎｍであるサブミクロン油滴を有し得る。
・スクアレン、トコフェロールおよびＴｒｉｔｏｎ洗浄剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）のエマルジョン。エマルジョンはまた、３ｄ−ＭＰＬ（以下参照のこと）を含み得る。エマルジョンは、リン酸緩衝剤を含有し得る。
・ポリソルベート（例えば、ポリソルベート８０）、Ｔｒｉｔｏｎ洗浄剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）およびトコフェロール（例えば、コハク酸α−トコフェロール）を含むエマルジョン。エマルジョンは、これら３つの成分を、約７５：１１：１０（例えば、７５０μｇ／ｍｌポリソルベート８０、１１０μｇ／ｍｌ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００および１００μｇ／ｍｌ コハク酸α−トコフェロール）の質量比で含んでよく、これらの濃度は、抗原からのこれらの成分の何らかの寄与を含むはずである。エマルジョンはまた、スクアレンを含んでもよい。エマルジョンはまた、３ｄ−ＭＰＬを含んでもよい（以下参照のこと）。水相は、リン酸緩衝剤を含有し得る。
・スクアラン、ポリソルベート８０およびポロキサマー４０１（「ＰｌｕｒｏｎｉｃＴＭ Ｌ１２１」）のエマルジョン。エマルジョンは、リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４中で処方してよい。このエマルジョンは、ムラミルジペプチドの有用な送達ビヒクルであり、「ＳＡＦ−１」アジュバント［２０］（０．０５〜１％Ｔｈｒ−ＭＤＰ、５％スクアラン、２．５％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｌ１２１および０．２％ポリソルベート８０）においてスレオニルＭＤＰとともに使用されてきた。「ＡＦ」アジュバント［２１］（５％スクアラン、１．２５％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｌ１２１および０．２％ポリソルベート８０）におけるように、Ｔｈｒ−ＭＤＰを伴わずに使用してもよい。マイクロフルイダイゼーションが好ましい。
・スクアレン、水性溶媒、ポリオキシエチレンアルキルエーテル親水性非イオン性界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレン（１２）セトステアリルエーテル）および疎水性非イオン性界面活性剤（例えば、ソルビタンモノオレエート（ｍｏｎｏｌｅａｔｅ）または「Ｓｐａｎ８０」などのソルビタンエステルまたはマンニドエステル（ｍａｎｎｉｄｅ ｅｓｔｅｒ））を含むエマルジョン。エマルジョンは、熱可逆性であることが好ましく、および／または、少なくとも９０％（容積で）の２００ｎｍ未満のサイズの油滴を有する［２２］。エマルジョンはまた、アルジトール、凍結防止剤（例えば、ドデシルマルトシドおよび／またはスクロースなどの糖）、および／またはアルキルポリグリコシドのうちの１つまたは複数を含み得る。このようなエマルジョンは、凍結乾燥してもよい。
・０．５〜５０％の油、０．１〜１０％のリン脂質および０．０５〜５％の非イオン性界面活性剤を有するエマルジョン。参考文献２３に記載されるように、好ましいリン脂質成分として、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリンおよびカルジオリピンがある。サブミクロン液滴サイズが有利である。
・非代謝可能油（例えば、軽油）および少なくとも１つの界面活性剤（例えば、レシチン、Ｔｗｅｅｎ８０またはＳｐａｎ８０）のサブミクロン水中油型エマルジョン。ＱｕｉｌＡサポニン、コレステロール、サポニン親油性結合体（例えば、グルクロン酸のカルボキシル基を介したデスアシルサポニンへの脂肪族アミンの付加によって製造される、参考文献２４に記載されるＧＰＩ−０１００）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ｄｉｍｅｔｈｙｉｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）および／またはＮ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）プロパンジアミンなどの添加物を含めてもよい。
・鉱油、非イオン性親油性エトキシ化脂肪アルコールおよび非イオン性親水性界面活性剤（例えば、エトキシ化脂肪アルコールおよび／またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）を含むエマルジョン［２５］。
・鉱油、非イオン性親水性エトキシ化脂肪アルコールおよび非イオン性親油性界面活性剤（例えば、エトキシ化脂肪アルコールおよび／またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）を含むエマルジョン［２５］。
・サポニン（例えば、ＱｕｉｌＡまたはＱＳ２１）およびステロール（例えば、コレステロール）がらせん状ミセルとして会合しているエマルジョン［２６］。
組成物中の抗原およびアジュバントは、通常、患者への送達の時点で混合物中にある。エマルジョンは、製造の際に抗原と混合してもよく、送達の時点で即席に抗原と混合してもよい。したがって、アジュバントおよび抗原は、パッケージングまたは分配されたワクチン中で別個に維持し、使用の時点で最終処方物に準備してもよい。通常、抗原は、ワクチンが２つの液体を混合することによって最終的に調製されるよう、水性形態となる。混合するための２つの液体の容積比は、変わり得る（例えば、５：１から１：５の間）が、通常、約１：１である。
（Ｃ．サポニン処方物［参考文献１３の第２２章］）
サポニン処方物もまた、本発明においてアジュバントとして使用してもよい。サポニンは、幅広い植物種の樹皮、葉、茎、根において、および花においてさえ見られる、ステロールグリコシドおよびトリテルペノイドグリコシドの異質性の群である。Ｑｕｉｌｌａｉａ ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａの樹の樹皮から得られるサポニンは、アジュバントとして広く研究されている。サポニンはまた、Ｓｍｉｌａｘ ｏｒｎａｔａ（サルサパリラ（ｓａｒｓａｐｒｉｌｌａ））、Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌｌａ ｐａｎｉｃｕｌａｔａ（ブライズベイル（ｂｒｉｄｅｓ ｖｅｉｌ））およびＳａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉａｎａｌｉｓ（ソープルート（ｓｏａｐ ｒｏｏｔ））から商業的に入手できる。サポニンアジュバント処方物として、ＱＳ２１などの精製処方物ならびにＩＳＣＯＭなどの脂質処方物が挙げられる。ＱＳ２１は、ＳｔｉｍｕｌｏｎＴＭとして販売されている。
サポニン組成物は、ＨＰＬＣおよびＲＰ−ＨＰＬＣを使用して精製されている。これらの技術を使用して、ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８、ＱＳ２１、ＱＨ−Ａ、ＱＨ−ＢおよびＱＨ−Ｃを含む特定の精製された画分が同定されている。サポニンは、ＱＳ２１であることが好ましい。ＱＳ２１の製造方法は、参考文献２７に開示されている。サポニン処方物はまた、コレステロールなどのステロールを含み得る［２８］。
サポニンおよびコレステロールの組み合わせを使用して、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）と呼ばれる独特の粒子を形成できる［参考文献１３の第２３章］。ＩＳＣＯＭはまた、通常、ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリンなどのリン脂質も含む。ＩＳＣＯＭには、任意の公知のサポニンを使用してよい。ＩＳＣＯＭは、ＱｕｉｌＡ、ＱＨＡおよびＱＨＣのうちの１つまたは複数を含むことが好ましい。ＩＳＣＯＭは、参考文献２８〜３０にさらに記載されている。場合により、ＩＳＣＯＭＳは、さらなる洗浄剤を欠いていてもよい［３１］。
サポニンベースのアジュバントの開発についての総説は、参考文献３２＆３３に見ることができる。
（Ｄ．ビロソームおよびウイルス様粒子）
ビロソームおよびウイルス様粒子（ＶＬＰ）もまた、本発明においてアジュバントとして使用してもよい。これらの構造は、通常、ウイルスに由来する１つまたは複数のタンパク質を含有し、場合により、リン脂質と組み合わされるか、またはリン脂質とともに処方される。それらは、通常、非病原性、非複製性であり、通常、天然のウイルスゲノムを少しも含有しない。ウイルスタンパク質は、組換えによって製造してもよく、または全ウイルスから単離してもよい。ビロソームまたはＶＬＰにおいて使用するのに適したこれらのウイルスタンパク質として、インフルエンザウイルス（例えば、ＨＡまたはＮＡ）、Ｂ型肝炎ウイルス（例えば、コアまたはカプシドタンパク質）、Ｅ型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、シンドビスウイルス、ロタウイルス、口蹄疫ウイルス、レトロウイルス、ノーウォークウイルス、ヒトパピローマウイルス、ＨＩＶ、ＲＮＡファージ、Ｑβファージ（例えば、コートタンパク質）、ＧＡ−ファージ、ｆｒ−ファージ、ＡＰ２０５ファージおよびＴｙ（例えば、レトロトランスポゾンＴｙタンパク質ｐ１）に由来するタンパク質が挙げられる。ＶＬＰは、参考文献３４〜３９において、さらに論じられている。ビロソームは、例えば、参考文献４０において、さらに論じられている。
（Ｅ．細菌または微生物誘導体）
本発明において使用するのに適したアジュバントとして、腸内細菌リポ多糖類（ＬＰＳ）の非毒性誘導体、脂質Ａ誘導体、免疫賦活性オリゴヌクレオチドならびにＡＤＰリボシル化毒素およびその解毒化された誘導体などの細菌または微生物誘導体が挙げられる。
ＬＰＳの非毒性誘導体として、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）および３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）が挙げられる。３ｄＭＰＬは、４、５もしくは６アシル化鎖を有する３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａの混合物である。３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａの好ましい「小粒子」形態は、参考文献４１に開示されている。３ｄＭＰＬのこのような「小粒子」は、０．２２μｍメンブレンを通して滅菌濾過されるのに十分に小さい［４１］。その他の非毒性ＬＰＳ誘導体として、アミノアルキルグルコサミニドホスフェート誘導体、例えば、ＲＣ−５２９などのモノホスホリル脂質Ａ摸倣物が挙げられる［４２、４３］。
脂質Ａ誘導体として、ＯＭ−１７４などの大腸菌由来の脂質Ａの誘導体が挙げられる。ＯＭ−１７４は、例えば、参考文献４４＆４５に記載されている。
本発明においてアジュバントとして使用するのに適した免疫賦活性オリゴヌクレオチドとして、ＣｐＧモチーフを含有するヌクレオチド配列（グアノシンとリン酸結合によって結合している非メチル化シトシンを含有するジヌクレオチド配列）が挙げられる。二本鎖ＲＮＡおよびパリンドロームまたはポリ（ｄＧ）配列を含有するオリゴヌクレオチドはまた、免疫賦活性であると示されている。
ＣｐＧは、ホスホロチオエート修飾などのヌクレオチド修飾／類似体を含み得、二本鎖または一本鎖であり得る。参考文献４６、４７および４８には、可能性ある類似体置換、例えば、グアノシンの、２’−デオキシ−７−デアザグアノシンでの置換が開示されている。ＣｐＧオリゴヌクレオチドのアジュバント効果は、参考文献４９〜５４にさらに論じられている。
ＣｐＧ配列は、モチーフＧＴＣＧＴＴまたはＴＴＣＧＴＴなどのＴＬＲ９に向けられ得る［５５］。ＣｐＧ配列は、ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮのようにＴｈ１免疫応答の誘導に対して特異的であり得、またはＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮのようにＢ細胞反応の誘導に対してより特異的であり得る。ＣｐＧ−ＡおよびＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮは、参考文献５６〜５８に論じられている。ＣｐＧは、ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮであることが好ましい。
ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、５’末端が受容体認識に利用できるように構築されることが好ましい。場合により、２つのＣｐＧオリゴヌクレオチド配列が、その３’末端で、「イムノマー（ｉｍｍｕｎｏｍｅｒ）」を形成するよう結合されてもよい。例えば、参考文献５５＆５９〜６１参照のこと。
免疫賦活性オリゴヌクレオチドに基づく特に有用なアジュバントは、ＩＣ−３１ＴＭとして公知である［６２］。したがって、本発明とともに使用されるアジュバントは、（ｉ）少なくとも１つの（好ましくは、複数の）ＣｐＩモチーフ（すなわち、イノシンと結合してジヌクレオチドを形成するシトシン）を含むオリゴヌクレオチド（例えば、１５〜４０の間のヌクレオチド）および（ｉｉ）少なくとも１つの（好ましくは、複数の）Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓトリペプチド配列を含むオリゴペプチド（例えば、５〜２０個の間のアミノ酸）などのポリカチオンポリマーの混合物を含み得る。オリゴヌクレオチドは、２６マーの配列５’−（ＩＣ）１３−３’（配列番号８０）を含むデオキシヌクレオチドであり得る。ポリカチオンポリマーは、１１マーのアミノ酸配列ＫＬＫＬＬＬＬＬＫＬＫ（配列番号８１）を含むペプチドであり得る。
細菌ＡＤＰリボシル化毒素およびその解毒化された誘導体を、本発明におけるアジュバントとして使用してもよい。タンパク質は、大腸菌（大腸菌熱不安定性エンテロトキシン「ＬＴ」）、コレラ（「ＣＴ」）または百日咳（「ＰＴ」）由来であることが好ましい。粘膜アジュバントとしての解毒化されたＡＤＰリボシル化毒素の使用は、参考文献６３に、非経口アジュバントとしての使用は、参考文献６４に記載されている。毒素またはトキソイドは、ＡおよびＢ両サブユニットを含むホロ毒素の形態であることが好ましい。Ａサブユニットが、解毒化変異を含有することが好ましく、Ｂサブユニットは変異されていないことが好ましい。アジュバントは、ＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２およびＬＴ−Ｇ１９２などの解毒化されたＬＴ変異体であることが好ましい。ＡＤＰリボシル化毒素およびその解毒化された誘導体、特に、ＬＴ−Ｋ６３およびＬＴ−Ｒ７２の、アジュバントとしての使用は、参考文献６５〜７２に見ることができる。有用なＣＴ変異体として、ＣＴ−Ｅ２９Ｈがある［７３］。アミノ酸置換の参照番号は、参照によりその全文が本明細書に具体的に組み込まれる参考文献７４に示されるＡＤＰリボシル化毒素のＡおよびＢサブユニットのアラインメントに基づくことが好ましい。
（Ｆ．ヒト免疫調節物質）
本発明においてアジュバントとして使用するのに適したヒト免疫調節物質として、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２［７５］など）［７６］、インターフェロン（例えば、インターフェロン−γ）、マクロファージコロニー刺激因子および腫瘍壊死因子などのサイトカインが挙げられる。好ましい免疫調節物質として、ＩＬ−１２がある。
（Ｇ．生体接着物質（Ｂｉｏａｄｈｅｓｉｖｅ）および粘膜接着物質（Ｍｕｃｏａｄｈｅｓｉｖｅ））
生体接着物質および粘膜接着物質も、本発明においてアジュバントとして使用してよい。適した生体接着物質として、エステル化ヒアルロン酸ミクロスフェア［７７］またはポリ（アクリル酸）、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、多糖およびカルボキシメチルセルロースの架橋誘導体などの粘膜接着物質が挙げられる。キトサンおよびその誘導体も、本発明においてアジュバントとして使用してよい［７８］。
（Ｈ．微小粒子）
微小粒子も、本発明においてアジュバントとして使用してよい。生分解性であり、非毒性である材料（例えば、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリカプロラクトンなど）から形成される微小粒子（すなわち、直径約１００ｎｍ〜約１５０μｍ、より好ましくは、直径約２００ｎｍ〜約３０μｍ、最も好ましくは、直径約５００ｎｍ〜約１０μｍの粒子）。ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）が好ましく、場合により、負の荷電表面を有するように（例えば、ＳＤＳを用いて）、または正の荷電表面を有するように（例えば、ＣＴＡＢなどのカチオン性洗浄剤を用いて）処理される。
（Ｉ．リポソーム（参考文献１３の第１３＆１４章））
アジュバントとして使用するのに適したリポソーム処方物の例は、参考文献７９〜８１に記載されている。
（Ｊ．ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステル処方物）
本発明において使用するのに適したアジュバントとして、ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステルが挙げられる［８２］。このような処方物は、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤を、オキトキシノールと組み合わせて［８３］、ならびにポリオキシエチレンアルキルエーテルまたはエステル界面活性剤を、オキトキシノールなどの少なくとも１つのさらなる非イオン性界面活性剤と組み合わせて［８４］さらに含む。好ましいポリオキシエチレンエーテルは、以下の群から選択される：ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ラウレス９）、ポリオキシエチレン−９−ステオリルエーテル、ポリオキシエチレン（ｐｏｌｙｏｘｙｔｈｅｙｌｅｎｅ）−８−ステオリルエーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテルおよびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテル。
（Ｋ．ポリホスファゼン（ＰＣＰＰ））
ＰＣＰＰ処方物は、例えば、参考文献８５および８６に記載されている。
（Ｌ．ムラミルペプチド）
本発明においてアジュバントとして使用するのに適したムラミルペプチドの例として、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）およびＮ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミンＭＴＰ−ＰＥ）が挙げられる。
（Ｍ．イミダゾキノロン化合物）
本発明においてアジュバントとして使用するのに適したイミダゾキノロン化合物の例として、参考文献８７および８８にさらに記載されるイミクアモド（Ｉｍｉｑｕａｍｏｄ）およびその相同体（例えば、「レシキモド３Ｍ」）が挙げられる。
本発明はまた、上記で同定されたアジュバントのうちの１つまたは複数の態様の組み合わせを含み得る。例えば、以下のアジュバント組成物を、本発明において使用してもよい：（１）サポニンおよび水中油型エマルジョン［８９］、（２）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋非毒性ＬＰＳ誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）［９０］、（３）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋非毒性ＬＰＳ誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）＋コレステロール、（４）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＬ−１２（場合により、＋ステロール）［９１］、（５）３ｄＭＰＬの、例えば、ＱＳ２１および／または水中油型エマルジョンとの組み合わせ［９２］、（６）サブミクロンエマルジョンにマイクロフルイダイズされているか、またはより大きな粒径のエマルジョンを作製するようボルテックス処理されている、１０％スクアラン、０．４％Ｔｗｅｅｎ８０ＴＭ、５％プロロニック−ブロックポリマーＬ１２１およびｔｈｒ−ＭＤＰを含有するＳＡＦ、（７）２％スクアレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０ならびにモノホスホリル脂質（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｉｐｉｄ）Ａ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）および細胞壁骨格（ＣＷＳ）からなる群からの１つまたは複数の細菌細胞壁成分（好ましくは、ＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤｅｔｏｘＴＭ））を含有するＲｉｂｉＴＭアジュバントシステム（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ）、および（８）１つまたは複数の無機塩（例えば、アルミニウム塩）＋ＬＰＳの非毒性誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）。
