CN110981969B

CN110981969B - 一种alv-k的elisa试剂盒及其检测方法

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Publication number: CN110981969B
Application number: CN201911344717.7A
Authority: CN
Inventors: 杨玉莹; 梁雄燕; 陈雪阳; 方春
Original assignee: Yangtze University
Current assignee: Yangtze University
Priority date: 2019-12-24
Filing date: 2019-12-24
Publication date: 2021-12-07
Anticipated expiration: 2039-12-24
Also published as: CN110981969A

Abstract

本发明公开了一种ALV‑K的ELISA检测试剂盒及其检测方法。该蛋白的编码序列如SEQ ID NO.1所示。通过编码SEQ ID NO.1的基因克隆到表达载体上，得到重组表达载体；将重组表达载体转化到宿主细胞中进行表达纯化，得到重组HIS‑K‑gp85蛋白。以重组HIS‑K‑gp85蛋白为抗原免疫大耳兔获得兔多抗KE7，并以此建立了一种ALV‑K的ELISA检测试剂盒及其检测方法。本发明通过对gp85基因重组，成功构建重组表达载体pET‑28a‑ALV‑K‑gp85，获得了可溶性重组HIS‑K‑gp85蛋白；本发明建立的ALV‑K的ELISA检测方法，可信度高，特异性强，敏感度高，重复性好。

Description

一种ALV-K的ELISA试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明属于重组基因蛋白及病毒检测技术领域，具体涉及一种ALV-K的ELISA试剂盒及其检测方法。

背景技术

禽白血病是由禽白血病病毒(ALV)引起的侵害多器官的肿瘤性传染病。根据囊膜糖蛋白gp85的特异性，ALV根据宿主范围和病毒的交叉可以分为11个亚群(A-K)，其中A-J和K亚群主要对鸡致病。随着时间的推移，禽白血病在我国的发生情况愈发复杂，ALV-K亚群禽白血病病毒为近几年从我国地方品种鸡群中发现的新亚群禽白血病病毒。K亚型病毒在不同鸡群中被发现，表明K亚群病毒在鸡群中的感染呈增长的趋势，可能成为继J亚群禽白血病病毒之后成为我国养鸡业新的重大潜在威胁。

近年来国家在禽白血病研究投入了大量的资金，但是一直没有相关的疫苗和治疗药物问世，仅能依靠淘汰阳性鸡达到净化鸡群。目前，鸡场禽白血病的净化主要依靠美国进口的ELISA检测试剂盒，小型鸡场及农户无法承担昂贵的价格，使得禽白血病的净化变得困难。国内研发的一些试剂盒在敏感性和符合度上明显弱于进口试剂盒。因此效果好、性价比高的的本国试剂盒在鸡群净化上变得尤为重要。敏感度高、特异性强、具有良好重复性的单克隆抗体是建立特异性ELISA(酶联免疫吸附试验)检测试剂盒的基础。gp85蛋白是囊膜蛋白的组分之一，在禽白血病病毒各亚群中差异较大，具有亚群特异性，因此本发明通过对ALV-K的gp85基因进行体外重组和表达，获得重组抗原，并以此建立特异性ELISA检测方法具有较高的应用价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种重组蓝藻抗病毒蛋白的编码序列，同时通过所述编码序列得到一种重组蓝藻抗病毒蛋白，并进一步提供所述重组蓝藻抗病毒蛋白的应用，其技术方案如下：

一种重组HIS-K-gp85蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，编码所述重组HIS-K-gp85蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

一种包含编码重组HIS-K-gp85蛋白的核苷酸序列的重组表达载体。

一种包含所述重组表达载体的宿主细胞。

一种重组HIS-K-gp85蛋白的制备方法，通过编码重组HIS-K-gp85蛋白的核苷酸序列克隆到表达载体上，得到重组表达载体；将所述重组表达载体转化到宿主细胞中进行表达，纯化，得到所述重组HIS-K-gp85蛋白。

一种ALV-K的ELISA试剂盒，其包括以下组分：

酶标板；

样品稀释液，为TB、CB、PBS、PBST、去离子水和生理盐水中的一种；

包被液，以纯化的所述重组HIS-K-gp85蛋白免疫雌性新西兰大耳兔，静脉采血，离心，经过硫酸铵沉淀法纯化，得到兔多抗KE7作为包被抗体，采用所述样品稀释液稀释所述包被抗体得到所述包被液；

洗涤液，为PBST；

封闭液，为1％NH₄Cl、5％NH₄Cl、1％BSA、5％BSA、1％脱脂乳和5％脱脂乳中的一种；

TMB底物显色液；

终止液，为2mol/L的硫酸溶液；

标准阳性样品；以及

标准阴性对照样品。

一种所述ALV-K的ELISA试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

(1)将所述包被液加入至所述酶标板的每孔中，于4℃包被过夜后，甩板，用所述洗涤液洗涤；其中，所述包被液中所述兔多抗KE7的浓度为1-6μg/100μL之间共6个梯度；

