CN103614329A - 一种j亚群禽白血病dna疫苗的构建及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种J亚群禽白血病DNA疫苗的构建及应用；本发明构建了表达鸡免疫球蛋白G的Fc片段基因和J亚群禽白血病病毒囊膜蛋白（env蛋白）基因的重组真核表达质粒pcDNA3.1-Fc-env。通过瞬时转染及间接免疫荧光试验，证实pcDNA3.1-Fc-env能够在293T细胞中正确表达。大量提取质粒，质粒纯化定量到1mg/ml，然后将重组质粒免疫小鼠，每只100ug，免疫三次，每次间隔两周。通过检测血清中ALV-J env蛋白特异性抗体水平；显示pcDNA3.1-Fc-env具有预防J亚群禽白血病的作用。

Description

一种J亚群禽白血病DNA疫苗的构建及应用

一、技术领域

本发明涉及一种J亚群禽白血病DNA疫苗的构建及应用，属于兽用核酸疫苗领域。 

二、背景技术

J亚群禽白血病病毒（Avian Leukosis virus subgroup J,ALV-J）是1988年首次从大不列颠白羽肉鸡中分离得到的一种禽白血病病毒新的亚群，主要引发白羽肉鸡的髓细胞组织增生和肿瘤。ALV-J与A、B亚群一样，属于外源性禽白血病病毒，在鸡体内既能垂直传播也能水平传播，且J亚群水平传播的速度远远高于A、B亚群病毒，该病已迅速蔓延到许多国家，使养鸡业面临一个严重问题。 

在我国，ALV-J随着引进的白羽肉种鸡带进了我国白羽肉鸡群。在1999年，从市场上的商品代肉鸡中首次分离检测到ALV-J，最早的毒株分别定名为SD9901、SD9902和YZ9901、YZ9902。后来又不断从其他不同的省份分离到ALV-J。随后，ALV-J又进一步传入到我国自主培育的黄羽肉鸡、固有型地方品种鸡及蛋用型鸡。ALV-J不仅给我国规模养鸡业带来很大损失，也威胁到我国历史上形成的地方鸡品种的种质资源库^[1-3]。 

目前ALV-J的防治没有商品化的疫苗，主要依靠净化种鸡群的办法来控制和清除ALV-J。由于养殖环境已被污染，完全实施净化是艰难和不可能完全实现的。早在20年前，欧美国家就有学者研制鸡ALV疫苗，但没有成功。Brumester等人曾经尝试研制ALV灭活疫苗，但是发现在灭活病毒的同时，也会使疫苗的免疫原性几乎随之丧失，不致病性的ALV弱毒活疫苗的研制也宣告失败。国外随着ALV在商品化鸡群中被基本净化，就不再做ALV疫苗的研究了。目前已经证实使用重组的ALV作为疫苗清除或降低ALV感染是可行的。通过表达ALV-A和ALV-J的重组囊膜糖蛋白作为免疫原的亚单位疫苗可作为潜在的疫苗，用于防止ALV的水平传播。近年来，崔志中等分别实验了A、B、J亚群ALV感染细胞的灭火疫苗及病毒中和反应相关的gp85亚单位疫苗的免疫效果。结果表明，机体对不同亚群ALV灭活疫苗或亚单位疫苗的免疫反应性都很差，但经过重复免疫后，还能够诱发一定水平抗体的形成，而且有助于缩短攻毒后病毒血症的持续期^[4]。 

env蛋白是ALV三个主要结构蛋白之一，是病毒的囊膜蛋白。env蛋白在与宿主细胞表面的特异性受体结合，是病毒进入宿主细胞复制，诱导肿瘤发生的必须条件，所以从病毒感染细胞、复制和表达以及肿瘤发生的整个过程来看，env蛋白在ALV的致病、致瘤中具有非常重要的作用^[5]。因此我们选择env蛋白作为核酸疫苗的靶基因。 