免疫刺激剤として作用するその他の物質は、参考文献１３の第７章に開示されている。
水酸化アルミニウムおよび／またはリン酸アルミニウムアジュバントの使用は、特に、小児において有用であり、抗原は、通常、これらの塩に吸着させられる。水中スクアレンエマルジョンも、特に、高齢者において好ましい。有用なアジュバントの組み合わせとして、ＣｐＧ＆アラムまたはレシキモド＆アラムなどのＴｈ１およびＴｈ２アジュバントの組み合わせが挙げられる。リン酸アルミニウムおよび３ｄＭＰＬの組み合わせを使用してもよい。
本発明の組成物は、細胞媒介性免疫応答ならびに体液性免疫応答の両方を誘発し得る。
通常、２種類のＴ細胞、ＣＤ４およびＣＤ８細胞が、細胞媒介性免疫および体液性免疫を開始および／または増強するのに必要であると考えられている。ＣＤ８Ｔ細胞は、ＣＤ８共受容体を発現でき、一般に、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）と呼ばれる。ＣＤ８Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子上にディスプレイされる抗原を認識でき、またはそれと相互作用できる。
ＣＤ４Ｔ細胞は、ＣＤ４共受容体を発現でき、一般に、ヘルパーＴ細胞と呼ばれる。ＣＤ４Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ分子と結合している抗原性ペプチドを認識できる。ＣＤ４細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ分子と相互作用すると、サイトカインなどの因子を分泌し得る。これらの分泌されたサイトカインは、Ｂ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、マクロファージおよび免疫応答に参加するその他の細胞を活性化し得る。ヘルパーＴ細胞またはＣＤ４＋細胞は、２つの機能的に別個のサブセット：そのサイトカインおよびエフェクター機能が異なるＴＨ１表現型およびＴＨ２表現型にさらに分割できる。
活性化されたＴＨ１細胞は、細胞性免疫（抗原特異的ＣＴＬ産生の増大を含む）を増強し、したがって、細胞内感染に対する反応において特に価値がある。活性化されたＴＨ１細胞は、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−βのうちの１つまたは複数を分泌し得る。ＴＨ１免疫応答は、マクロファージ、ＮＫ（ナチュラルキラー）細胞およびＣＤ８細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を活性化することによって局所炎症反応をもたらし得る。ＴＨ１免疫応答はまた、ＩＬ−１２を用いてＢおよびＴ細胞の増殖を刺激することによって免疫応答を拡大するよう作用し得る。ＴＨ１によって刺激されたＢ細胞は、ＩｇＧ２ａを分泌し得る。
活性化されたＴＨ２細胞は、抗体産生を増強し、したがって、細胞外感染に対する反応において価値がある。活性化されたＴＨ２細胞は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６およびＩＬ−１０のうちの１つまたは複数を分泌し得る。ＴＨ２免疫応答は、ＩｇＧ１、ＩｇＥ、ＩｇＡおよび将来の保護のための記憶Ｂ細胞の産生をもたらし得る。
増強された免疫応答は、増強されたＴＨ１免疫応答およびＴＨ２免疫応答のうちの１つまたは複数を含み得る。
ＴＨ１免疫応答は、ＣＴＬの増大、ＴＨ１免疫応答と関連している１つまたは複数のサイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−β）の増大、活性化されたマクロファージの増大、ＮＫ活性の増大またはＩｇＧ２ａの産生の増大のうちの１つまたは複数を含み得る。増強されたＴＨ１免疫応答が、ＩｇＧ２ａ産生の増大を含むことが好ましい。
ＴＨ１免疫応答は、ＴＨ１アジュバントを使用して誘発され得る。ＴＨ１アジュバントは、通常、アジュバントを用いない抗原の免疫化に対して、ＩｇＧ２ａ産生レベルの増大を誘発する。本発明において使用するのに適したＴＨ１アジュバントとして、例えば、サポニン処方物、ビロソームおよびウイルス様粒子、腸内細菌リポ多糖類（ＬＰＳ）の非毒性誘導体、免疫賦活性オリゴヌクレオチドを挙げることができる。ＣｐＧモチーフを含有するオリゴヌクレオチドなどの免疫賦活性オリゴヌクレオチドが、本発明において使用するのに好ましいＴＨ１アジュバントである。
ＴＨ２免疫応答は、ＴＨ２免疫応答と関連している１つまたは複数のサイトカイン（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６およびＩＬ−１０）の増大またはＩｇＧ１、ＩｇＥ、ＩｇＡおよび記憶Ｂ細胞の産生の増大のうちの１つまたは複数を含み得る。増強されたＴＨ２免疫応答が、ＩｇＧ１産生の増大を含むことが好ましい。
ＴＨ２免疫応答は、ＴＨ２アジュバントを使用して誘発され得る。ＴＨ２アジュバントは、通常、アジュバントを用いない抗原の免疫化に対して、ＩｇＧ１産生レベルの増大を誘発する。本発明において使用するのに適したＴＨ２アジュバントとして、例えば、無機物含有組成物、オイルエマルジョンならびにＡＤＰリボシル化毒素およびその解毒化された誘導体が挙げられる。アルミニウム塩などの無機物含有組成物が、本発明において使用するのに好ましいＴＨ２アジュバントである。
組成物は、ＴＨ１アジュバントおよびＴＨ２アジュバントの組み合わせを含み得る。このような組成物は、増強されたＴＨ１および増強されたＴＨ２反応、すなわち、アジュバントを用いない免疫化に対して、ＩｇＧ１の産生およびＩｇＧ２ａの産生両方の増大を誘発することが好ましい。ＴＨ１およびＴＨ２アジュバントの組み合わせを含む組成物は、単一アジュバントを用いる免疫化に対して（すなわち、ＴＨ１アジュバント単独を用いる免疫化またはＴＨ２アジュバント単独を用いる免疫化に対して）、増大されたＴＨ１および／または増大されたＴＨ２免疫応答を誘発することがさらにより好ましい。
免疫応答は、ＴＨ１免疫応答およびＴＨ２応答のうちの一方または両方であり得る。免疫応答は、増強されたＴＨ１応答および増強されたＴＨ２応答のうちの一方または両方を提供することが好ましい。
増強された免疫応答は、全身性免疫応答および粘膜免疫応答のうちの一方または両方であり得る。免疫応答は、増強された全身性免疫応答および増強された粘膜免疫応答のうちの一方または両方を提供することが好ましい。粘膜免疫応答は、ＴＨ２免疫応答であることが好ましい。粘膜免疫応答は、ＩｇＡの産生の増大を含むことが好ましい。
肺炎球菌感染は、身体の種々の領域に影響を及ぼし得るため、本発明の組成物は、種々の形態で調製してもよい。例えば、組成物は、注射用物質として、液体溶液または懸濁物のいずれかとして調製してよい。注射に先立って、液体ビヒクル中の溶液または懸濁物にとって適した固体形態も調製してよい（例えば、凍結乾燥組成物または噴霧凍結乾燥組成物）。組成物は、局所投与用に、例えば、軟膏、クリームまたは散剤として調製してもよい。組成物は、経口投与用に、例えば、錠剤またはカプセル剤として、スプレーとして、またはシロップ剤（場合により、矯味矯臭されて）として調製してもよい。組成物は、肺投与用に、例えば、微粉またはスプレーを使用する吸入剤として調製してもよい。組成物は、坐剤または膣坐剤として調製してもよい。組成物は、経鼻投与、耳への投与または眼の投与用に、例えば、滴剤として調製してもよい。組成物は、組み合わされた組成物が、患者への投与の直前に再構成されるように設計されたキットの形態であり得る。このようなキットは、液体形態の１つまたは複数の抗原および１つまたは複数の凍結乾燥抗原を含み得る。
組成物が、使用前に即席調製され（例えば、成分が凍結乾燥形態で提示される場合）、キットとして提示される場合には、キットは２つのバイアルを含む場合も、１つの事前充填されたシリンジと、１つのバイアルとを含み、シリンジの内容物を使用して、注射の前にバイアルの内容物を再活性化させる場合もある。
ワクチンとして使用される免疫原性組成物は、免疫学的に有効な量の抗原（複数可）ならびに必要に応じて任意のその他の成分を含む。「免疫学的に有効な量」とは、単一投与での、または一連のものの一部としての、個体へのその量の投与が、処置または予防にとって有効であることを意味する。この量は、処置される個体の健康状態および理学的状態、年齢、分類学的群（例えば、非ヒト霊長類、霊長類など）、個体の免疫系が抗体を合成する能力、望まれる保護の程度、ワクチンの処方、医学的状況の処置医師の評価ならびにその他の関連因子に応じて変わる。量は、比較的広い範囲に収まると予測され、これは日常的な試験によって決定できる。
（核酸免疫化）
上記の免疫原性組成物は、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のポリペプチド抗原を含む。しかし、すべての場合において、ポリペプチド抗原を、核酸免疫化に基づく組成物、方法および使用を与えるよう、それらのポリペプチドをコードする核酸（一般に、ＤＮＡ）によって置き換えてもよい［９３〜１００］。
免疫原をコードする核酸は、患者への送達の後、インビボで発現され、次いで、発現された免疫原は、免疫系を刺激する。有効成分は、通常、（ｉ）プロモーターと、（ｉｉ）作動可能にプロモーターと連結している免疫原をコードする配列と、場合により、（ｉｉｉ）選択マーカーとを含む核酸ベクターの形態をとる。好ましいベクターは、（ｉｖ）複製起点および（ｖ）（ｉｉ）の下流の、（ｉｉ）と作動可能に連結している転写ターミネーターをさらに含み得る。一般に、（ｉ）＆（ｖ）は、真核生物のものであり、（ｉｉｉ）＆（ｉｖ）は、原核生物のものとなる。
好ましいプロモーターは、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に由来するウイルスプロモーターである。ベクターはまた、プロモーターに加えて、プロモーターと機能的に相互作用する転写調節配列（例えば、エンハンサー）を含み得る。好ましいベクターは、前初期ＣＭＶエンハンサー／プロモーターを含み、また、より好ましいベクターは、ＣＭＶイントロンＡも含む。プロモーターは、免疫原をコードする下流配列と作動可能に連結しており、その結果、免疫原をコードする配列の発現は、プロモーターの制御下にある。
マーカーが使用される場合には、微生物宿主において（例えば、原核生物において、細菌において、酵母において）機能することが好ましい。マーカーは、原核生物選択マーカー（例えば、原核生物プロモーターの制御下で転写される）であることが好ましい。便宜のために、通常のマーカーは、抗生物質耐性遺伝子である。
ベクターは、自己複製エピソームベクターまたは染色体外ベクター（プラスミドなど）であることが好ましい。
ベクターは、複製起点を含むことが好ましい。複製起点が、原核生物では活性であるが、真核生物では活性ではないことが好ましい。
したがって、好ましいベクターは、ベクターの選択のための原核生物マーカーと、原核生物の複製起点と、免疫原をコードする配列の転写を駆動するための真核生物のプロモーターとを含む。したがって、ベクターは、（ａ）ポリペプチド発現を伴わずに原核生物宿主において増幅され、選択されるが、（ｂ）増幅されずに真核生物宿主において発現される。核酸免疫化ベクターにとってこの計画が理想的である。
ベクターは、コード配列の下流に、真核生物転写ターミネーター配列を含み得る。これは、転写レベルを増強し得る。コード配列が、それ自体のものを有さない場合には、ベクターはポリアデニル化配列を含むことが好ましい。好ましいポリアデニル化配列として、ウシ成長ホルモン由来のものがある。
ベクターは、マルチクローニング部位を含み得る。
免疫原およびマーカーをコードする配列に加えて、ベクターは、第２の真核生物コード配列を含み得る。ベクターはまた、免疫原と同一の転写物からの第２の真核生物のポリペプチドの翻訳を可能にするために、前記の第２の配列の上流にＩＲＥＳを含み得る。あるいは、免疫原をコードする配列は、ＩＲＥＳの下流であり得る。
ベクターは、非メチル化ＣｐＧモチーフ、例えば、２個の５’プリンおよび２個の３’ピリミジンが隣接する、グアノシンの前のシトシンを共通して有する非メチル化ＤＮＡ配列を含み得る。非メチル化型において、これらのＤＮＡモチーフは、いくつかの種類の免疫細胞の強力な刺激因子であることが示されている。
ベクターは、標的化方法で送達され得る。受容体媒介性ＤＮＡ送達技術は、例えば、参考文献１０１〜１０６に記載されている。核酸を含有する治療的組成物は、遺伝子療法プロトコールにおける局所投与のために約１００ｎｇ〜約２００ｍｇのＤＮＡの範囲で投与される。約５００ｎｇ〜約５０ｍｇ、約１μｇ〜約２ｍｇ、約５μｇ〜約５００μｇおよび約２０μｇ〜約１００μｇの濃度範囲のＤＮＡも、遺伝子療法プロトコールの際に使用してよい。作用方法（例えば、コードされる遺伝子産物のレベルを増強または阻害するための）、ならびに形質転換および発現の有効性などの因子は、最終的な有効性にとって必要な投与量に影響を及ぼす検討事項である。広い領域の組織にわたって、より高い発現が望まれる場合には、陽性の治療結果を達成するために、より多量のベクター、または投与の連続プロトコールでの同量の再投与、または種々の隣接する組織部分もしくは近接する組織部分への数回の投与が必要であり得る。すべての場合において、臨床試験における日常的な実験によって、最適な治療効果のための特定の範囲が決定される。
ベクターは、遺伝子送達ビヒクルを使用して送達してもよい。遺伝子送達ビヒクルは、ウイルス起源のものであっても、非ウイルス起源のものであってもよい（概して、参考文献１０７〜１１０を参照のこと）。
所望の核酸の送達および所望の細胞における発現のためのウイルスベースのベクターは、当技術分野で周知である。例示的なウイルスベースのビヒクルとして、それだけには限らないが、組換えレトロウイルス（例えば、参考文献１１１〜１２１）、アルファウイルスベースのベクター（例えば、シンドビスウイルスベクター、セムリキ森林ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−６７、ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４７）、ロスリバーウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−３７３、ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４６）およびベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−９２３、ＡＴＣＣ ＶＲ−１２５０、ＡＴＣＣ ＶＲ １２４９、ＡＴＣＣ ＶＲ−５３２）；これらのウイルスのハイブリッドまたはキメラも使用してよい）、ポックスウイルスベクター（例えば、ワクシニア、鶏痘、カナリアポックス、改変ワクシニアアンカラなど）、アデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（例えば、参考文献１２２〜１２７参照のこと）が挙げられる。死滅したアデノウイルスと連結しているＤＮＡ［１２８］の投与も使用してよい。
それだけには限らないが、死滅したアデノウイルス単独と連結しているか、または連結していないポリカチオン濃縮ＤＮＡ［例えば、１２８］、リガンドが連結しているＤＮＡ［１２９］、真核生物細胞送達ビヒクル細胞［例えば、参考文献１３０〜１３４］および核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ）電荷中和または細胞膜との融合を含む非ウイルス性送達ビヒクルおよび方法も使用してよい。裸のＤＮＡも使用してよい。例示的な裸のＤＮＡ導入法は、参考文献１３５および１３６に記載されている。遺伝子送達ビヒクルとして作用し得るリポソーム（例えば、イムノリポソーム）が、参考文献１３７〜１４１に記載されている。さらなるアプローチは、参考文献１４２＆１４３に記載されている。
使用するのに適したさらなる非ウイルス送達として、参考文献１４３に記載されるアプローチなどの機械的送達システムが挙げられる。さらに、コード配列およびこのようなものの発現生成物を、光重合されたヒドロゲル物質の沈着またはイオン化照射の使用によって送達してもよい［例えば、参考文献１４４＆１４５］。コード配列の送達のために使用できる遺伝子送達のためのその他の従来法として、例えば、ハンドヘルド遺伝子導入パーティクルガンの使用［１４６］または導入された遺伝子を活性化するためのイオン化照射の使用［１４４＆１４５］が挙げられる。
例えば、負の荷電表面を有するように（例えば、ＳＤＳを用いて処理）、または正の荷電表面を有するように（例えば、ＣＴＡＢなどのカチオン性洗浄剤を用いて処理）、場合により処理されていてもよい微小粒子への吸着による、ＰＬＧ｛ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）｝微小粒子を使用するＤＮＡの送達は、特に好ましい方法である。
（処置方法およびワクチンの投与）
本発明はまた、本発明の免疫原性組成物の有効量を投与するステップを含む、哺乳動物において免疫応答を惹起する方法を提供する。免疫応答は、防御的であることが好ましく、抗体および／または細胞媒介性免疫を含むことが好ましい。本方法は、追加免疫反応を惹起し得る。
本発明はまた、医薬としての組み合わせ使用のために、例えば、哺乳動物において免疫応答の惹起において使用するための、少なくとも２つの異なるＲｒｇＢクレイドを提供する。
本発明はまた、哺乳動物における免疫応答の惹起のための、医薬の製造における少なくとも２つの異なるＲｒｇＢクレイドの使用を提供する。
これらの使用および方法によって、哺乳動物において免疫応答を惹起することによって、哺乳動物は、肺炎球菌疾患および／または感染に対して、例えば、肺炎球菌髄膜炎に対して防御できる。
本発明はまた、本発明の免疫原性組成物を用いて予め充填した送達デバイスを提供する。
哺乳動物は、ヒトであることが好ましい。ワクチンが予防的使用のためである場合は、ヒトは、小児（例えば、幼児または乳児）または１０代であることが好ましく、ワクチンが治療的使用のためである場合は、ヒトは、１０代または成人であることが好ましい。小児用に意図されるワクチンはまた、例えば、安全性、投与量、免疫原性などを評価するために成人に投与してもよい。
治療的処置の有効性を調べる１つの方法は、本発明の組成物の投与後の肺炎球菌感染をモニタリングすることを含む。予防的処置の有効性を調べる１つの方法は、標準試験において免疫化後血清を試験することを含む。例えば、血清は、防御的有効性を示す細菌をオプソニン化する能力を用いる、オプソニン作用死滅アッセイ（ＯＰＫＡ）において試験することができる。予防的処置の有効性を調べる別の方法は、肺炎球菌感染の動物モデル、例えば、モルモットまたはマウスにおける免疫化後チャレンジを含む。１つのこのようなモデルは、参考文献１４７に記載されている。本発明の組成物の免疫原性を評価する別の方法は、イムノブロットおよび／またはマイクロアレイによって患者の血清または粘膜分泌物をスクリーニングするために組換えによってポリペプチドを発現させることである。ポリペプチドと患者サンプルとの間の正の反応は、患者が、問題のポリペプチドに対する免疫応答を開始したことを示す。また、この方法を使用して、免疫優性抗原および／または抗原内のエピトープを同定してもよい。
本発明の組成物は、通常、患者に直接的に投与される。直接送達は、非経口注射によって（例えば、皮下に、腹腔内に、静脈内に、筋肉内に、または組織の間質性空間への）、または経粘膜的に、例えば、直腸、経口（例えば、錠剤、スプレー）、経膣、局所、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）もしくは経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、鼻腔内、眼の、耳の、肺のまたはその他の粘膜投与によって達成され得る。
