CN109295012B - 一种表达alv-k囊膜蛋白的重组病毒的构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种构建表达ALV‑K囊膜蛋白的重组病毒方法，具体为：设计PCR扩增ALV‑J传染性克隆线性化表达载体引物以及PCR扩增ALV‑K‑env基因引物序列；PCR扩增ALV‑K囊膜蛋白基因片段和ALV‑J传染性克隆线性化载体，构建重组传染性克隆质粒，并将重组质粒转染DF‑1细胞拯救出表达ALV‑K囊膜蛋白的重组病毒。本发明利用ALV‑J传染性克隆，构建了高效复制及表达ALV‑K囊膜蛋白的重组病毒。这一重组病毒的获得不仅为研究ALV‑K囊膜蛋白功能受体及其致病性打下了基础，更能够为临床检测ALV‑K的中和抗体提供靶向病毒。

Description

一种表达ALV-K囊膜蛋白的重组病毒的构建方法
技术领域
本发明涉及一种构建表达ALV-K囊膜蛋白的重组病毒的方法。此发明不仅为研究ALV-K 囊膜蛋白功能受体及其致病性打下了基础，而且为临床检测ALV-K中和抗体提供了靶向病毒。因此，本发明具有一定应用价值。
背景技术
禽白血病病毒(Avian leukosis virus,ALV)是可引起禽类患多种肿瘤及免疫抑制性疾病的反转录病毒。根据其囊膜蛋白特征，该病毒可分为A-K共11个亚群。其中A，B，J亚群较为常见，且J亚群目前在国内最为常见。ALV-J感染主要造成鸡造血细胞恶性增生，引起髓细胞瘤、血管瘤及严重的免疫抑制，对国内外养禽业造成巨大经济损失。随着国内ALV净化工作的推进，鸡群ALV-J的感染及其发病率显著下降。ALV-K是近年来在国内地方品种鸡中分离鉴定出的新型禽白血病病毒。由于ALV-K病毒复制能力较弱，病毒蛋白表达水平较低，目前ALV通用检测试剂盒对其检测效果不是很好，且尚无商品化特异性ALV-K抗原及抗体检测试剂盒。
发明内容
本发明的目的是在于提供一种构建表达ALV-K囊膜蛋白的重组病毒方法。本发明的原理和最核心的关键技术是科学合理的设计引物，PCR扩增ALV-K囊膜蛋白基因片段和ALV-J 传染性克隆线性化载体，构建重组传染性克隆质粒，并将重组质粒转染DF-1细胞拯救出表达 ALV-K囊膜蛋白的重组病毒。本发明利用ALV-J传染性克隆，构建了高效复制及表达ALV-K 囊膜蛋白的重组病毒。这一重组病毒的获得不仅为研究ALV-K囊膜蛋白功能受体及其致病性打下了基础，更能够为临床检测ALV-K的中和抗体提供靶向病毒。
本发明公开了PCR扩增ALV-J传染性克隆线性化表达载体引物以及PCR扩增ALV-K-env 基因引物序列。本发明还公开了一种基于重组酶ExnaseTM II将线性化的ALV-J传染性克隆表达载体与ALV-K-env基因片段PCR产物不经酶切连接反应，直接重组克隆的技术；并通过转染DF-1细胞获得表达ALV-K囊膜蛋白的重组病毒，具体方案为：
(1)K亚群禽白血病病毒基因组的制备：首先将K亚群禽白血病病毒感染细胞后的上清经细胞裂解液裂解，随后用酚、氯仿、异戊醇进行病毒基因组抽提，最后用无水乙醇沉淀，溶于30uL灭菌超纯水，即得ALV-K前病毒DNA，置-20℃备用；
(2)PCR扩增ALV-K env基因片段和ALV-J传染性克隆线性化载体：首先设计出扩增ALV-K env基因的引物以及ALV-J传染性克隆线性化载体的引物；然后以ALV-J传染性克隆质粒以及ALV-K前病毒DNA为模板，利用相应引物分别PCR扩增出ALV-K-env和线性化的ALV-J 线性化载体。
(3)ALV-K-env-J重组表达载体的构建：利用重组酶ExnaseTMⅡ将线性化的ALV-J载体以及ALV-K env基因的PCR产物进行快速体外重组克隆，重组克隆经序列验证后，命名为 ALV-K-env-J传染性克隆质粒，并挑取阳性细菌菌液进行质粒制备。