核酸疫苗是20世纪90年代后发展起来的新型疫苗之一，具有制备方便、免疫力持久、副作用少并能诱导T细胞和B细胞介导的细胞核体液免疫等优点，但是该疫苗存在产生抗体 慢、水平低的缺点，需要有效的佐剂进行克服。目前ALV-J DNA疫苗的开发还未见报道。 

抗体是一个呈“Y”形的蛋白，Y的上面与抗原表位结合，下面的那一竖又叫Fc，即可结晶片段。在巨噬细胞、树突状细胞等细胞表面具有免疫球蛋白G的Fc片段受体。Fc与Fc受体结合，可以让巨噬细胞吞噬被抗体结合的抗原^[6]。 

本专利就是利用抗体Fc基因表达产物作为分子佐剂，增强env蛋白基因疫苗的免疫效果。 

三、发明内容:

为了解决上述问题，本发明提供了一种J亚群禽白血病DNA疫苗的构建及应用；构建了表达鸡免疫球蛋白G的Fc片段基因和J亚群禽白血病病毒囊膜蛋白（env蛋白）基因的重组真核表达质粒pcDNA3.1-Fc-env。通过瞬时转染及间接免疫荧光试验，证实pcDNA3.1-Fc-env能够在293T细胞中正确表达。大量提取质粒，质粒纯化定量到1mg/ml，然后将重组质粒免疫小鼠，每只100ug，免疫三次，每次间隔两周。在每次免疫一周后小鼠尾部采血，分离血清，检测血清中ALV-J env蛋白特异性抗体水平。结果显示pcDNA3.1-Fc-env能够诱导小鼠产生较高水平的抗体。且随着免疫次数的增加不断上升，与空白对照组差异显著。综上，pcDNA3.1-Fc-env具有预防J亚群禽白血病的作用。 

具体的，本发明包括以下各项内容： 

1、一种J亚群禽白血病DNA疫苗，所述J亚群禽白血病DNA疫苗是包含编码鸡免疫球蛋白G的Fc片段基因和J亚群禽白血病病毒囊膜蛋白（env蛋白）基因的重组真核表达质粒。 

2、所述鸡免疫球蛋白G的Fc片段基因序列如SEQ ID NO.1所示。 

3、所述J亚群禽白血病病毒囊膜蛋白（env蛋白）基因序列如SEQ ID NO.2所示。 

4、具有如SEQ ID NO.3所示的序列重组真核表达质粒用作预防J亚群禽白血病DNA疫苗的作用。 

一种J亚群禽白血病DNA疫苗的制备过程，包括以下步骤： 

1、鸡IgG-Fc基因克隆 

根据NCBI已发表的鸡IgG重链序列（X07174.1），设计引物，在上游引物中加入EcoR I酶切位点和ATG起始密码子，下游引物去除终止子，通过RT-PCR方法得到鸡IgG-Fc基因； 

2、ALV-J env基因的克隆 

按照ALV-J env基因设计引物，上游引物中加入与IgG Fc段互补序列，下游引物中加入Xba I酶切位点，克隆得到ALV-J env基因； 

3、Fc-env融合基因的扩增 

将鸡IgG-Fc基因和ALV-env基因核酸分别做1000倍稀释，作为反应的模板，以鸡IgG-Fc 上游引物和env下游引物作为一对引物进行重叠PCR；利用限制性内切酶EcoR I、Xba I酶切pcDNA3.1克隆载体；利用1%琼脂糖凝胶进行电泳，从胶上回收线形化的载体；利用限制性内切酶EcoR I、Xba I酶切重叠PCR产物(Fc-env)利用1%琼脂糖凝胶进行电泳，从胶上回收已切好的Fc-env DNA；将线形化的载体与回收的DNA片断用T4DNA连接酶连接过夜即完成重组真核表达质粒pcDNA3.1-Fc-env的构建。 

将pcDNA3.1-Fc-env转化大肠杆菌DH5α，即得到重组大肠埃希氏菌ALVFc（Escherichia coli）。已于2013年9月5日保存到中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏地址：北京市朝阳区北辰路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101；菌种保藏编号为：CGMCC NO:8136。 

