CN111398604A - 一种牛布病A19-ΔVirB12疫苗的血清学检测方法 - Google Patents

一种牛布病A19-ΔVirB12疫苗的血清学检测方法 Download PDF

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李静
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Abstract

本发明公开了一种牛布病A19‑ΔVirB12疫苗的血清学检测方法，以布鲁氏菌VirB12蛋白为标记抗原建立了鉴别区分牛布病免疫抗体与自然感染抗体的间接酶联免疫吸附试验(iELISA)方法。本发明提供的iELISA方法解决了牛布病免疫动物与临床患病动物难以鉴别的问题，该方法对牛布病的防控、根除和净化具有实际应用价值。

Description

一种牛布病A19-ΔVirB12疫苗的血清学检测方法
技术领域
本发明属于兽用疫苗检测技术领域，涉及一种牛布病A19-ΔVirB12疫苗的血清学检测方法，具体为牛布病A19-ΔVirB12疫苗免疫抗体与自然感染抗体鉴别诊断检测技术。
背景技术
布鲁氏菌病(Brucellosis)是由布鲁氏菌(Brucella)引起的世界各地广泛流行的一种人畜共患传染病，简称布病。对家畜布病的预防和根除已经成为众多国家和地区公共卫生安全防御体系的主要任务。在多数布病流行的国家和地区，疫苗免疫是预防和控制畜间布鲁氏菌病的主要措施和最有效的手段之一。目前世界上广泛应用的布鲁氏菌弱毒活疫苗主要有牛S19、牛RB51和羊Rev.1疫苗，我国主要应用牛A19、羊M5和猪S2；其中牛A19来源于前苏联，在我国已生产并使用60余年。
牛布病A19弱毒苗主要用于牛布病的预防，该苗对我国牛布鲁氏菌病的防治起到很大的作用，但同时也存在一定缺陷。首先，A19疫苗为弱毒活菌疫苗，毒力较强，在生产应用中存在毒力返强的问题，对人类健康存在威胁。其次，A19疫苗缺乏鉴别诊断标记，目前常规的血清学方法无法区分疫苗接种动物与自然患病动物，造成患病动物在自然群体中长期存在，严重危害人类和动物的健康，阻碍动物布鲁氏菌病的根除和净化。为解决布病弱毒疫苗存在的上述问题，以牛布病A19疫苗为亲本株，通过同源重组技术构建了缺失布鲁氏菌VirB12蛋白的牛布病分子标记苗(A19-ΔVirB12)，研究数据表明，A19-ΔVirB12疫苗毒力弱于A19疫苗，提高了该疫苗的生物安全性。另外，本发明以缺失的布鲁氏菌VirB12蛋白为标记抗原，建立了一种鉴别区分牛布病A19-ΔVirB12疫苗免疫抗体和自然感染抗体的iELISA方法，弥补了现有A19疫苗无法鉴别的缺陷，对国内拥有自主产权的布病弱毒疫苗的研发应用并解决实际生产问题具有重大现实意义。
发明内容
本发明的目的在于鉴别诊断疫苗接种动物与临床患病动物，提供了一种牛布病A19-ΔVirB12疫苗的血清学检测方法，以布鲁氏菌VirB12蛋白作抗原包被酶标板，布病标准阳性牛血清为阳性对照，1×PBS缓冲液为空白对照，兔抗牛IgG为二抗，以确诊的布病阳性牛血清为待检样品，按照ELISA方法的操作步骤进行样品检测及结果判定。可鉴别区分布病A19-ΔVirB12疫苗免疫抗体与自然感染抗体，以此来甄别牛群中布病疫苗免疫动物与临床患病动物。
为了达到上述技术目的，本发明具体通过以下技术方案实现：
一种牛布病A19-ΔVirB12疫苗的血清学检测方法，包括以下步骤：
1)以布鲁氏菌VirB12蛋白作抗原包被酶标板，VirB12蛋白作为抗原的包被量为50ng/mL；
2)以布病标准阳性牛血清(APHA B.abortus CH63)为阳性对照；以1×PBS缓冲液(pH7.4)为空白对照；以按照国家标准(GB/T18646-2018)检测确诊为布病阳性的牛血清为待检样品；以商品化的辣根过氧化物酶标记的兔抗牛IgG为二抗；
3)以ELISA方法的操作步骤进行样品检测并进行结果判定。
所述的判定方法为：布病标准阳性血清的检测值OD450nm≥0.60，空白对照OD450nm≦0.10时，则视为该检测试验数据有效；设定待检血清OD450nm值为N，国际布病标准阳性血清的检测值OD450nm为P，N/P≥60％判定为布病阳性自然感染动物；否则判定为免疫动物。
