CN110358733A - 一株稳定表达A亚群禽白血病病毒gp85蛋白的细胞系及应用 - Google Patents

一株稳定表达A亚群禽白血病病毒gp85蛋白的细胞系及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株稳定表达A亚群禽白血病病毒(ALV‑A)gp85蛋白的细胞系及应用。所述的稳定表达A亚群禽白血病病毒gp85蛋白的细胞系，命名为293F‑Agp85，该细胞系保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为CGMCC NO.17420。实验证明，该细胞系可以高效稳定表达A亚群禽白血病病毒gp85蛋白，其表达量高达25mg/L。此外，通过与细胞受体Tva互作和结合试验结果表明，由本发明细胞系表达获得的ALV‑A gp85蛋白具有正常的生物学活性，能够与细胞受体正常结合，并没有影响其生物学活性，且由于其表达量高，不需要转染，成本低，在体外研究ALV‑A感染细胞的机制和建立抗体检测方法等防控技术领域将具有良好的应用前景和意义。

Description

一株稳定表达A亚群禽白血病病毒gp85蛋白的细胞系及应用
技术领域
本发明涉及一株稳定表达A亚群禽白血病病毒gp85蛋白的细胞系，还涉及 由该细胞系表达获得的蛋白及应用。本发明属于生物技术领域。
背景技术
禽白血病(Avian leukosis,AL)是由禽白血病病毒(Avian leukosis virus,ALV)引 起的禽类多种具有传染性的良性和恶性肿瘤性疾病的总称。根据宿主范围、病毒 囊膜基因以及血清学交叉反应性的不同，ALV被划分为A-J 10个亚群，近些年 在我国又出现了新的亚群，指定为K亚群。根据病毒传播方式的不同，ALV可 分为内源性病毒和外源性病毒，其中E亚群为内源性病毒，A-D，J和K亚群为 外源性病毒。内源性病毒一般致病性低甚至无致病性，而ALV的临床肿瘤几乎 都是由外源性病毒感染所引起。A亚群禽白血病病毒(ALV-A)致病性较强，主 要引起蛋用型鸡的淋巴细胞白血病，主要引起鸡群生产性能下降以及感染鸡产生 肿瘤导致鸡的死亡，对养禽业危害严重。
ALV属于α-反转录病毒属，具有典型禽反转录病毒的基因组结构，为有囊膜 的RNA病毒。编码区包括gag，pol和env基因，gag基因编码核心蛋白，pol基 因编码酶蛋白，env基因编码囊膜糖蛋白。env是由表面蛋白gp85(SU)和跨膜蛋 白gp37(TM)组成的异源二聚体。gp85蛋白含有病毒-受体决定簇，能够识别宿主 细胞膜上的特异性受体，决定亚群特异性以及宿主的范围。因此，得到有生物学 活性的纯化的gp85蛋白，对于体外研究ALV-A感染细胞的机制和建立抗体检测 方法等防控技术至关重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一株稳定表达ALV-A gp85蛋白的细胞系，以及由该细 胞系表达获得的gp85蛋白及应用。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
为了能得到高效表达的ALV-A gp85蛋白，本发明发明人选取RAV-1(ALV-A) gp85基因第1-1020bp的序列，进行密码子优化并合成，优化后的ALV-A gp85基 因序列如SEQ IDNO.1所示，优化后的序列上游添加信号肽序列，下游携带His 标签。序列两端分别为BamHⅠ和XhoⅠ两个酶切位点。将此序列双酶切后， 胶回收，酶切产物用T4连接酶连接到同样经BamHⅠ和XhoⅠ酶切的慢病毒 表达载体pLVX，构建重组质粒pLVX-A-Tgp85。293T细胞在含10％胎牛血清的 DMEM培养基中，于37℃和5％CO2饱和湿度的培养箱中培养。待细胞生长至85％密度时，将0.1％PEI、质粒pLVX-A-gp85按照3：1的比例加入到无血清培 养基中，培养，收集细胞上清作为包装好的病毒液。293F细胞在无血清、2％青 链霉素混合液、1％谷氨酰胺293M无血清培养基中，于37℃和5％CO2饱和湿度 的摇床培养箱中培养。加入包装好的病毒液至293F细胞中继续培养，收集稳定 转染pLVX-A-gp85质粒的分选后的293F细胞上清，进行纯化。使用Western Blot 和SDS-PAGE电泳检测gp85蛋白表达情况。结果发现，该细胞系可以高效稳定 的表达ALV-A gp85蛋白，其蛋白表达量为25mg/L，且遗传稳定性良好。通过与 细胞受体Tva互作和结合试验结果表明，通过稳定表达的方式制备的ALV-Agp85 蛋白具有正常的生物学活性，能够与细胞受体正常结合，并没有影响其生物学活 性。