本发明的有益效果： 

将pcDNA3.1-Fc-env肌肉注射小白鼠，可产生抗禽白血病病毒的特异性抗体和细胞免疫。 

四、附图说明

图1ALV-env基因、IgG Fc片段基因与pcDNA3.1载体构建的pcDNA3.1-Fc-env酶切鉴定结果：1是pcDNA3.1-Fc-env表达载体双酶切产物；M是DNA分子量标记8K DNA Marker。 

本图显示pcDNA3.1-Fc-env构建成功及酶切特性。 

图2间接免疫荧光检测pcDNA3.1-Fc-env转染293T细胞中的表达：A为pcDNA3.1-Fc-env转染的293T细胞；B为阴性对照 

本图显示pcDNA3.1-Fc-env可表达出重组Fc-env融合蛋白。 

图3Env蛋白特异性抗体检测结果 

本图说明pcDNA3.1-Fc-env可诱导抗禽白血病病毒Env特异性抗体。 

五、具体实施方式

实施例一：J亚群禽白血病DNA疫苗pcDNA3.1-Fc-env的制备 

（一）鸡IgG-Fc基因克隆及鉴定 

根据NCBI已发表的鸡IgG重链序列（X07174.1），设计引物，在上游引物中加入EcoR I酶切位点和ATG起始密码子，下游引物去除终止子，通过RT-PCR方法得到鸡IgG-Fc基因。 

1、鸡脾脏总RNA的提取 

1）称取适量大小的脾脏组织于1.5ml离心管中，加入500ulBuffer LY和10ulβ－巯基乙醇在振荡器上剧烈震荡2分钟。然后静置2分钟，将组织碎块沉在管底。 

2）将上清液倾倒入一个DNA间隙柱内，13000rpm两分钟，弃去DNA柱子（将溶液中的DNA滤去），保留下边收集管中的液体。 

3）在步骤2）收集管中的液体中加入收集液1/2体积的100%乙醇。 

4）将步骤3）中收集管中的混合溶液倒入一个RNA柱子里，13000rpm离心1分钟，弃去收集管中的液体和收集管，将RNA柱子放入一个新的收集管中。 

5）加入500ul Buffer RB到RNA柱子中，13000rpm离心1分钟，弃去流出液将RNA柱子重新放回收集管中。 

6）加入500ulRNA Wash Buffer到RNA柱子中，13000rpm离心1分钟，弃去流出液。 

7）重复步骤6一次，将RNA柱子打开盖子放进一个新的收集管中。 

8）13000rpm离心2分钟。将残存的乙醇去除干净对于下一步RNA的洗脱是至关重要的。 

9）将RNA柱子放到一个没有RNA酶的1.5ml的离心管中。加入50-100ulDEPC处理过的双蒸水，13000rpm离心1分钟。RNA保存于离心管中，-80℃储存备用。 

2、反转录反应 

按下列组份配制RT反应液（反应液配制在冰上进行） 

以步骤1.9）反应中提取的RNA为模板进行反转录反应，反应条件如下： 

37℃15min（反转录反应）85℃5sec（反转录酶的失活反应） 

2、鸡IgG-Fc基因扩增 

鸡IgG-Fc基因特异性引物: 

上游引物：5’CGGAATTCATGCACCCCTCCTCCTGCACCCCG3’（SEQ.ID.NO.4） 

下游引物：5’CGTGTTCCTGTAGACGCT3’（SEQ.ID.NO.5） 

PCR反应体系如下： 

PCR反应程序如下 

3、PCR产物胶回收纯化 

（1）在低电压下通过琼脂糖凝胶电泳将目的DNA片段与其它片段分开，在紫外灯下用洁净的刀片将含目的片段的琼脂糖凝胶块切下（尽可能将多余地琼脂糖去除），切碎放入1.5ml离心管中，称重。 