本発明を使用して、全身性および／または粘膜免疫を誘発、好ましくは、増強された全身性および／または粘膜免疫を誘発してもよい。
増強された全身性および／または粘膜免疫は、増強されたＴＨ１および／またはＴＨ２免疫応答に反映されることが好ましい。増強された免疫応答は、ＩｇＧ１および／またはＩｇＧ２ａおよび／またはＩｇＡの産生の増大を含むことが好ましい。
投与量は、単一用量スケジュールによるものであっても、複数用量スケジュールによるものであってもよい。複数用量は、一次免疫化スケジュールにおいて使用しても、および／または追加免疫化スケジュールにおいて使用してもよい。複数用量スケジュールでは、種々の用量が、同一または異なる経路、例えば、非経口の一次免疫および粘膜の追加免疫、粘膜の一次免疫および非経口の追加免疫などによって与えられ得る。複数用量は、通常、少なくとも１週間離して（例えば、約２週間、約３週間、約４週間、約６週間、約８週間、約１０週間、約１２週間、約１６週間など）投与される。一実施形態では、複数用量を、生後、およそ６週間、１０週間および１４週間で、例えば、世界保健機構の拡大予防接種計画（Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｓａｔｉｏｎ’ｓ Ｅｘｐａｎｄｅｄ Ｐｒｏｇｒａｍ ｏｎ Ｉｍｍｕｎｉｓａｔｉｏｎ（「ＥＰＩ」））によってよく使用されるような、６週齢、１０週齢および１４週齢で投与してもよい。代替実施形態では、２回の一次免疫投与を、約２カ月離して、例えば、約７、８または９週間離して、続いて、１回または複数の追加免疫投与を、２回目の一次免疫投与の約６カ月から１年後に、例えば、２回目の一次免疫投与の約６、８、１０または１２カ月後に投与する。さらなる実施形態では、３回の一次免疫投与を、約２カ月離して、例えば、約７、８または９週間離して、続いて、１回または複数の追加免疫投与を、３回目の一次免疫投与の約６カ月から１年後に、例えば、３回目の一次免疫投与の約６、８、１０または１２カ月後に投与する。
本発明に従って調製されたワクチンを使用して、小児および成人の両方を処置してもよい。したがって、ヒト患者は、１歳未満、５歳未満、１〜５歳、５〜１５歳、１５〜５５歳または少なくとも５５歳であり得る。ワクチンを受け取るのに好ましい患者は、高齢者（例えば、≧５０歳、≧６０歳、好ましくは、≧６５歳）、幼若者（例えば、≦５歳）、入院患者、医療従事者、軍務関係者および軍人、妊婦、慢性疾患または免疫不全患者である。しかし、ワクチンは、これらの群だけに適しているわけではなく、より一般に、集団において使用され得る。
本発明によって製造されるワクチンは、その他のワクチンと実質的に同時に（例えば、同一医療相談または医療専門家もしくはワクチン接種センターへの訪問の際に）、例えば、麻疹ワクチン、おたふく風邪ワクチン、風疹ワクチン、ＭＭＲワクチン、水痘ワクチン、ＭＭＲＶワクチン、ジフテリアワクチン、破傷風ワクチン、百日咳ワクチン、ＤＴＰワクチン、ｂ型Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ結合ワクチン、不活化ポリオウイルスワクチン、Ｂ型肝炎ウイルスワクチン、髄膜炎菌結合ワクチン（例えば、４価Ａ−Ｃ−Ｗ１３５−Ｙワクチン）、ＲＳウイルスワクチンなどと実質的に同時に患者に投与してもよい。
（組み合わせ）
免疫化に有用な組成物は、少なくとも２つのＲｒｇＢクレイドを、ハイブリッドポリペプチドとして、または別個のポリペプチドとして含む。さらに、組成物は、（ｉ）肺炎球菌タンパク質に対する、特に、ＲｒｇＢ以外の肺炎球菌タンパク質に対する抗体反応を誘発する１つまたは複数のさらなるポリペプチド、（ｉｉ）肺炎球菌由来の莢膜糖類、および／または（ｉｉｉ）非肺炎球菌生物上のエピトープを認識する抗体反応を誘発する１つまたは複数のさらなる免疫原を含み得る。上で詳述されるように、これらのような組み合わせを含む本発明の組成物は、１つまたは複数のアジュバント、例えば、２つ以上のアジュバントを場合により含んでもよい。適したアジュバントとして、アルミニウム塩などの無機塩およびＭＦ５９などのスクアレン−水エマルジョンが挙げられる。
（さらなるポリペプチド抗原との組み合わせ［１４８］）
１つまたは複数のクレイドに由来するＲｒｇＢポリペプチドを、（１）ｓｐｒ００５７抗原、（２）ｓｐｒ０５６５抗原、（３）ｓｐｒ１０９８抗原、（４）ｓｐｒ１４１６抗原、（５）ｓｐｒ１４１８抗原、（６）ｓｐｒ０８６７抗原、（７）ｓｐｒ１４３１抗原、（８）ｓｐｒ１７３９抗原、（９）ｓｐｒ２０２１抗原、（１０）ｓｐｒ００９６抗原、（１１）ｓｐｒ１７０７抗原、（１２）ｓｐｒ１８７５抗原および／または（１３）ｓｐｒ０８８４抗原からなる群より選択される１つまたは複数の（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個または１３個すべて）ポリペプチド抗原と組み合わせてもよい。
同様に、１つまたは複数のクレイドに由来するＲｒｇＢポリペプチドを、（１）ＣｌｐＰ、（２）ＬｙｔＡ、（３）ＰｈｔＡ、（４）ＰｈｔＢ、（５）ＰｈｔＤ、（６）ＰｈｔＥ、（７）ＺｍｐＢ、（８）ＣｂｐＤ、（９）ＣｂｐＧ、（１０）ＰｖａＡ、（１１）ＣＰＬ１、（１２）ＰｓｐＣ、（１３）ＰｓｐＡ、（１４）ＰｓａＡ、（１５）ＰｒｔＡ、（１６）Ｓｐ１３３、（１７）ＰｉａＡ、（１８）ＰｉｕＡ、（１９）ＣｂｉＯおよび／または（２０）３０Ｓリボソームタンパク質Ｓ８からなる群より選択される１つまたは複数の（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９個または２０個すべて）ポリペプチド抗原と組み合わせてもよい。
これらのさらなる抗原は、別個のポリペプチドとして加えてもよい。代替として、それらは、ハイブリッド、例えば、ｓｐｒ００５７−ｓｐｒ００９６ハイブリッドまたはｓｐｒ００９６−ｓｐｒ２０２１ハイブリッド、ｓｐｒ０５６５−ＰｈｔＤハイブリッドなどとして加えてもよい。さらなる代替として、それらは、ＲｒｇＢポリペプチド配列と融合して、ハイブリッドポリペプチド、例えば、ＲｒｇＢ−ｓｐｒ００５７ハイブリッドを提供しもよい。
例えば、２つまたは３つのＲｒｇＢクレイドを含むキメラＲｒｇＢポリペプチドを、（ａ）ｓｐｒ００５７、ｓｐｒ００９６およびｓｐｒ２０２１の混合物、（ｂ）ｓｐｒ００５７、ｓｐｒ０５６５およびｓｐｒ２０２１の混合物、（ｃ）ｓｐｒ００５７、ｓｐｒ００９６およびｓｐｒ０５６５の混合物、（ｄ）ｓｐｒ００５７、ｓｐｒ００９６、ｓｐｒ０５６５およびｓｐｒ２０２１の混合物、（ｅ）ｓｐｒ１４１８、ｓｐｒ０８８４およびｓｐｒ００９６の混合物、（ｆ）ｓｐｒ１４１８、ｓｐｒ０８８４およびｓｐｒ２０２１の混合物、（ｇ）ｓｐｒ１４１８、ｓｐｒ０８８４、ｓｐｒ００９６およびｓｐｒ２０２１の混合物、（ｈ）ｓｐｒ０８８４、ｓｐｒ１４１６およびｓｐｒ００５７の混合物、（ｈ）ｓｐｒ０８８４、ｓｐｒ１４１６およびｓｐｒ００９６の混合物、（ｈ）ｓｐｒ０８８４、ｓｐｒ１４１６、ｓｐｒ００５７およびｓｐｒ００９６の混合物、または（ｉ）ｓｐｒ１４１８、ｓｐｒ１４３１およびｓｐｒ０５６５の混合物と組み合わせてもよい。これらの混合物が、ｓｐｒ００５７およびｓｐｒ００９６の両方を含む場合には、例えば、配列番号８２を含むか（参考文献１４８の配列番号２００参照のこと）、または配列番号８３を含むハイブリッドタンパク質を使用してもよい。これらの混合物が、ｓｐｒ００９６およびｓｐｒ２０２１の両方を含む場合には、例えば、配列番号８４を含む（参考文献１４８の配列番号２０５参照のこと）ハイブリッドタンパク質を使用してもよい。
さらなる実施例では、２つまたは３つのＲｒｇＢクレイドを含むキメラＲｒｇＢポリペプチドを、ｓｐｒ２０２１（ＳＰ２２１６とも呼ばれる）抗原、ＳＰ１７３２抗原、および場合により、ＰｓａＡ抗原を含む肺炎球菌免疫原と組み合わせてもよい。この種類の適した肺炎球菌免疫原として、抗原「ＳＰ２２１６−１」（参考文献１５９中の配列番号１、本明細書では配列番号９７）、「ＳＰ１７３２−３」（参考文献１５９中の配列番号２、本明細書では配列番号９８）、場合により、ＰｓａＡ（参考文献１５９中の配列番号３、本明細書では配列番号９９）を含む参考文献１５９に開示される免疫原がある。これらの配列番号の免疫原性断片を含む、例えば、配列番号９７＆９８の各々に由来する少なくとも１つの免疫原性断片を含むポリペプチドを、実際に開示される配列番号の代わりに使用してもよい。ｓｐｒ２０２１（ＳＰ２２１６）、ＳＰ１７３２、および場合により、ＰｓａＡの改変体を含む、例えば、配列番号９７および９８の各々に由来する少なくとも１つの改変体を含むポリペプチドも、実際に開示される配列番号の代わりに使用してもよい。この組み合わせの例として、参考文献１５９に開示される肺炎球菌免疫原の、以下に詳述されるキメラＩＩ−Ｉ−ＩＩＩ（例えば、配列番号２１）またはキメラＩＩＩ−ＩＩ−Ｉ（例えば、配列番号１５）を含むキメラＲｒｇＢポリペプチドとの組み合わせが挙げられる。さらなる抗原を、別個のポリペプチドとして加えてもよい。代替として、それらを、ハイブリッド、例えば、ｓｐｒ２０２１−ＳＰ１７３２ハイブリッドまたはｓｐｒ２０２１−ＳＰ１７３２−ＰｓａＡハイブリッドとして加えてもよい。さらなる代替として、それらを、ＲｒｇＢポリペプチド配列、例えば、キメラＲｒｇＢポリペプチドと融合して、ハイブリッドポリペプチド、例えば、ＲｒｇＢ−ｓｐｒ２０２１−ＳＰ１７３２ハイブリッドを提供してもよい。上記で詳述されるように、これらなどの組み合わせを含む本発明の組成物は、場合により、１つまたは複数のアジュバントを含み得る。適したアジュバントとして、アルミニウム塩などの無機塩およびＭＦ５９などのスクアレン−水エマルジョンが挙げられる。
これらの組み合わせのいずれも、通常、キャリアタンパク質（複数可）に結合体化された、１つまたは複数の肺炎球菌莢膜糖類を含んでもよい。このような糖類および結合体についてのさらなる情報を以下に提供する。
もともとの「ｓｐｒ００５７」配列は、参考文献１４９において「β−Ｎ−アセチル−ヘキソサミニダーゼ前駆体」として注釈をつけられた（ＧＩ：１５９０２１０１参照のこと）。参照目的で、Ｒ６株において見られる全長ｓｐｒ００５７のアミノ酸配列が、本明細書では配列番号２３として示されている。本発明とともに使用するのに好ましいｓｐｒ００５７ポリペプチドは、（ａ）配列番号２３に対して６０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれ以上）を有し、および／または（ｂ）配列番号２３の少なくとも「ｎ個」の連続するアミノ酸（ここで、「ｎ」は７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれ以上）である）の断片を含むアミノ酸配列を含む。これらのｓｐｒ００５７タンパク質は、配列番号２３の改変体を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号２３に由来するエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号２３のＣ末端から１個または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個またはそれ以上）および／またはＮ末端から１個または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個またはそれ以上）を欠き、一方で、配列番号２３の少なくとも１つのエピトープを保持する。その他の断片は、１つまたは複数のタンパク質ドメインを省いている。１つの適した断片として、天然リーダーペプチドおよびソルターゼ認識配列を省いている配列番号３８がある。別の適した断片として、Ｎ末端およびＣ末端の末端切断を有する配列番号２４がある。配列番号２７は、様々な野生型株に基づく配列番号２４の改変体であり、本発明とともに使用するのに有用なｓｐｒ００５７配列である。
もともとの「ｓｐｒ０５６５」配列は、参考文献１４９において、「β−ガラクトシダーゼ前駆体」として注釈をつけられた（ＧＩ：１５９０２６０９参照のこと）。参照目的で、Ｒ６株において見られる全長ｓｐｒ０５６５のアミノ酸配列が、本明細書では配列番号２５として示されている。本発明とともに使用するのに好ましいｓｐｒ０５６５ポリペプチドは、（ａ）配列番号２５に対して６０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれ以上）を有し、および／または（ｂ）配列番号２５の少なくとも「ｎ個」の連続するアミノ酸（ここで、「ｎ」は７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれ以上）である）の断片を含むアミノ酸配列を含む。これらのｓｐｒ０５６５タンパク質は、配列番号２５の改変体（例えば、配列番号４５、以下参照のこと）を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号２５に由来するエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号２５のＣ末端から１個または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個またはそれ以上）および／またはＮ末端から１個または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個またはそれ以上）を欠き、一方で、配列番号２５の少なくとも１つのエピトープを保持する。その他の断片は、１つまたは複数のタンパク質ドメインを省いている。１つの適した断片として、天然リーダーペプチドおよびソルターゼ認識配列を省いている配列番号４２がある。別の適した断片として、配列番号４３および４４がある。天然ポリペプチドが極めて長い（＞２０００個アミノ酸）ので、ｓｐｒ０５６５のこれらの短縮版は、特に有用である。
ｓｐｒ０５６５の改変体の形態は、本明細書では配列番号４５である。免疫化のためのこの改変体の形態の使用は、参考文献１５０において報告されている（それにおいては、配列番号１７８）。したがって、有用なｓｐｒ０５６５ポリペプチドは、（ａ）配列番号４５に対して６０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれ以上）を有し、および／または（ｂ）配列番号４５の少なくとも「ｎ個」の連続するアミノ酸の断片（ここで、「ｎ」は７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれ以上）である）を含むアミノ酸配列を含み得る。これらのポリペプチドは、配列番号４５の改変体を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号４５に由来するエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号４５のＣ末端から１個または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個またはそれ以上）および／またはＮ末端から１個または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個またはそれ以上）を欠き、一方で、配列番号４５の少なくとも１つのエピトープを保持する。その他の断片は、１つまたは複数のタンパク質ドメインを省いている。配列番号４５の免疫原性断片は、参考文献１５０の表１に同定されている。
もともとの「ｓｐｒ１０９８」配列は、参考文献１４９において「ソルターゼ」として注釈をつけられた（ＧＩ：１５９０３１４１参照のこと）。参照目的で、Ｒ６株において見られる全長ｓｐｒ１０９８のアミノ酸配列が、本明細書では配列番号２６として示されている。本発明とともに使用するのに好ましいｓｐｒ１０９８ポリペプチドは、（ａ）配列番号２６に対して６０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれ以上）を有し、および／または（ｂ）配列番号２６の少なくとも「ｎ個」の連続するアミノ酸（ここで、「ｎ」は７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれ以上）である）の断片を含むアミノ酸配列を含む。これらのｓｐｒ１０９８タンパク質は、配列番号２６の改変体を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号２６に由来するエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号２６のＣ末端から１個または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個またはそれ以上）および／またはＮ末端から１個または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個またはそれ以上）を欠き、一方で、配列番号２６の少なくとも１つのエピトープを保持する。その他の断片は、１つまたは複数のタンパク質ドメインを省いている。１つの適した断片として、天然リーダーペプチド配列を省いている配列番号４６がある。
もともとの「ｓｐｒ１４１６」配列は、参考文献１４９において、「仮説上のタンパク質」として注釈をつけられた（ＧＩ：１５９０３４５９参照のこと）。参照目的で、Ｒ６株において見られる全長ｓｐｒ１４１６のアミノ酸配列が、本明細書では配列番号２８として示されている。本発明とともに使用するのに好ましいｓｐｒ１４１６ポリペプチドは、（ａ）配列番号２８に対して６０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれ以上）を有し、および／または（ｂ）配列番号２８の少なくとも「ｎ個」の連続するアミノ酸（ここで、「ｎ」は７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれ以上）である）の断片を含むアミノ酸配列を含む。これらのｓｐｒ１４１６タンパク質は、配列番号２８の改変体を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号２８に由来するエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号２８のＣ末端から１個または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個またはそれ以上）および／またはＮ末端から１個または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個またはそれ以上）を欠き、一方で、配列番号２８の少なくとも１つのエピトープを保持する。その他の断片は、１つまたは複数のタンパク質ドメインを省いている。
もともとの「ｓｐｒ１４１８」配列は、参考文献１４９において「仮説上のタンパク質」として注釈をつけられた（ＧＩ：１５９０３４６１参照のこと）。参照目的で、Ｒ６株において見られる全長ｓｐｒ１４１８のアミノ酸配列が、本明細書では配列番号２９として示されている。本発明とともに使用するのに好ましいｓｐｒ１４１８ポリペプチドは、（ａ）配列番号２９に対して６０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれ以上）を有し、および／または（ｂ）配列番号２９の少なくとも「ｎ個」の連続するアミノ酸（ここで、「ｎ」は７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれ以上）である）の断片を含むアミノ酸配列を含む。これらのｓｐｒ１４１８タンパク質は、配列番号２９の改変体を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号２９に由来するエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号２９のＣ末端から１個または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個またはそれ以上）および／またはＮ末端から１個または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個またはそれ以上）を欠き、一方で、配列番号２９の少なくとも１つのエピトープを保持する。その他の断片は、１つまたは複数のタンパク質ドメインを省いている。