(2)每孔中加入所述封闭液，封闭，用所述洗涤液洗涤；

(3)加入待测样品，放于37℃孵育，用所述洗涤液洗涤；

(4)加入所述兔多抗KE7作为一抗，放于37℃孵育，用所述洗涤液洗涤；

(5)加入所述HRP酶标记的所述兔多抗KE7作为二抗，放于37℃孵育，用所述洗涤液洗涤；

(6)每孔中加入所述TMB底物显色液，显色；

(7)加入所述终止液终止；

(8)用酶标仪测450nm处吸光值，当P/N≥2时，判定样品为阳性；当P/N<2时，判定样品为阴性。

本发明还提供了一种ALV-K的ELISA试剂盒在血清学检测领域中的应用。

本发明提供的技术方案至少包括以下有益效果：

1、通过对HIS-K-gp85基因重组，成功构建重组表达载体pET-28a-ALV-K-gp85，转化至大肠杆菌DH5α菌细胞内，诱导表达，获得了可溶性重组HIS-K-gp85蛋白。

2、经过纯化后重组HIS-K-gp85作为抗压免疫获得ALV-K多克隆抗体，并以此构建了ALV-K的ELISA检测方法。其优化后条件为：以去离子水稀释兔多抗KE7作为包被抗体浓度为4μg/100μL作为包被液，5％的脱脂乳封闭为1.5h，一抗稀释后浓度为0.2μg/100μL孵育2h，HRP酶标二抗稀释度为1:2000，二抗孵育1h，底物显色20min；根据已经优化的间接ELISA反应条件，对60只1日龄阴性鸡采集肛拭子检测，并计算标准差s，判定标准为

其置信区间可达95％。

3、本发明提供的ALV-K的ELISA检测方法，建立对ELISA反应条件进行了优化，更能反映真实抗原效价的情况，同时判定标准的确立使用了大量的阴性样本，检测的阴性OD值平均数加3倍的标准差，其置信区间达到95％，检测符合率的可信度大大提高。

4、本发明提供的ALV-K的ELISA检测方法，本发明提供的ALV-K的ELISA检测试剂盒的对兔血清中的重组HIS-K-gp85蛋白、ALV-K病毒的分别最大检测限；本发明提供的ALV-K的ELISA检测方法具备良好的特异性；批内重复性试验变异系数最大值为5.364％，批间重复变异系数最大值为8.369％，说明本发明提供的ALV-K的ELISA检测方法重复性好。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为重组HIS-K-gp85基因扩增结果(SDS-PAGE)：图中M、1泳道分别为M、目的基因；M泳道为DL5000 marker；

图2为重组表达载体pET-28a-ALV-K-gp85的BamH I和Sal I双酶切鉴定结果(SDS-PAGE)：图中M、2泳道分别为M、目的基因；M泳道为DL5000 marker；

图3为重组HIS-K-gp85蛋白的诱导和纯化结果(SDS-PAGE)：泳道M，180KD蛋白Marker；泳道1，未诱导；泳道2，诱导；泳道3：纯化；

图4为兔多抗KE7纯化检测结果(SDS-PAGE)：泳道M，180KD蛋白Marker；泳道1，为纯化的兔多抗KE7血清；泳道2，纯化后的兔多抗KE7；

图5为鸡血清中的重组HIS-K-gp85蛋白的ELISA标准曲线；

图6为鸡血清中的AIV病毒、MDV病毒、ALV-A病毒、ALV-B病毒、ALV-J病毒、ALV-K病毒的特异性考察图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明作进一步地详细描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，均属于本发明保护的范围。

本发明实施例涉及的主要材料如下：

ALV-K毒株GDF0603(GenBank登录号KP686144.1)，T4 DNA连接酶、BamHI、Sal I均购自于NEB公司；

大肠杆菌DH5a、pTOPO-Simple，艾德莱，CV1501、pET28a质粒由本室保存；

琼脂糖凝胶回收试剂盒，上海捷瑞，GK2403-50；

雌性新西兰大耳兔，重庆市渝北区李青明种兔场提供；

Plasmid Recovery Column吸附柱，CBS，SolutionⅠ，SolutionⅡ，SolutionⅢ，W1Solution，Wash Solution，均为质粒小量制备试剂盒中材料，上海捷瑞，GK2004-50；

1mol/L IPTG溶液：称取2.4g IPTG粉末溶于8mL去离子水中，溶解后定容至10mL，0.22μm滤器过滤除菌后分装，-20℃保存。

100mg/mL溶菌酶：称取1g溶菌酶粉末溶于1分装0mL去离子水中，0.22μm滤器过滤除菌后分装，-20℃保存。

Buffer A：Tris base 3.0274g，EDTA0.3g，NaCl3g，加400mL去离子水调节PH至8.0，溶解后定容至500mL，常温保存。

Buffer B：Tris base 3.0274g，EDTA0.3g，NaCl3g，5mL 1％Nonidet P-40，去离子水溶解，定容至500mL，常温保存。

