CN1437023A - 禽白血病病毒j亚群诊断试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明属于禽病毒检测诊断技术领域。J亚群禽白血病病毒(ALV－J)是90年代鉴定出的一个新的禽白血病病毒亚群，是肉鸡髓细胞瘤(ML)的病原。本发明用PCR方法扩增出ALV－J囊膜蛋白env基因，并进行克隆，然后用昆虫杆状病毒表达系统表达ALV－J env基因产物，以此重组基因产物作为免疫源免疫BALB/C小鼠，研制出特异性单克隆抗体。再以单克隆抗体研制出了独特酶联免疫试验检测试剂盒，以其检测感染鸡血清、脏器及羽囊中抗原抗体复合物，判定是否感染ALV－J。

Description

禽白血病病毒J亚群诊断试剂盒

一、技术领域

本发明属于禽病毒检测诊断技术领域。

二、背景技术

J亚群禽白血病病毒(ALV-J)是90年代鉴定出的一个新的禽白血病病毒亚群(Payne 1991)；是肉鸡髓细胞瘤(ML)的病原。十多年来，该病毒已迅速蔓延到许多国家，在英国(Payne 1991)、美国(Benson1998)、非洲(Aly 2000)、中美洲(Neumann 2000)、南美洲(Buscaglia2000)、澳大利亚(Bagust2000)、欧洲(Dren2000)、中国(秦爱建1999、2002)等国家地区都有相关病毒感染报道，使养鸡业面临一个严重的问题。目前对该病的诊断有直接ELISA、抗体检测、PCR和病毒分离等方法。直接ELISA检测的是病毒上的gp27蛋白，而gp27蛋白在外源性和内原性病毒中均存在。故直接ELISA不能直接区别病毒亚群。在ALV-J抗体检测中，目前国外有二个商品化的抗体诊断试剂盒，均以昆虫细胞表达产物为基础，但检测结果不尽相同，且鸡群中10％的阳性率被认为是正常的背景。故抗体阳性也不能告诉我们鸡群是否感染ALV-J病毒。PCR虽然具有较强的灵敏度，但是决定ALV-J亚群特异性的env-gp85基因变异迅速，而且env基因与在所有鸡系中都存在的内原性EAV-HP序列有75-97％的同源性(Smith1999)，故PCR常导致假阳性。病毒分离是诊断ALV-J的最经典、最可靠的方法，但是这种方法费时、费力、费钱；很繁琐，不易推广，不适合于田间大规模样品检测。

ALV-J是反转录病毒，其前病毒基因组DNA可整合到宿主细胞，与宿主细胞长期共存；而且ALV-J病毒既可水平传播，又可垂直传播。故ALV-J病毒在鸡体内引起持续性感染，鸡体产生的抗原抗体复合物，不象正常情况很快被血液中巨噬细胞和枯否细胞等构成的免疫系统清除掉，抗原抗体复合物可在血液中循环，并可在肾、肺、皮肤、关节或血管等组织中沉积，引起炎症，组织损伤。因此，检测ALV-J病毒抗原抗体复合物可以反应鸡体ALV-J的感染情况，是一种有效的诊断方法。

三、发明内容：

本发明的目的是利用酶联免疫吸附试验检测诊断鸡ALV-J的感染，应用于进出口种鸡的检验检疫，兽医站疾病的诊断，种鸡场ALV-J的检测与该病的根除等。

本发明的技术方案是：应用群特异性单克隆抗体制备检测ALV-JELISA试剂盒或试纸。其制备方法为应用ALV-J特异性单克隆抗体作包被抗体制备检测ALV-J试剂盒或试纸。具体步骤为：

1.ALV-J病毒的分离鉴定：采用鸡胚成纤维细胞分离培养，并通过免疫荧光技术鉴定。

2.用PCR方法扩增ALV-J囊膜蛋白env基因，并进行克隆。

3.用昆虫杆状病毒表达系统表达ALV-J env基因产物。

4.以重组基因产物作为免疫源免疫BALB/C小鼠，研制特异性单克隆抗体。

5.以单克隆抗体建立独特酶联免疫试验检测试剂盒或检测试纸。

6.检测试剂盒或检测试纸检测感染鸡血清、脏器及羽囊中抗原抗体复合物。

7.抗原抗体复合物阳性者判定为ALV-J感染。

本发明的效果：

利用该试剂盒检或检测试纸测血清、脏器、羽囊等样本中ALV-J的存在情况，其特异性强、灵敏性高、检测速度快、成本低廉。检出率达100％，比用细胞分离鉴定病毒快6-7天，与病毒分离和PCR检测结果的符合率大于90％。