(4)将ALV-K-env-J传染性克隆质粒转染DF-1细胞，六天后将部分上清继续在DF-1细胞上盲传3代。PCR检测盲传三代后提取的细胞基因组，以IFA及PCR方法检测盲传3代后的细胞上清，结果证明ALV-K-env-J传染性克隆病毒拯救成功。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
第二，该发明设计的引物及基于重组酶ExnaseTM II的克隆策略，可快速构建重组ALV 传染性克隆，并拯救出表达ALV-K囊膜蛋白的重组病毒。本发明可提供一种高效扩增具有 ALV-K囊膜蛋白抗原的病毒，不仅为研究ALV-K囊膜蛋白功能受体及其致病性打下了基础，更能够为临床检测ALV-K的中和抗体提供靶向病毒，加快ALV的净化进程，在ALV净化检测中具有一定应用价值。
附图说明
图1PCR扩增ALV-K env基因片段和ALV-J传染性克隆S2线性化载体图；
图1中：泳道M，DNA Marker；泳道1，ALV-K env基因片段的PCR产物；泳道3，ALV-J传染性克隆S2线性化载体的PCR产物。
图2PCR检测拯救出的重组病毒ALV-K-env-J图；
图2中：泳道M，DNA Marker；泳道1，ALV-K-env-J重组病毒；泳道2，阴性对照；泳道3， ALV-K阳性对照。
图3A是IFA检测拯救出的重组病毒ALV-K-env-J重组病毒图；
图3B是IFA检测拯救出的ALV-J病毒图；
图3C是IFA检测阴性对照图；
图4重组病毒ALV-K-env-J在DF-1细胞中的生长曲线图。
具体实施方式
下面将通过附图和具体实施方法对本发明做进一步的具体描述，但不能理解为是对本发明保护范围的限定。
实施例
(1)ALV-K前病毒DNA的制备：
取ALV-K感染细胞后的上清400uL于1.5mL指形管内，加入400uL细胞裂解液(50mmol/L Tris-HCl pH＝8.0，20mmol/L EDTApH＝8.0，2％SDS和蛋白酶K)，充分混匀后放置56℃水浴锅作用4h；加入400uL Tris平衡酚，充分混匀后10000rpm离心10min，取上清于另一1.5mL 指形管；加入400uL酚：氯仿：异戊醇，充分混匀后10000rpm离心5min，取上清于另一1.5mL 指形管；加入800uL无水乙醇，颠倒混匀后放入-20℃孵育30分钟，12000rpm离心15分钟，弃尽上清；室温自然干燥后向沉淀加入30uL灭菌超纯水和2uL RNA酶，充分溶解后即得 ALV-K前病毒DNA，置-20℃备用。
(2)PCR扩增ALV-K env基因片段和ALV-J传染性克隆线性化载体：
设计扩增出含ALV-J传染性克隆线性化载体与ALV-K env基因片段的引物：扩增ALV-J 传染性克隆线性化载体的上游引物位于J1质粒7010-7039位；扩增ALV-J传染性克隆线性化载体的下游引物位于J1质粒5292-5320位。扩增ALV-K env基因上游引物位于ALV-K基因组5253-5274位，且在5’端带有15个与ALV-J传染性克隆线性化载体下游引物反向互补碱基；扩增ALV-K env基因下游引物位于ALV-K基因组7020-7040位，且在5’端带有15个与ALV-J 传染性克隆线性化载体上游引物反向互补碱基。具体引物序列见附表1，由苏州金唯智生物科技有限公司合成。
表1.PCR扩增ALV-J线性化载体及ALV-K env基因的引物
Figure RE-GDA0001892130410000031