（2）按每100mg琼脂糖（如胶块不足100mg则用水补充至100mg）加300-600μL的比例加入Buffer B2。 

（3）将盛有目的条带的离心管置于50℃左右的水浴中溶胶，隔一段时间混匀一次，直到胶块完全溶化为均质透明的液体。 

（4）将溶化好的液体全部移入吸附柱，如果多于吸附柱的量，则多次上柱，8,000×g离心30sec。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一收集管中。 

（5）向吸附柱中加入500μL Wash Solution，9,000×g离心30sec。将收集管中的液体倒掉，吸附柱放回同一收集管中。 

（6）重复步骤5）一次。 

（7）将空吸附柱连同收集管离心机，9,000×g开盖离心1min。 

（8）在吸附膜中央加入15-40μL Elution Buffer（提前放入60℃水浴中预热），室温静置1-2min，9,000×g离心1min。将所得到的鸡IgG-Fc基因DNA溶液置于-20℃保存或用于后续试验。 

（二）ALV-J env基因的克隆 

按照ALV-J env基因设计引物，上游引物中加入与IgG Fc段互补序列，下游引物中加入 Xba I酶切位点，克隆得到ALV-J env基因。 

引物设计 

上游引物：5’AGCGTCTACAGGAACACGATGGAAGCCGTCATAAAGGC3’ 

         （SEQ.ID.NO.6） 

下游引物：5’GCTCTAGACAGCTGCTCCCTAATTCTATG3’（SEQ.ID.NO.7） 

PCR反应体系如下： 

PCR反应程序如下 

ALV-env基因DNA纯化步骤参照实施例一中纯化步骤。 

（三）Fc-env融合基因的扩增 

1、将实施例一和实施例二得到的已纯化的鸡IgG-Fc基因和ALV-env基因核酸分别做1000倍稀释，作为反应的模板，以鸡IgG-Fc上游引物（SEQ.ID.NO.4）和ALV-env下游引物（SEQ.ID.NO.7）作为一对引物进行重叠PCR。具体反应如下 

反应程序 

PCR反应程序如下 

然后将重叠PCR产物(Fc-env)纯化，-20℃保存。 

（四）pcDNA3.1-Fc-env重组载体的构建 

1、利用限制性内切酶EcoR I、Xba I酶切pcDNA3.1克隆载体。利用1%琼脂糖凝胶进行电泳，从胶上回收线形化的载体。 

2、利用限制性内切酶EcoR I、Xba I酶切重叠PCR产物(Fc-env)利用1%琼脂糖凝胶进行电泳，从胶上回收已切好的Fc-env DNA。 

将线形化的载体与回收的Fc-env DNA片断用T4DNA连接酶连接过夜。 

3、转化和增菌 

（1）取步骤2）所述连接产物10μL，在无菌条件下加到含有200μl大肠杆菌DH5α感受态细胞的1.5ml离心管中，轻轻吹打混匀，冰浴30min。 

（2）将离心管从冰浴上迅速放入42℃水浴中，计时热激90S，立即取出，再放冰浴上2-3min。 

（3）在无菌条件下，加液体LB培养基（蛋白胨10克、酵母提取物5克、氯化钠10克，加去离子水1升，高压蒸汽灭菌）800μl，在37℃摇床上（转速不超过225rpm）振荡培养1h。 

（4）取出1.5ml离心管，3000rpm室温离心3min，弃去800μL上清培养液，用灭菌吸头吹打混匀剩余的培养液和细胞沉淀，均匀涂布于含有100μg/mL（W/V）氨苄青霉素（Amp）的固体LB平板培养基上。 

（5）将LB平板培养基倒置于37℃温箱中培养12-16h。 

（6）挑取单菌落，接种到含10mL LB培养基（含100μg/m L Amp（W/V））的试管中，37℃震荡培养过夜，提取质粒后利用限制性内切酶coR I、Xba I酶切，利用1%琼脂糖凝胶进行电泳，见到2319bp和5500bp两条DNA片段，见图1。DNA序列测定，确认阅读框架正确，pcDNA3.1-Fc-env表达载体质粒构建成功。 

该含有pcDNA3.1-Fc-env的DH5α大肠杆菌命名为ALVFc,已保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号为：CGMCC NO:8136。 