BufferC：240g尿素，6.0548gTris base，EDTA 0.3g，脱氧胆酸钠0.414g，TritonX-1002.5mL，β-巯基乙醇360μL，去离子水溶解，定容至500mL。

IPTG、小相对分子质量标准蛋白、引物购自上海生工生物公司；NiSepharoseTM6Fast Flow购自Amersham公司，四甲基偶氮唑(MTT)，美国SIGMA公司；

TB、CB、PBS、PBST、TMB显色液、HRP酶标、NH₄Cl、BSA、脱脂乳，美国SIGMA公司，其它试剂均为分析纯试剂。

实施例一重组表达载体的构建

1、gp85基因扩增

根据GenBank中已发表ALV-K毒株的gp85序列(如SEQ ID NO.1所示)，设计一对能特异性扩增gp85基因的引物，分别在正向引物gp85-F(如SEQ ID NO.2所示)和反向引物gp85-R(如SEQ ID NO.3所示)的各自5’端引入BamHI和SalⅠ酶切位点，如表1所示。

表1 gp85基因特异性扩增引物

引物	序列	TM值/℃
			gp85-F	5'-CGC<u>GGATCC</u>CACTTACTCGAGCAGCCAGGGAAC-3'	70.8
gp85-R	5'-ACGC<u>GTCGAC</u>GGGTGCTTCGTTTACGTCTTATACC-3'	67.3

以感染ALV-K毒株的DF-1细胞基因组DNA为模板，以gp85-F和gp85-R为引物，对gp85基因进行PCR扩增，PCR采用25μL反应体系，体系如表2所示：

表2

25μL体系
		2×Mix	12.5μL
gp85-F	1μL
		gp85-R	1μL
DNA模板	1μL
		去离子水	9.5μL

反应程序为：预变性94℃，1min；再经94℃变性10s，66℃退火10s，72℃延伸45s，33个循环；终末72℃延伸5min，并于16℃保温。

扩增获得的片段用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行回收，并使用1％琼脂糖凝胶检测，在预期大小处出现条带(1005bp)见图1。

2、克隆载体TOPO-ALV-K-gp85构建

目的基因gp85用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行回收，并将其连接至pTOPO-Simple载体上。将连接之后的产物转化值大肠杆菌DH5α细胞内，复苏后均匀涂布与Amp平板上，37℃过夜培养后，挑选阳性菌落鉴定并用质粒提取试剂盒提取重组质粒，具体步骤如下：

(1)吸取200μL Buffer CBS加入到Plasmid Recovery Column吸附柱中，活化吸附柱，12000r/min，离心1min；

(2)收集鉴定正确并过夜培养的转化后大肠杆菌DH5α菌液3mL，12000r/min，离心1min，弃去培养基，保留菌体；

(3)在收集的菌体中加入250μL的SolutionⅠ，并将菌体悬浮起来；

(4)在其中加入250μL的SolutionⅡ，轻轻的上下颠倒混匀，此步骤要控制在5min之内；

(5)加入350μL的SolutionⅢ，轻轻的上下颠倒混匀，在室温条件下静置4min，12000r/min，离心10min；

(6)将(4)中的上清液抽取到Plasmid Recovery Column吸附柱中，6000r/min，离心1min，弃废液，将流穿液重新加入到Plasmid Recovery Column吸附柱中，再次离心可提高质粒产量；

(7)在Plasmid Recovery Column吸附柱中加入500μL的W1 Solution，12000r/min，离心1min，弃废液；

(8)在Plasmid Recovery Column吸附柱中加入500μL的Wash Solution，12000r/min，离心1min，弃废液，重复一次该步骤；

(9)将Plasmid Recovery Column吸附柱以12000r/min的速度，离心2min，并放置在55℃挥发5min，保证Wash Solution彻底除去；

(10)在吸附柱的中央加入50μL预热的灭菌去离子水，55℃处理2min，使得质粒充分溶解，12000r/min，离心2min，即可得到克隆载体TOPO-ALV-K-gp85。

3、重组表达载体pET-28a-ALV-K-gp85构建

表3

将克隆载体TOPO-ALV-K-gp85和pET-28a质粒分别使用BamH I和Sal I进行双酶切，酶切体系如表3所示，双酶切在37℃恒温水浴槽中进行，时间为3h，酶切完毕后检测和回收均使用1％的琼脂糖凝胶回收目的基因gp85片段，回收片段与经BamH I和Sal I双酶切的pET-28a片段用T4连接酶25℃连接过夜(连接体系如表4所示)，连接之后的产物转化至大肠杆菌DH5α菌细胞内，复苏后均匀涂布与Amp和Kana平板上，37℃过夜培养后挑选阳性菌落，用质粒提取试剂盒提取重组载体，并对质粒做BamH I和Sal I双酶切鉴定，酶切鉴定正确的克隆进行测序确定，最终得到重组表达载体pET-28a-ALV-K-gp85；SDS-PAGE电泳结果见图2，双酶切结果在预期大小处出现目的条带。