所述的布鲁氏菌VirB12蛋白通过以下方法制备：
1)根据布鲁氏菌A19的VirB12基因设计引物(Genbank，AF226278)：
VirB12F：5′-CATATGCGCACATTGGTTATGGTC-3′含Nde I酶切位点；
VirB12R：5′-GTCGACTTACTTGCGTAAAATTTC-3′含Sal I酶切位点；
2)从牛种布鲁氏菌A19株提取细菌总DNA，以细菌总DNA为模板，进行聚合酶链反应，获得VirB12蛋白基因；
3)将VirB12蛋白基因转入原核表达载体pET-28a(+)中，获得重组表达载体；
4)将重组表达载体导入大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中诱导表达，收集菌体VirB12抗原蛋白；
5)收集的VirB12抗原蛋白经8M尿素变性，组氨酸结合树脂柱纯化，复性得到纯化的VirB12蛋白。
所述纯化的VirB12蛋白经Western-blot鉴定具有免疫活性，能被感染布鲁氏菌阳性牛血清所识别。
所述的VirB12蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在本发明的另一方面，还提供了一种用于扩增VirB12蛋白的引物，所述的引物如SEQ ID NO.3～4所示。
本发明的有益效果为：
本发明提供了一种牛布病A19-ΔVirB12疫苗的血清学检测方法。疫苗免疫是预防和控制家畜布病的主要措施及最有效的手段之一。由于布病疫苗为弱毒活疫苗，对人类食品安全和健康都存在潜在的威胁。国家规定每年必须对家畜进行两次布病检疫，常规的血清学方法无法区分畜群中布病疫苗接种动物与自然感染患病阳性动物，造成患病动物在自然群体中长期存在，严重危害人类和动物的健康，阻碍家畜布病的根除和净化。以布鲁氏菌VirB12蛋白为标记抗原建立的间接酶联免疫吸附试验(iELISA)方法可鉴别区分布病A19-ΔVirB12疫苗免疫抗体与自然感染抗体，以此来甄别牛群中布病疫苗免疫动物与临床患病动物，为扑杀和无害化处理布病阳性动物提供了技术支撑。临床试验验证该iELISA方法区分牛布病自然感染抗体与A19-ΔVirB12疫苗免疫抗体符合率达95％以上，大大减少了由于错杀和漏杀布病阳性动物带来的巨大经济损失，同时也快速清除了畜群中的传染源，解决了牛布病防控中的关键技术和实际生产难题，该方法对牛布病的防控、根除和净化具有实际应用价值。
附图说明
图1是本发明Western Blot鉴定VirB12蛋白免疫活性图；其中M为低分子量蛋白Marker；1为A19-ΔVirB12免疫；2为阴性对照；3为A19免疫；4为阳性对照。
具体实施方式
下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1制备VirB12抗原蛋白
菌株及载体：A19分子标记疫苗由新疆畜牧科学院兽医研究所布病课题组研制；布鲁氏菌2308株购自中国兽药监察所，克隆pGEM-T载体为商品化试剂，购自Promega公司；原核表达载体pET-28a(+)由新疆畜牧科学院兽医研究所保存。
试剂：限制性内切酶购自Fermentas公司；质粒DNA提取试剂盒和DNA凝胶回收试剂盒均购自Promega公司；T4DNA连接酶、DNA Marker、DH5α为北京鼎国生物公司产品。酶标二抗为兔抗牛IgG辣根过氧化物酶(美国，Bethyl公司)；蛋白纯化的His-trap柱为美国GE公司产品；序列测定由上海Invitrogen贸易有限公司完成。
VirB12基因表达载体的构建：从牛种布鲁氏菌A19株提取细菌总DNA，以该总DNA为模板，根据布鲁氏菌A19的VirB12基因序列(Genbank，AF226278)设计引物，PCR扩增VirB12基因片段，见SEQ ID NO.1。将VirB12基因克隆至pGEM-T载体中，即pV12，将该克隆质粒送至上海Invitrogen贸易有限公司测序，序列结果与目的VirB12基因序列一致，应用限制性内切酶Nde I和Sal I双酶切原核表达载体pET-28a(+)和pV12，将pET-28a(+)与VirB12基因片段连接、转化DH5α，得到VirB12基因表达载体pET28a-VirB12。