もともとの「ｓｐｒ０８６７」配列は、参考文献１４９において、「エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ」として注釈をつけられた（ＧＩ：１５９０２９１１参照のこと）。参照目的で、Ｒ６株において見られる全長ｓｐｒ０８６７のアミノ酸配列が、本明細書では配列番号３０として示されている。本発明とともに使用するのに好ましいｓｐｒ０８６７ポリペプチドは、（ａ）配列番号３０に対して６０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれ以上）を有し、および／または（ｂ）配列番号３０の少なくとも「ｎ個」の連続するアミノ酸（ここで、「ｎ」は７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれ以上）である）の断片を含むアミノ酸配列を含む。これらのｓｐｒ０８６７タンパク質は、配列番号３０の改変体を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号３０に由来するエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号３０のＣ末端から１個または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個またはそれ以上）および／またはＮ末端から１個または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個またはそれ以上）を欠き、一方で、配列番号３０の少なくとも１つのエピトープを保持する。その他の断片は、１つまたは複数のタンパク質ドメインを省いている。１つの適した断片として、天然リーダーペプチド配列を省いている配列番号４８がある。
もともとの「ｓｐｒ１４３１」配列は、参考文献１４９において、「１，４−β−Ｎ−アセチルムラミダーゼ」として注釈をつけられた（ＧＩ：１５９０３４７４参照のこと）。これは、「ＬｙｔＣ」としても知られ、免疫化のためのその使用は、参考文献１７１において報告されている。参照目的で、Ｒ６株において見られる全長ｓｐｒ１４３１のアミノ酸配列が、本明細書では配列番号３１として示されている。本発明とともに使用するのに好ましいｓｐｒ１４３１ポリペプチドは、（ａ）配列番号３１に対して６０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれ以上）を有し、および／または（ｂ）配列番号３１の少なくとも「ｎ個」の連続するアミノ酸（ここで、「ｎ」は７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれ以上）である）の断片を含むアミノ酸配列を含む。これらのｓｐｒ１４３１タンパク質は、配列番号３１の改変体を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号３１に由来するエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号３１のＣ末端から１個または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個またはそれ以上）および／またはＮ末端から１個または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個またはそれ以上）を欠き、一方で、配列番号３１の少なくとも１つのエピトープを保持する。その他の断片は、１つまたは複数のタンパク質ドメインを省いている。１つの適した断片として、天然リーダーペプチド配列を省いている配列番号４９がある。
「ｓｐｒ１７３９」ポリペプチドは、ニューモリシンである（例えば、ＧＩ：１５９０３７８１参照のこと）。参照目的で、Ｒ６株において見られる全長ｓｐｒ１７３９のアミノ酸配列が、本明細書では配列番号３２として示されている。本発明とともに使用するのに好ましいｓｐｒ１７３９ポリペプチドは、（ａ）配列番号３２に対して６０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれ以上）を有し、および／または（ｂ）配列番号３２の少なくとも「ｎ個」の連続するアミノ酸（ここで、「ｎ」は７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれ以上）である）の断片を含むアミノ酸配列を含む。これらのｓｐｒ１７３９タンパク質は、配列番号３２の改変体を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号３２に由来するエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号３２のＣ末端から１個または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個またはそれ以上）および／またはＮ末端から１個または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個またはそれ以上）を欠き、一方で、配列番号３２の少なくとも１つのエピトープを保持する。その他の断片は、１つまたは複数のタンパク質ドメインを省いている。ワクチン接種使用のためのニューモリシンの変異体の形態は、当技術分野では公知であり［１８３、１５１〜１５６］、これらの変異体の形態は本発明とともに使用してもよい。解毒化は、Ｃ末端の末端切断（例えば、参考文献１５７参照のこと）、例えば、３４個のアミノ酸、４５個のアミノ酸、７個のアミノ酸を欠失させることなど［１５８］によって達成できる。配列番号３２に従って番号付けられたさらなる変異として、Ｐｒｏ３２５→Ｌｅｕ（例えば、配列番号５０）および／またはＴｒｐ４３３→Ｐｈｅ（例えば、配列番号５１）が挙げられる。これらの変異を、Ｃ末端の末端切断と組み合わせて、例えば、Ｐｒｏ３２５→Ｌｅｕ変異を、７マーの末端切断と組み合わせてもよい（例えば、配列番号５２）。
もともとの「ｓｐｒ２０２１」配列は、参考文献１４９において、「一般的なストレスタンパク質ＧＳＰ−７８１」として注釈がつけられた（ＧＩ：１５９０４０６２参照のこと）。参照目的で、Ｒ６株において見られる全長ｓｐｒ２０２１のアミノ酸配列が、本明細書では配列番号３３として示されている。本発明とともに使用するのに好ましいｓｐｒ２０２１ポリペプチドは、（ａ）配列番号３３に対して６０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれ以上）を有し、および／または（ｂ）配列番号３３の少なくとも「ｎ個」の連続するアミノ酸（ここで、「ｎ」は７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれ以上）である）の断片を含むアミノ酸配列を含む。これらのｓｐｒ２０２１タンパク質は、配列番号３３の改変体を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号３３に由来するエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号３３のＣ末端から１個または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個またはそれ以上）および／またはＮ末端から１個または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個またはそれ以上）を欠き、一方で、配列番号３３の少なくとも１つのエピトープを保持する。その他の断片は、１つまたは複数のタンパク質ドメインを省いている。１つの適した断片として、天然リーダーペプチド配列を省いている配列番号５３がある。参考文献１５０では、ｓｐｒ２０２１に、ＧｂｐＢに対して相同性を有する分泌された４５ｋＤａタンパク質として注釈がつけられており、免疫原としてのその使用が開示されている（それにおいては、配列番号２４３、ＳＰ２２１６）。ｓｐｒ２０２１の免疫原性断片は、参考文献１５０の表１（７３頁）に同定されている。ｓｐｒ２０２１の別の有用な断片は、参考文献１５９の配列番号１として開示されている（本明細書では配列番号３３のアミノ酸２８〜２７８；ｓｐｒ２０２１のこの有用な断片は、本明細書では配列番号９７として提供される；ＳＰ２２１６−１）。
もともとの「ｓｐｒ００９６」配列は、参考文献１４９において「仮説上のタンパク質」として注釈をつけられた（ＧＩ：１５９０２１４０参照のこと）。参照目的で、Ｒ６株において見られる全長ｓｐｒ００９６のアミノ酸配列が、本明細書では配列番号３４として示されている。本発明とともに使用するのに好ましいｓｐｒ００９６ポリペプチドは、（ａ）配列番号３４に対して６０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれ以上）を有し、および／または（ｂ）配列番号３４の少なくとも「ｎ個」の連続するアミノ酸（ここで、「ｎ」は７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれ以上）である）の断片を含むアミノ酸配列を含む。これらのｓｐｒ００９６タンパク質は、配列番号３４の改変体（例えば、配列番号５４、以下参照のこと）を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号３４に由来するエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号３４のＣ末端から１個または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個またはそれ以上）および／またはＮ末端から１個または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個またはそれ以上）を欠き、一方で、配列番号３４の少なくとも１つのエピトープを保持する。その他の断片は、１つまたは複数のタンパク質ドメインを省いている。
配列番号３４に対して、そのＣ末端近傍に挿入物を有するｓｐｒ００９６の改変体の形態は、本明細書では配列番号５４である。免疫化のためのこの改変体の使用は、参考文献１５０において報告されており（それにおいては、配列番号１５０）、それにおいては、ＬｙｓＭドメインタンパク質として注釈がつけられている。したがって、本発明とともに使用するためのｓｐｒ００９６は、（ａ）配列番号５４に対して６０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれ以上）を有し、および／または（ｂ）配列番号５４の少なくとも「ｎ個」の連続するアミノ酸の断片（ここで、「ｎ」は７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれ以上）である）を含むアミノ酸配列を含み得る。これらのポリペプチドは、配列番号５４の改変体を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号５４に由来するエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号５４のＣ末端から１個または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個またはそれ以上）および／またはＮ末端から１個または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個またはそれ以上）を欠き、一方で、配列番号５４の少なくとも１つのエピトープを保持する。その他の断片は、１つまたは複数のタンパク質ドメインを省いている。配列番号５４の免疫原性断片は、参考文献１５０の表１に同定されている。
ｓｐｒ００９６ポリペプチドは、二量体、例えば、ホモ二量体の形態で使用してもよい。
もともとの「ｓｐｒ１７０７」配列は、参考文献１４９では、「ＡＢＣ輸送体基質結合性タンパク質−オリゴペプチド輸送」として注釈がつけられた（ＧＩ：１５９０３７４９参照のこと）。参照目的で、Ｒ６株において見られる全長ｓｐｒ１７０７のアミノ酸配列が、本明細書では配列番号３６として示されている。本発明とともに使用するのに好ましいｓｐｒ１７０７ポリペプチドは、（ａ）配列番号３６に対して６０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれ以上）を有し、および／または（ｂ）配列番号３６の少なくとも「ｎ個」の連続するアミノ酸（ここで、「ｎ」は７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれ以上）である）の断片を含むアミノ酸配列を含む。これらのｓｐｒ１７０７タンパク質は、配列番号３６の改変体（例えば、配列番号５５、以下参照のこと）を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号３６に由来するエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号３６のＣ末端から１個または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個またはそれ以上）および／またはＮ末端から１個または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個またはそれ以上）を欠き、一方で、配列番号３６の少なくとも１つのエピトープを保持する。その他の断片は、１つまたは複数のタンパク質ドメインを省いている。
配列番号１４とは、４個のアミノ酸が異なるｓｐｒ１７０７の改変体の形態は、本明細書では配列番号５５である。免疫化のための配列番号５５の使用は、参考文献１５０において報告されている（それにおいては、配列番号２２０）。したがって、本発明とともに使用するためのｓｐｒ１７０７ポリペプチドは、（ａ）配列番号５５に対して６０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれ以上）を有し、および／または（ｂ）配列番号５５の少なくとも「ｎ個」の連続するアミノ酸の断片（ここで、「ｎ」は７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれ以上）である）を含むアミノ酸配列を含み得る。これらのポリペプチドは、配列番号５５の改変体を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号５５に由来するエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号５５のＣ末端から１個または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個またはそれ以上）および／またはＮ末端から１個または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個またはそれ以上）を欠き、一方で、配列番号５５の少なくとも１つのエピトープを保持する。その他の断片は、１つまたは複数のタンパク質ドメインを省いている。配列番号５５の免疫原性断片は、参考文献１５０の表１に同定されている。
もともとの「ｓｐｒ１８７５」配列は、参考文献１４９において「仮説上のタンパク質」として注釈をつけられた（ＧＩ：１５９０３９１６参照のこと）。参照目的で、Ｒ６株において見られる全長ｓｐｒ１８７５のアミノ酸配列が、本明細書では配列番号３５として示されている。本発明とともに使用するのに好ましいｓｐｒ１８７５ポリペプチドは、（ａ）配列番号３５に対して６０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれ以上）を有し、および／または（ｂ）配列番号３５の少なくとも「ｎ個」の連続するアミノ酸（ここで、「ｎ」は７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれ以上）である）の断片を含むアミノ酸配列を含む。これらのｓｐｒ１８７５タンパク質は、配列番号３５の改変体を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号３５に由来するエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号３５のＣ末端から１個または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個またはそれ以上）および／またはＮ末端から１個または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個またはそれ以上）を欠き、一方で、配列番号３５の少なくとも１つのエピトープを保持する。その他の断片は、１つまたは複数のタンパク質ドメインを省いている。
「ｓｐｒ０８８４」タンパク質は、プロテアーゼ成熟タンパク質としても知られる、ペプチジルプロリルイソメラーゼである。参照目的で、全長ｓｐｒ０８８４のアミノ酸配列は、本明細書では配列番号３７である。本発明とともに使用するのに好ましいｓｐｒ０８８４ポリペプチドは、（ａ）配列番号３７に対して６０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれ以上）を有し、および／または（ｂ）配列番号３７の少なくとも「ｎ個」の連続するアミノ酸（ここで、「ｎ」は７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれ以上）である）の断片を含むアミノ酸配列を含む。これらのｓｐｒ０８８４タンパク質は、配列番号３７の改変体を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号３７に由来するエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号３７のＣ末端から１個または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個またはそれ以上）および／またはＮ末端から１個または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個またはそれ以上）を欠き、一方で、配列番号３７の少なくとも１つのエピトープを保持する。その他の断片は、１つまたは複数のタンパク質ドメインを省いている。１つの適した断片として、天然リーダーペプチド配列を省いている配列番号５６がある。免疫化のためのｓｐｒ０８８４の使用は、参考文献１６０において報告されている。
ＣｌｐＰはＡＴＰ依存性Ｃｌｐプロテアーゼタンパク質分解サブユニットである。参照目的で、全長ＣｌｐＰのアミノ酸配列は、本明細書では配列番号５８である。Ｒ６ゲノムでは、ＣｌｐＰは、ｓｐｒ０６５６である［１４９］。本発明とともに使用するのに好ましいＣｌｐＰポリペプチドは、（ａ）配列番号５８に対して６０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれ以上）を有し、および／または（ｂ）配列番号５８の少なくとも「ｎ個」の連続するアミノ酸（ここで、「ｎ」は７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれ以上）である）の断片を含むアミノ酸配列を含む。これらのＣｌｐＰタンパク質は、配列番号５８の改変体を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号５８に由来するエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号５８のＣ末端から１個または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個またはそれ以上）および／またはＮ末端から１個または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個またはそれ以上）を欠き、一方で、配列番号５８の少なくとも１つのエピトープを保持する。その他の断片は、１つまたは複数のタンパク質ドメインを省いている。免疫化のためのＣｌｐＰの使用は、参考文献１６１および１６２において報告されている。ＰｓｐＡおよびＰｓａＡおよび／またはＰｓｐＣと組み合わせて使用することが有利であり得る［１６１］。