表4

	pET-28a
		10×Ligation Buffer	1μL
T4DNA连接酶	0.5μL
		gp85基因	3μL
载体	5.5μL
		总体积	10μL

实施例二重组HIS-K-gp85蛋白的诱导与表达

将实施例一得到的重组表达载体pET-28a-ALV-K-gp85用热激的方法转化进E.coliBL21表达菌株中，复苏后均匀涂布与Amp和Kana平板上，37℃过夜培养后，挑选阳性菌落鉴定后将正确的菌落接入2支装有对应抗生素的液体LB培养基(每支4mL)中摇菌，其中一支用于后续试验，另一支用于诱导。待菌液OD值约0.6时，拿出3支灭菌的干净试管，在每支试管中加入1mL菌液和1μL1mol/L的IPTG，至中浓度为1mM，作为诱导组；原试管中剩余菌液作为未诱导组；诱导组设置温度梯度16℃、25℃和37℃。4-5h之后，12000r/min离心，1min收集菌体，用40μLPBS重悬菌体，加入溶菌酶和蛋白酶抑制剂(PMSF)至终浓度为分别为1mg/mL和1mM。将重悬的菌液至于超声破碎仪裂解，破碎5s，间隔10s，功率200W，工作总时间90min，离心后取上清进行SDS-PAGE凝胶检测。重组质粒pET-28a-ALV-K-gp85，表达重组HIS-K-GP85蛋白(如SEQ ID NO.4所示)。如图3中泳道2为诱导表达后菌液经过上述处理后的上清进行SDS-PAGE凝胶检测，结果表明HIS-K-gp85为可溶性表达。而袁丽霞等构建的pET-GDFX0603-gp85诱导表达的gp85重组蛋白为包涵体。

实施例三重组HIS-K-gp85蛋白的纯化

收集的E.coliBL21菌体使用30mL Buffer A洗涤菌体，12000r/min；4℃冷冻离心10min，弃去上清；用BufferC重新悬浮菌体，加入加入溶菌酶和蛋白酶抑制剂(PMSF)至终浓度为分别为1mg/mL和1mM，在冰水混合物中冰浴半小时，后将重悬的菌液至于超声破碎仪裂解，破碎5s，间隔10s，功率200W，工作总时间90min；超声波裂解结束后12000r/min；4℃冷冻离心20min，0.45μm滤器过滤除去杂质，得到待纯化蛋白液，备用。

用去离子水反复冲洗3次重力层析空柱，冲洗之后在空柱子中加入3mL NiFocurose6FF，PBS在层析柱中对Ni Focurose 6FF洗涤两次后使用Buffer C再洗涤两次；待Buffer C完全流出后关闭层析柱下方开关，加入过滤后的待纯化蛋白液于4℃充分吸附2-4h；从小到大依次加入梯度咪唑以洗脱吸附的HIS-K-gp85蛋白，每种洗脱液抽取40μL用于SDS-PAGE检测，剩余-80℃储存备用。纯化结果如图3中泳道3所示，说明纯化效果好。纯化的蛋白用Bradford蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。

实施例四 ALV-K多克隆抗体制备

以纯化的重组融合蛋白HIS-K-gp85为免疫用抗原，免疫2月龄的雌性新西兰大耳兔。首次免疫用1mg重组融合蛋白HIS-K-gp85(667μL)与等量的弗氏完全佐剂乳化后背部皮下多点注射；每两周进行一次加强免疫，用1mg融合蛋白(667μL)与等量的弗氏不完全佐剂乳化后背部皮下多点注射；第二次加强免疫后一周对大耳兔耳缘静脉采血，12000r/min，离心5min，制备抗血清并ELISA检测免疫效果，方法见3.2.2.1。心脏大量采集血液后，室温过夜放置，12000r/min，离心20min，分装血清-80℃保存。

免疫后血清硫酸铵沉淀法，即得到多克隆抗体纯化，纯化结果如图4所示。

具体方法如下(以1mL兔血清抗体纯化为例)：

(1)1mL融化的兔血清中加入1mL的生理盐水，均匀混合；

(2)在稀释的兔血清中加入2mL的饱和硫酸铵至终浓度为50％，室温下静置20min，3000r/min，离心15min，弃上清；

(3)用4mL生理盐水溶解沉淀，加入饱和硫酸铵1.97mL至33％饱和度，室温下静置20min，3000r/min，离心15min，弃上清，重复该操作2-3次；

(4)沉淀溶于适量的生理盐水中，在4℃环境下透析72h；

(5)透析完毕后，以12000r/min的速度4℃冷冻离心30min，收集上清分装并用Bradford蛋白定量试剂盒测定抗体浓度。Bradford结果表明，蛋白定量试剂盒测定抗体浓度，抗体浓度为4.730mg/mL。