（五）间接免疫荧光检测重组质粒在293T细胞中的正确表达 

1、真核表达载体的转染 

选择乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)作为转染试剂，计算质粒浓度，将PEI配制为浓度1.0μg/μL的原液，然后取9.0μL PEI原液加入250μL的DMEM培养基（市购，高糖），制成PEI使用液。将质粒pcDNA3.1-Fc-env在聚乙烯亚胺（Polyethylenimine，PEI）的作用下转染293T细胞(市购)，步骤如下： 

（1）在6孔细胞培养板中培养293-T细胞待细胞长满70%左右，备用； 

（2）取3μg pcDNA3.1-Fc-env质粒DNA加入到100μL的DMEM中，作为溶液A，取9μLPEI使用液加入100μLDMEM中，作为溶液B，将溶液A和溶液B混合，轻轻混匀，室温下孵育15～20min； 

（3）取适量的DMEM培养基缓缓洗涤步骤1）6孔细胞培养板培养的293-T单层细胞； 

（4）取200μL步骤2）制备的混合液加入800μLDMEM，轻轻摇匀，然后将摇匀的混合液加到经步骤3）洗涤过的六孔细胞培养板中，覆盖细胞，在含5%CO₂培养箱内37℃培养4-6h； 

（5）4-6h后每孔再加入1mL含有10%小牛血清的DMEM，继续在含浓度5%CO₂培养箱内37℃继续培养。 

（6）转染后48h将6孔细胞培养板中培养液弃掉，用0.1MPH7.0磷酸缓冲液（PBS）洗板2次后自然干燥，每孔加入1ml冷的丙酮进行固定30min，备用。 

2、IFA检测重组质粒瞬时表达 

间接免疫荧光实验检测细胞中重组质粒表达产物，具体操作步骤如下： 

（1）用6×HIS单克隆抗体（商品化试剂），按照抗体说明书将步骤1中固定好的细胞培养板用PBST洗涤3次；取6×HIS单抗，按1∶（V1/0V00）稀释，每孔加入300μL6×HIS单抗稀释液，将6孔细胞培养板置湿盒内37℃作用45min。 

（2）用PBST充分洗涤3次，每次5min，自然干燥。 

（3）取FITC标记的兔抗鼠IgG,按照说明书1∶100（V/V）加入PBST稀释，每孔加入300μL兔抗鼠IgG稀释液置湿盒内避光37℃作用45min。 

（4）用PBST充分洗涤3次，倒置荧光显微镜下观察有无荧光阳性细胞。如果有荧光阳性细胞，则表明重组质粒可以正常表达。检测结果见图2，说明pcDNA3.1-Fc-env可表达出重组Fc-ALV-env融合蛋白。 

实施例二DNA疫苗pcDNA3.1-Fc-env免疫效果的评估。 

1、重组质粒的大量提取 

（1）取实施例一构建的重组ALVFc大肠杆菌，接种150mlLB培养基，将过夜培养的重组大肠杆菌菌液，加入离心管中，10000rpm离心2～3分钟收集细菌，尽量吸弃全部上清。 

（2）按照DNA纯化商品试剂盒说明向留有菌体沉淀的离心管中加入12ml DNA纯化缓冲液Buffer P1(商品化DNA纯化试剂盒所含)，使用移液器或漩涡振荡器充分混匀，悬浮细菌沉淀。 

（3）向离心管中加入12ml Buffer P2(商品化DNA纯化试剂盒所含)，温和的上下颠倒混匀6-8次，使菌体充分裂解，室温放置3～5分钟。此时溶液应变的清亮粘稠。 

（4）向离心管中加入12ml Buffer E3(商品化DNA纯化试剂盒所含)，立即上下颠倒混匀6-8次，此时出现白色絮状沉淀，室温放置5分钟。10000rpm离心10分钟，将上清全部倒入除内毒素过滤器（Endo-Remover Filter）中，慢慢推动推柄过滤，滤液收集到干净的50ml离心管中。 