ＬｙｔＡは、Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼ（自己溶解素）である。参照目的で、全長ＬｙｔＡのアミノ酸配列は、本明細書では配列番号５９である。Ｒ６ゲノムでは、ＬｙｔＡは、ｓｐｒ１７５４である［１４９］。本発明とともに使用するのに好ましいＬｙｔＡポリペプチドは、（ａ）配列番号５９に対して６０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれ以上）を有し、および／または（ｂ）配列番号５９の少なくとも「ｎ個」の連続するアミノ酸（ここで、「ｎ」は７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれ以上）である）の断片を含むアミノ酸配列を含む。これらのＬｙｔＡタンパク質は、配列番号５９の改変体を含む（例えば、ＧＩ：１８５６８３５４）。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号５９に由来するエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号５９のＣ末端から１個または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個またはそれ以上）および／またはＮ末端から１個または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個またはそれ以上）を欠き、一方で、配列番号５９の少なくとも１つのエピトープを保持する。その他の断片は、１つまたは複数のタンパク質ドメインを省いている。免疫化のためのＬｙｔＡの使用は、特に、異種プロミスキャス（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）Ｔヘルパーエピトープと融合しているＬｙｔＡコリン結合ドメインを含む形態で、参考文献１６３に報告されている。
ＰｈｔＡは、肺炎球菌ヒスチジン三組（ｔｒｉａｄ）プロテインＡである。参照目的で、全長ＰｈｔＡ前駆体のアミノ酸配列は、本明細書では配列番号６０である。Ｒ６ゲノムでは、ＰｈｔＡは、ｓｐｒ１０６１である［１４９］。本発明とともに使用するのに好ましいＰｈｔＡポリペプチドは、（ａ）配列番号６０に対して６０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれ以上）を有し、および／または（ｂ）配列番号６０の少なくとも「ｎ個」の連続するアミノ酸（ここで、「ｎ」は７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれ以上）である）の断片を含むアミノ酸配列を含む。これらのＰｈｔＡタンパク質は、配列番号６０の改変体を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号６０に由来するエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号６０のＣ末端から１個または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個またはそれ以上）および／またはＮ末端から１個または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個またはそれ以上）を欠き、一方で、配列番号６０の少なくとも１つのエピトープを保持する。その他の断片は、１つまたは複数のタンパク質ドメインを省いている。免疫化のためのＰｈｔＡの使用は、参考文献１６４および１６５において報告されている。
ＰｈｔＢは、肺炎球菌ヒスチジン三組タンパク質Ｂである。参照目的で、全長ＰｈｔＢ前駆体のアミノ酸配列は、本明細書では配列番号６１である。残基５７８のＸａａは、リシンであり得る。本発明とともに使用するのに好ましいＰｈｔＢポリペプチドは、（ａ）配列番号６１に対して６０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれ以上）を有し、および／または（ｂ）配列番号６１の少なくとも「ｎ個」の連続するアミノ酸（ここで、「ｎ」は７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれ以上）である）の断片を含むアミノ酸配列を含む。これらのＰｈｔＢタンパク質は、配列番号６１の改変体を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号６１に由来するエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号６１のＣ末端から１個または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個またはそれ以上）および／またはＮ末端から１個または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個またはそれ以上）を欠き、一方で、配列番号６１の少なくとも１つのエピトープを保持する。その他の断片は、１つまたは複数のタンパク質ドメインを省いている。免疫化のためのＰｈｔＢの使用は、参考文献１６４、１６５および１６６において報告されている。
ＰｈｔＤは、肺炎球菌ヒスチジン三組タンパク質Ｄである。参照目的で、全長ＰｈｔＤ前駆体のアミノ酸配列は、本明細書では配列番号６２である。Ｒ６ゲノムでは、ＰｈｔＤは、ｓｐｒ０９０７である［１４９］。本発明とともに使用するのに好ましいＰｈｔＤポリペプチドは、（ａ）配列番号６２に対して６０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれ以上）を有し、および／または（ｂ）配列番号６２の少なくとも「ｎ個」の連続するアミノ酸（ここで、「ｎ」は７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれ以上）である）の断片を含むアミノ酸配列を含む。これらのＰｈｔＤタンパク質は、配列番号６２の改変体を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号６２に由来するエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号６２のＣ末端から１個または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個またはそれ以上）および／またはＮ末端から１個または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個またはそれ以上）を欠き、一方で、配列番号６２の少なくとも１つのエピトープを保持する。その他の断片は、１つまたは複数のタンパク質ドメインを省いている。免疫化のためのＰｈｔＤの使用は、参考文献１６４、１６５および１６６において報告されている。
ＰｈｔＥは、肺炎球菌ヒスチジン三組タンパク質Ｅである。参照目的で、全長ＰｈｔＥ前駆体のアミノ酸配列は、本明細書では配列番号６３である。Ｒ６ゲノムでは、ＰｈｔＥは、ｓｐｒ０９０８である［１４９］。本発明とともに使用するのに好ましいＰｈｔＥポリペプチドは、（ａ）配列番号６３に対して６０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれ以上）を有し、および／または（ｂ）配列番号６３の少なくとも「ｎ個」の連続するアミノ酸（ここで、「ｎ」は７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれ以上）である）の断片を含むアミノ酸配列を含む。これらのＰｈｔＥタンパク質は、配列番号６３の改変体を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号６３に由来するエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号６３のＣ末端から１個または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個またはそれ以上）および／またはＮ末端から１個または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個またはそれ以上）を欠き、一方で、配列番号６３の少なくとも１つのエピトープを保持する。その他の断片は、１つまたは複数のタンパク質ドメインを省いている。免疫化のためのＰｈｔＥの使用は、参考文献１６４および１６５において報告されている。
ＺｍｐＢは、亜鉛メタロプロテアーゼである。参照目的で、全長ＺｍｐＢのアミノ酸配列は、本明細書では配列番号６４である。Ｒ６ゲノムでは、ＺｍｐＢは、ｓｐｒ０５８１である［１４９］。本発明とともに使用するのに好ましいＺｍｐＢポリペプチドは、（ａ）配列番号６４に対して６０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれ以上）を有し、および／または（ｂ）配列番号６４の少なくとも「ｎ個」の連続するアミノ酸（ここで、「ｎ」は７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれ以上）である）の断片を含むアミノ酸配列を含む。これらのＺｍｐＢタンパク質は、配列番号６４の改変体を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号６４に由来するエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号６４のＣ末端から１個または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個またはそれ以上）および／またはＮ末端から１個または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個またはそれ以上）を欠き、一方で、配列番号６４の少なくとも１つのエピトープを保持する。その他の断片は、１つまたは複数のタンパク質ドメインを省いている。
ＣｂｐＤは、コリン結合タンパク質Ｄである。参照目的で、全長ＣｂｐＤのアミノ酸配列は、本明細書では配列番号６５である。Ｒ６ゲノムでは、ＣｂｐＤは、ｓｐｒ２００６である［１４９］。本発明とともに使用するのに好ましいＣｂｐＤポリペプチドは、（ａ）配列番号６５に対して６０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれ以上）を有し、および／または（ｂ）配列番号６５の少なくとも「ｎ個」の連続するアミノ酸（ここで、「ｎ」は７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれ以上）である）の断片を含むアミノ酸配列を含む。これらのＣｂｐＤタンパク質は、配列番号６５の改変体を含む（例えば、配列番号６６、以下参照のこと）。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号６５に由来するエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号６５のＣ末端から１個または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個またはそれ以上）および／またはＮ末端から１個または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個またはそれ以上）を欠き、一方で、配列番号６５の少なくとも１つのエピトープを保持する。その他の断片は、１つまたは複数のタンパク質ドメインを省いている。免疫化のためのＣｂｐＤの使用は、参考文献１７１において報告されている。
配列番号６５の改変体は、本明細書では配列番号６６である。免疫化のための配列番号６６の使用は、参考文献１５０において報告されている（それにおいては、配列番号２４１）。したがって、本発明と共に使用するためのＣｂｐＤポリペプチドは、（ａ）配列番号６６に対して６０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれ以上）を有し、および／または（ｂ）配列番号６６の少なくとも「ｎ個」の連続するアミノ酸の断片（ここで、「ｎ」は７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれ以上）である）を含むアミノ酸配列を含み得る。これらのＣｂｐＤタンパク質は、配列番号６６の改変体を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号６６に由来するエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号６６のＣ末端から１個または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個またはそれ以上）および／またはＮ末端から１個または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個またはそれ以上）を欠き、一方で、配列番号６６の少なくとも１つのエピトープを保持する。その他の断片は、１つまたは複数のタンパク質ドメインを省いている。配列番号６６の免疫原性断片は、参考文献１５０の表１に同定されている。
ＣｂｐＧは、コリン結合タンパク質Ｇである。参照目的で、全長ＣｂｐＧのアミノ酸配列は、本明細書では配列番号６７である。Ｒ６ゲノムでは、ＣｂｐＧは、ｓｐｒ０３５０である［１４９］。本発明とともに使用するのに好ましいＣｂｐＧポリペプチドは、（ａ）配列番号６７に対して６０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれ以上）を有し、および／または（ｂ）配列番号６７の少なくとも「ｎ個」の連続するアミノ酸（ここで、「ｎ」は７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれ以上）である）の断片を含むアミノ酸配列を含む。これらのＣｂｐＧタンパク質は、配列番号６７の改変体を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号６７に由来するエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号６７のＣ末端から１個または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個またはそれ以上）および／またはＮ末端から１個または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個またはそれ以上）を欠き、一方で、配列番号６７の少なくとも１つのエピトープを保持する。その他の断片は、１つまたは複数のタンパク質ドメインを省いている。免疫化のためのＣｂｐＧの使用は、参考文献１７１において報告されている。
ＰｖａＡ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ肺炎球菌ワクチン抗原Ａ）は、ｓｐ１０１としても知られている。参照目的で、全長ＰｖａＡのアミノ酸配列は、本明細書では配列番号６８である。Ｒ６ゲノムでは、ＰｖａＡは、ｓｐｒ０９３０である［１４９］。本発明とともに使用するのに好ましいＰｖａＡポリペプチドは、（ａ）配列番号６８に対して６０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれ以上）を有し、および／または（ｂ）配列番号６８の少なくとも「ｎ個」の連続するアミノ酸（ここで、「ｎ」は７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれ以上）である）の断片を含むアミノ酸配列を含む。これらのＰｖａＡタンパク質は、配列番号６８の改変体を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号６８に由来するエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号６８のＣ末端から１個または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個またはそれ以上）および／またはＮ末端から１個または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個またはそれ以上）を欠き、一方で、配列番号６８の少なくとも１つのエピトープを保持する。その他の断片は、１つまたは複数のタンパク質ドメインを省いている。免疫化のためのＰｖａＡの使用は、参考文献１６８および１６９において報告されている。
ＣＰＬ１は、肺炎球菌ファージＣＰ１リゾチームである。参照目的で、全長ＣＰＬ１のアミノ酸配列は、本明細書では配列番号６９である。本発明とともに使用するのに好ましいＣＰＬ１ポリペプチドは、（ａ）配列番号６９に対して６０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれ以上）を有し、および／または（ｂ）配列番号６９の少なくとも「ｎ個」の連続するアミノ酸（ここで、「ｎ」は７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれ以上）である）の断片を含むアミノ酸配列を含む。これらのＣＰＬ１タンパク質は、配列番号６９の改変体を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号６９に由来するエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号６９のＣ末端から１個または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個またはそれ以上）および／またはＮ末端から１個または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個またはそれ以上）を欠き、一方で、配列番号６９の少なくとも１つのエピトープを保持する。その他の断片は、１つまたは複数のタンパク質ドメインを省いている。免疫化のためのＣＰＬ１の使用は、特に、異種プロミスキャスＴヘルパーエピトープと融合しているＣＰＬ１コリン結合ドメインを含む形態で、参考文献１６３に報告されている。
ＰｓｐＣは、肺炎球菌表面タンパク質Ｃであり［１７０］、コリン結合プロテインＡ（ＣｂｐＡ）としても知られている。免疫化のためのその使用は、参考文献１６８および１７１に報告されている。Ｒ６株では、ｓｐｒ１９９５であり、参照のために、全長ｓｐｒ１９９５のアミノ酸配列は、本明細書では配列番号５７である。本発明とともに使用するのに好ましいＰｓｐＣポリペプチドは、（ａ）配列番号５７に対して６０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれ以上）を有し、および／または（ｂ）配列番号５７の少なくとも「ｎ個」の連続するアミノ酸（ここで、「ｎ」は７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれ以上）である）の断片を含むアミノ酸配列を含む。これらのｓｐｒ１９９５タンパク質は、配列番号５７の改変体を含む（例えば、配列番号７１、以下参照のこと）。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号５７に由来するエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号５７のＣ末端から１個または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個またはそれ以上）および／またはＮ末端から１個または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個またはそれ以上）を欠き、一方で、配列番号５７の少なくとも１つのエピトープを保持する。その他の断片は、１つまたは複数のタンパク質ドメインを省いている。
ＰｓｐＣの改変体は、「Ｈｉｃ」としても知られている。それは、参考文献１７２の図１に示されるようにＰｓｐＣと同様であり、それにおいては、Ｈ因子（ｆＨ）と結合すると報告されている。参照目的で、全長Ｈｉｃのアミノ酸配列は、本明細書では配列番号７１である。Ｈｉｃタンパク質は、ＰｓｐＣポリペプチドに加えて、またはＰｓｐＣポリペプチドの代わりに、本発明とともに使用してもよい。本発明とともに使用するのに好ましいＨｉｃポリペプチドは、（ａ）配列番号７１に対して６０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれ以上）を有し、および／または（ｂ）配列番号７１の少なくとも「ｎ個」の連続するアミノ酸（ここで、「ｎ」は７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれ以上）である）の断片を含むアミノ酸配列を含む。これらのＨｉｃタンパク質は、配列番号７１の改変体を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号７１に由来するエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号７１のＣ末端から１個または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個またはそれ以上）および／またはＮ末端から１個または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個またはそれ以上）を欠き、一方で、配列番号７１の少なくとも１つのエピトープを保持する。その他の断片は、１つまたは複数のタンパク質ドメインを省いている。ＰｓｐＣおよび／またはＨｉｃは、ＰｓｐＡおよび／またはＰｓａＡと組み合わせて使用することが有利であり得る。