实施例五 ALV-K的ELISA检测方法构建

一种ALV-K的ELISA试剂盒，其包括以下组分：酶标板；样品稀释液，为TB、CB、PBS、PBST、去离子水和生理盐水中的一种；包被液，以纯化的所述重组HIS-K-gp85蛋白免疫雌性新西兰大耳兔，静脉采血，离心，经过硫酸铵沉淀法纯化，得到兔多抗KE7作为包被抗体(如实施例四所示)，采用所述样品稀释液稀释所述包被抗体得到所述包被液；洗涤液，为PBST；封闭液，为1％NH₄Cl、5％NH₄Cl、1％BSA、5％BSA、1％脱脂乳和5％脱脂乳中的一种；TMB底物显色液；终止液，为2mol/L的硫酸溶液；标准阳性对照；以及标准阴性对照。(标准阳性样品，200ng/ml的HIS-K-gp85重组蛋白，标准阴性对照样品为PBS。)

一种ALV-K的ELISA试剂盒检测方法，包括以下步骤：

(1)将所述包被液加入至酶标板的每孔中，每孔100μL，于4℃包被过夜后，甩板，用所述洗涤液洗涤3次，每次5min，去除洗涤液；

(2)每孔中加入封闭液至酶标板的每孔中，每孔200μL，封闭，放于37℃孵育1-2.5h，用所述洗涤液洗涤3次，每次5min，去除洗涤液；

(3)加入待测样品至酶标板的每孔中，每孔100μL，放于37℃孵育2h，用所述洗涤液洗涤3次，每次5min，去除洗涤液；

(4)加入兔多抗KE7作为一抗至酶标板的每孔中，每孔100μL，放于37℃孵育0.5-2h，用所述洗涤液洗涤3次，每次5min，去除洗涤液；

(5)加入HRP标记的兔多抗KE7作为二抗至酶标板的每孔中，每孔100μL，放于37℃孵育0.5-2h，用所述洗涤液洗涤3次，每次5min，去除洗涤液；

(6)每孔中加入所述TMB底物显色液，显色；

(7)加入所述终止液终止；

样品稀释液的选择：分别以TB、CB、PBS、PBST、去离子水和生理盐水分别稀释包被抗体兔多抗KE7至同一浓度4μg/100μL，酶标板每孔100μL于4℃包被过夜，检测一抗稀释终浓度为1μg/100μL，按照基本操作进行检测，每组4个平行，读取OD值并计算P/N值，选取P/N值较大的且阳性值接近1的作为包被液。结果见表5，结果表明去离子水是最佳包被稀释液。

表5

包被浓度的选择：用筛选的包被稀释液将包被抗体分别稀释至1μg/100μL、2μg/100μL、3μg/100μL、4μg/100μL、5μg/100μL、和6μg/100μL，酶标板每孔100μL于4℃包被过夜，检测一抗稀释终浓度为1μg/100μL，按照基本操作进行检测，每组4个平行，读取OD值并计算P/N值，选取P/N值较大的且阳性值接近1的作为最佳被浓度。结果见表6，结果显示4μg/100μL为最佳包被浓度。

表6

封闭液的选择：用去离子水将兔多抗KE7分别稀释至4μg/100μL，分别选取1％NH₄Cl、5％NH₄Cl、1％BSA、5％BSA、1％脱脂乳、5％脱脂乳作为封闭液，未封闭的作为对照，检测一抗稀释终浓度为1μg/100μL，按照基本操作进行检测，每组4个平行，读取OD值并计算P/N值，选取P/N值较大的且阳性值接近1的作为最佳封闭液。结果见表7，结果显示5％的脱脂乳为最佳封闭液。

表7

封闭时间的选择：用去离子水将兔多抗KE7分别稀释至4μg/100μL，4℃孵育过夜，使用5％脱脂乳进行封闭，封闭时间设置4个对照组，分别为1h、1.5h、2h和2.5h，检测一抗稀释终浓度为1μg/100μL，按照基本操作进行检测，每组4个平行，读取OD值并计算P/N值，选取P/N值较大的且阳性值接近1的作为最佳封闭时间。结果见表8，结果显示5％的脱脂乳的最佳封闭时间为1.5h。

表8

检测用一抗稀释度选择：用去离子水将兔多抗KE7分别稀释至4μg/100μL，4℃孵育过夜，使用5％脱脂乳封闭1.5h，检测一抗稀释设置12个梯度0.1μg/100μL、0.2μg/100μL、0.2μg/100μL、0.4μg/100μL、0.5μg/100μL、1.0μg/100μL、1.5g/100μL、2.0μg/100μL、2.5μg/100μL、3.0μg/100μL、3.5μg/100μL和4.0μg/100μL按照基本操作进行检测，每组4个平行，读取OD值并计算P/N值，选取P/N值较大的且阳性值接近1的作为最佳一抗稀释度。见表9，结果显示最佳一抗稀释后浓度为0.2μg/100μL。

