CN108840914B - 一种具有免疫原性的多肽、其抗体的制备方法以及用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种具有免疫原性的多肽及其制备方法，以及能够表达所述多肽的基因工程载体和基因工程细胞。本发明还公开了针对该多肽的特异性抗体的制备方法，所述抗体能够用于检测无乳链球菌，且具有较高的灵敏性和特异性。

Description

一种具有免疫原性的多肽、其抗体的制备方法以及用途
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体地涉及一种具有免疫原性的多肽，还涉及该免疫原性多肽的抗体的制备方法和用途，更具体地，涉及所述抗体在制备用于检测无乳链球菌的试剂盒中的用途。
背景技术
无乳链球菌(Streptococcus agalactea)属于B群链球菌，是重要的乳源性人畜共患的致病菌。在动物主要引起奶牛乳腺炎，在内蒙古地区约70％以上牛乳腺炎是由该致病菌引起。无乳链球菌具有多种致病因子，特别是细胞黏附及感染密切相关的菌毛样结构，可以有效的帮助无乳链球菌在宿主细胞上黏附、定植，其菌毛岛屿PI-2a编码的亚基蛋白基因簇中有3个有效保守性抗原组分，分别为菌毛骨架蛋白BP、辅助蛋白AP1和AP2。小鼠实验研究表明，无乳链球菌菌毛岛屿亚结构蛋白具有良好免疫保护性。
前期研究通过生物信息学筛选、确定牛乳腺炎无乳链球菌菌毛岛屿PI-2a辅助蛋白AP1、AP2及BP的主要抗原域，利用基因工程技术串联表达3亚基基因的多表位融合蛋白，并对3个亚基融合表达蛋白进行抗原性研究，为研究牛乳腺炎无乳链球菌致病机制、新型免疫疫苗及检测试剂提供实验依据。但是，串联表达3亚基基因的多表位融合蛋白的纯化水平不高，难以达到进一步研究或应用的需要。
发明内容
为了解决上述技术问题的至少一种，本发明的第一方面提供一种多肽，其包括SEQID NO:8所示的氨基酸序列或由SEQ ID NO:8的氨基酸序列组成。
本发明的第二方面提供一种基因，其包括SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列或由SEQID NO:7所示的核苷酸序列组成。
本发明的第三方面提供一种基因工程载体，其包括本发明第一方面所述的基因。
本发明的第四方面提供一种基因工程细胞，其包括本发明第三方面所述的基因工程载体。
本发明的第五方面提供一种本发明第三方面所述的基因工程载体的制备方法，其包括以下步骤：
(1)获得无乳链球菌核酸样本；
(2)利用SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:6所示引物对步骤(1)获得的样本进行扩增；
(3)步骤(2)扩增产品经回收纯化后连接到线性化的基因工程载体上。
进一步地，包括将所述基因工程载体转化进原核表达细胞中并诱导所述基因工程载体表达的步骤。
更进一步，包括对多肽进行纯化的步骤：
(1)将细胞经超声破碎，离心去除细胞碎片；
(2)在步骤(1)的上清液中加入硫酸铵溶液；
(3)将溶液放在磁力搅拌器上搅拌，使重组蛋白充分沉淀；
(4)离心收集沉淀，利用悬浮液进行悬浮。
在本发明的实施方案中，所述硫酸铵溶液的浓底为10％～60％，例如为10、20、30、40、50、60％，再例如为15、25、35、45、55％，优选地，所述硫酸铵溶液的浓度为20％；所述悬浮液为PBS缓冲液或Tris-Cl缓冲液，任选地，所述Tris-Cl缓冲液的pH值为8.5，任选地，所述PBS缓冲液含有咪唑，优选地，所述PBS缓冲液含有20mmol/L咪唑。
本发明的第六方面提供一种靶向本发明第一方面所述的多肽的抗体的制备方法，其特征在于，包括利用所述多肽免疫家兔的步骤。
本发明的第七方面提供本发明第六方面所述的抗体在制备用于检测无乳链球菌的试剂盒中的用途。
本发明的有益效果
1.利用本发明构建的基因工程载体，表达AP1-AP2-BP重组蛋白的产量高，
不产生包涵体，易于回收。
2.利用本发明的蛋白纯化方法，AP1-AP2-BP重组蛋白回收率高，且具有较好的免疫原性。
3.利用本发明制备抗体的方法得到的抗体，可用于检测无乳链球菌，具有较高的敏感性和特异性。
附图说明