四、具体实施方式方式1.1.抗ALV-J特异性单克隆抗体JE9包被96孔聚苯乙烯酶标板：

用0.02M pH9.6的碳酸盐缓冲液将单克隆抗体稀释为3.25ug/ml，包被96孔聚苯乙烯酶标板，每孔100ul，37℃温浴4hr；洗液(含0.05％Tween-20的0.01M pH7.4的磷酸盐缓冲液)洗涤3遍。2.抗体包被孔聚苯乙烯酶标板的封闭：

用封闭液(含50mM甘氨酸的0.01M pH7.4的磷酸盐缓冲液)于37℃下封闭1hr；洗液洗涤3遍干燥后即为反应板，置4℃或-20℃备用。3.样品处理：

1)血清样品1∶40稀释(稀释液为0.01M pH7.4的磷酸盐缓冲液，即PBS。)后直接作为加样稀释液。

2)内脏样品包括肝、脾、肾、胸腺等，处理如下：取0.10g内脏于400ulPBS中碾磨后，10000rpm离心5min，取上清1∶10稀释后直接作为加样稀释液。

3)羽囊样品处理如下：0.10g羽囊于400ul PBS中碾磨后，10000rpm离心5min，取上清1∶5稀释后作为加样稀释液。4.ELISA检测操作步骤：

1)将被待检样本加入包被有ALV-J特异性的单克隆抗体的96孔聚苯乙烯酶标板，每孔100ul，每个样加2孔，并设阳性样本、正常样本和空白对照；置37℃45min后，用洗液洗涤3遍；

2)每孔加酶标抗体(工作浓度)100ul；置37℃45min，用洗液洗涤5遍；

3)每孔加底物显色液100ul，室温避光显色30min后，每孔加100ul的终止液；

4)用酶标仪测定每孔的OD490值，OD490值超过0.20，且P/N≥2.1者判为阳性，否则为阴性。方式21.抗ALV-J特异性单克隆抗体JE9包被硝酸纤维素纸片：

将单克隆抗体JE9作适当稀释，直接点加硝酸纤维素纸片上；自然干燥后，洗液洗涤3遍。2.非特异性封闭：

将点加单克隆抗体的硝酸纤维素纸片，再以封闭液于37℃下封闭60min；洗液洗涤3遍，自然干燥后4℃保存。3.样品处理：

同试验方式14.检测操作步骤：1)将上述硝酸纤维素纸片放入待检样本中，置37℃30min后，用洗液洗涤3遍；2)将洗涤后的硝酸纤维素纸片放入金标记抗体溶液中；置37℃30min，用洗液洗涤5遍；3)出现条带的为阳性，否则为阴性。附试剂配方1稀释液：磷酸盐缓冲液PBS(pH：7.2)Nacl                                                  8gNa₂HPO₄12H₂O                                      2.9gKH₂PO4                                               0.2gKcl                                                   0.2g双蒸水                                                1000ml2封闭液脱脂乳                                                10gPBS(pH：7.2)                                          100ml3洗涤液Tween-20                                              0.5mlPBS(pH：7.2)                                          999.5ml4酶标抗体使用液HRP标记的兔抗鸡IgG抗体                                4ulPBS(pH：7.2)                                          10ml5底物显色液0.1M的柠檬酸(C₆H₆O₇.H₂O 10.5g，双蒸水500ml)      4.86ml0.2M磷酸氢二钠(Na₂HPO₄.12H₂O 71.6g，双蒸水1000ml) 5.14ml邻苯二胺                                              4mgH₂O₃                                                100ul6 2M的硫酸溶液98％浓H₂SO₄                                         21.7ml双蒸水                                                 178.3ml

Claims (5)

1.一种禽白血病病毒J亚群诊断试剂盒，其特征在于应用群特异性单克隆抗体制备检测ALV-J ELISA试剂盒；

2.一种禽自血病病毒J亚群诊断试剂盒的制备方法，其特征在于应用ALV-J特异性单克隆抗体作包被抗体制备检测ALV-J ELISA试剂盒；

3.一种禽白血病病毒J亚群诊断试纸，其特征在于应用群特异性单克隆抗体制备检测ALV-J检测试纸；

4.一种禽白血病病毒J亚群诊断试纸的制备方法，其特征在于其特征在于应用ALV-J特异性单克隆抗体作包被抗体制备检测ALV-J检测试纸；

5.根据权利要求1或权利要求3所述禽白血病病毒J亚群诊断试剂盒或试纸的应用，其特征在于可以检测感染鸡血清、脏器及羽囊中的ALV-J抗原。