CN109295012B - 一种表达alv-k囊膜蛋白的重组病毒的构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种构建表达ALV‑K囊膜蛋白的重组病毒方法,具体为:设计PCR扩增ALV‑J传染性克隆线性化表达载体引物以及PCR扩增ALV‑K‑env基因引物序列;PCR扩增ALV‑K囊膜蛋白基因片段和ALV‑J传染性克隆线性化载体,构建重组传染性克隆质粒,并将重组质粒转染DF‑1细胞拯救出表达ALV‑K囊膜蛋白的重组病毒。本发明利用ALV‑J传染性克隆,构建了高效复制及表达ALV‑K囊膜蛋白的重组病毒。这一重组病毒的获得不仅为研究ALV‑K囊膜蛋白功能受体及其致病性打下了基础,更能够为临床检测ALV‑K的中和抗体提供靶向病毒。

Description

一种表达ALV-K囊膜蛋白的重组病毒的构建方法
技术领域
本发明涉及一种构建表达ALV-K囊膜蛋白的重组病毒的方法。此发明不仅为研究ALV-K 囊膜蛋白功能受体及其致病性打下了基础,而且为临床检测ALV-K中和抗体提供了靶向病毒。因此,本发明具有一定应用价值。
背景技术
禽白血病病毒(Avian leukosis virus,ALV)是可引起禽类患多种肿瘤及免疫抑制性疾病的反转录病毒。根据其囊膜蛋白特征,该病毒可分为A-K共11个亚群。其中A,B,J亚群较为常见,且J亚群目前在国内最为常见。ALV-J感染主要造成鸡造血细胞恶性增生,引起髓细胞瘤、血管瘤及严重的免疫抑制,对国内外养禽业造成巨大经济损失。随着国内ALV净化工作的推进,鸡群ALV-J的感染及其发病率显著下降。ALV-K是近年来在国内地方品种鸡中分离鉴定出的新型禽白血病病毒。由于ALV-K病毒复制能力较弱,病毒蛋白表达水平较低,目前ALV通用检测试剂盒对其检测效果不是很好,且尚无商品化特异性ALV-K抗原及抗体检测试剂盒。
发明内容
本发明的目的是在于提供一种构建表达ALV-K囊膜蛋白的重组病毒方法。本发明的原理和最核心的关键技术是科学合理的设计引物,PCR扩增ALV-K囊膜蛋白基因片段和ALV-J 传染性克隆线性化载体,构建重组传染性克隆质粒,并将重组质粒转染DF-1细胞拯救出表达 ALV-K囊膜蛋白的重组病毒。本发明利用ALV-J传染性克隆,构建了高效复制及表达ALV-K 囊膜蛋白的重组病毒。这一重组病毒的获得不仅为研究ALV-K囊膜蛋白功能受体及其致病性打下了基础,更能够为临床检测ALV-K的中和抗体提供靶向病毒。
本发明公开了PCR扩增ALV-J传染性克隆线性化表达载体引物以及PCR扩增ALV-K-env 基因引物序列。本发明还公开了一种基于重组酶ExnaseTM II将线性化的ALV-J传染性克隆表达载体与ALV-K-env基因片段PCR产物不经酶切连接反应,直接重组克隆的技术;并通过转染DF-1细胞获得表达ALV-K囊膜蛋白的重组病毒,具体方案为:
(1)K亚群禽白血病病毒基因组的制备:首先将K亚群禽白血病病毒感染细胞后的上清经细胞裂解液裂解,随后用酚、氯仿、异戊醇进行病毒基因组抽提,最后用无水乙醇沉淀,溶于30uL灭菌超纯水,即得ALV-K前病毒DNA,置-20℃备用;
(2)PCR扩增ALV-K env基因片段和ALV-J传染性克隆线性化载体:首先设计出扩增ALV-K env基因的引物以及ALV-J传染性克隆线性化载体的引物;然后以ALV-J传染性克隆质粒以及ALV-K前病毒DNA为模板,利用相应引物分别PCR扩增出ALV-K-env和线性化的ALV-J 线性化载体。
(3)ALV-K-env-J重组表达载体的构建:利用重组酶ExnaseTMⅡ将线性化的ALV-J载体以及ALV-K env基因的PCR产物进行快速体外重组克隆,重组克隆经序列验证后,命名为 ALV-K-env-J传染性克隆质粒,并挑取阳性细菌菌液进行质粒制备。