表9

一抗孵育时间选择：综合以上指标选择最佳结果，区别为一抗孵育时间设置了0.5h、1h、1.5h和2h 4个梯度，按照基本操作进行检测，每组4个平行，读取OD值并计算P/N值，选取P/N值较大的且阳性值接近1的作为最佳一孵育时间。结果见表10，表明孵育2h效果最好。

表10

HRP酶标二抗最佳稀释度：综合以上指标选择最佳结果，区别为对酶标二抗设置了1:1000-1:8000之间共8个稀释度，按照基本操作进行检测，每组4个平行，读取OD值并计算P/N值，选取P/N值较大的且阳性值接近1的作为最佳HRP酶标二抗稀释度。见表11，结果显示1:2000效果较好。

表11

HRP酶标二抗孵育时间选择：综合以上指标选择最佳结果，区别是HRP酶标二抗孵育时间设置了4个时间梯度，分别为0.5h、1h、1.5h和2h，按照基本操作进行检测，每组4个平行，读取OD值并计算P/N值，选取P/N值较大的且阳性值接近1的作为最佳HRP酶标二抗孵育时间。结果见表12，结果显示最佳孵育时间为1h。

表12

底物显色最佳时间：综合以上指标选择最佳结果，对底物作用时间选取5个时间梯度，每5min为一梯度，按照基本操作进行检测，每组4个平行，读取OD值并计算P/N值，选取P/N值较大的且阳性值接近1的作为最佳底物显色时间。结果见表13，结果底物显色最佳时间为20min。

表13最佳显色时间的确定

综上ALV-K的ELISA检测方法优化后的条件为：以去离子水稀释兔多抗KE7作为包被抗体浓度为4μg/100μL作为包被液，5％的脱脂乳封闭为1.5h，一抗稀释后浓度为0.2μg/100μL孵育2h，HRP酶标二抗稀释度为1:2000，二抗孵育1h，底物显色20min。

为进一步验证上述ELISA检测方法的判定标准，对60只1日龄阴性鸡采集肛拭子，采用已经优化的上述间接ELISA反应条件检测，获得阴性样品的OD值，计算cutoff值＝其平均值

和标准差(s)＝0.26326，结果显示该阴性样品的OD值大于

的样品数的置信区间达95％，说明本ELISA试剂盒和检测方法具备很高的可信度。

实施例六 ALV-K的ELISA检测方法效果评价

1、敏感性试验

将标准阳性样品，分为重组HIS-K-gp85蛋白抗原组和ALV-K病毒抗原组，各组分别设几个梯度，使用实施例五优化的ELISA试剂盒进行试验，以cutoff值判定抗原最低检出浓度。结果如表14显示，实施例五优化的ELISA试剂盒检测到阳性血清中重组HIS-K-gp85蛋白的最低检出浓度为0.05ng/mL，ALV-K抗原的最低检出滴度为2.74×10²TU/ml。

而袁丽霞等构建的K亚群亚群禽白血病病毒抗体间接ELISA检测方法中的最低检测限度仅为μg级。

表14敏感性检测

2、特异性试验

使用分别加入了AIV病毒、MDV病毒、ALV-A病毒、ALV-B病毒、ALV-J病毒、ALV-K病毒及重组HIS-K-gp85蛋白的鸡血清进行特异性检测，同时设立阴性对照(未加入任何病毒或重组HIS-K-gp85蛋白的鸡血清)，根据实施例五优化建立的ALV-K的ELISA检测方法进行试验。如图5-6结果显示，重组HIS-K-gp85蛋白组的OD450nm吸光值与其蛋白浓度呈现显著的依赖性，为线性正相关，拟合曲线分别为直线y＝0.0707x+0.2875，R2＝0.9973；ALV-K病毒的OD450nm吸光值与其病毒滴度呈现依赖性，为对数相关性，其拟合曲线为y＝-0.825+0.167*ln(x+231.6),R2＝0.972；其他组均无依赖性，也不成相关性。因此，本发明提供的ALV-K的ELISA检测方法具备良好的特异性。

3、重复性试验

选用10份血清样品进行ALV-K的ELISA检测方法的批间和批内重复性试验，该血清样品为鸡血清中加入ALV-K病毒颗粒作为阳性血清(浓度为1.24×10³TU/ml)，未加入ALV-K病毒颗粒的鸡血清作为阴性血清。结果如表15表示，批内重复性试验变异系数最大值为5.364％，批间重复变异系数最大值为8.369％，说明本发明提供的ALV-K的ELISA检测方法重复性好。