（5）向滤液中加入11ml异丙醇，上下颠倒混匀。 

（6）柱平衡：向已装入收集管(商品化DNA纯化试剂盒所含)中的吸附柱（Spin ColumnCX，商品化DNA纯化试剂盒所含）中加入2ml Buffer PS(商品化DNA纯化试剂盒所含)，10000rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。 

（7）将步骤5）中滤液与异丙醇的混合液转移到平衡好的吸附柱中。 

（8）6000-10000rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。 

（9）向吸附柱中加入10ml Buffer PW（商品化DNA纯化试剂盒所含），6000～10000rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液。 

（10）重复步骤9）； 

（11）将吸附柱重新放回收集管中，10000rpm离心5分钟，倒掉废液，将吸附柱置于室温干燥10分钟。 

（12）将吸附柱置于一个新的收集管中，向吸附膜中间部位加入1～3ml Endo-Free Buffer EB(商品化DNA纯化试剂盒)，室温放置2～5分钟，10000rpm离心五分钟，将质粒溶液收集到收集管中，即得到重组质粒pcDNA3.1-Fc-env，即禽白血病DNA疫苗，-20℃保存。 

2、免疫程序与标本采集 

取20只小鼠每组十只随机分成两组，一组注射DNA疫苗，另一组注射PcDNA3.1空载体作为对照；小鼠腿部肌肉注射，每只小鼠均为100ug。每隔两周免疫一次，共免疫三次，每次免疫一周后小鼠尾部采血，分离血清用ELISA试剂盒分别检测抗体水平含量。 

3、ALV-J env蛋白特异性抗体检测（市购小鼠ALV-J抗体检测ELISA试剂盒，按照说明书进行测定，具体方法如下） 

（1）样本制备：采集的血清用样本稀释液进行稀释200倍备用，阳性对照和阴性对照不稀释。 

（2）加样：点样空分为空白孔（不添加样品和酶标试剂）、阴性对照孔、双份阳性对照孔和待测样品孔，并做好标记。在待测样品孔中加入50μL200倍稀释的样本溶液。样品置于孔底并避免触及孔壁。 

（3）温育：使用封板膜封板，并于37℃条件下温育60min。 

（4）洗涤：温育后去掉孔中的液体并甩干，加入足量的洗涤液（10倍稀释的浓洗涤液），静置30s后，弃去溶液。反复5次洗涤，拍干。 

（5）加酶：除空白孔外，其他各孔均加入50μL酶标试剂。 

（6）温育：同3）。 

（7）洗涤：同4）。 

（8）显色：每孔先后加入50μL显色剂A和显色剂B，混匀，37℃条件下避光反应15min。 

（9）终止：加50μL终止液终止反应（蓝色立即转为黄色）。 

（10）测定：空白孔调零，在450nm波长条件下测定各反应孔溶液的OD值（确保在终止反应15min内完成测定）。 

免疫pcDNA3.1-Fc-env质粒的小鼠抗env抗体产生趋势见图2：抗体在免疫第二次后出现显著抗体水平，并且在第三次免疫后达到高峰，在第七周出现下降趋势；同时在第三、五、七周同一时期的抗体水平与对照组有显著性差异,见表1。该结果证明构建的pcDNA3.1-Fc-env质粒在体内表达了相应的蛋白，并且刺激机体产生了相应的抗体。 

表1小鼠血清中特异性抗体动态变化（*表示与空载体组在统计学上有明显差异） 

本发明构建的DNA疫苗（pcDNA3.1-Fc-env），通过免疫小鼠实验显示，该DNA疫苗能够刺激小鼠机体产生明显和持久的特异性中和抗体，可以作为ALV-J的新型的候选疫苗。 

Claims (2)

1.一株保藏号为CGMCC NO:8136的大肠埃希氏菌ALVFc，已于2013年9月5日保存到中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

2.如SEQ ID NO.3所示序列的重组真核表达质粒pcDNA3.1-Fc-env在预防J亚群禽白血病中的应用。

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