其中，本发明获得的一株稳定表达ALV-A gp85蛋白的细胞系，命名为 293F-Agp85，分类命名为表达A亚群禽白血病病毒gp85蛋白的293F稳定表达 细胞系，该细胞系保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址 在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，其菌种保藏编号 为CGMCC NO.17420，保藏时间为2019年3月28日。
进一步的，本发明还提出了所述的细胞系在制备A亚群禽白血病病毒gp85 蛋白中的应用。
更进一步的，本发明还提出了由所述的细胞系表达获得的A亚群禽白血病病 毒gp85蛋白。以及
所述的ALV-A gp85蛋白在制备检测A亚群禽白血病病毒抗体试剂中的用 途。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
本发明提供了一种能够高效、稳定表达ALV-A gp85蛋白的细胞系，该细胞 系可以高效稳定表达ALV-A gp85蛋白，其表达量高达25mg/L。此外，由本发明 细胞系表达获得的ALV-A gp85蛋白具有正常的生物学活性，能够与细胞受体正 常结合，并没有影响其生物学活性，且由于其表达量高，不需要转染，成本低， 在体外研究ALV-A感染细胞的机制和建立抗体检测方法等防控技术领域将具有 良好的应用前景和意义。
附图说明
图1为pLVX-A-gp85质粒感染293T细胞包装慢病毒荧光结果；
其中，A：荧光显微镜观察结果；B：明场细胞观察结果；
图2为慢病毒感染的293F细胞后不同时间阳性细胞；
图3为293F细胞分选后荧光检测结果；
其中，A：pLVX-A-gp85细胞系荧光显微镜观察结果；B：明场细胞观察结 果；
图4为表达ALV-A gp85蛋白细胞系SDS-PAGE和WB鉴定结果；
图5为不同代次293F稳定表达细胞系荧光检测结果；
图6为不同代次293F稳定表达细胞系gp85蛋白表达检测结果；
图7为证明ALV-Agp85蛋白与细胞受体Tva相互作用的Pull-down结果；
其中，A-GP85：为ALV-A gp85；K-GP85：为ALV-K gp85，作为阳性对照； J-GP85：为ALV-J gp85，作为阴性对照；
图8为纯化的ALV-A gp85蛋白能结合细胞受体Tva结合的结果；
其中，ALV-A gp85+pTva：为孵育ALV-A gp85蛋白和pCAF-pTva(带有flag 标签)；pTva only：为仅孵育pCAF-pTva(带有flag标签)；ALV-A gp85 only：为 仅孵育ALV-A gp85蛋白；NC组：为不处理对照组。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会 随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任 何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对 本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明 的保护范围内。
实施例1稳定表达ALV-A gp85蛋白细胞系的构建
1材料方法
1.1试剂及仪器
DMEM高糖培养基购于TRANSGEN公司；293CD 293M无血清培养 基购于上海源培生物科技公司；胎牛血清购于EXCELL公司；DH 5α感受态大肠 杆菌、真核表达载体pLVX、293T细胞、293F细胞株由本实验室保存；限制性内 切酶BamH I与Xho I购于Thermo公司；T4连接酶，购于NEB公司。
1.2真核表达载体的构建及慢病毒的包装
为了能得到高效表达的ALV-A gp85蛋白，本发明发明人选取RAV-1(ALV-A) gp85基因第1-1020bp的序列，进行密码子优化并合成，优化后的ALV-A gp85基 因序列如SEQ IDNO.1所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。优化后的 序列上游添加信号肽序列，下游携带His标签。序列两端分别为BamHⅠ和Xho Ⅰ两个酶切位点。将此序列双酶切后，胶回收，酶切产物用T4连接酶连接到同 样经BamHⅠ和XhoⅠ酶切的慢病毒表达载体pLVX，构建重组质粒 pLVX-A-Tgp85。将构建的重组质粒加入至DH 5α感受态细胞悬液中，轻轻涡旋 离心管混匀，冰浴放置30min，置于42℃水浴90s，然后快速置于冰上冰浴2min， 加入无抗LB培养基，220r·min-1，37℃培养1h。将转化的产物涂布于含卡那霉 素的LB琼脂平板上进行筛选培养，挑选单克隆，并进行扩增培养。提取质粒， 用限制性内切酶BamH I与Xho I将质粒双酶切后，挑取阳性克隆进行测序，最 终获得重组质粒分别命名为pLVX-A-gp85。