(4)将ALV-K-env-J传染性克隆质粒转染DF-1细胞,六天后将部分上清继续在DF-1细胞上盲传3代。PCR检测盲传三代后提取的细胞基因组,以IFA及PCR方法检测盲传3代后的细胞上清,结果证明ALV-K-env-J传染性克隆病毒拯救成功。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
第二,该发明设计的引物及基于重组酶ExnaseTM II的克隆策略,可快速构建重组ALV 传染性克隆,并拯救出表达ALV-K囊膜蛋白的重组病毒。本发明可提供一种高效扩增具有 ALV-K囊膜蛋白抗原的病毒,不仅为研究ALV-K囊膜蛋白功能受体及其致病性打下了基础,更能够为临床检测ALV-K的中和抗体提供靶向病毒,加快ALV的净化进程,在ALV净化检测中具有一定应用价值。
附图说明
图1PCR扩增ALV-K env基因片段和ALV-J传染性克隆S2线性化载体图;
图1中:泳道M,DNA Marker;泳道1,ALV-K env基因片段的PCR产物;泳道3,ALV-J传染性克隆S2线性化载体的PCR产物。
图2PCR检测拯救出的重组病毒ALV-K-env-J图;
图2中:泳道M,DNA Marker;泳道1,ALV-K-env-J重组病毒;泳道2,阴性对照;泳道3, ALV-K阳性对照。
图3A是IFA检测拯救出的重组病毒ALV-K-env-J重组病毒图;
图3B是IFA检测拯救出的ALV-J病毒图;
图3C是IFA检测阴性对照图;
图4重组病毒ALV-K-env-J在DF-1细胞中的生长曲线图。
具体实施方式
下面将通过附图和具体实施方法对本发明做进一步的具体描述,但不能理解为是对本发明保护范围的限定。
实施例
(1)ALV-K前病毒DNA的制备:
取ALV-K感染细胞后的上清400uL于1.5mL指形管内,加入400uL细胞裂解液(50mmol/L Tris-HCl pH=8.0,20mmol/L EDTApH=8.0,2%SDS和蛋白酶K),充分混匀后放置56℃水浴锅作用4h;加入400uL Tris平衡酚,充分混匀后10000rpm离心10min,取上清于另一1.5mL 指形管;加入400uL酚:氯仿:异戊醇,充分混匀后10000rpm离心5min,取上清于另一1.5mL 指形管;加入800uL无水乙醇,颠倒混匀后放入-20℃孵育30分钟,12000rpm离心15分钟,弃尽上清;室温自然干燥后向沉淀加入30uL灭菌超纯水和2uL RNA酶,充分溶解后即得 ALV-K前病毒DNA,置-20℃备用。
(2)PCR扩增ALV-K env基因片段和ALV-J传染性克隆线性化载体:
设计扩增出含ALV-J传染性克隆线性化载体与ALV-K env基因片段的引物:扩增ALV-J 传染性克隆线性化载体的上游引物位于J1质粒7010-7039位;扩增ALV-J传染性克隆线性化载体的下游引物位于J1质粒5292-5320位。扩增ALV-K env基因上游引物位于ALV-K基因组5253-5274位,且在5’端带有15个与ALV-J传染性克隆线性化载体下游引物反向互补碱基;扩增ALV-K env基因下游引物位于ALV-K基因组7020-7040位,且在5’端带有15个与ALV-J 传染性克隆线性化载体上游引物反向互补碱基。具体引物序列见附表1,由苏州金唯智生物科技有限公司合成。
表1.PCR扩增ALV-J线性化载体及ALV-K env基因的引物
Figure RE-GDA0001892130410000031