分别以ALV-J传染性克隆S2以及步骤(1)制备的K亚群禽白血病病毒基因组为模板，表1所述相应引物分别进行PCR，扩增出线性化的S2-linear载体以及ALV-K-env基因序列。 PCR扩增反应体系为：模板2uL，5×Buffer 10uL，10mM dNTP Mix 1uL，上游引物为10μmol 2uL，下游引物为10μmol 2uL，高保真酶1uL，加入灭菌超纯水至50uL。PCR扩增反应循环参数为：95℃预变性4min，随后进行30个循环(95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸4min30s/1min)，72℃延伸10min。PCR结束后，产物在1％的琼脂糖凝胶中进行电泳分析(如图1所示)。
(3)ALV-K-env-J重组表达载体的构建：
将(2)中纯化的线性化载体ALV-J以及ALV-K env基因片段PCR产物在商品化重组酶 ExnaseTMⅡ的作用下进行重组克隆。重组克隆经序列验证后，命名为 pMD19T-simple-ALV-K-env-J。具体重组反应体系如下：纯化的ALV-K env基因片段PCR产物50-100ng，纯化的ALV-J线性化载体170ng，2μL商品化的ExnaseTMⅡ酶，4uL 5×CEⅡ Buffer，其它补加水至20μL。反应产物于37℃作用30分钟后，置冰上5min。随后将20μL 反应产物转化到感受态细胞DH5α并涂LB平板。次日挑取细菌克隆进行质粒制备，阳性克隆鉴定。
(4)重组病毒拯救
将DF-1细胞接种于十二孔板，当汇合度为约70％时，将pMD19T-simple-ALV-K-env-J 传染性克隆质粒和ALV-J传染性克隆质粒分别转染十二孔板中的DF-1细胞，留一孔细胞作为阴性对照。每孔2μg质粒，37℃6h后换为含1％胎牛血清的DMEM培养基。维持6天后各取1ml上清接种于另一铺有DF-1的十二孔板，以相同方法继续盲传2代，并收取P2代、 P3代细胞上清冻于-80℃留做检测。
(5)PCR检测拯救出的重组病毒ALV-K-env-J
在收取P3代细胞上清后，以Axygen基因组提取试剂盒提取细胞基因组作为模板，表1②与表2中所述引物分别进行PCR，检测重组病毒是否拯救成功以及是否单一。PCR反应体系为：模板2uL，5×Buffer 10uL，10mM dNTP Mix 1uL，上游引物为10μmol 2uL，下游引物为 10μmol 2uL，高保真酶1uL，加入灭菌超纯水至50uL；2×Taq 10uL，灭菌超纯水6uL，上游引物1uL，下游引物1uL，模板2uL。PCR扩增反应循环参数为：95℃预变性4min，随后进行30个循环(95℃变性30s，55℃/58℃退火30s，72℃延伸1min/45s)，72℃延伸10min。 PCR结束后，产物在1％的琼脂糖凝胶中进行电泳分析。结果如图2、3A、3B、3C所示： ALV-K-env-J传染性克隆病毒基因组作为模板PCR只扩增出K-env片段并且无其他亚群的 ALV的核酸。
(6)IFA检测拯救出的重组病毒ALV-K-env-J
以IFA方法检测盲传3代后的ALV-K-env-J拯救病毒和ALV-J传染性克隆S2病毒的细胞上清：将DF-1细胞接种于96孔板，当汇合度约为70％时，接种病毒，维持5天后，将细胞用50μl丙酮：乙醇比例为3：2的固定液固定5分钟，干燥；将50μl 1：150稀释的抗J亚群禽白血病病毒P27单克隆抗体5D3为一抗与固定好的细胞于37℃孵育45分钟，弃去所有液体，以200μl PBS洗3遍；加入50μl 1：150稀释的FITC标记的羊抗鼠IgG为二抗于37℃孵育45分钟，弃去所有液体，以200μl PBS洗3遍，加入30μl PBS，于倒置荧光显微镜下进行观察。结果如图4所示，ALV-K-env-J传染性克隆病毒组可见特异性的绿色荧光，表明重组病毒拯救成功。
(7)重组病毒ALV-K-env-J生长曲线