293T细胞在含10％胎牛血清的DMEM培养基中，于37℃和5％CO2饱和湿 度的培养箱中培养。待细胞生长至80％～90％密度，用0.2％的胰蛋白酶消化传代。 细胞接种于6孔板，待细胞长至85％密度时，将0.1％PEI、质粒pLVX-A-gp85 按照3：1的比例加入到无血清培养基中，混合后室温孵育15min，转染293T细 胞，继续培养细胞48h后，荧光显微镜下观察绿色荧光在细胞的表达与分布，收 集细胞上清作为包装好的病毒液。
1.3稳定表达ALV-A gp85 293F细胞系的构建、目的蛋白的表达纯化鉴定
293F细胞在无血清、2％青链霉素混合液、1％谷氨酰胺293M无血清培养基 中，于37℃和5％CO2饱和湿度的摇床培养箱中培养。加入包装好的病毒液至293F 细胞中继续培养，每隔12h，荧光显微镜下观察绿色荧光信号在细胞的表达与分 布，观察至细胞的荧光率不再升高，使用超高速流式分选仪分选表达绿色荧光蛋 白的细胞。分选得到的293F细胞放入培养摇瓶继续培养。收集稳定转染 pLVX-A-gp85质粒的分选后的293F细胞上清，加入Ni-resin树脂，4℃结合12h 之后进行纯化。将收集到的洗脱液进行SDS-PAGE凝胶电泳，转NC膜，转膜后 用PBST洗膜3次(每次5min)，将膜在5％脱脂乳中封闭1.5h，之后PBST洗膜5 次(每次5min)。His单抗1：3000PBS稀释为30ml，室温孵育1.5h，用PBS 洗膜5次(每次5min)。加入对应二抗室温孵育1h后，用PBS洗膜5次(每次5min)。 采用Odyssey扫描仪扫描结果。
1.4稳定表达ALV-A gp85 293F细胞系遗传稳定性检测
将分选后的稳定表达细胞系连续传代至15代，分别检测5、10、15代稳定 表达细胞系表达GFP的阳性率，收集5、10、15代稳定表达细胞系培养上清，进 行SDS-PAGE凝胶电泳检测gp85蛋白表达情况。
2.结果
2.1真核表达质粒pLVX-A-gp85鉴定
pLVX-A-gp85质粒经BamH I和Xho I双酶切，琼脂糖凝胶电泳结果显示， 得到约1.1kd目的片段，与预期大小相符合。将阳性克隆测序，结果与实验室已 存质粒序列相符，说明质粒pLVX-A-gp85构建成功。
2.2表达ALV-A gp85慢病毒的包装与鉴定
将pLVX-A-gp85质粒转染293T细胞，48h时在倒置荧光显微镜下观察，发 现绿色荧光显著，证明慢病毒包装成功(图1)。
2.3稳定表达ALV-A gp85蛋白细胞系构建与鉴定
将包装好的慢病毒感染293F细胞后，24h出现荧光，48h时荧光阳性率在30％ 左右，72h荧光阳性率达到50％左右(图2)。细胞经过流式细胞术分选后，绿色 荧光阳性率达到85％(图3)。收集细胞培养上清，Western Blot和SDS-PAGE电 泳检测纯化产物表明，细胞系可以高效表达ALV-A gp85蛋白，表达量可达25mg/L (图4)，这些结果表明，稳定表达ALV-A gp85的293F细胞系构建成功。
2.4稳定表达ALV-A gp85蛋白细胞系的遗传稳定性
稳定表达细胞系连续传代后，5、10、15代表绿色荧光阳性率在85％以上(图 5)，将5、10、15代稳定表达细胞系上清进行SDS-PAGE凝胶电泳，结果表明5、 10、15代稳定表达细胞系可以稳定表达ALV-A gp85蛋白(图6)，这些结果表明， 稳定表达ALV-A gp85的293F细胞系遗传稳定性良好。
将本发明获得的稳定表达ALV-A gp85蛋白的细胞系，命名为293F-Agp85， 分类命名为表达A亚群禽白血病病毒gp85的293F稳定表达细胞系，该细胞系保 藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰 西路1号院3号中国科学院微生物研究所，其菌种保藏编号为CGMCC NO.17420， 保藏时间为2019年3月28日。
实施例2 ALV-A gp85蛋白的应用
1、方法
1.1 ALV-A gp85与细胞受体Tva相互作用试验
Pull-down试验：分别将稳定表达ALV-A gp85 293F细胞系(CGMCC NO.17420)表达纯化出的ALV-A-gp85蛋白以及可溶性表达的Tva蛋白测定浓度。 以等浓度等体积混合ALV-A gp85、可溶性表达的Tva蛋白(各500μg)。并设置 单独蛋白对照组，每管加入40μl NiSepharose以及80μl Binding Buffer(去除非 特异性结合)，4℃轻柔旋转孵育4～6h；4500rpm离心2min，弃上清；然后加入 800μl含有蛋白酶抑制剂且预冷的PBS，上下轻柔地颠倒EP管数次，洗涤Beads， 洗涤后4500rpm离心2min收集沉淀；重复以上步骤3次，共洗涤4次Beads。 最后加入40μl的2X蛋白上样缓冲液，100℃煮沸10min，进行Western Blot鉴 定。