分别以ALV-J传染性克隆S2以及步骤(1)制备的K亚群禽白血病病毒基因组为模板,表1所述相应引物分别进行PCR,扩增出线性化的S2-linear载体以及ALV-K-env基因序列。 PCR扩增反应体系为:模板2uL,5×Buffer 10uL,10mM dNTP Mix 1uL,上游引物为10μmol 2uL,下游引物为10μmol 2uL,高保真酶1uL,加入灭菌超纯水至50uL。PCR扩增反应循环参数为:95℃预变性4min,随后进行30个循环(95℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸4min30s/1min),72℃延伸10min。PCR结束后,产物在1%的琼脂糖凝胶中进行电泳分析(如图1所示)。
(3)ALV-K-env-J重组表达载体的构建:
将(2)中纯化的线性化载体ALV-J以及ALV-K env基因片段PCR产物在商品化重组酶 ExnaseTMⅡ的作用下进行重组克隆。重组克隆经序列验证后,命名为 pMD19T-simple-ALV-K-env-J。具体重组反应体系如下:纯化的ALV-K env基因片段PCR产物50-100ng,纯化的ALV-J线性化载体170ng,2μL商品化的ExnaseTMⅡ酶,4uL 5×CEⅡ Buffer,其它补加水至20μL。反应产物于37℃作用30分钟后,置冰上5min。随后将20μL 反应产物转化到感受态细胞DH5α并涂LB平板。次日挑取细菌克隆进行质粒制备,阳性克隆鉴定。
(4)重组病毒拯救
将DF-1细胞接种于十二孔板,当汇合度为约70%时,将pMD19T-simple-ALV-K-env-J 传染性克隆质粒和ALV-J传染性克隆质粒分别转染十二孔板中的DF-1细胞,留一孔细胞作为阴性对照。每孔2μg质粒,37℃6h后换为含1%胎牛血清的DMEM培养基。维持6天后各取1ml上清接种于另一铺有DF-1的十二孔板,以相同方法继续盲传2代,并收取P2代、 P3代细胞上清冻于-80℃留做检测。
(5)PCR检测拯救出的重组病毒ALV-K-env-J
在收取P3代细胞上清后,以Axygen基因组提取试剂盒提取细胞基因组作为模板,表1②与表2中所述引物分别进行PCR,检测重组病毒是否拯救成功以及是否单一。PCR反应体系为:模板2uL,5×Buffer 10uL,10mM dNTP Mix 1uL,上游引物为10μmol 2uL,下游引物为 10μmol 2uL,高保真酶1uL,加入灭菌超纯水至50uL;2×Taq 10uL,灭菌超纯水6uL,上游引物1uL,下游引物1uL,模板2uL。PCR扩增反应循环参数为:95℃预变性4min,随后进行30个循环(95℃变性30s,55℃/58℃退火30s,72℃延伸1min/45s),72℃延伸10min。 PCR结束后,产物在1%的琼脂糖凝胶中进行电泳分析。结果如图2、3A、3B、3C所示: ALV-K-env-J传染性克隆病毒基因组作为模板PCR只扩增出K-env片段并且无其他亚群的 ALV的核酸。
(6)IFA检测拯救出的重组病毒ALV-K-env-J
以IFA方法检测盲传3代后的ALV-K-env-J拯救病毒和ALV-J传染性克隆S2病毒的细胞上清:将DF-1细胞接种于96孔板,当汇合度约为70%时,接种病毒,维持5天后,将细胞用50μl丙酮:乙醇比例为3:2的固定液固定5分钟,干燥;将50μl 1:150稀释的抗J亚群禽白血病病毒P27单克隆抗体5D3为一抗与固定好的细胞于37℃孵育45分钟,弃去所有液体,以200μl PBS洗3遍;加入50μl 1:150稀释的FITC标记的羊抗鼠IgG为二抗于37℃孵育45分钟,弃去所有液体,以200μl PBS洗3遍,加入30μl PBS,于倒置荧光显微镜下进行观察。结果如图4所示,ALV-K-env-J传染性克隆病毒组可见特异性的绿色荧光,表明重组病毒拯救成功。
(7)重组病毒ALV-K-env-J生长曲线