ＰｓｐＡは、肺炎球菌表面プロテインＡである。参照目的で、全長ＰｓｐＡのアミノ酸配列は、本明細書では配列番号７２である。Ｒ６ゲノムでは、ＰｓｐＡは、ｓｐｒ０１２１である［１４９］。本発明とともに使用するのに好ましいＰｓｐＡポリペプチドは、（ａ）配列番号７２に対して６０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれ以上）を有し、および／または（ｂ）配列番号７２の少なくとも「ｎ個」の連続するアミノ酸（ここで、「ｎ」は７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれ以上）である）の断片を含むアミノ酸配列を含む。これらのＰｓｐＡタンパク質は、配列番号７２の改変体を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号７２に由来するエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号７２のＣ末端から１個または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個またはそれ以上）および／またはＮ末端から１個または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個またはそれ以上）を欠き、一方で、配列番号７２の少なくとも１つのエピトープを保持する。その他の断片は、１つまたは複数のタンパク質ドメインを省いている。免疫化のためのＰｓｐＡの使用は、特に参考文献１７３において報告されている。ＰｓｐＣと組み合わせて投与することが有利であり得る。
ＰｓａＡは、肺炎球菌表面アドヘシンである。参照目的で、全長ＰｓａＡのアミノ酸配列は、本明細書では配列番号７３である。本発明とともに使用するのに好ましいＰｓａＡポリペプチドは、（ａ）配列番号７３に対して６０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれ以上）を有し、および／または（ｂ）配列番号７３の少なくとも「ｎ個」の連続するアミノ酸（ここで、「ｎ」は７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれ以上）である）の断片を含むアミノ酸配列を含む。これらのＰｓａＡタンパク質は、配列番号７３の改変体を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号７３に由来するエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号７３のＣ末端から１個または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個またはそれ以上）および／またはＮ末端から１個または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個またはそれ以上）を欠き、一方で、配列番号７３の少なくとも１つのエピトープを保持する。その他の断片は、１つまたは複数のタンパク質ドメインを省いている。ＰｓａＡの有用な断片は、参考文献１５９において配列番号３として開示されている（本明細書では、配列番号７３のアミノ酸２１〜３０９に対応する；ＰｓａＡのこの有用な断片は、本明細書では配列番号９９として提供される）。免疫化のためのＰｓａＡの使用は、参考文献１７４に報告されている。ＰｓｐＡおよび／またはＰｓｐＣと組み合わせて使用してもよい。
ＰｒｔＡは、細胞壁結合セリンプロテイナーゼである。ｓｐ１２８およびｓｐ１３０としても知られており、スブチリシン様セリンプロテアーゼ中にある。参照目的で、全長ＰｒｔＡ前駆体のアミノ酸配列は、本明細書では配列番号７４である。Ｒ６ゲノムでは、ＰｒｔＡは、ｓｐｒ０５６１である［１４９］。本発明とともに使用するのに好ましいＰｒｔＡポリペプチドは、（ａ）配列番号７４に対して６０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれ以上）を有し、および／または（ｂ）配列番号７４の少なくとも「ｎ個」の連続するアミノ酸（ここで、「ｎ」は７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれ以上）である）の断片を含むアミノ酸配列を含む。これらのＰｒｔＡタンパク質は、配列番号７４の改変体を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号７４に由来するエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号７４のＣ末端から１個または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個またはそれ以上）および／またはＮ末端から１個または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個またはそれ以上）を欠き、一方で、配列番号７４の少なくとも１つのエピトープを保持する。その他の断片は、１つまたは複数のタンパク質ドメインを省いている。免疫化のためのＰｒｔＡの使用は、参考文献１７５および１７６、また参考文献１６８において報告されている。
Ｓｐ１３３は、保存された肺炎球菌抗原である。参照目的で、全長Ｓｐ１３３のアミノ酸配列は、本明細書では配列番号７５である。Ｒ６ゲノムでは、Ｓｐ１３３は、ｓｐｒ０９３１である［１４９］。本発明とともに使用するのに好ましいＳｐ１３３ポリペプチドは、（ａ）配列番号７５に対して６０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれ以上）を有し、および／または（ｂ）配列番号７５の少なくとも「ｎ個」の連続するアミノ酸（ここで、「ｎ」は７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれ以上）である）の断片を含むアミノ酸配列を含む。これらのＳｐ１３３タンパク質は、配列番号７５の改変体を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号７５に由来するエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号７５のＣ末端から１個または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個またはそれ以上）および／またはＮ末端から１個または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個またはそれ以上）を欠き、一方で、配列番号７５の少なくとも１つのエピトープを保持する。その他の断片は、１つまたは複数のタンパク質ドメインを省いている。免疫化のためのＳｐ１３３の使用は、参考文献１７７において報告されている。
ＰｉａＡは、肺炎球菌による鉄獲得に関与している膜透過酵素である。参照目的で、全長ＰｉａＡのアミノ酸配列は、本明細書では配列番号７６である。Ｒ６ゲノムでは、ＰｉａＡは、ｓｐｒ０９３５である［１４９］。本発明とともに使用するのに好ましいＰｉａＡポリペプチドは、（ａ）配列番号７６に対して６０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれ以上）を有し、および／または（ｂ）配列番号７６の少なくとも「ｎ個」の連続するアミノ酸（ここで、「ｎ」は７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれ以上）である）の断片を含むアミノ酸配列を含む。これらのＰｉａＡタンパク質は、配列番号７６の改変体を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号７６に由来するエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号７６のＣ末端から１個または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個またはそれ以上）および／またはＮ末端から１個または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個またはそれ以上）を欠き、一方で、配列番号７６の少なくとも１つのエピトープを保持する。その他の断片は、１つまたは複数のタンパク質ドメインを省いている。免疫化のためのＰｉａＡの使用は、特に、ＰｉｕＡと組み合わせて、参考文献１７８、１７９および１８０に報告されている。
ＰｉｕＡは、第二鉄輸送のためのＡＢＣ輸送体基質結合タンパク質である。ＦａｔＢとしても知られている。参照目的で、全長ＰｉｕＡのアミノ酸配列は、本明細書では配列番号７７である。Ｒ６ゲノムでは、ＰｉｕＡは、ｓｐｒ１６８７である［１４９］。本発明とともに使用するのに好ましいＰｉｕＡポリペプチドは、（ａ）配列番号７７に対して６０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれ以上）を有し、および／または（ｂ）配列番号７７の少なくとも「ｎ個」の連続するアミノ酸（ここで、「ｎ」は７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれ以上）である）の断片を含むアミノ酸配列を含む。これらのＰｉｕＡタンパク質は、配列番号７７の改変体を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号７７に由来するエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号７７のＣ末端から１個または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個またはそれ以上）および／またはＮ末端から１個または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個またはそれ以上）を欠き、一方で、配列番号７７の少なくとも１つのエピトープを保持する。その他の断片は、１つまたは複数のタンパク質ドメインを省いている。免疫化のためのＰｉｕＡの使用は、特に、ＰｉａＡと組み合わせて、参考文献１７８〜１８０において報告されている。
ＣｂｉＯは、コバルト輸送体ＡＴＰ結合サブユニットとして注釈がつけられている。参照目的で、全長ＣｂｉＯのアミノ酸配列は、本明細書では配列番号７８である。Ｒ６ゲノムでは、ＣｂｉＯは、ｓｐｒ２０２５である［１４９］。免疫化のためのＣｂｉＯの使用は、参考文献１８１において報告されている（それにおいては、「ＩＤ２」）。本発明とともに使用するのに好ましいＣｂｉＯポリペプチドは、（ａ）配列番号７８に対して６０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれ以上）を有し、および／または（ｂ）配列番号７８の少なくとも「ｎ個」の連続するアミノ酸（ここで、「ｎ」は７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれ以上）である）の断片を含むアミノ酸配列を含む。これらのＣｂｉＯタンパク質は、配列番号７８の改変体を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号７８に由来するエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号７８のＣ末端から１個または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個またはそれ以上）および／またはＮ末端から１個または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個またはそれ以上）を欠き、一方で、配列番号７８の少なくとも１つのエピトープを保持する。その他の断片は、１つまたは複数のタンパク質ドメインを省いている。
参照目的で、３０Ｓリボソームタンパク質Ｓ８のアミノ酸配列は、本明細書では配列番号７９である。Ｒ６ゲノムでは、Ｓ８サブユニットは、ｓｐｒ０２０３である［１４９］。本発明とともに使用するのに好ましいＳ８ポリペプチドは、（ａ）配列番号７９に対して６０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれ以上）を有し、および／または（ｂ）配列番号７９の少なくとも「ｎ個」の連続するアミノ酸（ここで、「ｎ」は７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれ以上）である）の断片を含むアミノ酸配列を含む。これらのＳ８タンパク質は、配列番号７９の改変体を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号７９に由来するエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号７９のＣ末端から１個または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個またはそれ以上）および／またはＮ末端から１個または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個またはそれ以上）を欠き、一方で、配列番号７９の少なくとも１つのエピトープを保持する。その他の断片は、１つまたは複数のタンパク質ドメインを省いている。
ＳＰ１７３２は、膜結合性セリン／トレオニンキナーゼ、ＳｔｋＰである。６５９個のアミノ酸を含むＳＰ１７３２の配列は、参考文献１５０において配列番号２１４として同定されている。「ＳＰ １７３２−３」と呼ばれる、この配列の例示的断片は、参考文献１５９において配列番号２として同定されている。参照目的で、ＳＰ １７３２−３のアミノ酸配列が、本明細書では配列番号９８として提供されている。本発明とともに使用するのに好ましいＳＰ１７３２ポリペプチドは、（ａ）配列番号９８に対して６０％以上の同一性（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれ以上）を有し、および／または（ｂ）配列番号９８の少なくとも「ｎ個」の連続するアミノ酸（ここで、「ｎ」は７以上（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれ以上）である）の断片を含むアミノ酸配列を含む。これらのＳＰ１７３２タンパク質は、配列番号９８の改変体を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号９８に由来するエピトープを含む。その他の好ましい断片は、配列番号９８のＣ末端から１個または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個またはそれ以上）および／またはＮ末端から１個または複数のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５個またはそれ以上）を欠き、一方で、配列番号９８の少なくとも１つのエピトープを保持する。その他の断片は、１つまたは複数のタンパク質ドメインを省いている。
（肺炎球菌糖類との組み合わせ）
１つまたは複数のクレイドに由来するＲｒｇＢポリペプチドは、通常、キャリアタンパク質（複数可）に結合体化された、１つまたは複数の肺炎球菌莢膜糖類と組み合わせてもよい。したがって、本発明は、
（１）混合物またはハイブリッドとしての、上記で論じられる少なくとも２つのＲｒｇＢクレイドの組み合わせと、
（２）１つまたは複数の肺炎球菌莢膜糖類と
の組み合わせを含む免疫原性組成物を提供する。
この組み合わせの成分（２）において使用される糖類は、理想的には、糖類部分と、キャリアタンパク質部分とを含む結合体として存在する。結合体中のキャリア部分は、単一のＲｒｇＢポリペプチド、ハイブリッドＲｒｇＢポリペプチド、非ＲｒｇＢ肺炎球菌ポリペプチドまたは非肺炎球菌ポリペプチドであり得る。
糖類は、肺炎球菌の莢膜糖類に由来するものである。糖類は、細菌からの糖類の精製の際に生じる大きさを有する多糖であり得、またはこのような多糖の断片化によって達成されるオリゴ糖であり得る。７価のＰＲＥＶＮＡＲＴＭ製品では、例えば、糖類のうちの６つは、無傷の多糖として提示され、一方で、１つ（１８Ｃ血清型）は、オリゴ糖として提示される。
組成物は、以下の肺炎球菌血清型のうちの１つまたは複数に由来する莢膜糖類を含み得る：１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆおよび／または３３Ｆ。組成物は、複数の血清型、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３個またはそれ以上の血清型を含み得る。２３価の非結合体化組み合わせと同様に、７価、９価、１０価、１１価および１３価の結合体化組み合わせがすでに当技術分野で公知である。
例えば、１０価の組み合わせは、血清型１、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆに由来する糖類を含み得る。１１価の組み合わせは、血清型３に由来する糖類をさらに含み得る。１２価の組み合わせには、１０価の混合物に、血清型６Ａおよび１９Ａ、６Ａおよび２２Ｆ、１９Ａおよび２２Ｆ、６Ａおよび１５Ｂ、１９Ａおよび１５Ｂ、ｒ２２Ｆおよび１５Ｂが加えられてもよい。１３価の組み合わせには、１１価の混合物に、血清型１９Ａおよび２２Ｆ、８および１２Ｆ、８および１５Ｂ、８および１９Ａ、８および２２Ｆ、１２Ｆおよび１５Ｂ、１２Ｆおよび１９Ａ、１２Ｆおよび２２Ｆ、１５Ｂおよび１９Ａ、１５Ｂおよび２２Ｆなどが加えられてもよい。１つの有用な１３価の組み合わせは、血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９、１９Ｆおよび２３Ｆに由来する莢膜糖類を含む。糖類が封入される場合には、血清型１、５および１４のうちの１、２または３つを含むことが好ましい。
結合体中のキャリアタンパク質は、（１）のＲｒｇＢ抗原のうちの１つであっても、そうでなくてもよい。ＲｒｇＢ抗原ではない場合には、代わりに、ｓｐｒ００５７、ｓｐｒ００９６およびｓｐｒ２０２１などまたはニューモリシン［１８２］もしくはその非毒性誘導体［１８３］または肺炎球菌表面タンパク質ＰｓｐＡ［１８４］といった様々な肺炎球菌抗原であり得る。いくつかの実施形態では、キャリアは肺炎球菌抗原ではなく、例えば、細菌毒素またはトキソイドであり得る。通常のキャリアタンパク質として、ジフテリアまたは破傷風トキソイドまたはその変異体がある。ＣＲＭ１９７ジフテリア毒素変異体［１８５］は、有用であり、ＰＲＥＶＮＡＲＴＭ製品中のキャリアである。その他の適したキャリアタンパク質として、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜タンパク質複合体［１８６］、合成ペプチド［１８７、１８８］、熱ショックタンパク質［１８９、１９０］、百日咳タンパク質［１９１、１９２］、サイトカイン［１９３］、リンホカイン［１９３］、ホルモン［１９３］、増殖因子［１９３］、種々の病原体由来抗原に由来する複数のヒトＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ［１９４］を含む人工タンパク質、例えば、Ｎ１９［１９５］、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ由来のタンパク質Ｄ［１９６〜１９８］、鉄取り込みタンパク質［１９９］、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来の毒素ＡまたはＢ［２００］、組換えＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａエキソプロテインＡ（ｒＥＰＡ）［２０１］などが挙げられる。
組成物が、２つ以上の結合体を含む場合には、各結合体は、同一のキャリアタンパク質を使用してもよく、異なるキャリアタンパク質を使用してもよい。参考文献２０２には、多価肺炎球菌結合体化ワクチンにおいて異なるキャリアタンパク質を使用する場合の潜在的利点が記載されている。
いくつかの実施形態では、単一結合体が、複数の血清型に由来する糖類を保持し得る［２０３］。しかし、通常、各結合体は、単一の血清型に由来する糖類を含む。
結合体は、過剰のキャリア（ｗ／ｗ）または過剰の糖類（ｗ／ｗ）を有し得る。いくつかの実施形態では、結合体は、等しい重量の各々を含み得る。