图1显示了表达产物AP1-AP2-BP重组蛋白的SDS-PAGE分析。M：低分子质量蛋白Marker(116～18Ku)；1：IPTG诱导前的AP1-AP2-BP三基因串联重组工程菌；2：IPTG诱导后的AP1-AP2-BP基因串联重组工程菌；3：IPTG诱导后的AP1-AP2-BP三基因串联重组工程菌破碎沉淀；4：IPTG诱导后的AP1-AP2-BP三基因串联重组工程菌破碎上清。
图2显示了抗体滴度的检测。
图3显示了不同浓度硫酸铵对AP1-AP2-BP重组蛋白的粗提的影响。1：IPTG诱导后三基因串联重组工程菌破碎上清；2：IPTG诱导前的AP1-AP2-BP三基因串联重组工程菌破碎上清；3-5：15％、20％、25％硫酸铵粗提AP1-AP2-BP重组蛋白；6：低分子量蛋白Marker；7-11：30％、35％、40％、45％、50％硫酸铵粗提AP1-AP2-BP蛋白。
图4显示了不同悬浮缓冲液对AP1-AP2-BP蛋白的粗提的影响。1：低分子量蛋白Marker；2：pH值为8.5浓度为50mmol/L的Tris-Cl缓冲液的悬浮液；3：20mmol/L PBS缓冲液且含有20mmol/L咪唑的悬浮液；4：20mmol/L PBS缓冲液作为悬浮液。
图5显示了最优条件的AP1-AP2-BP蛋白纯化。M：低分子量蛋白Marker；1：硫酸铵粗提后样品；2：上样；3-4：250mmol/L咪唑洗脱收集；5，硫酸铵粗提前样品。
图6显示了血清中IgG纯化的结果。1：低分子量蛋白Marker。2，3：纯化后IgG。
图7显示了IgG检测的ROC曲线。
具体实施方式
为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。
实施例
以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。
除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。
那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。
实施例1重组蛋白的表达
1材料与方法
1.1载体
将AP1、AP2、BP基因的PCR产物经相应酶处理后，分别与经同样酶切处理的表达载体进行连接，并转化于相应的BL21(DE3)宿主菌感受态细胞。提取质粒DNA，经双酶切鉴定筛选阳性重组质粒，同时将疑似阳性重组子进行测序。
1.2实验动物及主要试剂
10×PCR Buffer、T4连接酶、羊抗鼠IgG-HRP等均购自TaKaRa公司；质粒纯化试剂盒、DNA/PCR产物清洁试剂盒购自维特洁生化技术有限公司。
1.3 AP1、AP2、BP主要抗原域的预测、PCR融合扩增及重组表达载体的构建
根据GenBank中无乳链球菌基因序列(EU930008)，采用DNAStar Protean功能分析AP1、AP2、BP基因抗原表位优势区，设计3对分别扩增3个亚基抗原域序列引物(表1)。
Figure BDA0001763473120000051
*斜体黑子为引入的柔性序列
利用重叠PCR技术，AP1F引物和BPR引物技术获得AP1-AP2-BP串联融合片段，并将该片段连接到pET-30a(+)载体上，得到pET-30a(+)AP1-AP2-BP重组表达载体。
1.4重组蛋白的诱导表达、纯化及活性鉴定
将测序正确的pET-30a(+)AP1-AP2-BP阳性克隆转化至BL21大肠杆菌感受态细胞，经30℃，1mmol/L IPTG诱导8～9h后进行SDS-PAGE分析。将诱导完成的培养液分装、离心，并将获得的沉淀用PBS缓冲液以1:10的比例悬浮，再对其超声破碎20min左右，将破碎完全的菌液4℃离心20min，取上清并用孔径为0.45μm的滤膜过滤。纯化后获得目的蛋白，并检测其浓度。同时以纯化的蛋白为转膜抗原，鼠抗乳链球菌抗血清为一抗，羊抗鼠IgG-HPR为二抗，采用western blot分析融合蛋白免疫反应原性。
1.5 AP1-AP2-BP重组蛋白免疫小鼠试验
将纯化的AP1-AP2-BP重组蛋白加入弗氏佐剂，充分乳化后作为初免和强化免疫的免疫原。选取10只5周龄昆明白小鼠，免疫剂量50μg/只，于首免后14d加强免疫一次，分别于首免0及免后7d、14d、28d和35d采血分离血清，采用ELISA方法检测各组抗体水平，评价AP1-AP2-BP重组蛋白免疫原性。
2结果
2.1 AP1、AP2及BP亚基主要抗原域确定