VirB12重组蛋白的表达：将鉴定为阳性的pET28a-VirB12转化大肠杆菌BL21(DE3)，挑取单克隆接入含卡那霉素(50mg/L)的LB液体培养基中，温度37℃培养至OD600＝0.5，加入终浓度为0.2mg/mL的IPTG诱导4h，收集菌体，SDS-PAGE检测结果表明VirB12蛋白的表达在菌液沉淀中。
VirB12重组蛋白的纯化及复性：先将组氨酸结合树脂柱(His-trap柱)平衡，将菌体超声破碎后的沉淀用含有8M尿素的结合缓冲液重悬后上柱，然后用5倍柱体积的结合缓冲液进行洗涤；用洗脱缓冲液洗脱VirB12蛋白，收集洗脱液装入透析袋中，依次在温度4℃下经梯度6mol/L尿素、4mol/L尿素、2mol/L尿素、1mol/L尿素、0.01mol/LPBS中分别透析12h，缓慢复性，收集透析的复性蛋白于-70℃冰箱保存备用。
实施例2VirB12重组蛋白的免疫活性鉴定
将实施例1复性后的蛋白进行SDS-PAGE电泳，转膜、封闭、洗涤，然后将膜在室温下浸泡于布鲁氏菌阳性血清中1h，应用磷酸盐缓冲液洗膜后加入兔抗牛的二抗，室温孵育1h，4-氯-1-萘酚显色至条带清晰，蒸馏水冲洗终止反应。以纯化的VirB12蛋白为抗原，分别以A19疫苗免疫牛血清、A19-ΔVirB12免疫牛血清、非免疫布病阴性牛血清、自然感染布病阳性牛血清为抗体。
Western-blot实验结果表明，VirB12蛋白具有免疫活性，鉴定结果见图1，其中图1中，M为低分子量蛋白Marker；1为A19-ΔVirB12免疫；2为阴性对照；3为A19免疫；4为阳性对照。
实施例3A19-ΔVirB12疫苗免疫抗体与自然感染抗体的iELISA鉴别
实验材料及设备：丹麦NUNC酶标96孔反应板，兔抗牛IgG辣根过氧化物酶(美国，Bethyl公司)，酶标仪(Bio-Rad 680)，微量移液器(10-1000μL)。
试剂及溶液配方：
酶标板预处理液(PBST10)：1×PBS(pH7.4)1000mL，Tween205mL。
包被稀释液(0.05mol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，pH 9.6)：Na2CO31.5g，NaHCO32.9g，Na2N30.2g，加去离子水至1000ml，调至pH＝9.6。
洗涤液(PBST,pH 7.4)：NaCl 8.0g，KH2PO40.2g,NaHPO4·12H2O 2.9g,KCl 0.2g，Tween200.5ml，加去离子水至1000ml，调至pH 7.4。
样本稀释液：1×PBS1000mL，Tween205mL，(pH 10.8)。
酶标二抗：兔抗牛IgG辣根过氧化物酶。
底物显色液：1ml柠檬酸液加入20μLTMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)溶液和1.2μLH2O2，TMB水溶液15mg/ml；柠檬酸为0.1mol/L pH4.0。终止液：2mol/L H2SO4溶液。
iELISA法鉴别A19-ΔVirB12疫苗抗体与自然感染抗体的操作步骤：
酶标板预处理：酶标板各孔中加满酶标板预处理液，温度37℃孵育0.5h。
洗涤：弃去板内处理液，用去离子水洗涤5遍。
包被：用包被缓冲液稀释纯化VirB12蛋白抗原，每孔加入100μL(含蛋白5ng/孔)，4℃过夜。
洗涤：弃去板内包被液，用PBST洗涤3遍。
封闭：每孔加入含3％鱼皮胶的PBST 200μL，37℃孵育1h。
加样：用1×PBST洗涤1次，甩干后，加入待测血清及阳性对照血清5μl/孔，每孔用1×PBST补至100μl，37℃孵育1h；
加入二抗：1×PBST洗涤4次，甩干，加入用1×PBST按1:8000稀释的兔抗牛二抗，100μl/孔，37℃孵育30mim；
显色：1×PBST洗涤4次，甩干，加入TMB显色液，100μl/孔，室温避光显色10min左右；
终止：2M硫酸50μl/孔终止，15min内在酶标仪上测定λ＝450nm的OD值。