1.2 ALV-A gp85与细胞受体Tva结合试验
利用流式细胞术(FACS)检测稳定表达细胞系表达的ALV-A gp85蛋白与其 细胞受体Tva的结合情况。将跨膜表达Tva的质粒pCAF-pTva(带有flag标签) 转染至293T细胞，24h后消化下细胞，用FACS Buffer(含有1％FBS的PBS) 悬起，计数约2×106个细胞为一组，取500μL浓度为200μg/mL的稳定表达细胞 系表达的ALV-A gp85蛋白于冰上孵育，空白对照组和单染组用等量PBS孵育。 此后再依次孵育抗His标签抗体(1：200稀释)、IgG-FITC、Flag抗体、IgG-TRITC， 样品制备完成后转移至流式管中，进行流式细胞仪检测。
2.结果
2.1稳定表达细胞系表达的ALV-A gp85蛋白能与细胞受体Tva相互作用
Pull-down试验结果表明，稳定表达细胞系表达的ALV-A gp85蛋白与可溶性 表达的Tva蛋白存在相互作用(图7)。
2.2稳定表达细胞系表达的ALV-A gp85蛋白能结合细胞受体Tva
为了鉴定由稳定表达ALV-A gp85的293F细胞系表达、纯化获得的gp85蛋 白的功能，将纯化的ALV-A gp85蛋白进行与细胞受体结合实验，结果显示：纯 化的ALV-A gp85蛋白能与细胞受体Tva特异性结合，而其他对照组均不能结合 (图8)。
通过与细胞受体Tva互作和结合试验结果表明，通过稳定表达的方式制备的 ALV-A gp85蛋白具有正常的生物学活性，能够与细胞受体正常结合，并没有影响 其生物学活性，且由于其表达量高，不需要转染，成本低，具有良好的应用前景 和意义。
序列表
<110> 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心）
<120> 一株稳定表达A亚群禽白血病病毒 gp85 蛋白的细胞系及应用
<130> KLPI190318
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1020
<212> DNA
<213> ALV-A gp85
<400> 1
gacgtgcacc tgctggagca gccaggcaac ctgtggatca cctgggcaag caggacagga 60
cagaccgatt tttgcctgtc cacacagtct gccaccagcc ccttccagac atgtctgatc 120
ggcatccctt ccccaatctc tgaggacgac ttcaagggct acgtgtccga caccaattgc 180
gccacatctg agaccgatcg gctggtgagc tccgccgact tcacaggagg acctgataac 240
agcaccacac tgacctatag aaaggtgtcc tgtctgctgc tgaagctgaa tgtttctatg 300
tgggatgagc cacctgaact acagctgtta ggttcccagt ctctccctaa cattactaat 360
attactcaga tctccggtgt aaccggggga tgcgtaggct tcaggccaaa aggggttcct 420
tggtatctgg gttggtctag acaggaagcc acgcggtttc tccttagacg cccctctttc 480
tctaactcct gcaagccttt cacagtggtg accgccgata ggcacaatct gtttacaggc 540
tctgagtatt gtggcgccta cggctatcgc ttctggaaca tctacaattg cagccaagtg 600
ggccagcagt atagatgtgg caacgcaagg cgccccaggc ctggacaccc agagacacag 660
tgcaccagga gaggcggcaa gtgggtgaac caatcacgga aaattaatga gacagagccg 720
ttcagcttta cggtaacctg tacagctagt aatttgggta atgtgagcgg ctgctgtggc 780
aaggccggca tgatcctgcc tggcatctgg gtggacagca cacagggctc ctttaccaag 840