经软件分析筛选出了AP1基因140～238位氨基酸区域、AP2基因40～175位氨基酸区域、BP基因146～215氨基酸区域为主要抗原基因扩增区域。为确保串联后3个基因的顺利表达，在AP1和AP2之间或AP2和BP之间引入15位柔性氨基酸残基(GRRRKRRRRKRRWRL)。
融合基因的核酸酸序列如下：(SEQ ID NO:7)
Figure BDA0001763473120000061
Figure BDA0001763473120000071
所编码的多肽序列如下：(SEQ ID NO:8)
GTDTNGRTTLNPRSEHPNTLRDFPIPKIRDVREYPTITIKNEKKLGEIEFIKVDKDNNKLLLKGATFELQEFNEDYKLYLPIKNSDSKVVTGENKLGGGGSEAKEIAGAYFAFKNEAGTKYITENGEEVDTLDTTDAKGCAVLKGLTTDNGFKFNTSKLTGTYQIVELKEKSTYNNDGSILADSKAVPVKITLPLVNDNGVVKDAHVYPKNTETKPQVDKNFADKELDYANNKKDKGTVSASVGDVKKYHVGTKILKGSDYKKLIWTDSMTKGLTFNNDIAVTLDGATLDATNYKLVADDQGFRPKGGGGSGGGGSGGGGSRSNADTPNQLTITQIGLQPNTTEEGISYRLWTVTDNLKVDLLSQMTDSELNQKYKSILTSPTDTNGQTKIALPNGSYFGRAYKADQSVSTIVPFYIELPDDKLSNQLQINPKRKVETGRLKLIKYTKEGKIKKRLSGVIFVLYDNQNQPVRFKNGRFTTDQDGITSLVTDDKGEIEVEGLLPGKYIFREAKALTGYRISMKDAVVAVVANKTQEVEVVNEKETPPPTNPKPSQPLKLATALE
第一轮PCR，以AP1F/AP1R为引物扩增得到长度为320bp的AP1片段；以AP2F/AP2R为引物扩增得到长度为759bp的AP2片段；BPF/BPR为引物扩增得到长度为664bp的BP片段。第二轮PCR，以AP1F/AP2R为引物扩增得到长度为1064bp的AP1和AP2融合基因；以AP2F和BPR为引物扩增得到长度为1409bp的AP2和BP的融合基因；以AP1F和BPR为引物扩增得到长度为1689bp的AP1+AP2+BP的融合基因。以上结果表明，成功获得融合基因AP1+AP2+BP。
2.2重组原核表达载体构建与鉴定
将质粒pET-30a(+)和AP1-AP2-BP基因片段双酶切后连接，获得重组质粒pET-30a(+)AP1-AP2-BP，测序结果表明重组载体正确构建。
2.3重组蛋白的诱导表达、纯化及免疫反应性鉴定
将pET-30a(+)AP1-AP2-BP转化至BL21后经IPTG诱导后，对其SDS-PAGE凝胶电泳，对比可以确定，AP1-AP2-BP蛋白的分子量大小约为65Ku，该结果与预测分子质量大小相符，条带清晰(如图1所示)。
2.4 AP1-AP2-BP融合蛋白小鼠免疫结果
对家兔血清中抗体的滴度进行了ELISA测定，测定结果显示，家兔血清在免疫后抗体的水平逐渐上升，且从第三周开始抗体的水平明显提升，在第四周时抗体滴度达1:5600，该结果表明家兔经过免疫所产生的抗体具有很高的滴度水平(如图2所示)。
实施例2重组蛋白纯化条件优化
1材料和方法
1.1硫酸铵溶液和悬浮液
饱和硫酸铵溶液(SAS)：将767g硫酸铵(NH4)2SO4边搅拌边慢慢加到1L蒸馏水中，用氨水或硫酸调到pH 7.0。此即饱和度为100％的硫酸铵溶液(4.1mol/L，25℃)。
pH值为8.5的50mmol/L的Tris-Cl缓冲液,取6.05g Tris溶解于800mL的去离子水，用浓盐酸调pH值到8.5后定容到1000mL。
pH值为7.8的20mm的PBS缓冲液：称取7.6g Na3PO4.12H2O、11.68gNaCL、1.36g咪唑溶解于800mL的去离子水，用浓盐酸调pH值到7.8后定容到1000mL。
1.2重组蛋白纯化步骤
重组质粒诱导表达后，利用下述步骤分离纯化重组蛋白：
(1)将细胞经超声破碎，离心去除细胞碎片；
(2)在步骤(1)的上清液放在磁力搅拌器上搅拌，并逐滴加入饱和硫酸铵溶液；使重组蛋白充分沉淀；