实施例4
以布病标准阳性牛血清(APHA B.abortus CH63)为阳性对照；以1×PBS缓冲液(pH7.4)为空白对照；免疫A19-ΔVirB12疫苗牛血清79份(样品1～79)，布病自然感染阳性牛血清14份(样品81～94)，样品80和样品95为空白对照，样品96为标准阳性血清(APHAB.abortus CH63)，检测样品排列顺序见表1。按照上述iELISA方法操作步骤进行检测，根据该iELISA方法的判定，即待检血清OD450nm值为N，英国布病标准阳性血清的检测值OD450nm为P，N/P≥60％判定布病阳性自然感染动物。
表1样品加样顺序
Figure BDA0002448658280000091
表2应用iELISA方法检测样品结果
Figure BDA0002448658280000092
应用iELISA方法检测79份样品的结果见表2。检测结果表明，牛布病自然感染抗体与A19-ΔVirB12免疫抗体的值有明显差异。该iELISA方法可鉴别牛布病A19-ΔVirB12免疫抗体与自然感染抗体。根据判定标准，79份A19-ΔVirB12疫苗血清中77份判定为疫苗免疫抗体，2份为自然感染抗体。14份自然感染血清中，13份判定为自然感染抗体，结果表明该iELISA法区分牛布病自然感染抗体与A19-ΔVirB12疫苗免疫抗体符合率达95％以上。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
序列表
<110> 新疆畜牧科学院兽医研究所（新疆畜牧科学院动物临床医学研究中心）
<120> 一种牛布病A19-ΔVirB12疫苗的血清学检测方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 519
<212> DNA
<213> 布鲁氏菌VirB12(Brucella VirB12)
<400> 1
atgcgcacat tggttatggt cgcatgcgct gtctctctgg ccgcttgttc cagcccgccg 60
aagccgccca cagtcagcgg acgccaccgc attccgataa acagcccggc ggcacaagag 120
gaactgcgct tgcaggtttt cccgcaagaa cccaccgcgc aagcaaccat gtggccagca 180
cgaccgccca aacaaacagt caacgtgtat tttccccagg atgtgacggt attccggcca 240
acatccgcac agataaacca actccacaca ctgctctggc ccgtgcccaa gcatatcaac 300
gtcaggggcc tgacggacaa caactgccct cctcccggtg atacgcaagt cgcgcgtgtc 360
cgtgcgctgg ctatctataa ttggctgatc aatcaaggcg tacccgccag caggatcacc 420
ataagctatg ccccggtaaa agattacgca tcaaatgccc ccctttcacc gggccgcgtc 480
ctgaacaggc gcgtggatat cgaaatttta cgcaagtaa 519
<210> 2
<211> 172
<212> PRT
<213> 布鲁氏菌VirB12(Brucella VirB12)
<400> 2
Met Arg Thr Leu Val Met Val Ala Cys Ala Val Ser Leu Ala Ala Cys
1 5 10 15
Ser Ser Pro Pro Lys Pro Pro Thr Val Ser Gly Arg His Arg Ile Pro
20 25 30
Ile Asn Ser Pro Ala Ala Gln Glu Glu Leu Arg Leu Gln Val Phe Pro
35 40 45
Gln Glu Pro Thr Ala Gln Ala Thr Met Trp Pro Ala Arg Pro Pro Lys