キャリア分子は、キャリアと直接的に、またはリンカーを介して共有結合によって結合体化され得る。タンパク質との直接結合は、例えば、参考文献２０４および２０５に記載されるように、例えば、糖類とキャリアとの間の還元的アミノ化によって達成され得る。糖類は、まず、例えば、酸化によって活性化されることが必要であり得る。リンカー基を介した結合は、任意の公知の手順、例えば、参考文献２０６および２０７に記載される手順を使用して行ってよい。好ましい種類の結合はアジピン酸リンカーがあり、これは、遊離−ＮＨ２基（例えば、アミノ化によってグルカンに導入された）を、アジピン酸とカップリングすること（例えば、ジイミド活性化を使用して）、次いで、タンパク質を得られた糖類−アジピン酸中間体にカップリングすることによって形成され得る［２０８、２０９］。別の好ましい種類の結合として、カルボニルリンカーがあり、これは、ＣＤＩと糖類の遊離ヒドロキシル基［２１０、２１１］の反応と、それに続く、カルバメート結合を形成するタンパク質との反応によって形成され得る。その他のリンカーとして、β−プロピオンアミド［２１２］、ニトロフェニル−エチルアミン［２１３］、ハロゲン化ハロアシル［２１４］、グリコシド結合［２１５］、６−アミノカプロン酸［２１６］、ＡＤＨ［２１７］、Ｃ４〜Ｃ１２部分［２１８］などが挙げられる。カルボジイミド縮合も使用してよい［２１９］。
（非肺炎球菌抗原との組み合わせ）
ＲｒｇＢクレイドの組み合わせは、非肺炎球菌抗原との組み合わせにおいて使用してもよい。したがって、本発明は、
（１）混合物またはハイブリッドとしての上記で論じられた少なくとも２つのＲｒｇＢクレイドの組み合わせ、および
（２）ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、１つまたは複数の百日咳抗原、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原、不活化ポリオウイルス抗原、Ｂ型Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ由来の莢膜糖類抗原の結合体、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ｃ由来の莢膜糖類抗原の結合体、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ｙ由来の莢膜糖類抗原の結合体、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ｗ１３５由来の莢膜糖類抗原の結合体、およびＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ａ由来の莢膜糖類抗原の結合体からなる群より選択される１つまたは複数の抗原
の組み合わせを含む免疫原性組成物を提供する。
ジフテリアトキソイドは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ由来のジフテリア毒素を処理することによって（例えば、ホルムアルデヒドを使用して）得ることができる。ジフテリアトキソイドは、例えば、参考文献２２０の第１３章に、より詳細に開示されている。
破傷風トキソイドは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ由来の破傷風菌毒素を処理することによって（例えば、ホルムアルデヒドを使用して）得ることができる。破傷風トキソイドは、参考文献２２０の第２７章に、より詳細に開示されている。
ワクチン中の百日咳抗原は、細胞性（全細胞、Ｐｗ）または無細胞性（Ｐａ）のいずれかである。本発明は、いずれかの種類の百日咳抗原を使用してよい。細胞性百日咳抗原の調製は、十分に記述されている（例えば、参考文献２２０の第２１章を参照のこと）。例えば、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓの第Ｉ相培養物の熱不活性化によって得てもよい。無細胞性百日咳抗原（複数可）は、天然の細菌から精製されたか、または組換え宿主における発現後に精製されたかのいずれかの、特定の精製されたＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ抗原を含む。２つ以上の無細胞性抗原を使用することが普通であり、そのため、組成物は、以下の周知の、十分に特性決定されたＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ抗原のうちの１、２または３つを含み得る：（１）解毒化された百日咳毒素（百日咳トキソイドまたは「ＰＴ」）、（２）線維状血球凝集素（「ＦＨＡ」）、（３）ペルタクチン（「６９キロダルトン外膜タンパク質」としても知られている）。ＦＨＡおよびペルタクチンは、本発明に従って使用する前に、ホルムアルデヒドを用いて処理してもよい。ＰＴは、ホルムアルデヒドおよび／またはグルタルアルデヒドを用いて処理することによって解毒化され得るが、この化学的解毒化手順の代替として、変異誘発によって酵素活性が低減されている変異体ＰＴであってもよい［２２１］。使用してもよいさらなる無細胞性百日咳抗原として、線毛（例えば、凝集原２および３）が挙げられる。
Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）は、Ｂ型肝炎ウイルスのカプシドの主要成分である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどの酵母において組換え発現によって産生されることが好都合である。
不活化ポリオウイルス（ＩＰＶ）抗原は、細胞培養物で増殖させられ、次いで、不活化させた（例えば、ホルムアルデヒドを使用して）ウイルスから調製される。参考文献２２０の第２４章に説明されるように、３つのポリオウイルスのうちの１つによってポリオが引き起こされ得るので、組成物は、３つのポリオウイルス抗原：ポリオウイルス１型（例えば、Ｍａｈｏｎｅｙ株）、ポリオウイルス２型（例えば、ＭＥＦ−１株）およびポリオウイルス３型（例えば、Ｓａｕｋｅｔｔ株）を含み得る。
組成物が、成分（２）中に、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイドまたは無細胞性百日咳抗原のうちの１つを含む場合は、それらのうちの３つすべてを含むことが普通となる。すなわち、成分（２）は、Ｄ−Ｔ−Ｐａの組み合わせを含むこととなる。
組成物が、成分（２）中に、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイドまたは細胞性百日咳抗原のうちの１つを含む場合は、それらのうちの３つすべてを含むことが普通となる。すなわち、成分（２）は、Ｄ−Ｔ−Ｐｗの組み合わせを含むこととなる。
特に目的とする免疫原性組成物は、（ｉ）混合物またはハイブリッドとしての上記で論じられる少なくとも２つのＲｒｇＢクレイド、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、全細胞百日咳抗原、Ｂ型Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ莢膜糖類の結合体およびＨＢｓＡｇの組み合わせ、（ｉｉ）混合物またはハイブリッドとしての上記で論じられる少なくとも２つのＲｒｇＢクレイド、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、無細胞性百日咳抗原（複数可）、Ｂ型Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ莢膜糖類の結合体およびＨＢｓＡｇの組み合わせ、（ｉｉｉ）混合物またはハイブリッドとしての上記で論じられる少なくとも２つのＲｒｇＢクレイド、ならびに髄膜炎菌血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹのうちの１つまたは複数に由来する結合体（複数可）の組み合わせ、（ｉｖ）混合物またはハイブリッドとしての上記で論じられる少なくとも２つのＲｒｇＢクレイドならびに髄膜炎菌血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹのすべてに由来する結合体の組み合わせ、（ｖ）混合物またはハイブリッドとしての上記で論じられる少なくとも２つのＲｒｇＢクレイドおよび外膜小胞抗原などの髄膜炎菌血清群Ｂ抗原の組み合わせ、および／または参考文献２２２に開示される組み合わせを含む。
（抗体）
肺炎球菌抗原に対する抗体を、受動的免疫化に使用してもよい［２２３］。したがって、本発明は、（ａ）上記で定義される第１のアミノ酸配列を認識する抗体、（ｂ）上記で定義される第２のアミノ酸配列を認識する抗体、および／または（ｃ）上記で定義される第３のアミノ酸配列を認識する抗体のうちの少なくとも２つを含む、同時投与、別個の投与または逐次投与のための抗体の組み合わせを提供する。
本発明はまた、治療におけるこのような抗体の組み合わせの使用も提供する。本発明はまた、医薬の製造におけるこのような抗体の組み合わせの使用を提供する。本発明はまた、哺乳動物に、このような組み合わせの有効量を投与するステップを含む、哺乳動物を処置するための方法を提供する。免疫原性組成物について上に記載されるように、これらの方法および使用によって、哺乳動物が、肺炎球菌感染から保護されることが可能となる。
用語「抗体」は、無傷の免疫グロブリン分子ならびに抗原と結合できるその断片を含む。これらの分子として、ハイブリッド（キメラ）抗体分子［２２４、２２５］、Ｆ（ａｂ’）２およびＦ（ａｂ）断片およびＦｖ分子、非共有結合へテロ二量体［２２６、２２７］、一本鎖Ｆｖ分子（ｓＦｖ）［２２８］、二量体および三量体の抗体断片構築物、ミニボディー［２２９、２３０］、ヒト化抗体分子［２３１〜２３３］、およびこのような分子から得られた任意の機能的断片ならびにファージディスプレイなどの非従来的プロセスによって得られる抗体が挙げられる。抗体はモノクローナル抗体であることが好ましい。モノクローナル抗体を得る方法は、当技術分野で周知である。ヒト化または完全ヒト抗体が好ましい。
（一般）
本発明の実施は、特に断りのない限り、当技術分野の技術の範囲内の、化学、生化学、分子生物学、免疫学および薬理学の従来法を使用する。このような技術は、文献において十分に説明されている。例えば、参考文献２３４〜２４１などを参照のこと。
上記の「ＧＩ」番号付けが使用される。ＧＩ番号または「ＧｅｎＩｎｆｏ識別子」は、配列がそのデータベースに加えられたときに、ＮＣＢＩによって処理された各配列記録に連続して割り当てられた一連の数字である。ＧＩ番号は、配列記録のアクセッション番号とは類似性を有していない。配列が更新されると（例えば、訂正のために、またはより多くの注釈もしくは情報を加えるために）、新しいＧＩ番号を受け取る。したがって、所与のＧＩ番号と関連している配列は決して変化しない。
本発明が、「エピトープ」に関する場合は、このエピトープは、Ｂ細胞エピトープおよび／またはＴ細胞エピトープであり得る。このようなエピトープは、経験的に同定することができ（例えば、ＰＥＰＳＣＡＮ［２４２、２４３］または同様の方法を使用して）、または、それらは、予測され得る（例えば、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ抗原指数［２４４］、マトリックスベースのアプローチ［２４５］、ＭＡＰＩＴＯＰＥ［２４６］、ＴＥＰＩＴＯＰＥ［２４７、２４８］、ニューラルネットワーク［２４９］、ＯｐｔｉＭｅｒ＆ＥｐｉＭｅｒ［２５０、２５１］、ＡＤＥＰＴ［２５２］、Ｔｓｉｔｅｓ［２５３］、親水性［２５４］、抗原指数［２５５］または参考文献２５６〜２６０に開示される方法などを使用して）。エピトープは、抗体の抗原結合部位またはＴ細胞受容体によって認識され、それらと結合する抗原の部分であり、それらは、「抗原決定基」と呼ばれることもある。
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含有する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」ならびに「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含し、例えば、Ｘを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」組成物は、全くＸのみからなる場合も、追加の何か、例えば、Ｘ＋Ｙを含有する場合もある。
語句「実質的に」は、「完全に」を排除しない。例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まない場合もある。必要に応じて、語句「実質的に」は、本発明の定義から省かれ得る。
数値ｘに関連して、用語「約」とは、任意選択であり、例えば、ｘ±１０％を意味する。
特に断りのない限り、２つ以上の成分を混合するステップを含むプロセスは、特定の順序の混合を全く必要としない。したがって、成分は、任意の順序で混合してよい。３つの成分がある場合は、２つの成分を互いに混合してよく、次いで、その組み合わせを、第３の成分などと組み合わせてもよい。
抗体は、通常、その標的に対して特異的となる。したがって、それらは、標的に対して、ウシ血清アルブミンなどの無関係の対照タンパク質に対してよりも、高い親和性を有する。
２つのアミノ酸配列間の配列同一性百分率に対する言及は、アラインメントされた場合に、その百分率のアミノ酸が、比較している２つの配列において同一であることを意味する。このアラインメントおよび相同性または配列同一性パーセントは、当技術分野で公知のソフトウェアプログラム、例えば、参考文献２６１の７．７．１８節に記載されるものを使用して決定できる。好ましいアラインメントは、１２のギャップオープンペナルティーおよび２のギャップ伸長ペナルティー、６２のＢＬＯＳＵＭマトリックスを用いるアフィンギャップ検索を使用するＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムによって決定される。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムは、参考文献２６２に開示されている。
（発明を実施するための様式）
（ＲｒｇＢキメラの構築）
肺炎球菌では、２つの異なる線毛が同定されている［２］：ＰＩ−１およびＰＩ−２。ノックアウト研究によって、ＰＩ−２の喪失は、ほとんど影響がなかったが、ＰＩ−１の喪失は、株のコロニー形成能力を低下させ、ひいては、低度の菌血症および低い肺洗浄力価につながったことが示された。したがって、ＰＩ−１を遮断することは、ＰＩ−２を遮断することよりも良好な、肺炎球菌疾患からの保護の見通しを有する。
ＰＩ−１ ＲｒｇＢタンパク質は、３つの異なるクレイドを有する。４５個の異なる株において１５個の異なるＲｒｇＢアミノ酸配列が見られ、図９は、それらの関係性を示す。野生型配列は、各クレイド内で≧９８％保存されている。ＲｒｇＢタンパク質は、相同株（クレイド内）に対しては保護するが、異なるクレイドに由来するＲｒｇＢを有する株（クレイド間）に対しては保護できない免疫応答を誘発することがわかった。したがって、複数のＲｒｇＢクレイドを単一組成物中に組み合わせ、それによって株適用範囲のスペクトルを増大させることを決定した。
配列番号１、２および３は、株ＴＩＧＲ４、Ｆｉｎｌａｎｄ６Ｂ−１２およびＴａｉｗａｎ２３Ｆ−１５に由来するＲｒｇＢの全長によってコードされる配列である。これら３つのタンパク質のキメラを構築するために、そのＮ末端およびＣ末端を末端切断して、配列番号４、５および６を得た。この手順では、制限酵素ＮｈｅＩ、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩを使用した。これらの断片を結合してキメラを作製するために、Ｇｌｙ−ＳｅｒまたはＬｅｕ−Ｇｌｙジペプチドのいずれかと、それに続く配列番号７からなるリンカーの配列番号８および１０を使用した。これらのリンカーは、断片の連結にとって好都合な制限部位を提供する。キメラのＮ末端は、Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｓｅｒとして提供され、Ｃ末端は、Ｌｅｕ−Ｇｌｙジペプチドと、それに続く、精製を容易にするためのヘキサＨｉｓタグ（配列番号９）であった。
６つのキメラを構築し、以後は、以下のように呼んだ。
ＲｒｇＢ Ｉ−ＩＩ−ＩＩＩ＝配列番号１１
ＲｒｇＢ Ｉ−ＩＩＩ−ＩＩ＝配列番号１３
ＲｒｇＢ ＩＩＩ−ＩＩ−Ｉ＝配列番号１５
ＲｒｇＢ ＩＩＩ−Ｉ−ＩＩ＝配列番号１７
ＲｒｇＢ ＩＩ−ＩＩＩ−Ｉ＝配列番号１９
ＲｒｇＢ ＩＩ−Ｉ−ＩＩＩ＝配列番号２１
Ｉ−ＩＩＩ−ＩＩキメラ（配列番号１３）を除いて、発現されたキメラは、２０５ｋＤａの分子量を有しており、大腸菌において可溶性形態で発現され得、可溶性タンパク質から精製された。例えば、図３は、９０％の純度を有する１．６ｍｇ／ｍｌでのＩ−ＩＩ−ＩＩＩキメラのゲルを示す。
（有効性試験）
キメラの有効性を調べるために、肺炎球菌疾患の種々のモデル系を使用した。
腹腔内感染のマウスモデルでは、抗原を腹腔内に投与し、チャレンジは、腹腔内とした。６週齢の、特定の病原体を含まない雌性のＢＡＬＢ／ｃまたはＣＤ１マウスを、０、１４および２８日目に腹腔内で免疫化した。免疫化は、水酸化アルミニウムまたはフロイントのアジュバントとともに、単一の組換えタンパク質（２０μｇ／マウス）を使用して、またはそれらの組み合わせを用いて（各々１０μｇ／マウス）行った。対照には、同一過程で生理食塩水およびアジュバントを与えた。次いで、マウスを、致死用量のＴＩＧＲ４（通常のチャレンジ用量 約１×１０２ＣＦＵ／マウス）、Ｆｉｎｌａｎｄ６Ｂ−１２（約２．×１０４ＣＦＵ／マウス）または３５Ｂ−ＳＭＥ１５（約１×１０４ＣＦＵ／マウス）を用いて腹腔内でチャレンジした。これら３つの株は、それぞれ、ＲｒｇＢクレイドＩ、ＩＩまたはＩＩＩを発現し、ＴＩＧＲ４株は極めて毒性である。免疫化の有効性は、菌血症（感染の５および／または２４時間後に）および死亡率（細菌のチャレンジ後、少なくとも１０日間モニタリングされる）に対するワクチン接種の効果を評価することによって試験する。
静脈内感染のモデルでは、抗原を腹腔内に投与し、チャレンジは、静脈内とした。５週齢のＣＤ１またはＢＡＬＢ／ｃマウスを、０、１４および２８日目に腹腔内で免疫化した。免疫化は、フロイントのアジュバントとともに、組換えタンパク質を個別に使用して（２０μｇ／マウス）またはそれらの組み合わせを用いて（各々１０μｇ／マウス）行った。対照には、同一過程で生理食塩水およびアジュバントを与えた。次いで、マウスを、致死用量のＴＩＧＲ４（通常のチャレンジ用量 約５×１０６ＣＦＵ／マウス）、Ｆｉｎｌａｎｄ６Ｂ−１２（約２×１０７ＣＦＵ／マウス）または３５Ｂ−ＳＭＥ１５（約５×１０７ＣＦＵ／マウス）を用いて静脈内でチャレンジした。ワクチン候補物の有効性は、菌血症（感染の４８時間後）および死亡率（感染株に応じて、細菌のチャレンジ後１０日間またはそれ以上モニタリングされる）に対するワクチン接種の効果を評価することによって試験する。
例えば、ＣＤ１マウスを、キメラを用いて免疫化し、次いで、ＴＩＧＲ４を用いてチャレンジした。図１は、チャレンジ後の菌血症を示す。幾何平均ＣＦＵは、対照群に対するＵ検定比較とともに以下のとおりであった。
Figure 0006008741
 図２は、チャレンジ後の死亡率を示す。日数での生存期間中央値は以下のとおりであった。
Figure 0006008741
 図３０〜３３は、２０μｇのＩＩＩ−ＩＩ−Ｉキメラを用いて腹腔内で免疫化されたマウスの菌血症および死亡率アッセイの結果を示す。図３０は、ＴＩＧＲ４を用いるｉ．ｖ．チャレンジのデータを示し、図３１は、ＴＩＧＲ４を用いるｉ．ｐ．チャレンジのデータを示し、図３２は、３５Ｂ−ＳＭＥ１５を用いるｉ．ｖ．チャレンジのデータを示し、図３３は、６Ｂ Ｆｉｎｌａｎｄ １２を用いるｉ．ｖ．チャレンジのデータを示す。
以下の表は、それぞれ、クレイドＩ、ＩＩまたはＩＩＩのＲｒｇＢを発現する３つの異なる株を用いるチャレンジの、２つの異なるモデルにおいて得られた結果を要約するものである。
Figure 0006008741
 したがって、異なるクレイドのＲｒｇＢの組み合わせによって、単一のＲｒｇＢ抗原よりも、肺炎球菌株に対する広い適用範囲が可能となる。
さらなる試験では、ＲｒｇＢキメラにアラムを用いてアジュバント添加し、ＴＩＧＲ４腹腔内チャレンジに対する保護について試験した。キメラＩ−ＩＩ−ＩＩＩおよびＩＩＩ−ＩＩ−Ｉは、菌血症に対して高度に保護的であり、ＩＩＩ−ＩＩ−Ｉキメラはまた、生存の点で保護的であった（図７）。