(3)离心收集沉淀，利用含有咪唑的PBS悬浮液进行悬浮；
(4)利用亲和层析的方法对步骤(3)获得的悬浮液进行纯化，蛋白层析柱的填料选用Ni NTA Beads 6FF，恒流泵的流速保持在4.5mL/min，将样品过柱处理。
1.3硫酸铵浓度优化
将步骤(1)得到的上清液分为8组进行，即在步骤(2)中加入硫酸铵浓度分别达到15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％和50％。
1.4悬浮液选择
发明人选择两种悬浮液对沉淀进行悬浮，即20mmol/L咪唑的PBS缓冲液和pH值为8.5的50mM Tris-Cl缓冲液。
2结果
2.1蛋白沉淀硫酸铵浓度优化结果
经SDS-PAGE电泳可知，硫酸铵的浓度为20％时，AP1-AP2-BP蛋白的粗提取最理想，该浓度下杂带最少(如图3所示)。
2.2抗原蛋白悬浮缓冲液的优化结果
通过SDS-PAGE电泳实验结果证明，对于粗提的悬浮液，含有20mmol/L咪唑的PH值7.8的PBS缓冲液做悬浮液与pH值为8.5的Tris-Cl缓冲液做悬浮液相比，回收率更高，效果更为理想(如图4所示)。
2.3最优AP1-AP2-BP蛋白抗原纯化结果
通过对AP1-AP2-BP蛋白纯化过程的优化与改良，经SDS-PAGE电泳分析，纯化的AP1-AP2-BP蛋白浓度达到了比较理想的状态，并且通过硫酸铵粗提取法对AP1-AP2-BP蛋白纯化过程中出现的分子量约为33Ku的杂带有明显的去除作用，纯度达到98％(如图5所示)。
实施例3抗体的制备
对无乳链球菌AP1-AP2-BP重组蛋白进行亲和层析纯化，按常规方法制备弗氏完全佐剂乳化抗原和不完全佐剂乳化抗原。
1免疫程序
将饲养的3只家兔进行分组，其中2只家兔为实验组，另1只为对照组。用铝胶水溶性佐剂与纯化后的AP1-AP2-BP蛋白以1:5的比例混合，每只家兔免疫抗原含量为0.5mg/mL，免疫剂量为500μL/只。每隔7d进行1次免疫，共免疫4次，从第3次免疫开始，免疫剂量调整为1.0mL/只。
每次免疫前采集家兔耳静脉血液约10mL，ELISA检测抗体水平，如果抗体效价达到1:5600后从眼球静脉采血分离血清。
2测定亚单位抗体效价
用间接ELISA检测免疫血清效价：用pH9.6，0.05mol/L的碳酸盐缓冲液将纯化的AP1-AP2-BP重组蛋白稀释为20μg/mL，包被酶标板，每孔100μL，4℃包被过夜。次日每孔加入200μL封闭液(10％的脱脂乳)，37℃封闭1h后，用pH7.4的PBST(0.05％Tween-PBS)洗涤3次。然后每孔加入200～51200倍稀释的兔抗血清100μL，阴性对照为1:50倍稀释的免疫前血清，空白对照为兔抗血清稀释液(PBS)，每份样品均做3平行，37℃孵育1h后，同上洗涤3次。再次每孔加入100μL羊抗鼠IgG-HPR，37℃孵育1h后，同上洗涤3次。接下来每孔加入100μL TMB显色液，37℃避光反应20min后，每孔再加入50μL 2moL/L的硫酸终止液。最后，在酶标仪上测450nm下的OD值。
3亚单位抗体IgG的纯化与鉴定
按试剂盒(厂商，型号)说明进行。
4亚单位抗体的特异性和敏感性试验
用无乳链球菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌常见乳源性致病菌作为参比菌株作平板凝集试验，验证其特异性。
利用分离纯化的亚单位抗体IgG对临床上判定(PCR方法)为病原性无乳链球菌阳性的样本和判定为病原性无乳链球菌阴性的样本共235例(其中阳性123例，阴性112例)进行检测，以确定该亚单位抗体IgG用来检测病原性无乳链球菌的特异性和灵敏性。
5结果
对兔免疫血清进行间接ELISA检测时，当P/N＝(血清吸光值-空白吸光值)/(阴性对照吸光值-空白对照吸光值)>2，即认为是阳性，经计算，本发明制备的兔抗血清效价为1：12800(表1)。
表1 ELISA检测结果
Figure BDA0001763473120000111
通过亲和层析的方法对血清进行纯化，纯化得到的IgG的浓度非常理想，通过Protein A280的测量，IgG的最高浓度为9.102mg/mL，表明抗体含量达到要求，符合实验预期(如图6所示)。
平板凝集发现，所有参比菌株均显示阴性结果，只有无乳链球菌显示阳性结果，表明特异性非常好。