表15重复性试验

综上所述：

2、经过纯化后重组HIS-K-gp85作为抗原免疫获得ALV-K多克隆抗体，并以此构建了ALV-K的ELISA检测方法。其优化后条件为：以去离子水稀释兔多抗KE7作为包被抗体浓度为4μg/100μL作为包被液，5％的脱脂乳封闭为1.5h，一抗稀释后浓度为0.2μg/100μL孵育2h，HRP酶标二抗稀释度为1:2000，二抗孵育1h，底物显色20min；根据已经优化的间接ELISA反应条件，对60只1日龄阴性鸡采集肛拭子检测，并计算标准差s，判定标准为

其置信区间可达95％。

4、本发明提供的ALV-K的ELISA检测方法，本发明提供的ALV-K的ELISA检测试剂盒的对鸡血清中的重组HIS-K-gp85蛋白最低检出浓度为0.05ng/mL，ALV-K抗原的最低检出滴度为2.74×10²TU/ml；本发明提供的ALV-K的ELISA检测方法具备良好的特异性；批内重复性试验变异系数最大值为5.364％，批间重复变异系数最大值为8.369％，说明本发明提供的ALV-K的ELISA检测方法重复性好。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 长江大学

<120> 一种ALV-K的ELISA试剂盒及其检测方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1005

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cacttactcg agcagccagg gaacctttgg attacatggg ccaaccgtac aggccaaacg 60

gatttctgcc tctctacaca gtcagccacc tccccttttc aaacatgttt gataggtatc 120

ccgtccccta tttccgaagg tgattttaag ggatacgtct ctgatgattg caccaccttg 180

ggaactgacc ggttagtctc gtcagccgac attaccggcg gccctgacaa cagcaccacc 240

ctcacttatc gaaaggtttc atgcttgctg tcaaagctga atgtccctat gtgggatgag 300

ccaccggaac tacagctgct cggttcccag tctctcccta acattactaa tattgctcag 360

atctctggcg tagccggggg atgcgtagct ttcggccccc ggagcattga catgctttca 420

gattggtcca ggccgcaact cacgaggtgg ctcctcctcc gccgcaacta cacagaaccg 480

tttacggtgg tgacagcgga tagacacaat ctttttaggg ggagggagta ctgcggtaca 540

tatggttaca gattctggaa actgtataat tgctcacaga caggttctag gtaccgctgt 600

ggacgcgtgc ctgtcggggg cctccctgag accgggtgca cacgcacagg aggtaaatgg 660

gttaatcagt caaaggaaat taatgagacg gagccgttca gttttactgc gaactgtaca 720

gctagtaatt tgggtaatgt cagcggatgt tgtgggaaaa cgcccacgac tctcccacca 780

ggggcgtgga ttgacagcac acggggcggt ttcactaaac caaaagcact accacccgca 840

attttcctca tttgtgggga tcgcgcatgg caaggaattc ccagtcgtcc ggtagggggc 900

ccctgctatt taggcaagct taccatgtta gcacccaacc atacagatat tctcaaggtg 960

cttgccaatt catcgcggac aggtataaga cgtaaacgaa gcacc 1005

<210> 2

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgcggatccc acttactcga gcagccaggg aac 33