さらなる試験では、４つの異なるキメラ（Ｉ−ＩＩ−ＩＩＩ、ＩＩＩ−ＩＩ−Ｉ、ＩＩ−ＩＩＩ−Ｉ、ＩＩ−Ｉ−ＩＩＩ）のうちの１つを用いた腹腔内免疫化後の鼻腔内チャレンジを使用した。すべてのキメラが、鼻腔内ＴＩＧＲ４チャレンジ後の菌血症を低減することへの有効性または傾向を示した。ＩＩ−ＩＩＩ−Ｉキメラは、Ｔ４チャレンジの際に、菌血症の良好な低減および生存増大の有意ではない傾向を与えた。ＰｓａＡ対照は、菌血症または死亡率のいずれかによって評価される有効性をほとんど示さなかったが、ＩＩ−ＩＩＩ−Ｉキメラは、菌血症を低減させ、生存を増大させた。図１３は、２０μｇのキメラを用いて腹腔内で免疫化され（０−１４−２８日目）、ＴＩＧＲ４を用いて鼻腔内でチャレンジされたＢａｌＢ／ｃマウスにおける、２４時間菌血症アッセイにおける（図１３Ａ）および死亡率アッセイ（図１３Ｂ）におけるＲｒｇＢ ＩＩＩ−ＩＩ−Ｉキメラの結果を示す。
全５個のＲｒｇＢキメラに対する抗体はまた、ＯＰＫＡにおける肺炎球菌のインビトロ死滅を媒介するとわかった。例えば、図８は、ＴＩＧＲ４株に対する結果を示す。図１０は、ＯＰＫＡアッセイ（０、２１および３５日目に１００μｇの各キメラを用いて皮下に免疫化されたウサギ）における、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ血清型６Ｂに対する結果を示し、これは、死滅百分率の相違が、５つのキメラ間で観察されないこと、およびキメラは、結合体ワクチンＰＣＶ７に匹敵する死滅を示すことを示す。図１１は、死滅が特異的で、抗体濃度に依存することを示し、これは、希釈を１／１３１２２０まで増大させることによって、死滅百分率が、正の対照と同様に、試験されたキメラ曲線において低下するということを示す。
図１２は、ＩＩＩ−ＩＩ−Ｉキメラ（ｉ．ｐ．免疫化され、３５Ｂ−ＳＭＥ１５を用いてｉ．ｐ．チャレンジされた）を使用する、４８時間菌血症（図１２Ａ）および死亡率（図１２Ｂ）アッセイは、異なるキメラ用量（２μｇおよび２０μｇ）を使用する場合に同程度であることを示す。
図１４は、ＲｒｇＢ ＩＩＩ−ＩＩ−Ｉキメラが、ＭＦ５９アジュバントを使用して、２０μｇのキメラを用いて腹腔内で免疫化され（０−１４−２８日）、鼻腔内で（ｉｎｔｒａｎｓａｌｌｙ）チャレンジされたＢａｌＢ／ｃマウスにおいて保護的であることを示す。
図１５は、ＲｒｇＢ ＩＩＩ−ＩＩ−Ｉキメラが、皮下で免疫化され、ＴＩＧＲ４を用いて腹腔内でチャレンジされたＢａｌＢ／ｃマウス（１３０ＣＦＵ／マウス）において、皮下免疫化の際に保護的であることを示す。図１５Ａは、２４時間菌血症アッセイを示し、図１５Ｂは、死亡率アッセイを示す。
図１６は、２４時間菌血症アッセイにおいて、正常ウサギ血清（ＮＲＳ）対照と比較して、ＲｒｇＢ ＩＩＩ−ＩＩ−Ｉキメラが、受動的防御研究において機能的抗体の産生を誘発することを示す。
図１７は、抗体が、３つのクレイドの株に対するＯＰＡにおいて機能的であることを示し、図１８は、ＯＰＡ活性が、具体的には、ＲｒｇＢ ＩＩＩ−ＩＩ−Ｉキメラに対する抗体によるものであることを示す。
図１９は、単一（ｓｉｂｌｅ）ＲｒｇＢドメインが、インビボで保護を付与することを示す。具体的には、データは、ＲｒｇＢ Ｄ１ドメインまたはＲｒｇＢ Ｄ４ドメインを用いて免疫化した（ｉ．ｐ．免疫化２０μｇ、０−１４−２８日；ＴＩＧＲ４ １００ＣＦＵを用いるｉ．ｐ．チャレンジ）ＢａｌＢ／ｃマウスの生存％を示す。
図２３は、種々の組み合わせのさらなるポリペプチド抗原と組み合わせた場合の（アラムを含む２０μｇ抗原；ｉ．ｐ．免疫化され、６Ｂ−Ｆｉｎｌａｎｄ １．２Ｅ＋０８ ＣＦＵ／マウスを用いてｉ．ｖ．チャレンジされた）、ＩＩＩ−ＩＩ−Ｉキメラを使用する４８時間菌血症（図２３Ａ）および死亡率（図２３Ｂ）アッセイを示す。（Ａ）および（Ｂ）の両方において、列１は、ｓｐｒ００５７、ｓｐｒ００９６およびｓｐｒ２０２１の組み合わせを示し、列２は、ＳＰ２２１６−１、ＳＰ１７３２−３およびＰｓａＡの組み合わせを示し、列３は、ＲｒｇＢ ＩＩＩ−ＩＩ−Ｉキメラを示し、列４は、ｓｐｒ００５７、ｓｐｒ００９６およびｓｐｒ２０２１と組み合わせたＲｒｇＢ ＩＩＩ−ＩＩ−Ｉキメラを示し、列５は、ＳＰ２２１６−１、ＳＰ１７３２−３およびＰｓａＡと組み合わせたＲｒｇＢ ＩＩＩ−ＩＩ−Ｉキメラを示し、列６は、アラム対照を示す。これらのデータは、ＳＰ２２１６−１、ＳＰ１７３２−３およびＰｓａＡの組み合わせの有効性が、ＲｒｇＢキメラと組み合わされた場合に有意に増大することを示す。
図２４は、種々の組み合わせのさらなるポリペプチド抗原と組み合わせた場合の、ＩＩＩ−ＩＩ−Ｉキメラを使用する、４８時間菌血症（図２４Ａ）および死亡率（図２４Ｂ）アッセイを示す。（アラムを含む２０μｇ抗原；ｉ．ｐ．免疫化され、３５Ｂ−ＳＭＥ１５ ５．２Ｅ＋０７ ＣＦＵ／マウスを用いてｉ．ｖ．チャレンジされた）。（Ａ）および（Ｂ）の両方において、列１は、ｓｐｒ００５７、ｓｐｒ００９６およびｓｐｒ２０２１の組み合わせを示し、列２は、ＳＰ２２１６−１、ＳＰ１７３２−３およびＰｓａＡの組み合わせを示し、列３は、ＲｒｇＢ ＩＩＩ−ＩＩ−Ｉキメラを示し、列４は、ｓｐｒ００５７、ｓｐｒ００９６およびｓｐｒ２０２１と組み合わされたＲｒｇＢ ＩＩＩ−ＩＩ−Ｉキメラを示し、列５は、ＳＰ２２１６−１、ＳＰ１７３２−３およびＰｓａＡと組み合わされたＲｒｇＢ ＩＩＩ−ＩＩ−Ｉキメラを示し、列６は、アラム対照を示す。これらのデータは、ＲｒｇＢ ＩＩＩ−ＩＩ−ＩキメラおよびＲｒｇＢ ＩＩＩ−ＩＩ−Ｉキメラのその他の抗原との組み合わせはすべて保護的であることを示す。
図２５は、タグのないＩＩＩ−ＩＩ−Ｉキメラおよびアラム対照と比較した、ポリヒスチジンタグを含有するＩＩＩ−ＩＩ−Ｉキメラを使用するＢＡＬＢ／ｃマウスにおける、（Ａ）２４時間菌血症アッセイおよび（Ｂ）死亡率データ（ｉ．ｐ．免疫化、ＴＩＧＲ４ ２．１Ｅ＋０２ ＣＦＵ／マウスを用いるｉ．ｐ．チャレンジ）を示す。これらのデータは、ｈｉｓタグをつけた、およびタグのないキメラの両方とも、菌血症および生存率両方の点でＴＩＧＲ４に対して有意に保護することを示し、タグのないキメラは、最も有意な保護を示す。図２６は、同様のデータ、すなわち、タグのないＩＩＩ−ＩＩ−Ｉキメラおよびアラム対照と比較した、さらにｓｐｒ００５７、ｓｐｒ００９６およびｓｐｒ２０２１抗原の組み合わせ、ｓｐｒ００５７、ｓｐｒ００９６およびｓｐｒ２０２１抗原のタグのないＩＩＩ−ＩＩ−Ｉキメラとの組み合わせと比較した、ポリヒスチジンタグを含有するＩＩＩ−ＩＩ−Ｉキメラを使用する、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける２４時間菌血症アッセイ（ｉ．ｐ．免疫化、ＴＩＧＲ４ １．６Ｅ＋０２ ＣＦＵ／マウスを用いるｉ．ｐ．チャレンジ）を示す。図２７および２８は、３５Ｂ−ＳＭＥ１５（図２７）および６ＢＦｉｎｌａｎｄ１２（図２８）を用いるｉ．ｖ．チャレンジのデータを示し、タグのないＩＩＩ−ＩＩ−Ｉキメラが、３５Ｂ−ＳＭＥ１５および６ＢＦｉｎｌａｎｄ１２ｉ．ｖ．チャレンジに対して、ｈｉｓタグをつけたＩＩＩ−ＩＩ−Ｉキメラと同様の保護有効性を示したことを示す。同様に、図２９は、タグのない、およびｈｉｓタグをつけたＩＩＩ−ＩＩ−Ｉキメラの両方が、ｉ．ｖ．ＴＩＧＲ４チャレンジに対して保護的であることを示す。
図３４は、線毛を過剰発現するＴＩＧＲ４チャレンジ株を、極めて少量の線毛のみを発現するチャレンジ株と比較する、ＩＩＩ−ＩＩ−Ｉキメラの４８時間菌血症および死亡率アッセイの結果を示す。これらのデータは、線毛が過剰発現される場合も、線毛が極めて低レベルでのみ存在する場合も保護が極めて良好であることを示す。図３５は、線毛を過剰発現する６ＢＦｉｎｌ１２チャレンジ株（図３５Ａ）を、線毛を低発現する６ＢＦｉｎｌ１２チャレンジ株（図３５Ｂ）と比較する、ＩＩＩ−ＩＩ−ＩおよびＩＩ−Ｉ−ＩＩＩキメラ両方についての同様の菌血症データを示す。キメラは、線毛を過剰発現する株および低発現する株の両方に対して有意な保護を示す。
（抗菌剤耐性）
図３６は、線毛−１が、抗生物質に対して感受性である株と比較して、抗生物質に対して耐性である（エリスロマイシン耐性、ペニシリン耐性および多剤耐性）肺炎球菌株においてより一般に存在するということを示す。線毛−１の存在と抗生物質耐性との間には有意な関連がある。抗生物質耐性株における線毛−１の存在の増大はまた、多剤耐性ＰＭＥＮ株収集物において観察された（データは示していない）。これらのデータは、複数のＲｒｇＢクレイドを含む免疫原性組成物を使用する線毛−１に対する免疫化が、抗生物質処置に対して耐性である肺炎球菌、例えば、エリスロマイシン耐性株、ペニシリン耐性株および多剤耐性株に対する保護というさらなる利点を有することを示唆する。
（モノクローナル抗体）
モノクローナル抗体は、ＴＩＧＲ４由来のＲｒｇＢに対して生じさせた。４つのｍＡｂを、より詳細に研究した（２３Ｂ８／Ｂ６、２３Ｆ８／１０、２３Ｅ１／Ａ９および３０Ａ８／Ａ８と名づけられた）。２３Ｂ８／Ｂ６および２３Ｆ８／１０は、ＴＩＧＲ４由来の全長ＲｒｇＢと、Ｄ１ドメイン断片と、また、Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３断片と結合したが、Ｄ４断片とは結合しなかった。逆に、２３Ｅ１／Ａ９は、全長タンパク質、またＤ４ドメイン断片（すなわちＤ４断片）と結合したが、Ｄ１−Ｄ２−Ｄ３断片とは結合しなかった。３０Ａ８／Ａ８は、全長ＲｒｇＢタンパク質と結合したが、ドメイン断片のいずれとも結合しなかった。ｍＡｂは、Ｆｉｎｌａｎｄ６Ｂ−１２または２３Ｆ株由来のＲｒｇＢタンパク質と結合しなかったが、それらは発現させられた５つのキメラすべてと結合した。結合結果は、図５に示され、ＲｒｇＢが、ハイブリッド形態中にエピトープを保持することが確認される。
図４Ａに示されるように、４つの試験された抗ＴＩＧＲ４ ｍＡｂの各々が、受動的防御試験において菌血症を低減でき、最良の結果は、２３Ｆ８／１０によってもたらされた。４つの試験された抗ＴＩＧＲ４ ｍＡｂの各々はまた、死亡率アッセイにおいて有意な（２３Ｂ８／Ｂ６、Ｐ＝０．０２１を除くすべてのＭＡｂについてｐ＜０．０１）生存率の増大を保証した（図４Ｂ）。
４つの保護的ＭＡｂの各々によって認識されるエピトープを決定するために、異なるＲｒｇＢドメインを、Ｈｉｓタグのついたポリペプチドとして大腸菌において発現され、そしてＨｉｓトラップ高性能カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でアフィニティークロマトグラフィーによって可溶性形態で首尾よく精製される単一ドメイン（Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４）として、または複数ドメイン断片（Ｄ１−３、Ｄ２−４、Ｄ３−４）としてクローニングした。次いで、陽性対照および陰性対照としてそれぞれ、ＦＬ ＲｒｇＢクレイドＩおよびＢＳＡを使用することによって、組換えタンパク質を、ＭＡｂに対してウエスタンブロット分析において調べた。
図２０に示されるように、結果は、モノクローナル抗体が、組換えタンパク質に対して様々な特異的反応性を有することを示した。ｍＡｂ ２３ Ｆ８／１０およびｍＡｂ ２３ Ｂ８／Ｂ６の両方とも、Ｎ末端ドメインＤ１を特異的に認識でき、ｍＡｂ ２３ Ｅ１／Ａ９は、Ｃ末端Ｄ４を認識したのに対し、３０Ａ８／Ａ８はＤ２−４のみを検出でき、これは、Ｄ２とＤ４との間のコンホメーションエピトープの認識を示唆する。次いで、これらのデータをＥＬＩＳＡによって続いて確認した（データは示していない）。
モノクローナル抗体をまた、Ｆｉｎｌａｎｄ６Ｂ−１２由来のＲｒｇＢに対して生じさせた。２つの特定のｍＡｂ（２Ａ５／２９、３Ａ５／１９）は、Ｆｉｎｌａｎｄ６Ｂ−１２由来の全長ＲｒｇＢと結合したが、ＴＩＧＲ４または２３Ｆ株由来のＲｒｇＢタンパク質とは結合しなかった。ｍＡｂはまた、発現させられた５つのキメラすべてと結合した。結合結果は、図６に示されている。
（保護的ｍＡｂ ２３Ｆ８／１０のエピトープマッピング）
ｍＡｂ ２３ Ｆ８／１０によって認識される保護的エピトープを含有するＤ１ドメイン上の領域をマッピングするために、組換えタンパク質の質量分析、ウエスタンブロット検出および限定されたタンパク質分解を組み合わせて使用した。このアプローチは、４つの主要なステップ：（ｉ）タンパク質の酵素的または化学的部分切断、（ｉｉ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるその分離後のＭＳ分析による、生じた断片の配列カバー範囲（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｖｅｒａｇｅ）の定義、（ｉｉｉ）生じた断片のウエスタンブロット分析、（ｉｖ）エピトープの位置を決定するためのウエスタンブロットにおける正と負のバンドの比較にまとめることができる。
第１のステップは、全長ＲｒｇＢから、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの分離後に十分に分離したパターンを示す相当数のポリペプチドを得るためのものであった。この実験のために選択されたプロテアーゼは、タンパク質を、アルギニン（Ｒ）およびリシン（Ｋ）残基のＣ末端側で切断するトリプシンであった。２０μｇの全長ＲｒｇＢを消化し、消化生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分離した（５μｇの全長タンパク質および１２μｇの消化生成物）。上で記載されたように、また図２０に示されるように、モノクローナル抗体２３Ｆ８／１０は、全長組換えＲｒｇＢおよびＲｒｇＢ Ｄ１の両方、ならびに全長タンパク質のトリプシンでの切断に由来する非常に多数のポリペプチドを認識した。ウエスタンブロット分析では、正および負のバンド両方の同定（同一クマシー染色サンプルに関して）が、エピトープ同定のために重要であった。モノクローナル抗体２３Ｆ８／Ｃ１０を用いるウエスタンブロットが、図２１として示されている。ウエスタンブロット（ＭＡｂ ２３Ｆ８／Ｃ１０を用いてイムノブロットされた）の正（緑色矢印）および負（赤色矢印）のバンドの両方を含む約２０のクマシー染色されたタンパク質分解（ｐｒｏｔｅｏｌｉｔｉｃ）断片をゲルから切り出し、トリプシンＯ／Ｎでインサイチューで消化し、それらの各々の配列カバー範囲を定義するためにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ質量分析によって分析した。分析された断片各々について得られた配列カバー範囲は、ＰＭＦスペクトル（ペプチドマスフィンガープリント）において同定された、最も「Ｎ末端」のトリプシン処理ペプチドと最も「Ｃ末端」のトリプシン処理ペプチドとの間で定義した。ウエスタンブロットの結果と関連した、全長ＲｒｇＢに由来するトリプシン生成物の電気泳動パターンの模式的配列カバー範囲を作製した。この分析によって、２３Ｆ８／１０エピトープは、全長ＲｒｇＢのアミノ酸３２とアミノ酸１４１との間であることが示唆された。
次いで、同じ戦略をＮ末端ドメインＤ１に対して使用して、ＭＡｂ ２３Ｆ８／Ｃ１０によって認識されるエピトープを含有する領域を狭めた。２０μｇのＤ１を消化し、消化生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した（５μｇの全長タンパク質および１２μｇの消化生成物）。全長の消化されたＲｒｇＢとは異なり、この実験では、モノクローナル抗体２３Ｆ８／１０は、全長Ｄ１およびトリプシンＤ１消化に由来するポリペプチドの一部のみを認識した。その後、正および負両方のバンドを、さらなる分析のために考慮した。正および負両方のバンドを含む、約１０のクマシー染色されたペプチド断片をゲルから切り出し、トリプシンＯ／Ｎでインサイチューで消化し、それらの各々の配列カバー範囲を定義するためにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ質量分析によって分析した。分析された断片各々について得られた配列カバー範囲は、ＰＭＦスペクトル（ペプチドマスフィンガープリント）において同定された、最も「Ｎ末端」のトリプシン処理ペプチドと最も「Ｃ末端」のトリプシン処理ペプチドとの間で定義した。ウエスタンブロットの結果と関連してこれまでに確立されたように、ＲｒｇＢ Ｄ１ドメインに由来するトリプシン生成物の電気泳動バンドの配列カバー範囲によって、保護的エピトープを含有するＭＡｂ ２３Ｆ８／１０によって認識される領域は、ＲｒｇＢのアミノ酸残基５５〜アミノ酸残基８９であることが示唆された。Ｄ１アミノ酸配列（それに関する構造的データはまだ入手可能ではない）を、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ線毛骨格Ｓｐｙ０１２８のドメイン１結晶構造に対してモデル化した（全体の相同性約２７％）。データがエピトープであると示唆する残基（アミノ酸５５〜８９）を、モデル上にマッピングした（図２２Ａ）。ＲｒｇＢ Ｄ１−４構造の剛体フィッティング（ｒｉｇｉｄ ｂｏｄｙ ｆｉｔｔｉｎｇ）を実施して得た線毛の電子密度マップの３Ｄ再構築では、このエピトープは表面に露出されていると示される（図２２Ｂ＆２２Ｃ）。
（キャリアタンパク質としてのＲｒｇＢキメラ）
ＲｒｇＢキメラは、ワクチン成分として作用するほかに、糖類キャリア結合体中でキャリアタンパク質として使用するのに適している。Ｉ−ＩＩ−ＩＩＩおよびＩＩＩ−ＩＩ−Ｉキメラを糖類免疫原に結合体化させ、次いで、糖類に対するＩｇＧ反応（ＧＭＴ）をＥＬＩＳＡによって測定した。結果を、いくつかのその他の肺炎球菌タンパク質ならびに陽性対照としてＮ１９およびＣＲＭ１９７とも比較した。研究ＶＩ／ＶＩＩから得られた結果は以下のとおりであった。
Figure 0006008741
 本発明は、単に例として記載されたのであって、本発明の範囲および精神内に留まりながら改変を行ってもよいことは理解されるであろう。
Figure 0006008741
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Claims (6)

  1. （ａ）配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１のアミノ酸配列を含む、第１のポリペプチド、
    （ｂ）配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２のアミノ酸配列を含む、第２のポリペプチド、ならびに／または
    （ｃ）配列番号３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第３のアミノ酸配列を含む、第３のポリペプチド
    のうちの少なくとも２つを含む、免疫原性組成物。
  2. （ａ）配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、第１のアミノ酸配列、
    （ｂ）配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、第２のアミノ酸配列、ならびに／または
    （ｃ）配列番号３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、第３のアミノ酸配列
    のうちの少なくとも２つを含む、ポリペプチド。
  3. 請求項１に記載される第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、および／または、第３のポリペプチドのうちの少なくとも２つを含むポリペプチドであって、アミノ酸配列：
    Ａ−｛−Ｘ−Ｌ−｝ｎ−Ｂ
    （式中、各Ｘは、請求項１で定義される、第１のポリペプチド、第２のポリペプチドまたは第３のポリペプチドのアミノ酸配列であり、Ｌは、任意選択のリンカーアミノ酸配列であり、Ａは、任意選択のＮ末端アミノ酸配列であり、Ｂは、任意選択のＣ末端アミノ酸配列であり、ｎは、２以上の整数である）
    を含む、ポリペプチド。
  4. 配列番号１１、１３、１５、１７、１９および２１からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２または請求項３に記載のポリペプチド。
  5. （ａ）配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１のアミノ酸配列を含む、第１のポリペプチド、
    （ｂ）配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２のアミノ酸配列を含む、第２のポリペプチド、ならびに／または
    （ｃ）配列番号３に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第３のアミノ酸配列を含む、第３のポリペプチド
    のうちの少なくとも２つを発現する、細菌。
  6. 哺乳動物において免疫応答を惹起するための、請求項１に記載の免疫原性組成物、または、請求項２〜４のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む組成物。
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