另外，对临床上已知阳性和阴性的样本进行检测。ROC曲线的AUC达到0.98(图7)，当Cut-off值取2时，敏感性达到93％，特异性达到91％(表2)。
表2 IgG检测结果
Figure BDA0001763473120000112
Figure BDA0001763473120000121
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 内蒙古民族大学
<120> 一种具有免疫原性的多肽、其抗体的制备方法以及用途
<130> XY-2018-1-012
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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cttctcaaag gagctacgtt tgaacttcaa gaatttaatg aagattataa actttattta 240
ccaataaaaa atagtgattc aaaagtagtg acgggagaaa acaagcttgg cggaggcgga 300
tccgaagcga aagaaatcgc aggtgcttac tttgctttca aaaatgaagc cggtactaaa 360
tacatcactg aaaatggtga agaagttgat actttggata caacagatgc caaaggttgt 420
gctgttctta aaggtttaac aacagacaat ggtttcaaat ttaacacttc taaattaaca 480
ggaacttacc aaatcgttga attgaaagaa aaatctacat acaacaacga tggttctatc 540
ttggctgatt caaaagcagt tccagttaaa atcactcttc cattggtaaa cgacaatggt 600
gttgttaaag acgctcacgt ttatccaaag aacactgaaa caaaaccaca agtagataag 660
aacttcgcag ataaagaact tgattatgcg aacaacaaaa aagacaaagg gactgtctca 720
gcatctgttg gtgatgttaa aaaataccat gttggaacaa aaatccttaa aggttcagac 780
tataagaaat taatctggac cgatagcatg accaaaggtt tgactttcaa caacgatatt 840
gctgtaacat tggatggtgc aactcttgat gctacaaatt acaaacttgt agcagatgac 900
caaggtttcc gccccaaggg cggaggcgga agcggaggcg gaggaagcgg cggtggcggc 960
tccagatcca atgctgatac ccctaatcaa ctaacaatca cacagatagg acttcagcca 1020
aatactacag aggaggggat ttcttatcgt ttatggactg tgactgacaa cttaaaagtt 1080
gatttattga gccaaatgac agatagcgaa ttgaaccaga agtataagag tatcttgact 1140
tctcctactg atactaatgg tcagacaaag atagcactcc caaatggttc gtactttggt 1200
cgtgcttata aagctgatca aagcgtttca acaatagtac ctttttatat tgaattacca 1260
gatgataagt tatcaaatca attacagata aatcctaagc gaaaagttga aacaggccga 1320
ttaaaactta ttaaatatac aaaagaagga aagataaaga aaaggctatc cggagtaata 1380
tttgtattat acgataacca gaatcagcca gttcgcttta aaaatggacg atttacgacc 1440