将DF-1铺于六孔板,当汇合度约70%时,按MOI=0.01分别接种ALV-K-env-J拯救病毒和ALV-J传染性克隆S2病毒,各做两个重复。24h后收取细胞上清200μL并补充200μL含1%胎牛血清的维持液,此后连续6天以同样方法定时收取并补充,上清冻存于-80℃冰箱备用。将ALV-K-env-J传染性克隆病毒与ALV-J传染性克隆S2病毒各自收取的7个时间点的细胞上清通过Reed-Muench法测定TCID50;利用GraphPad Prism 5软件绘制病毒生长曲线。结果如图4所示:ALV-K-env-J传染性克隆病毒与ALV-J传染性克隆S2病毒相比,其生长速度远快于ALV-J拯救病毒。
<110>扬州大学
<120>一种表达ALV-K囊膜蛋白的重组病毒的构建方法
<160>4
SEQ ID NO.1
<210>1
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
TAGGTTCCGA ACGCGATGTA ACGGGGCAAG 30
SEQ ID NO.2
<210>2
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
CTGCAAAGAG AGGGCTCGCC TCATCCTTC 29
SEQ ID NO.3
<210>3
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
GCCCTCTCTT TGCAGGCATT TCTGACTGGA TATCCTG 37
SEQ ID NO.4
<210>4
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
CGCGTTCGGA ACCTACACTG TTCCATTTTC GGGCTG 36

Claims (2)

1.一种表达ALV-K囊膜蛋白的重组病毒的构建方法,其特征在于,所述构建方法包括以下步骤:
1)利用引物1,以ALV-J传染性克隆质粒为模板, PCR扩增出ALV-J传染性克隆线性化表达载体;所述引物1为:
ALV-J-linear-F:TAGGTTCCGAACGCGATGTAACGGGGCAAG;
ALV-J-linear-R:CTGCAAAGAGAGGGCTCGCCTCATCCTTC;
2)利用引物2,以ALV-K前病毒DNA为模板,PCR扩增出ALV-K囊膜蛋白基因;所述引物2为:
ALV-K-env-F: GCCCTCTCTTTGCAGGCATTTCTGACTGGATATCCTG;
ALV-K-env-R:CGCGTTCGGAACCTACACTGTTCCATTTTCGGGCTG;
3)利用重组酶ExnaseTM II对步骤1)和2)得到的PCR产物进行快速重组克隆;阳性克隆转染DF-1细胞拯救出表达ALV-K囊膜蛋白的重组病毒;
所述步骤(1)与步骤(2)中的PCR扩增反应体系均为:模板2uL,5×Buffer 10uL,10mMdNTP Mix 1uL,上游引物为10μmol 2uL,下游引物为10μmol 2uL,高保真酶1uL,加入灭菌超纯水至50uL;
述步骤(1)与步骤(2)中的PCR扩增反应循环参数均为:95℃预变性4min;随后进行30个循环,95℃变性30s,55℃退火30s,72℃ 延伸4min 30s/1min;72℃延伸10min;
所述步骤(1)与步骤(2)PCR扩增反应结束后,产物在1%的琼脂糖凝胶中进行电泳分析。
2.根据权利要求1所述的一种表达ALV-K囊膜蛋白的重组病毒的构建方法,其特征在于,所述具体重组反应体系如下:纯化的ALV-K env基因片段PCR产物50-100ng,纯化的ALV-J线性化载体170ng,2μL商品化的ExnaseTM Ⅱ酶,4uL 5×CE Ⅱ Buffer,其它补加水至20μL。
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