50 55 60
Gln Thr Val Asn Val Tyr Phe Pro Gln Asp Val Thr Val Phe Arg Pro
65 70 75 80
Thr Ser Ala Gln Ile Asn Gln Leu His Thr Leu Leu Trp Pro Val Pro
85 90 95
Lys His Ile Asn Val Arg Gly Leu Thr Asp Asn Asn Cys Pro Pro Pro
100 105 110
Gly Asp Thr Gln Val Ala Arg Val Arg Ala Leu Ala Ile Tyr Asn Trp
115 120 125
Leu Ile Asn Gln Gly Val Pro Ala Ser Arg Ile Thr Ile Ser Tyr Ala
130 135 140
Pro Val Lys Asp Tyr Ala Ser Asn Ala Pro Leu Ser Pro Gly Arg Val
145 150 155 160
Leu Asn Arg Arg Val Asp Ile Glu Ile Leu Arg Lys
165 170
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
catatgcgca cattggttat ggtc 24
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtcgacttac ttgcgtaaaa tttc 24

Claims (6)

1.一种牛布病A19-ΔVirB12疫苗的血清学检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)以布鲁氏菌VirB12蛋白作抗原包被酶标板，VirB12蛋白作为抗原的包被量为50ng/mL；
2)以布病标准阳性牛血清为阳性对照；以1×PBS缓冲液为空白对照；确诊为布病阳性牛血清为待检样品；以辣根过氧化物酶标记的兔抗牛IgG为二抗；
3)以ELISA方法的操作步骤进行样品检测并进行结果判定。
2.根据权利要求1所述的一种牛布病A19-ΔVirB12疫苗的血清学检测方法，其特征在于，判定方法为：布病标准阳性血清的检测值OD450nm≥0.60，空白对照OD450nm≦0.10时，则视为该检测试验数据有效；设定待检血清OD450nm值为N，国际布病标准阳性血清的检测值OD450nm为P，N/P≥60％判定为布病阳性自然感染动物；否则判定为免疫动物。
3.根据权利要求1所述的一种牛布病A19-ΔVirB12疫苗的血清学检测方法，其特征在于，所述的布鲁氏菌VirB12蛋白通过以下方法制备：
1)根据布鲁氏菌A19的VirB12基因设计引物，如SEQ ID NO.3～4所示；
2)从牛种布鲁氏菌A19株提取细菌总DNA，以细菌总DNA为模板，进行聚合酶链反应，获得VirB12蛋白基因；
3)将VirB12蛋白基因转入原核表达载体pET-28a(+)中，获得重组表达载体；
4)将重组表达载体导入大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中诱导表达，收集菌体VirB12抗原蛋白；
5)收集的VirB12抗原蛋白经8M尿素变性，组氨酸结合树脂柱纯化，复性得到纯化的VirB12蛋白。
4.根据权利要求3所述的一种牛布病A19-ΔVirB12疫苗的血清学检测方法，其特征在于，所述纯化的VirB12蛋白经Western-blot鉴定具有免疫活性，能被感染布鲁氏菌阳性牛血清所识别。
5.根据权利要求1所述的一种牛布病A19-ΔVirB12疫苗的血清学检测方法，其特征在于，所述的VirB12蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
6.一种用于扩增VirB12蛋白的引物，其特征在于，所述的引物如SEQ ID NO.3～4所示。
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