ccaaaggccc tgccacccgc catcttcctg atctgcggcg atagggcatg gcagggaatt 900
cctagtcgtc cggtaggggg cccctgctat ttgggcaagc ttaccatgtt ggcccccaac 960
cacaccgaca tcctgaagat cctggccaat tcctctcaga ccggcatcag gcgcaagcgg 1020
<210> 2
<211> 340
<212> PRT
<213> ALV-A gp85
<400> 2
Asp Val His Leu Leu Glu Gln Pro Gly Asn Leu Trp Ile Thr Trp 15
Ala Ser Arg Thr Gly Gln Thr Asp Phe Cys Leu Ser Thr Gln Ser 30
Ala Thr Ser Pro Phe Gln Thr Cys Leu Ile Gly Ile Pro Ser Pro 45
Ile Ser Glu Asp Asp Phe Lys Gly Tyr Val Ser Asp Thr Asn Cys 60
Ala Thr Ser Glu Thr Asp Arg Leu Val Ser Ser Ala Asp Phe Thr 75
Gly Gly Pro Asp Asn Ser Thr Thr Leu Thr Tyr Arg Lys Val Ser 90
Cys Leu Leu Leu Lys Leu Asn Val Ser Met Trp Asp Glu Pro Pro 105
Glu Leu Gln Leu Leu Gly Ser Gln Ser Leu Pro Asn Ile Thr Asn 120
Ile Thr Gln Ile Ser Gly Val Thr Gly Gly Cys Val Gly Phe Arg 135
Pro Lys Gly Val Pro Trp Tyr Leu Gly Trp Ser Arg Gln Glu Ala 150
Thr Arg Phe Leu Leu Arg Arg Pro Ser Phe Ser Asn Ser Cys Lys 165
Pro Phe Thr Val Val Thr Ala Asp Arg His Asn Leu Phe Thr Gly 180
Ser Glu Tyr Cys Gly Ala Tyr Gly Tyr Arg Phe Trp Asn Ile Tyr 195
Asn Cys Ser Gln Val Gly Gln Gln Tyr Arg Cys Gly Asn Ala Arg 210
Arg Pro Arg Pro Gly His Pro Glu Thr Gln Cys Thr Arg Arg Gly 225
Gly Lys Trp Val Asn Gln Ser Arg Lys Ile Asn Glu Thr Glu Pro 240
Phe Ser Phe Thr Val Thr Cys Thr Ala Ser Asn Leu Gly Asn Val 255
Ser Gly Cys Cys Gly Lys Ala Gly Met Ile Leu Pro Gly Ile Trp 270
Val Asp Ser Thr Gln Gly Ser Phe Thr Lys Pro Lys Ala Leu Pro 285
Pro Ala Ile Phe Leu Ile Cys Gly Asp Arg Ala Trp Gln Gly Ile 300
Pro Ser Arg Pro Val Gly Gly Pro Cys Tyr Leu Gly Lys Leu Thr 315
Met Leu Ala Pro Asn His Thr Asp Ile Leu Lys Ile Leu Ala Asn 330
Ser Ser Gln Thr Gly Ile Arg Arg Lys Arg 340

Claims (4)

1.稳定表达A亚群禽白血病病毒gp85蛋白的细胞系，命名为293F-Agp85，该细胞系保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为CGMCC NO.17420。
2.权利要求1所述的细胞系在制备A亚群禽白血病病毒gp85蛋白中的应用。
3.由权利要求1所述的细胞系表达获得的A亚群禽白血病病毒gp85蛋白。
4.权利要求3所述的A亚群禽白血病病毒gp85蛋白在制备检测A亚群禽白血病病毒抗体试剂中的用途。
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