<210> 3

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

acgcgtcgac gggtgcttcg tttacgtctt atacc 35

<210> 4

<211> 384

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

1 5 10 15

Arg Gly Ser His Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg

20 25 30

Gly Ser His Leu Leu Glu Gln Pro Gly Asn Leu Trp Ile Thr Trp Ala

35 40 45

Asn Arg Thr Gly Gln Thr Asp Phe Cys Leu Ser Thr Gln Ser Ala Thr

50 55 60

Ser Pro Phe Gln Thr Cys Leu Ile Gly Ile Pro Ser Pro Ile Ser Glu

65 70 75 80

Gly Asp Phe Lys Gly Tyr Val Ser Asp Asp Cys Thr Thr Leu Gly Thr

85 90 95

Asp Arg Leu Val Ser Ser Ala Asp Ile Thr Gly Gly Pro Asp Asn Ser

100 105 110

Thr Thr Leu Thr Tyr Arg Lys Val Ser Cys Leu Leu Ser Lys Leu Asn

115 120 125

Val Pro Met Trp Asp Glu Pro Pro Glu Leu Gln Leu Leu Gly Ser Gln

130 135 140

Ser Leu Pro Asn Ile Thr Asn Ile Ala Gln Ile Ser Gly Val Ala Gly

145 150 155 160

Gly Cys Val Ala Phe Gly Pro Arg Ser Ile Asp Met Leu Ser Asp Trp

165 170 175

Ser Arg Pro Gln Leu Thr Arg Trp Leu Leu Leu Arg Arg Asn Tyr Thr

180 185 190

Glu Pro Phe Thr Val Val Thr Ala Asp Arg His Asn Leu Phe Arg Gly

195 200 205

Arg Glu Tyr Cys Gly Thr Tyr Gly Tyr Arg Phe Trp Lys Leu Tyr Asn

210 215 220

Cys Ser Gln Thr Gly Ser Arg Tyr Arg Cys Gly Arg Val Pro Val Gly

225 230 235 240

Gly Leu Pro Glu Thr Gly Cys Thr Arg Thr Gly Gly Lys Trp Val Asn

245 250 255

Gln Ser Lys Glu Ile Asn Glu Thr Glu Pro Phe Ser Phe Thr Ala Asn

260 265 270

Cys Thr Ala Ser Asn Leu Gly Asn Val Ser Gly Cys Cys Gly Lys Thr

275 280 285

Pro Thr Thr Leu Pro Pro Gly Ala Trp Ile Asp Ser Thr Arg Gly Gly

290 295 300

Phe Thr Lys Pro Lys Ala Leu Pro Pro Ala Ile Phe Leu Ile Cys Gly

305 310 315 320

Asp Arg Ala Trp Gln Gly Ile Pro Ser Arg Pro Val Gly Gly Pro Cys

325 330 335

Tyr Leu Gly Lys Leu Thr Met Leu Ala Pro Asn His Thr Asp Ile Leu

340 345 350

Lys Val Leu Ala Asn Ser Ser Arg Thr Gly Ile Arg Arg Lys Arg Ser

355 360 365

Thr Val Asp Lys Leu Ala Ala Ala Leu Glu His His His His His His

370 375 380

Claims

1.一种ALV-K的ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括以下组分：

酶标板；

样品稀释液，为去离子水；

包被液，以纯化的重组HIS-K-gp85蛋白免疫雌性新西兰大耳兔，静脉采血，离心，经过硫酸铵沉淀法纯化，得到兔多抗KE7作为包被抗体，采用所述样品稀释液稀释所述包被抗体至4μg/100μL，得到所述包被液，其中所述重组HIS-K-gp85蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示；

洗涤液，为PBST；

封闭液，为5%脱脂乳；

TMB底物显色液；

终止液，为2mol/L的硫酸溶液；

HRP酶标；

标准阳性样品；以及

标准阴性对照样品；

其中5%脱脂乳的封闭时间为1.5h；一抗稀释后浓度为0.2μg/100μL孵育2h；HRP酶标二抗稀释度为1:2000，二抗孵育1h；底物显色20min。

2.根据权利要求1所述的一种ALV-K的ELISA试剂盒，其特征在于，所述重组HIS-K-gp85蛋白的制备方法包括：通过将如SEQ ID NO:1所示的基因克隆到表达载体上，得到重组表达载体；将所述重组表达载体转化到宿主细胞中进行表达，纯化，得到所述重组HIS-K-gp85蛋白。

3.根据权利要求2所述的一种ALV-K的ELISA试剂盒，其特征在于，所述表达载体为pET28a，所述宿主细胞为E. coli BL21。

4.据权利要求2所述的一种ALV-K的ELISA试剂盒，其特征在于，所述重组HIS-K-gp85蛋白的制备方法包括以下步骤：

（1）HIS-K-gp85基因扩增：以如SEQ ID NO:1所示的基因为模板，以gp85-F和gp85-R为引物，对HIS-K-gp85基因进行PCR扩增；扩增的片段用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行回收，并进行TOPO克隆，构建克隆载体TOPO-ALV-K-gp85，其中正向引物gp85-F的序列如SEQ ID NO:2所示，反向引物gp85-R的序列如SEQ ID NO: 3所示；

（2）重组表达载体构建：将克隆载体TOPO-ALV-K-gp85和pET-28a质粒分别进行双酶切，回收gp85片段，与经酶切的pET-28a片段连接，连接之后的产物转化至DH5α菌细胞内，培养后挑选阳性菌落，经鉴定，得到重组表达载体pET-28a-ALV-K-gp85；

（3）诱导表达：将所述重组表达载体pET-28a-ALV-K-gp85转化进E. coli BL21菌株中，复苏和培养后，挑选阳性并经鉴定正确的菌落进行诱导表达；

（4）重组HIS-K-gp85蛋白的纯化：诱导后菌体经溶解，超声裂解，裂解液上Ni柱，纯化后的蛋白进行鉴定，分装保存。

5.如权利要求1所述ALV-K的ELISA试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将所述包被液加入至所述酶标板的每孔中，于4℃包被过夜后，甩板，用所述洗涤液洗涤；

（2）每孔中加入所述封闭液，封闭，用所述洗涤液洗涤；

（3）加入待测样品，孵育后用所述洗涤液洗涤；

（4）加入所述兔多抗KE7作为一抗，孵育后用所述洗涤液洗涤；

（5）加入所述HRP酶标记的所述兔多抗KE7作为二抗，孵育后用所述洗涤液洗涤；

（6）每孔中加入所述TMB底物显色液，显色；

（7）加入所述终止液终止；

（8）用酶标仪测450nm处吸光值，当P/N≥2时，判定样品为阳性；当P/N<2时，判定样品为阴性。

6.如权利要求1-4任一项所述的ALV-K的ELISA试剂盒在制备血清学检测产品中的应用。