将DF-1铺于六孔板，当汇合度约70％时，按MOI＝0.01分别接种ALV-K-env-J拯救病毒和ALV-J传染性克隆S2病毒，各做两个重复。24h后收取细胞上清200μL并补充200μL含1％胎牛血清的维持液，此后连续6天以同样方法定时收取并补充，上清冻存于-80℃冰箱备用。将ALV-K-env-J传染性克隆病毒与ALV-J传染性克隆S2病毒各自收取的7个时间点的细胞上清通过Reed-Muench法测定TCID50；利用GraphPad Prism 5软件绘制病毒生长曲线。结果如图4所示：ALV-K-env-J传染性克隆病毒与ALV-J传染性克隆S2病毒相比，其生长速度远快于ALV-J拯救病毒。
<110>扬州大学
<120>一种表达ALV-K囊膜蛋白的重组病毒的构建方法
<160>4
SEQ ID NO.1
<210>1
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
TAGGTTCCGA ACGCGATGTA ACGGGGCAAG 30
SEQ ID NO.2
<210>2
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
CTGCAAAGAG AGGGCTCGCC TCATCCTTC 29
SEQ ID NO.3
<210>3
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
GCCCTCTCTT TGCAGGCATT TCTGACTGGA TATCCTG 37
SEQ ID NO.4
<210>4
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
CGCGTTCGGA ACCTACACTG TTCCATTTTC GGGCTG 36

Claims (2)

1.一种表达ALV-K囊膜蛋白的重组病毒的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：
1）利用引物1，以ALV-J传染性克隆质粒为模板， PCR扩增出ALV-J传染性克隆线性化表达载体；所述引物1为：
ALV-J-linear-F：TAGGTTCCGAACGCGATGTAACGGGGCAAG；
ALV-J-linear-R：CTGCAAAGAGAGGGCTCGCCTCATCCTTC；
2）利用引物2，以ALV-K前病毒DNA为模板，PCR扩增出ALV-K囊膜蛋白基因；所述引物2为：
ALV-K-env-F： GCCCTCTCTTTGCAGGCATTTCTGACTGGATATCCTG；
ALV-K-env-R：CGCGTTCGGAACCTACACTGTTCCATTTTCGGGCTG；
3）利用重组酶ExnaseTM II对步骤1）和2）得到的PCR产物进行快速重组克隆；阳性克隆转染DF-1细胞拯救出表达ALV-K囊膜蛋白的重组病毒；
所述步骤（1）与步骤（2）中的PCR扩增反应体系均为：模板2uL，5×Buffer 10uL，10mMdNTP Mix 1uL，上游引物为10μmol 2uL，下游引物为10μmol 2uL，高保真酶1uL，加入灭菌超纯水至50uL；
述步骤（1）与步骤（2）中的PCR扩增反应循环参数均为：95℃预变性4min；随后进行30个循环，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃ 延伸4min 30s/1min；72℃延伸10min；
所述步骤（1）与步骤（2）PCR扩增反应结束后，产物在1%的琼脂糖凝胶中进行电泳分析。
2.根据权利要求1所述的一种表达ALV-K囊膜蛋白的重组病毒的构建方法，其特征在于，所述具体重组反应体系如下：纯化的ALV-K env基因片段PCR产物50-100ng，纯化的ALV-J线性化载体170ng，2μL商品化的ExnaseTM Ⅱ酶，4uL 5×CE Ⅱ Buffer，其它补加水至20μL。
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