gatcaagatg ggattacttc attagtaact gatgataagg gagaaattga ggttgaaggt 1500
ttattacctg gtaagtatat ttttcgagaa gcaaaagcac taactggtta ccgtatatct 1560
atgaaggatg ctgtagttgc tgtagttgct aataaaacac aggaagtaga ggtagtaaac 1620
gaaaaagaaa ctcctccacc aacaaatcct aaaccatcac aaccgcttaa gcttgcgacc 1680
gcactcgag 1689
<210> 8
<211> 563
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Gly Thr Asp Thr Asn Gly Arg Thr Thr Leu Asn Pro Arg Ser Glu His
1 5 10 15
Pro Asn Thr Leu Arg Asp Phe Pro Ile Pro Lys Ile Arg Asp Val Arg
20 25 30
Glu Tyr Pro Thr Ile Thr Ile Lys Asn Glu Lys Lys Leu Gly Glu Ile
35 40 45
Glu Phe Ile Lys Val Asp Lys Asp Asn Asn Lys Leu Leu Leu Lys Gly
50 55 60
Ala Thr Phe Glu Leu Gln Glu Phe Asn Glu Asp Tyr Lys Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Pro Ile Lys Asn Ser Asp Ser Lys Val Val Thr Gly Glu Asn Lys Leu
85 90 95
Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ala Lys Glu Ile Ala Gly Ala Tyr Phe Ala
100 105 110
Phe Lys Asn Glu Ala Gly Thr Lys Tyr Ile Thr Glu Asn Gly Glu Glu
115 120 125
Val Asp Thr Leu Asp Thr Thr Asp Ala Lys Gly Cys Ala Val Leu Lys
130 135 140
Gly Leu Thr Thr Asp Asn Gly Phe Lys Phe Asn Thr Ser Lys Leu Thr
145 150 155 160
Gly Thr Tyr Gln Ile Val Glu Leu Lys Glu Lys Ser Thr Tyr Asn Asn
165 170 175
Asp Gly Ser Ile Leu Ala Asp Ser Lys Ala Val Pro Val Lys Ile Thr
180 185 190
Leu Pro Leu Val Asn Asp Asn Gly Val Val Lys Asp Ala His Val Tyr
195 200 205
Pro Lys Asn Thr Glu Thr Lys Pro Gln Val Asp Lys Asn Phe Ala Asp
210 215 220
Lys Glu Leu Asp Tyr Ala Asn Asn Lys Lys Asp Lys Gly Thr Val Ser
225 230 235 240
Ala Ser Val Gly Asp Val Lys Lys Tyr His Val Gly Thr Lys Ile Leu
245 250 255
Lys Gly Ser Asp Tyr Lys Lys Leu Ile Trp Thr Asp Ser Met Thr Lys
260 265 270
Gly Leu Thr Phe Asn Asn Asp Ile Ala Val Thr Leu Asp Gly Ala Thr
275 280 285
Leu Asp Ala Thr Asn Tyr Lys Leu Val Ala Asp Asp Gln Gly Phe Arg
290 295 300
Pro Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
305 310 315 320
Ser Arg Ser Asn Ala Asp Thr Pro Asn Gln Leu Thr Ile Thr Gln Ile
325 330 335
Gly Leu Gln Pro Asn Thr Thr Glu Glu Gly Ile Ser Tyr Arg Leu Trp
340 345 350
Thr Val Thr Asp Asn Leu Lys Val Asp Leu Leu Ser Gln Met Thr Asp
355 360 365
Ser Glu Leu Asn Gln Lys Tyr Lys Ser Ile Leu Thr Ser Pro Thr Asp
370 375 380
Thr Asn Gly Gln Thr Lys Ile Ala Leu Pro Asn Gly Ser Tyr Phe Gly
385 390 395 400
Arg Ala Tyr Lys Ala Asp Gln Ser Val Ser Thr Ile Val Pro Phe Tyr
405 410 415
Ile Glu Leu Pro Asp Asp Lys Leu Ser Asn Gln Leu Gln Ile Asn Pro
420 425 430
Lys Arg Lys Val Glu Thr Gly Arg Leu Lys Leu Ile Lys Tyr Thr Lys
435 440 445
Glu Gly Lys Ile Lys Lys Arg Leu Ser Gly Val Ile Phe Val Leu Tyr
450 455 460
Asp Asn Gln Asn Gln Pro Val Arg Phe Lys Asn Gly Arg Phe Thr Thr
465 470 475 480
Asp Gln Asp Gly Ile Thr Ser Leu Val Thr Asp Asp Lys Gly Glu Ile
485 490 495
Glu Val Glu Gly Leu Leu Pro Gly Lys Tyr Ile Phe Arg Glu Ala Lys
500 505 510
Ala Leu Thr Gly Tyr Arg Ile Ser Met Lys Asp Ala Val Val Ala Val
515 520 525
Val Ala Asn Lys Thr Gln Glu Val Glu Val Val Asn Glu Lys Glu Thr
530 535 540
Pro Pro Pro Thr Asn Pro Lys Pro Ser Gln Pro Leu Lys Leu Ala Thr
545 550 555 560
Ala Leu Glu

Claims (2)

1.一种多肽的制备方法，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示，所述方法包括将包括SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列的基因工程载体转化进原核表达细胞中并诱导所述基因工程载体表达的步骤，
具体包括以下步骤：
(1)获得无乳链球菌核酸样本；
(2)利用SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6所示引物对步骤(1)获得的样本进行扩增；
(3)步骤(2)扩增产品经回收纯化后连接到线性化的基因工程载体上，得到SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列的基因工程载体，
进一步包括对多肽进行纯化的步骤：
(1)将细胞经超声破碎，离心去除细胞碎片；
(2)在步骤(1)的上清液放在磁力搅拌器上搅拌，并逐滴加入饱和硫酸铵溶液；使重组蛋白充分沉淀；
(3)离心收集沉淀，利用悬浮液进行悬浮。
其中，所述硫酸铵溶液的浓度为20％；所述悬浮液为PBS缓冲液，所述PBS缓冲液含有20mmol/L咪唑。
2.权利要求1所述的方法制备的多肽在制备用于检测无乳链球菌的试剂盒中的用途。
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